ES2433127T3 - Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas - Google Patents
Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2433127T3 ES2433127T3 ES04809864T ES04809864T ES2433127T3 ES 2433127 T3 ES2433127 T3 ES 2433127T3 ES 04809864 T ES04809864 T ES 04809864T ES 04809864 T ES04809864 T ES 04809864T ES 2433127 T3 ES2433127 T3 ES 2433127T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- soluble
- collagen
- sequence
- pro
- trimerized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 102
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims abstract description 6
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 55
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 36
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 25
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 25
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 23
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 22
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 22
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 claims description 14
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 37
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 37
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 18
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 17
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 15
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 10
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 9
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 4
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 3
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004152 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 208000037487 Endotoxemia Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 1
- 108010083930 HIV Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006481 HIV Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000801228 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108010007127 Pulmonary Surfactant-Associated Protein D Proteins 0.000 description 1
- 102100027845 Pulmonary surfactant-associated protein D Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N cimetidine Chemical compound N#C/N=C(/NC)NCCSCC=1N=CNC=1C AQIXAKUUQRKLND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO ZAHQPTJLOCWVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procedimiento para generar una proteína de fusión trimérica secretada, que implica: (a) crear un constructo de ADN (AND recombinado) que incluya un promotor de transcripción ligado a una matriz que codifique una secuencia de péptido señal seguido de una unión en fase en un polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado, el cual es un polipéptido biológicamente activo o un receptor soluble que consiste de un/unos dominio/s de unión al ligando, y que a su vez está unido en fase a una porción C-terminal de procolágeno que es capaz de autotrimerizarse en una forma soluble con enlaces intermoleculares disulfuro unidos fuertemente de forma covalente; (b) introducir dicho constructo de ADN en una célula eucariota; (c) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada soluble codificada por dicha secuencia de ADN; y (d) aislar dicha proteína de fusión trimerizada del medio de cultivo de dicha célula huésped.
Description
Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas
CAMPO DEL INVENTO
El presente invento se refiere a procedimientos para la expresión de proteínas y, más específicamente, para crear y expresar proteínas triméricas secretadas y biológicamente activas, tales como receptores triméricos solubles.
ANTECEDENTES DEL INVENTO
En los organismos pluricelulares, como por ejemplo los seres humanos, las células se comunican entre sí por la llamada ruta de transducción de la señal, en la cual un ligando secretado (como por ejemplo citoquinas, factores de crecimiento u hormonas) se une a su/s receptor/es de la superficie celular, lo que lleva a la activación de dicho/s receptor/es. Los receptores son proteínas de membrana que consisten de un dominio extracelular responsable de la unión al ligando, y de una región central transmembrana seguida de un dominio citoplasmático encargado de enviar la señal hacia abajo en la ruta. La transducción de la señal puede tener lugar de tres formas distintas dependiendo de la fuente de la señal secretada y de la ubicación de la célula diana que expresa el/los receptor/es: de forma paracrina (comunicación entre células vecinas), de forma autocrina (comunicación hacia la propia célula) o de forma endocrina (comunicación entre células distantes a través de la circulación). Uno de los mecanismos generales que subyace a la activación del receptor y que pone en marcha la cascada de eventos bajo la membrana celular, incluyendo la activación de la expresión génica, es un ligando polipeptídico, como por ejemplo una citoquina, presente en su forma oligomérica, como un homo-dímero o trímero, que cuando se une a su receptor monomérico en la superficie exterior de las células lleva a la oligomerización del receptor. Las rutas de transducción de la señal desempeñan un papel clave en el desarrollo normal de las células y en su diferenciación, así como en la respuesta a ataques externos tales como infecciones bacterianas o víricas. Determinadas anomalías en estas rutas de transducción de la señal, ya sea en forma de subactivación (por ejemplo con la falta de ligando) o bien de sobreactivación (por ejemplo con un exceso de ligando), son las causas subyacentes de condiciones patológicas y enfermedades tales como la artritis, el cáncer, el SIDA o la diabetes. Una de las actuales estrategias para el tratamiento de estas enfermedades debilitantes se basa en el uso de receptores señuelo, tales como receptores solubles que consisten tan solo del dominio de unión al ligando extracelular, para interceptar el ligando y por lo tanto superar la sobreactivación del receptor. El mejor ejemplo de esta estrategia es la creación de Enbrel, una proteína de fusión dimérica soluble receptor TNF-α - inmunoglobulina (IgG) por Immunex (Mohler et al., 1993; Jacobs et al., 1997), que ahora forma parte de Amgen. La familia TNF de citoquinas es una de las principales señales proinflamatorias producidas por el cuerpo en respuesta a una infección
o una lesión tisular. Sin embargo, se ha demostrado que la producción anormal de estas citoquinas, por ejemplo en ausencia de infección o lesión de los tejidos, es una de las causas subyacentes de enfermedades como la artritis y la psoriasis. En la superficie celular está presente de forma natural un receptor TNF-α en su forma monomérica antes de la unión a su ligando, el TNF-α, que existe, por el contrario, como un homotrímero (Locksley et al., 2001). En consecuencia, la fusión de un receptor TNF-α soluble con la región Fc de la inmunoglobulina G1, que es capaz de una dimerización espontánea a través de enlaces disulfuro (Sledziewski et al., 1992 y 1998), permite la secreción de un receptor TNF-α dimérico soluble (Mohler et al., 1993; Jacobs et al., 1997). En comparación con el receptor soluble monomérico, la unión dimérica receptor TNF-αII - Fc tiene una afinidad mucho mayor al ligando homotrimérico. Esto proporciona una base molecular para su uso clínico en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR), una enfermedad autoinmune en la cual niveles constitutivamente altos de TNF-α, una citoquina proinflamatoria importante, juegan un papel clave en la causa de la enfermedad. Aunque Enbrel ha demostrado tener valores de Ki para TNF-α que se encuentran en el rango de pM (ng/mL) (Mohler et al., 1993), en los pacientes con AR son necesarias inyecciones subcutáneas de 25 mg dos veces por semana para lograr beneficios clínicos, lo que se traduce en niveles del receptor soluble de mg/mL (www.enbrel.com). El alto nivel de consumo recurrente de Enbrel por los pacientes con AR ha generado una gran presión así como un alto coste en lo que respecta al suministro del medicamento, lo que por sí solo limita el acceso al mismo a millones de pacientes potenciales ya solo en este país. Además de la familia TNF-α de las importantes citoquinas proinflamatorias, el virus del VIH que causa el SIDA también utiliza una proteína de cubierta homo-trimérica, la gp120, para poder entrar en las células T colaboradoras CD-4 positivas en nuestro cuerpo (Kwong et al., 1998). Uno de los primeros eventos durante la infección por VIH implica la unión de la gp120 a su receptor CD-4, expresado únicamente en la superficie celular de las células T colaboradoras (Clapham et al., 2001). Hace una década se demostró que el CD-4 monomérico soluble es un agente potente contra la infección por VIH (Clapham et al., 1989). Sin embargo, por desgracia, el entusiasmo cayó cuando se demostró que su capacidad estaba limitada únicamente a cepas de VIH del laboratorio (Daar et al., 1990). Resultó que las cepas de VIH de pacientes con SIDA tenían una afinidad mucho menor al CD-4 monomérico soluble que las cepas de laboratorio, probablemente debido a la variación de la secuencia en la gp120 (Daar et al., 1990). Aunque se han desarrollado proteínas de fusión diméricas solubles Fc - CD-4, estos receptores señuelo CD-4 del VIH mostraron poco efecto antiviral, tanto en los laboratorios como en las clínicas, contra los VIH que se dan de forma natural en los pacientes con SIDA, debido a la baja afinidad por la gp120 (Daar et al., 1990).
Es por ello que existe una gran necesidad de crear receptores homotriméricos solubles secretados o proteínas biológicamente activas, las cuales pueden tener sitios de unión perfectamente acoplados, y por lo tanto una mayor afinidad, a sus ligandos homotriméricos presentes en la naturaleza, tales como la familia TNF de las citoquinas y las proteínas de cubierta del VIH. Tales receptores señuelo triméricos deberían tener teóricamente una afinidad mucho mayor por su ligando trimérico que sus homólogos diméricos. Estos análogos de receptores triméricos solubles diseñados de forma racional podrían aumentar significativamente los beneficios clínicos, así como reducir la cantidad o la frecuencia de las inyecciones de medicamentos para cada paciente. Para ser terapéuticamente factible, como la inmunoglobulina Fc, idealmente la fracción de la proteína de trimerización deseada debe ser parte de una proteína secretada de forma natural que sea a su vez abundante en el cuerpo y capaz de autotrimerizarse de forma eficiente. El colágeno es una familia de proteínas fibrosas que representan los componentes principales de la matriz extracelular. Es la proteína más abundante de los mamíferos, y constituye casi el 25% de las proteínas totales del cuerpo. El colágeno juega un papel estructural importante en la formación de huesos, tendones, piel, córneas, cartílagos, vasos sanguíneos y dientes (Stryer, 1988). Los tipos fibrilares de colágeno I, II, III, IV, V y XI se sintetizan como precursores triméricos más grandes denominados procolágenos, en los que el dominio de triple hélice central no interrumpida que consta de cientos de repeticiones "GXY" (o repeticiones de glicina) está acompañado de los dominios no colágeno (NC), el N- propéptido y el C-propéptido (Stryer, 1988). Tanto la extensión C– como la Nterminal se procesan proteolíticamente después de la secreción del procolágeno, un evento que desencadena el ensamblaje de la proteína madura en las fibrillas de colágeno, las cuales forman una matriz celular insoluble (Prockop et al., 1998). El trímero C-propéptido de colágeno de tipo I se encuentra en la sangre de las personas sanas en una concentración que se encuentra entre 100 y 600 ng/mL, presentando niveles más altos en los niños, los cuales son indicativos de la formación activa de hueso. Los colágenos de tipo I, IV, V y XI están ensamblados principalmente en formas heterotriméricas que consisten en dos cadenas α-1 y una cadena α-2 (para los tipos I , IV y V), o de tres cadenas α diferentes (para el tipo XI), las cuales son altamente homólogas en su secuencia. Los colágenos de tipo II y III son homotrímeros de cadena α-1. En el caso del colágeno tipo I, la forma más abundante de colágeno, también se forma el homotrímero estable α-1(I)que está presente en niveles variables en diferentes tejidos (Álvarez et al., 1999). La mayoría de estas cadenas Cpropéptido de colágeno se pueden autoensamblar en homotrímeros cuando se sobreexpresan solas en una célula. Aunque primero se sintetizan los dominios N-propéptido, el ensamblaje molecular en colágeno trimérico comienza con la asociación de los C-propéptidos. Se cree que el complejo C-propéptido se estabiliza por la formación de enlaces disulfuro intercatenarios, pero la necesidad de que se formen enlaces disulfuro para la adecuada obtención de la cadena no está clara. La triple hélice de glicina se repite y se propaga en forma de cremallera desde los extremos C-terminal asociados hasta los extremos N-terminal. Esto ha permitido la creación de tipos no naturales de matriz de colágeno mediante el intercambio de los C-propéptidos de diferentes cadenas de colágeno por medio del uso de tecnología de ADN recombinante (Bulleid et al., 2001). Las proteínas no colágenas, como las citoquinas y los factores de crecimiento, también se han fusionado con el extremo N-terminal, tanto del procolágeno como del colágeno maduro, para permitir la formación de una nueva matriz de colágeno que está destinada a permitir la lenta liberación de las proteínas no colágenas de la matriz celular (Tomita et al., 2001). Sin embargo, en los dos casos, es necesario que los C-propéptidos se escindan antes de que las fibrillas de colágeno recombinante se ensamblen en una matriz celular insoluble. Mohler et al., J Immunol, 1993, 151(3): 1548-61, mostraron que los receptores solubles del factor de necrosis tumoral (TNF por sus siglas en inglés ‘tumor necrosis factor’) son agentes terapéuticos eficaces en la endotoxemia letal y funcionan simultáneamente como portadores y antagonistas de TNF. El documento EP 0985732 A2 da a conocer una proteína quimera trimérica que ha conservado suficiente actividad fisiológica de un péptido fisiológicamente activo junto con un colágeno con capacidad para la formación de fibrillas. Una proteína quimera trimérica que comprende un colágeno y un péptido biológicamente activo fusionado con el colágeno, en cuyo caso el péptido biológicamente activo se fusiona en el extremo amino terminal del colágeno y el colágeno es un colágeno formador de fibrillas que tiene una estructura de triple hélice en su región de triple hélice. El documento WO 02/090553 A2 da a conocer proteínas de fusión recombinantes que tienen la propiedad de formar trímeros. Dichas proteínas de fusión recombinantes comprenden al menos un componente A y al menos un componente B. El componente B posee propiedades de trimerización mientras que el componente A presenta propiedades biológicas. El documento WO 02/090553 A2 da a conocer trímeros de dichas proteínas de fusión recombinantes. El documento WO 02/090553 A2 describe también el uso de dichos trímeros en la producción de un medicamento o el uso de los mismos para el diagnóstico in vitro o para la producción de un agente de diagnóstico in vitro. El documento WO 02/090553 A2 también se refiere a secuencias de ADN que codifican para dicha proteína de fusión y vectores de expresión y células huésped que contienen dichas secuencias de ADN o vectores de expresión. Hayashi et al., Biochim Biophys Acta, 1528 (2001), 187-95, describen la producción de la proteína quimérica de EGF
- colágeno que muestra la actividad mitogénica.
Kishore et al., J. Immunol (2001) 166: 559-565, describen que un homotrímero recombinante, compuesto de una
región de cuello de hélice alfa de la proteína D surfactante humana y del dominio globular C1qB, es un inhibidor de
la ruta complementaria clásica.
Holler et al., J Immunol Methods (2000) 237(1-2): 159-73, describen el desarrollo de inhibidores solubles de FasL y
CD40L mejorados y basados en receptores oligomerizados.
RESUMEN DEL INVENTO
Se presenta aquí un invento que permite que cualquier receptor soluble o polipéptido biológicamente activo se pueda desarrollar en su forma trimérica como una proteína secretada. La esencia del invento es fusionar, por medio de tecnología de ADN recombinante, receptores solubles y proteínas biológicamente activas al dominio C-propéptido del colágeno fibrilar que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización. Las proteínas de fusión resultantes, cuando se expresan en células eucariotas, son secretadas como proteínas solubles principalmente en sus formas triméricas fuertemente unidas de forma covalente por enlaces disulfuro intermoleculares formados entre los tres C-propéptidos. En un aspecto del invento, se da a conocer un procedimiento para producir proteínas de fusión triméricas secretadas, que consiste de las siguientes fases: (a) la creación de un constructo de ADN (AND recombinado) que incluye un promotor de transcripción ligado a una matriz que codifique una secuencia de péptido señal seguido de una unión en fase al polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual es un polipéptido biológicamente activo o un receptor soluble que consiste de un/unos dominio/s de unión al ligando, y que a su vez está unido en fase a una porción C-terminal de procolágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización en una forma soluble con enlaces disulfuro intermoleculares unidos fuertemente de forma covalente; (b) introducir dicho constructo de ADN en una célula eucariota; (c) hacer crecer la célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada soluble codificada por dicha secuencia de ADN, y (d) aislar la proteína de fusión trimerizada del medio de cultivo de la célula huésped. En un ejemplo de ejecución, la secuencia del péptido señal es la secuencia nativa de la proteína que se va a trimerizar. En otro ejemplo de ejecución, la secuencia del péptido señal es de una proteína secretada distinta de aquella que se va a trimerizar. En un ejemplo de ejecución, el polipéptido no colágeno que se va a trimerizar es un receptor soluble que consiste de un/os dominio/s de unión al ligando. En un ejemplo de ejecución, la porción Cterminal del colágeno es el C-propéptido que no tiene ninguna región de triple hélice de colágeno (IDs de Secuencia: 3-4). En otro ejemplo de ejecución, el extremo C-terminal del colágeno consiste de una fracción de la región de triple hélice de colágeno que funciona como un conector con las proteínas no colágenas que se van a trimerizar (IDs de Secuencia: 1-2). En otro ejemplo de ejecución, la porción C-terminal del colágeno tiene un sitio de reconocimiento para la proteasa BMP-1 que está mutado o suprimido (IDs de secuencia: 3-4). Según uno de los aspectos del invento, se da a conocer un procedimiento para producir una proteína de fusión trimérica secretada que consiste de las siguientes fases: (a) introducir en una célula huésped eucariota un constructo de ADN que comprende un promotor que dirija la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste en una secuencia de péptido señal que está unida en fase a un polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual se une en fase a su vez a la porción C-terminal de colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización, y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa. 1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa.2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI); (b) cultivar la célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento apropiado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada codificada por dicha secuencia de ADN, y (c) aislar la proteína de fusión trimérica secretada a partir de una célula huésped. En un ejemplo preferido de ejecución, el polipéptido no colágeno que se va a trimerizar es el TNF-RII soluble (p75) (ID de Secuencia: 9-12). En otro ejemplo de ejecución preferido, el polipéptido no colágeno que se va a trimerizar es el CD-4 soluble, el correceptor del VIH (ID de Secuencia: 13-16). En un nuevo ejemplo preferido de ejecución, el polipéptido no colágeno que se va a trimerizar es una fosfatasa alcalina secretada de la placenta (ID de Secuencia: 5-8). En un aspecto del presente invento, se da a conocer un procedimiento para producir una proteína de fusión trimérica secretada, que consiste de las siguientes fases: (a) introducir en una célula huésped eucariota un primer constructo de ADN que comprende un promotor que dirije la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste en una secuencia de péptido señal que está unida en fase a un polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual está unido a su vez a la porción C-terminal del colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización, y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.l (V), pro.alfa.2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI), (b) introducir en una célula huésped eucariota un segundo constructo de ADN que comprende un promotor que dirije la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste de una segunda secuencia de péptido señal que está unida en fase a un segundo polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual está unido en fase, a su vez, a la segunda porción C-terminal del colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa.2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI), (c) hacer crecer la célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada codificada por las susodichas primera y segunda secuencias de ADN y (d) aislar la proteína de fusión trimérica secretada por la célula huésped. En un aspecto del presente invento, se da a conocer un procedimiento para producir una proteína de fusión trimérica secretada, que consiste de las siguientes fases: (a) introducir en una célula huésped eucariota un primer constructo de ADN que comprende un promotor que dirije la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste de una secuencia de péptido señal que está unida en fase a un polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual está unido en fase, a su vez, a la porción C-terminal del colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (11), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI), (b) introducir en una célula huésped eucariota un segundo constructo de ADN que comprende un promotor que impulsa la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste de una segunda secuencia de péptido señal que está unida en fase a un segundo polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual está unido en fase, a su vez, a una segunda porción C-terminal del colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa.2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI), (c) introducir en una célula huésped eucariota un tercer constructo de ADN que comprende un promotor que dirija la transcripción de un marco de lectura abierto que consiste de una tercera secuencia de péptido señal que está unida en fase a un tercer polipéptido no colágeno que se va a trimerizar, el cual está unido en fase, a su vez, a una tercera porción C-terminal del colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización y que es seleccionada de pro.alfa.1 (I), pro.alfa.2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa.2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI), (d) hacer crecer la célula hospedadora bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada codificada por las susodichas primera y segunda secuencias de ADN, y (e) aislar la proteína de fusión trimérica secretada por la célula huésped. Este invento presenta las siguientes ventajas: (1) el colágeno es la proteína más abundante secretada en el cuerpo de un mamífero y constituye cerca del 25% de las proteínas totales del cuerpo; (2) las principales formas de colágeno se producen naturalmente en forma de hélices triméricas, y sus C-propéptidos globulares son los responsables del inicio de la trimerización, (3) el C-propéptido de colágeno trimérico liberado proteolíticamente del colágeno maduro se encuentra naturalmente en niveles por debajo del microgramo/mL en la sangre de los mamíferos y no se ha demostrado que sea tóxico para el cuerpo; (4) la región de triple hélice lineal de colágeno puede estar incluida como un enlazador con una separación esperada de 2.9 A por residuo o excluida como parte de la proteína de fusión, por lo que la distancia entre la proteína que se va a trimerizar y el C-propéptido de colágeno puede ser ajustada de forma precisa para lograr una actividad biológica óptima; (5) el sitio de reconocimiento del BMP1, el cual escinde el C-propéptido del procolágeno, se puede mutar o suprimir para evitar la alteración de la proteína de fusión trimérica; (6) el dominio C-propéptido proporciona una etiqueta de afinidad universal, que se puede utilizar para la purificación de cualquiera de las proteínas de fusión secretadas creadas por el presente invento. En contraste con la tecnología Tag Fc (Sledziewski et al., 1992 y 1998 ), con la que se pueden crear proteínas de fusión diméricas secretadas, el presente invento aquí descrito permite por primera vez la creación y secreción de proteínas de fusión solubles triméricas. Teniendo en cuenta el hecho de que un homotrímero tiene simetría ternaria mientras que un homodímero tiene tan solo simetría binaria, teóricamente estas dos formas estructurales distintas nunca pueden ser perfectamente superpuestas (Fig. 1). De esta forma, ni el homodímero soluble TNF-R-Fc (como por ejemplo, Enbrel), ni las proteínas de fusión CD4-Fc solubles, podrían haber tenido una interfaz óptima para la unión a sus correspondientes ligandos homotriméricos, TNF-α y la gp120 del VIH, respectivamente. Por el contrario, el CD4 y los receptores TNF solubles homotriméricos creados por el presente invento son estructuralmente trivalentes y tienen el potencial de acoplarse perfectamente a los ligandos homotriméricos correspondientes. Es por ello que estos análogos de receptores triméricos solubles pueden ser mucho más eficaces neutralizando las actividades biológicas de sus ligandos triméricos. Con este oportuno invento se pueden diseñar fácilmente y racionalmente medicamentos más eficaces y aún por encima menos costosos, tales como el CD4 y el TNF-R soluble trimérico descritos en los ejemplos preferidos de ejecución, para combatir las enfermedades debilitantes, tales como la artritis y el SIDA. Con el presente invento se puede crear también la gp120 trimérica soluble, que puede mimetizar mejor el complejo de la proteína de cubierta gp120 trimérica nativa que se encuentra en los virus del VIH, y se utiliza así como una vacuna más eficaz en comparación con la antígenos gp120 no triméricos utilizados anteriormente. Anticuerpos quimera en forma trimérica también pueden ser creados con el presente invento, lo que le proporcionaría a un anticuerpo una mayor intensidad en la neutralización de su antígeno.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A, 1B, 1C y 1D son una representación esquemática del procedimiento de acuerdo con el presente invento en comparación con la anterior fusión de la inmunoglobulina Fc dimérica. Las figuras 1A y 1B son una vista en alzado lateral y una vista en planta desde arriba, respectivamente, de las características estructurales de una fusión Fc - receptor TNF-RII homodimérico soluble, como por ejemplo Enbrel de Amgen, ya sea en forma de ligando libre o unido tal y como se indica. Los dominios marcados con un 1 indican el TNF-RII soluble. Nótese que la proteína de fusión Fc (marcada con un 2 con enlaces disulfuro intercatenarios 3) es una estructura dimérica. Dada su simetría binaria, la proteína de fusión Fc dimérica es bivalente y por lo tanto teóricamente no tiene una conformación óptima para unirse a un ligando homotrimérico, como por ejemplo el TNF-α (marcado con un 4) que tiene una simetría ternaria. Las figuras 1C y 1D son una vista en alzado lateral y una vista en planta desde arriba, respectivamente, de las características estructurales de la fusión de un receptor sTNF-RII soluble trimérico y un C-propéptido. Dada su simetría ternaria, una proteína de fusión sTNF-RII - Trimer es trivalente en la naturaleza, por lo que puede acoplarse perfectamente a su ligando trimérico TNF-α. El C-propéptido de colágeno que es capaz de llevar a cabo la autotrimerización está etiquetado con un 5 con enlaces disulfuro intercatenarios 3. Las figuras 2A y 2B ilustran las estructuras de vectores plasmídicos pTRIMER para la creación de proteínas de fusión triméricas secretadas. Cualquier ADNc que codifica para receptores solubles o polipéptidos biológicamente activos puede ser clonado en los sitios únicos Hind III o Bgl II para permitir la unión en fase en los extremos Cterminales del colágeno α(I) que contiene la secuencia C-propéptido para la trimerización.
La figura 2A muestra que el constructo pTRIMER (T0) contiene parte de las repeticiones de glicina (GXY)n por
encima del C-propéptido.
La figura 2B muestra que el pTRIMER (T2) contiene solo el dominio C-propéptido con un sitio de reconocimiento de
la proteasa BMP-1 mutado.
Las figuras 3A y 3B ilustran la expresión y secreción de proteínas de fusión de colágeno triméricas unidas por
enlaces disulfuro.
La figura 3A muestra un Western blot de la trimerización de la fosfatasa alcalina de placenta humana (AP) cuando se
fusiona con los C-propéptidos de colágeno α(I). Los vectores de expresión que codifican ya sea para AP sola o para
las uniones de AP - C-propéptido en vectores pTRIMER fueron transitoriamente transfectados en células HEK293T.
Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio condicionado (20 mL) de cada una de las células transfectadas en la
forma indicada fue hervido durante 5 minutos en el mismo volumen de 2X tampón SDS, con o sin agente reductor
(mercaptoetanol), separado en un 10% de SDS -PAGE y analizado por Western blot utilizando un anticuerpo
policlonal para AP (GenHunter Corporation). Nótese que las AP de 67 kDa secretadas no forman por sí solas
enlaces disulfuro intermoleculares, mientras que las fusiones AP-T0 y AP-T2 secretadas son ensambladas de
manera eficiente en trímeros unidos por enlaces disulfuro.
La figura 3B muestra un Western blot de la trimerización del TNF-RII humano soluble cuando se une a los Cpropéptidos del colágeno α(I). Los vectores de expresión que codifican ya sea para la unión AP - C-propéptido (T2)
(como un control negativo para la especificidad del anticuerpo), o para uniones C-propéptido - TNF-RII solubles
humanos en la forma indicada en los vectores de pTRIMER fueron transitoriamente transfectados en células
HEK293T. Cuarenta y ocho horas más tarde, el medio acondicionado (20 mL) de cada una de las células
transfectadas y no transfectadas en la forma indicada fue hervido durante 5 minutos en un volumen igual de 2X
tampón SDS, con o sin agente reductor (mercaptoetanol), separado en un 10% de SDS-PAGE y analizado por
Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal para el TNF-RII humano (clon 226, R & D Systems, Inc.). Nótese
que el anticuerpo monoclonal solo puede reconocer el TNF-RII secretado con enlaces disulfuro. Tanto las uniones
TNF-RII - T0 como TNF-RII - T2 solubles son ensambladas de manera eficiente en trímeros unidos por enlaces
disulfuro.
Las figuras 4 y 5 ilustran los bioensayos que muestran la potente actividad neutralizante de la proteína de fusión
soluble trimérica humana TNF-RII – C-propéptido frente a la apoptosis mediada por TNF-α.
La figura 4, las células WEHI - 13VAR sensibles a TNF-α (ATCC) se resuspendieron en 1 millón de células/mL en
medio RPMI conteniendo un 10% de SFB. Una alícuota de 100 mL de la suspensión celular se sembró en cada
pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos y a cada pocillo se le añadió Actinomicina D en una
concentración de 500 ng/mL seguida por 500 pg/mL de TNF-α humano (R & D Systems) en presencia o ausencia de
TNF-RII - T2 trimérico humano soluble en la forma indicada. Como control negativo se añadió la AP-T2 trimérica en
lugar de TNF-RII - T2. Después de 16 horas de incubación en un incubador de cultivo tisular, la viabilidad de las
células se examinó por medio de un microscopio invertido con un aumento de 20X o mediante azul de Alamar
(Biosource, Inc.), que es la tinción indicadora de la viabilidad celular y que fue añadida en cada pocillo a una
concentración del 10% (v/v). Las células vivas son capaces de convertir el color de la tinción del azul al rosa. Nótese
que el TNF-RII - T2 soluble trimérico humano muestra una potente actividad neutralizante frente al TNF-α,
protegiendo a las células de la apoptosis mediada por TNF-α.
La figura 5 muestra los análisis cuantitativos de la actividad neutralizante del TNF-RII - T2 soluble trimérico humano
frente al TNF-α humano. El experimento se llevó a cabo como se muestra en la Fig. 4A. Dos horas después de
añadir el colorante azul de Alamar, el medio de cultivo de cada pocillo fue analizado a una absorbancia (OD) de 575
nm. Las lecturas fueron normalizadas con los valores de los pocillos a los que no se les había añadido TNF-α (100%
de viabilidad) o de los que tenían TNF-α pero no se les había añadido el agente neutralizante (0% de viabilidad).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS LISTAS DE SECUENCIAS
Número de ID de secuencia: 1 (963 bases)
Secuencia de nucleótidos que codifica para el C-propéptido del constructo T0 del colágeno α(I) humano. El
constructo de ADNc fue clonado en el vector pAPtag2, reemplazando a la región de codificación para AP. Las
secuencias subrayadas indican los sitios de las enzimas de restricción, utilizados en la construcción del vector
pTRIMER correspondiente. Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la región codificante T0.
Número de ID de secuencia: 2 (311 aa)
La secuencia proteica esperada para el C-propéptido T0 de colágeno α(I) humano. La secuencia subrayada indica la
región de las repeticiones de glicina "por encima" del C-propéptido. Los residuos de aminoácidos que están en rojo
indican el sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1.
Número de ID de secuencia: 3 (771 bases)
La secuencia de nucleótidos que codifica para el C-propéptido del constructo T2 de colágeno α(I) humano. El
constructo de ADNc fue clonado en un vector pAPtag2, en sustitución de la región codificante AP. Las secuencias
subrayadas indican los sitios de las enzimas de restricción, utilizados en la construcción del vector pTRIMER
correspondiente. Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la región codificante T2.
Número de ID de secuencia: 4 (247 aa)
La secuencia proteica esperada para el C-propéptido T2 de colágeno α(I) humano. El residuo de aminoácido que se
muestra en rojo indica la ubicación del sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada.
Número de ID de secuencia: 5 (2487 bases)
Secuencia de nucleótidos que codifica para la fosfatasa alcalina de la placenta humana (AP) unida al C-propéptido T0 del colágeno α(I) humano (AP-T0). Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para llevar a cabo la unión. El sitio de restricción, que marca el sitio de unión mostrado en mitad de la secuencia, es Bgl II. Número de ID de secuencia: 6 (819 aa) La secuencia proteica esperada para la proteína de fusión AP-T0. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de unión entre las fosfatasas alcalinas de placenta humana (AP) y el polipéptido T0 de colágeno α(I). Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la proteína de fusión. La secuencia subrayada indica la región de las repeticiones de glicina "por encima" del C-propéptido de colágeno α(I) humano. Los residuos de aminoácidos en rojo indican la secuencia de reconocimiento de la proteasa BMP-1. Número de ID de secuencia: 7 (2294 bases) Secuencia de nucleótidos que codifica para las fosfatasas alcalinas de placenta humana (AP) unidas al C-propéptido T2 de colágeno α(I) humano (AP-T2). Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la proteína de fusión. Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para llevar a cabo la fusión. El sitio de restricción, que marca el sitio de fusión mostrado en mitad de la secuencia, es Bgl II. Número de ID de secuencia: 8 (755 aa) La secuencia proteica esperada para la fusión AP - T2. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de fusión entre las fosfatasas alcalinas de placenta humana (AP) y el polipéptido T2 de colágeno α(I). El residuo de aminoácido en rojo indica la ubicación del sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada. Número de ID de secuencia: 9 (1734 bases) Secuencia de nucleótidos que codifica para el TNF-RII soluble humano fusionado al C-propéptido T0 de colágeno α(I) humano (sTNF-RII - T0). Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la proteína de fusión. Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para llevar a cabo la fusión. La secuencia subrayada, que marca el sitio de fusión mostrado en mitad de la secuencia, es la unión BamH I / Bgl II. Número de ID de secuencia: 10 (566 aa) Secuencia proteica esperada para la fusión humana soluble TNF-RII - T0. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de fusión entre el TNF-RII humano soluble y el polipéptido T0 de colágeno α(I). La secuencia subrayada indica la región de las repeticiones de glicina "por encima" del C-propéptido de colágeno α(I) humano. Los residuos de aminoácidos en rojo indican el sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1. Número de ID de secuencia: 11 (1.542 bases) Secuencia de nucleótidos que codifica para el TNF-RII humano soluble fusionado al C-propéptido T2 de colágeno α(I) humano (sTNF-RII - T2). Los codones en negrita indican el inicio y la terminación de la proteína de fusión. Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para la construcción de la fusión. La secuencia subrayada, que marca el sitio de fusión mostrado en mitad de la secuencia, es la unión BamH I / Bgl II. Número de ID de secuencia: 12 (502 aa) La secuencia proteica esperada de la proteína de fusión humana soluble TNF-RII - T2. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de fusión entre el TNF-RII humano soluble y el polipéptido T2 de colágeno α(I). El residuo de aminoácido que se muestra en rojo indica la ubicación del sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada. Número de ID de secuencia: 13 (2.139 bases) Secuencia de nucleótidos que codifica el CD4 humano soluble fusionado al C-propéptido T0 de colágeno α(I) humano. Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para la construcción de la fusión. La secuencia subrayada, que marca el sitio de fusión mostrado en mitad de la secuencia, es el sitio Bgl II. Número de ID de secuencia: 14 (699 aa) La secuencia proteica esperada de la fusión humana soluble CD4 - T0. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de fusión entre el polipéptido T0 de colágeno α(I) y el CD4 soluble humano. La secuencia subrayada indica la región de las repeticiones de glicina "por encima" del C-propéptido de colágeno α(I) humano. Los residuos de aminoácidos que se muestran en rojo indican el sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1. Número de ID de secuencia: 15 (1.947 bases) Secuencia de nucleótidos que codifica el CD4 humano soluble fusionado al C-propéptido T2 de colágeno α(I) humano. Las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción utilizados para la construcción de la fusión. La secuencia subrayada, que marca el sitio de fusión mostrado en mitad de la secuencia, es el sitio Bgl II. Número de ID de secuencia: 16 (635 aa) La secuencia proteica esperada de la fusión humana soluble CD4 - T2. Los residuos de aminoácidos en azul indican los sitios de fusión entre el CD4 humano soluble y el polipéptido T2 de colágeno α(I). El residuo de aminoácido en rojo indica la ubicación del sitio de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada.
DESCRIPCIÓN DEL INVENTO
Antes de presentar el invento, puede resultar útil para su comprensión presentar las definiciones de ciertos términos que se utilizarán de aquí en adelante.
Constructo de ADN: una molécula de ADN, generalmente en forma de un vector plasmídico o vírico, ya sea de una hebra doble o sencilla que ha sido modificado por medio de la tecnología de ADN recombinante para contener segmentos de ADN unidos de tal forma que en su conjunto no existirían en la naturaleza. Los constructos de ADN contienen la información necesaria para dirigir la expresión y/o secreción de la proteína codificante de interés.
Secuencia de péptido señal: tramo de una secuencia de aminoácidos que actúa dirigiendo la secreción de un polipéptido maduro o una proteína de una célula. Los péptidos señal se caracterizan por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran típicamente en los extremos amino de las proteínas recién sintetizadas que van a ser secretadas o ancladas a la superficie celular. El péptido señal se escinde a menudo de la proteína madura durante la secreción. Dichos péptidos señal contienen sitios que permiten la escisión de los péptidos señal de las proteínas maduras a medida que pasan a través de la ruta de secreción proteica. Cuando una secuencia de péptido señal está unida al extremo amino terminal de otra proteína que no tiene péptido señal puede dirigir la secreción de la proteína fusionada. La mayoría de las proteínas secretadas, como los factores de crecimiento, las hormonas peptídicas, las citoquinas y las proteínas de membrana, como por ejemplo los receptores de la superficie celular, contienen una secuencia de péptido señal cuando se sintetizan como una proteína naciente. Receptor soluble: una parte o la totalidad de un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular que es capaz de unirse a su ligando. Por lo general, no contiene ningún tramo interno de la secuencia de aminoácidos hidrófobos responsables del anclaje a la membrana. C-propéptido de colágeno: el C-terminal globular, y el dominio no triple hélice de colágeno, que es capaz de autoensamblarse en trímeros. A diferencia de lo que ocurre con la región de triple hélice de colágeno, el Cpropéptido no contiene ninguna secuencia de repetición de glicina y normalmente es eliminado proteolíticamente a partir del precursor procolágeno después de la secreción de procolágeno antes de la formación de las fibrillas de colágeno. Repeticiones de glicina: región central lineal de triple hélice formadora de colágeno que contiene cientos de repeticiones de (Gly -XY)n en la secuencia de aminoácidos. Estas repeticiones también son ricas en prolina en las posiciones X y/o Y. Tras la eliminación de los N- y C-propéptidos, las repeticiones de glicina que contienen triples hélices de colágeno pueden ensamblarse en fibrillas de colágeno insolubles de mayor orden, lo que constituye el componente principal de la matriz celular. ADNc: hebras para el ADN complementario o secuencia de ADN complementaria al ARN mensajero. Por lo general, las secuencias de ADNc no contienen ninguna secuencias de intrones (codificación no proteica).
Antes de este invento, casi todos los anticuerpos terapéuticos y las proteínas de fusión de receptor Fc soluble, tales como Enbrel, eran de estructura dimérica (Fig. 1). Aunque se ha demostrado que estas moléculas, en comparación con sus homólogos monoméricos, se unen a sus antígenos diana o ligandos con una mayor intensidad, es de esperar que todavía sean imperfectas, debido a las limitaciones estructurales, para unir las dianas que tienen una estructura homotrimérica. Entre los ejemplos de ligandos triméricos terapéuticamente importantes se encuentran la familia TNF de citoquinas y la proteína de cubierta gp120 del VIH. Por lo tanto, desde un punto de vista estructural, también es deseable que se puedan generar receptores o anticuerpos solubles triméricos que se que puedan acoplar perfectamente a sus ligandos triméricos o antígenos diana (Fig. 1), y bloquear de este modo completamente la actividad del ligando. Se espera que dichos receptores solubles o anticuerpos quiméricos triméricos tengan una afinidad más alta por sus dianas y que por lo tanto se puedan utilizar de una forma más eficaz y eficiente para el tratamiento de enfermedades como la artritis y el SIDA. Este invento describe formas para la generación de dichos receptores triméricos secretados y proteínas biológicamente activas por fusión a los C-propéptidos de colágeno, que son capaces de autoensamblarse en trímeros. El invento presenta las siguientes ventajas: (1) el colágeno es la proteína más abundante secretada en el cuerpo de un mamífero, constituyendo cerca del 25% de las proteínas totales del cuerpo; (2) las principales formas de colágeno se producen de forma natural como hélices triméricas, con sus C-propéptidos globulares como responsables del inicio de la trimerización, los cuales se escinden posteriormente mediante proteolisis tras la formación de la triple hélice; (3) el C-propéptido trimérico soluble escindido de colágeno se encuentra de forma natural en niveles inferiores a un microgramo/mL en la sangre de los mamíferos; (4) la región de triple hélice lineal de colágeno puede ser incluida como un enlazador o excluida como parte de la proteína de fusión de tal modo que la distancia entre una proteína que va a ser trimerizada y el C-propéptido de colágeno se puede ajustar de forma precisa para lograr una actividad biológica óptima; (5) el sitio de reconocimiento de BMP1 que escinde el Cpropéptido del pro-colágeno se puede mutar o suprimir para evitar la alteración de una proteína de fusión trimérica;
(6) el dominio C-propéptido proporciona un marcador de afinidad universal, que puede ser utilizado para la purificación de cualquiera de las proteínas de fusión secretadas creadas por este invento; (7) a diferencia del marcador Fc IgG1 que es conocido por tener otras funciones biológicas, tales como la unión a sus propios receptores de superficie celular, la única función biológica del C-propéptido de colágeno es la capacidad de iniciar la trimerización de cadenas nacientes de procolágeno y mantener el trímero recién hecho de pro-colágeno soluble antes del ensamblaje en la matriz celular insoluble. Por estas propiedades únicas del C-propéptido de colágeno es de esperar que sea poco probable que esta etiqueta única de trimerización sea tóxica o inmunogénica, por lo que es un candidato ideal para aplicaciones terapéuticas. Para demostrar la viabilidad de la fabricación de proteínas de fusión trimérica secretadas, las secuencias de ADNc que codifican todos los C-propéptidos de colágeno α1(I) humano que contienen alguna región de triple hélice con repeticiones de glicina (constructo T0, números de ID de secuencia 1-2 ), o bien sin repeticiones de glicina con un sitio de reconocimiento de BMP-1 mutado (constructo T2, número de ID de Secuencia 3-4), fueron amplificadas por RT-PCR usando los clones EST obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC). Los ADNc amplificados se clonaron cada uno como un fragmento XbaI - Bgl II en el vector de expresión de mamíferos pAPtag2 (GenHunter Corporation; Leder et al., 1996 y 1998), en sustitución de la región de codificación AP (Fig. 2). Los vectores resultantes se denominan pTRIMER, versiones T2 y T0 respectivamente. Los vectores permiten la conveniente fusión en fase de cualquier matriz de ADNc que codifica un receptor soluble o una proteína biológicamente activa en los sitios Hind III y Bgl II únicos. Dichas proteínas de fusión tienen las etiquetas de trimerización de colágeno situadas en los extremos C-terminales, de forma similar a los procolágenos nativos.
Ejemplo 1:
Para demostrar la viabilidad de este invento, un ADNc que codifica la fosfatasa alcalina de placenta humana secretada (AP), incluyendo su secuencia nativa de péptido señal, fue cortada como un fragmento Bgl II – Hind III del vector de pAPtag4 (GenHunter Corporation; Leder et al., 1996 y 1998) y se clonó en los sitios correspondientes de los vectores pTRIMER - T0 y pTRIMER - T2. Los constructos de fusión AP - colágeno resultantes (número de ID de secuencia 5-8) se expresaron en células HEK293T (GenHunter Corporation) después de la transfección. El éxito de la secreción de las proteínas de fusión AP - colágeno puede ser determinada fácilmente mediante un ensayo de actividad AP utilizando un medio acondicionado de las células transfectadas. La actividad AP alcanzó aproximadamente 1 unidad/mL (o el equivalente a aproximadamente 1 mg/mL de la proteína de fusión) 2 días después de la transfección. Para obtener células HEK293T que expresan de forma estable las proteínas de fusión, se seleccionaron clones estables después de la co-transfección con un vector resistente a puromicina pBabe - Puro (GenHunter Corporation). Los clones que expresan actividad AP se ampliaron y se guardaron para la producción a largo plazo de las proteínas de fusión. Para determinar si las proteínas de fusión AP - colágeno están ensambladas en trímeros unidos por enlaces disulfuro, los medios acondicionados que contienen las AP solas o bien las fusiones AP - T0 y AP - T2 son hervidos en tampones de SDS que contienen β - mercaptoetanol (reductor) o no (no reductor), separados por medio de SDS-PAGE y analizados por Western blot utilizando un anticuerpo de policlonación anti-AP (GenHunter Corporation). Las AP solas, sin fusión, mostraron una banda de 67 kDa, tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras, lo que, tal y como era de esperar, es consistente con la falta de enlaces disulfuro intermoleculares (Fig. 3A). Por el contrario, tanto la proteína de fusión secretada AP - T0 como la AP - T2 mostraron un tamaño tres veces mayor (alrededor de 300 kDa) en condiciones no reductoras que en condiciones reductoras (90-100 kDa), lo que indica que las dos proteínas de fusión fueron completamente ensambladas en homotrímeros (Fig. 3A). Este resultado reduce esencialmente el concepto de este invento en la práctica.
Ejemplo 2:
Para proporcionar una prueba de que se pueden proporcionar funciones biológicas nuevas y terapéuticamente beneficiosas a una proteína de fusión trimérica, se construyó un receptor de TNF-RII trimérico soluble humano (p75) por medio del correspondiente clon EST obtenido de la ATCC. Como se ha descrito en el ejemplo 1, la región N terminal del TNF-RII humano, incluyendo toda la región de unión al ligando pero excluyendo el dominio transmembrana, fue clonado en fase, como un fragmento Bam HI, en el sitio Bgl II tanto del vector pTRIMER - T0 como del vector pTRIMER - T2 (número de ID de secuencia 9-12). Los constructos de fusión resultantes se expresaron en células HEK293T después de la transfección. Los clones estables fueron obtenidos por coselección con puromicina tal y como ha sido descrito en el ejemplo 1. Se llevó a cabo un análisis por Western blot tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras para determinar si las resultantes proteínas de fusión solubles TNF-RII - colágeno fueron en efecto expresadas, secretadas y ensambladas en formas triméricas. Como era de esperar, el anticuerpo monoclonal del TNF-RII humano (clon 226 de R&D Systems, Inc.) reconoció de forma precisa las proteínas de fusión - TNF triméricas solubles expresadas por los dos vectores de fusión T0 y T2 como bandas de 220-240 kDa, que son alrededor tres veces más grande que las correspondientes proteínas de fusión monoméricas (Fig. 3B). El anticuerpo TNF-RII no pudo detectar las proteínas de fusión monoméricas en condiciones reductoras, en consonancia con la propiedad especificada por el fabricante del anticuerpo. Como un control negativo para la especificidad del anticuerpo, ni las células HEK293T solas, ni las células que expresaban la proteína de fusión AP -T2 expresaron el TNF-RII (Fig. 3B). Para determinar si los receptores triméricos solubles de TNF-RII son inhibidores potentes de su ligando trimérico TNF-α, se llevó a cabo un bioensayo de TNF-α usando la línea celular sensible a la citoquina WEHI - 13VAR (ATCC) tal y como ha sido descrito por Mohler et al. (1993). El resultado mostrado en la Fig. 4 indica claramente que las proteínas de fusión solubles triméricas de TNF-RII - C-propéptido son altamente potentes neutralizando la apoptosis mediada por TNF-α de las células WEHI - 13VAR en presencia de actinomicina D (500 ng/mL) (Sigma). Cuando el TNF-α humano (R&D Systems) fue utilizado a una concentración de 0,5 ng/mL, el TNF-RII - T2 trimérico soluble (ya sea de medio libre de suero o en su forma purificada) presentó una Ki-50 aparente (50% de inhibición) de aproximadamente 2 ng/mL o 8 x 10 -12 M (asumiendo un Pm de 240 kDa para un homotrímero). Esta afinidad al TNF-α es de un orden de magnitud 4 veces mayor que la del monómero de TNF-RII y al menos de 10 a 100 veces mayor que la de la fusión dimérica soluble de TNF-RII - Fc, como es el caso de Enbrel (Mohler et al., 1993). En este ejemplo fundamental demuestra que este invento puede crear proteínas de fusión triméricas con nuevas propiedades biológicas que pueden tener importantes aplicaciones terapéuticas. Este tipo de receptores triméricos solubles de TNF humanos pueden llegar a ser mucho más eficaces que el receptor TNF dimérico soluble (por ejemplo, Enbrel) que se encuentra actualmente en el mercado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la AR. El el drástico aumento de la potencia de los receptores de TNF triméricos podría reducir en gran medida la cantidad de inhibidores del TNF que se le tienen que inyectar semanalmente a cada paciente, al mismo tiempo que mejora el tratamiento y rebaja significativamente el coste que supone dicho tratamiento a los pacientes.
La mejora en la potencia de los receptores de TNF triméricas también puede aliviar el cuello de botella en la producción actual del receptor de TNF dimérico, ya que actualmente solo es posible satisfacer las demandas en el tratamiento de alrededor de 100.000 pacientes en los Estados Unidos.
Ejemplo 3.
El virus del VIH, causante del sida, infecta y destruye en nuestro cuerpo todo un linaje especial de linfocitos T. Estos linfocitos conocidos como células T CD4+ expresan una proteína de la superficie celular CD4 doblada, que es el receptor del VIH. El VIH reconoce a las células CD4+ con su proteína de cubierta viral gp120, la cual se une a la CD4. En particular, la gp120 existe como un complejo homotrimérico gigante en la superficie viral, mientras que las CD4 son monoméricas en la superficie celular. El modelo actual para la infección por VIH es el de un acoplamiento completo del VIH a las células T CD4+, en el cual es necesaria la unión de cada una de las tres subunidades de los trímeros de gp120 a la CD4 para que el ARN viral entre en las células. Obviamente, una de las estrategias más directas para detener la infección por VIH es el uso de CD4 soluble para neutralizar el virus. En efecto, tal enfoque utilizando tanto las fusiones de CD4 - Fc como las CD4 solubles monoméricas ha demostrado ser muy eficaz en la reducción de infecciones por el VIH en cepas aisladas de laboratorio (Clapham et al., 1989; Daar et al., 1990). Desafortunadamente, estas CD4 solubles fueron menos eficaces en la detención de la infección de cepas virales de VIH que se encuentran en pacientes con SIDA (Daar et al., 1990), posiblemente debido a las variaciones de la secuencia de amino ácidos de la gp120, lo que disminuye la afinidad para las CD4 monoméricas y diméricas solubles. Para aumentar de manera significativa la afinidad de una CD4 soluble a cualquiera de las variantes de gp120 en los virus VIH, es preferible que la CD4 soluble esté en forma trimérica para que se pueda acoplar perfectamente a su ligando trimérico, los homotrímeros gp120. Uno de los principales retos en la lucha contra el SIDA ha sido la alta tasa de mutación del genoma viral, que lleva a una mayor resistencia a los medicamentos. Es por ello que cualquier fármaco que afecte directamente a genes virales del tipo de la transcriptasa inversa del VIH (por ejemplo, AZT) o la proteasa, son probablemente ineficaces debido a la alta tasa de mutaciones virales. Por el contrario, e independientemente de cuál sea la tasa de mutación, el virus del VIH tiene que unirse a un receptor celular CD4 para iniciar la infección. Por lo tanto, un trímero de CD4 soluble de alta afinidad debería de ser inmune a las mutaciones virales ya que dichas mutaciones en los genes gp120 harán que el virus sea incapaz de unirse no solo a un CD4 trimérico soluble sino también al receptor CD4 de las células. Para crear estos análogos triméricos solubles del receptor CD4 del VIH, se amplificó un ADNc que codifica la totalidad de los CD4 solubles humanos, incluyendo su secuencia nativa de péptido señal pero excluyendo los dominios citoplásmicos cortos y de transmembrana, utilizando un clon EST obtenido de la ATCC. A continuación, el ADNc resultante se clonó como un fragmento Bgl II - Hind III en los sitios correspondientes de los vectores de expresión pTRIMER - T0 y pTRIMER -T2. Los constructos de fusión resultantes de colágeno - CD4 solubles (número de ID de secuencia 13-16) se expresaron en células HEK293T (GenHunter Corporation) después de la transfección. Para obtener células HEK293T que expresaran de forma estable las proteínas de fusión, se seleccionaron clones estables después de la cotransfección con un vector resistente a la puromicina, pBabe - Puro (GenHunter Corporation). Los clones que expresan las proteínas de fusión se multiplicaron y guardaron para obtener posteriormente las proteínas de fusión. Para determinar si las proteínas de fusión colágeno humano - CD4 solubles se ensamblan en trímeros unidos por enlaces disulfuro, los medios acondicionados que contienen las fusiones de CD4 - T0 y CD4 - T2 solubles se llevaron a ebullición en un tampón de SDS sin (no reductor) o con β-mercaptoetanol (reductor), se separaron por medio de una SDS-PAGE y se analizaron por Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal para CD4 humano (R & D Systems). Los resultados mostraron que las dos proteínas de fusión solubles secretadas CD4 - T0 y CD4 - T2 eran tres veces más grandes (alrededor de 300 kDa) en condiciones no reductoras que aquellas en condiciones reductoras (90-100 kDa), lo que indica que fueron ensambladas completamente en homotrímeros (datos no mostrados). Ahora bien, estos CD4 soluble triméricos pueden ser fácilmente probados para la unión con la gp120 y la infección anti-VIH.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GENHUNTER CORPORATION
<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA PRODUCIR ANÁLOGOS DE RECEPTORES TRIMÉRICOS SECRETADOS Y PROTEÍNAS DE FUSIÓN BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS
<130> 04-066-PL
<150> 10/677,877
<160> 16
<210> 1
<211> 963
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220> <221>CDS <222>12 947 <400> 1
Hind III BglII AAGCTTACGTAAGATCTAACGGTCTCCCTGGCCCCATTGGGCCCCCTGGTCCT CGCGGTCGCACTGGTGATGCTGGTCCTGTTGGTCCCCCCGGCCCTCCTGGACC TCCTGGTCCCCCTGGTCCTCCCAGCGCTGGTTTCGACTTCAGCTTCCTGCCCC AGCCACCTCAAGAGAAGGCTCACGATGGTGGCCGCTACTACCGGGCTGATGAT GCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACCCTCAAGAGCCT GAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCCCG CCCGCACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAG TACTGGATTGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTG CAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCC AGAAGAACTGGTACATCAGCAAGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTC GGCGAGAGCATGACCGATGGATTCCAGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGA CCCTGCCGATGTGGCCATCCAGCTGACCTTCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGG CCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCGTGGCCTACATGGACCAG CAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCTCAAGGGCTCCAACGAGATCGA GATCCGCGCCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTACAGCGTCACTGTCGATGGCT GCACGAGTCACACCGGAGCCTGGGGCAAGACAGTGATTGAATACAAAACCACC AAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGATGTGGCCCCCTTGGACGTTGGTGCCCC AGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCCT CCATCTAGA
Xba I
<210>2 <211>311
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 2
1 RSNGLPGPIG PPGPRGRTGD AGPVGPPGPP GPPGPPGPPS AGFDFSFLPQ PPQEKAHDGG 60 61 RYYRADDANV VRDRDLEVDT TLKSLSQQIE NIRSPEGSRK NPARTCRDLK MCHSDWKSGE 120 121 YWIDPNQGCN LDAIKVFCNM ETGETCVYPT QPSVAQKNWY ISKNPKDKRH VWFGESMTDG 180 181 FQFEYGGQGS DPADVAIQLT FLRLMSTEAS QNITYHCKNS VAYMDQQTGN LKKALLLKGS 240 241 NEIEIRAEGN SRFTYSVTVD GCTSHTGAWG KTVIEYKTTK SSRLPIIDVA PLDVGAPDQE 300 301 FGFDVGPVCF L
<210>3 3 <211>711
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 12 755
<400> 3
Hind III BglII AAGCTTACGTAAGATCTGATGCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACC CTCAAGAGCCTGAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCC CGCCCGCACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAGTACTGGA TTGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTGCAACATGGAGACTGGT GAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCCAGAAGAACTGGTACATCAGCAAGAA CCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCGAGAGCATGACCGATGGATTCCAGTTCGAGT ATGGCGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCGATGTGGCCATCCAGCTGACCTTCCTGCGCCTGATG TCCACCGAGGCCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCGTGGCCTACATGGACCA GCAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCTCAAGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCGCG CCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTACAGCGTCACTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGA GCCTGGGGCAAGACAGTGATTGAATACAAAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGA TGTGGCCCCCTTGGACGTTGGTGCCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCT GCTTCCTGTAAACTCCCTCCATCTAGA
Xba I
<210>4
<211> 247
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 4
1 RSDANVVRDR DLEVDTTLKS LSQQIENIRS PEGSRKNPAR TCRDLKMCHS DWKSGEYWID 60 61 PNQGCNLDAI KVFCNMETGE TCVYPTQPSV AQKNWYISKN PKDKRHVWFG ESMTDGFQFE 120 121 YGGQGSDPAD VAIQLTFLRL MSTEASQNIT YHCKNSVAYM DQQTGNLKKA LLLKGSNEIE 180 181 IRAEGNSRFT YSVTVDGCTS HTGAWGKTVI EYKTTKSSRL PIIDVAPLDV GAPDQEFGFD 240 241 VGPVCFL
<210> 5
<211> 2487
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 12 2471
<400> 5
Hind III AAGCTTCCTGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCTCCC TGGGCATCATCCCAGTTGAGGAGGAGAACCCGGACTTCTGGAACCGCGAGGCAGCCG AGGCCCTGGGTGCCGCCAAGAAGCTGCAGCCTGCACAGACAGCCGCCAAGAACCTCA TCATCTTCCTGGGCGATGGGATGGGGGTGTCTACGGTGACAGCTGCCAGGATCCTAA AAGGGCAGAAGAAGGACAAACTGGGGCCTGAGATACCCCTGGCCATGGACCGCTTCC CATATGTGGCTCTGTCCAAGACATACAATGTAGACAAACATGTGCCAGACAGTGGAG CCACAGCCACGGCCTACCTGTGCGGGGTCAAGGGCAACTTCCAGACCATTGGCTTGA GTGCAGCCGCCCGCTTTAACCAGTGCAACACGACACGCGGCAACGAGGTCATCTCCG TGATGAATCGGGCCAAGAAAGCAGGGAAGTCAGTGGGAGTGGTAACCACCACACGAG TGCAGCACGCCTCGCCAGCCGGCACCTACGCCCACACGGTGAACCGCAACTGGTACT CGGACGCCGACGTGCCTGCCTCGGCCCGCCAGGAGGGGTGCCAGGACATCGCTACGC AGCTCATCTCCAACATGGACATTGACGTGATCCTAGGTGGAGGCCGAAAGTACATGT TTCCCATGGGAACCCCAGACCCTGAGTACCCAGATGACTACAGCCAAGGTGGGACCA GGCTGGACGGGAAGAATCTGGTGCAGGAATGGCTGGCGAAGCGCCAGGGTGCCCGGT ATGTGTGGAACCGCACTGAGCTCATGCAGGCTTCCCTGGACCCGTCTGTGACCCATC TCATGGGTCTCTTTGAGCCTGGAGACATGAAATACGAGATCCACCGAGACTCCACAC TGGACCCCTCCCTGATGGAGATGACAGAGGCTGCCCTGCGCCTGCTGAGCAGGAACC CCCGCGGCTTCTTCCTCTTCGTGGAGGGTGGTCGCATCGACCATGGTCATCATGAAA GCAGGGCTTACCGGGCACTGACTGAGACGATCATGTTCGACGACGCCATTGAGAGGG CGGGCCAGCTCACCAGCGAGGAGGACACGCTGAGCCTCGTCACTGCCGACCACTCCC ACGTCTTCTCCTTCGGAGGCTACCCCCTGCGAGGGAGCTCCATCTTCGGGCTGGCCC CTGGCAAGGCCCGGGACAGGAAGGCCTACACGGTCCTCCTATACGGAAACGGTCCAG GCTATGTGCTCAAGGACGGCGCCCGGCCGGATGTTACCGAGAGCGAGAGCGGGAGCC CCGAGTATCGGCAGCAGTCAGCAGTGCCCCTGGACGAAGAGACCCACGCAGGCGAGG ACGTGGCGGTGTTCGCGCGCGGCCCGCAGGCGCACCTGGTTCACGGCGTGCAGGAGC AGACCTTCATAGCGCACGTCATGGCCTTCGCCGCCTGCCTGGAGCCCTACACCGCCT GCGACCTGGCGCCCCCCGCCGGCACCACCGACGCCGCGCACCCGGGTTCCGGAAGAT CTAACGGTCTCCCTGGCCCCATTGGGCCCCCTGGTCCTCGCGGTCGCACTGGTGATG CTGGTCCTGTTGGTCCCCCCGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTCCCCCTGGICCTCCCA GCGCTGGTTTCGACTTCAGCTTCCTGCCCCAGCCACCTCAAGAGAAGGCTCACGATG GTGGCCGCTACTACCGGGCTGATGATGCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGG TGGACACCACCCTCAAGAGCCTGAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGG GAAGCCGCAAGAACCCCGCCCGCACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACT GGAAGAGTGGAGAGTACTGGATTGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCA AAGTCTTCTGCAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTG TGGCCCAGAAGAACTGGTACATCAGCAAGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGT TCGGCGAGAGCATGACCGATGGATTCCAGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGACC CTGCCGATGTGGCCATCCAGCTGACCTTCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGGCCTCCC AGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCGTGGCCTACATGGACCAGCAGACTGGCA ACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCTGAAGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCGCGCCGAGG GCAACAGCCGCTTCACCTACAGCGTCACTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGAG CCTGGGGCAAGACAGTGATTGAATACAAAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCA TCGATGTGGCCCCCTTGGACGTTGGTGCCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTG GCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCCTCCATCTAGA
Xba I <210>6 <211>819
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 6
1 MLLLLLLLGL RLQLSLGIIP VEEENPDFWN REAAEALGAA KKLQPAQTAA KNLHFLGDG 60 61 MGVSTVTAAR ILKGQKKDKL GPEIPLAMDR FPYVALSKTY NVDKHVPDSG ATATAYLCGV 120 121 KGNFQTIGLS AAARFNQCNT TRGNEVISVM NRAKKAGKSV GVVTTTRVQH ASPAGTYAHT 180 181 VNRNWYSDAD VPASARQEGC QDIATQLISN MDIDVILGGG RKYMFPMGTP DPEYPDDYSQ 240 241 GGTRLDGKNL VQEWLAKRQG ARYVWNRTEL MQASLDPSVT HLMGLFEPGD MKYEIHRDST 300 301 LDPSLMEMTE AALRLLSRNP RGFFLFVEGG RIDHGHHESR AYRALTETIM FDDAIERAGQ 360 361 LTSEEDTLSL VTADHSHVFS FGGYPLRGSS IFGLAPGKAR DRKAYTVLLY GNGPGYVLKD 420 421 GARPDVTESE SGSPEYRQQS AVPLDEETHA GEDVAVFARG PQAHLVHGVQ EQTFIAHVMA 480 481 FAACLEPYTA CDLAPPAGTT DAAHPGSGRS NGLPGPIGPP GPRGRTGDAG PVGPPGPPGP 540 541 PGPPGPPSAG FDFSFLPQPP QEKAHDGGRY YRADDANVVR DRDLEVDTTL KSLSQQIENI 600 601 RSPEGSRKNP ARTCRDLKMC HSDWKSGEYW IDPNQGCNLD AIKVFCNMET GETCVYPTQP 660 661 SVAQKNWYIS KNPKDKRHVW FGESMTDGFQ FEYGGQGSDP ADVAIQLTFL RLMSTEASQN 720 721 ITYHCKNSVA YMDQQTGNLK KALLLKGSNE IEIRAEGNSR FTYSVTVDGC TSHTGAWGKT 780 781 VIEYKTTKSS RLPIIDVAPL DVGAPDQEFG FDVGPVCFL
<210> 7
<211> 2294
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 12 2278
<400> 7
Hind III AAGCTTCCTGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCTCCC TGGGCATCATCCCAGTTGAGGAGGAGAACCCGGACTTCTGGAACCGCGAGGCAGCCG AGGCCCTGGGTGCCGCCAAGAAGCTGCAGCCTGCACAGACAGCCGCCAAGAACCTCA TCATCTTCCTGGGCGATGGGATGGGGGTGTCTACGGTGACAGCTGCCAGGATCCTAA AAGGGCAGAAGAAGGACAAACTGGGGCCTGAGATACCCCTGGCCATGGACCGCTTCC CATATGTGGCTCTGTCCAAGACATACAATGTAGACAAACATGTGCCAGACAGTGGAG CCACAGCCACGGCCTACCTGTGCGGGGTCAAGGGCAACTTCCAGACCATTGGCTTGA GTGCAGCCGCCCGCTTTAACCAGTGCAACACGACACGCGGCAACGAGGTCATCTCCG TGATGAATCGGGCCAAGAAAGCAGGGAAGTCAGTGGGAGTGGTAACCACCACACGAG TGCAGCACGCCTCGCCAGCCGGCACCTACGCCCACACGGTGAACCGCAACTGGTACT CGGACGCCGACGTGCCTGCCTCGGCCCGCCAGGAGGGGTGCCAGGACATCGCTACGC AGCTCATCTCCAACATGGACATTGACGTGATCCTAGGTGGAGGCCGAAAGTACATGT TTCCCATGGGAACCCCAGACCCTGAGTACCCAGATGACTACAGCCAAGGTGGGACCA GGCTGGACGGGAAGAATCTGGTGCAGGAATGGCTGGCGAAGCGCCAGGGTGCCCGGT ATGTGTGGAACCGCACTGAGCTCATGCAGGCTTCCCTGGACCCGTCTGTGACCCATC TCATGGGTCTCTTTGAGCCTGGAGACATGAAATACGAGATCCACCGAGACTCCACAC TGGACCCCTCCCTGATGGAGATGACAGAGGCTGCCCTGCGCCTGCTGAGCAGGAACC CCCGCGGCTTCTTCCTCTTCGTGGAGGGTGGTCGCATCGACCATGGTCATCATGAAA GCAGGGCTTACCGGGCACTGACTGAGACGATCATGTTCGACGACGCCATTGAGAGGG CGGGCCAGCTCACCAGCGAGGAGGACACGCTGAGCCTCGTCACTGCCGACCACTCCC ACGTCTTCTCCTTCGGAGGCTACCCCCTGCGAGGGAGCTCCATCTTCGGGCTGGCCC CTGGCAAGGCCCGGGACAGGAAGGCCTACACGGTCCTCCTATACGGAAACGGTCCAG GCTATGTGCTCAAGGACGGCGCCCGGCCGGATGTTACCGAGAGCGAGAGCGGGAGCC CCGAGTATCGGCAGCAGTCAGCAGTGCCCCTGGACGAAGAGACCCACGCAGGCGAGG ACGTGGCGGTGTTCGCGCGCGGCCCGCAGGCGCACCTGGTTCACGGCGTGCAGGAGC AGACCTTCATAGCGCACGTCATGGCCTTCGCCGCCTGCCTGGAGCCCTACACCGCCT GCGACCTGGCGCCCCCCGCCGGCACCACCGACGCCGCGCACCCGGGTTCCGGAGATC TGATGCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACCCTCAAGAGCCT GAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCCCGCCCG CACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAGTACTGGAT TGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTGCAACATGGAGAC TGGTGAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCCAGAAGAACTGGTACAT CAGCAAGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCGAGAGCATGACCGATGG ATTCCAGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCGATGTGGCCATCCAGCT GACCTTCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGGCCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAA GAACAGCGTGGCCTACATGGACCAGCAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCT CAAGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCGCGCCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTACAG CGTCACTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGAGCCTGGGGCAAGACAGTGATTGA ATACAAAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGATGTGGCCCCCTTGGACGT TGGTGCCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAAC TCCCTCCATCTAGA
XbaI
<210> 8
<211> 755
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 8
1 MLLLLLLLGL RLQLSLGIIP VEEENPDFWN REAAEALGAA KKLQPAQTAA KNLIIFLGDG 60 61 MGVSTVTAAR ILKGQKKDKL GPEIPLAMDR FPYVALSKTY NVDKHVPDSG ATATAYLCGV 120 121 KGNFQTIGLS AAARFNQCNT TRGNEVISVM NRAKKAGKSV GVVTTTRVQH ASPAGTYAHT 180 181 VNRNWYSDAD VPASARQEGC QDIATQLISN MDIDVILGGG RKYMIFPMGTP DPEYPDDYSQ 240 241 GGTRLDGKNL VQBWLAKRQG ARYVWNRTEL MQASLDPSVT HLMGLFEPGD MKYEIHRDST 300 301 LDPSLMEMTE AALRLLSRNP RGFFLFVEGG RIDHGHHESR AYRALTETIM FDDAIERAGQ 360 361 LTSEEDTLSL VTADHSHVFS FGGYPLRGSS IFGLAPGKAR DRKAYTVLLY GNGPGYVLKD 420 421 GARPDVTESE SGSPEYRQQS AVPLDEETHA GEDVAVFARG PQAHLVHGVQ EQTFIAHVMA 480 481 FAACLEPYTA CDLAPPAGTT DAAHPGSGRS DANVVRDRDL EVDTTLKSLS QQIENIRSPE 540 541 GSRKNPARTC RDLKMCHSDW KSGEYWIDPN QGCNLDAIKV FCNMETGETC VYPTQPSVAQ 600 601 KNWYISKNPK DKRHVWFGES MTDGFQFEYG GQGSDPADVA IQLTFLRLMS TEASQNITYH 660 661 CKNSVAYMDQ QTGNLKKALL LKGSNEIEIR AEGNSRFTYS VTVDGCTSHT GAWGKTVIEY 720 721 KTTKSSRLPI IDVAPLDVGA PDQEFGFDVG PVCFL
<210> 9
<211> 1734
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 18 1718
<400> 9
Bam HI GGATCCCGCCCGCACCCATGGCGCCCGTCGCCGTCTGGGCCGCGCTGGCCGTCGGACTGGAG CTCTGGGCTGCGGCGCACGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACACCCTACGCCCCGGAGCC CGGGAGCACATGCCGGCTCAGAGAATACTATGACCAGACAGCTCAGATGTGCTGCAGCAAAT GCTCGCCGGGCCAACATGCAAAAGTCTTCTGTACCAAGACCTCGGACACCGTGTGTGACTCC TGTGAGGACAGCACATACACCCAGCTCTGGAACTGGGTTCCCGAGTGCTTGAGCTGTGGCTC CCGCTGTAGCTCTGACCAGGTGGAAACTCAAGCCTGCACTCGGGAACAGAACCGCATCTGCA CCTGCAGGCCCGGCTGGTACTGCGCGCTGAGCAAGCAGGAGGGGTGCCGGCTGTGCGCGCCG CTGCGCAAGTGCCGCCCGGGCTTCGGCGTGGCCAGACCAGGAACTGAAACATCAGACGTGGT GTGCAAGCCCTGTGCCCCGGGGACGTTCTCCAACACGACTTCATCCACGGATATTTGCAGGC CCCACCAGATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGCAGTCTGCACG TCCACGTCCCCCACCCGGAGTATGGCCCCAGGGGCAGTACACTTACCCCAGCCAGTGTCCAC ACGATCCCAACACACGCAGCCAACTCCAGAACCCAGCACTGCTCCAAGCACCTCCTTCCTGC TCCCAATGGGCCCCAGCCCCCCAGCTGAAGGGAGCACTGGATCTAACGGTCTCCCTGGCCC CATTGGGCCCCCTGGTCCTCGCGGTCGCACTGGTGATGCTGGTCCTGTTGGTCCCCC CGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTCCCCCTGGTCCTCCCAGCGCTGGTTTCGACTTCAG CTTCCTGCCCCAGCCACCTCAAGAGAAGGCTCACGATGGTGGCCGCTACTACCGGGC TGATGATGCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACCCTCAAGAG CCTGAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCCCGC CCGCACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAGTACTG GATTGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTGCAACATGGA GACTGGTGAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCCAGAAGAACTGGTA CATCAGCAAGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCGAGAGCATGACCGA TGGATTCCAGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCGATGTGGCCATCCA GCTGACCTTCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGGCCTCCCAGAACATCACCTACCACTG CAAGAACAGCGTGGCCTACATGGACCAGCAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCT CCTCAAGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCGCGCCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTA CAGCGTCACTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGAGCCTGGGGCAAGACAGTGAT TGAATACAAAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGATGTGGCCCCCTTGGA CGTTGGTGCCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCTGCTTCCTGTA AACTCCCTCCATCTAGA
Xba I
<210> 10
<211> 566
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 10
1 MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG 60 61 QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC 120 121 RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR 180 181 PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS 240 241 FLLPMGPSPP AEGSTGSNGL PGPIGPPGPR GRTGDAGPVG PPGPPGPPGP PGPPSAGFDF 300 301 SFLPQPPQEK AHDGGRYYRA DDANVVRDRD LEVDTTLKSL SQQIENIRSP EGSRKNPART 360 361 CRDLKMCHSD WKSGEYWIDP NQGCNLDAIK VFCNMETGET CVYPTQPSVA QKNWYISKNP 420 421 KDKRHVWFGE SMTDGFQFEY GGQGSDPADV AIQLTFLRLM STEASQNITY HCKNSVAYMD 480 481 QQTGNLKKAL LLKGSNEIEI RAEGNSRFTY SVTVDGCTSH TGAWGKTVIE YKTTKSSRLP 540 541 IIDVAPLDVG APDQEFGFDV GPVCFL
<210>11
<211> 1542
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 18 1526
<400> 11
Bam HI GGATCCCGCCCGCACCCATGGCGCCCGTCGCCGTCTGGGCCGCGCTGGCCGTCGGACTGGAG CTCTGGGCTGCGGCGCACGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATTTACACCCTACGCCCCGGAGCC CGGGAGCACATGCCGGCTCAGAGAATACTATGACCAGACAGCTCAGATGTGCTGCAGCAAAT GCTCGCCGGGCCAACATGCAAAAGTCTTCTGTACCAAGACCTCGGACACCGTGTGTGACTCC TGTGAGGACAGCACATACACCCAGCTCTGGAACTGGGTTCCCGAGTGCTTGAGCTGTGGCTC CCGCTGTAGCTCTGACCAGGTGGAAACTCAAGCCTGCACTCGGGAACAGAACCGCATCTGCA CCTGCAGGCCCGGCTGGTACTGCGCGCTGAGCAAGCAGGAGGGGTGCCGGCTGTGCGCGCCG CTGCGCAAGTGCCGCCCGGGCTTCGGCGTGGCCAGACCAGGAACTGAAACATCAGACGTGGT GTGCAAGCCCTGTGCCCCGGGGACGTTCTCCAACACGACTTCATCCACGGATATTTGCAGGC CCCACCAGATCTGTAACGTGGTGGCCATCCCTGGGAATGCAAGCATGGATGCAGTCTGCACG TCCACGTCCCCCACCCGGAGTATGGCCCCAGGGGCAGTACACTTACCCCAGCCAGTGTCCAC ACGATCCCAACACACGCAGCCAACTCCAGAACCCAGCACTGCTCCAAGCACCTCCTTCCTGC TCCCAATGGGCCCCAGCCCCCCAGCTGAAGGGAGCACTGGATCTGATGCCAATGTGGTTCG TGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACCCTCAAGAGCCTGAGCCAGCAGATCGAGAA CATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCCCGCCCGCACCTGCCGTGACCTCAA GATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAGTACTGGATTGACCCCAACCAAGGCTG CAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTGCAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTA CCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCCAGAAGAACTGGTACATCAGCAAGAACCCCAAGGA CAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCGAGAGCATGACCGATGGATTCCAGTTCGAGTATGG CGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCGATGTGGCCATCCAGCTGACCTTCCTGCGCCTGAT GTCCACCGAGGCCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACAGCGTGGCCTACAT GGACCAGCAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCTCAAGGGCTCCAACGAGAT CGAGATCCGCGCCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTACAGCGTCACTGTCGATGGCTG CACGAGTCACACCGGAGCCTGGGGCAAGACAGTGATTGAATACAAAACCACCAAGTC CTCCCGCCTGCCCATCATCGATGTGGCCCCCTTGGACGTTGGTGCCCCAGACCAGGA ATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCCTCCATCTAGA
Xba I
<210> 12
<211> 502
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 12
1 MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG 60 61 QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC 120 121 RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR 180 181 PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS 240 241 FLLPMGPSPP AEGSTGSDAN VVRDRDLEVD TTLKSLSQQI ENIRSPEGSR KNPARTCRDL 300 301 KMCHSDWKSG EYWIDPNQGC NLDAIKVFCN METGETCVYP TQPSVAQKNW YISKNPKDKR 360 361 HVWFGBSMTD GFQFEYOGQG SDPADVAIQL TFLRLMSTEA SQNITYHCKN SVAYMDQQTG 420 421 NLKKALLLKG SNEIEIRAEG NSRFTYSVTV DGCTSHTGAW GKTVIEYKTT KSSRLPIIDV 480 481 APLDVGAPDQ EFGFDVGPVC FL
<210> 13 <211>2139
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 24 2123
<400> 13
Hind III AAGCTTCCCTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTC TGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGG GCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATAC AATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCT TAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGG ACCAAGGAAACTTTCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTT ACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGA CTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGA GCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGA CATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGC TAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGT TCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGT GGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACA AGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGC TCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACC TCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGG TGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCT CCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGC GGGAGAAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGA GTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCAGATCTAACG GTCTCCCTGGCCCCATTGGGCCCCCTGGTCCTCGCGGTCGCACTGGTGATGCTGGTC CTGTTGGTCCCCCCGGCCCTCCTGGACCTCCTGGTCCCCCTGGTCCTCCCAGCGCTG GTTTCGACTTCAGCTTCCTGCCCCAGCCACCTCAAGAGAAGGCTCACGATGGTGGCC GCTACTACCGGGCTGATGATGCCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACA CCACCCTCAAGAGCCTGAGCCAGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCC GCAAGAACCCCGCCCGCACCTGCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGA GTGGAGAGTACTGGATTGACCCCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCT TCTGCAACATGGAGACTGGTGAGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCC AGAAGAACTGGTACATCAGCAAGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCG AGAGCATGACCGATGGATTCCAGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCG ATGTGGCCATCCAGCTGACCTTCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGGCCTCCCAGAACA TCACCTACCACTGCAAGAACAGCGTGGCCTACATGGACCAGCAGACTGGCAACCTCA AGAAGGCCCTGCTCCTCAAGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCGCGCCGAGGGCAACA GCCGCTTCACCTACAGCGTCACTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGAGCCTGGG GCAAGACAGTGATTGAATACAAAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGATG TGGCCCCCTTGGACGTTGGTGCCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTG TCTGCTTCCTGTAAACTCCCTCCATCTAGA
Xba I <210> 14
<211> 699
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
<400> 14
1 MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK 60 61 ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL 120 121 LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLBSPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG 180 181 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW 240 241 QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA 300 301 LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV 360 361 LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPRS NGLPGPIGPP GPRGRTGDAG PVGPPGPPGP 420 421 PGPPGPPSAG FDFSFLPQPP QEKAHDGGRY YRADDANVVR DRDLEVDTTL KSLSQQIENI 480 481 RSPEGSRKNP ARTCRDLKMC HSDWKSGEYW IDPNQGCNLD AIKVFCNMET GETCVYPTQP 540 541 SVAQKNWYIS KNPKDKRHVW FGESMTDGFQ FEYGGQGSDP ADVAIQLTFL RLMSTEASQN 600 601 ITYHCKNSVA YMDQQTGNLK KALLLKGSNE IEIRAEGNSR FTYSVTVDGC TSHTGAWGKT 660 661 VIEYKTTKSS RLPIIDVAPL DVGAPDQEFG FDVGPVCFL
<210> 15
<211> 1947
<212> ADNc
<213> HOMO SAPIENS
<220>
<221> CDS
<222> 24 1931
<400> 15
Hind III AAGCTTCCCTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTC TGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGG GCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATAC AATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCT TAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGCTGACTCAAGAAGAAGCCTTTGGG ACCAAGGAAACTTTCCCCTGATCATCAAGAATCTTAAGATAGAAGACTCAGATACTT ACATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCGGATTGA CTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGA GCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTAAAAACATAC AGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGA CATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGC TAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGT TCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGT GGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACA AGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGC TCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACC TCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGG TGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCT CCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGC GGGAGAAGGCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGA GTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCAGATCTGATG CCAATGTGGTTCGTGACCGTGACCTCGAGGTGGACACCACCCTCAAGAGCCTGAGCC AGCAGATCGAGAACATCCGGAGCCCAGAGGGAAGCCGCAAGAACCCCGCCCGCACCT GCCGTGACCTCAAGATGTGCCACTCTGACTGGAAGAGTGGAGAGTACTGGATTGACC CCAACCAAGGCTGCAACCTGGATGCCATCAAAGTCTTCTGCAACATGGAGACTGGTG AGACCTGCGTGTACCCCACTCAGCCCAGTGTGGCCCAGAAGAACTGGTACATCAGCA AGAACCCCAAGGACAAGAGGCATGTCTGGTTCGGCGAGAGCATGACCGATGGATTCC AGTTCGAGTATGGCGGCCAGGGCTCCGACCCTGCCGATGTGGCCATCCAGCTGACCT TCCTGCGCCTGATGTCCACCGAGGCCTCCCAGAACATCACCTACCACTGCAAGAACA GCGTGGCCTACATGGACCAGCAGACTGGCAACCTCAAGAAGGCCCTGCTCCTCAAGG GCTCCAACGAGATCGAGATCCGCGCCGAGGGCAACAGCCGCTTCACCTACAGCGTCA CTGTCGATGGCTGCACGAGTCACACCGGAGCCTGGGGCAAGACAGTGATTGAATACA AAACCACCAAGTCCTCCCGCCTGCCCATCATCGATGTGGCCCCCTTGGACGTTGGTG CCCCAGACCAGGAATTCGGCTTCGACGTTGGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACTCCCT CCATCTAGA Xba I <210> 16
<211> 635
<212> PROTEÍNA
<213> HOMO SAPIENS
5 <400> 16
1 MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK 60 61 ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL 120 121 LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG 180 10 181 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW 240 241 QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA 300 301 LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV 360 361 LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPRS DANVVRDRDL EVDTTLKSLS QQIENIRSPE 420 421 GSRKNPARTC RDLKMCHSDW KSGEYWIDPN QGCNLDAIKV FCNMETGETC VYPTQPSVAQ 480 15 481 KNWYISKNPK DKRHVWFGES MTDGFQFEYG GQGSDPADVA IQLTFLRLMS TEASQNITYH 540 541 CKNSVAYMDQ QTGNLKKALL LKGSNEIEIR AEGNSRFTYS VTVDGCTSHT GAWGKTVIEY 600 601 KTTKSSRLPI IDVAPLDVGA PDQEFGFDVG PVCFL
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento para generar una proteína de fusión trimérica secretada, que implica:
- (a)
- crear un constructo de ADN (AND recombinado) que incluya un promotor de transcripción ligado a una matriz que codifique una secuencia de péptido señal seguido de una unión en fase en un polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado, el cual es un polipéptido biológicamente activo o un receptor soluble que consiste de un/unos dominio/s de unión al ligando, y que a su vez está unido en fase a una porción C-terminal de procolágeno que es capaz de autotrimerizarse en una forma soluble con enlaces intermoleculares disulfuro unidos fuertemente de forma covalente;
- (b)
- introducir dicho constructo de ADN en una célula eucariota;
- (c)
- cultivar dicha célula huésped bajo condiciones fisiológicas en un medio de crecimiento adecuado para permitir la secreción de una proteína de fusión trimerizada soluble codificada por dicha secuencia de ADN; y
- (d)
- aislar dicha proteína de fusión trimerizada del medio de cultivo de dicha célula huésped.
-
- 2.
- Procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que la proteína de fusión polipeptídica trimerizada es un homotrímero soluble.
-
- 3.
- Procedimiento conforme a la reivindicación 1 en el que el residuo de polipéptido trimerizado comprende la porción C-terminal de colágeno que es capaz de auto-ensamblarse en un trímero soluble seleccionado de un grupo que consiste de pro.alfa.1 (I), pro.alfa 2 (I), pro.alfa.1 (II), pro.alfa.1 (III), pro.alfa.1 (V), pro.alfa2 (V), pro.alfa.1 (XI), pro.alfa.2 (XI) y pro.alfa.3 (XI).
-
- 4.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la secuencia de péptido señal y el polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado proceden de la misma proteína secretada nativa.
-
- 5.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 4, en el cual tanto la secuencia de péptido señal como el polipéptido no colágeno que va a ser trimerizado se seleccionan a partir de dos proteínas secretadas distintas.
-
- 6.
- Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el cual la célula eucariota huésped es una célula procedente de hongos o de insectos.
-
- 7.
- Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el cual la célula eucariota huésped es una línea celular de mamíferos cultivada.
-
- 8.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la porción C-terminal del procolágeno incluye una región de colágeno de triple hélice de "glicina - repetida" unida al C-propéptido.
-
- 9.
- Procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el cual la porción C-terminal de procolágeno está identificada con los números de ID de secuencia 1-2.
-
- 10.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la porción C-terminal de trimerización de procolágeno comprende únicamente un C-propéptido sin una región de colágeno de triple hélice de "glicina repetida".
-
- 11.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 8 a 10, en el cual la porción C-terminal de trimerización del procolágeno comprende una secuencia de reconocimiento de la proteasa BMP-1 mutada o suprimida, confiriendo de este modo a las proteínas de fusión triméricas resistencia a la degradación por las proteasas BMP -1.
-
- 12.
- Procedimiento conforme a las reivindicaciones 10 a 11, en el cual la porción C-terminal de trimerización de procolágeno está identificada por los números de ID de secuencia 3-4.
-
- 13.
- Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo el receptor soluble trimérico humano TNF-α II (p75) identificado por los números de ID de secuencia 9-12.
-
- 14.
- Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo los CD4 triméricos humanos solubles identificados por los números de ID de secuencia 13-16.
-
- 15.
- Composiciones de proteínas de fusión secretadas generadas por los procedimientos de las reivindicaciones 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11 y 12, siendo la fosfatasa alcalina de placenta humana trimérica soluble identificada por los números de ID de secuencia 5-8.
-
- 16.
- Receptor soluble TNF-α II trimerizado que comprende tres cadenas polipeptídicas, incluyendo cada una de dichas cadenas polipeptídicas un dominio de unión al ligando del receptor, unido a un C-propéptido de colágeno, en cuyo caso la trimerización de la fusión polipeptídica resulta en la mejora de la actividad biológica hacia TNF-α.
-
- 17.
- Producto o composición para ser usada en un tratamiento médico mediante el bloqueo de la actividad biológica del TNF-α usando un receptor soluble TNF-α II trimerizado generado conforme a la reivindicación 13.
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓNLa lista de referencias citada por el solicitante lo es solamente para utilidad del lector, no formando parte de los documentos de patente europeos. Aún cuando las referencias han sido cuidadosamente recopiladas, no pueden 5 excluirse errores u omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad a este respecto.Documentos de patente citado en la descripción- •
- EP 0985732 A2 [0009] • US 10677877 B [0038]
- •
- WO 02090553 A2 [0010]
Bibliografía de patentes citada en la descripción- •
- MOHLER et al. J Immunol., 1993, vol. 151 (3), • KISHORE et al. J. Immunol, 2001, vol. 166, 1548-61 [0008] 559-565 [0012]
- •
- HAYASHI et al. Biochim Biophys Acta, 2001, • HOLLER et al. J Immunol Methods, 2000, vol. vol. 1528, 187-95 [0011] 237 (1-2), 159-73 [0013]
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US677877 | 1984-12-04 | ||
US10/677,877 US7268116B2 (en) | 2003-10-02 | 2003-10-02 | Methods and compositions for producing secreted trimeric receptor analogs and biologically active fusion proteins |
PCT/US2004/032753 WO2005047850A2 (en) | 2003-10-02 | 2004-10-04 | Methods and compositions for producing secreted trimeric receptor analogs and biologically active fusion proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2433127T3 true ES2433127T3 (es) | 2013-12-09 |
Family
ID=34590628
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES04809864T Active ES2433127T3 (es) | 2003-10-02 | 2004-10-04 | Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7268116B2 (es) |
EP (1) | EP1671097B1 (es) |
JP (1) | JP5077924B2 (es) |
CN (1) | CN101146818B (es) |
ES (1) | ES2433127T3 (es) |
WO (1) | WO2005047850A2 (es) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7393924B2 (en) * | 2004-01-06 | 2008-07-01 | Franco Vitaliano | Smart bio-nanoparticle elements |
US10183986B2 (en) * | 2005-12-15 | 2019-01-22 | Industrial Technology Research Institute | Trimeric collagen scaffold antibodies |
WO2010033249A2 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions of and methods using ligand dimers |
WO2010071938A1 (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel collagen constructs |
US11235062B2 (en) * | 2009-03-06 | 2022-02-01 | Metaqor Llc | Dynamic bio-nanoparticle elements |
US11096901B2 (en) | 2009-03-06 | 2021-08-24 | Metaqor Llc | Dynamic bio-nanoparticle platforms |
CN103641896B (zh) * | 2009-11-19 | 2015-08-05 | 浙江大学 | 明胶样单元的用途 |
BR112012013330A2 (pt) * | 2009-12-02 | 2017-03-28 | Acceleron Pharma Inc | composições e métodos para aumentar meia vida do soro de proteínas de fusão fc |
WO2011119836A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for cardioprotection and cardioregeneration |
CA2800595C (en) | 2010-05-26 | 2018-04-24 | Shriners Hospitals For Children | Compositions comprising the nc2 domain of collagen ix and methods of using same |
EP2718328A4 (en) | 2011-06-08 | 2014-12-24 | Acceleron Pharma Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING THE HALF TIME OF SERUM |
CN104955480A (zh) | 2013-01-25 | 2015-09-30 | 西蒙有限公司 | 用于选择性减少循环的生物活性可溶性tnf的组合物以及用于治疗tnf介导的疾病的方法 |
MA41460A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Oncomed Pharm Inc | Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations |
GB201510758D0 (en) | 2015-06-18 | 2015-08-05 | Ucb Biopharma Sprl | Novel TNFa structure for use in therapy |
GB201621907D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Ucb Biopharma Sprl And Sanofi | Antibody epitope |
US11377490B2 (en) | 2017-05-31 | 2022-07-05 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc | Method for treating cancer using disulfide-linked trimeric 4-1BBL |
US10618949B2 (en) | 2017-05-31 | 2020-04-14 | Peng Liang | Method and compositions for producing disulfide-linked trimeric TNF family of cytokines and their use |
CN109418230A (zh) * | 2017-08-25 | 2019-03-05 | 香港大学深圳医院 | 一种骶髂关节炎小鼠模型 |
WO2021249013A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Vaccine compositions, methods, and uses thereof |
WO2021249010A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Coronavirus diagnostic compositions, methods, and uses thereof |
WO2021249116A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof |
WO2021249012A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Coronavirus vaccine compositions, methods, and uses thereof |
WO2021249011A1 (en) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. | Hiv vaccine compositions, methods, and uses thereof |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5605690A (en) * | 1989-09-05 | 1997-02-25 | Immunex Corporation | Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor |
GB9409768D0 (en) * | 1994-05-16 | 1994-07-06 | Medical Res Council | Trimerising polypeptides |
DE69628576T2 (de) * | 1995-08-31 | 2004-04-22 | The Victoria University Of Manchester | Procollagene |
BR9611547A (pt) * | 1995-11-13 | 1999-06-15 | Fibrogen Inc | Proteína de fusão processos para produzir proteína de fusão humana recombinante e colágeno tipo ix humano recombinante |
FR2757874B1 (fr) * | 1996-12-17 | 2003-04-25 | Biocem | Collagenes recombinants et proteines derivees produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
JP2000125872A (ja) * | 1998-09-07 | 2000-05-09 | Terumo Corp | 三量体キメラタンパク質およびキメラタンパク質を含有するコラーゲンマトリックス |
DE10122140A1 (de) * | 2001-05-08 | 2002-11-28 | Apotech Res & Dev Ltd | Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere |
WO2003012121A2 (en) * | 2001-07-31 | 2003-02-13 | The General Hospital Corporation | Collagen xxii, a novel human collagen and uses thereof |
JP2006504391A (ja) * | 2001-10-17 | 2006-02-09 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 分泌されたタンパク質ztnf9 |
-
2003
- 2003-10-02 US US10/677,877 patent/US7268116B2/en active Active
-
2004
- 2004-10-04 ES ES04809864T patent/ES2433127T3/es active Active
- 2004-10-04 EP EP04809864.4A patent/EP1671097B1/en active Active
- 2004-10-04 WO PCT/US2004/032753 patent/WO2005047850A2/en active Application Filing
- 2004-10-04 CN CN2004800287468A patent/CN101146818B/zh active Active
- 2004-10-04 JP JP2006534253A patent/JP5077924B2/ja active Active
-
2006
- 2006-12-21 US US11/643,568 patent/US7666837B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-12-21 US US11/643,285 patent/US7691815B2/en active Active - Reinstated
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101146818B (zh) | 2012-05-30 |
WO2005047850A2 (en) | 2005-05-26 |
US20070087413A1 (en) | 2007-04-19 |
EP1671097B1 (en) | 2013-08-14 |
CN101146818A (zh) | 2008-03-19 |
EP1671097A4 (en) | 2010-04-21 |
US20050202537A1 (en) | 2005-09-15 |
JP2007519611A (ja) | 2007-07-19 |
JP5077924B2 (ja) | 2012-11-21 |
WO2005047850A3 (en) | 2007-12-06 |
US7691815B2 (en) | 2010-04-06 |
US20070117755A1 (en) | 2007-05-24 |
US7268116B2 (en) | 2007-09-11 |
US7666837B2 (en) | 2010-02-23 |
EP1671097A2 (en) | 2006-06-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2433127T3 (es) | Procedimientos y composiciones para producir análogos de receptores triméricos secretados y proteínas de fusión biológicamente activas | |
ES2236710T3 (es) | Nueva citoquina denominada lerk-5. | |
RU2240328C2 (ru) | Гомодимерный слитый белок, имеющий активность ингибитора ангиогенеза (варианты), молекула днк, кодирующая гомодимерный слитый белок, вектор для экспрессии гомодимерного слитого белка, способ трансфекции клетки млекопитающего и способ получения гомодимерного слитого белка | |
CN110461871A (zh) | 白蛋白结合结构域融合蛋白 | |
US20090131317A1 (en) | Compounds and peptides that bind the trail receptor | |
JP4435304B2 (ja) | アポトーシスを誘導するサイトカイン | |
ES2240981T3 (es) | Citocina denominada lerk-7. | |
ES2327409T3 (es) | Proteinas de fusion fc mejoradas. | |
ES2302845T3 (es) | Factor de crecimiento dimerizado y materiales y metodos para producirlo. | |
ES2287950T3 (es) | Proteina receptora designada 2f1. | |
SK287037B6 (sk) | Modifikovaný peptidový produkt a jeho použitie, DNA, expresný vektor, hostiteľská bunka, farmaceutická kompozícia a spôsob prípravy farmakologicky aktívnej zlúčeniny | |
ES2384350T3 (es) | Anticuerpo anti-osteopontina humana humanizado | |
US20090093407A1 (en) | Matrix-targeted fusion polypeptides for tissue regeneration and wound healing | |
EP3679068A2 (en) | CONDITIONALLY ACTIVATED BINDING MOIETIES CONTAINING Fc REGIONS | |
CA2210644A1 (en) | Ligands for eph-like receptors | |
CA2407956A1 (en) | Modified peptides as therapeutic agents | |
WO2008051505A2 (en) | Protease resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage | |
CN102007145A (zh) | 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂 | |
ES2287773T3 (es) | Composiciones y metodos relacionados con fragmentos solubles multimericos y oligomericos del receptor tweak. | |
JP2000504586A (ja) | ヘテロ二量体を形成するハイブリッドタンパク質 | |
WO2017021528A1 (en) | Heteromers comprising antibody domain fusion proteins | |
CN101914161B (zh) | 抑制肿瘤生长的融合蛋白HGFα-Fc及其用途 | |
KR20220046008A (ko) | 새롭게 설계된 공동국지화 의존적 단백질 스위치를 사용한 초고특이적 세포 표적화 | |
CN105399832A (zh) | 一种无标签单链型人源双特异性抗体及其用途 | |
CN117750970A (zh) | 包含nkg2d、cxcr2和dap10/dap12融合多肽的组合物及其使用方法 |