ES2528599T3

ES2528599T3 - Análogos truncados de un polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa

Info

Publication number: ES2528599T3
Application number: ES09805288.9T
Authority: ES
Inventors: Zheng Xin Dong; Yeelana Shen; Daniel B. Deoliveira
Original assignee: Ipsen Pharma SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 2008-08-07
Filing date: 2009-08-07
Publication date: 2015-02-10
Anticipated expiration: 2029-08-07
Also published as: JP2014051505A; CA2733005C; WO2010016935A2; EP2915538A3; HK1154787A1; CN104031140A; EP2915538A2; PL2320923T3; EP2320923A4; JP5864506B2; PT2320923E; BRPI0917001A2; CA2733005A1; EP2320923B1; AU2009280012B2; CN104031140B; KR20130093693A; DK2320923T3; EP2320923A2; US20110136724A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (I),**Fórmula** en la que: A1 está delecionado; A2 es Ala, 4Hppa, o está delecionado; A3 es Glu, 4Hyp, Pro, o está delecionado; A4 es Gly, o está delecionado; A5 es Thr, o está delecionado; A6 is Phe, o está delecionado; A7 es A5c o A6c; A8 es Ser o Chc-Ser; A9 es Asp; A10 es Tyr; A11 es Ser, A6c o Aib; A12 es Ile; A13 es Ala o Aib; A14 es Met, A6c, o Nle; A15 es Asp; A16 es Lys; A17 es Ile; A18 es His; A19 es Gln; A20 es Gln; A21 es Asp; A22 es Phe; A23 es Val; A24 es Asn; A21 es Trp; A26 es Leu; A27 es Leu; A28 es Ala; A29 es Gln; A30 es Lys; A31 es Gly, Cys(Hsu), Cys(Psu), 2Nal, D-2Nal, Orn(N-C(O)-(CH2)4-CH3), Orn(N-C(O)-(CH2)8-CH3), Orn(N-C(O)- (CH2)12-CH3), o está delecionado; A32 es Lys, Cys(Psu), o está delecionado; A33 es Lys, Cys(Psu), o está delecionado; A34 es Asn, Cys(Psu), Orn(N-C(O)-(CH2)8-CH3), o está delecionado; A35 es Asp, Cys(Psu), o está delecionado; A36 es Trp, Cys(Psu), o está delecionado; A37 es Lys, Cys(Psu), o está delecionado; A38 es His, Cys(Psu), o está delecionado; A39 es Asn, Cys(Psu), o está delecionado; A40 es Ile, Cys(Psu), o está delecionado; A41 es Thr, o está delecionado; A42 es Gln, o está delecionado; A43 es Gln, o está delecionado; R1 es OH o NH2; cada uno de R2 y R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H o acilo(C1-C30); con la condición de que cuando R2 es acilo(C1-C30), entonces R3 es H; y con la condición de que cuando A2 es 4Hppa, entonces R2 y R3 están delecionados; y con la condición de que al menos uno de A2, A3, A4, A5, A6, A8, A9, A11, A13, A14, A31, A32, A33, A34, A35, A36, A37, A38, A39 y A40 no es el resto aminoácido de la correspondiente posición del GIP nativo; o su sal farmacéuticamente aceptable.

Description

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A3c:: ácido 1-amino-1-ciclopropancarboxílico

A4c:: ácido 1-amino-1-ciclobutancarboxílico

A5c:: ácido 1-amino-1-ciclopentancarboxílico

A6c:: ácido 1-amino-1-ciclohexancarboxílico

Act:: 4-amino-4-carboxitetrahidropirano

Ado:: ácido 12-aminododecanoico

Aib:: ácido α-aminoisobutírico

Aic:: ácido 2-aminoindan-2-carboxílico

Ala o A:: alanina

β-Ala:: beta-alanina

Amp:: 4-aminofenilalanina;

Apc:: 4-amino-4-carboxipiperidina:

Arg o R:: arginina

hArg:: homoarginina

Asn o N:: asparagina

Asp o D:: ácido aspártico

Aun:: ácido 11-aminoundecanoico

Ava:: ácido 5-aminovalérico

Cha:: β-ciclohexilalanina

Chc:: ácido ciclohexilcarboxílico

Cys o C:: cisteína

D-Ala:: D-alanina

Dhp:: 3,4-deshidroprolina

Dmt:: ácido 5,5-dimetiltiazolidina-4-carboxílico

Gaba:: ácido γ-aminobutírico

Gln o Q:: glutamina

Glu o E:: ácido glutámico

Gly o G:: glicina

His o H:: histidina

4Hppa:: ácido 3-(4-hidroxifenil)propiónico

Hsu:: N-hexilsuccinimida

3Hyp:: 3-hidroxiprolina

4Hyp:: 4-hidroxiprolina

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hPro:: homoprolina

Ile o I:: isoleucina

4Ktp:: 4-cetoprolina

Leu o L:: leucina

Lys o K:: lisina

Met o M:: metionina

Nle:: norleucina

NMe-Tyr:: N-metiltirosina

1Nal o 1-Nal:: β-(1-naftil)alanina

2Nal o 2-Nal:: β-(2-naftil)alanina

Nle:: norleucina

Nva:: norvalina

Orn:: ornitina

2Pal o 2-Pal:: β-(2-piridinil)alanina

3Pal o 3-Pal:: β-(3-piridinil)alanina

4Pal o 4-Pal:: β-(4-piridinil)alanina

Pen:: penicilamina

Phe o F:: fenilalanina

(3,4,5F)Phe:: 3,4,5-trifluorofenilalanina

(2,3,4,5,6)Phe:: 2,3,4,5,6-pentafluorofenilalanina

Pro o P:: prolina

Psu:: N-propilsuccinimida

Ser o S:: serina

Taz:: β-(4-tiazolil)alanina

3Thi:: β-(3-tienil)alanina

Thr o T:: treonina

Thz:: tioprolina

Tic:: ácido tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico

Tle:: terc-leucina

Trp o W:: triptófano

Tyr o Y:: tirosina

Val o V:: valina

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Ciertas otras abreviaturas que pueden utilizarse en la presente se definen a continuación:

Act:: acetonitrilo

Boc:: terc-butiloxicarbonilo

BSA:: albúmina de suero bovino

DCM:: diclorometano

DIPEA:: diisopropiletilamina

DMF:: dimetilformamida

DTT:: ditiotrieitol

ESI:: ionización de electropulverización

Fmoc:: 9-fluorenilmetiloxicarbonilo

HBTU:: hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HOBt:: 1-hidroxibenzotriazol

HPLC :: cromatografía líquida de alta resolución

IBMX:: isobutilmetilxantina

LC-MS:: cromatografía líquida-espectrometría de masas

Mtt:: metiltritilo

NMP:: N-metilpirrolidona

5K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 5.000.

5 10K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 10.000.

20K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 20.000.

30K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o 10 ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 30.000.

40K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 40.000.

50K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 50.000.

15 60K PEG: polietilenglicol, que puede incuir otros grupos funcionales o restos, tales como un conector, que es lineal o ramificado tal como se define a continuación, con un peso molecular total medio de aproximadamente 60.000.

tBu:: terc-butilo

TIS:: triisopropilsilano

Trt:: tritilo

TFA:: ácido trifluoroacético

Z:: benciloxicarbonilo

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en 45 ml de éter etílico anhidro frío. El precipitado se sedimentó durante 10 minutos a 3500 RPM en una centrífuga refrigerada. El éter se decantó, y el péptido se resuspendió en éter fresco. El tratamiento con éter se realizó un total de 2 veces. Después del último lavado con éter, el péptido se dejó secar al aire para eliminar el éter residual. El sedimiento del péptido se resuspendió en 8 ml de acetonitrilo (Acn), seguido de 8 ml de agua desionizada, y se dejó 5 que se disolviese completamente. La disolución del péptido después se analizó mediante espectrometría de masas. El análisis de masas empleando ionizacion de electropulverización identificó un producto principal que contenía una masa de 4414,9 Daltons, que se corresponde con el producto lineal. El producto bruto (aproximadamente 500 mg) se analizó mediante HPLC, empleando una columna de 250 x 4,6 mm C18 (Phenomenex, Torrance, CA, EEUU) empleando un gradiente de acetonitrilo al 2-80% (TFA al 0,1%) durante 30 minutos. La HPLC analítica identificó un 10 producto con 58% de pureza. El péptido bruto después se derivatizó con N-hexilmaleimida (Hma) para generar el derivado de hexilsuccinimida (Hsu) sobre la cadena lateral de cisteína. El péptido lineal bruto se introdujo en agua, ajustada hasta pH 6,5 con carbonato de amonio, a 5 mg/ml. Se añadieron 5 equivalentes de Hma con agitación constante durante 30 segundos. El exceso de Hma se extinguió empleando 5 eq. de ditiotreitol (DTT). La disolución del péptido derivatizado después se analizó mediante espectrometría de masas. El análisis de masas identificó un

15 producto principal que contenía una masa de 4596,1 Daltons, que se corresponde con el producto derivatizado con Hsu deseado. El producto después se volvió a purificar mediante una HPLC preparativa empleando un gradiente similar al que se indicó anteriormente. El producto purificado se analizó mediante HPLC para la pureza (95,4%) y mediante espectrometría de masas (4596,4 Daltons) y después se liofilizó. Después de la liofilización se obtuvieron 28,1 mg del producto purificado, que representan un rendimiento del 6,1%.

20 Los compuestos GIP PEGilados descritos en la presente pueden sintetizarse sustancialmente según el procedimiento descrito para la síntesis del compuesto del ejemplo 2, empleando PEG-maleimida como material de partida en lugar de la N-propilmaleimida empleada en el ejemplo 2.

Los expertos en la técnica pueden preparar otros péptidos descritos en la presente empleando procedimientos sintéticos análogos a los descritos en los anteriores ejemplos. Los datos físicos para los compuestos ejemplificados

25 en la presente se indican en la tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo n.º: Peso mol. (esperado) Peso mol. (ESI-MS) % de pureza (HPLC)

1: 4368,92 4368,8 96,70

2: 4498,06 4498,6 95,20

3: 4497,12 4497,5 99,90

4: 4474,08 4473,9 99,90

5: 4425,01 4425,0 99,90

6: 4496,13 4496,5 99,90

7: 4497,12 4496,7 99,90

8: 4483,05 4482,4 99,90

9: 4483,05 4482,7 99,90

10: 4554,17 4554,0 99,90

11: 4483,05 4482,7 98,40

12: 4636,38 4636,6 95,20

13: 4580,27 4580,7 96,70

14: 4538,23 4538,8 99,90

15: 4692,48 4693,1 95,00

16: 4524,16 4524,9 96,20

17: 4482,13 4482,6 99,90

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Ejemplo n.º: Peso mol. (esperado) Peso mol. (ESI-MS) % de pureza (HPLC)

18: 4580,27 4580,9 95,70

19: 4523,22 4523,7 95,50

20: 4481,18 4481,4 99,90

21: 4635,43 4636,0 95,30

22: 4596,25 4596,4 95,40

23: 4554,21 4554,6 95,80

24: 4509,11 4509,8 99,10

25: 4509,11 4509,9 99,90

26: 4787,37 4788,4 99,90

27: 4497,05 4496,8 99,90

28: 3530,07 3530,0 99,90

29: 3159,62 3159,6 96,40

30: 4701,35 4701,7 96,40

31: 4659,31 4660,0 95,10

32: 3064,50 3064,7 99,90

33: 3306,80 3306,7 96,30

34: 3264,76 3264,6 98,20

35: 2990,40 2990,8 96,83

36: 3004,42 3004,7 99,90

37 (ejemplo de referencia): 2990,44 2990,8 97,20

38 (ejemplo de referencia): 4270,80 4270,6 99,90

39 (ejemplo de referencia): 4413,06 4413,5 99,90

40 (ejemplo de referencia): 4497,12 4497,6 96,90

41 (ejemplo de referencia): 4485,11 4485,7 96,40

42: 4893,49 4894,4 99,90

43 (ejemplo de referencia): 4847,45 4848,1 99,90

44 (ejemplo de referencia): 4911,51 4911,4 99,90

45 (ejemplo de referencia): 4891,45 4891,0 99,90

46 (ejemplo de referencia): 4935,58 4935,8 99,90

47 (ejemplo de referencia): 5150,9 5151,4 99,9

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Ensayos funcionales

A. Ensayo de unión al receptor de hGIP in vitro

Las membranas para los ensayos de unión al receptor in vitro se prepararon homogeneizando células clonales CHO-K1 que expresan el receptor de GIP recombinante humano, con un Brinkman Polytron (ajuste 6, 15 seg), en 5 Tris-HCl 50 mM enfriado en hielo, y después sometiéndolas a dos centrifugaciones a 39.000 g durante 10 minutos, con una resuspensión en tampón fresco entre medias. Para el ensayo, se incubaron partes alícuotas de las preparaciones de membrana lavadas (100 minutos a 25 °C con [125I]GIP 0,05 nM (aproximadamente 2200 Ci/mmol) en Tris-HCl 50 mM, bacitracina 0,1 mg/ml, y BSA al 0,1%. El volumen final del ensayo fue de 0,5 ml. Las incubaciones se terminaron mediante filtración rápida a través de filtros GF/C (empapados previamente en

10 polietilenimina al 0,5%) usando un colector de filtración Brandel. A continuación, cada tubo y cada filtro se lavaron tres veces con partes alícuotas de 5 ml del tampón enfriado en hielo. La unión específica se definió como el radioligando total unido menos el unido en presencia de GIP 1000 nM. Los datos de unión al receptor de hGIP para los compuestos ejemplificados en la presente se indican en la tabla 2.

B. Ensayo de semivida plasmática en seres humanos y ratas

15 Se añadió el péptido GIP (50 µl, 1 mg/ml) a 450 µl de plasma (humano o de rata), se agitó en vórtice brevemente y se incubó a 37 °C. Se retiraron 50 µl en diversos momentos, por ejemplo a las 0, 1, 2, 3, 4, 8, 24, 32, 48, 56, 72 horas, se mezclaron con 5 µl de ácido fórmico y 150 µl de acetonitrilo en un tubo de microcentrífuga, se agitaron en vórtice y se centrifugaron durante 10 minutos a 10K rpm. El sobrenadante se trasladó a un vial de inyección y se analizó mediante LC-MS. El sistema de LC-MS consistió en un espectrómetro de masas API4000 con una sonda

20 ESI. Se empleó el modo de ion positivo y la detección de barrido completo. La separación por HPLC se realizó en una columna Luna 3µ C8 (2), 2 x 30 mm, con un gradiente desde A al 90% hasta B al 90% en 10 minutos a un caudal de 0,3 ml/min. El tampón A era ácido fórmico al 1% en agua, y el tampón B era ácido fórmico al 1% en acetonitrilo. Los datos de la semivida plasmática en seres humanos y ratas para los compuestos ejemplificados en la presente se indican en al tabla 2.

25 Tabla 2

Ejemplo n.º: Ki(nM) Plasma humano, T½ (hr) Plasma de rata, T½ (hr)

1: N/A >72 11,0

2: 532,19 13,7 7,2

3: 75,73 16,4 5,6

4: 332,97 10,0 6,0

5: 442,49 7,8 8,5

6: 486,41 8,0 3,2

7: 735,40 7,9 1,6

8: 416,57 N/A N/A

9: 686,96 N/A N/A

10: 963,06 8,0 2,6

11: 127,00 N/A N/A

12: 178,00 7,3 >72

13: N/A 17,8 19,0

14: N/A 4,1 15,3

15: N/A 5,2 >72

16: N/A >50 30,0

17: N/A >50 9,4

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Ejemplo n.º: Ki(nM) Plasma humano, T½ (hr) Plasma de rata, T½ (hr)

18: N/A 13,8 6,3

19: N/A 18,9 10,7

20: 274,00 9,4 13,9

21: 163,50 8,0 >72

22: N/A 7,7 5,0

23: 772,00 11,7 5,3

24: 194,33 26,3 12,2

25: 159,39 >50 13,7

26: 546,10 30,1 17,5

27: 7,92 N/A N/A

28: 114,78 8,8 4,1

29: 48,32 12,2 7,0

30: 574,00 7,2 7,6

31: 277,01 4,4 5,1

32: 68,54 24,1 60,3

33: 77,48 13,6 10,2

34: 101,42 11,3 7,4

35: 734,33 16,5 23,0

36: 212,33 21,9 21,6

37 (ejemplo de referencia): 170,00 13,5 28,5

38 (ejemplo de referencia): 472,00 N/A N/A

39 (ejemplo de referencia): N/A 31,1 13,7

40 (ejemplo de referencia): 403,33 4,1 6,9

41 (ejemplo de referencia): 205,48 5,9 3,7

42: 293,90 >51 10,3

43 (ejemplo de referencia): 800,01 >53 2,3

44 (ejemplo de referencia): 12,89 48,8 9,9

45 (ejemplo de referencia): 50,43 64,2 4,3

46 (ejemplo de referencia): 91,78 30,8 11,9

47 (ejemplo de referencia): N/A N/A N/A

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Claims

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