ES2534574A1 - Biosensor para la detección de ácido fosfatídico en membranas celulares - Google Patents

Abstract

Biosensor para la detección de ácido fosfatídico en membranas celulares. La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un fragmento de la proteína Spo20, la proteína fluorescente ECFP y la proteína fluorescente Venus o una variante de ésta. También se refiere a la secuencia nucleotídica que las comprende. Además, también se refiere a su uso para la detección y/o cuantificación in vitro de ácido fosfatídico en membranas celulares, por ejemplo, membrana plasmática o membrana mitocondrial. Además, también se refiere a un método de cribado utilizando las proteínas de fusión de la invención.

Description

5 la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un fragmento de la proteína Sp020 de levadura, la proteína fluorescente ECFP y la proteína fluorescente Venus o una variante de la misma, cuya expresión celular se dirige a membranas y que presenta un cambio del espectro de emisión fluorescente cuando une el ácido fosfatídico. la proteína de fusión de la invención es útil para la

10 cuantificación de los niveles de ácido fosfatídico. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la Biomedicina.

ESTADD DE LA TÉCNICA ANTERIOR

15 El ácido fosfatídico (AF) es un fosfolípido en forma de cono que estabiliza la curvatura negativa de las membranas, lo que ayuda en la formación de vesículas del aparato de Golgi o membrana plasmática y lleva a cabo la fusión y la fisión de orgánulos tales como las mitocondrias. Además, el AF es un mediador lipídico. las notables propiedades de su grupo fosfomonoéster, situado más cerca del interior hidrofóbico de

20 la bicapa lipídica que en otros fosfolípidos, proporcionan un ambiente especial para el anclaje de proteínas de unión a AF. Estas proteínas parecen utilizar residuos básicos debidamente espaciados en lugar de una secuencia de aminoácidos precisa para su unión a AF. la lista de efectores conocidos que unen AF se está expandiendo rápidamente. Cambios en los niveles de AF se han asociado con el reclutamiento y/o

25 activación de una amplia gama de proteínas que participan en diferentes actividades celulares, tales como la remodelación del citoesqueleto de actina, el tráfico de vesículas, el crecimiento celular, la difusión, la proliferación y la supervivencia celular (revisado en Stace Cl y Ktistakis NT Biochim Biophys Acta 2006;1761(8):913-926).

30 El AF también juega un papel en la biosíntesis de otros lípidos de señalización. Se piensa que la principal fuente de AF en células es la enzima fosfolipasa O (PlD, isoformas 1 y 2), que utiliza fosfatidilcolina como sustrato. El AF puede ser convertido a diacilglicerol (DAG) por fosfatasas del AF, que comprenden las lipinas y las fosfatasas de fosfato de lípidos. A su vez, el DAG puede ser reconvertido en AF por

35 las DAG quinasas (DGKs). A partir de AF también se puede generar ácido lisofosfatídico por la fosfolipasa A, mientras que la reacción inversa es catalizada por las acil transferasas de ácido lisofosfatídico. Esta compleja red de reacciones enzimáticas se regula por diversos bucles de retroalimentación.

El creciente interés en las moléculas de señalización lipídicas ha fomentado el desarrollo de herramientas para analizar mejor su dinámica espacio-temporal. Además de los métodos tradicionales para la determinación de los cambios en los niveles de lípidos, se han descrito biosensores construidos con dominios de unión a lípidos unidos a proteínas fluorescentes pero que sin embargo no proporcionan información cuantitativa del AF en las membranas celulares ni información sobre la disminución del mismo. Por ejemplo, se ha descrito un biosensor para AF, que consiste en la fusión molecular de un dominio de unión a AF (un fragmento de Spo20) y la proteína fluorescente GFP (Nakanishi H et al. Mol Biol CeU 2004;15(4):1802-1815). En células

de mamífero, este biosensor se transloca del citoplasma y núcleo a la membrana plasmática en respuesta al aumento de AF en la misma. Sin embargo, la fluorescencia de esta proteína quimérica se ve afectada también por factores como el fotoapagamiento de GFP, la concentración del indicador o el grosor de la célula en una u otra localización y por lo tanto, sólo proporciona información cualitativa del AF.

Otro indicador fluorescente de AF que se ha descrito está basado en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En este caso el biosensor tiene como dominio de unión a AF un fragmento de la proteína DOCK2, y posee dos proteínas fluorescentes. Sin embargo, el cambio de señal que se obtiene con este biosensor es de pequeña magnitud y no muestra disminuciones de AF, sino sólo aumentos del fosfolipido (Nishioka T et al. J Biol Chem 2010; 285(46):35979-35987).

Por lo tanto, se hace necesario obtener biosensores más robustos, con mayor cambio de la señal fluorescente por la unión del AF que proporcionen información cuantitativa tanto del aumento como de la disminución del AF. De esta manera se avanzaría en la caracterización de las funciones del AF en las células y se posibilitaría el cribado farmacológico de ligandos que modifican su concentración.

DESCRIPCION DE LA INVENCiÓN El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar una proteína de fusión fluorescente más sensible al ácido fosfatídico (AF) que las descritas en el estado del arte y que proporciona información sobre la detección y cuantificación del AF en las membranas celulares, incluidas las membranas mitocondriales.

El sensor fluorescente (o biosensor) de ácido fosfatídico (AF) de la presente invención está formado por la prote ína de levadura Sp020 como dominio sensible a AF (los residuos 51 a 91 de esta proteína), y las proteínas fluorescentes ECFP (proteína fluorescente cian) y Venus (proteína fluorescente amarilla) como donador y aceptar de 10 transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), respectivamente. La expresión de las proteínas quiméricas (o quimeras) en diferentes membranas celulares se obtuvo utilizando secuencias de direccionamiento apropiadas. Los autores de la presente invención han utilizado varias configuraciones del espaciador entre las proteínas fluorescentes y el fragmento de Sp020 para maximizar el cambio de la

15 transferencia de energía con la variación de los niveles de AF en membranas celulares. Los biosensores de la invención son sensibles tanto al aumento como a la disminución del AF en las membranas celulares.

Los biosensores de la presente invención son útiles para la detección dinámica de AF

20 en las membranas celulares. Se ha demostrado la invención en las membranas plasmática y mitocondrial externa. Los biosensores de la invención cambian su color de emisión fluorescente en respuesta a los estímulos que aumentan o disminuyen los niveles de AF en estas membranas, validando así su utilidad. Con esta herramienta se pueden obtener nuevos datos relativos a la dinámica de formación de AF y su relación

25 con actividades enzimáticas de las membranas, así como las variaciones de niveles de AF durante actividades como la migración celular, la emisión de procesos de membrana y la autofagia. Además, se pueden construir líneas celulares con expresión estable del biosensor fluorescente para utilizarlas en el cribado farmacológico de las enzimas implicadas en la formación y degradación del AF. Además, es posible utilizar

30 los biosensores para ensayos in vivo de la bioquímica del AF en las diferentes membranas.

La proteína fluorescente cian (ECFP) utilizada en la presente invención se refiere a una variante de la proteína fluorescente verde (GFP) que se obtiene a partir del 35 organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucleico se refieren a la SEO

ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEa ID NO: 2. La SEa ID NO: 1 es idéntica a la secuencia nucleotídica en la base de datos GenBank EU422995.1. La SEa ID NO: 2 es idéntica a la secuencia de proteína ACB12919.1 en GenBank. También se puede referir a cualquier variante de ECFP que guarde al menos un 70% de identidad con la misma.

La proteína Venus utilizada en la presente invención se refiere a una variante de la proteína fluorescente verde (GFP) que se obtiene a partir del organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucleico se refieren a la SEO ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEO ID NO: 6. La SEO ID NO: 5 es idéntica a la secuencia nucleotídica en GenBank FJ3891 61.1. La SEO ID NO: 6 es idéntica a la secuencia de proteína ACQ43942.1 en GenBank. También se puede referir a cualquier variante de Venus que guarde al menos un 70% de identidad con la misma.

La proteína Spo20, de la que se utiliza un fragmento que comprende los residuos 51 a 91 en la presente invención, se refiere a una proteína que se obtiene a partir del organismo Saccharomyces cerevisiae (Nakanishi H et al. Mol Biol Cell 2004;15(4):1802-1815) y cuya secuencia de ácido nucleico se refiere a la SEO ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEO ID NO: 4. La SEO ID NO: 3 es idéntica a la secuencia nucleotídica en GenBank NM_001182513.1. La SEa ID NO: 4 es idéntica a la secuencia de proteína NP _013730.1 en GenBank. También se puede referir a cualquiera de las variantes de Sp020 que guarden al menos un 70% de identidad con la misma, por ejemplo Spo20-like-protein obtenida a partir de Saccharomyces kudriavzevii (secuencia nucleotídica AAC103000513.1 (GenBank), secuencia de aminoácidos EJT43717.1 (GenBank). La proteína Spo20 se une al ácido fosfatídico, es decir, es sensible al mismo por lo que es capaz de unirse al ácido fosfatídico.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión fluorescente que comprende :

a.

una subunidad (a) que comprende una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

b.

una subunidad (b) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (a) que comprende una proteína que se une al ácido fosfatídico con al menos

un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4; o un fragmento de la

misma;

c. y una subunidad (c) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (b) que comprende una proteína con al menos un 70% de identidad con la 5 secuencia SEO ID NO: 6 o una permutación circular de la misma o un

fragmento de la misma; donde las subunidades se unen entre sí sin espaciador o con un polipéptido espaciador. Preferiblemente la unión entre las subunidades se realiza mediante enlace peptídico.

10 Esta proteína de fusión fluorescente también se denomina en la presente invención "proteína quimérica", "proteína quimérica fluorescente", "proteína de la invención", "biosensor" o "biosensor de la invención".

15 Una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la sub unidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2.

Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la sub unidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4.

20 Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 6.

Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína

25 donde la sub unidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2, la subunidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4 y la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 6.

En la presente invención, la subunidad (c) también puede comprender una permutación circular de la SEO ID NO: 6_

Se entiende por "permutación circular" aquella variante de una proteína que tiene un inicio de su secuencia lineal de aminoácidos distinto de la proteína silvestre, manteniendo el orden de aminoácidos y con una estructura similar en tres dimensiones. Las permutaciones circulares pueden aparecer de forma natural por

35 eventos evolutivos, por modificaciones post-traducción, o ser producidas artificialmente en el laboratorio para mejorar la estabilidad, actividad catalítica u otra característica

funcional de una proteína con métodos conocidos por el experto en la materia. Se puede entender como si se hubieran unido sus extremos originales y se hubieran creado otros nuevos en otro lugar.

Las permutaciones circulares de Venus utilizadas en la presente invención son versiones (o variantes) de Venus que poseen los extremos N (ami no) y e (carboxilo) terminales conectados por un peptapéptido (GGSGG donde la secuencia está descrita en el código de aminoácidos de una letra conocido por el experto en la materia, pero 10 puede ser otro péptido) y los nuevos extremos N y e terminales se sitúan en regiones expuestas del barril que se forma en la estructura en tres dimensiones. Venus cp49, Venus cp157, Venus cp173, Venus cp195 y Venus cp229 tienen nuevos extremos N terminales, respectivamente en Thr-49, Gln-157, Asp-173, Leu-195, e lIe-229 y se refieren respectivamente a las secuencias de nucleótidos SEO ID NO: 7, 9, 11,13 Y 15 15 ya las secuencias de aminoácidos SEO ID NO: 8, 10, 12, 14 Y 16 (Nagai T et al. Proc Natl Aead Sei U S A 2004;101(29):10554-10559). En la presente invención la subunidad (c) también puede comprender una proteína con al menos un 70% (preferiblemente al menos un 80% , más preferiblemente un 90% , aún más preferiblemente un 95% de identidad) con la proteína de SEO ID NO: 6 permutada

20 circularmente , o un fragmento de dicha permutación circular.

Por lo tanto, otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteina donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 8.

25 Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 10.

Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la subunidad (e) consiste en la SEO ID NO: 12.

30 Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína donde la subunidad (e) consiste en la SEO ID NO: 14.

Otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína 35 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 16.

Se entiende por "proteína fluorescente" aquella proteína que tras ser excitada con una determinada longitud de onda, emite luz de una longitud de onda mayor. Se entiende por "proteína fluorescente cian" aquella proteína que tras ser excitada en una

5 determinada longitud de onda emite luz en la zona cian (azul) del espectro visible. Se entiende por "proteína fluorescente amarilla" aquella proteína que tras ser excitada en una determinada longitud de onda emite luz en la zona amarilla del espectro visible.

La fluorescencia es un tipo de luminiscencia que caracteriza a las sustancias que son

10 capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas (luz de excitación) y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente (emisión fluorescente).

Luminiscencia es todo proceso de emisión de luz cuyo origen no está condicionado 15 por un aumento de temperatura.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta descripción, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias de 20 aminoácidos puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias. El porcentaje de identidad que se indica en la presente invención con respecto a la subunidad (a), (b) o (c) se refiere a la identidad con respecto a la longitud total de la subunidad (a), (b) o (c). El porcentaje de identidad puede ser al menos un

25 70%, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% de identidad.

El término "fragmento", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de la proteina SEO ID NO: 2 o de la SEO ID NO: 4 o de la SEO ID NO: 6 o de

30 cualquiera de sus variante biológicamente activas, capaz de emitir fluorescencia en el caso de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 6 o bien capaz de unir AF en el caso de la SEO ID NO: 4.

El término "polipéptido espaciador" (o "linker" o "espaciador"), tal y como se utiliza en 35 la presente descripción, se refiere a una secuencia de aminoácidos, preferiblemente,

de hasta 60 aminoácidos de longitud (preferiblemente hasta 50 aminoácidos, más preferiblemente de entre 35 y 45 aminoácidos) situada entre la secuencia de aminoácidos de la subunidad (a) y la secuencia de aminoácidos de la subunidad (b), o entre la secuencia de aminoácidos de la subunidad (b) y la secuencia de aminoácidos 5 de la sub unidad (c). Los polipéptidos espaciadores localizados entre las subunidades pueden ser iguales o distintos. Los pOlipéptidos espaciadores se unen a las subunidades mediante enlaces peptídicos. El polipéptido espaciador puede comprender la secuencia de aminoácidos "EAAAR" (secuencia descrita en el código de aminoácidos de una letra conocido por el experto en la materia) y puede

10 comprender repeticiones de la misma.

El polipéptido espaciador también puede estar situado entre la secuencia de direccionamiento y la subunidad a la que esté unida.

15 El término "secuencia de direccionamiento", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una secuencia de aminoácidos, preferiblemente de hasta 33 aminoácidos de longitud, situada en el extremo amino-terminal o carboxilo-terminal del biosensor, y cuya expresión resulta en la unión del biosensor a una membrana celular específica. Por lo tanto, la proteína de fusión de la invención puede comprender

20 secuencias de direccionamiento a membranas, por ejemplo, secuencias de direccionamiento a membrana plasmática (por ejemplo la SEa ID NO: 18) o a membrana mitocondrial (por ejemplo la SEO ID NO: 22 para membrana mitocondrial externa).

25 Una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína que además comprende un polipéptido que comprende la secuencia SEa ID NO: 18 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a). Preferiblemente, comprende un polipéptido que consiste en la secuencia SEa ID NO: 18 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a). La unión puede realizarse mediante un

30 polipéptido espaciador o sin espaciador. Preferiblemente la proteína de fusión consiste en la proteína de secuencia SEO ID NO: 20.

Otra realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere a una proteína que además comprende un polipéptido que comprende la secuencia SEa ID

35 NO: 22 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a). Preferiblemente, comprende un polipéptido que consiste en la secuencia SEa ID NO: 22 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a ). La unión puede realizarse mediante un polipéptido espaciador o sin espaciador. Preferiblemente la proteína de fusión consiste en la proteína de secuencia SEO ID NO: 24.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia que codifica la proteína de fusión del primer aspecto de la invención.

En la presente invención se describen las secuencias de AoN siguientes: SEO ID : 1 se refiere a ECFP, SEa ID NO: 3 a Spo20 fragmento 51-91 , SEa ID NO: 5 a Venus, SEO ID NO: 7 a Venus cp49, SEO ID NO: 9 a Venus cp157, SEO ID NO: 11 a Venus cp173, SEO ID NO: 13 a Venus cp195, SEO ID NO: 15 a Venus cp229, SEO ID NO: 17 a Lck fragmento 1-12, SEO ID NO: 19 a la secuencia correspondiente a la proteína de fusión pmPAS, SEO ID NO: 21 a Tom20 fragmento 1-33, SEO ID NO: 23 a la secuencia correspondiente a la proteína de fusión mitPAS.

La secuencia nucleotídica puede ser un ácido desoxirribonucleico (AoN) o un ácido ribonucleico (ARN).

Una realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere a la secuencia nucleotídica donde dicha secuencia consiste en la SEa ID NO: 19.

Otra realización preferida del segundo aspecto de la invención se refiere a la secuencia nucleotídica donde dicha secuencia consiste en la SEO ID NO: 23.

La secuencia nucleotídica puede estar comprendida en una construcción génica. Para generar construcciones génicas que comprendan la secuencia nucleotídica de la invención, se pueden utilizar las herramientas moleculares conocidas por cualquier experto en la materia, entre ellas el clonaje y la utilización de enzimas de restricción. Esta construcción génica de la invención puede comprender el ácido nucleico de la invención, operativa mente unido a una secuencia reguladora de la expresión del ácido nucleico de la invención, constituyendo de este modo un cassette de expresión.

"Unidos operativamente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así

descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" al ácido nucleico, está ligada al mismo de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificadora del ácido nucleico.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que afectan la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de iniciación, señales de terminación, intensificadores o silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de contror incluya aquellos componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

En una realización preferida, la construcción génica de la invención comprende el ácido nucleico de la invención unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende:

a.

un promotor,

b.

una señal de inicio de la transcripción,

c.

una señal de terminación de la transcripción,

d.

una señal de poliadenilación, o

e.

un activador transcripcional.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región de ADN situada en posición 5' con respecto al punto de inicio de la transcripción y que resulta necesaria o facilita dicha transcripción en una célula animal. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles.

Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico de la invención. En una realización particular, las secuencias de control de expresión unidas al ácido nucleico de la invención son funcionales en células y organismos procariotas, (bacterias); mientras que en otra

realización particular, dichas secuencias de control de expresión son funcionales en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de levadura o células animales.

El ácido nucleico de la invención o la construcción génica de la invención pueden ser 5 introducidos al interior de una célula, denominada célula hospedadora, por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector.

El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin

10 que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura.

El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, se

15 refiere a un vector de clonaje adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control.

20 El término "célula hospedadora", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN o de ARN

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende la secuencia

25 nucleotídica del segundo aspecto de la invención. La introducción de dichas construcciones génicas se puede realizar con los métodos conocidos en el estado de la técnica. La presente invención también se refiere a la célula que al comprender la proteína de la invención emite fluorescencia. También se refiere esta invención, a la población celular que comprende la célula de la invención.

30 Un cuarto aspecto de la presente invención, se refiere al uso de la proteína de fusión del primer aspecto de la invención o de la secuencia nucleotídica del segundo aspecto de la invención para la detección y/o cuantificación in vi/ro del ácido fosfatídico en una célula (procariota o eucariota, por ejemplo células HeLa o HEK), en un tejido o en un

35 extracto celular.

Preferiblemente el ácido fosfatídico que se detecta se localiza en una membrana en la superticie o el interior de una célula, por ejemplo pero sin limitarse a la membrana plasmática, membrana mitocondrial, retículo endoplásmico o sarcoplásmico, 5 membrana nuclear, membrana del aparato de Golgi, membrana de vesículas secretoras, membrana de gránulos de secreción, u otros dominios subcelulares. En todos estos casos, se añaden secuencias de direccionamiento subcelular en el extremo 5' o 3' de las secuencias nucleotídicas que codifican para las proteínas de la invención. Un ejemplo de direccionamiento subcelular es el direccionamiento a la 10 membrana plasmática o a la membrana mitocondrial por unión de una secuencia en el extremo amino-terminal. En la presente invención se muestran ejemplos, SEa ID NO: 17, SEa ID NO: 18 que se refieren a la secuencia nucleotídica y a la proteína respectivamente de Lck1-12, que está presente en el extremo amino terminal de la proteína de fusión pmPAS (el biosensor PAS con señal de localización de membrana 15 plasmática, secuencias nucleotídica y de proteína SEO ID NO 19 Y 20, respectivamente) y también SEO ID NO: 21 , SEO ID NO: 22 que se refieren a la secuencia nucleotídica y a la proteína respectivamente de Tom20 (residuos 1-33), que está presente en el extremo amino terminal de la proteína de fusión mitPAS (el biosensor PAS con señal de localización de membrana mitocondrial externa:

20 secuencia nucleotídica y de proteína SEQ ID NO 23 Y 24, respectivamente).

Una realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al uso donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana plasmática de la célula.

25 Otra realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al uso donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana mitocondrial, preferiblemente la membrana mitocondrial externa de la célula.

La presente invención también se refiere al uso de la proteína de fusión del primer

30 aspecto de la invención o de la secuencia nucleotídica del segundo aspecto de la invención para la detección y/o cuantificación in vivo del ácido fosfatídico.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende la proteína de fusión del primer aspecto de la invención o la secuencia nucleotídica del segundo

35 aspecto de la invención o la célula del tercer aspecto de la invención. La proteína de fusión de la invención puede estar inmovilizada en un soporte, dicho soporte puede formar parte del kit del quinto aspecto de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso del kit del quinto aspecto de la 5 invención para la detección y/o cuantificación in vitro del ácido fosfatídico en una célula

o en un tejido o en un extracto celular.

Una realización preferida del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana plasmática.

10 Otra realización preferida del sexto aspecto de la invención se refiere al uso donde el ácido fosfatidico se localiza en la membrana mitocondrial, preferiblemente externa.

La presente invención también se refiere al uso del kit del quinto aspecto de la 15 invención para la detección y/o cuantificación in vivo del ácido fosfatidico.

Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención de la proteína de fusión del primer aspecto de la invención que comprende cultivar una célula del tercer aspecto de la invención en condiciones que permiten la expresión de

20 dichas proteínas. Por ejemplo, dicha expresión se produce en bacterias (por ejemplo en E. eall), levaduras, baculovirus, células de mamífero en cultivo o cualquier otro sistema de expresión de proteína recombinante. Ejemplos no limitantes de células de mamífero son líneas celulares como HeLa o HEK, células musculares, astrocitos, neuronas, células epiteliales y endoteliales.

25 En una realización preferida del procedimiento del séptimo aspecto de la invención, además comprende aislar y/o purificar dichas proteínas obtenidas. Las técnicas de aislamiento o purificación que pueden utilizarse para las proteínas de la invención son las conocidas por el experto en la materia. Por este motivo, las proteínas de la

30 invención pueden estar unidas a secuencias de etiquetado ("tag sequences"), por ejemplo etiqueta de polihistidina.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método para el análisis cuantitativo de los niveles de ácido fosfatídico que comprende:

a. poner en contacto una célula o tejido o extracto celular con la proteína de fusión del primer aspecto de la invención o con la secuencia nucleotídica del segundo aspecto de la invención;

b. anclaje de la proteína de fusión del primer aspecto de la invención a una 5 membrana celular;

c. detección y cuantificación de la fluorescencia emitida, proporcional a la presencia de ácido fosfatídico, preferiblemente por microscopía de fluorescencia o por fluorimetría.

10 En el paso (a) la introducción de la secuencia nucleotídica en la célula o tejido de la invención se realiza mediante métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, transfección o transformación. La secuencia nucleotídica se ha de expresar en el interior de la célula.

15 La detección por microscopía de fluorescencia se puede realizar de la siguiente manera: se toman dos imágenes mediante un microscopio de fluorescencia, la primera imagen corresponde a la emisión de ECFP (que forma parte de la proteína de la invención) que se excita directamente mediante iluminación de una longitud de onda apropiada (centrada en 430 nm) y la segunda imagen corresponde a la fluorescencia

20 de la proteína Venus (o una de sus variantes) pero excitada indirectamente, por transferencia de energía resonante (FRET) de la proteína ECFP. A continuación, se cuantifica la FRET, por ejemplo mediante la división pixel por pixel de las dos imágenes citadas imagenEcFP/imagenFRET, obteniendo una imagen cociente o ratio de ambas, cuya intensidad es proporcional a la concentración de ácido fosfatídico.

25 La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) depende de la distancia entre ECFP (donador de energía) y Venus (aceptor de energía) y de la orientación entre ambas. El ácido fosfatídico de la membrana se une a la secuencia Sp020 de la proteína de la invención, de forma que cambios en los niveles de ácido

30 fosfatídico resultan en un cambio de FRET y, por tanto, un cambio del color de emisión de la proteína de la invención, de cian a amarillo, es decir la unión al AF hace que aumente el color cian. De esta forma se asocian los niveles de ácido fosfatídico en la membrana celular a una señal óptica (en la detección por microscopía, el cociente de las imágenes microscópicas descritas).

5

Una realización preferida del octavo aspecto de la invención se refiere al método que ademas comprende entre el paso (b) y (e) estimular la célula o el tejido con una sustancia, por ejemplo, una hormona o una sustancia obtenida de una librería de compuestos para screening, con potencial inhibidor o activador de un receptor de membrana o una enzima cuya respuesta sobre los niveles de ácido fosfatidico sea conocida, donde la célula o el tejido expresan un receptor de membrana acoplado a la liberación o metabolización de ácido fosfatídico, o una enzima que sintetice o degrade el acido fosfatidico.

10

Por lo tanto, este método se refiere a un método de cribado de ligandos de receptores de membrana.

15

Una realización aún más preferida del octavo aspecto de la invención se refiere al método donde además se estimula la célula o el tejido con un agonista conocido del receptor, cuya respuesta sobre los niveles de ácido fosfatídico sea conocida.

20 2S 30

El método del octavo aspecto de la invención se puede utilizar para determinar las propiedades farmacológicas de sustancias de prueba que actúen sobre receptores o enzimas implicados en la liberación o metabolización de ácido fosfatídico en las membranas celulares. Por ejemplo, el ensayo es adecuado para encontrar ligandos (activadores o inhibidores) de receptores acoplados a fosfolipasa O, otros receptores de membrana acoplados a diacilglicerolquinasa, y moduladores de estas u otras enzimas implicadas en la regulación de los niveles de ácido fosfatídico (por ejemplo, algunas de ellas se muestran en la Fig. 1). El término "acoplado" significa una comunicación o interacción molecular entre el receptor y la proteína G, o entre ésta y una enzima como la fosfolipasa O, donde las enzimas sintetizan o metabolizan ácido fosfatídico . Los receptores acoplados a proteínas G y enzimas forman parte de la transmisión de señales desde el exterior al interior de la célula.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la

invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la

invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

5 BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Metabolismo del ácido fosfatídico. Las enzimas que producen o metabolizan ácido fosfatídico se indican en cursiva. Los activadores o inhibidores de las citadas enzimas se indican en negrita, con un signo "+" para indicar activación y un signo "-" 10 para indicar inhibición. Los intermediarios lipídicos son: Glic3P, glicerol 3-fosfato; AGCoA, ácido graso-coenzima-A; PC, fosfatidilcolina; AF, ácido fosfatídico; ALF, ácido lisofosfatídico; DAG, diacilglicerol; PI, fosfatidilinositol; PI(4,5)P], fosfatidilinositol-4,5difosfato; PI4 P, fosfatidilinositol-4-fosfato; PI(3,4 ,5)P3, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato; CDP-DAG, citidina difosfato diacilglicerol. Las flechas indican la dirección de la

15 reacción enzimática correspondiente.

Figura 2: Células HeLa fueron transfectadas con GFP-Sp020 y estimuladas con PMA 100 nM. A, Fluorescencia de una célula HeLa representativa, 1 min antes y 30 min después de estimulación con PMA. B, transcurso temporal del ratio: intensidad de

20 zonas de membrana I intensidad del núcleo celular. Los valores se normalizaron a 1 justo antes de la estimulación con PMA. En algunas células se realizó una incubación con FIPI1 ¡..1M durante 30 minutos previamente a la adición de PMA.

Figura 3: A, Valores basales del cociente ECFP/FRET de las diferentes quimeras de

25 pmPAS expresadas en células HeLa. B, células HeLa transfectadas transitoriamente con diferentes quimeras que difieren en la proteína fluorescente aceptora (Venus o sus formas permutadas circularmente) fueron estimuladas con propranolol100 mM + PMA 100 nM. Se muestra el valor del cociente ECFP/FRET en el tiempo (cociente normalizado a 1 antes de la adición de propranolol+PMA).

30 Figura 4: A, Extractos de células HeLa transfectadas con vector vacío, pmPAS y mitPAS se sometieron a electroforesis en gel de agarosa con SDS y se probaron con anticuerpo anti-GFP, confirmando el tamaño e integridad de las quimeras. B, imagen confocal de una célula HeLa expresando pmPAS, confirmando la localización en

35 membrana plasmática. C, colocalización de mitPAS con mitTdT (TdTomato fusionada con una señal de importación mitocondrial) en células HeLa, confirmando la

localización en la mitocondria.

Figura 5: A, Estructura esquemática del biosensor basado en FRET, pmPAS (Q/asma membrane PA sensor): Lck, /ymphocyte-specific protein tyrosine kinase; Ln, espaciador. B, Estructura del biosensor basado en FRET, mitPAS (mitocondrial PA ~ensor): Tom20, translocasa de la membrana mitocondrial externa-20; Ln, espaciador.

Figura 6: Células HeLa transfectadas transitoriamente con pmPAS se lisa ron y se sometieron a ultracentrifugación en gradiente de sacarosa (se detalla en Material y Métodos), con el fin de comprobar la localización de pmPAS en subdominios de la membrana plasmática de diferente densidad, comparados con el marcador caveolina.

Figura 7: A, curso temporal de los valores normalizados del cociente ECFP/FRET de células HeLa transfectadas transitoriamente con pmPAS y sometidas a estimulación secuencial con propranolol (100 ~M) Y luego PMA (100 nM). B, células HeLa expresando pmPAS se estimularon con PMA (100 nM) con o sin preincubación (30 min) con FIPI (1 IJM). Células HeLa expresando pmPAS juntamente con PLD1 o PLD2 también se estimularon con PMA (100 nM). e, células HeLa transfectadas

transitoriamente con pmPAS fueron estimuladas con el factor de crecimiento epidérmico, EGF (100 ng I mi) con o sin preincubación (30 min) con FIPI (1 ~M). D, efecto de la introducción de la mutación puntual L67P dentro del dominio de unión a AF de Spo20 en el transcurso temporal de ECFP/FRET en células HeLa expresando pmPAS, ante estimulación con propranolol100 IJM + PMA 100 nM.

Figura 8: A-C, transcurso temporal de los valores de ECFP/FRET normalizados de células HeLa transfecladas transitoriamente con pmPAS estimuladas con IipoDOPA (Iiposomas que contienen ácido dioleoilfosfatídico, 200 IJM). Se muestra la respuesta de tres células individuales (A-C) representativas de los resultados obtenidos.

Figura 9: A, transcurso temporal de los valores de ECFP/FRET normalizados de células HeLa transfectadas transitoriamente con pmPAS estimuladas con liposomas que contienen solamente fosfadidilcolina (lipoPC), o fosfadidilcolina y 500 IJM de ácido oleico (lipoOA). B, transcurso temporal de los valores de ECFP/FRET normalizados de

una célula HeLa transfectada transitoriamente con pmPAS estimulada con IipoOA (Iiposomas que contienen ácido oleico, 500 1-1 M).

Figura 10: células HeLa transfectadas transitoriamente con pmPAS o mitPAS se

5 analizaron antes (control sin ayuno), o después de 4 y 14 horas de privación de suero (ayuno) (pmPAS: control sin ayuno: n=45 células, 4h de privación de suero n=65 células, 14h de privación de suero n=41 células; mitPAS: control sin ayuno: n=32 células, 4h de privación de suero n=43 células, 14h de privación de suero n=43 células; ** p <0,01 y *** P <0,001 mediante el test t para determinar la significación

10 estadística).

Figura 11: A, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados, de células HeLa transfectadas con mitPAS, estimuladas con propranolol (100 I-IM). B, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados de células HeLa transfectadas con 15 mitPAS, estimuladas con EGF (100 ng I mi) con o sin preincubación (30 min) con FIPI (1 I-IM). C, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados de células HeLa transfectadas con mitPAS, estimuladas con PMA (100 nM) con o sin preincubación (30 min) con FIPI (1 jJM). D, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados, de células HeLa transfectadas con mitPAS o pmPAS,

20 estimuladas con el compuesto R59949, un inhibidor de diacilglicerolquinasas (DGKs) (40 mM, previamente mezclado con ácido plurónico 20% 1:1, para aumentar su solubilidad en agua).

Figura 12: Niveles basales de ácido fosfatídico y respuesta a inhibidores en tres líneas

25 celulares de cáncer humano. A, se analizaron varias células transfectadas transitoriamente con pmPAS y se realizó un análisis estadístico de los niveles ECFP/FRET basales (HeLa n=45 células; HT29, n=48 células; HCT116 n=53 células, *** p <0,0001 usando one-way ANOVA para determinar la significación estadística). B, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados de células HeLa, HT29 o

30 HCT116, transfectadas con pmPAS, estimuladas con FIPI (1 I-IM). C, transcurso temporal de los valores ECFP/FRET normalizados de células HeLa, HT29 o HCT116, transfectadas con pmPAS, estimuladas con PMA (100 nM).

Figura 13: A-B, se analizaron células HeLa, transfecladas con pmPAS. Se 35 seleccionaron las células que presentaban una migración en una dirección y se realizó un análisis comparativo entre los niveles de ECFP/FRET en los bordes delanteros (BD) y traseros (BT) (n= 18, p<0.01 utilizando t-test). C, valores ECFPIFRET de los bordes delantero y trasero de una célula HeLa que detiene su migración. D, valores ECFP/FRET totales de células HeLa en división o mitosis (n=4 divisiones: 4 células

5 madre, 8 células hijas. Los valores fueron normalizados a 1 justo antes de la división celular). La imagen muestra una de estas células antes y después de la división celular (fluorescencia de la proteína Venus).

Figura 14: Células de las líneas MSC80 y OLN93 se transfectaron con pmPAS y se

10 compararon los valores ECFP/FRET entre los procesos y el cuerpo celular. Se representan los valores ECFP/FRET en los procesos, normalizados a los valores ECFPIFRET del cuerpo celular de la misma célula (MSC80: n=58 células; OLN93: n=64 células). Las imágenes corresponden a células MSC80 y OLN93 representativas, con las regiones de interés (procesos y cuerpo celular) señaladas.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se

20 incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1: Generación de las proteínas de fusión de la invención

MATERIALES Y MÉTODOS

REACTIVOS:

30 4-lluoro-N-(2 -(4 -(5-lluoro-1 H-indol-1-il) piperidin-1-il) etil) benzamida (FIPI), ácido dioleoil-fosfatídico (DOPA), fosfatidilcolina de yema de huevo (pe), ácido oleico (DA), factor de crecimiento epidérmico humano (EGF), forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), propranolol y el inhibidor de diacilglicerol quinasa (R59949) se adquirieron de SigmaAldrich. Ácido plurónico F-127 se adquirió de Molecular Probes.

CULTIVO CELULAR y TRANSFECCIÓN:

Las líneas celulares humanas de adenocarcinoma de cuello de útero HeLa, y las líneas celulares de cáncer de colon HT29 y HCT116 (proporcionadas por el Dr. 5 Ricardo Sánchez Prieto) y las células MSC80 y OLN93 (proporcionadas por el Dr. Joao Relvas) se cultivaron en "Dulbecco Modified Eagle Medium" (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina, 100 U I mi de penicilina y 100 IJg/mL de sulfato de estreptomicina (todos ellos de Lonza) a 37 o C con 5% de CO2 en una atmósfera húmeda. Las células fueron transfectadas con

10 "Lipofectamine® 2000" (Invitrogen) o con jetPrime® (PolyPlus) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

ADQUISICiÓN DE IMÁGENES POR MICROSCOPiA DE FLUORESCENCIA EN CÉLULAS VIVAS:

15 Los ensayos se realizaron con las células sembradas en placas de fondo de cristal (ibidi GmbH) 24 a 48 horas después de la transfección. El medio celular se reemplazó con la solución salina "Hanks Balanced Salt Solution" (HBSS, Gibco) suplementada con 10 mM de HEPES y 5,55 mM de O-glucosa, con el pH ajustado a 7,4. Los agentes

20 químicos se diluyeron directamente en el medio de la placa sobre las células. Alternativamente, se utilizó un sistema de perfusión de flujo impulsado por la gravedad acoplado a una bomba de vacío para la retirada de las soluciones.

La toma de imágenes de fluorescencia de las células se realizó utilizando un

25 microscopio invertido de epifluorescencia (DMIRE-2, Leica) con objetivos de inmersión en aceite PlanApo 40x (apertura numérica 1.25) o PlanApo 63x (apertura numérica 1.4). La fuente de luz de excitación fue un policromador equipado con una lámpara de Xe (C7773, Hamamatsu Photonics). Una rueda de filtros de emisión se controló mediante un dispositivo Lambda-10 (Sutter Instruments). El detector para la

30 adquisición de imágenes fue una cámara EM-CCD (C9100-1 3, Hamamatsu Photonics). El software AQUACOSMOS 2.6 (Hamamatsu Photonics) se utilizó para controlar todos los dispositivos.

Durante los experimentos de imagen en las células que expresaban los biosensores 35 fluorescentes, se tomaron secuencialmente tres imágenes en cada punto temporal: "imagen ECFP" se refiere a la imagen obtenida excitando el donador de FRET (ECFP, a 430 nm) y monitorizando su emisión (filtro de emisión de 475/20 nm). La "imagen Venus" se refiere a la imagen que se obtiene excitando el aceptar de FRET (la proteína fluorescente amarilla llamada "Venus", a 500 nm) y monitorizando su emisión

5 (filtro de emisión de 535/22 nm). Por último, la "imagen FRET" se refiere a la imagen obtenida excitando el donador de FRET (ECFP, a 430 nm) y monitorizando la emisión del aceptor de FRET (Venus, filtro de emisión de 535/22 nm). Se utilizó un espejo dicroico "Brightline" de triple paso y filtros de emisión "Brightline" de una sola banda (todos ellos de Semrock).

10 El software ImageJ con macros personalizadas se utilizó para el procesamiento de imagen, se restó la intensidad de una imagen sin iluminación (el fondo) a las imágenes adquiridas según se describe en el párrafo anterior. Se generó la imagen "cociente (o ratio) ECFP/FRET" dividiendo pixel por pixel la "imagen ECFP" por la "imagen FRET"

15 (previa sustracción del fondo a cada una de ellas).

PREPARACiÓN DE LlPOSOMAS:

Para los liposomas de ácido oleico (lipoDA), el ácido oleico se mezcló con una mezcla

20 de cloroformo:metanol (1:1) conteniendo una cantidad equimolar de fosfatidilcolina. Para los liposomas de ácido dioleoil-fosfatídico (lipoDOPA), alícuotas de 5 mg/ml de ácido dioleoil-fosfatídico se disolvieron en cloroformo:metanol (1:1). Estas soluciones se secaron al vacío y las películas resultantes se hidrataron en 150 ¡JI de tampón de resuspensión de liposomas (Tris HCI 10 mM, NaCI 100 mM, pH 7,4) durante 30

25 minutos a 37°C. Las suspensiones se pipetearon varias veces y se sometieron a 3 ciclos de 1 min de agitación en vórtex a la velocidad máxima. Las suspensiones lechosas resultantes (que contienen en su mayoría vesículas multilamelares) se transfirieron a tubos Falcon™ conteniendo 450 ¡JI de tampón HBSS. Los liposomas se generaron utilizando una sonda de ultrasonidos UP200S (Dr. Hielscher GmbH). Se

30 aplicaron nueve ciclos de 20 pulsos de 0,5 s cada uno (30% de la amplitud máxima) con una pausa de 20 s entre ellos. Los tubos se mantuvieron en hielo durante la sonicación para evitar el sobrecalentamiento y se sometieron a un corto centrifugado cada 3 ciclos. Los liposomas se añadieron a las células sobre el microscopio de fluorescencia inmediatamente después de la preparación.

CLONAJE y PREPARACiÓN DE LOS BIOSENSORES EN PLÁSMIDOS DE EXPRESiÓN:

Todos los biosensores contienen un dominio de unión a AF obtenido de la proteína

5 SNARE Sp020 de Saccharornyces cerevisiae, que comprende los aminoácidos 51-91 de esta proteína, y las proteínas fluorescentes ECFP y Venus, en este orden (de ami no a carboxi-terminal): ECFP-Sp020(51-91 )-Venus. Además, al extremo N-terminal de la quimera anterior se añadió una señal de direccionamiento para su expresión en diferentes membranas celulares. Los cuatro dominios proteicos anteriores (señal de

10 direccionamiento, ECFP, Sp020(51-91), y Venus o cpVenus) están unidos por tres espaciadores, como se indica en la Fig. 5A. El espaciador 1 une la señal de localización en la membrana con ECFP, el espaciador 2 conecta ECFP y el fragmento Sp020(51-91), mientras que el espaciador 3 conecta Sp020(51-91) con la proteína fluorescente Venus.

15 Para el clonaje se utilizó una batería de seis construcciones de los sensores de calcio llamados Yellow Carne/eon en el vector de expresión pRSETB (Invitrogen), proporcionada por el Dr. Atsushi Miyawaki (BSI, RIKEN, Saitama, Japón). Todos los oligonucleótidos utilizados en los clonajes se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific.

20 Para insertar el espaciador 2, se hibridaron los oligonucleótidos SEQ ID NO: 25 y SEO ID NO: 26, se fosforilaron en el extremo 5' y se clonaron en el sitio de restricción Sphl de la batería de Yellow Carne/eon en pRSETB (en el extremo 3' de ECFP). Con el fin de insertar el espaciador 3, los oligonucleótidos SEO ID NO: 27 y SEO ID NO: 28 se hibridaron, se fosforilaron en 5' y se clonaron en el sitio de restricción de Sacl (en el

25 extremo 5' de Venus o una de sus permutaciones circulares), Las construcciones resultantes se clonaron en los sitios de restricción BamHl/EcoRI del plásmido pcDNA3.1 <Invitrogen), un vector de expresión para células de mamífero.

Respecto a las señales de direccionamiento para la expresión del biosensor en

30 diferentes membranas celulares, para la membrana plasmática se clonaron los doce aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína Iyrnphocyte-specific protein tyrosine kinase (Lck). El péptido Lck (1-12) contiene una señal de acilación que conduce al anclaje de la proteína quimérica en la membrana plasmática intracelularmente, Los oligonucleótidos SEO ID NO: 29 y SEO ID NO: 30 se hibridaron, se fosforilaron en 5' y

35 se clonaron en los sitios de restricción Hindlll/BamHI de la batería de construcciones

en pcDNA3.1. Luego, el espaciador 1 fue insertado entre la secuencia del péptido

Lck(1-12) y ECFP. Para ello, los oligonucleótidos SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 se hibridaron, se fosforilaron en 5' y se clonaron en el sitio de restricción BamHI de la batería de plásmidos en pcDNA3.1.

A continuación, el sitio de restricción Sphl existente antes del espaciador 2 y el sitio restricción Sacl después del espaciador 3 se mutaron en toda la batería de construcciones, para generar dos sitios de restricción BsiWl, utilizando los oligonucleótidos SEa ID NO: 33 y SEO ID NO: 34, respectivamente. La secuencia 10 nucleotídica que codifica para los aminoácidos 51-91 de Sp020 y la misma secuencia con la mutación puntual de Leucina en posición 67 a Prolina (L67P), se extrajeron de GFP_Sp020(51-91 ) y GFP_Sp020(51-91LL67P (Nakanishi H el al. Mol Biol Cell 2004;15(4):1802-1815) utilizando los oligonucleótidos SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y se clonaron en los sitios de restricción BsiW I de la batería de plásmidos 15 pcDNA3.1 , entre los espaciadores 2 y 3. La secuencia mutada Sp020(51-91) L67P dará lugar a un biosensor poseyendo menor afinidad por AF (Nakanishi H et aJ. Mol

Biol CeIl2004;15(4):1802-1815).

Para garantizar buenos niveles de expresión y que el 100% de la traducción empiece

20 en la primera metionina del péptido Lck(1-12), se diseñó una secuencia de Kozac alrededor del codón de iniciación. Sin embargo, en Western bJots de extractos celulares de esta quimera, apareció una banda de peso molecular ligeramente más bajo inmunorreactiva con el anticuerpo anti-GFP, así como una pequeña cantidad de proteína no localizada en la membrana, visible con microscopía de fluorescencia, lo

25 que sugiere que la iniciación de la traducción se llevaba a cabo también en la primera metionina de ECFP. Este problema se resolvió utilizando el oligonucleótido SEa ID NO: 37 para mutar la primera metionina de ECFP a una valina con el fin de alterar su secuencia Kozac menos precisa, pero aún válida.

30 De las seis construcciones anteriores, en experimentos posteriores se seleccionó aquella con Venus cp173, por presentar mayor cambio del espectro de fluorescencia por la unión del AF, la cual se denominó pmPAS (Fig. 3) (ver resultados).

A partir de pmPAS, se generó el biosensor mitPAS mediante la sustitución de la señal 35 de direccionamiento Lck(1-12) por la secuencia que codifica para los aminoácidos 1-33

de la proteína mitocondrial Tom20. La proteína resultante de su expresión lleva la señal de direccionamiento para la membrana mitocondrial externa, con la porción ECFP-Sp020-cpVenus orientada al citoplasma. Para preparar mitPAS, el sitio de restricción Hindlll existente en medio del dominio de unión a AF y el sitio de restricción 5 BamHI en el extremo 3' del espaciador 1 del pmPAS fueron mutados, sin alterar la secuencia de aminoacidos, utilizando los oligonucleótidos SEO ID NO: 38 y 39, para que los oligonucleótidos SEO ID NO: 40 y SEO ID NO: 41 pudieran ser hibridados, fosforilados en 5' y clonados directamente en los sitios de restricción Hindlll y BamHI de pmPAS, sustituyendo el péptido Lck (1-12) por los aminoácidos 1-33 de la proteína

10 mitocondrial Tom20.

La hibridación de oligonucleótidos se realizó en tampón de hibridación (NaCI 50 mM, EDTA 0,1 mM, TrisHCI 10 mM, pH 8,0) mezclando cantidades equimolares de oligonucleótidos complementarios, calentando la mezcla a 95 oC durante 5 minutos y 15 dejando que se enfríe lentamente hasta temperatura ambiente. Las digestiones por enzimas de restricción (Fermentas), ligaciones (Iigasa T4 de Promega), fosforilaciones (PNK de Fermentas), desfosforilaciones (SAP de Fermentas), reacción de polimerasa en cadena (PCR) (Pfu de Fermentas) y muta génesis (QuikChange Lightning Multi SiteDirected Mutagenesis Kit de Agilent Technologies) se realizaron de acuerdo con los

20 protocolos de los fabricantes. El éxito de los clones se rastreó mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), digestión enzimática y por secuenciación (realizada por Macrogen, Corea del Sur, o StabVida, Portugal).

Se verificó el tamaño, integridad y la localización de pmPAS y mitPAS en líneas

25 celulares de mamífero transfectadas (Fig 4). Los plásmidos que codifican para PLD1 y PLD2 fueron descritos anteriormente en la literatura.

ULTRACENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD:

30 Dos placas de cultivo de 100 mm de diámetro conteniendo células HeLa transfectadas confluentes se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Las células se desprendieron mecánicamente de la placa y se recogieron en 1 mi de tampón de lisis (10 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 5 mM de EDTA, 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 20 j..Ig/mlleupeptina, y 20 j..Ig/ml de aprotinina, 1% de Triton X100) y

35 se dejaron en hielo durante 1 h, mezclando periódicamente. Se prepararon soluciones

de sacarosa al 80%, 35% Y 5% (masa/volumen) en tampón de lisis sin detergente o inhibidores de proteasas. El lisado se centrifugó (700 x g, 10 min, 4 OC) Y el sobrenadante postnuclear resultante se diluyó 1:1 con la solución de sacarosa al 80% y se colocó en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga. La solución de sacarosa 5 al 40% resultante que contiene la muestra se estratificó con 4 mi de 35% de sacarosa, 1 mi de 5% de sacarosa y 5,5 mi de tampón de lisis sin inhibidores de proteasas o detergentes. Los tubos se centrifugaron a 39.000 rpm durante 18 horas a 4 oC (rotor SW41Ti, Beckman). Después de la centrifugación, se desecharon los primeros 4,5 mi (la parte superior del tubo) y el contenido del tubo se recogió en nueve fracciones de

10 igual volumen partiendo de la parte superior. Las fracciones se analizaron por Western blo! y do! blo! (ver SDS-PAGE, Wes!ern blo! y do! blo!).

PREPARACiÓN DE USADOS CELULARES, ELECTROFORESIS EN GEL DE POUACRILAMIDA, WESTERN-BLOTY DOT-BLOT

Para comprobar el tamaño de las construcciones, las células transfectadas con los biosensores se trataron con tampón de lisis (el mismo utilizado para la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa) en hielo durante 1 h mezclando periódicamente. Los lisados celulares se centrifugaron a 700 x 9 a 4 oC durante 10 20 minutos. 20 ~I de los lisados celulares anteriormente referidos o 30 ~I de fracciones de ultracentrifugación se aplicaron en geles de poliacrilamida a 10% de sodio dodecil sulfato (SOS). Después de la electroforesis, las proteínas en los geles se transfirieron a membranas Hybond-P (Amersham Biosciences) utilizando un método semiseco (BioRad). Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en TBS + 0,1% 25 Tween® 20 y se sondearon con anticuerpo anti-GFP (Covance, 1:1.000 en 1% de leche desnatada en TBS + 0,1% Tween® 20) durante la noche a 4 oC. Para el análisis de dot-blot, 2 ~I de cada fracción de ultracentrifugación se aplicaron en membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon como se detalla para membranas de PVDF y se sondearon con anticuerpo anti-caveolina-1 (Abcam, 1:1.000 en 1% de 30 leche desnatada en TBS + 0,1% Tween® 20). Las inmunotransferencias se incubaron a continuación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano

(1:1.000 en 1% de leche desnatada en TBS + 0,1% Tween® 20) durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las transferencias se incubaron con ECL Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific) y se detectó la

35 quimioluminiscencia con una cámara CCD Fujifilm LAS-3000.

Ejemplo 1.1: Medición de ácido fosfatídico en la membrana plasmática en células individuales.

5 la proteína Sp020, una proteína SNARE de la levadura Saccharomyces cerevisiae, se une especificamente al AF in vivo (Nakanishi H el al. Mol Biol Cetl 2004;15(4):18021815) y, de hecho, los residuos 51-91 de Sp020 se han fusionado a la proteína fluorescente GFP (GFP-Sp020) para crear un sensor que se transloca del núcleo y citoplasma a la membrana al aumentar los niveles de AF (Du G & Frohman MA Mol

10 Biol Cell 2009;20(1 ):200-208) (Fig. 2). El sensor de translocación GFP-Sp020, a diferencia del biosensor de la invención, no se puede expresar en compartimentos subcelulares como la mitocondria. Hemos utilizado los residuos 51-91 de Sp020, como dominio de unión a AF, para construir sensores de AF capaces de informar dinámicamente sobre los niveles de este fosfolípido en las membranas celulares. la

15 unión del AF a este dominio se traduce en una señal fluorescente por el fenómeno de transferencia de energía por resonancia entre dos proteínas fluorescentes incorporadas al biosensor. Como se ha detallado en Materiales y Métodos, las proteínas quiméricas para determinar AF en la membrana plasmática contienen, desde el extremo N-a C-terminal los siguientes elementos: los residuos 1-12 de la proteína

20 lck (secuencia de direccionamiento a la membrana plasmática), la proteína fluorescente cian ECFP (donador de energía), los residuos 51-91 de Sp020 (dominio de unión a AF), y la proteína fluorescente amarilla Venus (o una de sus variantes permutadas circularmente, cpVenus) (el aceptor de energía) (la Fig. 5A muestra la fusión con Venus cp173). Estos fragmentos están unidos entre sí por tres

25 espaciadores de 37-41 aminoácidos, que sirven para proporcionar flexibilidad entre los dominios descritos anteriormente. Además, dado que la orientación ECFP-Venus (donador-aceptor) en la proteína quimérica es importante para determinar la eficiencia de la transferencia de energía por resonancia, se han ensayado varias orientaciones del aceptor utilizando cinco permutaciones circulares de Venus.

30 En primer lugar se transfectaron transitoriamente células Hela con las quimeras descritas. las proteínas de fusión mostraron bandas únicas del tamaño previsto en extractos de células transfectadas sometidos a Western blot (Fig. 4A), lo que da muestra de su estabilidad en el ambiente celular. las células transfectadas con

35 pmPAS mostraron tinción de membrana plasmática cuando se observaron mediante

microscopía confocal (Fig. 4B). Se ha demostrado que los ésteres de forbol (como el PMA) activan la proteína quinasa C y aumentan la actividad de la fosfolipasa D (PLD), Y por lo tanto incrementan los niveles de AF en la membrana plasmática. Por otro lado, el propranolol inhibe rápidamente la conversión de AF a DAG por las AF fosfatasas 5 (Nishioka T et al. J Biol Che m 2010;285(46):35979-35987) (véase la Fig. 1 con las vías de síntesis y degradación de AF). Por lo tanto, añadimos estos dos compuestos juntos para aumentar los niveles de AF en las células. La adición de PMA y propranolol a las células que expresan las seis quimeras descritas anteriormente (con Venus como aceptar de FRET o con cada una de las cinco variantes de Venus permutadas 10 circularmente) resultó en una disminución de la emisión de la proteína fluorescente Venus (imagen de FRET) y el aumento de ECFP (donador de energía), es decir, la relación ECFP/FRET aumentó (Fig. 38). La variante que mostró un cambio mayor fue la que contiene Venus permutada circularmente en el residuo 173 (Venus cp173). Esta quimera se denominó pmPAS {Qlasma membrane PA Sensor) y se utilizó en

15 experimentos posteriores. pmPAS mostró la relación ECFP/FRET basal más baja (Fig. 3A) Y el mayor aumento de esta relación tras la estimulación (mostró el mayor rango dinámico) (Fig. 38). Cuanto mayor es el rango dinámico de un biosensor en respuesta al ligando, es más fácil de detectar. Los biosensores de la invención presentan el mayor rango dinámico descrito con AF.

20 La acilación del dominio N-terminal de Lck, la secuencia de direccionamiento presente en pmPAS, debe favorecer el anclaje del biosensor en las balsas de lípidos, como se ha demostrado con este dominio en una fusión con GFP. Después de la ultracentrifugación de extractos de células en gradiente de sacarosa, se halló que

25 pmPAS colocaliza con caveolina-1 (un marcador de las balsas lipídicas) en las fracciones de baja densidad (Fig. 6) aunque ambas proteínas también estaban presentes a densidades más altas de dicho gradiente de sacarosa. La presencia de una parte de pmPAS en las balsas de lípidos permite la detección de AF en estos subdominios funcionales.

30 El aumento de AF por inhibición de la AF fosfatasa por el propranolol fue rápido (segundos), y el propranolol potenció el efecto de los ésteres de forbol (Fig. 7A). Estos resultados sugieren que las células HeLa en reposo tienen actividad basal AF fosfatasa y, cuando ésta se inhibe, los niveles de AF aumentan. Al sobreexpresar

35 PLD1 o PLD2 (por co-transfección con pmPAS) se observó un mayor aumento en los niveles de AF por PMA (Fig. 7B). Por otra parte, el aumento de AF por PMA fue

inhibido parcialmente por la preincubación de las células con FIPI, un inhibidor de la

PLD (1 ~M) (Fig 7B).

5 Tras ensayar la estimulación farmacológica de las enzimas citadas, se hizo una estimulación fisiológica con el factor de crecimiento epidérmico, EGF, que se ha utilizado en la literatura para activar la PLD y aumentar los niveles de AF en la membrana. En células HeLa privadas de suero que expresan pmPAS, la adición de EGF resultó en un aumento de la relación de ECFP/FRET (Fig. 7C). Este efecto se

10 bloqueó por la preincubación con el inhibidor de PLD FIPI, lo que sugiere que está mediado por la activación de PLD. También se evaluó el efecto de la introducción de una mutación puntual en el dominio Sp020 de la quimera, que confiere menor afinidad por el AF (Nakanishi H el al. Mol Biol CeI1 2004;15(4):1802-1815). El cambio de Leu 67 a Pro (L67P) en el dominio Sp020 en pmPAS ralentizó la respuesta al propranolol y

15 PMA y disminuyó la magnitud del cambio (Fig. 7D).

Una forma de ensayar la respuesta de los biosensores de AF, además de la manipulación farmacológica o fisiológica descrita anteriormente, fue añadir liposomas con este fosfolípido directamente a las células. La Figura 8 muestra experimentos 20 representativos en células HeLa incubadas con liposomas que contienen ácido dioleoilfosfatídico (lipoDOPA, 200 ~M), lo que resultó en un rápido aumento de la relación de ECFP/FRET, seguido por una recuperación parcial en cuestión de minutos. La respuesta a lipoDOPA fue heterogénea de célula a célula, probablemente debido a la variabilidad en el tamaño de los liposomas y su fusión con las células. El aumento

25 de la relación ECFP/FRET en respuesta a estos liposomas confirma de forma directa la respuesta del biosensor pmPAS a AF.

Referencias de la literatura sugieren que el ácido oleico activa las lipinas (fosfatasas de AF que lo convierten en DAG) probablemente mediante la inducción de su

30 translocación a la membrana plasmática (Fig. 1). De este modo, el ácido oleico debe disminuir los niveles de AF, el efecto contrario del obtenido con propranolol. La incubación de las células con liposomas que contienen una mezcla de fosfatidilcolina y ácido oleico (lipocA, 500 ~M) dio lugar a una rápida disminución de la relación ECFP/FRET, seguida de una lenta recuperación (Fig . 9A Y B). No se observó ningún

35 efecto con liposomas que contienen solo fosfatidilcolina (Fig. 9A).

El biosensor de FRET pmPAS, por lo tanto, es sensible tanto al aumento como a la disminución de los niveles de AF en la membrana plasmática. El resto de variantes de Venus y cpVenus también funcionan como biosensores de AF (Fig. 3), aunque con un

5 menor cambio de FRET para un mismo estímulo.

Ejemplo 1.2: Detección de ácido fosfatídico en la membrana mitocondrial externa a nivel de células individuales.

10 Las mitocondrias expresan PLD6, también conocida como mitoPLD, una fosfolipasa atípica que genera AF utilizando cardiolipina como substrato (Fig. 1). En las mitocondrias, la producción de AF se ha implicado en la fusión y fisión de las mismas. Dado que los niveles de AF en la membrana externa mitocondrial pueden ser regulados o no en concierto con el AF de la membrana plasmática, se hace necesaria

15 la obtención de una proteína de fusión capaz de detectar el AF en la membrana mitocondrial. Por este motivo, dirigimos la expresión del sensor de AF a la membrana externa mitocondrial mediante el uso de un pequeño fragmento de la translocasa Tom20, que es suficiente para dirigir la expresión de una proteína a esta membrana. El fragmento N-terminal de Lck utilizado en la construcción pmPAS fue reemplazado por

20 los residuos 1-33 de Tom20 para producir el indicador mitPAS (mitochondrial PA ~ensor (Fig. 58). La quimera debe anclarse en la membrana mitocondrial externa como una proteína integral de membrana, con los dominios ECFP-Sp020-cpVenus orientados al citoplasma. Las células transfectadas con mitPAS mostraron fluorescencia mitocondrial (cian y amarillo) (Fig. 4C), por lo que la secuencia de

25 direccionamiento funcionó correctamente. La relación ECFP/FRET del biosensor mitPAS en células no estimuladas fue mayor que la de pmPAS (Fig. 10, sin ayuno). Esto podría indicar mayores niveles de AF en estado estacionario en la membrana mitocondrial externa que en la membrana plasmática, pero también podría deberse al diferente modo de anclaje de la porción ECFP-Sp020-Venus a estas membranas.

30 En la membrana mitocondrial externa, como en la membrana plasmática, el propranolol (inhibidor de la AF fosfatasa) causó un aumento rápido en los niveles de AF (Fig. 11A). Tanto la membrana mitocondrial externa como la membrana plasmática parecen tener conversión tónica de AF en DAG. Además, cuando las células fueron

35 estimuladas con EGF aumentaron los niveles de AF> pero con un retraso más largo que en la membrana plasmática (Fig. 11 B). Este cambio se bloqueó por la preincubación con FIPI, como en la membrana plasmática. Tras la estimulación de PLD con ésteres de forbol (PMA), aumentaron los niveles de AF en la mitocondria sin un retraso significativo (Fig. 11 C) y la preincubación con FIPI disminuyó tanto la tasa

5 como la magnitud del cambio de AF inducido por PMA.

Las diacilglicerol quinasas (DGKs) catalizan la conversión de DAG en AF, aumentando los niveles de este último (Fig. 1). El tratamiento de las células con el compuesto R59949 (40 mM), inhibidor de DGK (Fig. 1), disminuyó la relación ECFP/FRET de

10 mitPAS, pero no tuvo ningún efecto sobre pmPAS (Fig. 110). Este hallazgo sugiere que las células HeLa muestran una síntesis tónica de AF a partir de DAG en la membrana mitocondrial externa, pero no en la membrana plasmática.

Se ha usado la retirada del suero del medio de cultivo celular para inducir la autofagia,

15 un proceso en el que mTOR, una proteína regulada positivamente por AF, está involucrada. En la membrana plasmática, la privación de suero durante 14 horas dio como resultado una pequeña, pero estadísticamente significativa, disminución de AF (Fig. 10). Sin embargo, en la membrana mitocondrial externa la relación ECFP/FRET de mitPAS disminuyó significativamente ya después de la privación de suero durante 4

20 horas (Fig. 10). El mecanismo o las enzimas que participan en esta disminución en los niveles de AF no están establecidos.

Por lo tanto, se demostró que las proteínas de fusión de la invención son útiles para detectar y cuantificar AF en la membrana mitocondrial externa.

Ejemplo 1.3: Diferencia en los niveles de AF en la membrana plasmática en

varias líneas celulares de cáncer.

Se compararon los niveles basales de AF en la membrana plasmática de las células

30 HeLa, derivadas de un adenocarcinoma de cuello de útero humano, y las derivadas de cáncer de colon humano HT29 y HCT116. Las células HeLa y las HT29 exhibieron los niveles más bajos y más altos, respectivamente, mientras que las células HCT116 mostraron un valor intermedio (Fig. 12A). Varios tipos de cánceres humanos tienen aumentada la actividad de PLD, lo que sugiere una alta producción de AF. Mientras

35 que las células HeLa no mostraron cambios en los niveles de AF por incubación con FIPI, un inhibidor de PLD, los niveles de AF en membrana plasmática de células HT29 disminuyeron (Fig. 12B), lo que sugiere una alta actividad basal de PLD1/2 en estas células. Al igual que en células Hela, las células HCT116 no mostraron respuesta a la adición de FIPI.

También se estimularon las líneas celulares derivadas de cáncer de colon con PMA. Los niveles de AF en células HT29 no aumentaron tanto como en células HeLa tratadas con PMA (Fig. 12C), lo que apoya que tienen una elevada actividad basal PLD, como se ha indicado anteriormente. De acuerdo con estos resultados, se ha

10 descrito en la literatura una elevada actividad PLD en las balsas lipídicas de células HT29 resistentes a múltiples fármacos . Este resultado sugiere que los biosensores de la invención pueden ser útiles en la caracterización de los niveles de AF en células cancerosas.

15 Ejemplo 1.4: Niveles basales de AF durante la migración celular y la división celular (mitosis).

Durante la migración celular se distingue un polo anterior, en la dirección del movimiento de la célula (leading edge) y un polo posterior (trailing edge), y ambos 20 presentan características bioquímicas diferenciadas. En células HeLa que presentaban polarización, con bordes anterior y posterior bien definidos, se observó un gradiente en los niveles de AF: niveles de AF más altos (mayor ECFP/FRET) en el borde posterior y más bajos (menor ECFP/FRET) en el borde delantero (Fig. 13A Y B). Esta diferencia bioquímica se mantuvo mientras la células permanecian polarizadas. En la figura 13C 25 se representan los valores de ECFP/FRET de una célula que detiene su migración. A medida que la célula retrajo el borde anterior, el gradiente de AF se anuló (Fig. 13C). Por otra parte, durante los experimentos se observaron algunas células en mitosis, en el proceso de división celular de una célula madre a dos células hijas. Antes de la división, las células se redondean y se desprenden de la matriz o superficie de la placa

30 de cultivo, lo que supone una ausencia completa de polarización de la membrana plasmática. De acuerdo con los resultados anteriores, los niveles de AF en la membrana plasmática aumentaron durante la retracción de membrana justo antes de la división y volvieron a disminuir cuando las dos células hijas comenzaron a emitir contactos y extenderse sobre la placa de cultivo (Fig. 13D).

Ejemplo 1.5: Heterogeneidad intracelular en los niveles de AF en células formadoras de procesos de membrana especiales.

Las células de Schwann y oligodendrocitos, in vivo, son las responsables de la mielinización de los axones de las neuronas en el sistema nervioso periférico y sistema nervioso central, respectivamente. Para ello, estas células emiten procesos membranares que exploran el ambiente y que son los responsables de seleccionar y establecer una relación con el axón durante el proceso de mielinización. Así, la producción de estos procesos es crucial para una correcta mielinización. Hemos transfectado pmPAS en células MSC80, una línea celular de células de Schwann, y en células OLN93, una línea celular de oligodendrocitos (ambas de ratón). El análisis del ratio ECFP/FRET en estas células mostró que, en ambas, los niveles de AF son menores en los procesos en comparación con el cuerpo celular (Fig. 14). Así pues, con el uso de los biosensores de la invención, se detecta una menor concentración de AF tanto en el polo anterior de células Hela durante la migración celular, como durante la emisión de procesos en líneas de células de Schwann y oligodendrocitos.

CONCLUSIONES

En la presente invención se han desarrollado nuevos biosensores basados en FRET sensibles a los cambios de los niveles de AF en membranas celulares.

El dominio 51-91 de Sp020 se ha fusionado en el pasado a la proteína fluorescente GFP y se ha utilizado como sensor de AF basado en translocación (GFP-Sp020). Los sensores de translocación pueden inducir a falsos positivos cuando se utiliza microscopía de fluorescencia no confocal, por ejemplo en zonas de membrana plasmática con alta actividad dinámica, donde se provoca localmente un aumento del volumen citoplasmático que se puede confundir con una mayor localización del sensor en membrana. Además. los sensores de translocación poseen menor cociente señal/ruido, mayor susceptibilidad de interferencia por autofluorescencia, y menor resolución espacial que los sensores de la invención basados en FRET. La utilización de etiquetas de anclaje a distintos tipos de membrana en los biosensores de la invención permite que la señal emitida refleje solamente niveles de AF presente en un determinado compartimento celular, lo que es imposible en sensores basados en translocación.

Se han introducido espaciadores de 37-41 aminoácidos entre las subunidades del biosensor. Estos espaciadores están diseñados para introducir las etiquetas de anclaje

5 en el extremo N-terminal de la proteína quimérica, por ejemplo, la etiqueta lck1-12 para el anclaje a la membrana plasmática, y para permitir movilidad de los distintos dominios del biosensor ante la unión del AF.

El aumento de AF inducido farmacológicamente en la membrana plasmática provoca un aumento de intensidad de la fluorescencia de la proteína dadora de energía (ECFP)

10 y una disminución de intensidad de la fluorescencia de la proteína aceptara (Venus o versiones permutadas de Venus) en toda la batería de construcciones probadas, resultando en un aumento del ratio de intensidad ECFP/intensidad de Venus a través de FRET.

la construcción que contiene Sp020(51-91 ) fusionada entre ECFP y Venus cp173

15 (pmPAS) mostró un mayor rango dinámico en respuesta a estímulos que aumentan AF en la membrana plasmática. El biosensor pmPAS ha demostrado sensibilidad y capacidad de percibir aumentos y disminuciones de AF en la membrana plasmática.

la presencia de una etiqueta lck1-12 ha permitido anclar la proteína quimérica en balsas lipídicas de la membrana plasmática pero también en dominios de la membrana

20 plasmática no pertenecientes a balsas lipídicas (Fig. 6), garantizando que no se dejan subdominios fuera del rango de sensibilidad del sensor. Un sensor de FRET para AF desarrollado en el pasado (Nishioka T et al. J Biol ehem 2010;285(46):35979-35987) posee un anclaje de membrana C-terminal CAAX. box, que localiza el sensor en subdominios no pertenecientes a balsas lipídicas, limitando el rango de sensibilidad

25 del sensor a esos subdominios.

los biosensores de la invención han permitido por primera vez detectar cambios en los niveles de AF en la membrana plasmática durante la polarización celular, así como durante la división celular. Se han hallado niveles disminuidos en el polo anterior de células Hela durante la migración celular, así como en los procesos emitidos por

30 líneas celulares de Schwann y oligodendrocitos. Durante la mitosis, las células se redondean y aumentan los niveles de AF en la membrana plasmática.

La sustitución en pmPAS de la etiqueta Lck1-12 por los aminoácidos 1-33 de la proteína Tom20 ha permitido anclar el biosensor en la membrana mitocondrial externa (mitPAS), el cual ha permitido detectar aumentos y disminuciones de AF en esta membrana. Este es el primer biosensor capaz de monitorizar niveles de AF en la membrana mitocondrial externa.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Proteína de fusión fluorescente que comprende:

   a. una subunidad (a) que comprende una proteína con al menos un 70% de 5 identidad con la secuencia SEO ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

   b. una subunidad (b) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (a) que comprende una proteína que se une al ácido fosfatídico con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4; o un fragmento de la misma;

   10 c. y una subunidad (c) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (b) que comprende una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 6 o una permutación circular de la misma o un fragmento de la misma;

   donde las subunidades se unen entre sí sin espaciador o con un polipéptido 15 espaciador.
2. 2. Proteína según la reivindicación 1 donde la sub unidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2.

   20 3. Proteína según la reivindicación 1 donde la sub unidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4.
3. 4 . Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO:6.
4. 5. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2, la subunidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4 y la subunidad (e) consiste en la SEO ID NO: 6.

   30 6. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 8.

5. 7.

   Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 10.

6. 8.

   Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEa ID NO: 12.

7. 9. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID 5 NO: 14.
8. 10. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEa ID NO: 16.

   10 11. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende la secuencia SEa ID NO: 18 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a).

9. 12.

   Proteína según la reivindicación 1 donde la proteína de fusión consiste en la proteína de secuencia SEO ID NO: 20.

10. 13.

    Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende la secuencia SEa ID NO: 22 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a).

11. 14. Proteína según la reivindicación 1 donde la proteína de fusión consiste en la 20 proteína de secuencia SEO ID NO: 24.
12. 15. Secuencia nucleotídica que comprende la secuencia que codifica una proteina de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

    25 16. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 15 donde dicha secuencia consiste en la SEa ID NO: 19.
13. 17. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 15 donde dicha secuencia consiste en la SEa ID NO: 23.
14. 18. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.
15. 19. Uso de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o de 35 la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para la detección y/o cuantificación in vitre del ácido fosfatídico en una célula o en un tejido.
16. 20. Uso según la reivindicación 19 donde el ácido fosfatídico se localiza en la 5 membrana plasmática.
17. 21. Uso según la reivindicación 19 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana mitocondrial.

    10 22. Kit que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o la célula según la reivindicación 18.
18. 23. Uso del kit según la reivindicación 22 para la detección y/o cuantificación in vitro 15 del ácido fosfatídico en una célula o en un tejido o en un extracto celular.
19. 24. Uso según la reivindicación 23 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana plasmática.

    20 25. Uso según la reivindicación 23 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana mitocondrial.
20. 26. Procedimiento de obtención de la proteína de fusión según cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 14 que comprende cultivar una célula según la reivindicación 25 18 en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas.
21. 27. Método para el análisis cuantitativo de los niveles de ácido fosfatídico que comprende:

    a. poner en contacto una célula o tejido o extracto celular con la proteína de

    30 fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o con la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17;

    b.

    anclaje de la proteína de fusión a una membrana celular;

    c.

    detectar y cuantificar la fluorescencia emitida, proporcional a la presencia de ácido fosfatídico.

22. 28. Método según la reivindicación 27 que además comprende, para el cribado de ligandos de receptores de membrana o de enzimas, entre el paso (b) y el paso (c) estimular la célula o el tejido con una sustancia, donde la célula o el tejido expresa un receptor de membrana acoplado a la liberación o metabolización de ácido fosfatídico, o una enzima que sintetiza o degrada el ácido fosfatídico.