ES2442667T3 - Enzimas lisantes de la pared celular estables frente a proteasas - Google Patents

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Abstract

Variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13.

Description

Enzimas lisantes de la pared celular estables frente a proteasas
La presente invención se refiere a una variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13. La invención se refiere además a ácidos nucleicos con una secuencia que codifica para los polipéptidos de acuerdo con la invención.
Las bacterias patógenas aparecen en muchos sitios y provocan enormes problemas de salud por infecciones así como altos costes económicos por ejemplo también por ataque bacteriano indeseado en la industria alimentaria, cosmética o medioambiental. En la Sanidad, crecen cada vez más los problemas debidos a gérmenes resistentes a antibióticos, de modo que se buscan desesperadamente alternativas a los antibióticos. En la industria alimentaria y cosmética se intenta cada vez más defenderse sin los conservantes clásicos, que encuentran en la población cada vez menos aceptación. Como solución para estos problemas se ofrece el uso de enzimas lisantes de la pared celular, que suprimen de manera natural el crecimiento de las bacterias indeseadas y destruyen los gérmenes existentes.
Ejemplos de enzimas lisantes de la pared celular son endolisinas que se aislaron a partir de bacteriófagos. Los bacteriófagos utilizan estas enzimas al final de su ciclo de reproducción, para liberar los bacteriófagos formados dentro de la célula bacteriana. La envoltura bacteriana se lisa a este respecto y de esta manera se destruye la bacteria huésped. Un ejemplo adicional son enzimas que necesitan el bacteriófago al principio de su ciclo de reproducción y por regla general están localizadas en proteínas de cola de bacteriófago. Estas enzimas se necesitan para la rotura de la pared bacteriana en el caso de la infección bacteriana. Un tercer ejemplo son enzimas que presentan una función similar y con frecuencia también una similitud secuencial con respecto a las endolisinas. Estas enzimas son las autolisinas formadas por bacterias en determinadas circunstancias, que llevan a la autolisis de las bacterias. Un cuarto ejemplo son enzimas que se forman así mismo por bacterias y se conocen como bacteriocinas. Estos cuatro grupos de enzimas lisantes de la pared celular se utilizan ya técnicamente y probablemente en el futuro ganarán importancia.
Un campo de aplicación es el uso médico en la prevención y la terapia así como en el diagnóstico de infecciones bacterianas en el ser humano y en animales. Un campo de aplicación adicional es la aplicación en la industria alimentaria, medioambiental y cosmética para impedir un crecimiento bacteriano indeseado y para destruir los gérmenes por ejemplo mediante desinfección así como la detección de bacterias en muestras alimentarias, medioambientales y cosméticas.
Prácticamente todas las aplicaciones en las que se usan enzimas que lisan bacterias exigen altos requisitos sobre la estabilidad de las enzimas utilizadas, mereciendo la pena por lo tanto su uso económicamente. En el documento US
6.432.444 B1 se propone para la estabilización de las enzimas lisantes de la pared celular, usar por ejemplo un tampón de estabilización para garantizar la actividad enzimática óptima. Además se propone la adición de sustancias estabilizantes tales como agentes de reducción, quelantes de metal, inmunoglobulinas, sales tampón específicas, valores de pH fisiológicos, agentes conservantes o detergentes suaves.
En general la estabilidad de las proteínas se reduce con frecuencia debido a las proteasas presentes. Estrategias para el aumento de la estabilidad de proteínas frente a una degradación por proteasa son por ejemplo la adición de quelantes de metal, para inhibir las proteasas, que para su actividad necesitan iones de metal o la adición de inhibidores de proteasas especiales, tal como pueden obtenerse comercialmente por ejemplo para serina proteasas. Sin embargo, los inhibidores de proteasa pueden utilizarse para la estabilidad de enzimas lisantes de la pared celular sólo en determinados casos, porque perturban también otros componentes esenciales en el sitio de acción. Además los inhibidores específicos son también muy caros. También la elección de otras condiciones del entorno, en las que las proteasas son menos activas, no es posible por regla general, dado que las enzimas lisantes de la pared celular necesitan condiciones muy similares para su actividad que las proteasas. De este modo, las enzimas lisantes de la pared celular trabajan del mejor modo en un entorno acuoso y con valores de pH moderados, en las que la mayor es también la actividad proteasa. Los planteamientos de estabilización conocidos no son adecuados para el uso en el caso de enzimas lisantes de la pared celular.
Por lo tanto, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar enzimas estables lisantes de la pared celular.
El objetivo se consigue mediante el objeto definido en las reivindicaciones.
Las siguientes figuras sirven para explicar la invención.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de tipo natural del dominio CHAP (aminoácido 1-154), la región de ligador (subrayado, aminoácido 155-193) y el dominio de amidasa (aminoácido 194-393) de una endolisina de PlyPitti26. Puntos de corte potenciales para proteasa V8, que corta después del resto de aminoácido E, están resaltados en negrita y se encuentran en las posiciones de aminoácido 163, 179 y 189. El sitio de escisión de trombina está marcado en gris y se encuentra en la posición R167.
La Figura 2 muestra el resultado de una digestión con proteasa y posterior prueba de actividad de PlyPitti26 no modificada con las proteasas trombina y V8 proteasa. La Figura 2A muestra un gel de SDS-poliacrilamida con muestras de PlyPitti26 no modificada después de una digestión con trombina (T), V8 proteasa (V8) y una digestión de control con plasmina (P), para la que no existe sitio de escisión. PlyPitti26 sin digerir está marcada con “-”. M designa patrones de peso molecular con los tamaños de proteína indicados en el borde en kDa. En el borde derecho están indicadas las posiciones de las bandas para el fragmento del extremo N terminal del sitio de escisión de trombina (dominios CHAP), el fragmento del extremo C terminal del sitio de escisión (Ami-CBD) y las bandas de trombina añadida. La Figura 2B muestra el resultado de una prueba de lisis de líquidos para determinar las actividades específicas de PlyPitti26 no modificada digerida y no digerida. La lisis de células bacterianas se sigue mediante una medición de dispersión de la luz en el fotómetro. Están representadas las curvas de lisis para PlyPitti26 sin digerir (__), endolisina digerida con plasmina (-----), así como digerida con trombina (_._.) o digerida con V8 proteasa (_.._..).
La Figura 3 muestra el resultado de una digestión con proteasa de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada y no modificada. La Figura 3A muestra el resultado de una digestión con trombina de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3). CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada tiene un sitio de escisión de trombina singular entre el dominio CHAP y amidasa en la posición R167, el polipéptido modificado un intercambio de R con A en la posición 167. La Figura 3A muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de la digestión con trombina: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa indicados en el borde); 1 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada sin trombina; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada después de la digestión con trombina; 3 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin trombina; 4 -CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada después de la adición de trombina.
La Figura 3B muestra el resultado de una digestión con V8 proteasa de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada y de una endolisina de Staphylococcus modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (mutante 4 en la Tabla 3). CHAPAmiPitti26-CBDUSA no modificada tiene un sitio de escisión de V8 proteasa entre el dominio CHAP y amidasa en la posición E163, el polipéptido modificado un intercambio de E con A en la posición 163. La Figura 3B muestra un gel de SDS-poliacrilamida de ambas variantes de enzima antes y después de digestión con V8-proteasa: M - marcador de peso molecular (pesos moleculares en kDa indicados en el borde); 1 - CHAPAmiPitti26-CBDUSA no modificada sin V8 proteasa; 2 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 15 min de digestión con V8 proteasa; 3 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA no modificada 60 min de digestión con V8 proteasa; 4
- CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada sin V8 proteasa; 5 - CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada 15 min de digestión con V8 proteasa; 6 -CHAPAmiPitti26-CBDUSA modificada 60 min digestión con V8 proteasa.
La Figura 4 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de la endolisina modificada del fago de Cl. difficile < CD119 (CD119) con la endolisina modificada del fago de Cl. difficile < 630. El sitio de escisión de la caspasa 1 singular existente en < CD119 y < 630 de tipo natural en el aminoácido D214 se modificó a E214, el sitio de escisión de trombina singular presente en < 630 de tipo natural R87 se modificó a K87.
La Figura 5 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de la región del sitio de escisión de trombina de distintas endolisinas de Staphylococcus aureus. El residuo de aminoácido R marcado en negrita es la posición R167 en la secuencia de referencia ply_pitti26, denominada P26A. Las otras secuencias de aminoácidos indicadas están alineadas con R167 de ply_pitti26. La comparación de secuencias de aminoácidos se realizó con el programa BLAST; Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410. El número a la derecha junto a la comparación de secuencias de aminoácidos designa la posición de aminoácidos del último aminoácido en el segmento de secuencia representado de la endolisina respectiva. Los números en el borde izquierdo representan distintas proteínas homólogas de la comparación de secuencias de aminoácidos. P26A representa ply_pitti26, 15 una autolisina (Nacetilmuramoil-L-alanin-amidasa) de Staphylococcus aureus (número de acceso a la base de datos P24556), 16 representa una amidasa del bacteriófago 80 alfa (número de acceso a la base de datos AAB39699), 3 representa la endolisina del fago de Staphylococcus phi MR11 (número de acceso a la base de datos YP 001604156), 4 representa ORF006 del fago de Staphylococcus aureus 88 (número de acceso a la base de datos YP 240699), 5 representa ORF21 del fago de Staphylococcus aureus 85 (número de acceso a la base de datos YP 239752), 9 representa la amidasa del fago de Staphylococcus 11 (número de acceso a la base de datos NP803306), 10 representa ORF007 del fago de Staphylococcus 52A (número de acceso a la base de datos YP 240634), 11 representa la N-acetilmuramoil-L-alanin-amidasa de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9 (número de acceso a la base de datos YP 001246457), 12 representa la hidrolasa de la pared celular putativa del fago phiMR25 (número de acceso a la base de datos YP 001949866), 13 representa ORF007 del fago de Staphylococcus 69 (número de acceso a la base de datos YP 239596), 14 representa ORF007 del fago de Staphylococcus 55 (número de acceso a la base de datos YP 240484), 2 representa la N-acetilmuramoil-L-alanin-amidasa de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9 (número de acceso a la base de datos YP 001245749), 8 representa ORF007 del fago de Staphylococcus 29 (número de acceso a la base de datos YP 240560), 7 representa la autolisina de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325 (número de acceso a la base de datos YP 0516), 1 representa la amidasa del fago de Staphylococcus phiNM2 (número de acceso a la base de datos ABF73160), 6 representa una amidasa relacionada con fago de la cepa Staphylococcus aureus RF122 (número de acceso a la base de datos YP 417165), 17 representa ORF006 del fago de Staphylococcus 37 (número de acceso a la base de datos YP 240103) y 18 representa ORF007 del fago de Staphylococcus EW (número de acceso a la base 60 de datos YP 240182).
La Figura 6 reproduce secuencias de aminoácidos de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA modificada y no modificada. La Figura 6A a D muestra la secuencia de aminoácidos de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA sin sustituciones de aminoácidos en sitios de escisión de proteasas (A) y CHAP-AmiPitti26-CBDUSA con sustituciones de aminoácidos en sitios de escisión de proteasas (B a E). La Figura 6F a K muestra la secuencia de aminoácidos de CHAP-AmiPitti26- CBDUSA-Add2 sin sustituciones de aminoácidos en sitios de escisión de proteasas y un residuo 5 de aminoácido adicional en la posición dos (F) y CHAP-AmiPitti26-CBDUSA-Add2 con sustituciones de aminoácidos en sitios de escisión de proteasas y un residuo de aminoácido adicional en la posición dos (G a K).
La Figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos de la endolisina modificada de la cepa de Cl. difficile 630 con un intercambio de D214 a E214. La Figura 7B muestra la secuencia de aminoácidos de la endolisina de Cl. difficile modificada del fago phi CD119 con un intercambio de R87 a K87 y D214 a E214.
La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la endolisina Ply511. Las posiciones de aminoácidos marcadas en negrita E7, E40 y E89 pueden sustituirse con cualquier otro residuo de aminoácido.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la endolisina Ply511. Los posibles sitios de escisión (R en la posición P1) para la proteasa clostripaína están subrayados. Ambos sitios de escisión especialmente sensibles experimentalmente determinados (R92 y R221) están subrayados y marcados en negrita.
La Figura 10 muestra la digestión de la endolisina terapéuticamente utilizable CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) por proteasas existentes en extractos de órgano. La Figura 10A muestra un gel de SDS en el que las bandas de proteínas se separaron después de la incubación con extracto de hígado, riñón y pulmón. A la izquierda está representado un patrón de peso molecular. Los carriles 1 a 3 muestran controles (sólo endolisina, sin extracto de órgano), que no se incubaron en absoluto (carril 1), 18 h a temperatura ambiente (carril 2) o 18 h a 4 ºC (carril 3). En los carriles 4 a 6 se añadió extracto de hígado, en el carril 7 a 9 extracto de riñón y en los carriles 10 a 12 extracto de pulmón. Los carriles 4, 7 y 10 sólo contienen extracto de órgano, carriles 5, 8 y 11 extracto de órgano y endolisina después de 18 h de incubación a temperatura ambiente, carriles 6, 9 y 12 extracto de órgano y endolisina después de 18 h de incubación a 4 ºC. Las flechas con los números 1 a 7 junto al carril 9 marcan las bandas que se secuenciaron en el extremo N después de la transferencia a una membrana de transferencia. La Figura 10B muestra un gel de SDS en el que las bandas de proteínas se separaron después de la incubación con extracto de corazón o de bazo. A la izquierda está representado un patrón de peso molecular. Los carriles 1 a 3, así como 10, muestran controles (sólo endolisina, sin extracto de órgano), que no se incubaron en absoluto (carril 1 y 10), 18 h a temperatura ambiente (carril 2) o 18 h a 4 ºC (carril 3). En los carriles 4 a 6 se añadió extracto de corazón, en el carril 7 a 9 extracto de bazo. Los carriles 4 y 7 sólo contienen extracto de órgano, carriles 5 y 8 extracto de órgano y endolisina después de 18 h de incubación a temperatura ambiente, carriles 6 y 9 extracto de órgano y endolisina después de 18 h de incubación a 4 ºC.
La Fig. 11 muestra la secuencia de la endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) con zonas sensibles a proteasas. Los sitios de escisión (posición P1) que resultaron de la incubación con extracto de riñón están marcados en negrita. Las secuencias de aminoácidos que resultaron en la secuenciación del extremo N de los fragmentos formados están subrayadas. Las regiones de aminoácidos que definen el ligador de dominios están representadas en cursiva. Esto es una región del ligador de dominios entre los dominios CHAP y amidasa 2 (aminoácidos 159 a 198), así como un segundo ligador entre el dominio amidasa 2 y CBD (aminoácidos 347 a 412).
La Fig. 12 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de la región del sitio de escisión de la caspasa 1 de distintas de endolisinas Staphylococcus. Se trata de amidasas de los fagos de Staphylococcus SAP-2, 44AHJD y el fago 66. Los números de acceso a la base de datos NCBI para las proteínas son YP_001491539, 44AHJD_15 amidasa y YP_239469. La posición D42, después de la cual se escinde, está marcada en negrita, la secuencia de reconocimiento conservada para la caspasa 1 está respectivamente representada en cursiva y rodeada. Las 3 proteínas son idénticas en su longitud total al 89 al 90 %, aminoácidos no conservados para la región de aminoácidos 1 a 60 están marcados con “-”. La comparación de secuencias de aminoácidos se realizó con el programa BLAST.
El término “polipéptido” o “proteína” como aquí se usa designa péptidos de al menos ocho aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser polipéptidos farmacológica o inmunológicamente activos o polipéptidos usados para fines diagnósticos.
El término “enzimas lisantes de la pared celular” como aquí se usa designa enzimas que pueden romper la pared celular bacteriana al menos parcialmente o dañarla de forma que a continuación se produzca una lisis celular o al menos un efecto bacteriostático. El término designa especialmente endolisinas, autolisinas, proteínas de la cola de bacteriófago y bacteriocinas.
El término “endolisina” como aquí se usa designa enzimas que son naturalmente codificadas por bacteriófagos y que
las producen éstos al final de su ciclo huésped para lisar la célula huésped y así liberar los bacteriófagos recientemente producidos en la célula huésped. Las endolisinas están construidas por al menos un dominio enzimáticamente activo (EAD) y un dominio de unión a células no enzimáticamente activo (CBD). Los EAD individuales presentan diferentes actividades, presentando las endolisinas al menos un EAD seleccionado del siguiente grupo: N-acetil-muramoil-L-alanin-amidasa (amidasa, por ejemplo, Ami_2, Ami_5), (endo)-peptidasa (por ejemplo, CHAP, es decir, cisteína, amidohidrolasas/peptidasas dependientes de histidina), transglucosilasa, glucosilhidrolasa, (N-acetil)-muramidasa (lisozima) y N-acetil-glucosaminidasa.
El término “autolisina” como aquí se usa designa peptidoglucanohidrolasas bacterianas que en determinadas
situaciones conducen a una autolisis de bacterias. Funcionalmente y también estructuralmente son autolisinas y endolisinas frecuentemente relacionadas. Distintos dominios de endolisinas y autolisinas pueden combinarse con frecuencia modularmente y formar quimeras activas.
El término “proteína de la cola de bacteriófago” como aquí se usa designa proteínas con estructura de fago que al principio del ciclo de replicación del bacteriófago en la infección cumplen la función de unirse a receptores sobre la superficie bacteriana y a este respecto lisan componentes de la superficie celular mediante su función enzimática. Las proteínas de bacteriófago correspondientes no siempre deben estar localizadas en la cola de fagos, sino que también pueden situarse directamente en la cabeza del fago en fagos sin cola.
El término “bacteriocina” como aquí se usa designa toxinas proteinógenas que son secretadas por bacterias para inhibir el crecimiento del tamaño de géneros de bacterias similares. Están constituidas por un dominio que se une a
pared celular, un dominio de translocación y por el “factor de destrucción” (“killing factor”). A este respecto, el grupo
de bacteriocinas contenido en este contexto ataca membranas bacterianas. Ejemplos son colicina, microcina, nisina, epidermina y lantibióticos (antibióticos que contienen lantionina).
El término “pared celular” bacteriana como aquí se usa designa todos los componentes que construyen la envoltura celular externa de las bacterias y así garantizan su integridad. Bajo éste deben entenderse especialmente el peptidoglucano, la membrana externa de bacterias Gram negativas con el lipopolisacárido, la membrana celular bacteriana, pero también capas adicionales soportadas sobre el peptidoglucano como cápsulas, mucosidad o capas de proteínas externas.
El término “proteasa” como aquí se usa designa una enzima que está en situación de disociar hidrolíticamente proteínas y/o péptidos.
El término “dominio” como aquí se usa designa una región parcial de una secuencia de aminoácidos que está
definida funcional y/o estructuralmente. Los dominios pueden preverse frecuentemente muy bien debido a homologías mediante programas de búsqueda correspondientes que se apoyan en bases de datos correspondientes con dominios conservados (por ejemplo, Conserved Domain Database (CDD) en el NCBI (Marchler-Bauer y col., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6), Pfam (Finn y col., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251) o SMART (Schultz y col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864, Letunic y col., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260).
El término “de tipo natural” como aquí se usa designa la secuencia de aminoácidos tal como existe en proteínas naturales y cuya secuencia no se modificó con respecto a sitios de escisión de proteasas. A este respecto puede tratarse de secuencias de aminoácidos, tales como existen naturalmente en un bacteriófago, profago o bacteria. Adicionalmente, el término designa todas las secuencias de aminoácidos de enzimas lisantes de la pared celular existentes en las bases de datos que todavía contienen determinados sitios de escisión de proteasas, incluso cuando las secuencias de aminoácidos ya se modificaron en comparación con proteínas que existen naturalmente. En relación con secuencias de nucleótidos, el término natural también designa las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que presentan una secuencia de aminoácidos anteriormente descrita.
La presente invención se refiere a un polipéptido modificado con la actividad biológica para lisar paredes celulares de bacterias, no conteniendo el polipéptido caspasa, enterocinasa, factor Xa, granzima B, peptidasa I de Staphylococcus (V8 proteasa), plasmina, estreptopaína, bacilolisina o sitio de escisión de trombina, así como otros sitios de escisión de proteasas, que se determinaron específicamente para el polipéptido respectivo mediante digestión con proteasas con posterior análisis de los fragmentos formados y a continuación se modificaron de la forma descrita. La presente invención se refiere preferiblemente a polipéptidos modificados que lisan bacterias Gram positivas, pudiendo proceder las bacterias del grupo constituido por clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc. Preferiblemente, el polipéptido de acuerdo con la invención es una endolisina, una proteína de la cola de bacteriófago, una autolisina o
una bacteriocina.
La presente invención se refiere además a un polipéptido producido por recombinación con la actividad biológica para lisar paredes celulares de bacterias, presentando la secuencia de aminoácidos del polipéptido modificaciones 5 con respecto a la secuencia de tipo natural en posiciones de aminoácidos que son reconocidas por proteasas y/o después de las cuales las proteasas disocian los polipéptidos.
Ha resultado sorprendente que las enzimas lisantes de la pared celular puedan modificarse en su secuencia de aminoácidos de forma que pueda alcanzarse una estabilidad frente a proteasas elevada sin que deban añadirse 10 sustancias estabilizadoras. En general se sabe que distintas proteasas escinden la cadena de polipéptidos en un determinado residuo de aminoácido o necesitan motivos de secuencias de aminoácidos para su actividad enzimática. Los sitios de escisión de proteasas en proteínas pueden predecirse en la secuencia de aminoácidos existente con programas de análisis de secuencias adecuados (por ejemplo, ExPASy PeptideCutter, Gasteiger y col., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server en John M. Walker (ed): The Proteomics 15 Protocols Handbook, Humana Press (2005)). Así, para una proteína de tamaño medio con aproximadamente 300 a 400 residuos de aminoácidos generalmente resultan muchos más de 100 posibles sitios de escisión de proteasas, de manera que una estabilización de las proteínas sólo puede alcanzarse modificando los sitios de escisión de una pluralidad de proteasas. Sin embargo, esto no es factible, ya que la proteína pierde su acción y actividad cuando se introducen demasiadas modificaciones de aminoácidos. Otra posibilidad para determinar regiones sensibles a 20 proteasas, además de la predicción mediante la secuencia de aminoácidos, sobre todo para proteasas, en las que no se conoce ninguna secuencia de reconocimiento o no se conoce su identidad, es la determinación experimental de sitios de escisión reales mediante una digestión de las proteínas con proteasas que pueden obtenerse comercialmente. Además, para esto pueden usarse proteasas aisladas de organismo o muestras. Especialmente pueden usarse las muestras que contienen proteasas como, por ejemplo, muestras de alimentos, muestras 25 medioambientales, extractos de órgano, muestras médicas, sin aislar previamente las proteasas. A continuación, las mezclas madre de ensayo se someten a un análisis de los productos de degradación formados con ayuda de determinación de secuencias (por ejemplo, secuenciación del extremo N o C terminal, mapeo de péptidos junto con espectrometría de masas) y determinación del tamaño (por ejemplo, espectrometría de masas, análisis de bandas de geles de SDS, filtración en gel analítica). Realmente, los inventores han encontrado en muchas enzimas lisantes 30 de la pared celular sitios de escisión y motivos de secuencias de aminoácidos para proteasas. Esto parece sorprendente cuando se supone que las enzimas lisantes de la pared celular deben evolucionar verdaderamente a una alta estabilidad. Sin embargo, se mostró sorprendentemente que los sitios de escisión y los motivos de secuencias de aminoácidos para las proteasas están presentes en bajo número, frecuentemente incluso en forma singular, en las enzimas lisantes de la pared celular y frecuentemente también están conservados en proteínas
35 homólogas. De esta manera, una modificación de algunos pocos o incluso sólo un sitio de escisión de proteasa es suficiente para elevar la estabilidad de las enzimas lisantes de la pared celular.
En la presente invención sólo se modifican aquellos sitios de escisión de proteasas que son reconocidos por determinadas proteasas potencialmente existentes en el sitio de acción de las enzimas lisantes de la pared celular.
40 A este respecto, las secuencias de aminoácidos de las enzimas lisantes de la pared celular se modifican de forma que ya no puedan ser reconocidas por las proteasas específicas y en consecuencia ya no son escindidas. Esto conduce a una elevada estabilidad de las enzimas lisantes de la pared celular con respecto a proteasas existentes en el sitio de acción. Por lo tanto, se evita una pérdida inducida por proteasas de la actividad de enzimas lisantes de la pared celular y se alcanza una mayor eficacia.
45 Hay una serie de proteasas que para su actividad enzimática necesitan una secuencia de reconocimiento específica en sus proteínas de sustrato. Algunos ejemplos de éstas se indican en la siguiente tabla. El experto conoce múltiples otras proteasas tal como se describen, por ejemplo, en la base de datos de peptidasas Merops (Rawlings y col., 2008, Nucleic Acids Res 36, D320-D325). Sin embargo, lo siguiente también es válido para sitios de escisión de
50 proteasas de proteasas desconocidas que pueden determinarse experimentalmente. P1 designa la posición del aminoácido, después del cual se escinde, P4, P3 y P2 son las posiciones del extremo N terminal antes del sitio de escisión P1. La denominación P1’ y P2’ son las posiciones del extremo C terminal a continuación de P1. Esto significa que las proteasas disocian la cadena de polipéptidos entre P1 y P1’. Las letras en mayúsculas indicadas en lugar de los residuos de aminoácidos representan las designaciones internacionalmente usadas de residuos de
55 aminoácidos y son conocidas en general. Si en la descripción de la presente invención se usan letras en mayúscula, se indica el residuo de aminoácido correspondiente.
Tabla 1
Proteasa
Sitio de escisión
P4
P3 P2 P1 P1 P2
Caspasa 1
F, W, Y o L - H, A o T D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 2
D V A D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 3
D M Q D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 4
L E V D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 5
L o W E H D - -
Caspasa 6
V E H o I D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 7
D E V D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 8
I o L E T D no P, E, D, Q, K o R -
Caspasa 9
L E H D - -
Caspasa 10
I E A D - -
Clostripaína (clostridiopeptidasa B)
- - - R -
Enterocinasa
D o N D o N D o N K - -
Factor Xa
A, F, G, I, L, T, V o M D o E G R - -
Plasmina (fibrinolisina, fibrinasa)
- - - K o R - -
Estreptopaína (peptidasa A de Streptococcus)
- - F F Y -
Bacilolisina (proteasa neutra de Bacillus subtilis)
- G o F o A G o F L o F A o G o L -
Granzima B
I E P D - -
Peptidasa I de Staphylococcus (V8 proteasa)
- - no E E - -
Trombina
- - G R G -
A, F, G, I, L, T, V o M
A, F, G, I, L, T, V, W o A P R no D, E no D, E
Preferiblemente, la presente invención se refiere a un polipéptido modificado con la actividad biológica para lisar paredes celulares de bacterias, presentando el polipéptido de acuerdo con la invención, con respecto al que existe naturalmente, una o varias modificaciones en su secuencia de aminoácidos en una o varias de las posiciones
5 mostradas en la Tabla 1 o en sitios de escisión de proteasas experimentalmente determinados, existiendo una modificación o varias modificaciones en los aminoácidos de sitios de escisión de proteasas indicados en la Tabla 1 o experimentalmente determinados. De esta manera se aumenta la estabilidad del polipéptido frente a la proteasa o proteasas cuya secuencia de reconocimiento se modificó correspondientemente.
10 En una forma de realización preferida de la presente invención el residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido adecuado en la posición después de la cual se escinde (P1), de manera que el polipéptido de acuerdo con la invención ya no es escindido por la proteasa cuyo sitio de reconocimiento se modificó correspondientemente. En lugar de un intercambio del residuo de aminoácido en la posición P1 o también adicionalmente a un intercambio en la posición P1, otros residuos de aminoácidos pueden intercambiarse en el sitio
15 de reconocimiento, preferiblemente, las posiciones indicadas en la Tabla 1 de P4, P3, P2, P1’ y/o P2’, por otros residuos de aminoácidos. Preferiblemente se efectúan por sitio de reconocimiento 6, 5, 4, 3, 2, 1 sustituciones, de manera especialmente preferente de 1 a 3 sustituciones.
En una forma de realización adicional de la presente invención en un polipéptido pueden modificarse uno o varios 20 sitios de escisión de proteasas como se ha descrito previamente.
Es importante que la variante de proteínas de acuerdo con la invención después de la mutación no sólo presente una mayor estabilidad frente a una degradación por proteasas, sino que además también conserve su actividad lisante de la pared celular. Por tanto, la sustitución de aminoácidos se realiza como se describe a continuación.
25 En el estado de la técnica se conocen una serie de residuos de aminoácidos esenciales que son conocidos para la actividad de las enzimas lisantes de la pared celular, por ejemplo, cisteínas e histidinas conservadas en distintas amidasas o dominios CHAP. Los residuos esenciales correspondientes también pueden encontrarse con programas de análisis de secuencias que buscan especialmente dominios conservados (por ejemplo, Conserved Domain
30 Database (CDD) mediante NCBI (Marchler-Bauer y col., 2005, Nucleic Acids Res. 33, D192-6), Pfam (Finn y col., 2006, Nucleic Acids Research 34, D247-D251) o SMART (Schultz y col., 1998, proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 58575864, Letunic y col., 2006, Nucleic Acids Res 34, D257-D260).
Para desestabilizar lo menos posible la estabilidad, estructura y función de los polipéptidos de acuerdo con la invención, los residuos de aminoácidos que van a intercambiarse de la secuencia de reconocimiento de proteasas se sustituyen por residuos de aminoácidos que están a ser posible muy relacionados por su estructura y bioquímica y no obstante no son reconocidos por la proteasa. Entretanto es conocimiento especializado general clasificar los 20 5 aminoácidos existentes en la naturaleza en determinados grupos que se diferencian por su bioquímica (por ejemplo, aminoácidos ácidos, básicos, hidrófobos, polares, aromáticos), pero dentro de los cuales los aminoácidos están relacionados entre sí. Los intercambios para los residuos de aminoácidos en los polipéptidos están resumidos en la Tabla 2. Las posibilidades de intercambio mencionadas en la columna 2 representan alternativas de aminoácidos conservativos que son especialmente similares al residuo de aminoácido en el tipo natural tanto por su estructura
10 como por su función. Esto son variantes de intercambio especialmente preferidas. Sin embargo, para los polipéptidos lisantes de la pared celular de acuerdo con la invención también son posibles otras variantes de intercambio que se mencionan en la columna 3.
Tabla 2 15
Aminoácido en el tipo natural
Intercambio conservativo Otras posibilidades de intercambio
A (Ala)
S T, G, V, E, D
N (Asn)
Q, D K, H, I, T, S, A
D (Asp)
E, N A, G, S
R (arg)
K S, Q, A
C (Cys)
S M, G, A
E (Glu)
D, Q A, G, S, A
Q (Gln)
N, E H, L, R, A
G (Gly)
A S, N, D
H (His)
Q, N R, A
I (Ile)
V, L T, A
L (Leu)
V, I M, F, A
K (Lys)
R N, T, S, Q, A
M (Met)
L K, V, I, C, A
F (Phe)
Y L, I, M, A
P (Pro)
A S, Q
S (Ser)
A, T G, N, K
T (Thr)
S, A V, K, N
W (Trp)
Y F, S, R, A
Y (Tyr)
F H, N, C, A
V (Val)
I, A L, T
La matriz de Dayhoff representa otra posibilidad para determinar qué residuo de aminoácido se integra en lugar del residuo que va a sustituirse; véase, por ejemplo, en Creighton (Proteins: Structure and Molecular Properties, 2ª ed., 1984, Freeman, Nueva York). A partir de investigaciones de proteínas homólogas se sabe que la mutación al azar
20 de manera puramente estadística al nivel de los ácidos nucleicos no se refleja en la secuencia de aminoácidos de las proteínas correspondientes. Por tanto, parece que para determinadas posiciones de aminoácidos en las proteínas homólogas existe una presión de selección sobre determinados residuos de aminoácidos, lo que se especifica en la matriz de Dayhoff.
25 Otra posibilidad para determinar qué residuo de aminoácido se integra en lugar del residuo que va a sustituirse se sirve de la ayuda de programas de análisis de secuencias, por ejemplo, del programa BLAST, véase Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410. Con él pueden buscarse proteínas relacionadas con las enzimas lisantes de la pared celular que van a mutarse. A este respecto, el algoritmo de búsqueda encuentra similitudes al nivel de secuencias. Si se busca al nivel de secuencias de aminoácidos, entonces el programa “Protein BLAST” es adecuado
30 para mostrar parentescos funcionales y/o evolutivos. Si se encuentran variantes de aminoácidos con al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % de identidad en una región de aproximadamente 100 o 50 o 20 residuos de aminoácidos como límite alrededor del posible sitio de escisión de proteasas en proteínas estrechamente relacionadas, la secuencia de aminoácidos que se desvía de la secuencia de reconocimiento de proteasas puede integrarse en el polipéptido de acuerdo con la invención. A este
35 respecto, las sustituciones de aminoácidos pueden desviarse de las posibilidades de intercambio indicadas en la Tabla 2.
Hay una serie de endolisinas conocidas que presentan sitios de escisión de proteasas, como están representados en la Tabla 1, especialmente sitios de escisión para las proteasas trombina, caspasa, clostripaína o V8 proteasa. Especialmente sitios de escisión de trombina o caspasa son frecuentemente singulares y pueden sustituirse de acuerdo con la invención, de manera que resulte una endolisina estabilizada. En una forma de realización preferida, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en una o varias secuencias de reconocimiento de trombina. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con R en la posición P1 se intercambia con el residuo de aminoácido designado con K. También se describe un intercambio por S, Q o A. En la primera variante de la secuencia de reconocimiento de trombina (G; R; G), adicional o alternativamente al intercambio de R, ambos G o solo uno de ellos puede intercambiarse preferiblemente por A. En la segunda variante de la secuencia de reconocimiento de trombina (P; R; no D, E; no D, E), R también se intercambia preferiblemente por K o por S, Q o A. Adicionalmente o como alternativa, P en la posición P2 puede intercambiarse por A, S o Q. Además, adicionalmente
o como alternativa, una o ambas posiciones P1’ y P2’ pueden sustituirse con D o E.
En una forma de realización preferida adicional, el residuo de aminoácido D en la posición P1 de un sitio de escisión de caspasa se intercambia por N o A. El residuo de aminoácido R en la posición P1 de un sitio de escisión de clostripaína se intercambia preferiblemente por K o A, el residuo de aminoácido E en la posición P1 de un sitio de escisión de V8 proteasa por Q o A. Otros intercambios preferidos se resumen en la Tabla 2, también pueden realizarse intercambios estabilizadores en el sitio de reconocimiento fuera de la posición P1.
Formas de realización especialmente preferidas se indican en la SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4 y 5.
La presente invención se refiere además a un polipéptido producido de manera recombinante con la actividad biológica de lisar paredes celulares de bacterias, presentando la secuencia de aminoácidos del polipéptido adiciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de tipo natural. Preferiblemente, el polipéptido de acuerdo con la invención presenta una, dos, tres o cuatro adiciones de residuos de aminoácidos, pudiendo introducirse los residuos de aminoácidos coherentemente o independientemente entre sí. Se prefiere la adición de uno o dos residuos de aminoácidos, especialmente se prefiere la adición de un residuo de aminoácido, se prefiere muy especialmente la adición de un residuo de aminoácido en la posición dos. Las adiciones de aminoácidos pueden introducirse en polipéptidos que presentan modificaciones en posiciones de aminoácidos que son reconocidas por proteasas y/o después de las proteasas disocian los polipéptidos, o también en polipéptidos en los que no se integraron modificaciones de este tipo. Formas de realización especialmente preferidas se indican en la SEC ID Nº: 12-17, 19 y
22.
En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en una o varias secuencias de reconocimiento de V8 proteasa. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con E en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con A o Q. Una forma de realización especialmente preferida se indica en la SEC ID Nº: 6.
En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en uno o varios sitios de escisión de clostripaína. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con R en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con K o
A. Formas de realización especialmente preferidas se indican en la SEC ID Nº: 7 y 8.
En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en una o varias secuencias de reconocimiento de caspasa. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con D en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con E o A. Formas de realización especialmente preferidas se indican en la SEC ID Nº: 9 y 10.
En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en una o varias secuencias de reconocimiento de V8 proteasa y una o varias secuencias de reconocimiento de trombina. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con E en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con Q o A y el residuo de aminoácido designado con R en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con K o A. Una forma de realización especialmente preferida se indica en la SEC ID Nº: 11.
En una forma de realización preferida adicional, el polipéptido de acuerdo con la invención se modifica en una o varias secuencias de reconocimiento de proteasa que se identificaron después de una digestión con extracto de riñón. A este respecto, el residuo de aminoácido designado con Q en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con N o A y el residuo de aminoácido designado con S en la posición P1 se intercambia con otro residuo de aminoácido, preferiblemente, por el residuo de aminoácido designado con T o A. Formas de realización especialmente preferidas se indican en la SEC ID Nº: 12 y
13.
Las sustituciones de aminoácidos introducidas en el marco de la presente invención pueden realizarse con ayuda de técnicas convencionales de biología molecular que son conocidas para el experto y se indican, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular cloning. A laboratory manual; 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. Así, con ayuda de cebadores de ARN, las mutaciones deseadas pueden integrarse en la secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos de acuerdo con la invención. Las secuencias de nucleótidos modificadas así obtenidas pueden expresarse luego en un huésped adecuado, preferiblemente E. coli, y purificarse los polipéptidos. La secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos de acuerdo con la invención puede además adaptarse a las células huésped correspondientes con el llamado uso de codones (“codon-usage”) para conseguir una mejor expresión. Por tanto, la presente invención se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de acuerdo con la invención, vectores de expresión correspondientes y células huésped para la producción de los polipéptidos de acuerdo con la invención.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden investigarse con distintos ensayos para determinar la sensibilidad a proteasas y/o actividad enzimática. Ejemplos de tales ensayos son digestión con proteasas y posterior separación de los fragmentos mediante electroforesis en gel de SDS, espectrometría de masas, ensayo de lisis celular sobre placas de agar, ensayo de lisis de líquidos mediante medición de la dispersión de la luz en el fotómetro, ensayo de zimograma para ensayo de actividad sobre geles.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden utilizarse en los sectores médico, terapéutico, diagnóstico, de tecnología medioambiental, cosmético o alimentario.
La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de acuerdo con la invención. Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
Además, la presente invención se refiere a células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido de acuerdo con la invención. Una célula huésped adecuada para la expresión de los polipéptidos según la expresión comprende preferiblemente una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención. Preferiblemente, una célula huésped adecuada para la expresión del polipéptido de acuerdo con la invención se transforma con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.
A este respecto, en la modificación de los sitios de reconocimiento se modifica preferiblemente el sitio de reconocimiento de aquellas proteasas que existen de acuerdo con la invención en el campo de aplicación deseado. Así, se sabe que en los seres humanos o en animales existen, por ejemplo, las caspasas, trombina, granzima B, enterocinasa, factor Xa. El experto también conoce proteasas específicas para tejido, por ejemplo, las proteasas meprina y renina, que existen en el riñón. Además, también pueden existir proteasas de bacterias patógenas que desencadenan una infección en el ser humano o en animales o están presentes como flora secundaria. A éstas pertenecen, por ejemplo, la V8 proteasa de Staphylococcus o clostridiopeptidasa B de clostridios. Si los polipéptidos de acuerdo con la invención se usan en la terapia de aquellas infecciones, preferiblemente se modifican los sitios de reconocimiento para las proteasas que están presentes en las bacterias que son responsables de una infección que va a tratarse con terapia. Las regiones sensibles a proteasas de las enzimas lisantes de la pared celular se determinan preferiblemente de manera experimental mediante una digestión de las proteínas con proteasas que pueden obtenerse comercialmente, proteasas aisladas de organismos o muestras que contienen proteasas como, por ejemplo, muestras de alimentos, muestras medioambientales, extractos de órgano, muestras médicas y un posterior análisis de los productos de degradación formados con ayuda de determinación de secuencias (por ejemplo, secuenciación del extremo N o C terminal, mapeo de péptidos junto con espectrometría de masas) y determinación del tamaño (por ejemplo, espectrometría de masas, análisis de bandas de geles de SDS, filtración en gel analítica). Un campo de aplicación para enzimas lisantes de la pared celular es la aplicación tópica en heridas en forma de pomadas, cremas, tinturas o coberturas para heridas como vendajes o vendas, por ejemplo, en una infección por estafilococos o clostridios. Problemas de estabilidad adicionales para las enzimas lisantes de la pared celular pueden aparecer por el hecho de que en el cuidado de las heridas se usen parcialmente medicamentos o productos médicos que también contienen proteasas. Por ejemplo, en las heridas de la piel se intenta conseguir una ligera limpieza de la herida mediante fibrinólisis. Ejemplos de proteasas que se utilizan en el cuidado de heridas son fibrinolisina, plasmina, estreptocinasa, clostridiopeptidasa A y proteasa de Bacillus subtilis. Los polipéptidos de acuerdo con la invención también presentan preferiblemente modificaciones de los sitios de reconocimiento para estas proteasas.
En la industria alimentaria, medioambiental y cosmética también pueden estar presentes múltiples proteasas que o bien se producen por bacterias que se usan, por ejemplo, en la preparación de alimentos como lactobacilos, lactococos o distintas cepas de bacilos, o bien serán secretadas por gérmenes no deseados que serán lisados (por ejemplo, B. cereus, B. subtilis, Cl. perfringens, Cl. botulinum). En bacterias que se usan en la preparación de alimentos como, por ejemplo, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. delbrueckii, L. brevis, L. helveticus o Lactococcus lactis se conocen, por ejemplo, respectivamente entre 60 y 130 proteasas. Adicionalmente, las proteasas también están presentes en los propios alimentos. Los polipéptidos de acuerdo con la invención presentan preferiblemente aquellas modificaciones de los sitios de reconocimiento de proteasas que existen en la industria alimentaria, medioambiental y cosmética. La presente invención se refiere además al polipéptido de acuerdo con la invención como fármaco o composición farmacéutica así como al uso del polipéptido de acuerdo con la invención como fármaco o composición farmacéutica para la prevención o terapia de enfermedades, que se provocan por bacterias Gram positivas, especialmente clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc.
La presente invención se refiere además al polipéptido de acuerdo con la invención como agente de diagnóstico o composición de diagnóstico, así como al uso del polipéptido de acuerdo con la invención como agente de diagnóstico o composición de diagnóstico en la Medicina para la detección de enfermedades, especialmente las que se provocan por bacterias Gram positivas, especialmente clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc.
El polipéptido de acuerdo con la invención se usa además en el diagnóstico para lisar específicamente las bacterias que van a detectarse, de manera que puedan seguir una o varias etapas de detección que detectan constituyentes celulares específicos de las bacterias como, por ejemplo, ADN, ARN, enzimas, componentes de la pared celular. Por el estado de la técnica se conocen procedimientos adecuados para ello, por ejemplo, PCR, NASBA, hibridación, detecciones basadas en anticuerpos tales como ELISA, detecciones bioquímicas para determinadas enzimas específicas, detecciones colorimétricas.
Además, la presente invención se refiere al uso del polipéptido de acuerdo con la invención para suprimir el crecimiento o la detección de bacterias Gram positivas en la industria medioambiental, alimentaria o cosmética.
Los siguientes ejemplos de realización sirven para explicar la invención, pero no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1: Digestión con proteasas de PlyPitti26
Se realizó una digestión de PlyPitti26 con las proteasas trombina y V8. Respectivamente, 90 !l de disolución de proteína (concentración de proteína 1,35 mg/ml) se mezclaron con 10 !l de trombina y en mezclas madre de control sólo con plasmina. Para la digestión con V8 proteasa se usaron 99 !l de disolución de proteína y 1 !l de disolución de proteasa. La concentración de las disoluciones madre de proteasa ascendió respectivamente a 500 !g/ml. Las mezclas madre de ensayo se incubaron durante la noche a 25 ºC en un tampón Tris 20 mM/HCl, pH 7,5, DTE 10 mM, ZnSO4 0,1 mM. Una parte de las muestras se mezcló con tampón de aplicación de gel de SDS y después de hervir se analizó sobre geles de SDS-poliacrilamida.
Se comprobó que PlyPitti26 fue completamente degradada por trombina, formándose dos fragmentos de proteína relativamente grandes, de los cuales uno contenía el dominio CHAP y el otro el dominio amidasa y CBD. En una digestión con V8 proteasa se formaron varios fragmentos de proteína más pequeños, pero también definidos. En una digestión de control con plasmina no se realizó la fragmentación de la proteína en las condiciones especificadas. Los resultados se muestran en la Figura 2A.
Ejemplo 2: Ensayo de actividad de PlyPitti26 sin tratar y tratada con proteasas
En otros experimentos, las muestras se sometieron a prueba en el ensayo de lisis de líquidos para determinar la reactividad lítica con respecto a células de Staphylococcus. El ensayo de lisis de líquidos es un ensayo de actividad para enzimas lisantes de la pared celular en el que se mide la lisis celular bacteriana en tiempo real mediante dispersión de la luz en el fotómetro. A este respecto, la absorción a una longitud de onda de 600 nm es una medida del número de células bacterianas presentes. Si se lisan las células bacterianas, la disolución de muestra se volverá poco a poco clara y la absorción medida disminuirá en el caso ideal hasta un valor de cero. Las bacterias de Staphylococcus se cultivaron en medio BHI hasta una DO600 de aproximadamente 0,8. Las células no inactivadas por calor se recogieron y se resuspendieron en tampón TBST (Tris 20 mM/HCl, pH 7,5, NaCl 60 mM, 0,1 % de Tween, CaCl2 2 mM) a una DO600 de aproximadamente 1. 990 !l de suspensión celular se mezclaron respectivamente con 10 !l de disolución enzimática (concentración de enzima en el ensayo 10 !g/ml) y la reducción de la absorción a 600 nm se siguió a 30 ºC.
Se comprobó que en PlyPitti26 no diluida y en el control de plasmina se produjo una lisis completa de los estafilococos después de aproximadamente 1000 s, mientras que en las muestras digeridas con trombina y V8 proteasa ya no tuvo lugar una lisis celular visible, es decir, la enzima lisante de la pared celular se inactivó completamente. Los resultados se muestran en la Figura 2B.
Ejemplo 3. Estabilización de CHAP-AmiPitti26-CBDUSA
Una variante de endolisina producida sintéticamente activa contra estafilococos que está constituida por los dominios enzimáticamente activos CHAP y Ami de la endolisina de PlyPitti26 y por los dominios que se unen a la pared celular (CBD) de la endolisina del profago <SA2USA, que procede del genoma de la cepa de MRSA USA300 (Diep y col., The Lancet, 2006, 367, 731-739; número de acceso de la base de datos NC_007793) se designa CHAP-AmiPitti26-CBDUSA.
Para estabilizar esta proteína frente a la digestión con trombina y digestión por V8 proteasa, tanto el sitio de escisión de trombina como también los sitios de escisión de V8 que se encuentran en el ligador entre el dominio CHAP y amidasa se modificaron por sustituciones de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida a sitio. Las mutaciones simples, dobles, triples y cuádruples de acuerdo con la invención realizadas para este fin están resumidas en la 5 Tabla 3. Para todos los mutantes indicados en la Tabla 3, la actividad de endolisina contra estafilococos todavía se detectó después de la mutación en la prueba de lisis en placa como se describe más adelante. Las posiciones de aminoácidos indicadas en la tabla se refieren a las posiciones respectivas de la secuencia de tipo natural o a las posiciones en polipéptidos modificados en los que no se introdujeron residuos de aminoácidos. Por ejemplo, la posición E163 está en una forma de realización de un polipéptido de acuerdo con la invención con una adición de
10 aminoácido en la posición dos E164, entonces la posición E167 es E168. La posición se desplaza correspondientemente en más de una adición de aminoácido. Si un residuo de aminoácido se introduce primero en la posición 174, entonces la posición E163 queda igual, pero la posición E189 cambia a E190.
Tabla 3 15
Mutante
Sitio de escisión V8: V8 proteasa T: trombina Intercambio
1
E163 (V8) R167 (T) 163Q 167K
2
E163 (V8) R167 (T) 163Q 167A
3
E163 (V8) R167 (T) 163A 167K
4
E163 (V8) R167 (T) 163A 167A
5
E179 (V8) 179Q
6
E179 (V8) 179A
7
E189 (V8) 189Q
8
E189 (V8) 179A
9
E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179Q 189Q
10
E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163Q 167A 179A 189Q
11
E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179Q 189Q
12
E163 (V8) R167 (T) E179 (V8) E189 (V8) 163A 167A 179ª 189Q
13
R167 (T) 167A
14
E163 (V8) 163A
15
E163 (V8) 163Q
16
R167 (T) 167K
17
E179 (V8) E189 (V8) 179A 189Q
18
E179 (V8) E189 (V8) 179Q 189Q
19
E163 (V8) R167 (T) E189 (V8) 163Q 167A 189Q
20
E163 (V8) R167 (T) E189 (V8) 163A 167A 189Q
Las endolisinas se utilizaron a una concentración de 1 mg/ml en la digestión. Para la digestión con trombina se utilizaron 90 !l de proteína y 10 !l de trombina humana (disolución madre con 50 !g/ml). Las mezclas madre de ensayo se incubaron durante la noche a 25 ºC en tampón (Tris 20 mM/HCl, pH 7,5, DTE 10 mM, ZnSO4 0,1 mM). Una parte de las muestras se mezcló con tampón de aplicación de gel de SDS y después de hervir se analizó sobre
5 geles de SDS-poliacrilamida. La mutación de R en la posición 167 a A conduce a una insensibilización completa frente a trombina. Lo mismo es válido para la mutación de R en la posición 168 a A, después de la adición de A en la posición de aminoácido dos (CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA-Add2).
CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA no modificada, CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA-Add2 y el mutante 4 respectivo
10 (E163A,R167A o E164A, R1678) también se digirieron con V8 proteasa. Las endolisinas se utilizaron en una concentración de 1 mg/ml en la digestión. Para la digestión con V8 proteasa se utilizaron 99 !l de proteína y 1 !l de V8 proteasa (disolución madre con 500 !g/ml). Las mezclas madre de ensayo se incubaron durante 15 min o 60 min en tampón Tris 20 mM/HCl, pH 7,5, DTE 10 mM, ZnSO4 0,1 mM. Una parte de las muestras se mezcló con tampón de aplicación de gel de SDS y después de hervir se analizó sobre geles de SDS-poliacrilamida. Aunque la mutación
15 de E en la posición 163, o 164, a A no conduce a una insensibilización completa en comparación con V8 proteasa, el mutante según la invención está claramente estabilizado en comparación con el tipo natural en el que se produjo una digestión completa. El sitio de escisión de trombina modificado en la posición 167/168 no desempeñó ninguna función en la digestión con V8 proteasa realizada. En los polipéptidos modificados, dos fragmentos de aproximadamente 40 kDa todavía están presentes tanto después de 15 min como también después de 60 min, que
20 en los polipéptidos no modificados sólo estuvieron presentes débilmente después de 15 min y después de 60 min ya no estuvieron presentes.
Ejemplo 4. Ensayo de lisis con endolisinas sensibles a proteasas y resistentes a proteasas
25 Para investigar si los polipéptidos de acuerdo con la invención todavía tienen la actividad deseada después del intercambio de aminoácidos, se sometieron a prueba en un ensayo de lisis en placa con distintas cepas de Staphylococcus. Las cepas de bacterias se cultivaron durante la noche en cultivos de 5 ml en medio BHI y las células bacterianas se centrifugaron 5 min a 4000 rpm en la centrífuga de mesa. El sedimento celular se resuspendió a continuación en 200 !l de tampón PBS (fosfato de Na 10 mM, NaCl 144 mM, KCl 50 mM, pH 7,4) y
30 las células se inactivaron con calor 30 min a 80 ºC. Las células inactivadas con calor se vertieron con 15 ml de agar superior en placas de Petri y se secaron. A continuación se salpicaron respectivamente 5 !g de proteína y las placas de agar se incubaron durante 1 h a 30 ºC. Las coronas de lisis celular formadas en los sitios de las proteínas salpicadas se evaluaron visualmente y dependiendo del tamaño se valoraron con +++, ++ y + o con -, en caso de que no se produjera la lisis.
35 El resultado de la prueba para algunos de los polipéptidos de acuerdo con la invención está resumido en la Tabla 4.
Tabla 4
Especies de Staphylococcus
PlyPitti26 (no modificada) Mutante 10 de la Tabla 3 (E163Q,R 167A, E179A, E189Q) Mutante 4 de la Tabla 3 (E163A, R167A) CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (no modificada)
MRSA de Staphylococcus aureus
+++ +++ +++ +++
MRSA de Staphylococcus aureus
+++ +++ +++ +++
MRSA de Staphylococcus aureus
++ +++ +++ +++
Staphylococcus epidermis
+++ +++ +++ +++
Staphylococcus equorum
+ ++ ++ ++
Staphylococcus sciuri
- ++ + ++
Staphylococcus saprophyticus
- +++ ++ +++
Staphylococcus sciuri
- - - -
MRSA de Staphylococcus aureus
+++ +++ +++ +++
Staphylococcus epidermidis
+++ +++ +++ +++
Negativa para coagulasa de Staphylococcus epidermidis
++ ++ ++ ++
Negativa para coagulasa de Staphylococcus haemolyticus
++ ++ ++ ++
Negativa para coagulasa de Staphylococcus epidermidis
+++ +++ +++ +++
Tanto PlyPitti26 no modificada como también CHAP-AmiPitti26-CBDUSA presentaron un amplio espectro de lisis con respecto a distintas cepas de Staphylococcus, mostrando CHAP-AmiPitti26-CBDUSA una actividad lítica algo mejor. Los dos polipéptidos modificados de acuerdo con la invención mostrados en la tabla, Mutante 4 y Mutante 10
5 con los intercambios de aminoácidos en los sitios de escisión de trombina o distintos de V8 proteasa presentaron una actividad prácticamente idéntica a la de la proteína no modificada CHAP-AmiPitti26-CBDUSA. Esto mostró que las mutaciones de acuerdo con la invención no influyeron negativamente en la actividad de las enzimas lisantes de la pared celular. Lo mismo era válido para CHAP-Ami_Pitti26-CBD-USA-Add2 no modificada, así como los polipéptidos de CHAP-Ami_ Pitti26-CBD-USA-Add2 modificada correspondientes.
10 Ejemplo 5: Enzimas que se unen a la pared celular modificadas contra Clostridium difficile
Dos endolisinas de distintos fagos de Cl. difficile (números de acceso YP_529586 para la endolisina del fago < CD119 y YP_001087453 para la endolisina de la cepa Cl. difficile 630) presentaron un sitio de escisión de la 15 caspasa 1 singular después de los aminoácidos D214, mientras que un sitio de escisión de trombina singular sólo apareció en la endolisina del fago < CD119 en la posición 87. Debido a la alta similitud de secuencias de ambas endolisinas, además de las modificaciones de los sitios de escisión de la caspasa 1 de D214 a E214 en < CD119, la endolisina R en la posición 87 se intercambió por K, que en la endolisina homóloga de la cepa Cl. difficile 630 estaba presente en esta posición y no se reconoce por trombina como sitio de escisión. Otras modificaciones de acuerdo
20 con la invención están representadas en la Tabla 2.
Ejemplo 6: Determinación de regiones sensibles a proteasas dentro de la secuencia de Ply511.
Ply511 tiene 6 posibles sitios de escisión para la peptidasa I de Staphylococcus (6 glutamatos) debido a su
25 secuencia de aminoácidos. Para descubrir qué regiones de la endolisina Ply511 son especialmente sensibles a proteasas se realizaron experimentos de digestión con proteasas con la peptidasa I de Staphylococcus. Para la degradación con peptidasa I de Staphylococcus se usaron 99 !l de disolución de proteína (concentración de aproximadamente 1 mg/ml) y 1 !l de disolución de proteasa (concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml). Las mezclas madre de ensayo se incubaron durante distintos intervalos de tiempo (minutos a varias horas) a 37 ºC en un
30 tampón con Tris 20 mM/HCl, NaCl 100 mM, pH 8,0. Las bandas de proteínas se separaron sobre geles de SDS. Los fragmentos de degradación formados se transfirieron a membranas de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), se cortaron bandas bien separadas y se secuenció el extremo N terminal. Resultaron tres sitios de escisión preferidos para peptidasa I de Staphylococcus después de los aminoácidos E7, E40 y E89.
35 Ejemplo 7: Eliminación de sitios de escisión de peptidasa I de Staphylococcus en Ply511
En las posiciones E7, E40 y E89, las sustituciones se realizaron tanto como sustitución individual como en combinación, de manera que en los mutantes formados aparecieron otros aminoácidos, excepto glutamato, en las posiciones respectivas, que ya no se escinden por peptidasa I de Staphylococcus. Los mutantes así obtenidos se
40 utilizaron en la digestión con proteasas descrita en el Ejemplo 6 y a continuación se analizaron sobre geles de SDS, si las bandas de degradación correspondientes todavía aparecían o no. Demostraron ser especialmente adecuadas las mutaciones E7A y E7Q, así como E40A y E40Q.
Ejemplo 8: Resistencia frente a trombina y V8 proteasa de distintas variantes de endolisina de Plypitti26 y CHAP45 AmiPitti26-CBDUSA.
Distintas combinaciones de mutantes de acuerdo con la invención de la Tabla 3 se introdujeron en la variante de Plypitti26 CHAP-AmiPitti26-CBDUSA y CHAP-AmiPitti26-CBDUSA-Add2 y se combinaron en parte con otras mutaciones. A continuación, estas variantes de endolisina se sometieron a prueba para determinar su resistencia 50 frente a trombina y V8 proteasa, así como la actividad enzimática (detección como se ha descrito en el Ejemplo 3). Los resultados están resumidos en la Tabla 5 para CHAP-AmiPitti26-CBDUSA y sus modificaciones. Los resultados
para CHAP-AmiPitti26-CBDUSA-Add2 y sus modificaciones (las posiciones de aminoácidos están desplazadas una posición en la dirección del extremo C terminar con respecto a las posiciones en la tabla respectivamente) son idénticos y no se reproducen de nuevo en la Tabla 5.
Tabla 5: Resistencia frente a trombina y V8 proteasa de distintos mutantes de CHAP-Amipitti26_CBDUSA (en la tabla se denomina EADpitti26_CBDUSA) en comparacióncon el tipo natural de Plypitti26
Constructo de endolisina
plypitti26 EADpitti26_CBDUSA EADpitti26_CBDUSA EADpitti26 _CBDUSA EADpitti26 _CBDUSA EADpitti26 _CBDUSA EADpitti26 _CBDUSA EADpitti26 _CBDUSA
Mutaciones
E163A, R167A, Y200H E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H L55H, L56T, E163A,R167A,Y200H L55H, L56T, E163A,R167A,E179A,E189Q, Y200H L55H, L56T, E163A,R167A
Propiedad
Ensayo
Resistencia frente trombina
SDS-PAGE - +++ ++ +++ +++ - +++ +
Resistencia frente trombina
Flüssiglyse - - - ++ ++ - - +
Resistencia frente a V8 Proteasa
SDS-PAGE - - + - + - - -
Se mostró que las variantes de endolisina de acuerdo con la invención CHAP-Amipitti26_CBDUSA (E163A, R167A, Y200H), CHAP-Amipitti26_CBDUSA (E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H), CHAP-Amipitti26_CBDUSA (L55H, L56T, E163A, R167A, Y200H), CHAP-Amipitti26_CBDUSA (L55H, L56T, E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H) y CHAPAmipitti26_ CBDUSA (E163A, R167A), así como CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (E164A, R168A, Y201H), CHAPAmipitti26_ CBDUSA-Add2 (E164A, R168A, E180A, E190Q, Y201H), CHAP-Amipitti26_CBDUSA-5 Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H), CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, E180A, E190Q, Y201H) y CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (E164A, R168A) presentaban una resistencia de buena a muy buena frente a la digestión con trombina. Las variantes de endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA (L55H, L56T, E163A, R167A, Y200H) y CHAP-Amipitti26_CBDUSA (L55H, L56T, E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H), así como CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) y CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, E180A, E190Q, Y201H), también mostraron en el ensayo de lisis de líquidos una alta actividad enzimática después de la digestión con trombina. Las variantes de endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA (E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H) y CHAP-Amipitti26_CBDUSA (L55H, L56T, E163A, R167A, E179A, E189Q, Y200H), así como CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (E164A, R168A, E180A, E190Q, Y201H) y CHAP15 Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, E180A, E190Q, Y201H), presentaban una resistencia mejorada frente a la digestión con V8 proteasas. Especialmente las sustituciones E179A y E189Q o E180A y E190Q demostraron ser ventajosas en este caso.
Ejemplo 9: Endolisinas con sitios de escisión de proteasas de acuerdo con la invención
Si una sustitución de acuerdo con la invención de un residuo de aminoácido demuestra ser ventajosa, puede detectarse mediante las detecciones descritas anteriormente para estabilidad de proteasas y actividad de endolisina. En la Tabla 6 se muestra una serie de ejemplos de endolisinas, que lisan representantes de distintos géneros de bacterias y que pueden estabilizar de acuerdo con la invención contra degradación por proteasas. Los sitios de escisión de proteasas se determinaron con el programa PeptideCutter (Gasteiger y col., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)).
Tabla 6: Endolisinas con sitios de escisión de proteasas de acuerdo con la Tabla 1
Sitios de escisión de proteasas para
Endolisina (lisis debacterias del género)
Fuente para la secuencia de aminoácido (número de acceso de NCBI) Trombina; número de aminoácidos P1 ysecuencia de reconocimiento Caspasa 1; número deaminoácidos P1 ysecuencia de reconocimiento Clostripaína;número V8 proteasa;número
PlyPitti26 (Staphylococcus)
Neu 167 (TAPR) 20 24
CHAP-AmiPitti26-CBDUSA (Staphylococcus)
Neu 167 (TAPR) 21 23
Amidasa del fago de Staphylococcus SAP-2
(YP_0014915 39) 39) 42 (YITDG) 7 9
Endolisina E1 (Enterococcus)
(NP_814147) 106 (FLPR) 358 (YGTDY) 6 15
Endolisina E2 (Enterococcus)
(NP_815016) 330 (YIADG) y Caspasa 1031 (IEAD) 13 13
Endolisina E5 (Enterococcus)
(NP_815749) 147 (WLADY) 8 13
Fab25 (Enterococus)
Neu 112 (LLHDL) 14 9
B30-PlyGBS (Streptococcus)
(AAR99416) 388 (LSTDY) 12 18
Pal amidasa (Streptococcus)
(CAB07986) 14 13
Cp1 Lisina (Streptococcus)
(2IU_A) 133 (FTHDN) 7 12
LysK (Staphylococcus)
(YP_024461) 60 (LITDY) y 67 (WLTDN) 16 18
Ply187 (Staphylococcus)
(CAA69022) 596 (YATDI) 23 20
Lisostafina(Staphylococcus)
(AAB53783) 9 51
Ply511 (Listeria)
(Q38653) 6 6
Ply118 (Listeria)
Documento EP0781349 B1; SEQ ID Nº: 4 262(GTPR) 129 (YGTDT) 8 6
PlyA500 (Listeria)
(AAY52812) 12 12
Ply21 (Bacillus)
(CAA72267) 82 (GRG) 15 13
PlyBA (Bacillus)
(CAA72266) 11 25
Ply12 (Bacillus)
(CAA72264) 14 10
PlyCD119 (Clostridium)
Neu 87 (GRG) 214 (LVTDI) 7 13
Ply3626 (Clostridium)
Documento US 7.371.375 B2; SEQ ID Nº:2 17 27
Ejemplo 10: Determinación de sitios de escisión de clostripaína en endolisinas de Listeria
Como se puede ver en la Tabla 6, posibles sitios de escisión para clostripaína en endolisinas están frecuentemente presentes en mayor número (de 6 a 23 en los ejemplos descritos). Dado que una sustitución de todos los posibles 5 sitios de escisión puede influir negativamente en la actividad de la endolisina, es útil determinar para la proteasa sitios de escisión accesibles y sólo modificar éstos. La endolisina de Listeria Ply511 contiene seis posibles sitios de escisión para clostripaína. Se realizó una digestión con clostripaína de Ply511 para determinar las regiones sensibles a clostripaína de la endolisina. Ply511 (0,1 mg/ml) se digirió durante 3 h o durante la noche a temperatura ambiente con 5 unidades de clostripaína (definición de unión según datos del fabricante, Sigma) en 60 !l de volumen
10 de muestra con la siguiente composición: fosfato de sodio 25 mM, acetato de calcio 1 mM, DTT 2,5 mM, pH 7,6. Los fragmentos de proteína formados se separaron por electroforesis en gel de SDS (geles de gradiente 10 - 20 % de acrilamida). Aparecieron 3 bandas (pesos moleculares aproximadamente 25 kDa, aproximadamente 14 kDa, aproximadamente 10 kDa) que se transfirieron a membranas de PVDF, luego se cortaron y se secuenciaron mediante degradación de Edman del extremo N terminal.
15 Resultaron las siguientes secuencias del N terminales para los fragmentos:
1.
(M)V K Y T V E N K; la metionina del N se disoció en parte
2.
DKLAK
20 3. TSNATTF
Este resultado muestra que de los seis posibles sitios de escisión de clostripaína (R46, R62, R92, R221, R312, R326), dos son reconocidos por la proteasa, concretamente R92 y R221. Variantes estabilizadas de acuerdo con la invención de Ply511 tienen en estas posiciones intercambios de R a otros residuos de aminoácidos, especialmente
25 R62K o R62A, así como R221K o R221A.
Ejemplo 11: Degradación por proteasas de una proteína terapéuticamente utilizable en distintos órganos y determinación de regiones sensibles a proteasas
30 En estudios de farmacocinética se comprobó que la endolisina utilizada contra estafilococos CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) ya no era detectable en diferentes órganos a distintas velocidades. Para someter a prueba si esto se atribuía a la degradación por proteasas, la endolisina se incubó con extractos de órgano y se analizaron posibles bandas de degradación sobre geles de SDS. Se congelaron muestras de tejido de hígado, corazón, bazo, riñón y pulmón de ratas, se descongelaron de nuevo y se
35 homogeneizaron en el mismo volumen de tampón PBS. Por mezcla madre de ensayo se mezclaron 40 !l de CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) (1 mg/ml en Tris 20 mM, pH 8,0) y 10 !l de extracto de órgano (diluido 1:20 con PBS) y se incubaron durante 18 h a temperatura ambiente o a 4 ºC. En los controles de proteína sólo se añadió tampón PBS en lugar de extracto de órgano y se incubó durante estos mismos tiempos, así como se preparó un control de proteína sin tiempo de incubación. Como otros controles se analizó respectivamente
40 extracto de órgano sin adición de endolisina. Las muestras se mezclaron con tampón de muestra y se aplicaron sobre geles de SDS al 12 %.
Se mostró que sólo en las muestras en las que se añadió extracto de riñón tuvo lugar una significativa degradación de proteína durante el periodo de tiempo del experimento, en todos los otros extractos de órgano, así como los 45 controles, la endolisina permaneció estable. En la incubación con el extracto de riñón se formaron fragmentos de proteína más grandes con tamaño definido, de manera que fue probable que la endolisina fuera degradada por una
o menos proteasas específicas para riñón. Para determinar las regiones sensibles para esta(s) proteasa(s), las bandas formadas (marcadas con flechas y los números 1 a 7) se transfirieron a una membrana de PVDF y los polipéptidos se secuenciaron en el extremo N terminal mediante degradación de Edman. El tamaño aproximado de
50 los fragmentos formados se derivó mediante una curva estándar que se creó a partir de las distancias recorridas de las bandas del patrón de peso molecular en el que se conocía el peso molecular. Resultaron los siguientes fragmentos que están resumidos en la Tabla 7. Los segmentos de proteínas formados se determinaron a partir de las secuencias N terminales determinadas junto con los tamaños de fragmentos.
55 Tabla 7: Fragmentos de la endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 (L56H, L57T, E164A, R168A, Y201H) después de la degradación mediante proteasa(s) específica(s) de riñón
Nº de banda
Tamaño (calculado a partir de la distancia recorrida en el gel) kDa Secuencia N terminal Segmento de proteína Tamaño (calculado a partir de la secuencia de aminoácidos) kDa
1
58 ASIIMEV Proteína completa, M N terminal disociada 55
2
43 ASIIM Fragmento N terminal. Dominio CHAP y amidasa. EAD completo hasta el sitio de escisión antes de la banda 5 (ASSNTV) 44
3
25 ASKKETAPQ Dominio de amidasa. Hasta el sitio de escisión antes de la banda 5 (ASSNTV). 24
4
19 ASIIMEVAT MQ Fragmento N terminal. Dominio CHAP hasta el sitio de escisión antes de la banda 3 (ASKKETAPQ). 19
5
15 ASSNTV Fragmento C terminal. CBD. 12
6
20 ASIIMEVAT Fragmento N terminal. Dominio CHAP hasta el sitio de escisión antes de la banda 7 (XPTQA). 20
7
41 XPTQA Fragmento C terminal. Dominio de amidasa y CBD. 36
X: aminoácido que no pudo definirse
A partir de la determinación de las secuencias N terminales junto con la determinación del tamaño de los fragmentos formados resultó que las proteasas existentes en el extracto de riñón escindieron la endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 en 3 posiciones, concretamente después de los aminoácidos Q171, Q175 y S384. Una 5 búsqueda de dominios conservados dentro de la endolisina CHAP-Amipitti26_CBDUSA-Add2 en CDD (conserved domain database) dio 3 dominios conservados, concretamente del extremo N terminal un dominio CHAP (aminoácidos 28 a 158), seguido de un dominio amidasa_2 (aminoácidos 199 a 346), así como un dominio SH3_5 situado en el extremo C terminal (aminoácidos 413 a 478). El dominio CHAP y amidasa 2 son los EAD, mientras que el dominio SH3_5 forma el CBD. Entre el dominio CHAP y amidasa 2 se encuentra una región de ligador de
10 dominios (aminoácidos 159 a 198), así como un segundo ligador entre el dominio amidasa 2 y el CBD (aminoácidos 347 a 412). Los tres sitios de escisión encontrados se encontraron en medio de las regiones de ligador de dominios que han demostrado ser menos estables que los dominios conservados. No pudieron identificarse las proteasas de riñón que eran responsables de la degradación, pero llamó la atención que al menos una proteasa necesitara una Q en la posición P1, así como que los tres sitios de reconocimiento de proteasas fueran ricos en serinas y alaninas.
15 LISTA DE SECUENCIAS
<110> Biomerieux S.A. Hyglos Invest GmbH
<120> Enzimas lisantes de la pared celular estables frente a proteasas 20 <130> PRO-029 PCT/EP DIV 1
<140> desconocido
<141>
25 <150> Documento EP 07 114 785.4
<151>
<150> Documento US 60/957 351
<151>
30
<150> Documento DE 10 2007 061 929.6
<151>
<150> Documento EP 08 152 096.7
<151>
<150> Documento US 61/032 211
<151>
5
<150> Documento DE 10 2008 023 448.6
<151>
<160> 22 10
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 496 15 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en R167 20
<400> 1
<210> 2
<213> Artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en E163 y R167 10
<400> 2
<210> 3 5 <211> 496
<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> Polipéptido que comprende sustitución en E163, R167, E179, E189
<210> 4
<213> Artificial
<220>
<223> Polipéptido que comprende sustitución en D214 10
<400> 4
<210> 5
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Polipéptido que comprende sustitución en R87 y D214
<400> 5
<210> 6
<211> 341 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en E7 y E40 10
<400> 6
<210> 7
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en R92K, R221K 10
<400> 7
<210> 8
<211> 341 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en R92A, R221A 10
<400> 8
<210> 9
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en D112E 10
<400> 9
<210> 10
<211> 317
<212> PRT
<213> artificial 5
<220>
<223> Polipéptido que comprende sustitución en D112A
<400> 10 10
<210> 11
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en E163, R167 10
<400> 11
<210> 12
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustituciones en L56, L57, E164, R168, Y201, Q171, Q175, S384 10
<400> 12
<210> 13
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustituciones en L56, L57, E164, R168, Y201, Q171, Q175, S384 10
<400> 13
<210> 14
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en R168 10
<400> 14
<210> 15
<211> 497
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Polipéptido que comprende sustitución en E163 y R167
<400> 15
<210> 16
<211> 497
<212> PRT
<213> artificial 5
<220>
<223> Polipéptido que comprende sustitución en E163, R167, E179, E189
<400> 16 10
<210> 17
<211> 497 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustitución en E163, R167 10
<400> 17
<210> 18
<213> artificial
<220>
<223>
CHAP-AMIpitti26-CBDUSA 10
<400> 18
<210> 19
<213> artificial
<220>
<223>
CHAP-AMIpitti26- CBDUSA-Add2 10
<400> 19
<210> 20
<213> artificial
<220>
<223>
CHAP-AMIpitti26 10
<400> 20
<210> 21
<211> 341
<212> PRT
<213> Bacteriófago A511
<400> 21
<210> 22
<213> artificial
<220>
<223>
Polipéptido que comprende sustituciones en L56, L57, E164, R168, Y201 10
<400> 22

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Variante polipeptídica del polipéptido de acuerdo con la SEQ ID Nº: 1, seleccionándose la variante polipeptídica del grupo que consiste en: SEQ ID Nº: 2, 3, 11, 12 y 13.
  2. 2.
    Molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
  3. 3.
    Vector de expresión, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.
  4. 4.
    Célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.
  5. 5.
    Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 como fármaco o como agente de diagnóstico.
  6. 6.
    Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como fármaco para la prevención o la terapia de enfermedades provocadas por bacterias Gram positivas, en particular clostridios, bacilos, listerias, estafilococos, lactobacilos, enterococos, aerococos, pediococos, estreptococos, micoplasmas y/o Leuconostoc.
  7. 7.
    Uso del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la supresión del crecimiento de bacterias Gram positivas en las industrias medioambiental, alimentaria o cosmética.
  8. 8.
    Polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso como agente de diagnóstico en medicina e industrias medioambiental, alimentaria o cosmética.
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