ES2533770T3 - N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, métodos de tratamiento usando dicha enzima y métodos para producir y purificar dicha enzima - Google Patents

Abstract

Composición que comprende N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora, en la que dicha Nacetilgalactosamina- 4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99% basándose en la proteína total, en la que dicha pureza se mide usando el método de fase inversa HPLC (RP-HPLC) y en la que la composición está libre de bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie.

Description

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También preferiblemente, la pureza de la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora (ASB) es tal que la composición tiene sólo cantidades traza de formas procesadas o degradadas. Las proteasas presentes en las células huésped escinden la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa en formas de peso molecular inferior. Aunque

5 algunas de estas formas también pueden ser enzimáticamente activas, la forma precursora es preferible para la captación celular y el direccionamiento lisosómico y por tanto, es deseable una cantidad superior de ASB precursora no procesada en la preparación final. Además, las formas degradas de ASB en el producto terminado también pueden dar lugar a una incidencia o cantidades superiores de anticuerpos frente a la propia ASB, lo que es sumamente indeseable en casos tales como aquellos en los que se requiere terapia a largo plazo de los pacientes. El proceso de purificación por perfusión descrito en el presente documento da como resultado una preparación altamente pura que está esencialmente libre de proteínas de célula huésped contaminantes o formas procesadas/agregadas de ASB tal como se somete a ensayo mediante la combinación de SDS-PAGE, RPHPLC y SEC-HPLC. Cuando se administra a seres humanos, el producto producido mediante este proceso parece tener una semivida más larga.

15 La indicación para la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana recombinante (rhASB) es para el tratamiento de MPS VI, también conocida como síndrome de Maroteaux-Lamy. Según las realizaciones preferidas, se proporciona una dosis inicial de 1 mg/kg (~50 U/kg) a pacientes que padecen una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4sulfatasa. Preferiblemente, la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa se administra semanalmente mediante inyección. Según otras realizaciones preferidas, los pacientes que no demuestran una reducción en excreciones urinarias de glicosaminoglicanos de al menos el cincuenta por ciento se cambian a una dosificación de 2 mg/kg (~100 U/kg) en el plazo de aproximadamente tres meses de la dosificación inicial. Preferiblemente, la N-acetilgalactosamina-4sulfatasa (rhASB) o un fragmento, mutante o análogo biológicamente activo de la misma se administra por vía intravenosa a lo largo de un periodo de aproximadamente cuatro horas una vez a la semana preferiblemente

25 mientras que persistan síntomas clínicos significativos de la enfermedad. Además, preferiblemente, la Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa (rhASB) se administra mediante un catéter intravenoso colocado en la vena cefálica u otra vena apropiada con una infusión de solución salina comenzando a aproximadamente 30 cc/h. Además, preferiblemente la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (rhASB) se diluye en aproximadamente 250 cc de solución salina normal.

En un segundo aspecto, la presente invención presenta composiciones farmacéuticas novedosas que comprenden N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora, en las que dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora tiene una pureza al menos igual al, o mayor del 99% basándose en la proteína total, en las que dicha pureza se mide usando el método de HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y en las que la composición está libre de 35 bandas detectables de aproximadamente 47-48 kDa tras la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) con tinción de Coomassie, opcionalmente en las que dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana precursora es una N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora recombinante para el tratamiento de una deficiencia en N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa. La enzima recombinante puede administrarse de varias formas además de las realizaciones preferidas descritas anteriormente, tal como administración parenteral, tópica, mediante inhalación u oral. Otro aspecto de la invención es proporcionar la administración de la enzima formulándola con un portador farmacéuticamente aceptable que puede ser sólido, semisólido o líquido o una cápsula que pueda ingerirse. Los ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen comprimidos, gotas tales como gotas nasales, composiciones para aplicación tópica tales como pomadas, gelatinas, cremas y suspensiones, aerosoles para inhalación, pulverizador nasal, liposomas. Habitualmente, la enzima recombinante comprende entre el 0,05 y el 99%

45 o entre el 0,5 y el 99% en peso de la composición, por ejemplo entre el 0,5 y el 20% para composiciones destinadas a inyección y entre el 0,1 y el 50% para composiciones destinadas a administración oral.

Para producir composiciones farmacéuticas en esta forma de unidades de dosificación para aplicación oral que contienen una enzima terapéutica, la enzima puede mezclarse con un portador sólido, pulverulento, por ejemplo lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, un almidón tal como almidón de patata, almidón de maíz, amilopectina, polvo de laminaria o polvo de pulpa de limón, un derivado de celulosa o gelatina y también pueden incluir lubricantes tales como estearato de magnesio o calcio o un Carbowax u otras ceras de polietilenglicol y comprimirse para formar comprimidos o núcleos para grageas. Si se requieren grageas, los núcleos pueden recubrirse por ejemplo con disoluciones de azúcar concentradas que pueden contener goma arábiga, talco y/o dióxido de titanio, o

55 alternativamente con un agente de formación de película disuelto en disolventes orgánicos fácilmente volátiles o mezclas de disolventes orgánicos. Pueden añadirse colorantes a estos recubrimientos, por ejemplo, para distinguir entre contenido diferente de principio activo. Para la composición de cápsulas de gelatina blanda que consisten en gelatina y, por ejemplo, glicerol como plastificante, o cápsulas cerradas similares, el principio activo puede mezclarse con un Carbowax o un aceite adecuado como por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de oliva o aceite de cacahuete. Las cápsulas de gelatina dura pueden contener granulados del principio activo con portadores sólidos, pulverulentos tales como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones tales como almidón de patata, almidón de maíz o amilopectina, derivados de celulosa o gelatina, y también pueden incluir estearato de magnesio o ácido esteárico como lubricantes.

65 Las enzimas terapéuticas de la presente invención también pueden administrarse por vía parenteral tal como mediante inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa, o bien mediante inyección individual o infusión de

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unida al receptor de manosa-6-fosfato, la enzima se somete a endocitosis a través de depresiones recubiertas y se transporta a los lisosomas. Al pH de los lisosomas, la enzima es activa y comienza eliminar residuos de sulfato procedentes del sulfato de dermatano acumulado. En los fibroblastos en MPS VI, el aclaramiento del almacenamiento es rápido y se demuestra fácilmente en el plazo de 92 horas de la exposición enzimática (Anson, et

5 al., J. Clin. Invest. 99:651-662 (1997)). La enzima recombinante puede producirse a una escala de fermentación de 110 l (volumen de trabajo de aproximadamente 90 l) según un proceso según el diagrama de flujo explicado resumidamente en la figura 1.

La enzima recombinante puede producirse usando el siguiente método tal como se expone en la tabla 1A-C. 10 Tabla 1A: Proceso de cultivo celular mediante el proceso discontinuo alimentado

Etapa

Proceso Prueba en proceso

1. Descongelación del Banco de Células de Trabajo (WCB)

• Inocular las células descongeladas en un matraz T-75 con 25 ml de medio Exell 302 de JRF complementado con L-glutamina 4 mM, glucosa 4,5 g/l e hipoxantina/timidina 10 mg/l; complementado adicionalmente con ácido fólico, serina y asparagina (sin G418) • Cultivar durante 3 días para lograr una densidad de 1 x 1010 células • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

3. Matraz de agitación de 250 ml

• Añadir células a 175 ml de medio complementado (sin G418) • Cultivar durante 3 días • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

4. Matraz de agitación de 1 l

• Añadir células a 800 ml de medio complementado (sin G418) • Cultivar durante 1-2 días • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

5. Matraz de agitación de 8 l

• Añadir células a 4 l de medio complementado (sin G418) • Cultivar durante 1-2 días • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

6. 2 x Matraces de agitación de 8 l

• Dividir volumen de trabajo en 2 matraces de agitación de 8 l • Añadir células a 5,5 l de medio complementado (sin G418) a cada matraz de agitación de 8 l • Cultivar durante 1-2 días • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

7. Inoculación de biorreactor de 110 l

• Añadir células a 7 ml de medio complementado • Cultivar durante 9 días • Recuento celular • Viabilidad celular

↓

8. Producción

• Aproximadamente 9 días de crecimiento en biorreactor • Recuento celular • Viabilidad celular • Actividad

↓

9. Recogida del sobrenadante

• La recogida se bombea al interior de una bolsa de 100 l, refrigerada durante la noche

↓

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10. Retirada de células

• Las células se retiran del medio de recogida mediante filtración a través de un cartucho de membrana de 10 µm seguido por cartuchos de 1 µm y 0,2 µm. Puesto que se ha permitido que las células sedimenten durante la noche, del 5 al 10% final del medio de recogida se descarta antes de la filtración. Punto de descarga de QC • Actividad • Carga biológica • Endotoxina • Micoplasmas • Agentes adventicios in vitro

En una realización, las células transfectadas se hacen crecer en un proceso de cultivo celular que es un proceso basado en perfusión con recogidas que continúan durante hasta 35 o más días con una tasa de recogida de aproximadamente 400 l por día de un biorreactor de 110 l. Preferiblemente, la tasa de recogida es de

5 aproximadamente 800 l por día desde un biorreactor de 110 l. En la tabla 1B se muestra un diagrama de flujo del proceso que compara el proceso de cultivo celular por perfusión con el proceso de cultivo celular discontinuo. En la tabla 1C se resumen las comparaciones para el proceso discontinuo alimentado así como detalles de los cambios específicos implementados para el proceso de cultivo celular basado en perfusión.

10 Tabla 1B: Comparación del proceso de cultivo celular entre los procesos discontinuo alimentado y de perfusión

Proceso discontinuo

Proceso de perfusión

1 vial de Banco de Células de Trabajo (WCB)

1 vial de WCB

↓ ↓

Matraz T de 75 cm2

Matraz T de 75 cm2

↓ ↓

Matraz de agitación de 250 ml

Matraz de agitación de 250 ml

↓ ↓

2 x Matraces de agitación de 250 ml

2 x Matraces de agitación de 250 ml

↓ ↓

2 x Matraces de agitación de 3 l

2 x Matraces de agitación de 3 l

↓ ↓

2 x Matraces de agitación de 8 l

2 x Matraces de agitación de 8 l

↓ ↓

1 x biorreactor de 110 l (volumen de trabajo de 75-85 l) 2 x biorreactores de 110 l

Modo discontinuo, 1-3 días (volumen de trabajo de 85-95 l) Modo discontinuo, 11-12 días

1 x biorreactor de 110 l (volumen de trabajo de 75-85 l) Duración del cultivo de hasta 35 días

↓ ↓

Recogida almacenada en bolsas de polietileno de 200 l

Recogida almacenada en bolsas de polietileno de 200 l

Tabla 1C: Descripción resumen de las diferencias entre los procesos discontinuo alimentado y de perfusión

Etapa de producción

Descripción (discontinuo) Descripción (perfusión)

CULTIVO CELULAR

Un lote es el resultado de una serie de producción con dos biorreactores de 110 l. Cambio: Un lote es el resultado de una serie de producción con un biorreactor de 110 l

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Descongelación del vial de WCB

Un vial por cada lote de producción: Pruebas: Viabilidad celular esperada > 95% Se esperan ≥ 1 x 106 células recuperadas Cambio: Viabilidad celular: > 90% Una viabilidad > 90% en la descongelación ha demostrado producir series y producto satisfactorios que cumplen las especificaciones

↓

Matraces T de 75 cm 2

Aproximadamente 5 x 106 células sembradas en 1 matraz. Duración de la etapa: ~ 3 días Pruebas: Viabilidad celular esperada > 90% Se esperan ≥ 2 x 107 células recuperadas Sin cambios

↓

Matraz de agitación de 250 ml

Las células de T75 se dividen en un matraz de agitación de 250 ml Duración de la etapa: ~ 2 días Pruebas: Viabilidad celular esperada > 90% Se esperan ≥ 2 x 108 células recuperadas Sin cambios

↓

2 x Matraces de agitación de 250 ml

Las células de 1 x matraz de agitación de 250 ml se dividen en dos matraces de agitación de 250 ml Duración de la etapa: ~ 3 días Pruebas: Viabilidad celular esperada > 90% Se esperan ≥ 4 x 108 células recuperadas Sin cambios

↓

2 x Matraces de agitación de 3 l

Las células de 2 x matraces de agitación de 250 ml se dividen en dos matraces de agitación de 3 l Duración de la etapa: ~ 4 días Pruebas: Viabilidad celular esperada > 90% Se esperan ≥ 4,8 x 109 células recuperadas Sin cambios

↓

2 x Matraces de agitación de 8 l

Las células de 2 x matraces de agitación de 3 l se dividen en dos matraces de agitación de 8 l Duración de la etapa: ~ 2 días Pruebas: Viabilidad celular esperada > 90% Se esperan ≥ 1,6 x 1010 células recuperadas Sin cambios

↓

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Inoculación de matraz de cultivo

Se añade un inóculo ≥ 0,8 x 1010 células a cada uno de dos biorreactores que contienen 32 l de medio de cultivo cada uno. El cultivo se monitoriza con un sistema de control interconectado a PC Cambio: Se añade un inóculo ≥ 1,6 x 1010 células a un biorreactor que contiene 64 l de medio de cultivo. (Refleja el uso de un biorreactor frente a dos).

↓

Producción

Crecimiento: 3 días de crecimiento hasta que el cultivo alcanza una densidad > 3,2 x 1010 células. División vertical: Medios de cultivo añadidos al volumen final de 95 l Recogida: Se recogió el sobrenadante en el día 11 o cuando la viabilidad celular disminuyó por debajo del 70%. Se filtra y se almacena el sobrenadante Cambios: Crecimiento/Transición/Recogida: Cuando la densidad celular alcanza > 8 x 1010 células/ml, se inicia la perfusión. La tasa de perfusión se aumenta gradualmente hasta 5 volúmenes de recipiente por día basado en los niveles de glucosa. Cuando la densidad celular es > 1,28 x 1012, se ajusta el punto de ajuste de pH a 7,35. Una vez que cesan los aumentos en las tasas de perfusión, se mantiene el nivel de glucosa reduciendo la densidad celular con una purga de células. Se recupera y se filtra el sobrenadante recogido.

Terminación

Se termina la serie en la recogida Cambio: Se termina la serie una vez alcanzados 35 o más días, o la actividad disminuye por debajo de 2 mg/l durante tres días consecutivos o una vez que se ha recuperado sobrenadante recogido adecuado.

La preparación del inóculo para el proceso de ampliación a escala es la misma para los procesos discontinuo alimentado y de perfusión. En una realización, se inicia el cultivo de células con rhASB descongelando un único vial del Banco de Células de Trabajo y transfiriendo su contenido (aproximadamente 1 ml) a aproximadamente 25 ml de 5 medio EX-CELL 302 (modificado con L-glutamina, sin rojo fenol) en un matraz de cultivo celular T de 75 cm2. En cada etapa de expansión, se incuba el cultivo celular hasta que se logra un recuento de células viables de aproximadamente 0,8 x 106 células/ml. Se monitoriza cada etapa de expansión de células para determinar el crecimiento celular (densidad celular) y la viabilidad celular (a través de exclusión con azul de tripano). Todas las adiciones de medio EX-CELL 302 (modificado con L-glutamina, sin rojo fenol) y transferencias de células se realizan

10 asépticamente en una campana de flujo laminar. Se expande el cultivo celular secuencialmente del matraz T de 75 cm 2 a un matraz de agitación de 250 ml, a dos matraces de agitación de 250 ml, a dos matraces de agitación de 3 l y finalmente a dos matraces de agitación de 8 l. Todo el proceso de ampliación a escala dura aproximadamente 14 días. Cuando los dos matraces de agitación de 8 l están a una densidad de al menos 1,0 x 106 células/ml, se usan los frascos para sembrar un biorreactor de 110 l.

15 Se prefiere que las operaciones del biorreactor para la expresión o producción o fabricación de rhASB utilicen un proceso de cultivo celular basado en perfusión. Preferiblemente, el biorreactor, que usa el proceso de perfusión, puede controlar densidades celulares de hasta 37 millones de células por ml, en comparación con 4-5 millones de células por ml usando el proceso discontinuo alimentado.

20 El proceso basado en perfusión tarda más (35 días) que el proceso discontinuo alimentado (11-12 días) y produce un volumen mayor de fluido de cultivo celular recogido (aproximadamente 400 l/día a una tasa de perfusión de 5 volúmenes de recipiente por día) en comparación con el proceso discontinuo alimentado (190 l/serie). Preferiblemente, la recogida se realiza hasta 35 días para una recuperación total de aproximadamente 8400 l de

25 sobrenadante.

Se evalúa el final de las células de producción (EPC) para determinar la estabilidad genética, identidad, esterilidad y contaminación por agente adventicio según la directriz de la ICH. Preferiblemente, los resultados de EPC, obtenidos a partir de una serie en biorreactor de 35 días de duración, AC60108, producido en condiciones de cGMP, no

30 muestran crecimiento ni resultados negativos ni detección de la presencia de bacterias y hongos, micoplasmas, contaminantes virales adventicios, virus murinos o contaminantes o partículas similares.

En el presente documento se muestra una línea celular transgénica que presenta la capacidad para producir Nacetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB) o un fragmento, mutante o análogo biológicamente activo de la misma en 35 cantidades que permiten usar la enzima terapéuticamente. En el presente documento se muestra también una línea celular de ovario de hámster chino recombinante tal como la línea celular CHO K1 que produce de manera estable y

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fiable cantidades de N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB) que permiten usar la enzima terapéuticamente. Se prefiere especialmente la línea celular CHO-K1 designada CSL4S-342. En algunas realizaciones preferidas, la línea celular contiene uno o más de un constructo de expresión. Más preferiblemente, la línea celular contiene aproximadamente 10 o más copias del constructo de expresión. En realizaciones incluso más preferidas, la línea

5 celular expresa N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa recombinante (ASB) en cantidades de al menos aproximadamente 20-80 ó 40-80 microgramos por 107 células por día.

La N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana recombinante (rhASB) puede producirse a partir de una línea celular CHO-K1 (ovario de hámster chino) transfectada estable designada CSL4S-342. La línea celular de describe en la

10 bibliografía (Crawley, J.Clin.Invest. 99:651-662 (1997)). Se prepararon el Banco de Células Maestro (MCB) y el Banco de Células de Trabajo (WBC) en Tektagen Inc. (Malvern, PA). Los bancos de células se han caracterizado por las directrices recomendadas de la ICH para una línea celular recombinante de mamífero.

En el presente documento se muestran vectores novedosos adecuados para producir N-acetilgalactosamina-4

15 sulfatasa (ASB) o un fragmento, mutante o análogo biológicamente activo de la misma en cantidades que permiten usar la enzima terapéuticamente.

Se describen en el presente documento, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa novedosa (ASB) o un fragmento, mutante o análogo biológicamente activo de la misma producida según los métodos que se muestran en el presente 20 documento y por tanto presente en cantidades que permiten usar la enzima terapéuticamente. La actividad específica preferida de la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (ASB) según la presente invención es de aproximadamente 20-90 unidades y más preferiblemente mayor de 50 unidades por miligramo de proteína. Preferiblemente, la enzima tiene un peso desglicosilada de aproximadamente 55 a 56 kDa, lo más preferiblemente de aproximadamente 55,7 kDa. Preferiblemente, la enzima tiene un peso glicosilada de aproximadamente 63 a 68

25 kDa, lo más preferiblemente de aproximadamente 64 a 66 kDa. La presente invención también incluye fragmentos biológicamente activos incluyendo moléculas truncadas, análogos y mutantes de la N-acetilgalactosamina-4sulfatasa humana que se produce de manera natural.

El ADNc humano para la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa prevé una proteína de 533 aminoácidos con un péptido

30 señal de 41 aminoácidos (Peters, et al. J. Biol. Chem. 265:3374-3381). El peso molecular previsto es de aproximadamente 55,9 kDa tras la escisión del péptido señal. La enzima recombinante tiene un peso molecular aparente de 64 kDa en SDS-PAGE debido a modificaciones de hidratos de carbono. La secuencia de proteína prevista contiene seis posibles sitios de modificación de oligosacárido unidos a N de los que cuatro pueden usarse basándose en una masa promedio de 2.000 kDa y una diferencia de 8.000 kDa entre la masa prevista y la aparente.

35 Una forma madura de la proteína intracelular tiene tres péptidos unidos mediante enlaces de cistina. El péptido más grande tiene un peso molecular de 47 kDa; los otros dos tienen un peso molecular de 6 y 7 kDa, respectivamente.

En la tabla 2 se proporciona una descripción de un producto terminado producido y purificado según los métodos de la presente invención.

40 Tabla 2: Especificaciones preliminares del producto terminado

Prueba

Procedimiento Especificación

Actividad

Ensayo de fluorescencia 20.000 – 120.000 mUnidades

Virus adventicios*

Ensayo in vivo Pasa

Aspecto

Visual Disolución transparente, de incolora a amarillo claro

Endotoxina bacteriana

LAL ≤ 2 EU/ml

Cloruro

Absorción atómica Notificar valor

Ensayo de captación de fibroblastos con ASB

TBD ≤ 40 nmol

Micoplasmas*

Puntos a considerar 1993 Pasa

Materiales particulados

USP ≤ 600/vial a 25 µm y ≤ 6000/vial a 10 µm

pH

USP 5,5-6,8

Fosfato

Absorción atómica Notificar resultado

Concentración de proteínas

UV 280 0,8 -1,2 mg/ml

Pureza

SDS-PAGE 1 banda principal entre 65 – 70 kDa

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• Tampón de separación: • Tampón de desinfección: • Tampón de almacenamiento:

NaCl 1 M, NaPO4 10 mM pH 7,3 NaOH 0,5 N NaOH 0,1 N

↓

3. Blue Sepharose FF

• Prelavado 1: • Prelavado 2: • Prelavado 3: • Tampón de equilibrado: • Carga: • Tampón de lavado: • Tampón de elución: • Tampón de regeneración: • Tampón de desinfección: • Tampón de almacenamiento: ETOH al 20% NaOH 0,1 N H2O NaAc 1 M, pH 5,5 NaCl 150 mm, NaAc 20 mM pH 5,5 Flujo a través de DEAE NaCl 150 mM, NaAc 20 mM, pH 5,5 NaCl 500 mM, NaAc 20 mM pH 5,5 NaCl 1 M, NaAc 20 mM pH 5,5 NaOH 0,1 N, 0,5-2 horas NaCl 500 mM, NaAc 20 mM, pH 5,5

↓

4. Cu++ Chelating Sepharose FF

• Tampón de desinfección: • Tampón de lavado: • Tampón de carga: • Tampón de equilibrado: • Carga: • Tampón de lavado 1: • Tampón de lavado 2: • Tampón de lavado 3: • Tampón de elución: • Tampón de separación: • Tampón de desinfección: • Tampón de almacenamiento: NaOH 0,1 N H2O Sulfato de cobre 0,1 M NaAc 20 mM, NaCl 0,5 M, glicerol al 10%, pH 6,0 Eluato de Blue Sepharose NaAc 20 mM, NaCl 0,5 M, glicerol al 10%, pH 6,0 NaAc 20 mM, NaCl 1 M, glicerol al 10%, pH 4,0 NaAc 20 mM, NaCl 1 M, glicerol al 10%, pH 3,8 NaAc 20 mM, NaCl 1 M, glicerol al 10%, pH 3,6 EDTA 50 mM, NaCl 1 M NaOH 0,5 N, 0,5-2 horas NaOH 0,1 N

↓

5. Phenyl Sepharose HP

• Tampón de prelavado 1: • Tampón de prelavado 2: • Tampón de equilibrado: • Carga: • Tampón de lavado 1: • Tampón de lavado 2: • Tampón de elución 1: • Tampón de separación: • Tampón de desinfección: • Tampón de almacenamiento: NaOH 0,1 N H2O NaCl 3 mM, NaAc 20 mM, pH 4,5 Eluato de Cu++ Chelating Sepharose NaCl 3,0 M, NaAc 20 mM, pH 4,5 NaCl 1,5 M, NaAc 20 mM, pH 4,5 NaCl 1,0 M, NaAc 20 mM, pH 4,5 NaCl 0 M, NaAc 20 mM, pH 4,5 NaOH 0,5 N NaOH 0,1 N

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↓

6. UF/DF

La rhASB purificada se concentra y diafiltra hasta una concentración final de 1,5 mg/ml en tampón de formulación (NaCl 150 mM, NaPO4 10 mM, pH 5,8) usando un sistema de TFF.

↓

7. Formulación (si es necesario)

• Diluir con tampón de formulación adicional hasta 1,0 mg/ml

↓

8. Reducción viral/filtración estéril

• Filtración en 0,02 µm en recipiente estéril

↓

9. Disposición en vial

• Producto lleno en viales de vidrio de 5 cc de tipo 1, cerrados manualmente, apretados y etiquetados.

El principio activo a granel formulado puede esterilizarse a través de un filtro de 0,04 micrómetros o preferiblemente de 2 micrómetros en una campana de flujo laminar de clase 100 en viales de vidrio de tipo 1. Los viales pueden llenarse hasta un volumen final de aproximadamente 5 ml usando una máquina de llenado de líquido

5 semiautomática. Entonces los viales pueden taparse, sellarse y etiquetarse.

Un método más preferido para purificar una N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora comprende: (a) obtener un fluido que contiene N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora; (b) reducir la actividad proteolítica de una proteasa en dicho fluido que puede escindir la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora, en el que dicha reducción no 10 daña a dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora; (c) poner en contacto el fluido con una resina de cromatografía de interacción con el colorante azul Cibracon; (d) poner en contacto el fluido con una resina de cromatografía de quelación de cobre; (e) poner en contacto el fluido con una resina de cromatografía de interacción hidrófoba con fenilo; y (f) recuperar dicha N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora. De manera preferible, las etapas (c), (d) y (e) se realizan secuencialmente. Este método requiere no más de tres etapas o columnas de

15 cromatografía. Con el fin de obtener N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora altamente purificada, no se requieren etapas o columnas de cromatografía adicionales. Este método no comprende que el fluido se ponga en contacto con una resina de DEAE Sepharose. La N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora recuperada tiene una pureza al menos igual al o mayor del 99%. El rendimiento de recuperación global puede ser de al menos aproximadamente el 40-60%.

20 Preferiblemente, obtener el fluido que contiene la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora comprende hacer crecer un cultivo de células transformadas con un gen que codifica para N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa; preferiblemente, el gen codifica para la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana. Preferiblemente, las células son células de mamífero. Más preferiblemente, las células de mamífero son células de ovario de hámster chino. La etapa

25 de obtención puede comprender adicionalmente recoger el fluido de dicho cultivo de células. La etapa de obtención puede comprender además concentrar dicho fluido hasta aproximadamente 20x.

Una característica de este método es una separación temprana de la actividad proteasa y la N-acetilgalactosamina4-sulfatasa precursora. Esta separación puede comprender o bien (1) la reducción, inhibición o inactivación de la 30 actividad proteasa, o bien (2) la separación física de la(s) proteasa(s) de la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora. Preferiblemente, esta separación se produce lo antes posible durante el proceso de purificación. El fin es mantener a un mínimo el número de moléculas de N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora que se están escindiendo para dar lugar a la forma madura o procesada y/u otra(s) forma(s) degradada(s). La forma precursora de N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa es la forma preferida, en contraposición a la forma madura o procesada,

35 porque se capta más fácilmente en el tejido diana y por el posterior direccionamiento al lisosoma. Cuanto antes se separe la actividad proteasa de la N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora menor será el número de moléculas de la forma precursora que se escindirá en la forma madura o procesada.

La actividad de la proteasa se reduce o inhibe ajustando el fluido hasta un valor de pH de entre aproximadamente

40 4,8 y 8,0. Preferiblemente, el valor de pH está entre aproximadamente 4,8 y 5,5. Más preferiblemente, el valor de pH está entre aproximadamente 4,8 y 5,2. La actividad proteasa específica que se desea reducir es la actividad proteasa que escinde específicamente la forma precursora de N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa en las formas maduras o procesadas. La actividad proteasa se encuentra en una o más cisteína proteasas. Una cisteína proteasa que escinde específicamente N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa precursora es catepsina L. Esta catepsina L tiene un

45 peso molecular de aproximadamente 36 kDa en su forma inactiva que se convierte en sus formas activas de 21-29 kDa en tamaño tras la exposición a pH inferior a 5,0 (véase la figura 9C). El pH puede ajustarse a cualquier valor por el que la(s) proteasa(s) no se convierte(n) de su forma activa a su forma inactiva y la N-acetilgalactosamina-4sulfatasa precursora deseada, o actividad biológica de la misma, no resulta dañada o dañada irreversiblemente.

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Por tanto, los números reales obtenidos a partir del ELISA de proteínas de impureza son cuestionables y los números de RP-HPLC se basan en una base más firme.

Además, el análisis de SDS-PAGE permite la detección tanto de impurezas de células huésped como de formas

5 procesadas o degradadas del producto de proteína terminado deseado. Cuando se usa conjuntamente con inmunotransferencia de tipo Western, las impurezas no relacionadas con el producto procedentes de contaminantes de la célula huésped pueden diferenciarse de las impurezas relacionadas con el producto. Finalmente, SEC-HPLC permite un nivel de cuantificación de impurezas relacionadas con el producto porque puede detectar impurezas de pesos moleculares diferentes, incluyendo formas procesadas o degradadas de peso molecular inferior de la proteína

10 así como monómeros, dímeros y otros multímeros.

En la tabla 4 se representa una realización de este método de purificación.

Tabla 4: Método de purificación

Etapa

Proceso

Filtración de producto recogido

■ Filtración a través de filtros de clarificación, filtros de 0,45 µm y finalmente filtro de 0,2 µm. ■ Los productos recogidos combinados filtrados se almacenan en bolsas de polipropileno

Concentración por UF

■ Equilibrado y purgado: fosfato de sodio 100 mM, pH 7,3 ■ Carga: Fluido recogido filtrado ■ Concentración: Concentración hasta 20X ■ Filtración: Filtrar el producto diluido a través de un filtro de 0,2 µm en un recipiente de almacenamiento

Ajuste del pH y filtración

■ Ajuste del pH: añadir ácido acético glacial al 10% a concentrados 20X combinados hasta un pH final igual o inferior a aproximadamente 7,3; preferiblemente, el pH es aproximadamente de 4,0 a 7,3; más preferiblemente, el pH es aproximadamente de 4,5 a 5,5; incluso más preferiblemente, el pH es aproximadamente de 5,0 ■ Carga: Concentrados 20X combinados ■ Aclarado: Agua para inyección (WFI) ■ Filtración a través de filtros de clarificación y filtro de 0,2 µm. ■ Purgado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 120 mM, pH 5,0 ■ El rendimiento de recuperación puede ser de al menos aproximadamente el 83%

Columna de cromatografía de interacción con colorante azul Cibracon (Blue Sepharose 6 FF) (Blue, Blue Sepharose)

■ Prelavado: hidróxido de sodio 0,1 N ■ Lavado: Agua para inyección (WFI) ■ Equilibrado: Fosfato de sodio 10 mM, el pH es inferior a aproximadamente 6,5; preferiblemente, el pH es aproximadamente de 5,0 a 6,5; más preferiblemente, el pH es aproximadamente de 6,45 ■ Carga: Concentrados 20X combinados filtrados y con pH ajustado ■ Lavado: Fosfato de sodio 10 mM, pH 6,45 ■ Elución: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 125 mM, pH 6,45 ■ Regeneración: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45 ■ Desinfección: Hidróxido de sodio 0,1 N ■ Lavado 1: Agua para inyección (WFI) ■ Lavado 2: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45 ■ Almacenamiento: Etanol al 20% ■ El rendimiento de recuperación puede ser de al menos aproximadamente el 84%

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Columna de cromatografía de quelación de cobre (Chelating Sepharose FF) (Copper, CC, Copper Chelating)

■ Prelavado: Hidróxido de sodio 0,1 N ■ Lavado: Agua para inyección (WFI) ■ Tampón de carga: Sulfato cúprico 0,1 M ■ Equilibrado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, el pH es inferior a aproximadamente 6,0; preferiblemente, el pH es aproximadamente de 3,6 a 5,5; más preferiblemente, el pH es aproximadamente de 5,5 ■ Carga: Ajustar el contenido en glicerol de los eluatos de Blue combinados hasta el 10%, añadiendo acetato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 2,0 M, glicerol al 50%, pH 5,2 ■ Lavado 1: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 5,5 ■ Lavado 2: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,9 ■ Elución: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,6 ■ Eluato mantenido durante 30-120 minutos antes del ajuste a pH 4,5 con NaOH 0,5 M ■ Regeneración: EDTA 50 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 8,0 ■ Desinfección: Hidróxido de sodio 0,5 M ■ Almacenamiento: Hidróxido de sodio 0,1 M ■ El rendimiento de recuperación puede ser de al menos aproximadamente el 86%

Columna de cromatografía de interacción hidrófoba con fenilo (Phenyl Sepharose 6 FF High Sub) (Phenyl, Phenyl High Sub)

■ Prelavado: Hidróxido de sodio 0,1 N ■ Lavado: Agua para inyección (WFI) ■ Equilibrado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, el pH es aproximadamente de 4,5 a 7,1; preferiblemente el pH es aproximadamente de 4,5 ■ Carga: Ajustar el contenido de cloruro de sodio del eluato de Copper hasta 2 M, añadiendo acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 5 M, pH 4,5 ■ Lavado 1: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 7,1 ■ Lavado 2: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 4,5 ■ Elución: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 4,5 ■ Regeneración: Acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 ■ Desinfección: Hidróxido de sodio 0,5 N ■ Almacenamiento: Hidróxido de sodio 0,1 N ■ El rendimiento de recuperación puede ser de al menos aproximadamente el 88%

UF/DF, filtración de ADN, filtración viral, formulación

■ Equilibrado: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 ■ Concentración: Concentración hasta NMT 1,5 mg/ml ■ Diafiltración: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 ■ Filtración de ADN: Producto filtrado a través de un filtro de ADN ■ Filtración/dilución viral: producto filtrado a través de un filtro de 0,02 µm y diluido hasta 1,0 mg/ml ■ Formulación: Se añade polisorbato 80 a una concentración de 50 µg/ml ■ Filtración: filtrar el producto diluido a través de un filtro de 0,2 µm en un recipiente de almacenamiento

En la tabla 5 se exponen los componentes del producto terminado así obtenidos. En la tabla 6 se exponen los componentes de la composición de producto terminado dentro del alcance de la presente invención

Tabla 5: Componentes del producto terminado

Componente

Descripción

Principio activo

N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa humana recombinante

Excipientes

Fosfato de sodio, monobásico, 1H2O Fosfato de sodio, dibásico, 7 H2O

Cloruro de sodio

Recipiente

Vial de vidrio transparente de 5 ml de tipo I, Kimble Glass, borosilicato West pharmaceuticals, tapón gris S-127 4432150

Tabla 6: Composición de producto terminado

Componente

Cantidad

rhASB

1 mg/ml

Fosfato de sodio, monobásico, 1H2O

9 mM

Fosfato de sodio, dibásico, 7 H2O

1 mM

Cloruro de sodio

150 mM

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garanticen hasta la aprobación de BLA.

Número de pacientes y tasa de inclusión

5 Se incluirá un único paciente al inicio del ensayo, con dos pacientes adicionales un mes más tarde y dos pacientes más dos semanas más tarde excluyendo cualquier complicación imprevista relacionada con el tratamiento. Se admitirán a pacientes adicionales si cualquiera de los pacientes incluidos enferma de manera crítica, o si un niño necesita un procedimiento clínico agudo para estados potencialmente mortales o perjudiciales.

Diagnóstico y criterios de inclusión/exclusión

El paciente puede ser hombre o mujer, de cinco años o mayor con un diagnóstico documentado de MPS VI confirmado mediante signos y síntomas clínicos medibles de MPS VI, y apoyado por un nivel de actividad de la enzima ASB de fibroblastos o leucocitos disminuido. Las pacientes en edad fértil deben tener una prueba de

15 embarazo negativa (β-hCG en orina) justo antes de cada dosificación y se les debe aconsejar que usen un método anticonceptivo médicamente aceptado a lo largo de todo el estudio. Se excluirá un/a paciente de este estudio si el/la paciente se ha sometido previamente a trasplante de médula ósea; está embarazada o en estado de lactancia; ha recibido un fármaco experimental en el plazo de 30 días antes de la inclusión en el estudio; o tiene un estado médico, enfermedad intercurrente grave, u otra circunstancia atenuante que pueda disminuir significativamente el cumplimiento del estudio.

Dosis, vía y régimen

Los pacientes recibirán rhASB a una dosis de 1 mg/kg (~50 U/kg) durante los primeros 3 meses del estudio. En el

25 caso de que no se disminuyan los GAG en orina en exceso en una cantidad razonable y no se observe beneficio clínico, se doblará la dosis. Se producirá un aumento de dosis solamente después de que los 5 pacientes se hayan sometido a 3 meses de terapia. Se administrará esta forma de dosificación de rhASB por vía intravenosa a lo largo de aproximadamente un periodo de cuatro horas una vez a la semana durante un mínimo de 12 semanas consecutivas. Se colocará un catéter intravenoso periférico en la vena cefálica u otra vena apropiada y se comenzará una infusión de solución salina a 30 cc/h. Se medicará previamente al paciente con hasta 1,25 mg/kg de difenilhidramina por vía i.v. basándose en experimentos de ajuste de la dosis completados antes del ensayo. Se diluirá rhASB en 100 cc de solución salina normal complementada con albúmina humana 1 mg/ml. Se administrará mediante infusión la enzima diluida a 1 mg/kg (aproximadamente 50 unidades por kg) a lo largo de un periodo de 4 horas con monitorización cardiorrespiratoria y pulsioximetría. Se monitorizará clínicamente a los pacientes así como

35 para determinar cualquier reacción adversa a la infusión. Si se observa cualquier síntoma inusual, incluyendo pero sin limitarse a malestar, disnea, hipoxemia, hipotensión, taquicardia, náuseas, escalofríos, fiebre y dolor abdominal, se detendrá la infusión inmediatamente. Basándose en los síntomas y signos clínicos, puede administrarse una dosis adicional de difenilhidramina, oxígeno con mascarilla, un bolo de fluidos por vía i.v. u otras intervenciones clínicas apropiadas tales como tratamiento con esteroides. Si se produce una reacción aguda, se someterá a prueba una evaluación para determinar el consumo de complemento en el suero. Se usará un segundo sitio por vía i.v. para la toma de muestras requeridas para el análisis farmacocinético.

Pacientes evaluables

45 Los datos de cualquier paciente dado se considerarán evaluables siempre que no falten más de dos infusiones no secuenciales durante las 12 semanas de terapia. Deben completarse las evaluaciones iniciales, en el punto medio y finales.

Seguridad

Se determinará que la terapia enzimática es segura si no se producen reacciones agudas significativas que no puedan impedirse alterando la tasa de administración de la enzima, o el uso de antihistamínicos o esteroides agudo. Se determinará que la administración a largo plazo de la enzima es segura si no se observan anomalías significativas en los exámenes clínicos, pruebas clínicas de laboratorio u otros estudios apropiados. No se

55 considerará peligrosa por sí misma la presencia de anticuerpos o activación del complemento, pero tales anticuerpos requerirán monitorización mediante ELISA y mediante evaluaciones clínicas de posible enfermedad de los complejos inmunitarios.

Eficacia

Un fin de este estudio es evaluar posibles criterios de valoración para el diseño de un ensayo fundamental. Se espera que las mejoras en los criterios de valoración clínicos y de sustitución sean resultado del suministro de la enzima y la eliminación del almacenamiento de glicosaminoglicanos del cuerpo. Se llevará a cabo un aumento de dosis si los niveles de glicosaminoglicano en orina en exceso medios no se reducen en una cantidad razonable a lo 65 largo de tres meses y no se observa beneficio clínico significativo a los 3 meses. Se espera que las mejoras sean comparables a las observadas en el ensayo clínico de MPS I completado recientemente y deberían incluir índice de

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las vías respiratorias mejorado o resolución de la apnea del sueño, movilidad articular mejorada y aumento de la resistencia.

Ejemplo 2

5 A continuación se presenta una revisión exhaustiva de la información disponible para gatos con MPS VI y estudios farmacológicos y toxicológicos relevantes: Se ha establecido la terapia de sustitución enzimática como un tratamiento prometedor para una variedad de trastornos metabólicos heredados tales como enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry y mucopolisacaridosis I. En algunos de estos trastornos, un modelo de animal

10 natural ofrece la capacidad de predecir la eficacia clínica del tratamiento humano durante estudios preclínicos. Se encontró que esto era cierto en MPS I (modelo canino). Teniendo esto en cuenta, se han realizado estudios con gatos con MPS VI antes del comienzo de estudios en seres humanos para esta enfermedad. Existen suficientes datos de seguridad y eficacia para continuar con un ensayo clínico en pacientes con MPS VI humanos.

15 Los estudios de gatos con MPS VI de rhASB indican que no ha muerto ningún gato como resultado de la administración del fármaco. Tal como se predijo, los experimentos en gatos con MPS VI también indican que la captación de rhASB depende de la presencia de cadenas laterales de hidratos de carbono modificadas con manosa6-fosfato. También se ha mostrado que rhASB en gatos con MPS VI aclara el almacenamiento de una variedad de órganos principales y altera moderadamente la densidad ósea. Los estudios de eficacia de dosis variable a largo

20 plazo sugieren que una dosis de 1 mg/kg/semana es la concentración más baja para observar beneficios clínicos significativos. También se han realizado estudios para comparar la distribución de la enzima, el aclaramiento del almacenamiento de glicosaminoglicanos tisular y la disminución de los niveles de glicosaminoglicano en orina tras infusión en bolo y lenta (2 horas). Los estudios en progreso continúan evaluando la seguridad de infusiones semanales de la dosis clínica proyectada de 1 mg/kg de rhASB en gatos que padecen MPS VI.

25 En la década de 1970 se identificó una forma espontánea de MPS VI en varias familias de gatos siameses (Jezyk, Science 198:834-36 (1977)), y se han publicado informes detallados de los cambios patológicos en estos animales (Haskins, et al., Am. J. Pathol. 101:657-674 (1980); Haskins, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 182:983-985 (1983); Konde, et al., Vet. Radiol. 28:223-228 (1987)). Aunque la presentación clínica de estos gatos es un tanto variable,

30 todos ellos muestran cambios generales que se han notificado en la bibliografía (Jezyk, et al., Science 198:834-36 (1977); Konde, et al., Vet. Radiol. 28:223-228 (1987); Crawley, “Enzyme replacement therapy in a feline model of mucopolysaccharidosis type VI” tesis de PhD, Universidad de Adelaida, Adelaida, S. Australia, (1998)). Se ha construido la tabla 6 a partir de estas fuentes para proporcionar los cambios “promedio” que se esperaría observar en un gato con MPS VI no tratado:

35 Tabla 7: modelo de gato con MPS VI

Observación clínica

Momento de aparición Cambios en relación con la enfermedad humana (independientemente del tiempo)

• Dismorfia facial: • Cabeza pequeña, • Maxilar ancho, • Orejas pequeñas

2 meses • Similar a la enfermedad humana

• Opacificación difusa de la córnea

2 meses • Similar a la enfermedad humana

• Anomalías óseas: • Displasia epifisaria • Subluxaciones • Pectus excavatum

Primeros signos a los 2 meses-progresivo • Similar a la enfermedad humanaalteraciones en la calcificación endocondral

• Peso corporal reducido

3 meses • Similar a la enfermedad humana

• Flexibilidad de la columna vertebral cervical

El valor normal de los gatos es de 180º en todas las edades En MPS VI: 3 meses: 130-170º 5 meses: 45-130º 6 meses: 30-100º 11 meses: 20-80º • Similar a la enfermedad humana

• Osteoporosis/enfermedad articular degenerativa

1 año o más • Similar a la enfermedad humana

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• Defectos en el modo de andar con las extremidades posteriores • Parálisis o paresia de las extremidades posteriores (compresiones en la médula toracolumbar)

Véase la tabla a continuación • Síndrome del túnel carpiano • Subluxación en C1-C2 • Compresión de la médula cervical secundaria a una duramadre engrosada más típica

• Hígado y bazo normales a simple vista

• Hígado y bazo agrandado en seres humanos

• Válvulas cardiacas engrosadas

• Similar a la enfermedad humana

• Sin lesiones en el SNC-agrandamiento leve del ventrículo lateral

• Puede compararse con hidrocefalia en la enfermedad humana

Otras determinaciones bioquímicas/morfológicas indican que en 35 días, los órganos de gatos no tratados tienen almacenamiento máximo de glicosaminoglicanos en tejidos (Crawley, et al., J. Clin. Invest. 99:651-662 (1997)). Los niveles de glicosaminoglicano en orina están elevados en el nacimiento en gatos tanto normales como con MPS VI

5 pero tras aproximadamente 40 días, los gatos normales tiene niveles disminuidos. Los glicosaminoglicanos en orina de gatos con MPS VI permanecen elevados o continúan aumentando hasta que alcanzan un estado estacionario tras aproximadamente 5 meses.

Se observa variabilidad en la presentación clínica en miembros de la camada afectados. Además de cierta

10 variabilidad en el momento de aparición de anomalías particulares, el transcurso del tiempo de progresión para algunos de los cambios clínicos y patológicos también es variable. En general, las lesiones óseas normalmente son progresivas (Konde et al., Vet. Radiol. 28:223-228 (1987)), mientras que la opacificación de la córnea no lo es. Además, se ha indicado que algunos gatos paralizados mejoran a paresia grave con el tiempo. Los estudios que detallan la progresión de la enfermedad en gatos individuales se limitan a observaciones clínicas (o radiográficas).

15 Algunos de estos tiene distintas correlaciones patológicas, tales como déficit neurológico y compresión de la médula derivada de la proliferación de tejido óseo en la región toracolumbar (Haskins, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 182:983-985 (1983)).

Se realizó un estudio de eficacia de seis meses de terapia de sustitución enzimática usando ASB felina

20 recombinante en gatos con MPS VI recién nacidos. Esto fue provocado por la observación de que varios gatos con MPS VI tratados desarrollaron anticuerpos frente a la enzima humana (véase la sección 6,5). Estos anticuerpos pueden alterar la captación y la estabilidad de la enzima (Brooks, et al., Biochim. Biophys. Acta 1361:203-216 (1997)). Se administró mediante infusión la enzima felina a 1 mg/kg semanalmente. Las conclusiones principales del estudio eran que se mejoró el GAG en orina, el peso corporal/crecimiento, la morfometría ósea y el aclaramiento de

25 material almacenado de diversos tejidos en relación con la misma dosis de enzima recombinante humana usada en el estudio anterior, que no se detectaron anticuerpos más allá del intervalo observado en gatos normales y que la dosis de enzima felina a 1 mg/kg era comparable en la reversión de la enfermedad a la dosis de enzima humana a 5 mg/kg en una comparación directa (Bielicki, et al., J. Biol. Chem., 274:36335-43 (1999)). Estos estudios indican que es posible una mejora en incremento en los criterios de valoración y en la inmunogenia cuando se administra la

30 enzima derivada de gato a los gatos. Esto proporciona apoyo adicional a la dosificación de pacientes humanos con la enzima humana a 1 mg/kg/semana. Los resultados de este estudio se indican en la tabla 7.

Tabla 8: Eficacia de inyecciones en bolo semanales de ASB felina recombinante derivada de CHO en gatos con MPS VI recién nacidos

Resultados

Dosis

1 mg/kg

Duración

6 meses (n = 2) 3 meses (n = 3)

GAG en orina

Disminuyó hasta 2x los valores normales Disminuyó hasta 2x los valores normales

Títulos de anticuerpos

• Dentro del intervalo observado en gatos normales • Ha de completarse

Clínica

Aspecto

• Opacificación de la córnea persistente • Cierta resolución de dismorfia facial • Forma corporal mejorada • Opacificación de la córnea persistente • Cierta resolución de dismorfia facial • Forma corporal mejorada

Peso

• Más pesado de lo normal • Ligeramente más ligero de lo normal

Flexibilidad de la columna vertebral (normal = 180º)

160º-180º No examinada

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Neurológica

• Normal • Normal

Radiología

• Calidad mejorada • Densidad y dimensiones del hueso (similar a 1 mg/kg de rh4S, ref. 10) • No examinado

A simple vista

Grosor de hueso/cartílago

• Variable; disminución del grosor del cartílago • Hueso subcondral más uniforme (similar a 1 mg/kg de rh4Sº) • No examinado

Médula espinal

• No hay compresiones presentes • No examinado

Nivel celular

Hígado (Kupffer)

• Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo • Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo

Piel

• Casi reducción completa en almacenamiento • Reducción leve

Córnea/Cartílago (oreja, articular)

• Sin aclaramiento del almacenamiento lisosómico en comparación con controles con MPS VI no tratados • Sin aclaramiento del almacenamiento lisosómico

Válvulas cardíacas

• Reducción significativa del almacenamiento lisosómico • Ha de completarse

Aorta

• Casi reducción completa en • Reducción leve en

Dosis

1 mg/kg

Duración

6 meses (n = 2) 3 meses (n = 3)

almacenamiento lisosómico

almacenamiento lisosómico

La tabla 9 proporciona un resumen de todos los estudio realizados usando ASB humana recombinante en el modelo de gato con MPS VI.

Tabla 9: Resultados del estudio de rhASB

N.º de gato

Dosis Duración (meses) Vía de administración GAG en orina Histopatología

1

0,8 mg/kg/14 d 7-22 Bolo i.v. Disminuyeron un 50% en comparación con gatos no tratados • Normalización de vacuolización en el hígado • Reducción significativa en riñones y piel • Sin corrección en córnea y condrocitos • Sin deposición de complejo inmunitario en riñones

1,5 mg/kg/7d

22-27 Bolo i.v.

1

0,5 mg/kg/14 d 12-23 Bolo i.v. Disminuyeron casi hasta valores normales

1,4 mg/kg/7d

23-27 Bolo i.v.

1

0,8 mg/kg/14 d 2-15 Bolo i.v.

1

0,2 mg/kg/8 d 6 Bolo i.v. Reducción marginal en comparación con no tratados N/A

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4

1 mg/kg/7 d 5/6 Bolo i.v. Disminuyeron y se mantuvieron a 3x los valores normales en comparación con no tratados y 10x los valores normales • Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo en células hepáticas • Sin pruebas de afectación renal o deposición de complejo inmunitario en los glomérulos • Reducción significativa del almacenamiento lisosómico en las válvulas cardíacas • Contenido de almacenamiento en gradiente de la túnica media a la adventicia en la aorta

1

11 Bolo i.v. • Reducción leve del almacenamiento lisosómico de la piel (cadera, duramadre, riñón) • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular • Sin cambios significativos en el almacenamiento lisosómico de córnea/cartílago

2

5 mg/kg/7d 5/6 Bolo i.v. Disminuyeron y se mantuvieron a 2x los valores normales en comparación con no tratados a 10x los valores normales •Almacenamiento lisosómico completo en el aclaramiento de hígado y piel (cadera, duramadre, riñón) • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular • Reducción casi completa en el almacenamiento lisosómico en válvulas cardíacas • Banda delgada de células vacuoladas en la túnica media externa

1

11 Bolo i.v. • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular • Reducción casi completa en el almacenamiento lisosómico en válvulas cardíacas • Banda delgada de células vacuoladas en la túnica media externa

2

0,5 mg/kg 2x semana 6 Bolo i.v. Disminuyeron hasta 3x los valores normales • Aclaramiento lisosómico completo en hígado • Reducción de leve a moderada en la piel • Reducción variable del almacenamiento lisosómico de las válvulas cardíacas • Reducción leve del almacenamiento lisosómico en la aorta

2

1 mg/kg/7 d 1 Infusión prolongada (2 h) Se redujeron tras la primera o segunda infusión hasta por debajo de valores de gatos con MPS VI no tratados • Reducción del almacenamiento lisosómico en células del retículo endotelial y muy leve en válvula cardíaca y aorta tras infusión

2

Infusión corta (10 min.)

5

1 mg/kg/7 d 6 Infusión prolongada (2 h)

Ejemplo 3

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Distribución y viabilidad

Se realizó un estudio inicial para documentar la captación y distribución enzimática, y para servir como estudio piloto de posibles criterios de valoración para estudios de eficacia posteriores (Crawley, et al., J. Clin. Invest. 97:1864-1873 5 (1996)). Se administró ASB humana recombinante mediante inyección en bolo a gatos afectados una vez por semana o una vez cada dos semanas a de 0,5 hasta 1,5 mg/kg. La evaluación de un gato con MPS VI no tratado (gato D) y un gato normal proporcionó los valores a partir de los que se extrajeron las comparaciones. Los datos del gato no tratado se apoyaron adicionalmente por la evaluación de la historia de 38 gatos no tratados adicionales. Se llevaron a cabo los estudios de captación y distribución aguda en gatos normales usando una técnica de ensayo

10 inmunitaria que permitió la detección de ASB humana en presencia de enzima de gato normal.

Las conclusiones principales de estos estudios demostraron captación amplia de enzima con la predominancia esperada de captación de hígado y bazo tal como se observa en otros estudios de sustitución enzimática en modelos animales con MPS. La eficacia de captación dependía de la presencia de cadenas laterales de hidratos de

15 carbono modificadas con manosa-6-fosfato en la enzima. Se determinó que la semivida de la enzima era de 2-4 días. Terapéuticamente, la enzima aclaró el almacenamiento de una variedad de órganos principales y alteró moderadamente la densidad ósea. Los defectos en la córnea, la morfología ósea y los defectos del cartílago no se trataron eficazmente en gatos con MPS VI más viejos. En la tabla 10 se resumen los resultados del estudio.

20 Tabla 10: Sumario: Estudio de distribución/viabilidad en gatos con MPS VI

Parámetro

Hallazgos

Gato

A B C

MPS VI tratada

MPS VI tratada

MPS VI tratada

Dosis

0,8 mg/kg durante 14 d 1,5 mg/kg durante 7 d 0,5 mg/kg durante 14 d 1,4 mg/kg durante 7 d 0,8 mg/kg durante 14 d

Edad a la dosis (meses)

7*-22 22-27 12*-33 23-27 2*-15

Parámetros de infusión

2-10 ml (PBS) por vía cefálica durante 5-20 minutos

t1/2 plasmática (bolo i.v.)

• 13,7±3,2 min. a 1 mg/kg • 45 min. a 7,5 mg/kg

Todos los valores en relación con enzima ASB felina endógena cuatro horas tras la infusión de 1 mg/kg de rhASB en gatos normales • Hígado: 495x • Bazo: 6x • Pulmón: 22,3x • Corazón: 4,3x • Aorta: 4x • Piel: 31x • Cartílago: 0x • Córnea: 0x

t1/2 tisular

2-4 días a 1 mg/kg en la mayoría de los órganos (enzima detectable en la mayoría de tejidos de gato B, pero sólo en hígado de A tras 7 días)

Neurológico

• La ambulación fluctuó, pero mejoró a dosis más altas N/A • Progresión marginal hasta umbral parético al final del estudio

Opacidad de la córnea

• No cambió con terapia (examen con lámpara de hendidura 3x hacia el final del tratamiento)

Esqueleto (rayos X) 4 vistas cada 3 meses

• Las lesiones progresaron (sin mejora radiográfica) • Aumentó el volumen óseo/trabecular # en el gato C (recibió tratamiento anterior) • Compresión vertebral en el gato C

Anafilaxia

• Sin anafilaxia, molestias mínimas con la infusión;

Respuesta de anticuerpos (títulos de Ig) MPS VI no tratada = 4.000-32.000

1 x 10º (plasma pudo inhibir la actividad enzimática in vitro) 64.000 64.000

GAG en orina (a ~ 400 días)

• Disminuyó un 50% en comparación con gato no tratado • Disminuyó hasta valores casi normales

E10011421

26-03-2015

Sulfato de dermatano en orina (~ 400 días)

• Intermedio para los 3 gatos (en relación con control D no tratado y normal)

Peso corporal

• 2,5-3,0 kg frente a 4-7 kg de normal

Hígado/Bazo

• Normal a simple vista

Válvulas cardíacas

• Normales a simple vista

Cartílago

• Formación y grosor anómalos

Microscopía (vacuolización)

• Normalización de vacuolización en hígado, • Reducción significativa en riñones y piel, • Sin corrección en córnea y condrocitos

Deposición de complejo inmunitario en riñones

• Ausente

Ejemplo 4

Eficacia en gatos con MPS VI tratados desde su nacimiento

5 Se realizó un estudio de eficacia de dosis variable a largo plazo en gatos con MPS VI empezando en su nacimiento (Crawley, et al., J. Clin. Invest. 99:651-662 (1997)) y se resume en la tabla 10. Se trataron gatos con MPS VI semanalmente con inyecciones en bolo i.v. de 0,2, 1 y 5 mg/kg de rhASB comenzando en su nacimiento. Se trató un total de 9 gatos durante 5, 6 u 11 meses. Además, se incluyeron 12 gatos con MPS VI y 9 gatos normales como

10 controles no tratados. Las conclusiones principales son que la dosis de 0,2 mg/kg no alteró la progresión de la enfermedad en el gato estudiado, y el único beneficio clínico documentado fue una reducción en el almacenamiento en células de Kupffer hepáticas. Los niveles de GAG en orina disminuyeron hasta valores casi normales durante el ensayo en los grupos de dosis más altas. Además de mejoras en los órganos principales, las dosis más altas de terapia desde el nacimiento pudieron impedir o mejorar la deformidad ósea de la columna vertebral y la forma

15 anómala de muchos huesos. Hubo un efecto dependiente de la dosis sobre la mejora en el volumen de mineral óseo vertebral en L-5, grosor trabecular óseo y la densidad de superficie ósea entre las dosis de 1 y 5 mg/kg, aunque ambas fueron equivalentes en la mejora de la tasa de formación ósea a de 5 a 6 meses de ERT (Byers, et al., Bone

21: 425-431 (1997)). La válvula mitral y la aorta dependían de la dosis y era menos completa a 1 mg/kg pero casi completa a 5 mg/kg. No se observó mejora del almacenamiento en cartílago y córnea a cualquier dosis. El estudio

20 sugiere que la dosis de 1 mg/kg/semana es la concentración más baja para observar beneficio clínico significativo. En la tabla 11 se resumen los resultados del estudio.

Tabla 11: Eficacia de inyecciones en bolo semanales de ASB humana recombinante derivada de CHO en gatos con MPS VI recién nacidos (estudio PC-BM102-002)

Resultados

Dosis

1 mg/kg 5 mg/kg

Duración

5/6 meses 11 meses 5/6 meses 11 meses

N

4 1 2 1

Bioquímica

GAG en orina

• Disminuyeron y se mantuvieron a 3x los valores normales en comparación con no tratados a 10x los valores normales • Disminuyeron y se mantuvieron a 2x los valores normales en comparación con no tratados a 10x los valores normales

Clínica

Aspecto

• Cambios variables; • Opacificación de la córnea persistente determinada mediante lámpara de hendidura • Cambios variables; • Opacificación de la córnea persistente determinada mediante lámpara de hendidura

Peso

• Intermedio (sin prescripción frente a normal) • Intermedio (sin prescripción frente a normal)

E10011421

26-03-2015

Flexibilidad de la columna vertebral (normal=180) (MPS VI no tratada = 90º)

130-160º 90º 180º 160º

Neurológicos

• 1 de 4 parálisis leves de las extremidades posteriores • Sin déficit • Sin déficit • Sin déficit

Radiología

• Calidad, densidad y dimensiones óseas mejoradas • Calidad, densidad y dimensiones óseas mejoradas • Posiblemente superior a 1 mg/kg

A simple vista

Grosor del hueso/cartílago

• Variabilidad, pero mejorado • Enfermedad articular degenerativa presente • Variabilidad, pero mejorado • Enfermedad articular degenerativa presente

Médula espinal

• 1 de 4 con diversas compresiones leves • Sin compresiones • Sin compresiones de médula

Nivel celular

Hígado (Kupffer)

• Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo • Mantenido • Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo • Mantenido

Piel (cadera, duramadre, riñones)

• Sin pruebas de afectación renal o deposición de complejo inmunitario glomerular • Reducción leve en el almacenamiento lisosómico • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular • Aclaramiento del almacenamiento lisosómico completo • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular • Mantenido • Sin pruebas de afectación renal o deposición glomerular

Córnea/cartílago (oreja, articular)

NA • Sin cambios significativos en el almacenamiento lisosómico NA • Sin cambios significativos en el almacenamiento lisosómico

Válvulas cardiacas

• Reducción significativa (variable) en el almacenamiento lisosómico • Reducción significativa (variable) en el almacenamiento lisosómico, casi completa • Reducción casi completa en el almacenamiento lisosómico

Aorta

• Gradiente de contenido de almacenamiento desde la túnica media hasta la adventicia • Banda delgada de células vacuoladas en la túnica media externa

Ejemplo 5

Eficacia de infusiones dos veces por semana de ASB humana recombinante en gatos con MPS VI recién 5 nacidos

Se realizó un estudio de seis meses en gatos recién nacidos para evaluar una infusión de 0,5 mg/kg administrada dos veces por semana. Además, la enzima usada en este estudio se derivó exclusivamente de la línea celular CSL4S-342. Las conclusiones principales del estudio incluyen que en comparación con la dosis semanal de 1 mg/kg

10 notificada anteriormente, este estudio produjo mejoras similares en los parámetros físicos, bioquímicos, neurológicos y radiográficos. Las diferencias más notables fueron flexibilidad de la columna vertebral cervical ligeramente empeorada y menor aclaramiento de almacenamiento lisosómico en los tejidos conectivos más densos tales como las válvulas cardiacas y la aorta. En la tabla 12 se resumen los resultados.

15 Tabla 12: Eficacia de inyecciones en bolo dos veces por semana de ASB humana recombinante derivada de CHO en gatos con MPS VI recién nacidos

Parámetro

Resultados

Dosis

0,5 mg/kg E10011421

26-03-2015

Duración

2x semana: 6 meses (n=2; gatos 225f, 226m)

GAG en orina

• Disminuyó hasta 3x los valores normales

Títulos de anticuerpos

• Dentro del intervalo observado en gatos normales

Clínica

Aspecto

• Opacificación de la córnea persistente • Cierta resolución de dismorfia facial • Forma corporal mejorada

Peso

• Intermedio (entre no tratamiento y normal)

Flexibilidad de la columna vertebral (normal = 180º)

90º -150º

Neurológicos

• Sin parálisis de las extremidades posteriores

Radiología

• Calidad, densidad y dimensiones mejoradas de los huesos (similar a 1 mg/kg de rh4S en ref. 110

A simple vista

Grosor de hueso/cartílago

• Variable; disminuyó el grosor del cartílago y hueso subcondral más uniforme (similar a 1 mg/kg de rh4Sa)

Médula espinal

• Sin compresiones presentes

Nivel celular

Hígado (Kupffer)

• Aclaramiento lisosómico completo

Piel

• Reducción de leve a moderada en almacenamiento

Córnea/cartílago (oreja, articular)

• Sin aclaramiento de almacenamiento lisosómico en comparación con controles con MPS VI no tratados

Válvulas cardiacas

• Reducción variable en el almacenamiento lisosómico (completo en 225f; sin cambios con respecto a no tratados en 226m)

Aorta

• Reducción leve en almacenamiento lisosómico

Ejemplo 6

Evaluación de la captación y distribución enzimática como función de la tasa de infusión de la enzima en 5 gatos con MPS VI

El objetivo principal de este estudio era comparar la distribución enzimática, el aclaramiento de almacenamiento de GAG tisular y la disminución de niveles de GAG en orina tras infusión en bolo y tras infusión lenta (2 horas) de una dosis de 1 mg/kg idéntica. El fin de la administración lenta se basa en la experiencia de estudios preclínicos y 10 clínicos de α-L-iduronidasa para el tratamiento de MPS I. Además, el estudio proporcionó los primero datos de que la enzima producida en BioMarin a partir de la línea celular CSL-4S-342 es biológicamente activa y segura. Las conclusiones principales del estudio incluyen que los cuatro gatos (dos por grupo) tratados en este estudio no mostraron reacción adversa aguda frente a la infusión o bien lenta o bien rápida, ni efectos perjudiciales de infusiones de la enzima repetidas. Sin embargo, la infusión en bolo da como resultado captación hepática alta, que

15 no se prefiere. La infusión lenta proporciona una mejor distribución en los tejidos y por tanto es un método preferido para el ensayo clínico.

La distribución tisular de rhASB obtenida en el estudio sugirió que esas infusiones de 2 horas podían aumentar los niveles enzimáticos en otros órganos aparte del hígado, incluyendo un aumento de la actividad en el cerebro. Se 20 observó inmediatamente reducción en GAG en orina tras la primera o la segunda infusión hasta niveles por debajo del intervalo observado en gatos con MPS VI no tratados. Se observó la corrección de almacenamiento lisosómico en células del retículo endotelial y muy leve en algunos fibroblastos (válvula cardíaca) y células del músculo liso (aorta) tras 5 infusiones. No se observó otra respuesta clínica significativa a las infusiones en cualquier grupo, sin embargo esto no era inesperado debido a la corta duración del estudio y debido a que la terapia empezaba tras

25 haberse desarrollado ya cambios patológicos significativos. La infusión prolongada de 2 horas fue segura y se toleró bien en relación con los protocolos más cortos usados en estudios previos. La infusión de 2 horas puede proporcionar mejoras en la distribución enzimática basada en el gato que pudo evaluarse para determinar la distribución tisular enzimática.

30

imagen11

imagen12

E10011421

26-03-2015

Ejemplo 9

Método de fabricación y purificación (proceso de perfusión)

5 En la tabla 14 se proporciona un diagrama de flujo de proceso que compara los procesos de purificación para los procesos de cultivo celular discontinuo alimentado y basado en perfusión. En la tabla 15 se resumen comparaciones del proceso de purificación discontinuo alimentado así como detalles de los cambios específicos implementados para la purificación del material del proceso de perfusión. La tabla 16 representa el método de purificación usado para los cultivos celulares basados en perfusión.

10

imagen13

Filtración de producto recogido

Filtración de producto recogido

↓ ↓

Concentración 10x y diafiltración

Concentración 20x

↓ ↓

Cromatografía DEAE-Sepharose

Ajuste del pH y filtración

↓ ↓

Cromatografía Blue SepharoseFF

Cromatografía Blue SepharoseFF

↓ ↓

Cromatografía Copper chelating SepharoseFF

Cromatografía Copper chelating-SepharoseFF

↓ ↓

Cromatografía Phenyl-Sepharose HP

Cromatografía Phenyl-SepharoseFF Hi Sub

↓ ↓

Ultrafiltración/diafiltración

Reducción viral a través de un filtro de 0,04 µm

Formulación

Filtro de 0,02 µm

Se almacena el principio activo a granel formulado hasta la liberación de QA. Los lotes de principio activo a granel formulado que cumplen las especificaciones de liberación pueden combinarse en esta etapa

Ultrafiltración/diafiltración

Eliminación de ADN

Reducción viral a través de un filtro de 0,02 µm

Formulación con polisorbato 80

Filtro de 0,02 µm

Se almacena el principio activo a granel formulado hasta la liberación de QA. Los lotes de principio activo a granel formulado que cumplen las especificaciones de liberación pueden combinarse en esta etapa

↓ ↓

Se envía el principio activo a granel formulado liberado a

Se envía el principio activo a granel formulado liberado a

Hollister-Stier Laboratories para el llenado, envasado en

Hollister-Stier Laboratories para el llenado, envasado en

viales y el etiquetado

viales y el etiquetado

Tabla 15: Descripción resumen de los cambios de la purificación

Etapa de producción

Descripción (discontinuo) Descripción (perfusión)

PROCESO DE

PURIFICACIÓN

E10011421

26-03-2015 E10011421

Concentración/ Diafiltración

Filtración de flujo tangencial: 2,8 m2 Filtros de MWCO de retención de albúmina Operación: • Concentración hasta 10X • Se diafiltró frente a 5 volúmenes de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,3 Cambios: Filtración de flujo tangencial: 5,6 m2 Filtros de MWCO de retención de albúmina Operación: • Concentración hasta 20X • Sin diafiltración, se aclaró el sistema con fosfato de sodio 100 mM, pH 7,3 Fundamento: • Reducción de volumen para el almacenamiento a 4ºC

↓

Cromatografía de flujo a través DEAE-Sepharose FF

Columna: 2 x 30 cm de diámetro x 33 cm de altura • Prelavado: hidróxido de sodio 0,1 N • Lavado: Agua para inyección (WFI) • Neutralizar: fosfato de sodio 100 mM, pH 7,3 • Equilibrado: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,3 • Carga: producto recogido concentrado / diafiltrado • Lavado: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 7,3 • Separación: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,5 M, pH 7,3 • Regeneración: ácido acético glacial al 10% • Lavado: Agua para inyección (WFI) • Desinfección: hidróxido de sodio 0,5 N • Almacenamiento: hidróxido de sodio 0,1 N Etapa eliminada

↓

Ajuste de pH y filtración

• Ajuste del pH: adición de ácido acético glacial al 10% a concentrados 20X combinados hasta un pH final de 5,0 • Carga: concentrados 20X combinados • Filtración a través de filtros de clarificación y filtro de 0,2 µm • Purgado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 120 mM, pH 5,0 Fundamento: • Aumenta la capacidad de unión a rhASB de la columna de resina de Blue Sepharose posterior

26-03-2015 E10011421

Cromatografía Blue Sepharose FF

Columna: 20 cm de diámetro x 11 cm de altura • Prelavado: hidróxido de sodio 0,1 N • Lavado: Agua para inyección (WFI) • Neutralización: acetato de sodio 1 M, pH 5,5 • Equilibrado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,5 • Carga: flujo a través de DEAE ajustado para acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,5 • Lavado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,5 • Elución: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 5,5 • Regeneración: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 5,5 • Desinfección: hidróxido de sodio 0,1 N • Lavado 1: Agua para inyección • Lavado 2: acetato de sodio 1 M, pH 5,5 • Almacenamiento: etanol al 20% Cambio Columna: 45 cm de diámetro x 16 cm de altura Neutralización: omitida • Equilibrado: fosfato de sodio 10 mM pH 6,45 • Carga: concentrados 20X combinados, pH ajustado a 5,0 y filtrado. • Lavado: fosfato de sodio 10 mM, pH 6,45 • Elución: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 125 mM, pH 6,45 • Regeneración: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45 • Lavado 2: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45 Fundamento: • Las condiciones permiten la una mejora de la eliminación de impurezas de CHO potenciales lo que permite la eliminación de cromatografía DEAE Sepharose.

↓

Cromatografía Copper Chelating Sepharose FF

Columna: 14 cm de diámetro x 9 cm de altura Prelavado: hidróxido de sodio 0,1 N • Lavado: Agua para inyección (WFI) • Tampón de carga: sulfato cúprico 0,1 M • Equilibrado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 6,0 • Carga: Ajustar el contenido en glicerol de eluato de Blue hasta el 10%, añadiendo acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM, glicerol al 50%, pH 6,0 • Lavado 1: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 6,0 • Lavado 2: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 4,0 • Lavado 3: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,8 • Elución: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,6 • Regeneración: EDTA 50 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 8,0 • Desinfección: hidróxido de sodio 0,5 M • Almacenamiento: hidróxido de sodio 0,1 M Cambios: Columna: 40 cm de diámetro x 16 cm de altura • Equilibrado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 5,5 • Carga: Ajustar el contenido en glicerol de eluato de Blue combinado hasta el 10%, añadiendo acetato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 2,0 M, glicerol al 50%, pH 5,2 • Lavado 1: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 5,5 • Lavado 2: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,9 • Lavado 3: omitido Fundamento: • Pureza del producto constante y reproducible obtenida con la etapa modificada

↓

Inactivación viral

Se mantienen las fracciones de eluato combinadas durante 30-120 minutos antes del ajuste a pH 4,5 con NaOH 0,5 M Sin cambios

↓

26-03-2015 E10011421

Cromatografía de Phenyl Sepharose

Columna: 10 cm de diámetro x 16 cm de altura Resina: Phenyl Sepharose High Performance • Prelavado: hidróxido de sodio 0,1 N • Lavado: Agua para inyección (WFI) • Equilibrado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 3,0 M, pH 4,5 • Carga: Ajustar el contenido en cloruro de sodio de eluato de Copper hasta 3 M, añadiendo acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 5 M, pH 4,5 • Lavado 1: acetato de sodio 20 mM, 3,0 M cloruro de sodio, pH 4,5 • Lavado 2: acetato de sodio 20 mM, 1,6 M cloruro de sodio, pH 4,5 • Elución: acetato de sodio 20 mM, 1 M cloruro de sodio, pH 4,5 • Regeneración: acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 • Desinfección: hidróxido de sodio 0,5 N • Almacenamiento: hidróxido de sodio 0,1 N Cambio Columna: 40 cm de diámetro x 16 cm de altura Resina: Phenyl Sepharose High Sub Fast Flow • Equilibrado: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 4,5 • Carga: Ajustar el contenido en cloruro de sodio de eluato de Copper hasta 2 M, añadiendo acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 5 M, pH 4,5 • Lavado 1: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 7,1 • Lavado 2: acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 4,5 • Elución: acetato de sodio 20 mM, 250 mM cloruro de sodio, pH 4,5 Fundamento: • La resina alternativa tiene características de flujo y capacidad más favorables para rhASB • El lavado 1 permite un aclaramiento robusto de impurezas de proteína potenciales

↓

UF/DF final

Filtración de flujo tangencial con filtros de MWCO de 10 kDa < 0,4 m2 . • Equilibrado: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 • Concentración: Concentración hasta NMT 1,5 mg/ml • Diafiltración: fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 Cambio Filtración de flujo tangencial: filtros de MWCO de 10 kDa de 2,8 m2 .

↓

Eliminación de ADN

No se hace Nueva etapa: • Filtración de ADN: Se filtró el producto a través de un filtro de ADN basado en intercambio iónico. Fundamento: • Aclaramiento de ADN adicional para compensar la deleción de la etapa de cromatografía de flujo a través de DEAE.

↓

Formulación

• Se diluye hasta 1,0 mg/ml con fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8

↓

Filtración viral

• Filtración viral: Se filtra el producto a través de un filtro de 0,04 µm Cambio: • Filtración viral: Se filtra el producto a través de un filtro de 0,02 µm Fundamento: • Uso de tamaño de poro más pequeño para potenciar el aclaramiento viral.

↓

26-03-2015 E10011421

Formulación

La etapa se realiza antes en el proceso (antes de la filtración viral) Cambio: • Se diluye hasta 1,0 mg/ml con fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 • Formulación: Se añade polisorbato 80 hasta una concentración de 50 µg/ml.

↓

Filtración

• Filtración: Filtrar el producto diluido a través de un filtro de 0,2 µm en un recipiente de almacenamiento Sin cambios

Tabla 16: Método de purificación de rhASB (Proceso de perfusión)

Etapa

Proceso

Filtración de producto recogido

Filtración a través de filtros de clarificación, filtros de 0,45 µm y finalmente filtro de 0,2 µm. Los productos recogidos combinados filtrados se almacenan en bolsas de polipropileno

Concentración por UF

Equilibrado y purgado: Fosfato de sodio 100 mM, pH 7,3 Carga: Fluido recogido filtrado Concentración: Concentración hasta 20X Filtración: Filtrar el producto diluido a través de un filtro de 0,2 µm en un recipiente de almacenamiento

Ajuste del pH y filtración

Ajuste del pH: Añadir ácido acético glacial al 10% a concentrados 20X combinados hasta un pH final de 5,0 Carga: Concentrados 20X combinados Aclarado: Agua para inyección (WFI) Filtración a través de filtros de clarificación y filtro de 0,2 µm. Purgado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 120 mM, pH 5,0

Blue Sepharose 6 FF (Blue, Blue Sepharose)

Prelavado: Hidróxido de sodio 0,1 N Lavado: Agua para inyección (WFI) Equilibrado: Fosfato de sodio 10 mM, pH 6,45 Carga: Concentrados 20X combinados, filtrados y con pH ajustado Lavado: Fosfato de sodio 10 mM, pH 6,45 Elución: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 125 mM, pH 6,45 Regeneración: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45

Desinfección: Hidróxido de sodio 0,1 N Lavado 1: Agua para inyección (WFI) Lavado 2: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 6,45 Almacenamiento: Etanol al 20%

Chelating Sepharose FF (Copper, CC, Copper Chelating)

Prelavado: Hidróxido de sodio 0,1 N Lavado: Agua para inyección (WFI) Tampón de carga: Sulfato cúprico 0,1 M Equilibrado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 5,5 Carga: Ajustar el contenido en glicerol de los eluatos de Blue combinados hasta el 10%, añadiendo acetato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 2,0 M, glicerol al 50%, pH 5,2 Lavado 1: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 5,5 Lavado 2: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,9 Elución: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, glicerol al 10%, pH 3,6 Eluato mantenido durante 30-120 minutos antes del ajuste a pH 4,5 con NaOH 0,5 M Regeneración: EDTA 50 mM, cloruro de sodio 1,0 M, pH 8,0 Desinfección: Hidróxido de sodio 0,5 M Almacenamiento: Hidróxido de sodio 0,1 M

26-03-2015

Phenyl Sepharose 6 FF High Sub (Phenyl, Phenyl High Sub)

Prelavado: Hidróxido de sodio 0,1 N Lavado: Agua para inyección (WFI) Equilibrado: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 4,5 Carga: Ajustar el contenido de cloruro de sodio del eluato de Copper hasta 2 M, añadiendo acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 5 M, pH 4,5 Lavado 1: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 7,1 Lavado 2: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 2,0 M, pH 4,5 Elución: Acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 4,5 Regeneración: Acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 Desinfección: Hidróxido de sodio 0,5 N Almacenamiento: Hidróxido de sodio 0,1 N

UF/DF, filtración de ADN, filtración viral, formulación

Equilibrado: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 Concentración: Concentración hasta NMT 1,5 mg/ml Diafiltración: Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 5,8 Filtración de ADN: Producto filtrado a través de un filtro de ADN Filtración/dilución viral: producto filtrado a través de un filtro de 0,02 µm y diluido hasta 1,0 mg/ml Formulación: Se añade polisorbato 80 a una concentración de 50 µg/ml Filtración: filtrar el producto diluido a través de un filtro de 0,2 µm en un recipiente de almacenamiento

Se regeneran todas las columnas de purificación antes de su uso, se desinfectan tras su uso y se almacenan en los tampones apropiados tal como se indica en las tablas 15 y 16. Materiales de partida de purificación Todos los materiales se suministran por proveedores cualificados. Tabla 17: Materiales de partida para purificación

Componente

Calidad

Ácido acético glacial

USP

Sulfato cúprico pentahidratado

USP

Edetato de disodio

USP

Alcohol deshidratado, USF (Etanol, 200 Proof)

USP

Glicerina

USP

Acetato de sodio, trihidratado

USP

Cloruro de sodio

USP

Disolución de hidróxido de sodio al 50% p/p

Calidad de reactivo

Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado

USP/EP

Fosfato de sodio, monobásico, monohidratado

USP

Ácido clorhídrico, disolución volumétrica 6 N

Calidad de reactivo

Polisorbato 80 MF/EP (CRILLE 4 HP)

NF/EP

Agua para inyección, envasada a granel

USP

10 La glicerina que va a utilizarse se deriva de un proceso sintético. Todos los materiales de partida usados deben cumplir con la última versión de la nota de orientación del CPMP/CVMP titulada, “Minimising the Risk of Transmitting Animal Spongiform Encephalopathy Agents Via Human and Veterinary Medicinal Products”, en la que los derivados de sebo tales como glicerol y ácidos grasos preparados mediante procesos rigurosos que implican condiciones de

15 altas temperaturas y presión o reacciones químicas que se sabe que son letalmente hostiles para el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) se cree que es poco probable que sean infecciosos. Por tanto, se considera que el riesgo de transmisión de EEB de la glicerina es bajo.

La seguridad viral de rhASB se confirma mediante una combinación de selección y cualificación de los proveedores,

20 pruebas del material de partida, estudios de caracterización del banco de células, estudios de eliminación viral y capacidad de inactivación de los procesos de purificación de rhASB y pruebas de liberación de lote de rutina. Se ha hecho referencia a reglamentos y directrices de los EE.UU., UE e ICH para garantizar la seguridad viral de rhASB.

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E10011421

26-03-2015

Ensayo in vitro para determinar la presencia de contaminantes virales1

Negativo (especificación de liberación)

1 Se realiza la toma de muestras en múltiples puntos de tiempo durante la fase de recogida de cultivo celular de la fabricación. Se somete a prueba la última muestra retirada antes de la terminación del proceso de cultivo celular y se requiere un resultado negativo para la liberación del lote.

Tabla 20: Pruebas en proceso de los productos intermedios de purificación

Prueba

Niveles de acción

Endotoxina bacteriana mediante LAL (USP/EP)

≥ 3 UE/ml en eluatos de columna1

Carga biológica(USP/EP)

≥ 20 ufc/ml de filtración previa1

≥ 1 ufc/100 ml en el principio activo a granel formulado (FBDS)2

Actividad

Resultado usado para el cálculo de las cargas de columna de Copper Chelating y Phenyl Sepharose

Proteínas totales mediante espectrofotometría UV-Vis

Resultado usado para el cálculo de la concentración de proteínas para la UF/DF

1 Los resultados que superan los niveles de acción se investigan mediante procedimientos normalizados de trabajo. 2 Si los resultados superan el nivel de acción, el FBDS se filtrará a través de un filtro de 0,2 µm en recipientes de almacenamiento estériles apropiados y después se pondrán en cuarentena a la espera de la liberación para el envío a los sitios de llenado.

10 Resultados del método de perfusión de purificación de la rhASB precursora

La tabla 21 proporciona datos sobre el grado de pureza de rhASB obtenida usando los métodos de purificación descritos en las tablas 15 y 16. La columna de “pureza mediante RP-HPLC” indica el grado de pureza obtenido para 15 la cantidad combinada de las formas tanto precursora como madura de rhASB.

Tabla 21: Resultados de liberación de lote de rhASB

Lote

Pureza mediante RP-HPLC Presencia de las formas procesadas* Proceso de fabricación

A60028

99,6 - Proceso discontinuo

AP60029

98,8 + Proceso discontinuo

A60030

98,7 + Proceso discontinuo

AP60031

99,1 - Proceso discontinuo

AP60032

99,8 - Proceso discontinuo

AP60033

99,4 - Proceso discontinuo

AP60035

99,7 - Proceso discontinuo

AP60036

99,4 - Proceso discontinuo

AP60038

99,6 - Proceso discontinuo

AP60039

99,3 - Proceso discontinuo

AP60040

99,1 - Proceso discontinuo

AP60101

99,3 - Proceso discontinuo

AP60102

98,9 - Proceso discontinuo

AP60103

99,0 - Proceso discontinuo

AP60104

99,0 + Proceso discontinuo

AP60105

99,0 - Proceso discontinuo

AP60106

99,2 - Proceso discontinuo

AP60107

99,4 - Proceso discontinuo

AP60108

99,7 - Proceso de perfusión

AP60109

99,8 - Proceso de perfusión

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Claims (1)

1. imagen1

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