ES2525954B1

ES2525954B1 - Enzibióticos bactericidas mejorados frente a neumococo y otras bacterias

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Publication number: ES2525954B1
Application number: ES201330777A
Authority: ES
Inventors: Pedro GARCÍA GONZÁLEZ; Margarita MENÉNDEZ FERNÁNDEZ; Ernesto GARCÍA LÓPEZ; Roberto DÍEZ MARTÍNEZ; Héctor DE PAZ FERNÁNDEZ; Noemi BUSTAMANTE SPUCH
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Respiratorias CIBERES
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Centro de Investigacion Biomedica en Red de Enfermedades Respiratorias CIBERES
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2015-10-23
Anticipated expiration: 2033-05-28
Also published as: ES2525954R2; ES2525954A2; WO2014191598A1

Abstract

Enzibióticos bactericidas mejorados frente a neumococo y otras bacterias.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. En la presente invención se presenta una secuencia polipeptídica derivada del módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7), que permite la construcción de nuevas enzimas líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro. Igualmente, en esta invención se incluyen enzimas quiméricas que contienen dicho módulo de unión a pared mejorado y se dan ejemplos de su actividad frente a especies Gram-positivas y Gram-negativas.

Description

ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRAS BACTERIAS

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que se une a la pared celular de diversos microorganismos (módulo de unión a pared) derivado de la enzima lítica del fago Cp-7 de Streptococcus pneumoniae. A este módulo de unión a pared se le pueden acoplar, mediante técnicas de biología molecular, diversos módulos catalíticos que degradan la pared bacteriana (mureín-hidrolasas) lo que genera enzimas líticas con un efecto bactericida tanto en neumococo como en otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

ESTADO DE LA TECNICA

Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es un patógeno Gram-positivo y el principal agente causal de enfermedades infecciosas tan importantes como neumonía, sepsis y meningitis. Los grupos de población más afectados son los niños menores de cinco años, los ancianos y los pacientes inmunodeprimidos. De hecho, según estimaciones recientes de la Organización Mundial de la Salud neumococo es la causa más común de las neumonías severas en niños de esas edades, tanto en países desarrollados como en los que están en vías de desarrollo (UNICEF, WHO, 2006. Pneumonia: the lorgotten killer 01 ch iId ren. http://www . u n ieef .org/s pan ish/pu blication slfi les/P neu monia _ The_F orgotte n_Kili er _of _Children.pdf). En general, la tasa de mortalidad de las infecciones neumocócicas en la población pediátrica es mayor que la provocada por el SIDA, la malaria y el sarampión juntos (Wardlaw et al. 2006. Lancet 368: 1048-1050; Rudan y Campbell. 2009. Lancel374: 854-856).

En los últimos años se ha producido un generalizado incremento de cepas clinicas de neumococo resistentes a una variedad de antibióticos, sobre todo a los ¡3-lactámicos, lo que está provocando la búsqueda urgente de otros tratamientos o terapias alternativas para combatir este patógeno. En este contexto, el uso de mureín-hidrolasas líticas (enzimas que degradan de forma específica y eficaz el peptidoglicano bacteriano) codificadas por bacterias o bacteriófagos constituye una prometedora linea de investigación para luchar contra las infecciones bacterianas. Ya se ha demostrado que este tipo de enzimas (denominadas enzibióticos) son eficaces para matar "in vivo" determinadas bacterias en una variedad de modelos animales (Fenton et al. 2010. Bioeng. Bugs 1: 9-16; Fischetti , VA. 2011 . Bacteriophage 1 :1-7).

En el sistema de neumococo se han descrito varias murein-hidrolas8s, tanto bacterianas como fágicas (Hermoso et al. 2007. Curr. Opino Microbio!. 10: 461-472). Todas ellas son enzimas modulares con un dominio responsable de la catálisis y otro de la unión al sustrato insoluble que es la pared celular. Todas estas enzimas con actividad mureín-hidrolasa son, con excepción de epl-?, dependientes de la presencia del aminoalcohol colina para su actividad enzimática. La lisozima Cpl-7, codificada por el fago Cp-7, es capaz de degradar paredes de neumococo conteniendo tanto colina como su análogo estructural etanolamina. Cpl-7 contiene un dominio de unión a la pared celular (C-Cpl-7), formado por tres repeticiones idénticas (motivos CW_7), completamente diferente al que comparten las otras enzimas colina-dependientes, lo que explica este comportamiento (García et al. 1990. Gene

86: 81-88). Hasta el momento se ha demostrado la efectividad como agentes antibacterianos de Pal (Loeffler et al. 2001. Science 294: 2170-2172), Cpl-1 (Jado et al. 2003. J. Antimicrob. Chemother. 52: 967-973) y LytA (Rodriguez-Cerrato et al. 2007. Antimicrob. Agents Chemother. 51 : 3371-3373) usando diferentes modelos animales de infección neumocócica.

EXPLlCACION DE LA INVENCiÓN

El objeto principal de la presente invención es la construcción de nuevas mureín-hidrolasas capaces de degradar muy eficazmente la pared celular de neumococo y de otras especies bacterianas. Los inventores han modificado sustancialmente el módulo de unión a la pared bacteriana de la lisozima del fago Cp7 de S. pneumoniae, reduciendo su elevada carga neta negativa, para disminuir las interacciones electrostáticas desfavorables que se establecen entre la envuelta celular (negativamente cargada) y la enzima cuando ésta actúa desde el exterior de la bacteria (Low et al. 2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403). Las modificaciones introducidas en las tres repeticiones que constituyen el módulo de unión al sustrato (C-Cpl-7) provocan que tenga mayor facilidad de acceso e interacción con la pared bacteriana (peptidoglicano) y, en consecuencia , su capacidad litica y bactericida sea mayor que la de la Cpl-7 silvestre, no solo frente a S. pneumoniae sino también frente a otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En el caso de neumococo, la gran capacidad bactericida de las nuevas construcciones que emplean este módulo de unión a pared

mejorado se extiende también a cepas multirresislenles a diversos antibióticos de amplia importancia clínica.

Asimismo, esta invención también aporta otras construcciones quiméricas que emplean el mismo módulo de unión a la pared celular, combinado con módulos cataliticos mejorados de Cpl-7 o Cpl-1, lo que demuestra la amplia versatilidad de enzibióticos que se pueden construir empleando las enzimas líticas ya conocidas.

EXPLICACiÓN DElALLADA DE LA INVENCION

La presente invención describe una secuencia polipeptidica derivada del módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7), que permite la construcción de nuevas enzimas líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro mediante la modificación de, al menos, 15 aminoácidos clave en la secuencia original o parental de partida C-epl-7. Igualmente, se describe la secuencia de nucleótidos codificante de dicho módulo así como construcciones genéticas derivadas que incluyen módulos catalíticos procedentes de otros fagos, o de Cpl-7 mejorados, que permiten la construcción de nuevas enzimas liticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro.

El punlo de partida lue el módulo de unión a pared del enzima litica del lago Cp7 (Cpl-7)

descrito en (García et al. 1990. Gene 86: 81 -88). El procedimiento de mejora modificó la carga neta de las tres repeticiones que forman el dominio de unión a pared (C-Cpl-7) sin que los cambios de secuencia introducidos alteren el plegamiento de la proteína. La selección de las posiciones a modificar y el tipo de mutación introducida en cada posición se llevó a cabo teniendo en cuenta la conservación de secuencias dentro de la familia CW_7 (PF08230) y los modelos a alta resolución previamente generados para N-Cpl-7 (dominio catalítico N

terminal) y C-Cpl-7 (Buslamante el al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196).

Esta adaptación permite una sustancial mejora de la capacidad de unión del módulo peptídico de unión a pared, lo que combinado con su amplio espectro de bacterias a las que se une, lo convierte en una herramienta útil para el diseño de nuevos antibióticos con un espectro interespecies más amplio que los enzibióticos hasta ahora descritos (como

ejemplos: US20120258088, W02013052643, W02010002959, W02008018854, US2007025978, US2005208038) dado que cubre tanto bacterias Gram-positivas como

Gram-Negativas lo que permite que sean usadas como antibióticos en combinación con

elementos que alteren la pared celular (enzibióticos), o incluso en aplicaciones biotecnológicas como la purificación y/o concentración de poblaciones bacterianas.

Un resumen de los polinucleótidos y péptidos descritos en la presente invención se resumen en la siguiente tabla :

Descripción: Secuencia polipeptidica Secuencia nucleotídica

Cpl-7: Secuencia nativa 1 2

N-Cpl-7: Secuencia nativa de dominio catalítico 3 4

L-Cpl-7: Secuencia nativa de linker 5 6

C-Cpl-7: Secuencia nativa de dominio de unión a pared 7 8

N-Cpl-7N: Secuencia mutada de dominio catalítico 9 10

C-Cpl-7S: Secuencia mutada de dominio de unión a pared 11 12

N-Cpl-1: Secuencia nativa de dominio catalítico 13 14

L-Cpl-1: Secuencia nativa de linker 15 16

Cp17-00S: Enzima quimérica 17 18

CpI7-NOS: Enzima quimérica 19 20

Cp17-00E: Enzima quimérica 21 22

Cp11-07S: Enzima quimérica 23 24

Cp11-00S: Enzima quimérica 25 26

Un primer objeto de la invención se refiere al polipéptido, de ahora en adelante polipéptido de la invención, que codifica el módulo de unión a pared de la lisina epl-7 derivada del fago de Streptococcus. pneumoniae Cp-7, denominado e-epl-7, modificado para que aumente su carga neta lo que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEO ID NO 7, Y porque comprende alteraciones en su secuencia de aminoacidos (como pueden ser, por ejemplo, sustituciones, deleciones

y/o inserciones) en las siguientes posiciones: la posición homóloga a la posición 216 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L216K), la posición homóloga a la posición 225 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D225K), la posición homóloga a la posición 230 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoacido (R) (mutación A230R), la posición homóloga a la posición 233 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D233N), la posición homóloga a la posición 239 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D239N), la posición homóloga a la posición 264 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L264K), la posición homóloga a la posición 273 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D273K), la posición homóloga a la posición 278 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R) (mutación A278R), la posición homóloga a la posición 281 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D281N), la posición homóloga a la posición 287 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D287N), la posición homóloga a la posición 312 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L312K), la posición homóloga a la posición 321 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D321K), la posición homóloga a la posición 326 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R) (mutación A326R), la posición homóloga a la posición 329 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D329N), la posición homóloga a la posición 335 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D335N).

En una realización particular, el polipéptido de la invención comprende la SEQ ID NO 11.

Tal y como se utiliza en la presente invención el término "Iisina~ hace referencia a un enzima lítica aislada de origen fágico que mediante su unión a la pared bacteriana rompe dicha barrera mediante al hidrolizar la mureína, o peptidoglicano, que la conforma, para permitir la salida de la progenie fágica de la bacteria hospedadora y la infección de nuevas bacterias.

En la literatura, las enzimas de tipo lisina con actividad mureln-hidrolasa de bacterias Grampositivas y sus bacteriófagos presentan una estructura modular, con características funcionales que las distinguen (Lopez, R. el al. 1997Microb Drug Resist. 3, 199-211). Así, en la presente invención el término "módulo de unión a pared~ de una li5ina se refiere al extremo C-terminal del polipéptido con actividad lisina que permite que ésta éste se una a la pared de la bacteria. El término "módulo catalítico" de una lisina se refiere al extremo Nterminal del polipéptido con actividad lisina y que le confiere su actividad catalítica mureínhidrolasa. Y el término "linker" o "módulo linker" se refiere al fragmento polipeptídico comprendido entre los dominios e-terminal y N-terminal y que sirve de nexo entre ambos.

En la presente invención, los diferentes dominios se representan aquí con la letra correspondiente a su posición, seguida de la lisina de la que derivan, y una letra correspondiente al mutante al que se refiere. Así, por ejemplo, C-Cpl-?S se refiere al extremo C-terminal de la lisina Cpl? (módulo de unión a pared), mutante S; Así, por ejemplo, N-Cpl-? se refiere al extremo N-terminal de la lisina Cpl? (módulo catalítico), no-mutado. Como un experto en el estado de la técnica podrá apreciar, es posible combinar los diferentes módulos fágicos para obtener nuevas enzimas con actividad bactericida.

Los diferentes dominios combinados se representan aqui con las letras "Cpl", que se corresponden a la denominación común de las lisinas empleadas en los ejemplos, seguidas de un número que indica el fago de origen de la secuencia nativa, y otros tres dígitos que se corresponden a la posición de cada uno de los módulos empezando por el extremo N-terminal ; cada dígito es representado por un cero, cuando se refiere a la secuencia nativa del número que sigue a las letras Cpl, un número que se corresponde con el fago del cual se extrae la secuencia nativa y una letra cuando se trata de una variante mutada, asi, por ejemplo:

a) Cpl-?: secuencia nativa de Cpl-?

b) CpI7-00S: donde

a.: O: módulo catalítico N-terminal , secuencia nativa de Cpl-?

b.: O: módulo linker, secuencia nativa de Cpl-?I,

c.: S: módulo C-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S.

e) Cp11-00S donde:

a.: O: módulo catalítico N-terminal, secuencia nativa de Cpl-1.

b.: O: módulo linker, secuencia nativa de Cpl-1 .

c. S: módulo e-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S. d) Cp11-07S donde:

a.: O: módulo catalítico N-terminal, secuencia nativa de Cpl-1 .

b.: o: módulo linker, secuencia nativa de epl-?

c.: S: módulo e-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S.

Como se ha comentado en la presente invención, el polipéptido de la invención que codifica el módulo de unión a pared de la lisina epl-? modificado para que aumente su carga neta, presenta una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y combinado con uno

o varios módulos catalíticos, y opcionalmente linkers, procedentes de otros fa90s bacterianos permite la construcción de enzimas lisinas quiméricas con actividad bactericida.

Así, otro objeto de la invención son las enzimas quiméricas, denominadas de ahora en adelante enzimas quiméricas de la invención, que comprenden, al menos, el polipéptido de la invención y un módulo N-terminal con actividad catalítica mureín-hidrolasa. Opcionalmente, dichas quimeras pueden presentar también un módulo linker.

Así, un objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además comprende:

a.: un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico Nterminal de Cp17,

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7,

c.: el módulo catalítico e-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención.

Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se corresponde con la SEO ID NO 17 (mutante CpI7-00S) donde:

a.: un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico Nterminal de Cpl7 con SEQ ID NO 3,

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7 con SEQ ID NO 5,

C.: el módulo catalítico e-terminal que se corresponde con el polipeptido de la invención con SEQ ID NO 11 (C-Cpl-7S).

Así, otro objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además comprende:

a.: un módulo catalítico N-terminal que presenta, al menos, las siguientes

mutaciones en: posiciones homólogas al módulo catalítico de la Cpl-7 nativa (de

SEQ ID NO 3):

a.: la posición homóloga a la posición 25 de dicha secuencia, que sustituye el

aminoacido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E25Q).

b.: la posición homóloga a la posición 68 de dicha secuencia, que sustituye el

aminoacido (E) original por el aminoacido (Q) (mutación E68Q).

c.: la posición homóloga a la posición 69 de dicha secuencia, que sustituye el

aminoácido (E) original por el aminoácido (A) (mutación E69A).

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7,

c.: el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la

invención con C-Cpl-7S.

Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se corresponde con la SEQ ID NO 19 (mutante CpI7-NOS) donde:

a.: un módulo catalítico N-terminal que presenta, al menos, las siguientes mutaciones en posiciones homólogas al módulo catalitico de Cpl-7 nativa (de SEQ ID NO 3) Y comprende la SEQ ID NO 9,

a.: la posición homóloga a la posición 25 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (E) original por el aminoácido (a) (mutación E250).

b.: la posición homóloga a la posición 68 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E68Q).

c.: la posición homóloga a la posición 69 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (E) original por el aminoácido (A) (mutación E69A).

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7 de SEO ID NO 5,

c.: el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención con SEQ ID NO 11 (C-Cpl-7S).

a.: un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico Nterminal de Cpl-1,

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de epl-7,

Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se corresponde con la SEO ID NO 25 (mutante CpI1-00S) donde:

a.: un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico Nterminal de Cpl1 con SEQ ID NO 13,

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-1,

c.: un módulo catalítico C-terminal se corresponde con el polipéptido de la invención.

Una realización particular de la invención es el enzima quimérico de la invención que se corresponde con la SEQ ID NO 23 (mutante CpI1 -07S) donde:

a.: un módulo catalitico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico Nterminal de Cpl1 con SEQ ID NO 13,

b.: un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-1 con SEQ ID NO 15,

c.: el módulo catalítico e-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención con SEQ ID NO 11 (C-Cpl-7S).

Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan aquí como XN , en la que X es el aminoácido en la secuencia (designado mediante el código de una letra universalmente aceptado en la nomenclatura de aminoácidos), y N es la posición en la secuencia. Las mutaciones puntuales tipo sustitución en una secuencia de aminoácidos se representan aquí como X1NX2 , en la que X1 es el aminoácido en la secuencia de proteína no mutada, X2 es el/los aminoácido/s nuevos de la secuencia de proteína mutada, y N es la posición en la secuencia de aminoacidos.

El termino "carga neta" de una proteína se define como la suma de todas las cargas positivas y negativas que lleva la proteína a un determinado pH. Modos de medir calcular la carga neta de una proteína son conocidos en el estado de la técnica, y entre ellos, por ejemplo, se halla el método descrito en Low et al. 2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403, en el que la carga neta (Z) se estima como la diferencia entre el número de (Lisinas + Argininas) menos el número de residuos de (Ácido aspártico + Ácido glutámico); o el método utilizado en Sedenterp en el que, además del número de grupos que pueden estar cargados positiva (Lisinas + Argininas + histidinas) o negativamente (Ácida aspártico + Ácido glutámico + cisteínas), la estimación tiene en cuenta el estado de ionización de los mismos calculado a partir las constantes de íonización de los distintos grupos y del valor del pH del medío en que se encuentra la proteína (Laue et al. 1992. Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Seience pp. 90-125).

El término "capacidad de unión a la pared celular bacteriana" hace referencia a la afinidad que tienen las lisinas fágicas por la pared celular de las bacterias. Una mayor afinidad, obtenida por ejemplo por mejora de la carga neta polipeptídica, incrementa la cantidad de lisina fágica que se une la bacteria, y por tanto, la cantidad de pared hidrolizada y, como consecuencia, una mayor lisis bacteriana.

Las mutaciones aquí descritas introducidas en la secuencia polipeptidica SEO ID No 7 que se corresponde con el dominio de unión a pared de la lisina Cpl-7 pueden obtenerse mediante técnicas de ingeniería genética o AON recombinante, como por ejemplo mutando la secuencia codificante de Cpl-7 (SEO ID NO 1) mediante mutagénesis dirigida o al azar, o bien pueden obtenerse a partir de la síntesis química de la secuencia de nucleótidos portadora de las mutaciones.

Además, con la información suministrada, un experto en la materia es capaz de combinar las mutaciones anteriormente descritas en la presente invención para generar nuevas variantes del módulo de unión a pared C-Cpl-7 con actividad similar o mejorada. Una posibilidad es la sustitución conservativa de los aminoácidos en las posiciones anteriormente comentadas. Así, por ejemplo, se entiende por sustitución conservativa aquella que mantiene las características de polaridad y carga del aminoácido sustituido. Por ejemplo, lisina y arginina son aminoácidos cuyas cadenas laterales están cargadas positivamente a pH neutro, por lo que se acepta que los cambios de lisina por arginina o viceversa representan cambios conservativos. Se han clasificado los 20 aminoácidos que constituyen la base de todas las proteínas naturales de acuerdo a su conservatividad en grupos: (i) aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano); (ii) aminoácidos alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina); (iii) aminoácidos ioniza bies básicos (histidina, lisina y arginina); (iv) aminoácidos ioniza bies acidos (ácidos aspartico y glutamico); (v) amidas de aminoacidos acidos (asparagina y glutamina); y (vi) aminoacidos hidroxilados (serina y treonina). Algunos autores incluirian la cisteina en este último grupo.

También se incluyen en esta invención los polinucleótidos que codifican para los polipéptidos de la invención descritos y que se corresponden a variantes de los mismos obtenidos mediante mutagénesis dirigida del módulo de unión a pared C-terminal de la lisina Cpl-7 (dominio C-Cpl-7 con SEQ ID NO 7). Dichos polinucleótidos se corresponden con la secuencia de nucleótidos que constituye la secuencia codificante del polipéptido de la invención, denominados de ahora en adelante polinucleótidos de la invención.

Los términos "polinucleótido", "secuencia nucleotidica", "secuencia de nucleótidos", "acido nucleico" y "oligonucleótido" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquimicamente modificados.

Así, un segundo objeto de la invención hace referencia a la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de la invención, de ahora en adelante polinucleótido primero de la invención, caracterizado porque codifica el módulo de unión a pared de la lisina Cpl-7 derivada del fago de S. pneumoniae Cp-7 modificado para que aumente su carga neta (lo que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana), porque presenta los cambios en su secuencia de aminoácidos descritos anteriormente: y, además, porque su secuencia presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID NO 2.

Así, un objeto preferido de la invención es el polinucleótido primero de la invención que codifica el polipéptido de la invención que presenta los cambios de aminoácidos L216K, D225K, A230R, D233N, D239N, L264K, D273K, A278R, D281N, D287N, L312K, D321K, A326R, D329N Y D335N. En una realización particular de la invención, el polinucleótido de la invención se corresponde con la SEQ ID NO 12 (módulo C-Cpl-7S).

Otro objeto de la invención se corresponde con el polinucleótido que codifica la enzima de la invención, de ahora en adelante, polinucleótido segundo de la invención, caracterizado porque comprende un dominio catalítico N-terminal y el dominio de unión a pared e-terminal se corresponde con el polipéptido de la invención.

Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cpl-?, un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-?, y el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 18.

Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cpl? mutado N-Cpl?-N, un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-?, y el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 20.

Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalitico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cp11 , un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-1 , y el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 26.

Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cp11 , un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-?, y el módulo catalítico C-terminal que se

corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 24.

Considerando que las lisinas de distintas cepas y aislados de los fagos de S. pneumoniae, particularmente del fago Cp7, puedan ser evolutivamente similares, es de esperar que la identidad global de los genes que las codifican sea igualo mayor de un 50%, y más concretamente al nivel de la secuencia polinucleotidica correspondiente a la SEO ID NO 8 (C-Cpl-7 nativo), sea del 60% o mayor. Además, el grado de identidad o la homología existente entre las secuencias de aminoácidos de la(5) lisina(s) objeto de la invención y las secuencias de otras lisinas similares pueden determinarse por métodos conocidos en estado de la técnica. Por ejemplo, a través del alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la lisina putativa y la correspondiente al módulo C-Cpl-7S de esta memoria (SEO ID NO 11).

El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente a la semejanza o identidad entre los nucleótidos de posiciones equivalentes en dos o más polinucleótidos.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria , hace referencia a la proporción de nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Puesto que dos proteinas se consideran homólogas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 60% indican estructuras homólogas. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 80% mantendrán las mismas propiedades de dicho polipéptido.

Con la información suministrada en la presente invención un experto en la materia es capaz de identificar secuencias de nucleótidos homólogas a las descritas en la presente invención y que codifican para módulos de unión a pared bacteriana con características idénticas a las descritas para el polipéptido de la invención. Por tanto, el polinucleótido de la invención constituye la secuencia codificante de una variante de la módulo de unión a pared de la lisina Cpl-7 derivada del lago de S. pneumoniae Cp-7 modificado con las caracteristicas anteriormente descritas, cuya secuencia de nucleótidos se corresponde a:

a) moléculas de ácido nucleico de la secuencia polinucleotídica aislada o en su cadena complementaria,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar con una secuencia polinucleotídica de (a), o e) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a la degeneración del código genético.

Los polinucleólidos primero y segundo de la invención puede encontrarse aislado como talo formando parte de los vectores que permiten la propagación de dichos polinucleótidos en células hospedadoras adecuadas. Por lo tanto, en otro objeto, la invención se refiere a un vector, en adelante vector primero de la invención, que comprende el polinucleólido primero de la invención como se describe anteriormente. Otro objeto de la invención se refiere a un vector, en adelante vector segundo de la invención, que comprende el polinucleótido segundo de la invención como se describe anteriormente.

El vector puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. Preferiblemente, dicho vector es un plásmido apropiado para la expresión y purificación del polipéptido de la invención y/o la enzima quimérica de la invención.

El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de AON , sin que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de AON o cromosomas artificiales de levadura.

El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula huésped. Dicho ácido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control.

El término "expresión" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de un polinucleótido. Incluye la transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm en una proteína o un polipéptido.

El término "célula hospedadora" o "célula huésped", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN.

Los vectores adecuados para la inserción de los polinucleólidos primero y segundo de la invención son plásmidos utilizados para la expresión de proteínas en procariotas tales, a título ilustrativo, como pT7-7, pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, Col El , pCR1 , RP4, lagos y vectores "lanzadera", tales como pSA3 y pAT28; vectores de expresión en levaduras tales como el plásmido de 2 micras de Saccharomyces cerevisiae, plasmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centrómeros y similares; vectores de expresión en células de inseclos tales como los vectores de la serie pAC y de la pVL vectores de expresión; vectores de expresión en células de plantas tales como piBi, pEarleyGate, PAVA, pCAMBIA, PGSA, PGWB, PMOC, PMY, serie de poros y similares, y otros plásmidos de expresión de proteínas utilizados en células eucariotas, incluyendo baculovirus adecuados para la transfección de células de insecto usando cualquier sistema disponible en el estado de la técnica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "célula hospedadora" o "célula huésped" incluye cualquier célula cultivable que puede ser modificada mediante la introducción de ADN no contenido de manera natural en la célula, de aqui en adelante célula hospedadora de la invención.

Preferiblemente, una célula hospedadora es aquélla en la que el polinucleótido primero de la invención y el polinucleótido segundo de la invención pueden ser expresados, dando lugar a un polipéptido estable, modificado post-traduccionalmente y localizado en el compartimento subcelular apropiado. La elección de una célula hospedadora adecuada puede también estar influida por la elección de la señal de detección. Por ejemplo, el uso de construcciones con genes reporteros (por ejemplo, JaeZ, luciferasa, timidina quinasa o la proteína verde fluorescente "GFP") puede proporcionar una señal seleccionable mediante la activación o inhibición de la transcripción del gen de interés en respuesta a una proteína reguladora de la transcripción. De cara a conseguir una selección o "screening" óptimo, el fenotipo de la célula hospedadora deberá ser considerado.

Una célula hospedadora de la presente invención incluye células procariotas y eucariotas. Entre las procariotas se incluyen organismos Gram negativos (por ejemplo, Escherichia eDil)

o Gram positivos (por ejemplo, bacterias del género BaciIJus). Las células procariotas se usarán, preferiblemente, para la propagación de la secuencia del control de la transcripción del vector que contiene el(los) polinucleótido(s) objeto(s) de la invención, lo que permitirá conseguir un mayor número de copias del vector conteniendo el(los) polinucleótido(s) objeto(s) de la invención. Entre las células hospedadoras procariotas adecuadas para la

transformación de este vector se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse a, E. coli,

Baciffus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras especies dentro de los géneros

Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Las células eucariotas incluyen, entre otras,

células de levadura, células de plantas, células de hongos, células de insectos, células de

5: mamífero, y células de organismos parásitos (por ejemplo, Trypanosomas). Tal y como se

emplea en esta memoria, el término levadura no incluye sólo levadura en el sentido

taxonómico estricto, es decir, organismos unicelulares, sino también hongos multicelulares

similares a las levaduras u hongos filamentosos. Ej emplos de especies son Kluyveromyces

lactis, Schizosaccharomyces pombe, y Ustilago maydis, con Saccharomyces cerevisiae y

10: Pichia pastoris como organismos preferidos. Otras levaduras que pueden utilizarse en la

producción de la(s) secuencia(s) polipeptídica(s) de la presente invención son Neurospora

crassa, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Gandida tropicalis, y Hansenula polymorpha.

los sistemas de cultivo con células hospedadora de mamífero incluyen lineas celulares

establecidas como las células COS, células L, células 3T3, células de ovario de hámster

15: chino (CHO), células madre embrionarias, con las células BHK, HeK o Hela como células

preferidas. las células eucariotas son, preferiblemente, utilizadas para la expresión del gen

recombinante mediante la aplicación de la secuencia de regulación de la transcripción o el

vector de expresión de la presente invención.

Así otro objeto de la invención se refiere a un método de obtención del polipéptido de la

20: invención , de ahora en adelante método primero de la invención, que comprende:

1) Introducir el vector primero de la invención en una célula hospedadora

adecuada (célula hospedadora primera de la invención),

2) Cultivar la célula hospedadora primera de la invención en un medio adecuado,

y,

2S: 3) Purificar el polipéptido de la invención con mayor carga neta y mayor capacidad

de unión a la pared celular bacteriana.

Así otro objeto de la invención se refiere a un método de obtención de la enzima quimérica

de la invención, de ahora en adelante método segundo de la invención, que comprende:

1) Introducir el vector segundo de la invención en una célula hospedadora

30: adecuada (célula hospedadora segunda de la invención),

2) Cultivar la célula hospedadora segunda de la invención en un medio adecuado,

y,

3) Purificar la enzima quimérica de la invención con mayor carga neta y mayor

capacidad de unión a la pared celular bacteriana .

Un cultivo de células hospedadoras se refiere al proceso de mantener y crecer las células hospedadoras. Los cultivos celulares necesitan condiciones contra ladas de temperatura, pH, porcentajes de gases (oxigeno y dióxido de carbono), así como la presencia de los nutrientes adecuados para permitir la viabilidad y la división celular. Los cultivos celulares pueden desarrollarse en sustratos sólidos como el agar, o en medio liquido, lo que permite cultivar grandes cantidades de células en suspensión.

El término "purifica( tal y como se emplea en la descripción, se refiere al aislamiento del polipéptido de la invención o de la enzima quimérica de la invención y a su concentración, del resto de polipéptidos presentes en el medio de cultivo y de la célula hospedadora de la invención. El aislamiento del polipéptido de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o isoelectroenfoque. Las técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga iónica (basada en el estado de ionización de los aminoácidos en las condiciones de trabajo), la afinidad de la proteína por determinadas matrices o columnas cromatográficas, o mediante etiquetas de purificación, y puede realizarse en columna, en papel o en placa. El aislamiento de la proteina puede realizarse, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato amónico, cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés "Fast Protein Liquid Cromatography") o cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, del inglés "High Performance Liquid Chromatography"), empleando sistemas automatizados que reducen notablemente el tiempo de purificación e incrementan el rendimiento de la purificación.

La expresión "etiqueta de purificación" o "etiqueta de afinidad", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que ha sido incorporada (generalmente, por ingeniería genética) a una proteína para facilitar su purificación. La etiqueta, que puede ser otra proteína o una secuencia corta de aminoácidos, permite la purificación de la proteína, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. Etíquetas de purificación conocidas en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a, el péptido de unión a calmodulina (CBP), la enzima glutatión-S-transferasa (GST) o una cola de residuos de histidina.

Un experto en el estado de la técnica conoce las técnicas por las que se puede obtener el polinucléotido de la invención, que podría hacerse, por ejemplo, pero sin limitarse a, por mutagénesis dirigida o al azar a partir de un polinucleótido no mutado, mediante síntesis química del polinucleótido completo, o a través del ensamblado de fragmentos de AON que codifiquen para distintas porciones de la secuencia que se desea obtener.

Así, otro objeto de la invención se refiere al uso del polinucleótido primero de la invención para la obtención del polipéptido de la invención con mayor carga neta y mejor capacidad de unión a la pared bacteriana.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de la célula primera hospedadora de la invención para la obtención del polipéptido de la invención. Preferentemente, la célula hospedadora primera de la invención es una bacteria, más preferentemente Escherichia eoli.

Otro objeto de la invención se refiere al uso del polinucleótido segundo de la invención para la obtención de la enzima quimérica de la invención con mayor carga neta y mejor capacidad de unión a la pared bacteriana.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora segunda de la invención para la obtención de la enzima quimérica de la invención. Preferentemente, la célula hospedadora segunda de la invención es una bacteria, más preferentemente

Escherichia coli.

En el estado de la técnica son conocidas técnicas de marcaje como los inmunoensayos que se basan en el reconocimiento por parte de un anticuerpo de una determinada secuencia polipeptidica, o epitopo. En este caso, el polipéptido de la invención puede unirse a la pared bacteriana mediante el reconocimiento del peptidoglicano que la recubre; esta característica, como el experto en el estado de la técnica puede apreciar, permite, sobre todo en el caso de las bacterias Gram-positivas, el empleo del polipéptido de la invención en aplicaciones biotecnológicas como el marcaje y la captura de las bacterias de interés.

Así, un objeto particular de la invención lo constituye el polipéptido de la invención caracterizado por que está unido a una etiqueta de marcaje. Etiquetas de marcaje comúnmente empleadas incluyen, pero no se limitan a, biotina, moléculas fluorescentes, moléculas radiactivas, sustratos cromogénicos, marcadores quimioluminiscentes, enzimas, y similares; éstos permiten la detección de una bacteria en, por ejemplo, un tejido mediante, por ejemplo, el uso de marcaje fluorescente, lo que permitiría observar su capacidad de infecti vidad.

Otro objeto particular de la invención lo constituye el polipéptido de la invención caracterizado por que está unido a una partícula de aislamiento para la concentración de la población bacteriana de una muestra. Partículas de aislamiento pueden ser, por ejemplo, pequeñas esferas magnéticas (beads) o de sepharosa. Este tipo de partículas permiten el aislamiento de las bacterias de una muestra, particularmente aquellas de interés clínico como por ejemplo esputos, exudados, biopsias, etc., pero también aquellas de interés forense como muestras de semen o saliva, y tras una centrifugación, su concentración. Las bacterias así aisladas pueden luego ser sometidas a una PCR para su identificación, o bien su cultivo en medios adecuados para la identificación mediante técnicas clásicas de microbiología, bien conocidas por el experto en el estado de la técnica. Este tipo de concentración previa a la identificación es de particular interés en el caso de aquellas muestras en las que la identificación es particularmente dificil debido al bajo número de células de interés en la muestra.

Tal y como se ha comentado, las lisinas tienen la capacidad de romper las paredes celulares por las que presentan afinidad, provocando la muerte bacteriana. Así, las enzimas quiméricas de la invención, que comprenden, al menos, el polipéptido de la invención, un módulo catalítico con actividad murein-hidrolasa, y opcionalmente un linker, pueden ser empleadas como biocidas tanto en aplicaciones terapéuticas (antibióticos) como en la limpieza antiséptica de superficies y materiales contra bacterias pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:

a) Gram positivas, preferentemente, Streptococcus, Staphylococcus, Bifidobacterium, Corynebacterium, Lactococcus, Mycobacterium, Listeria, Clostridium, Bacillus, Actinomyces, y más preferentemente, Streptococcus. pneumoniae, Streptococcus. pyogenes, Streptococcus. mitis, Streptococcus. aga/actiae, Streptococcus. iniae, Streptococcus. mutans, Streptococcus. dysgaJactiae, StaphyOococcus. aureus, Bacillus ado/escenties, C/ostridium. jeikeium, Enterococcus. faecaJis, Lactococcus. /aclis, and Mycobaclerium smegmalis.

b) Gram negativas, preferentemente, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Campilobacter, Shigella, Yersinia, Vibrio, Helicobacter, Bartonella, Neisseria y Bordetella, y más preferentemente, Escherichia coJi, y Pseudomonas pulida,

Así, otro objeto de la invención lo constituye el uso de la enzima quimérica de la invención en la elaboración de un medicamento o una composición farmacéutica para el tratamiento de una infección bacteriana o como antiséptico. Preferentemente, dicho tratamiento está dirigido contra Slreplococcus. pneumoniae, Streplococcus. pyogenes, Streplococcus. milis, Streptococcus. agalactiae, Slreptococcus. iniae, Streptococcus. mutans, Streplococcus. dysgalactiae, Staphyilococcus. aureus, B. acillus adolescenties, Clostridium. jeikeium, Enterococcus. faecalis, Lactococcus. lactis, and Mycobacter;um. Smegmatis.

Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico, en adelante composición farmacéuti ca de la invención, que comprende al menos una enzima quimérica de la invención, en cantidad farmacéutica mente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o veh ¡culos farmacéuticamente aceptables.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamenle aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y veh1culos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas o antisépticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéutica mente efectiva~ se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de eliminar los microorganismos patógenos, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, para el caso de una composición terapéutica, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta, forma y frecuencia de administración; y para el caso de una composición antiséptica, las condiciones del entorno, la forma de aplicación, entre otras.

En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier via de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el 'Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.

Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención donde la enzima quimérica de la invención comprende una secuencia perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente grupo: SEO ID NO 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los

5 siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EXPLICACiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema de las construcciones de enzibióticos. A) Esquema de enzimas silvestres. B) Esquema de lisozimas modificadas y quimeras .

10 Figura 2. Localización de las mutaciones introducidas en los mutantes Cpl7-00S y CpI7-NOS. A) Estructura de la segunda repetición de C-CpI7-00S (SEQ ID NO 11) mostrando los aminoácidos modificados, e identificación de la zona reconocida por "fpocket" como sitio de unión a la pared celular mediante el conjunto de esferas grises. En la parte superior se muestra la secuencia de una repetición seguida del linker. Sobre fondo gris los

15 residuos conservados dentro de la familia CW_7. B) Localización de las mutaciones introducidas en N-CpI7-N (SEQ ID NO 9). La cavidad catalítica está situada en el centro del barril.

Figura 3. Cinética de lisis de la cepa R6 de S. pneumoniae por diferentes variantes de Cpl-7 a distintas concentraciones de enzima. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, 20 a 37'C. Panel superior, Cpl-7; Panel medio, CpI7-00S; y panel inferior, CpI7-NOS.

Figura 4. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa R6 de S. pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

25 Figura 5. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa 039 de S. pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 6. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa P007 de S. pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 7. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa pooa de S. pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 8. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre la cepa 048 de S. pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 9. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre de S. pyogenes. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 10. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. aureus. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 11. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. iniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 3JOC y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 12. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. mitis SK598. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 13. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre E. coli DH10B pretratadas con 0.01% carvaerol. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 IJg/ml.

Figura 14. Modelo animal de infección en embriones de pez cebra. Representación del porcentaje de viabilidad de embriones de peces cebra en las pruebas de infección con S. pneumoniae o S. pyogenes y tratamiento con epl7-DOS. Las barras indican desviaciones stándard y los asteriscos resultados estadísticamente significativos con respecto a los controles. Para el análisis estadístico se ha realizado el test de Anova (p<O.01).

MODO DE REALlZACION DE LA INVENCION

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de dominios de unión a pared C~CpIM7 mejorados. El procedimiento de mejora está basado, fundamentalmente, en la modificación de la carga neta de las tres repeticiones que forman el dominio C-Cpl-7 sin que los cambios de secuencia introducidos alteren el plegamiento de la proteína. La selección de las posiciones a modificar y el tipo de mutación introducida en cada posición se llevó a cabo teniendo en cuenta, por tanto, la conservación de secuencias dentro de la familia CW_7 (PF08230) y los modelos a alta resolución previamente generados para N-Cpl-7 y C-Cpl-7 (Bustamante et al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196). Se construyeron 2 mutantes en los que se modificaron una posición por repetición (CpI7-00E, SEO ID NO 21)) Y cinco posiciones por repetición (CpI7-OOS, SEO ID NO 17) de C-Cpl-7, todas ellas situadas en zonas alejadas de los posibles sitios de unión a la pared, según el análisis de la estructura llevado a cabo con el programa "Fpocket" (Le Guilloux et al. 2009. BMC Bioin!. 10:168) (Figura 2 A). Se construyó asimismo un tercer mutante (CpI7-NOS, SEO ID NO 19) en el que además de las mutaciones de Cp17-00S se mutaron tres aminoácidos no conservados de N-Cpl-7, todos situados fuera de la cavidad catalítica (Figura 28). Mediante dichas mutaciones la carga neta de la proteina pasó de -28.8 (Cpl-7) a -25.8 (CpI7-00E), -10.85 (CpI7-00S) y -7.85 (CpI7-NOS) y se ha invertido, de negativa a positiva, la carga de las repeticiones CW_7 en los dos últimos mutantes.

Simultáneamente, y con el objetivo de facilitar la creación de futuras mutaciones puntuales, se rompió la degeneración de secuencia que tiene la región codificante de e-epl-? en la proteína silvestre, introduciendo en cada posición cadones frecuentemente utilizados por E. coli que, sin modificar la secuencia de aminoácidos, permitieron también optimizar la expresión de las formas mutadas. En la Figura 1 se muestra la organización estructural de epl-7 y los mutanles mejorados junto con la carga neta total calculada para cada uno de ellos a pH neutro. Las secuencias codificantes de cada forma mutada , junto con las secuencias de aminoácidos se incluyen al final del ejemplo.

Los genes codificantes para las distintas variantes se obtuvieron por síntesis química a traves de la empresa ATG:biosynthetics como derivados del plasmido pUCo Para optimizar la expresión de las proteínas, los fragmentos de AON respectivos se subclonaron en el plasmido pT?-? utilizando los sitios Ndel y Pst1. Los plásmidos resultantes (pTRD?50, pTR753 Y pTR752 codificantes de CpI7-00S, CpI7-NOS y CpI7-00E, respectivamente) se transformaron en E. coli BL21 (DE3) Y las células transformadas se crecieron en LB tras inducir con IPTG (isopropil-j3-D-tiogalactopiranósido). Los niveles de expresión de las proteínas recombinantes fueron elevados y la purificación se llevó a cabo siguiendo el procedimiento establecido para Cpl-? silvestre. Las muestras purificadas se mantuvieron congeladas a -20°C en 20 mM fosfato (pH 6.0). El mantenimiento de la estructura nativa de Cpl-? en los mutantes se verificó comparando los espectros de dicroísmo circular de la forma silvestre y los mutantes (estructuras secundaria y terciaria) y los perfiles de sedimentación obtenidos por ultracentrifugación analítica (estructura cuaternaria).

Ejemplo 2. Construcción de proteínas híbridas con actividad bactericida portadoras de C-CpI7-00S con espectro de acción ampliado

Se han construido dos lisozimas híbridas portadoras del módulo catalítico de Cpl-1 (N-Cpl-1) fusionado a C-Cpl-7S mediante los linker de las formas nativas de Cpl-1 (quimera CpI1 -00S) y Cpl-? (quimera CpI1-07S). En la Figura 1 se muestra la organización estructural de las enzimas parentales (panel A) y de las mureín-hidrolasas híbridas construidas (panel B). Las secuencias codificantes, junto con las secuencias de aminoacidos se incluyen al final del ejemplo. Como puede verse en la Figura 1 B, la carga neta de las quimeras es significativamente inferior a la epl-? silvestre.

Los genes codificantes para las quimeras se obtuvieron por síntesis química a traves de la empresa ATG:biosynthetics como derivados del plasmido pUCo Para optimizar la expresión de las proteínas se procedió de la forma descrita en el ejemplo 1 para las variantes de epl-7. Las quimeras se purificaron siguiendo un procedimiento paralelo al descrito para epl-7 y sus mutantes. Las muestras purificadas se mantuvieron congeladas a -20°C in 20 mM fosfato (pH 6.0).

Ejemplo 3. Actividad bactericida de los mutantes de e-epl-7 y quimeras portadoras de

C·CpJ7·00S

Una vez puesto a punto el protocolo para la producción de las mureín-hidrolasas expresadas en E. coli, se purificaron las correspondientes proteínas y se llevaron a cabo ensayos de actividad bactericida sobre S. pneumoniae y otras bacterias, tanto Gram-positivas como Gram-negativas (Tabla 1). Como se puede observar en los datos de la Tabla 2, y a diferencia de Cpl-1, las enzimas portadoras del módulo C-Cpl-7 tienen un rango de huésped ampliado, ya que degradan no sólo las paredes de neumococo sino también las de otras bacterias, que no contienen colina en sus envueltas celulares, tanto Gram-positivas (S. pyogenes, S mitis y E. faecalis, entre otras) como Gram-negativas (por ejemplo, P. putida y

E. coli). Los módulos mejorados potencian de forma significativa la actividad bactericida, como se deduce del hecho de que Cp17-00S tenga el mismo nivel de actividad que Cpl-7 a una concentración 2.5 veces menor y de que, en igualdad de condiciones, la caída en el número de células vía bies producida por las enzimas modificadas sea "" 10 veces mayor en un porcentaje importante de casos (Tabla 2). Es importante destacar que este aumento de la actividad bactericida se observa también frente a aislados clínicos multirresistentes de neumococo (cepas D48, 69 Y 1515), frente a S. mitis (otro patógeno de enorme relevancia clínica) y frente a especies como E. coli que pueden ser o no patogénicas. De entre todas las enzimas construidas, Cp17-00S es la más activa frente S. pneumoniae, S. milis y E. coli ya que su capacidad bactericida supera, o como mínimo iguala, a las de las otras enzimas que contienen el módulo C-Cpl-7 o variantes del mismo (Tabla 3), y su CMI para la cepa de neumococo ATTCC 49619 es cuatro veces inferior a la de Cpl-? (Tabla 2). Cpl?-OOS constituye por tanto el primer ejemplo de la optimización de las propiedades enzimáticas de una mureín-hidrolasa nativa de neumococo, en este caso codificada por un fago, que es capaz de hidrolizar diversas paredes bacterianas, más allá de las de su sustrato homólogo.

Tabla 1. Lista de bacterias utilizadas

Bacteria Cepa

Origenb

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pyogenes Streptococcus milis

Streptococcus aga/actiae Streptococcus iniae

Streptococcus mutans

Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimi/is Staphylococcus aureus Bifidobacterium adolescentis Corynebacterium jeikeium Enterococcus faecalis Lactococcus lactis subsp. lactis Mycobacterium smegmatis Escherichia coli Pseudomonas puUda

R6

P007 P008 D39 D48 69 1515

SK598

mc2155

DH10S KT2442

49456 13813 29178 25175

12600 12600 43734 19433 9936 19420

CIS CIS CIS CIS CIS ISCIII ISCIII CECT CIS CIS CECT CECT CECT

CECT

CECT CECT

DSM

CECT CECT CIS CIS CIS

aATCC, American Type Culture Collection. beiS, Centro de Investigaciones Biológicas; CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; ISelll, Instituto de Salud Carlos 111.

Tabla 2. Análisis de células viables de las diferentes cepas estudiadas tras incubarlas durante 60 mi" con distintas murein-hidrolasas

Bacteria Cpl-1 Cpl-7 Cp17-Cp17-Cp17-Cp11 -Cp11 OOS NOS OOE 07S OOS

Gram-positivas

S. pneumoniae

R6: • +++ ++++ ++++ +++ +++ +++

D39: ++ +++ ++ ++ +++ +++

POO7: • ++ ++ ++ ++ ++ ++

POO8: • ++ +++ ++ ++ ++ ++

D48: ++++ + ++ ++ ++ ++ ++

69: ++ +++ n.d. n.d. n.d. n.d.

1515: ++ +++ n.d. n.d. n.d. n.d.

S. pyogenes: +++ ++++ +++ +++ +++ +++

S. milis

SK598: +++ +++ ++ ++ ++ ++

49456: ++++ +++ ++++ n.d. n.d. n.d. n.d.

S. aga/actiae

S. iniae: + + + + + +

S. mutans: + +

S. dysgalactiae: + + + + + +

S. aureus

B. adolescentis: + + + + + +

C. jeikeium

E. faecafis: ++ ++ n.d. n.d. n.d. n.d.

L. lactis

M. smegmatis

Gram-negativas

+ +++ + + + +

E. cofi DH10B

P. pulida ++ ++ +

KT2442

H Sin efecto; n.d. no determinado; (+) Descenso de 1 unidad logarítmica en células viables; (++) Descenso de 2 unidades logarítmicas en células viables; (+++) Descenso de 3 unidades logarítmicas en células viables; (++++) Descenso de 4 o más unidades logarítmicas en células viables; (*) < 10 unidades formadoras de colonias/mi.

Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (CMI)

Enzibióticos CMI

Cpl-7: 256 ~g/ml

Cp17-00S: 64 ~g/ml

Cpl-1: 16 ~g/ml

Los ensayos de lisis sobre las bacterias Gram-posilivas ensayadas se realizaron a diferentes concentraciones de enzima (Figura 2), y como concentración standard se escogió 51-lg/ml (Figuras 4-14). Finalmente, en el ensayo estándar se usó una solución de la bacteria a estudiar resuspendida en tampón PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HP04,2

H20, 2 mM KH2P04, pH 6.0) con un valor de 00550 == 0.6 y, tras añadir una determinada cantidad de enzima purificada, se midió la evolución de la turbidez de la muestra a 550 nm (00550) incubando durante 60 minutos a 37'C. A diferentes inlervalos se tomaron alícuotas de las muestras para observar la morfologia celular al microscopio óptico y se calculó el número de células viables (Figuras 3-13).

En general, las murein-hidrolasas han demostrado su efectividad contra bacterias Grampositivas pero se han mostrado ineficaces contra las Gram-negativas, debido a la presencia en estas últimas de una membrana externa que impide el acceso directo de la enzima al peptidoglicano, su sustrato natural; consistentemente, los mismos resultados se obtuvieron en nuestro caso con E. coli y P. pulida. Es por ello que se recurrió a combinar el tratamiento enzimatico con la adición de compuestos capaces de inducir alteraciones de la membrana externa y, por tanto, facilitar la acción de las mureín-hidrolasas añadidas desde el exterior. Para dicha estrategia se seleccionaron algunos aceites esenciales que habían demostrado tener actividad antibacteriana y cuyo modo de acción esta asociado a la modificación de las membranas celulares (Surt, S. 2004. Int. J. Food Microbio!. 94:223-253). Más concretamente, se ha descrito que el carvacrol y el timol son capaces de desintegrar la membrana externa de bacterias Gram-negativas, liberando lipopolisacáridos e incrementando la permeabilidad de la membrana citoplasmica al ATP (Helander et al. 1998.

J. Agr. Food Chem. 46:3590-3595). Asi pues, se probaron distintas concentraciones (0.1%,

0.01 % Y 0.001 %) de estos dos aceites esenciales utilizando E. coli y P. pulida como sistemas modelo (datos no mostrados). Finalmente se eligió carvacrol al 0.01% por su capacidad para promover la acción litica de algunas de las mureín-hidrolasas ensayadas sin tener apenas efecto bactericida por sí mismo. En estas condiciones, la tasa de muerte inducida por epl7 -008 a 5 J.lg/ml transcurridos 60 min superaba en dos unidades logarítmicas (P. pUlida) y tres unidades logarítmicas (E. coli) a la provocada únicamente por el carvacrol (Figura 13 y Tabla 2), mientras que la li50z1ma Cpl-1, dependiente de colina para su actividad, se mostró completamente ineficaz.

En la Tabla 2 se resumen los valores obtenidos para las tasas de muerte celular causadas por las distintas enzimas en las cepas testadas. A partir de los mismos se puede concluir que la modificación del módulo de unión a pared celular de e-epl-?, y en particular los cambios introducidos en el módulo C-Cpl-7S, potencian significativamente la actividad antimicrobiana de las lisinas que los portan, haciéndolas particularmente eficaces frente a las distintas cepas de neumococo ensayadas, incluidos los aislados clínicos multirresistentes, así como frente a S. pyogenes, y S. milis, otros dos importantes patógenos humanos.

Ejemplo 4. Actividad bactericida de los mutantes de C-Cpl-7 in vivo.

Para validar estos resultados obtenidos in vilro en un modelo de infección animal, se puso a punto un modelo utilizado previamente para estudiar la patogenesis de estafilococos y que supone una alternativa al clásico modelo murino: los embriones de pez cebra (Miller y Neely. 2004. Acta Trop. 91 :53-68). Embriones de 72 horas mantenidos en medio E3 (5 mM NaCI, 0,17 mM KGI, 0,33 mM GaGl, and 0,33 mM MgSO" pH 7.0) se expusieron, por inmersión, a la acción de neumococo (cepa D39) oS. pyogenes durante 7 horas a 28.5'C, al cabo de las cuales se lavaron con medio E3 y se trataron con buffer o con una solución de mureínhidrolasa (25 I-.Ig mr\ En estas condiciones la tasa de mortalidad de los embriones infectados era significativa con respecto a los controles no expuestos a las bacterias (22.6% para S. pneumoniae y 29.4% para S. pyogenes). Como se muestra en la Figura 14, la adición de Cp17-00S a las muestras infectadas elevó de forma significativa la tasa de supervivencia (99% en el caso de neumococo y 95.3% en el caso de S. pyogenes). Por el contrario el tratamiento con Cpl-1 sólo protegió a los embriones infectados por S. pneumoniae. Estos resultados demuestran la capacidad de Cp17-00S y otras mureínhidrolasas portadoras del módulo C-Cpl-7 mejorado para actuar como antimicrobianos in vivo frente a infecciones causadas por patógenos susceptibles a las mismas (Figura 14).

Materiales y métodos

Bacterias y medios de cultivo. Las cepas bacterianas utilizadas se enumeran en la Tabla 1 y las características de las cepas de neumococo se resumen a continuación: R6, cepa de

laboratorio no capsulada; D39 (cápsula tipo 2); P007 (cápsula tipo 3) (Domenech et al., 2009. Environ. Microbiol. 11:2542-2555); P008 (cápsula tipo 4) (similar a P007 pero transformada con DNA de un tipo 4 capsular), y D48 (cápsula tipo 23F), 1515 (cápsula tipo 6B) y 69 (cápsula tipo 19F) son aislados clinicos multirresistentes (Ramos-Sevillano et al.

2012. Antimicrob. Agents Chemother. 56:5534-5540). Las bacterias Gram-positivas se sembraron en medios BHI (C. jeikeium, S. dysgalactiae , S. iniae ), LB (M. smegmatis m¿ 155), M17 (L. lactis ), BM (B. adolescentes), y C+Y (todas las demás), y se crecieron a 37'C sin agitación, excepto S. iniae que fue con agitación (Lacks y Hotchkiss. 1960. Biochim. Biophys. Acta 39: 508-517). E. coli y P. pulida se crecieron, con agitación, en medio LB a 37°C y 30°C, respectivamente (Sambrook y Russell. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual). Las cepas se conservaron congeladas a -70'C en medio de cultivo al que se añadió glicerol a110% (v/v) (concentración final).

Construcción de genes y purificación de proteinas. Los genes codificantes de Cpl7 -DOS,

CpI7-NOS, CpI7-00E, Cpll-00S y Cpll-07S se obtuvieron a partir de plásmidos

recombinantes sintetizados por la empresa ATG:biosynthetics (Merzhausen, Alemania). Para dichas síntesis se partió de los genes nativos epl-1 y epl-7 (García et al. 1988. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918; Garcia et al. 1990. Gene 86: 81-88). La secuencia de C

Cpl-7 se modificó para invertir su carga neta de elevadamente negativa a positiva, basandose en la observación de Low y colaboradores de que la carga neta del módulo catalitico de las murein-hidrolasas fagicas determina el que la actividad bactericida de las mismas dependa o no de la adquisición de módulos de unión a la pared celular (Low et al.

2011 . J. Biol. Chem. 286: 3439 1-34403), yen la hipótesis de que la carga de los módulos de

unión a la pared celular podría tener en efecto comparable, aunque no haya sido previamente observado. Tras un exhaustivo ana lisis de la conservación de secuencias en las familias GH-25 (módulo catalitico de Cpl-l y Cpl-7; PF081183) y de las repeticiones CWJ (PF08230; código de acceso a PFAM ), y basándose en la información estructural

disponible (Bustamante et al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196), se introdujeron mutaciones que por su naturaleza o localización no deberian afectar a la estructura de los mutantes. De esta manera, se mutaron varios residuos localizados tanto en el módulo Nterminal como en el C-terminal por lo que la carga neta pasó, por ejemplo, de -28.8 (Cpl-7) a

-: 10.85 (CpI7-00S) y -7.85 (CpI7-NOS). Los cambios introducidos se detallan en el ejemplo 1.

En todos los casos, se aprovecharon estas síntesis para cambiar algunos codones de los genes originales, pero sin provocar cambios en la secuencia de aminoacidos, con el objetivo

de optimizar la expresión en E. coJi y facilitar la introducción de nuevas mutaciones puntuales en e-epl-7 al romper la repetición perfecta de cad enes que existe en esta región en el gen silvestre. Los genes codificantes de estas enzimas, suministrados por ATG:biosinthetic en un plásmido derivado de pUC, se subclonaron en el plásmido pT7-7 y su expresión se llevó a cabo en la cepa de E. coli BL21 (DE3).

La pureza de las proteínas recombinanles se verificó por SDS-PAGE y espectrometria de masas (MALOI-TOF). Las enzimas purificadas se conservaron a -20°C y se diluyeron en PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na,HPO, and 1.8 mM KH,PO,), pH 6.0, antes de realizar los ensayos. Las concentraciones de proteína se midieron espectrofotométricamente utilizando los coeficientes de absorción molar a 280 nm.

Las secuencias de todas estas mureín-hidrolasas y sus genes codificantes se muestran en los esquemas de los ejemplos 1 y 2. La carga neta de las proteínas y sus módulos a pH neutro se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos con el programa Sendterp (Laue et al. 1992. En Ana/ytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (Harding, SE, Rowe, AJ, y Horton, JC, eds) pp. 90-125, Royal Society 01 Chemistry, Cambridge, UK).

Evaluación de la conservación de la estructura nativa de los mutantes de epl-7. La conservación del estado nativo se verificó por dicroísmo circular (OC) y ultracentrifugación analítica. Los espectros de OC se registraron (UV-Iejano y UV-cercano) en las condiciones previamente descritas por Bustamante et al. (2010), utilizando un espectropolarímetro J-810. Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron en una ultra centrífuga Optima XL-A a 45.000 rpm utilizando células de doble sector. La distribución de coeficientes de sedimentación se calculó modelando por mínimos cuadrados no lineales los datos experimentales, con el programa SEDFIT (Laue et al. 1992. En Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (Harding, SE, Rowe, AJ, y Hartan, JC, eds) pp. 90125, Royal Society 01 Chemistry, Cambridge, UK). Todas las medidas se realizaron en 20 mM fosfato, pH 6.0, a 20°C.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). Las CMls para Cpl-?, Cpl?OOS y Cpl-1 (Tabla 3) se midieron usando la cepa control para ensayos de susceptibilidad en neumococo ATCC 49619 (serotipo 19 F) (http://www.lgcstandardsatcc.org/Products/AII/49619.aspx). Se siguió el método de microdilución aprobado por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), usando caldo Mueller-Hinton 11 ajustado en cationes (Sectan, Dickinson and Ca., Le Pont-de-Claix, Francia) suplementado con

sangre lisada de caballo al 5% (CA-MHB-LHB). Los ensayos se realizaron por triplicado y se procedió a su lectura tras 20-24 horas a 37°C.

Ensayo de actividad bactericida y cálculo de células viables. Las bacterias en fase exponencial de crecimiento se centrifugaron y se resuspendieron en 1.5 mi de PBS ajustando la turbidez final de las suspensiones a una 00550 =: 0,6. A estas muestras se añadieron concentraciones adecuadas de las diferentes enzimas purificadas, o un volumen equivalente de PBS (controles). Los tubos se incubaron a 37'C durante una hora midiéndose la D0550 a distintos tiempos de incubación. En los ensayos con bacterias Gramnegativas, las células se resuspendieron en PBS suplementado con la concentración deseada de carvacrol o timol (0.1% , 0.01% Y 0.001%) antes de proceder de la forma anteriormente descrita, y se realizaron controles en ausencia y en presencia de los mismos. Para calcular el número de células viables, se realizaron diluciones seriadas de las muestras en PBS y se sembraron en placas de agar en medio C+Y o de agar-sangre (agar de soja tripticaseina suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero) en el caso de las bacterias Gram-positivas y en placas de agar-LB en las Gram-negativas. Las placas se incubaron toda la noche a 37''C y se contaron las ca lonias. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Ensayo de actividad bactericida en el modelo de embriones de pez cebra. Los embriones silvestres distribuidos por ZF-biolabs (Tres Cantos, Madrid), se mantuvieron de acuerdo a los protocolos estándar (Westerfield M. 1993. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio) . Eugene: The University of Oregon Press) y se trataron con pro nasa (2 mg/ml) durante 2 minutos para eliminar el carian 24 h después de la fecundación. Durante los experimentos los embriones se mantuvieron en medio E3 (5 mM NaCI, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl, and 0,33 mM MgSO,), pH 7, a 28.5'C. A las 72 h de la fecundación, los embriones se expusieron a la acción de los patógenos, agregando las

bacterias ('" 108 CFU ml-) previamente resuspendidas en medio E3. Al cabo de 7 h las muestras se lavaron de forma exhaustiva (7 veces) con medio E3 para eliminar las bacterias y se agregó Cp17-00S o Cpl -1 (dosis única de 25 Jlg), o la cantidad equivalente de tampón (controles). La evolución de los embriones se siguió durante cinco días, añadiendo medio E3 fresco cada día. Los embriones se consideraron muertos cuando no se observó movimiento y desaparecía poco tiempo después la transparencia de los mismos. Controles con muestras libres de bacterias se realizaron en paralelo. Se emplearon un total de 255 embriones distribuidos individualmente en placas de 96 pocillos. Se probaron las siguientes

condiciones (24-36 embriones para cada condición) y cada experimento se repitió un

mínimo de tres veces: Control (embriones + medio E3) Control + enzima ensayada

5 Infección con S. pneumoniae 0 39 Infección con S. pneumoniae 0 39 + tratamiento con las enzimas ensayadas (CpI7OOS o Cpl-1) Infección con S. pyogenes Infección con S. pyogenes + tratamiento con las enzimas ensayadas (CpI7-00S o

10 Cpl-1)

En la Figura 14 se muestran las tasas de supervivencia de los embriones en las distintas condiciones ensayadas. La viabilidad de los embriones incubados con la cepa R6 de neumococo (no patogénica) o con la cepa 0 39 ¡nactivada por calentamiento (10 min a 65°C) era equivalente a la de los controles.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que consiste en el módulo de unión a pared de la lisina epl-?, e-epl-7, modificado para que aumente su carga neta lo que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEO ID NO 7, Y porque comprende, al menos, las siguientes alteraciones en su secuencia de aminoácidos:

la posición homóloga a la posición 216 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K), la posición homóloga a la posición 225 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (K), la posición homóloga a la posición 230 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R), la posición homóloga a la posición 233 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N), la posición homóloga a la posición 239 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N), la posición homóloga a la posición 264 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K), la posición homóloga a la posición 273 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (K), la posición homóloga a la posición 278 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R), la posición homóloga a la posición 281 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (D) original por el aminoácido (N), la posición homóloga a la posición 287 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N), la posición homóloga a la posición 312 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (L) original por el aminoácido (K), la posición homóloga a la posición 321 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoacido (K), la posición homóloga a la posición 326 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (A) original por el aminoácido (R), la posición homóloga a la posición 329 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N),

la posición homóloga a la posición 335 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido (O) original por el aminoácido (N).
2.

Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEO ID NO 11 .
3.

Polinucleótido caracterizado por que codifica para el polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
4.

Polinucleótido según la reivindicación 3 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la secuencia SEO ID NO 12.
5.

Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las reivindicaciones 3 y 4.
6.

Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la reivindicación 5.
7.

Célula hospedadora según la reivindicación 6 caracterizada por ser Escheriehia eoli.
8.

Método de obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por

que comprende: a) introducir el vector según la reivindicación 5 en una célula hospedadora adecuada b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 en un medio adecuado, y, c) purificar el polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
9.

Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 3 y 4 para la obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
10.

Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 para la obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
11.

Polipeptido según la reivindicación 1 y 2 caracterizado por que está unido a una etiqueta de marcaje.
12.

Uso del polipéptido según la reivindicación 11 en técnicas de marcaje bacteriano.
13.

Uso del polipéptido según la reivindicación 12 caracterizado por que está unido a una

5 part1cula de aislamiento útil para la concentración de la población bacteriana de una muestra.
14. Enzima quimérica caracterizada por que, al menos, comprende los siguientes polipéptidos:

a) un módulo catalítico N-terminal procedente de un fago bacteriano, 10 b) un módulo de unión pared e-terminal según las reivindicaciones 1 y 2.
15. Enzima quimérica según la reivindicación 14 caracterizado por que su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO t 7, SEO ID NO t 9, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.
16.

Polinucleótido caracterizado por que codifica una enzima quimerica según las 15 reivindicaciones 14 y 15.
17. Polinucleótido según la reivindicación 16 caracterizado por que su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO t 8, SEO ID NO 20, SEO ID NO 24, SEQ ID NO 26.
18.

Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las 20 reivindicaciones 16 y 17.
19.

Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la reivindicación 18.
20.

Célula hospedadora según la reivindicación 19 caracterizada por ser Escherichia eoli.
21.

Método de obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 que

comprende: a) introducir el vector según la reivindicación 18 en una célula hospedadora adecuada

5 b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 en un medio adecuado, y, e) purificar la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
22. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 16 y 17 para la obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.

10 23. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 para la obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
24. Uso de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 en la elaboración de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de una infección bacteriana o como antiséptico.

15 25. Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico caracterizada por que comprende al menos una enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que la

secuencia de la enzima quimérica se corresponde con alguna de las siguientes: SEO 10 NO 20 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25.
27.

Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que contiene además un adyuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28.

Composición farmacéutica según las reivindicaciones 25 a 27 caracterizada por que contiene además otro principio activo.