ES2418362T3 - Método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta, que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta.

Description

Método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia al estrés en plantas. Más específicamente, 5 el método de la presente invención es para mejorar la resistencia a la sequía y la tolerancia a la sal.

Antecedentes de la invención

Las plantas responden a estímulos ambientales alterando en parte su perfil de expresión génica, lo que conduce finalmente a diversas respuestas adaptativas a niveles celular y de planta completa (Bray, 1993; Thomashow, 1999; Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 1997; Ingram y Bartel, 1996). Un importante regulador de las respuestas de las 10 plantas a ambientes de estrés abiótico es la fitohormona ácido abscísico (ABA; del inglés, abscisic acid). El ABA está implicado en las respuestas de las plantas a estreses abióticos tales como baja temperatura, sequía y salinidad, así como en la regulación del crecimiento y el desarrollo de las plantas, incluyendo la embriogénesis, la inactividad de las semillas, el crecimiento de brotes y raíces y la transpiración de las hojas (Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000). La evidencia de un papel del ABA en la regulación génica sensible al 15 estrés en las plantas ha sido doble. En primer lugar, bajo condiciones de estrés por frío, sequía o sal, las plantas acumulan una cantidad aumentada de ABA, ejerciendo el estrés por sequía el efecto más prominente sobre la acumulación de ABA. En segundo lugar, el ABA exógeno induce la expresión de muchos genes sensibles al estrés, y su capacidad de inducción por estrés está disminuida en plantas mutantes defectuosas en cuanto a la biosíntesis de ABA o a la sensibilidad al ABA. 20

Un análisis genético basado en el efecto inhibitorio del ABA sobre la germinación de semillas ha permitido producir mutantes con una biosíntesis reducida de ABA o una sensibilidad alterada al ABA (Koornneef et al., 1998; McCourt, 1999; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000). El primer grupo de mutantes en Arabidopsis incluye aba1, aba2 y aba3. El gen ABA1 codifica una zeaxantina epoxidasa que actúa en una etapa precoz de la biosíntesis de ABA convirtiendo zeaxantina en violaxantina. Hasta ahora no se ha comunicado la clonación molecular de ABA2 ni ABA3. 25 Los fenotipos comunes de estos mutantes aba incluyen pérdida de la inactividad de las semillas, resistencia de la germinación al estrés por NaCl, y marchitamiento cuando son transferidos de condiciones de humedad elevada a condiciones de humedad baja. La utilización de mutantes deficientes en ABA junto con mutantes sensibles a ABA en estudios de regulación génica por estrés condujo a la idea de que la expresión génica sensible al estrés en las plantas está mediada por vías tanto dependientes de ABA como independientes de ABA (Shinozaki y Yamaguchi-30 Shinozaki, 1977; Leung y Giraudat, 1998; Rock, 2000; Thomashow, 1999. Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a las diferencias entre la regulación génica dependiente de ABA y la independiente de ABA no están claros, el análisis de los promotores de genes sensibles al estrés y el aislamiento de factores de transcripción que activan estos genes respaldan el hecho de que hay distintos mecanismos regulatorios para las diferentes vías. En estos promotores, el complejo ABRE [elemento sensible a ABA (del inglés, ABA-responsive element)] media en la 35 inducción génica por ABA (Guiltinan et al., 1990; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994; Shen y Ho, 1995; Vasil et al., 1995), mientras que el DRE/CRT (elemento sensible a la deshidratación) media en la sensibilidad al estrés osmótico y por frío independientemente de ABA (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994; Stockinger et al., 1997). A pesar de estas diferencias en la activación transcripcional, el análisis genético ha indicado que las vías dependientes de ABA y las independientes de ABA presentan vastas interacciones o interferencias en cuanto al control de la 40 expresión génica bajo estreses abióticos (Ishitani et al., 1997; Xiong et al., 1999a).

Como bien se aprecia en este campo técnico, aún existe la necesidad de métodos para mejorar la resistencia de las plantas a la sequía.

Sumario de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos y composiciones para aumentar la tolerancia al estrés 45 en las plantas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar plantas y células vegetales que tengan una resistencia aumentada al estrés.

Los objetos de la presente invención pueden ser llevados a cabo con un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta, que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno 50 sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta. Preferiblemente, la cofactor de molibdeno sulfurasa es codificado por un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.

La presente invención ha sido llevada a cabo usando un planteamiento de gen informador para disecar genéticamente la transducción de señales de ABA y el estrés en Arabidopsis. Se construyeron plantas bioluminiscentes sensibles a ABA y al estrés introduciendo el gen informador de luciferasa de luciérnaga bajo el 55

control del promotor RD29A (que contiene tanto elementos ABRE como DRE/CRT; Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994) en Arabidopsis. Se sometieron las plantas RD29A-LUC a mutagénesis y se aislaron mutantes con una bioluminiscencia anormal en respuesta al frío, la sequía, la sal o el ABA (Ishitani et al., 1997). Un grupo de mutantes presenta respuestas de luminiscencia reducidas al estrés por NaCl. Aquí presentamos la caracterización y clonación de dos mutantes alélicos de este grupo. Estos dos mutantes, denominados los5-1 y los5-2 (baja expresión 5 de genes osmóticamente sensibles), muestran una expresión reducida de genes sensibles al estrés bajo condiciones de estrés tanto osmótico como por frío. Aunque el papel de LOS5 en la regulación por estrés osmótico de la expresión génica es mediado por ABA, la regulación de la sensibilidad al frío por LOS5 no depende de ABA. La función de LOS5 en la expresión de genes sensibles al estrés osmótico y por frío es independiente de los factores de transcripción CBF/DREB1 y DREB2A. Las plantas mutantes los5 son más susceptibles al daño por estreses por 10 congelación, sal y sequía, lo que sugiere que LOS5 es crítico para la tolerancia de las plantas al estrés. Las plantas mutantes también muestran una pérdida aumentada de agua de transpiración y acumulan menos ABA en respuesta al estrés por sequía. Pruebas alélicas muestran que los5 es alélico con respecto a la mutación aba3. La clonación de LOS5/ABA3 basada en mapas revela que codifica una supuesta cofactor de molibdeno [MoCo (del inglés, molybdenum cofactor)] sulfurasa que cataliza la sulfuración de la forma desulfo de MoCo, lo que es consistente con 15 hallazgos previos relativos a que la alteración en aba3 está en la introducción de S en MoCo (Schwartz et al., 1997a). El MoCo sulfurilado es un cofactor de la ABA-aldehído oxidasa que actúa en la última etapa de la biosíntesis de ABA. La expresión del gen LOS5/ABA3 es suprarregulada por ABA y estreses por sal y sequía. Estos datos proporcionan importantes conocimientos sobre la biosíntesis de ABA y promueven significativamente la comprensión de la regulación génica por estrés y la tolerancia al estrés. 20

Se obtendrá fácilmente una apreciación más completa de la invención y de muchas de las ventajas concomitantes de la misma conforme la invención llegue a ser mejor conocida por referencia a las Figuras siguientes junto con la posterior descripción detallada.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: Fenotipos de luminiscencia de plantas mutantes los5. 25

(A) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) en una placa de agar.

(B) Luminiscencia de (A) después de un tratamiento a baja temperatura, a 0 °C, durante 48 horas.

(C) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) en una placa de agar.

(D) Luminiscencia después de un tratamiento con ABA 100 µM durante 4 horas.

(E) Morfología de plantones los5-1 (derecha) y de tipo silvestre (izquierda) sobre papel de filtro saturado con NaCl 30 300 mM.

(F) Luminiscencia de (E) después de 5 horas de tratamiento con NaCl 300 mM.

(G) Cuantificación de las intensidades de luminiscencia de plantas los5-1 y de tipo silvestre en respuesta a tratamientos con frío (0 °C durante 48 horas), ABA (100 µM durante 4 horas) o NaCl (300 mM durante 5 horas), como se muestra en las Figuras 1B, 1D y 1F. También se muestra las de plantas no tratadas (testigo). 35

(H) Curva de dosis de temperatura baja-respuesta. Los tratamientos a -5 °C o -10 °C duraron 3 horas, y fueron seguidos de incubación a temperatura ambiental durante 2 horas. Los tratamientos a otras temperaturas duraron 48 horas antes de la obtención de imágenes.

(I) Curva de dosis de NaCl-respuesta. El tiempo de tratamiento fue 3 horas.

La escala cromática situada a la derecha muestra la intensidad de luminiscencia desde el azul oscuro (la menor) 40 al blanco (la mayor). Los datos de (G) a (I) representan valores medios y errores estándares (n = 20). Símbolos blancos: tipo silvestre; símbolos negros: los5-1.

Figura 2: Niveles de transcritos de genes sensibles al estrés en plantas los5-1 y de tipo silvestre. Los plantones no se trataron (testigo, C) o se trataron con baja temperatura (Frío, 0 °C durante 24 horas), ABA 100 µM durante 2 horas, NaCl 300 mM durante 3 horas, o PEG al 30% durante 5 horas. Se usó actina como un testigo de carga. WT 45 (del inglés, wild type): tipo silvestre.

Figura 3: Sensibilidad de plantas los5-1 a la congelación.

(A) Plantas antes del tratamiento por congelación.

(B) Plantas después del tratamiento por congelación (-7 °C durante 5 horas). La fotografía se tomó 7 días después del tratamiento por congelación. 50

Figura 4: Acumulación de prolina y sensibilidad al estrés osmótico de plantas mutantes los5-1.

(A) Acumulación de prolina en plantas los5-1 y de tipo silvestre que no fueron tratadas (testigo) o fueron tratadas con NaCl 150 mM o fueron tratadas con ABA 50 µM. Los datos representan valores medios y errores estándares (n = 3).

(B) Sensibilidad a la sequía, según se mide por pérdida de electrolitos, en plantas los5-1 y de tipo silvestre tratadas con PEG al 30%. Los datos representan valores medios y errores estándares (n = 4). 5

(C) Las plantas los5-1 son más sensibles al estrés por NaCl. Se transfirieron plantones los5-1, los6/aba1 y de tipo silvestre, de una semana de edad, de medio de agar nutriente MS a una placa de agar MS sin NaCl (NaCl 0 mM) o con NaCl 100 mM. Adviértase que las hojas de los mutantes los5-1 se decoloraron a causa del estrés por NaCl. Las fotografías se tomaron 3 semanas después de que se transfirieran los plantones a las placas de tratamiento.

Figura 5: Morfología de hojas y fenotipos marchitos de plantas mutantes los5-1. 10

(A) Plantas de tipo silvestre en suelo.

(B) Plantas mutantes los5-1 en suelo.

(C) Las plantas en roseta los5-1 y de tipo silvestre están turgentes inmediatamente después de la segregación radicular.

(D) Las plantas los5-1 están marchitas 10 minutos después de la segregación radicular. La flecha apunta a una 15 hoja marchita de los5-1.

(E) Morfología de la inflorescencia de tipo silvestre (izquierda) y de los5-1 10 minutos después de ser pasadas de una humedad relativa del 90% a una humedad relativa de ~30%. Adviértase que las plantas los5-1 están marchitas.

(F) Pérdida acumulativa de agua de transpiración en brotes de los5-1 y del tipo silvestre segregados, con o sin 20 tratamiento con ABA 100 µM. Los datos son valores medios y errores estándares (n = 4).

Figura 6: Regulación por estrés por frío o sal, de la expresión de RD29A-LUC en plantones de tipo silvestre, los5-1 y los6/aba1, según resulta afectada por ABA exógeno.

(A) La sensibilidad al estrés por sal en mutantes los5-1 y los6-1 se recupera mediante la aplicación de ABA.

(B) La sensibilidad al frío en el mutante los5-1 no se recupera mediante la aplicación de ABA. 25

Los datos son valores medios y errores estándares (n = 20). Frío: 0 °C durante 48 horas; ABA: 100 µM durante 4 horas; y Na: NaCl 300 mM durante 4 horas.

Figura 7: Clonación posicional de LOS5 y organización del gen LOS5 y el producto del gen LOS5.

(A): Se mapeó LOS5 en el brazo superior del cromosoma I y se situó en el clon BAC F19K19.

(B) Estructura del gen LOS5 y posición de mutaciones los5/aba3. Las posiciones son relativas al codón de 30 iniciación de la traducción. Los rectángulos rellenos indican el marco de lectura abierto, y las líneas entre rectángulos indican intrones.

(C) Estructura global de la proteína LOS5.

Figura 8: Secuencia de la secuencia de cDNA que codifica la proteína LOS5.

Figura 9: Alineación secuencial de LOS5 y sus compuestos homólogos de otros organismos. Los restos en fondo 35 negro indican identidad y el fondo gris indica similitud. Las líneas de puntos indican huecos que se introdujeron para maximizar la alineación. El supuesto motivo ligante de fosfato de piridoxal está subrayado con línea continua y el motivo de cisteína conservado está subrayado con línea discontinua. El resto de lisina crítico conservado del dominio PLP se indica con un asterisco, y el resto de cisteína conservado se indica con un cuadrado. También se muestran las posiciones de mutaciones los5/aba3 (los círculos rellenos indican un codón de parada introducido). Los 40 números de acceso de secuencias para LOS5/ABA3 y sus compuestos homólogos son los siguientes: LOS5/ABA3, AY034895; ser humano, BAA91354; mosca de la fruta (proteína Mal de Drosophila melanogaster), AAF50901; ganado vacuno (MCSU de Bos taurus), BAA98133; y Aspergillus (HxB de Aspergillus nidulans), AAF22564.

Figura 10: Expresión del gen LOS5/ABA3 y regulación génica por estrés en mutantes deficientes en ABA o insensibles al ABA. 45

(A) Expresión de LOS5 en diferentes partes de plantas.

(B) Suprarregulación de la expresión de LOS5 por sequía en plantones de tipo silvestre.

(C) Expresión de LOS5 bajo diferentes tratamientos por estrés en plantas de tipo silvestre y los5-1.

(D) Expresión de LOS5 y otros genes sensibles al estrés seleccionados, en plantas los5-1, aba1-1 y abi1-1.

(E) Expresión de CBF2 y DREB2A en mutantes deficientes en ABA.

Testigo, sin tratamiento; frío, 4 °C durante 12 horas; ABA, ABA 100 µM durante 4 horas; NaCl, NaCl 300 mM durante 5 horas; PEG, PEG al 30% durante 5 horas. Se muestran tubulina y actina como testigos de carga. 5

Figura 11: Reacción catalizada por LOS5/ABA3

La forma desulfo/dioxio del cofactor de molibdeno (MoCo) (izquierda) ha de ser sulfurilada en uno de los dos grupos oxio terminales por la cofactor de molibdeno sulfurasa LOS5/ABA3 para generar la forma sulfuro del MoCo (derecha). La forma sulfuro del MoCo es un cofactor de la aldehído oxidasa (AO) y la xantina deshidrogenasa (XDH), mientras que la forma dioxio del MoCo es el cofactor para la nitrato reductasa (NR) y la sulfito oxidasa (SOX). La AO 10 cataliza la última etapa de la biosíntesis de ABA. El dador de azufre inmediato podría ser un resto de cisteína, procedente de LOS5/ABA3 u otras fuentes. La estructura de la pterina y su esquema de numeración son de acuerdo con Rajagoplant (1991).

Figura 12: Índice reducido de pérdida de agua de hojas de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan el gen LOS5. Se segregaron hojas de plantones cultivados en suelo, en fase de roseta, y se colocaron bajo condiciones 15 ambientales bajo luz. Las fotos se tomaron en el momento indicado después de la segregación.

Descripción detallada de la invención

Descripción de las realizaciones preferidas

Como se describe con detalle en los Ejemplos posteriores, la sobreexpresión de la cofactor de molibdeno sulfurasa descrita en esta memoria proporciona a las plantas una resistencia mejorada a la sequía. También se espera que 20 dichas plantas sean más resistentes al estrés por sal y el estrés por congelación. Esto es así porque la tolerancia a la sequía está íntimamente relacionada con la tolerancia a la sal y a la congelación, especialmente con respecto a ABA. Los mutantes los5 con pérdida de función son más sensibles al estrés por sal o congelación, lo que también sugiere que es probable que las plantas con sobreexpresión sean más tolerantes a los estreses por sal y congelación. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, la expresión "aumentar la tolerancia al estrés en 25 las plantas" se refiere a uno, o a cualquier combinación, de los puntos siguientes: tolerancia aumentada a la sequía, resistencia aumentada a la sal (es decir, la salinidad del suelo) y tolerancia aumentada a la congelación. Como apreciarán fácilmente quienes tienen experiencia en la técnica, la tolerancia aumentada al estrés en las plantas que sobreexpresan la cofactor de molibdeno sulfurasa se refiere a las plantas correspondientes que no sobreexpresan esta enzima. 30

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en esta memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por quien tiene una experiencia normal en el campo de la biología molecular. Aunque en la práctica o el ensayo de la presente invención se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, en esta memoria se describen métodos y materiales adecuados. 35

Se hace referencia a libros de texto estándares de biología molecular que contienen definiciones y métodos y medios para llevar a cabo técnicas básicas, abarcados por la presente invención. Véanse, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989); Methods in Plant Molecular Biology, redactado por Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995); 40 Arabidopsis, redactado por Meyerowitz et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1994) y las diversas referencias en ellos citadas.

El término "planta" incluye plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales y progenie de las mismas. La clase de plantas que se puede utilizar en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores sensibles a técnicas de transformación, 45 incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las plantas preferidas incluyen arroz, maíz, trigo, algodón, cacahuete y soja.

De este modo, en una realización de la presente invención, la tolerancia de una planta a la sal puede ser potenciada o aumentada al aumentar la cantidad de proteína disponible en la planta, preferiblemente mediante la potenciación del gen de la cofactor de molibdeno sulfurasa en la planta. 50

De este modo, una realización de la presente invención son células vegetales que portan los polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y preferiblemente plantas transgénicas que portan dichos polinucleótidos.

Como se utiliza en esta memoria, el término "potenciación" significa aumentar la actividad intracelular de una o más enzimas en una célula vegetal y/o una planta, que son codificadas por el correspondiente DNA. La potenciación puede ser alcanzada con la ayuda de diversas manipulaciones de la célula bacteriana. Con objeto de alcanzar la potenciación, particularmente la sobreexpresión, se puede aumentar el número de copias del gen correspondiente, se puede utilizar un promotor potente, o se puede mutar la región promotora y reguladora o el sitio de unión al 5 ribosoma que está situado cadena arriba del gen estructural. Los casetes de expresión que se incorporan cadena arriba del gen estructural actúan de la misma manera. Además, es posible aumentar la expresión empleando promotores inducibles. También se puede utilizar un gen que codifique una correspondiente enzima con una actividad elevada. También se puede mejorar la expresión mediante medidas para prolongar la vida del mRNA. Además, se aumenta la actividad enzimática en conjunto previniendo la degradación de la enzima. Más aún, estas 10 medidas pueden ser opcionalmente combinadas de cualquier modo deseado. Se conocen estos y otros métodos para alterar la actividad génica en una planta, como se describe, por ejemplo, en Methods in Plant Molecular Biology, redactado por Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995).

La presente descripción también se refiere a polinucleótidos que contienen el gen completo con la secuencia polinucleotídica que corresponde a SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma, y que se pueden obtener mediante 15 exploración por medio de la hibridación de un correspondiente banco de genes con una sonda que contiene la secuencia de dicho polinucleótido que corresponde a SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma, y el aislamiento de la secuencia de DNA.

Las secuencias polinucleotídicas descritas en esta memoria son adecuadas como sondas de hibridación para RNA, cDNA y DNA, con objeto de aislar aquellos cDNAs o genes que presentan un elevado grado de similitud con la 20 secuencia de SEQ ID NO: 1.

Las secuencias polinucleotídicas descritas en esta memoria son también adecuadas como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), para la producción de DNA que codifica una enzima que tiene actividad cofactor de molibdeno sulfurasa.

Oligonucleótidos tales como estos, que sirven como sondas o cebadores, pueden contener más de 30, 25 preferiblemente hasta 30, más preferiblemente hasta 20, lo más preferiblemente al menos 15, nucleótidos sucesivos. También son adecuados los oligonucleótidos con una longitud de al menos 40 o 50 nucleótidos.

El término "aislado" significa separado de su entorno natural.

El término "polinucleótido" se refiere, en general, a polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, y puede significar un RNA o DNA no modificado o un RNA o DNA modificado. 30

Se ha de entender que el término "polipéptidos" significa péptidos o proteínas que contienen dos o más aminoácidos que están unidos por medio de enlaces peptídicos.

La descripción también se refiere a secuencias de DNA codificadoras que resultan de la SEQ ID NO: 1 por degeneración del código genético.

Finalmente, la presente descripción se refiere a secuencias de DNA que se producen mediante la reacción en 35 cadena de la polimerasa (PCR) al usar cebadores oligonucleotídicos que resultan de la SEQ ID NO: 1. Los oligonucleótidos de este tipo tienen típicamente una longitud de al menos 15 nucleótidos.

Las secuencias polinucleotídicas para uso en la presente invención pueden ser portadas por uno o más vectores plasmídicos adecuados, como es sabido en la técnica para plantas o similares.

En una realización, para propagar el polinucleótido puede resultar ventajoso portarlo en una cepa bacteriana o 40 fúngica con el apropiado vector adecuado para el tipo celular. Los métodos ordinarios para propagar polinucleótidos y producir proteínas en estos tipos celulares son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1982), y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).

En otra realización preferida, los polinucleótidos para uso en la presente invención están en un vector y/o una célula 45 huésped. Preferiblemente, los polinucleótidos están en una célula vegetal o una planta transgénica. Preferiblemente, la planta es Arabidopsis thaliana o una seleccionada del grupo que consiste en trigo, maíz, cacahuete, algodón, avena y soja. En una realización preferida, los polinucleótidos están operativamente ligados a un promotor, preferiblemente un promotor inducible.

La presente descripción proporciona un procedimiento para explorar polinucleótidos que codifican una proteína que 50 tiene actividad cofactor de molibdeno sulfurasa, que comprende hibridar el polinucleótido de la invención con el polinucleótido que se va a explorar; hacer que se exprese el polinucleótido para producir una proteína; y detectar la presencia o ausencia de actividad cofactor de molibdeno sulfurasa en la proteína.

La presente descripción proporciona un método para preparar la proteína cofactor de molibdeno sulfurasa, que

comprende cultivar la célula huésped que porta los polinucleótidos de la invención durante un tiempo y bajo unas condiciones adecuados para la expresión de la cofactor de molibdeno sulfurasa, y recoger la proteína cofactor de molibdeno sulfurasa.

La presente descripción proporciona un método para producir una planta transgénica, que comprende introducir los polinucleótidos de la invención en la planta. 5

En una realización, la presente invención proporciona un método para aumentar la tolerancia a la sal de una planta que lo necesita, que comprende introducir los polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en dicha planta.

Los métodos, vectores y composiciones para transformar plantas y células vegetales de acuerdo con la invención son bien conocidos por los expertos en la técnica y no están particularmente limitados. Para un ejemplo descriptivo, 10 véase Karimi et al., TRENDS in Plant Science, volumen 7, nº 5, mayo de 2002, páginas 193-195.

Para entender la señalización de los estreses por baja temperatura y osmótico en plantas, aislamos y caracterizamos dos mutantes alélicos de Arabidopsis, los5-1 y los5-2, que están alterados en cuanto a la inducción génica por estreses por frío y osmótico. La expresión de RD29A-LUC (gen informador de luciferasa de luciérnaga bajo el control del promotor RD29A sensible al estrés) en respuesta a frío y sal/sequía está reducida en los mutantes 15 los5, pero la respuesta a ABA permanece inalterada. Un análisis por transferencia de RNA indica que la mutación los5 reduce la inducción por frío de varios genes sensibles al estrés y disminuye intensamente o incluso bloquea completamente la inducción de RD29A, COR15, COR47, RD22 y P5CS por estreses osmóticos. Las plantas mutantes los5 están comprometidas en cuanto a su tolerancia al estrés por congelación, sal o sequía. Las plantas los5 son deficientes en ABA, como viene indicado por una pérdida aumentada de agua de transpiración y una 20 acumulación reducida de ABA bajo estrés por sequía en el mutante. Una comparación con otro mutante deficiente en ABA, aba1, revela que la alterada regulación génica por baja temperatura es específica de la mutación los5. Ensayos genéticos sugieren que los5 es alélico en relación con aba3. La clonación basada en mapas revela que LOS5/ABA3 codifica una cofactor de molibdeno (MoCo) sulfurasa. La MoCo sulfurasa cataliza la generación de la forma sulfurilada de MoCo, un cofactor requerido por la aldehído oxidasa que actúa en la última etapa de la 25 biosíntesis de ABA en las plantas. El gen LOS5/ABA3 se expresa ubicuamente en diferentes partes de la planta, y el nivel de expresión aumenta en respuesta a la sequía, la sal o el tratamiento con ABA. Nuestros resultados muestran que LOS5/ABA3 es un regulador esencial de la biosíntesis de ABA, la expresión de genes sensibles al estrés y la tolerancia al estrés.

Resultados 30

Aislamiento de mutantes de Arabidopsis con una inducción reducida de RD29A-LUC por estrés salino

Se sometieron semillas de plantas de Arabidopsis que expresan el transgén RD29A-LUC (a las que se hace referencia como "tipo silvestre") a mutagénesis con metanosulfonato de etilo (EMS; del inglés, ethyl methanesulfonate) y se examinaron plantones de la generación M2 en cuanto a mutantes con una regulación alterada del transgén (Ishitani et al., 1997). Se aisló un grupo de mutantes que presentaban una clara reducción de 35 la luminiscencia inducida por NaCl. Para una caracterización detallada se escogieron dos mutantes alélicos, denominados los5 (los1 a los4 son mutantes con defectos específicos en la señalización por baja temperatura; J.-K. Zhu, datos no publicados), que muestran una reducida inducción de luminiscencia en respuesta tanto al NaCl como al frío.

Como se muestra en la Figura 1, las intensidades de luminiscencia en los plantones mutantes los5-1 eran 40 considerablemente menores que aquéllas en el tipo silvestre cuando se trataban con frío (0 °C) durante 48 horas (Figura 1B) o con NaCl 300 mM durante 5 horas (Figura 1F). Por contraste, la expresión de luminiscencia en respuesta a ABA (100 µM durante 5 horas) no es menor que aquélla en el tipo silvestre (Figura 1D). Sin el tratamiento con estrés no hubo casi expresión de luminiscencia en el tipo silvestre ni en el mutante los5. La cuantificación de las intensidades de luminiscencia de la Figura 1 indica que los niveles de expresión de RD29A-45 LUC en los plantones los5-1 son sólo el 8% y el 2% de los niveles en el tipo silvestre para los tratamientos con frío y NaCl, respectivamente, mientras que los niveles de expresión bajo el tratamiento con ABA son casi los mismos para el mutante y el tipo silvestre (Figura 1G).

Para determinar si el mutante los5 tiene una respuesta umbral alterada al estrés por frío o por sal, se aplicaron bajas temperaturas diferentes o dosis de NaCl diferentes y se cuantificó la expresión de luminiscencia en las plantas los5 y 50 de tipo silvestre. Los resultados muestran que las plantas mutantes los5 presentaban una expresión de luminiscencia consistentemente menor bajo las temperaturas probadas (Figura 1H), y las concentraciones aumentadas de NaCl tampoco dieron lugar a una recuperación de la expresión hasta los niveles del tipo silvestre (Figura 1I). Esto indica que la sensibilidad reducida al estrés osmótico o por frío en los5 no se debe a umbrales de inducción alterados de estos estreses. 55

Se retrocruzaron plantas mutantes los5-1 con las plantas de tipo silvestre. El análisis de la expresión de luminiscencia de los plantones F1 y la población F2 endogámica indicó que los5 es una mutación recesiva en un gen

nuclear (Tabla 1). Los cruces por parejas con otros mutantes que también muestran respuestas de luminiscencia reducidas al tratamiento con NaCl permitieron identificar un segundo alelo, los5-2 (Tabla 1). El mutante los5-2 tiene fenotipos idénticos a los de los5-1 (datos no mostrados).

Regulación génica reducida por sal, sequía y frío en mutantes los5

Para evaluar si la mutación los5 ejerce sobre la expresión del RD29A endógeno un efecto similar al que ejerce sobre 5 el transgén RD29A-LUC, se llevó a cabo un análisis por transferencia de RNA con RNA total aislado de plantones los5-1 y de tipo silvestre que no habían sido tratados con estrés (testigo) o habían sido tratados con frío (0 °C) durante 24 horas, ABA 100 µM durante 2 horas, NaCl 300 mM durante 3 horas o PEG al 30% durante 5 horas. Los resultados muestran que, mientras que la inducción del RD29A endógeno por ABA no resultaba sustancialmente afectada, la inducción por NaCl era casi completamente bloqueada por la mutación los5 (Figura 2). La mutación 10 también reducía claramente la expresión de RD29A en respuesta a un tratamiento con frío. Para distinguir si el efecto del NaCl se debe a un estrés iónico u osmótico, se utilizó polietilenglicerol (PEG, peso molecular medio de 6000). El nivel de transcritos de RD29A en estado estacionario resultó también muy reducido en los5 en respuesta al tratamiento con PEG (Figura 2). Esto indica que la mutación los5 reduce la expresión génica bajo estrés osmótico.

La mutación los5 también ejerce drásticos efectos sobre la expresión de otros genes sensibles al estrés bajo un 15 tratamiento de estrés osmótico o por frío. Se analizaron diversos genes sensibles al estrés, incluyendo COR15A (Lin y Thomashow, 1992), KIN1 (Kurkela y Franck, 1990), COR47 (Gilmour et al., 1992), RD22 (Yamaguchi-Shinozaki et al., 1992) y P5CS. La mutación los5 bloquea casi completamente la inducción de COR15A, KIN1 y P5CS (Figura 2) por estrés osmótico. También reduce sustancialmente la inducción de RD22 y COR47 por NaCl y PEG. Es interesante que, mientras que la inducción de COR47 por ABA es potenciada por la mutación los5, la inducción de 20 COR15A y P5CS por ABA es reducida por la mutación (Figura 2). Como testigo se determinó el nivel de transcritos de un gen de actina, y el resultado muestra que su expresión no es cambiada por los tratamientos con estrés y no es sustancialmente diferente entre el mutante y el tipo silvestre bajo los respectivos tratamientos (Figura 2).

Las plantas mutantes los5 son más sensibles al estrés por congelación

La reducida expresión de RD29A y otros genes sensibles al estrés en los5 podría ejercer un impacto sobre la 25 tolerancia de las plantas mutantes al estrés. Para probar la sensibilidad de plantas mutantes los5 a una baja temperatura, se incubaron plantas los5-1 y de tipo silvestre a 4 °C durante hasta 4 semanas. No se halló diferencia significativa alguna de crecimiento entre el mutante y el tipo silvestre, lo que indica que LOS5 no es crítico para la resistencia al enfriamiento. Para probar si las plantas mutantes los5 son defectuosas en cuanto a la aclimatación al frío, se aclimataron al frío (4 °C bajo luz), durante 48 horas, plantas de tipo silvestre y los5-1 en roseta que crecían 30 en suelo (Figura 3A). Las plantas fueron luego tratadas a -7 °C durante 5 horas. Después de una incubación en la cámara de crecimiento durante un día, se observó una clara diferencia: mientras que el 97% de las plantas de tipo silvestre sobrevivían a la congelación a -7 °C, todas las plantas mutantes los5-1 murieron (Figura 3B y datos no mostrados). El resultado muestra que las plantas mutantes los5 tienen una tolerancia reducida a la congelación.

Las plantas mutantes los5 son más sensibles al daño por estreses por sequía y sal 35

Los niveles de RNA en estado estacionario, como se muestra en la Figura 2, han revelado en plantas mutantes los5-1 una notable reducción de la expresión de genes sensibles al estrés en respuesta a tratamientos con sal o sequía (es decir, PEG). Excepto para el gen P5CS (Δ1-pirrolina-5-carboxilato sintasa), la función de la mayoría de los genes examinados no está clara. El P5CS cataliza la etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis de prolina, un principal osmolito importante para la tolerancia de las plantas a los estreses por congelación, sequía y sal (por 40 ejemplo, Xin y Browse, 1998; Roosens et al., 1999; Hong et al., 2000). Se midieron los contenidos de prolina en plantas de tipo silvestre y los5-1 tratadas con ABA o estrés salino. En ausencia del tratamiento por estrés (es decir, testigo), las plantas mutantes los5-1 tenían un contenido de prolina ligeramente mayor que las plantas de tipo silvestre. El contenido de prolina aumentaba en respuesta a un tratamiento con NaCl 150 mM tanto en las plantas los5-1 como en las de tipo silvestre. Sin embargo, el aumento es menor en las plantas los5-1 que en las plantas de 45 tipo silvestre. Las plantas mutantes los5-1 y las de tipo silvestre tenían contenidos similares de prolina cuando se trataban con ABA 50 µM (Figura 4A).

Para determinar la sensibilidad a la sequía en plantas mutantes los5, se trataron plantones los5-1 y de tipo silvestre con PEG al 30% y se midió la pérdida de electrolitos como un indicador del daño celular inducido por la sequía. Aunque los plantones los5-1 tenían una mayor pérdida de electrolitos que el tipo silvestre incluso sin tratamiento por 50 estrés, el tratamiento con PEG daba lugar a una pérdida de electrolitos en el mutante que era el doble que en las plantas de tipo silvestre (Figura 4B), lo que indica que las plantas mutantes los5 son más sensibles al estrés por sequía.

Aunque las semillas mutantes los5-1 eran más tolerantes al estrés por NaCl en la germinación, el crecimiento radicular del mutante no difería del crecimiento del tipo silvestre en cuanto a su sensibilidad al NaCl (datos no 55 mostrados). A pesar de los niveles similares de inhibición del crecimiento radicular por el estrés por NaCl, las plantas mutantes los5-1 mostraron una sensibilidad aumentada al NaCl en el brote. Con NaCl en concentraciones de 75 mM o superiores, los plantones mutantes los5-1 se volvieron amarillentos y murieron por la exposición prolongada al

estrés, mientras que las plantas de tipo silvestre sobrevivieron (Figura 4C, y datos no mostrados).

Las plantas mutantes los5 son deficientes en cuanto a acumulación de ABA inducida por estrés

Además de los cambios en la sensibilidad al estrés, las plantas mutantes los5 están también alteradas en cuanto al desarrollo. Bajo nuestras condiciones de crecimiento de días largos, las plantas los5-1 florecieron aproximadamente 5 días antes que las plantas de tipo silvestre. Además de tener un color verde más oscuro, las hojas de mutantes 5 los5-1 son más estrechas y con un borde ligeramente dentado en comparación con las hojas más redondas de las plantas de tipo silvestre (Figuras 5A y 5B). De hecho, las plantas mutantes los5 se pueden distinguir del tipo silvestre basándose en estas características de las hojas. Estos fenotipos visibles son compartidos por las plantas mutantes los5-2, segregan conjuntamente con los fenotipos de luminiscencia de los5 y están presentes en plantas los5-1 que han sido retrocruzadas 4 veces con el tipo silvestre. 10

Cuando las partes situadas por encima del suelo fueron segregadas de las raíces en la fase de roseta (Figura 5C), las hojas más jóvenes de las plantas los5-1 se marchitaron en 10 minutos bajo nuestras condiciones ambientales (22 ± 2 °C, ~ 30% de humedad relativa). Por contraste, las hojas de tipo silvestre permanecieron turgentes bajo las mismas condiciones (Figura 5D). La inflorescencia de las plantas los5 adultas también se marchitó rápidamente cuando las plantas fueron pasadas de las cámaras de crecimiento (22 °C ± 2 °C, 90% de humedad relativa) a 15 nuestras condiciones ambientales, mientras que la inflorescencia de tipo silvestre permaneció turgente (figura 5E). Estas observaciones sugieren que las plantas mutantes los5 pueden tener un mayor índice de transpiración. La medición de la pérdida de agua de transpiración muestra que las plantas mutantes los5 realmente pierden agua mucho más rápidamente que las plantas de tipo silvestre (Figura 5F), lo que indica posibles defectos en la regulación de los estomas, que es un fenotipo típico de mutantes deficientes en ABA o insensibles al ABA. 20

Para determinar si las plantas mutantes los5 son deficientes en ABA o son insensibles al ABA, se pulverizó ABA 100 µM sobre plantas de tipo silvestre y los5-1 en fase de roseta 3 horas antes de segregar las partes aéreas para la medición de la pérdida de agua. La Figura 5F muestra que, mientras que el tratamiento con ABA no afectó significativamente a la pérdida de agua de transpiración de las plantas de tipo silvestre, el tratamiento redujo sustancialmente el índice de pérdida de agua de las plantas los5-1. Esta observación es consistente con una 25 deficiencia de ABA en plantas mutantes los5-1 y sugiere que los5-1 no es insensible al ABA.

Se midieron los contenidos de ABA en plantas los5-1 y de tipo silvestre utilizando un inmunoensayo. En ausencia de tratamiento por estrés, los contenidos de ABA en las hojas de tipo silvestre y las hojas los5-1 son esencialmente los mismos (Tabla 2). Cuando se dejó que las hojas segregadas perdieran el 30% de su peso en estado fresco, los contenidos de ABA aumentaron tanto en el tipo silvestre como en el mutante los5-1. Sin embargo, las magnitudes de 30 los aumentos son bastante diferentes. Mientras que el contenido de ABA en el tipo silvestre aumentó más de un 300% en respuesta al estrés acuoso, el aumento en las hojas los5 fue sólo de 80%, teniendo el tipo silvestre casi un 250% más ABA que el mutante (Tabla 2).

Estos datos muestran claramente que los5-1 es un mutante deficiente en ABA. Para probar si los5 es alélico con respecto a mutantes deficientes en ABA conocidos, se cruzó inicialmente los5-1 con aba1 y aba2. El análisis de las 35 plantas F1 indicó que los5-1 no es alélico con respecto a ninguno de ellos (Tabla 1 y datos no mostrados). Cuando más tarde se pudo disponer del mutante aba3-1, lo cruzamos con los5-1 y analizamos los fenotipos de los plantones F1 y F2 mediante obtención de imágenes por luciferasa y medición de la pérdida de agua. Las imágenes de luminiscencia mostraron que los plantones F1 resultantes tenían una baja expresión de luminiscencia cuando se trataban con NaCl 300 mM, lo que indica que los5 es probablemente alélico con respecto a aba3. Sin embargo, la 40 medición de la pérdida de agua de transpiración en los plantones F1 fue menos concluyente, en parte porque, cuando se cruzaron con las plantas RD29A-LUC de tipo silvestre (fondo C24), las plantas heterocigóticas aba3/ABA3 mostraron un fenotipo recesivo incompleto, es decir, las plantas F1 perdieron agua más lentamente que aba3 pero más rápidamente que el tipo silvestre RD29A-LUC. Aunque las plantas F1 (los5/aba3) de un cruce entre los5-1 y aba3-1 perdían agua más rápidamente que las plantas F1 de un cruce entre el tipo silvestre RD29A-LUC y 45 aba3-1, el índice de pérdida de agua de las plantas heterocigóticas los5-1/aba3-1 era aún menor que la de cualquiera de los mutantes los5-1 y aba3-1 (datos no mostrados). Los fenotipos intermedios probablemente tengan que ver con las diferencias genéticas entre los dos ecotipos (C24 frente a Columbia).

LOS5 regula la expresión de genes sensibles a estreses por frío y osmótico a través de distintos mecanismos

Un análisis de la expresión génica en plantas mutantes los5-1 sugiere un papel crítico de LOS5 en la regulación por 50 sal y sequía y, en menor grado, por frío, de genes sensibles al estrés (Figura 1 y Figura 2). En nuestra exploración de mutantes, un segundo locus genético, LOS6, fue definido por plantas mutantes los6-1 que muestran una inducción génica reducida por tratamientos con sal/sequía (J.-K. Zhu, observación no publicada). Resulta interesante que el análisis genético mostró que los6 es alélico con respecto a aba1. Esto proporciona una excelente oportunidad para estudiar el papel de ABA en la regulación de la expresión génica por estreses por frío y osmótico usando el 55 muy sensible y fiable informador RD29A-LUC y comparando dos diferentes mutantes deficientes en ABA, los5 y los6. La inducción de RD29A-LUC por estrés salino está significativamente reducida en los5 y los6 (Figura 6A). Resulta interesante que, cuando se administró simultáneamente ABA con el estrés salino, se restableció la expresión de RD29A-LUC tanto en los5 como en los6/aba1 hasta el nivel de tipo silvestre o superior, lo que indica

que el ABA exógeno complementa el fenotipo reducido por inducción salina. Esto sugiere que la inducción génica reducida por sal y sequía en los mutantes tanto los5-1 como los6/aba1 puede ser únicamente explicada por una deficiencia de ABA.

También se analizó la inducción génica por frío usando estos dos mutantes. Sin tratamiento por estrés, los6, como los5 y el tipo silvestre, no mostró ninguna expresión de luminiscencia (datos no mostrados). Para nuestra sorpresa, 5 mientras que la inducción de RD29A-LUC por frío está significativamente reducida en los5-1, la expresión en los6/aba1 está significativamente aumentada (Figura 6B). Esta expresión de luminiscencia aumentada en los6 se observó consistentemente en numerosos experimentos independientes. Para probar el papel de ABA en la regulación génica por frío, se administró ABA junto con el tratamiento por frío. La medición de la expresión de RD29A-LUC muestra que el tratamiento con ABA restablece la expresión de luminiscencia en los6/aba1 casi hasta 10 el nivel de tipo silvestre (Figura 6B), lo que indica que la elevada inducción por frío en los6/aba1 puede ser una consecuencia indirecta de la deficiencia de ABA. Por contraste, la aplicación de ABA a plantones mutantes los5 no pudo restablecer la expresión de RD29A-LUC hasta el nivel de tipo silvestre. En realidad, no parecía que las plantas los5 respondieran a este tratamiento con ABA en comparación con el tratamiento sólo por frío (Figura 6B), lo que sugiere que la reducida inducción génica por frío en los mutantes los5 no es un resultado de la deficiencia de ABA. 15

Clonación del gen LOS5 basada en mapas

Para clonar el gen LOS5, se cruzaron plantas mutantes los5-1 homocigóticas en el ecotipo C24 con plantas de tipo silvestre en el ecotipo Columbia. Se dejó que las plantas F1 resultantes se autopolinizaran. Inicialmente, se sembraron las semillas F2 en placas de agar MS y se analizaron los plantones en cuanto a expresión de luminiscencia. Se seleccionaron supuestos mutantes por su expresión de luminiscencia reducida bajo tratamiento 20 con frío así como bajo tratamiento con sal. Luego se transfirieron los plantones seleccionados a suelo y se examinaron las plantas adultas en cuanto al fenotipo marchito bajo condiciones de humedad reducidas. Para el mapeo genético se usaron marcadores de polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLP; del inglés, simple sequence length polymorphism) distribuidos por los cinco cromosomas de Arabidopsis que presentan un polimorfismo de tamaño entre los ecotipos C24 y Columbia. El mapeo genético situaba el locus LOS5 en el brazo 25 superior del cromosoma I, entre los marcadores SSLP AtEAT1 y nga248 (Figura 7A). Esta región corresponde aproximadamente a la región donde se mapeó el locus ABA3 (Léon-Kloosterzie et al., 1996). Puesto que la mayoría de los plantones mutantes seleccionados después del tratamiento con NaCl no sobrevivieron, usamos luego el fenotipo de tolerancia salina de las semillas mutantes los5 durante la germinación para seleccionar mutantes para el mapeo. Específicamente, se sembraron las semillas F2 segregadoras en medio de agar complementado con NaCl 30 200 mM, una concentración de sal que inhibe la germinación de las semillas de tipo silvestre pero no de las semillas mutantes los5. Los supuestos plantones los5 fueron luego transferidos a suelo y fueron confirmados más tarde mediante el examen de su fenotipo marchito.

Mientras estaba en curso el mapeo fino de LOS5, se anunció la secuencia de DNA genómico correspondiente a la región LOS5. Dado el fenotipo con deficiencia de ABA, la disponibilidad de la secuencia genómica hace posible 35 seleccionar candidatos génicos para hallar la mutación los5. Un examen detallado de los genes sobre clones BAC en esta región (http://www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/5chrom) permitió identificar varios candidatos que posiblemente podrían actuar en la biosíntesis de ABA. Entre ellos, parece que el gen F19K19.13 sobre el clon BAC F19K19 es un buen candidato (Figura 7A). Búsquedas mediante BLAST sugieren que el producto génico implicado presenta una elevada similitud con la cofactor de molibdeno sulfurasa de otros organismos. Estudios previos han 40 indicado que la alteración genética en aba3 está en la introducción de S en el factor de molibdeno (MoCo) (Schwartz et al., 1997a) y que el MoCo sulfurilado es requerido por la aldehído oxidasa (Schwartz et al., 1997a; Akaba et al., 1998; Sagi et al., 1999) que actúa en la última etapa de la biosíntesis de ABA (Schwartz et al., 1997a).

El DNA genómico correspondiente a F19K19.13 fue multiplicado por PCR a partir de plantas mutantes los5-1 y de tipo silvestre y fue secuenciado. Una comparación entre las secuencias reveló un cambio de G a A 1083 pares de 45 bases (bp; del inglés, base pairs) cadena abajo del previsto codón de inicio de la traducción en los5-1. El gen F19K19.13 fue luego multiplicado a partir de los5-2 y fue secuenciado. El análisis de la secuencia permitió identificar un cambio de G a A en los5-2, 1040 bp cadena abajo del previsto codón de inicio de la traducción. Estos resultados sugieren acusadamente que el gen F19K19.13 es LOS5.

Se prevé que el producto del gen F19K19.13 actúe en la biosíntesis de ABA en una etapa correspondiente a ABA3. 50 Nuestro análisis genético también sugería que los5-1 es probablemente alélico con respecto a aba3-1 (Tabla 2). Tomados en conjunto, estos resultados sugerían acusadamente que F19K19.13 es el gen ABA3/LOS5. Para probar esta hipótesis, secuenciamos el gen F19K19.13 a partir de los alelos aba3-1 y aba3-2 y se compararon las secuencias de DNA con las de plantas de tipo silvestre Columbia (fondo aba3-1) y Landsberg (fondo aba3-2), respectivamente. Los resultados mostraron que en aba3-1 aparecía un cambio de G a A en la posición 3707 55 mientras que, en el alelo aba3-2, hay tres mutaciones en una fila con un solo nucleótido no mutado que las separa: un cambio de G a A en la posición 3176, un cambio de T a A en la posición 3178 y una deleción de T en la posición 3180. La naturaleza de las mutaciones es consistente con el tipo de mutágeno utilizado: aba3-1 fue causado por EMS, mientras que aba3-2 fue causado por irradiación con rayos γ (Léon-Kloosterzie et al., 1996).

Se prevé que todos los cambios en la secuencia de DNA de F19K19.13 de los cuatro alelos mutantes de los5/aba3 60

causen cambios en el previsto marco de lectura abierto. En conjunto, los datos anteriores demuestran inequívocamente que el locus LOS5 es idéntico al ABA3 y que el gen LOS5/ABA3 es F19K19.13. Una vez que hubimos identificado la mutación los5, se anunció recientemente un tercer alelo mutante de ABA3, frs1/aba3-3 (Llorente et al., 2000). El fenotipo sensible a la congelación y el grado de deficiencia en ABA de frs1/aba3-3 (Llorente et al., 2000) son muy similares a los de los5. Por coherencia, proponemos renombrar a los5-1 como aba3-4, y a 5 los5-2 como aba3-5.

LOS5/ABA3 codifica una cofactor de molibdopterina sulfurasa

Para obtener la secuencia de cDNA de LOS5, se llevó a cabo una PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR; del inglés, reverse transcriptase-PCR), con mRNA extraído de plantas Columbia de tipo silvestre. El producto de RT-PCR fue clonado y secuenciado (número de acceso AY034895). Una vez que se hubo clonado el cDNA de LOS5, se 10 anunció en Genebank una secuencia idéntica (número de acceso AF325457, enviada por F. Bittner y R. R. Mendel). La comparación con la secuencia de DNA genómica reveló que el gen LOS5 consiste en 21 exones y 20 intrones (Figura 7B). El marco de lectura abierto consiste en 2457 nucleótidos y se prevé que codifique una proteína de 819 aminoácidos con un peso molecular estimado de 91,8 kDa. En la Figura 8 se muestran las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos (SEQ ID NO: 1 y 2). 15

La mutación los5-1 aparecía en el 4º exón y cambia un resto de triptófano de la posición de aminoácido 120 por un codón de parada y, por lo tanto, trunca la proteína. La mutación los5-2 también aparecía en el 4º exón y cambia un pequeño resto de glicocola de la posición 106 por un resto de ácido glutámico más grande y negativamente cargado. La mutación aba3-1 aparecía en el 13º exón y cambia una glicocola de la posición 469 por un resto de ácido glutámico. Las mutaciones aba3-2 aparecían en la unión entre los exones 10º y 11º. La mutación aba3-2 cambia el 20 resto de leucina de la posición 387 por un codón de parada y, por lo tanto, trunca la proteína a partir del 11º exón (Figuras 7B y 8).

Búsquedas en bases de datos mostraron que LOS5/ABA3 presenta una elevada homología secuencial con la cofactor de molibdopterina sulfurasa (MCSU; del inglés, molybdopterin cofactor sulfurase) recientemente identificada en ganado vacuno (Watanabe et al., 2000), que pertenece a una familia de proteínas muy conservadas halladas en 25 desde bacterias a seres humanos (Figura 10). En conjunto, la proteína LOS5 tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de 35% y una similitud de 53% con respecto al compuesto homólogo humano, una identidad de 34% y una similitud de 49% con respecto a la proteína Mal de Drosophila melanogaster, una identidad de 35% y una similitud de 51% con respecto a la MCSU de ganado vacuno (Watanabe et al., 2000), y una identidad de 31% y una similitud de 48% con respecto a la proteína HxB de Aspergillus nidulans (Amrani et al., 1999). Parece que la 30 secuencia completa de LOS5/ABA3 consiste en tres dominios. El dominio N-terminal muestra una elevada homología secuencial con respecto a las aminotransferasas de Clase V dependientes de piridoxal 5'-fosfato, de plegadura tipo I, representadas por la isopenicilina N epimerasa, la fosfoserina aminotransferasa, la aspartato descarboxilasa, la subunidad pequeña de la hidrogenasa cianobacteriana soluble y las proteínas NifS de Azotobacter vinelandii. Recientemente se resolvieron las estructuras de diversas proteínas de tipo NifS (Fuji et al., 35 2000; Kaiser et al., 2000), lo que hizo posible identificar motivos conservados en el dominio de tipo NifS de LOS5/ABA3 (Figura 7C). Esto incluye un supuesto motivo ligante de fosfato de piridoxal y un motivo de cisteína conservado (Figura 7C). Los respectivos restos clave de estos motivos están marcados en la Figura 10. Es digno de mención que varias supuestas proteínas del genoma de Arabidopsis muestren una significativa similitud secuencial con este dominio de tipo NifS (datos no mostrados). El segundo dominio, la unión que conecta el dominio de tipo 40 NifS con el dominio C-terminal, muestra poca homología secuencial con otras proteínas salvo entre miembros de esta familia de MCSU. El dominio C-terminal muestra una significativa similitud secuencial con un grupo de proteínas desconocidas, halladas tanto en Arabidopsis como en otros organismos. Sin embargo, el genoma de Arabidopsis no contiene ninguna otra proteína con una significativa homología secuencial global con respecto a la proteína LOS5/ABA3 de longitud completa, lo que implica que LOS5/ABA3 es un gen de copia única en el genoma. 45

LOS5/ABA3 se expresa ubicuamente y su expresión es potenciada por ABA y estrés por sequía

Para analizar el patrón de expresión del gen LOS5/ABA3, se utilizó cDNA de LOS5 de longitud completa como una sonda en un análisis por transferencia de RNA, usando RNA total extraído de diferentes partes de plantas de tipo silvestre no estresadas. El resultado indica que LOS5 se expresa constitutivamente a un nivel relativamente bajo en todas las partes de la planta examinadas, incluyendo raíces, tallos, hojas, flores y silicuas (Figura 10A). Resulta 50 interesante que el nivel de transcritos de LOS5 aumente significativamente en respuesta a tratamientos por sequía (Figura 10B), ABA, NaCl o PEG (Figura 10C). El tratamiento con frío no ejerce efecto significativo alguno sobre la expresión de LOS5 (Figuras 10C y 10D). Los niveles de transcritos de LOS5 en estado estacionario de los plantones los5-1 son considerablemente menores que los del tipo silvestre bajo las condiciones de tratamiento (Figura 10D), lo que sugiere que el transcrito mutante con un codón de parada prematuro puede desencadenar mecanismos de 55 vigilancia de RNA que eliminen transcritos anormales (Hilleren y Parker, 1999).

También se analizó la expresión de LOS5 en otro mutante deficiente en ABA, aba1-1 (Koornneef et al., 1982), y en un mutante insensible a ABA, abi1-1 (Koornneef et al., 1984). Los resultados indican que la inducción de LOS5 por estrés osmótico en aba1 no es sustancialmente diferente de aquélla en el tipo silvestre. En el mutante abi1-1, parece que la inducción de LOS5 es ligeramente menor que aquélla en el tipo silvestre (Figura 10D). 60

Comparación entre los efectos de las mutaciones los5/aba3, aba1 y abi1 sobre la regulación génica por estrés

Por contraste con los5-1, la mutación aba1-1 no disminuye la inducción del transcrito de RD29A por frío o ABA (Figura 10D). En realidad, la inducción de RD29A por frío parece mayor en aba1-1 que en el tipo silvestre. La mutación aba1-1 disminuye la inducción de RD29A por estrés por NaCl o PEG, aunque el efecto no es tan drástico como el de los5-1. Los diferentes efectos sobre la inducción de transcritos de RD29A por los5-1 y aba1-1 están en 5 general de acuerdo con los hallazgos sobre los efectos de los5-1 y los6-1 (un alelo aba1 diferente) sobre la expresión de RD29A-LUC (Figura 6). aba1-1 potencia la inducción de ADH por frío y ABA pero disminuye la inducción por estrés por NaCl o PEG (Figura 10D). Esto está de nuevo en acusado contraste con la mutación los5-1, que disminuye la inducción de ADH por frío, ABA, NaCl o PEG (Figura 10D). Tanto aba1-1 como los5-1 bloquean casi completamente la inducción de RAB18 por estreses osmóticos (Figura 10D). Sin embargo, los5-1, pero no 10 aba1-1, también bloquea la inducción de RAB18 por ABA (Figura 10D). En comparación con aba1-1 o los5-1, la mutación abi1-1 ejerce poco efecto sobre la inducción de RD29A o ADH por los estreses (Figura 10D). No obstante, la inducción de RAB18 por ABA, NaCl o PEG está reducida en el mutante abi1-1 (Figura 10D).

Puesto que se sabe que las familias CBF (Stockinger et al., 1997) y DREB2 (Liu et al., 1998) de factores de transcripción se unen al elemento DRE presente en los promotores de RD29A y otros diferentes genes sensibles al 15 estrés, estuvimos interesados en determinar si la inducción de estos factores de transcripción por estrés se ve afectada por las mutaciones deficientes en ABA o insensibles al ABA. Los resultados muestran que la expresión del CBF2/DREB1C específico del frío no se ve significativamente afectada por los5-1/aba3-4 ni aba3-1, pero se ve potenciada en el mutante aba2-1 (Figura 10E). Se ha comunicado que DREB2A es específicamente inducido por estrés osmótico (Liu et al., 1998). Bajo nuestras condiciones de tratamiento, la expresión de DREB2A es también 20 suprarregulada por estrés por frío. Resulta interesante que, mientras que ninguna de las mutaciones deficientes en ABA afecta significativamente a la inducción de DREB2A por estrés osmótico, los5 muestra una inducción aumentada de DREB2A por frío en comparación con el tipo silvestre (Figura 10E).

Discusión

La fitohormona ABA desempeña muchos papeles significativos en el crecimiento y el desarrollo de las plantas y en 25 las respuestas de las plantas a estreses ambientales. Por lo tanto, la comprensión de las vías de biosíntesis de ABA en las plantas tiene una importancia crítica. Los mutantes en cuanto a la biosíntesis de ABA sirven como excelentes herramientas para comprender la biosíntesis de ABA y para estudiar la regulación génica en respuesta a entornos estresantes. En Arabidopsis y otras plantas tales como el maíz, el tabaco y el tomate, el análisis genético basado en la promoción de la inactividad de las semillas por ABA ha producido una serie de mutantes que son defectuosos en 30 cuanto a la biosíntesis de ABA (para una reciente revisión, véanse Koornneef et al., 1998; Cutler y Krochko, 1999; y Loitenberg et al., 1999). La caracterización de estos mutantes junto con estudios bioquímicos han revelado que en las plantas se sintetiza ABA a partir de una vía "indirecta" por medio de la escisión de un precursor carotenoide. El mutante aba1 de Arabidopsis (y aba2 del tabaco) es defectuoso en cuanto a la epoxidación de zeaxantina y anteraxantina hasta violaxantina (Rock y Zeevaart, 1991), y el gen afectado codifica una zeaxantina epoxidasa 35 (Marin et al., 1996). La escisión oxidativa de la 9-cis-neoxantina por la proteína VP14 produce xantoxina. El gen VP14 fue aislado usando el mutante vp14 de maíz (Tan et al., 1997) y codifica una 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (NCED) (Schwartz et al., 1997b). Se cree que la xantoxina es convertida en ABA mediante una reacción de dos etapas a través de AB-aldehído. El mutante aba2 de Arabidopsis está afectado en cuanto a la primera etapa de esta reacción, por lo que es incapaz de convertir xantoxina en AB-aldehído. El mutante aba3 de Arabidopsis es 40 defectuoso en cuanto a la última etapa de la biosíntesis de ABA, es decir, la conversión de AB-aldehído en ABA (Schwartz et al., 1997a), que es catalizada por la AB-aldehído oxidasa. Mutaciones en la apoproteína de la aldehído oxidasa (por ejemplo, Seo et al., 2000b) o en la cofactor de molibdeno (MoCo) sintasa afectan a la biosíntesis de ABA y conducen a deficiencia de ABA en las plantas.

El cofactor de molibdeno consiste en un único átomo de Mo coordinado con los átomos de azufre de un grupo 45 orgánico, la molibdopterina. El MoCo está muy conservado en los organismos celulares y se usa para la transferencia de un átomo de oxígeno en reacciones redox implicadas en el metabolismo del nitrógeno, el azufre y el carbono (para una revisión, véase Kisher et al., 1997). Se ha comunicado que defectos en la biosíntesis de MoCo están asociados con muchas enfermedades en seres humanos y otros animales (para una revisión, véase Reiss, 2000). En las plantas, se han descrito tres grupos de enzimas que contienen MoCo (para una revisión, véase 50 Mendel y Schwartz, 1999): la nitrato reductasa (NR), la xantina deshidrogenasa (XDH) y la aldehído oxidasa (AO). En el genoma completamente secuenciado de Arabidopsis también existe un cuarto grupo, la sulfito oxidasa. Sin embargo, a diferencia de la nitrato reductasa y la sulfito oxidasa que emplean la forma dioxio de MoCo, tanto la xantina deshidrogenasa como la aldehído oxidasa requieren que el MoCo sea modificado en la última etapa de la biosíntesis con la inserción de un átomo de azufre para reemplazar uno de los dos átomos de oxígeno terminales 55 (Figura 11). Esta reacción de sulfuración es catalizada por la cofactor de molibdopterina sulfurasa (MCSU). Se han identificado mutantes defectuosos en cuanto a esta etapa en Drosophila melanogaster (tipo castaño, mal) (Wahl et al., 1982), Aspergillus nidulans (hxB) (Scazzocchio, 1973; Amrani et al., 1999) y ganado vacuno (Watanabe et al., 2000). También se han identificado mutantes de plantas defectuosos en cuanto a esta etapa de sulfuración, es decir, aba1 de tabaco (Leydecker et al., 1995), flacca de tomate (Marin y Marion-Poll, 1997) y aba3 de Arabidopsis 60 (Schwartz et al., 1997a). Las caracterizaciones bioquímicas sugieren que estos mutantes de plantas son todos

defectuosos en cuanto a la última etapa de la biosíntesis de ABA. Como se esperaba, los defectos son específicos para AO y XDH pero no para NR (Leydecker et al., 1995; Marin y Marion-Poll, 1997; Schwartz et al., 1997a). Como en el mutante mal de Drosophila, la resulfuración de los extractos de mutantes de plantas con Na2S restablece las actividades XDH y AO en aba3 de Arabidopsis (Schwartz et al., 1997a), aba1 de tabaco (Akaba et al., 1998) y flacca de tomate (Sagi et al., 1999). Estos estudios previos sugieren que los genes de tipo silvestre que corresponden a las 5 respectivas mutaciones probablemente codifican cofactor de molibdeno sulfurasas que actúan en la última etapa de la modificación de MoCo, que es específicamente requerida por aldehído oxidasas y xantina deshidrogenasas para sus actividades catalíticas.

La identificación de mutantes los5 como alterados en cuanto a la biosíntesis de ABA y la clonación del gen LOS5/ABA3 demuestran que realmente LOS5/ABA3 codifica una supuesta cofactor de molibdeno sulfurasa (MCSU). 10 Puesto que el cofactor de molibdeno libre es muy inestable, hasta la fecha no ha habido comunicado alguno sobre la actividad enzimática de sulfuración de MCSU usando MoCo u otros sustratos. Sin embargo, una abundante evidencia de estudios tanto en plantas como en animales sobre que la resulfuración de extractos de mutantes restablece las actividades AO y XDH u otras actividades enzimáticas sugiere acusadamente que MCSU tiene actividad de sulfuración in vivo sobre la forma desulfo de MoCo. Además, comparaciones secuenciales con otras 15 proteínas también respaldan la posible propiedad catalítica de MCSU.

Como otras proteínas MCSU, el producto del gen LOS5/ABA3 presenta una amplia similitud secuencial con la proteína de tipo NifS en su región N-terminal (Figura 7C). La proteína NifS de Azotobacter vinelandii es necesaria para la actividad de nitrogenasa, la única enzima que contiene Mo y no utiliza el cofactor de molibdopterina sino que requiere una agrupación de hierro-molibdeno-azufre para la transferencia de electrones. Aunque no se conoce la 20 función exacta de la proteína NifS en la fijación de nitrógeno, se ha mostrado que NifS es capaz de utilizar in vitro L-cisteína como sustrato para formar alanina y sulfuro. De esta manera, parece que NifS actúa como una cisteína desulfurasa en la biogénesis de la agrupación metálica al movilizar un sulfuro inorgánico originado a partir del sustrato L-cisteína (Zheng et al., 1993). Esta reacción es bastante similar a las reacciones químicas que se espera que sean catalizadas por LOS5/ABA3 en la sulfuración del desulfo-MoCo. En realidad, tanto el motivo ligante de 25 fosfato de piridoxal como el motivo de cisteína conservado requeridos por NifS están bien conservados en LOS5/ABA3 y en sus compuestos homólogos en otros organismos (Figuras 7C y 8). Tanto por analogía con miembros de las proteínas de tipo aminotransferasa de clase V como por análisis experimental (Zheng et al., 1993), se halló que el fosfato de piridoxal (PLP) es un cofactor para la proteína NifS. Dada la elevada similitud con NifS y otras proteínas dependientes de PLP de esta clase, es probable que PLP también sea un cofactor para LOS5/ABA3. 30 Al comparar LOS5/ABA3 con otras proteínas NifS cuyas estructuras han sido resueltas recientemente (Fujii et al., 2000; Kaiser et al., 2000), la lisina conservada de la posición 271 (Figura 9) es probablemente el resto donde se fija covalentemente el PLP para generar una base de Schiff (Fujii et al., 2000). Asimismo, el resto de cisteína conservado de la posición 430 (Figura 10) es un probable dador de S para la reacción de trans-sulfuración (Figura 11). Ambos motivos conservados se encuentran en todos los compuestos homólogos de LOS5/ABA3 (Figura 10). Se 35 supone que tanto el PLP como los motivos de cisteína son necesarios para la actividad catalítica de LOS5/ABA3. Resulta interesante que la mutación aba3-1 aparezca justo fuera del dominio de tipo NifS, pero aún es una región muy conservada, lo que sugiere que esta región es también necesaria para la función enzimática.

La estructura global de LOS5/ABA3 hace pensar en una proteína quimérica que ha evolucionado por fusión de dos proteínas distintas. El dominio C-terminal no tiene aún una función conocida, pero probablemente es también 40 importante considerando la elevada similitud en este dominio entre las proteínas MCSU de diversos organismos y su elevada similitud con varias proteínas desconocidas del genoma de Arabidopsis.

Una interesante cuestión relacionada con la estructura aparentemente múltiple del dominio funcional es que tanto los mutantes los5-1 como los los5-2 tienen una morfología de hojas única (Figura 5B), mientras que en aba3-1 y aba3-2 no hay tan clara alteración en la forma de las hojas (datos no mostrados). Es digno de mención que tanto las 45 mutaciones los5-1 como las los5-2 aparecieran en la parte N-terminal, mientras que las mutaciones aba3-1 y aba3-2 aparecían en mitad de la proteína. Por lo tanto, es tentador especular con que el dominio N-terminal de las proteínas mutantes aba3-1 y aba3-2 pueda tener aún cierta actividad que sea necesaria para el mantenimiento de la morfología de las hojas de tipo silvestre. Por otra parte, puede que las formas mutantes los5-1 y los5-2 hayan perdido esta actividad, lo que daría lugar a una forma de hoja alterada. 50

Puesto que LOS5/ABA3 es un gen de una sola copia del genoma de Arabidopsis, no es sorprendente que se exprese ubicuamente (Figura 10A). Esto contrasta con la familia génica de la aldehído oxidasa (AAO), donde cada miembro tiene un patrón de expresión diferente (Seo et al., 2000b). Sin embargo, es interesante advertir que se comunicó que el mutante flacca de tomate pierde las actividades AO y XDH en los brotes pero conserva actividades mensurables en las raíces, donde acumula una notable cantidad de ABA (Sagi et al., 1999). Esto plantea la 55 posibilidad de que pueda existir más de un gen de MCSU de tipo LOS5/ABA3 en el tomate, y que pueda(n) permanecer activa(s) una(s) isoforma(s) específica(s) de la raíz en el mutante flacca. Además de una biosíntesis de ABA alterada en el brote del mutante flacca, se mostró que la mutación podría también reducir el transporte de ABA de la raíz al brote (Sagi et al., 1999).

En el presente estudio, mostramos que la expresión del gen LOS5/ABA3 está suprarregulada cuando las plantas 60

son tratadas con sequía, sal o ABA (Figura 10). Advertimos que la región promotora de LOS5/ABA3 contiene supuestos ABREs (por ejemplo, ACGTGG a -253 cadena arriba del codón de inicio de la traducción) y elementos de tipo DRE/CRT, lo que sugiere que el gen LOS5/ABA3 puede ser regulado por ABA y estrés por sequía/sal de un modo similar a otros genes sensibles al estrés. En la vía de la biosíntesis de ABA, se cree generalmente que la fase limitante de la velocidad está en la escisión oxidativa de la 9-cis-neoxantina, catalizada por la proteína VP14 (Tan et 5 al., 1997; Schwartz et al., 1997b; Loitenberg et al., 1999; Iuchi et al., 2000; Thompson et al., 2000; Taylor et al., 2000). Dada la poca abundancia relativa del transcrito de LOS5/ABA3 y el hecho de que es el único gen que codifica MCSU en Arabidopsis, es probable que LOS5/ABA3 pueda también regular la biosíntesis de ABA. Parece que la baja temperatura ejerce poco efecto sobre la expresión de LOS5/ABA3 (Figuras 9C y 9D), lo que es consistente con su efecto limitado sobre la biosíntesis de ABA endógeno (Thomashow, 1999). Qin y Zeevart (1999) también hallaron 10 que la baja temperatura no inducía la expresión de PvNECD1 (un compuesto homólogo de VP14 en la judía). Los tratamientos por sequía (20% de pérdida de peso en estado fresco e incubación durante 3 o 6 horas) aumentaban significativamente la expresión de LOS5/ABA3 (Figura 10B); sin embargo, los mismos tratamientos no pudieron suprarregular la expresión del gen AAO3 (datos no mostrados). Esta falta de inducción de AAO3 difiere de la observación de Seo et al. (2000a) de que la deshidratación (es decir, en una campana con flujo de aire durante 3 15 horas) inducía significativamente la expresión de AAO3 en el brote de Arabidopsis. La razón de esta discrepancia se debe probablemente a que nuestra condición de estrés (deshidratación en aire quieto durante aproximadamente 40 minutos para perder el 20% del peso en estado fresco, seguida de incubación con una humedad de 100% durante 3 o 6 horas) no era tan drástica. Nuestro resultado implica que LOS5/ABA3 puede ser el regulador clave en esta última etapa de la biosíntesis de ABA. Consistentemente con esta especulación, Sagi et al. (1999) hallaron que la 20 sulfuración con Na2S "superinducía" la actividad de AO y XDH en extractos crudos de tomate de tipo silvestre, lo que sugiere que la sulfuración de MoCo limita la actividad AB-aldehído oxidasa. La suprarregulación de la expresión de LOS5/ABA3 por ABA (Figuras 9C y 9D) es muy intrigante y puede sugerir una regulación por retroalimentación positiva de la biosíntesis de ABA por ABA.

La disponibilidad de mutantes de plantas defectuosos en cuanto a la biosíntesis de ABA ha proporcionado una 25 excelente oportunidad para estudiar la regulación génica por ABA bajo diversas condiciones de estrés abiótico. Al hacer esto, la mayoría de los investigadores han usado aba1 o abi1 y abi2 junto con los respectivos tipos silvestres. El mutante aba1 de Arabidopsis deficiente en ABA fue el primer mutante aislado de Arabidopsis, defectuoso en cuanto a la biosíntesis de ABA (Koornneef et al., 1982). Recientemente se ha podido disponer de mutantes adicionales de Arabidopsis deficientes en ABA, aba2 y aba3 (Léon-Kloosterziel et al., 1996). Sin embargo, no se ha 30 informado de la regulación génica por estrés en estos mutantes recién aislados.

Amplios estudios con mutantes aba1 o abi1/2 han producido una considerable, aunque a veces contrapuesta, información. Por ejemplo, por un lado Savoure et al. (1997) comunicaron que la expresión de genes P5CS es independiente de ABA ya que observaron que el nivel de expresión es similar en el tipo silvestre y en aba1 bajo tratamientos por frío o sequía. Sugirieron que ABA podría afectar postranscripcionalmente a la biosíntesis de prolina 35 (Savoure et al., 1997). Por otro lado, Yoshiba et al. (1999) comunicaron que la inducción de AtP5CS1 mediante estrés por sequía y sal es regulada tanto por vías dependientes de ABA como por vías independientes de ABA. Además, Strizhov et al. (1997) hallaron que la expresión del gen P5CS1 inducida por estrés requiere absolutamente ABA, lo que es consistente con nuestros presentes hallazgos (Figura 2). Para ayudar a aclarar la confusión, se han publicado varias revisiones y se han alcanzado ciertos consensos (Leung y Giraudat, 1998; Shinozaki y Yamaguchi-40 Shinozaki, 1997; Thomashow, 1999; Rock, 2000). Aunque el tratamiento a baja temperatura puede desencadenar un aumento transitorio de ABA, y la aplicación de ABA puede inducir la expresión de genes sensibles al frío a temperaturas cálidas y aumenta la tolerancia de la planta a la congelación, un consenso general es que ABA no ejerce un papel importante en la regulación de la expresión de la clase DRE/CRT de genes (Thomashow, 1999). En el presente estudio, hallamos que plantones los5-1 muestran una drástica reducción de la expresión del transgén 45 RD29A-LUC bajo un tratamiento a baja temperatura (Figuras 1B y 1G). El análisis por transferencia de RNA mostró que la inducción de COR15, KIN1, COR47, RD29A, RAB18 y ADH por baja temperatura está también significativamente reducida en plantas mutantes los5-1 (Figuras 2 y 9D). Sin embargo, la reducción de la expresión génica regulada por frío que se ve en los5-1 no se observó en aba1-1 (Figura 10D). En realidad, la inducción tanto de ADH como de RD29A por frío estaba potenciada en aba1-1 (Figura 10D). Similarmente, la inducción de la 50 expresión de RD29A-LUC por frío estaba potenciada en los plantones mutantes los6/aba1 (Figura 6B). Nuestros resultados con los6/aba1 son consistentes con los estudios previos sobre expresión génica regulada por frío llevados a cabo con aba1-1 (revisado en Thomashow, 1999). Los diferentes efectos de las mutaciones los5 y aba1 plantean la cuestión de si el significativo papel desempeñado por LOS5/ABA3 en la expresión génica regulada por frío es el resultado de una deficiencia de ABA. A esto se dirigió parcialmente nuestro experimento mostrado en la 55 Figura 6B; mientras que el tratamiento con ABA complementó el defecto de los6/aba1 en la expresión de RD29A-LUC regulada por frío, el mismo tratamiento no pudo rescatar a los5/aba3 (Figura 6B). Esto sugiere que, además de su papel en la biosíntesis de ABA, LOS5/ABA3 puede tener papeles adicionales en la regulación por frío. Consistente con esta idea es el hallazgo de que, aunque el ABA exógeno alcanza una expresión similar o ligeramente mayor de COR47, RD22, RD29A y ADH (Figuras 2, 6 y 9D) en los5 con respecto a la expresión en el 60 tipo silvestre, ABA no induce la expresión de COR15 ni P5CS y ejerce una inducción reducida de KIN1 (Figura 2). Estos resultados sugieren acusadamente que la señalización por frío requiere una función de LOS5/ABA3 que no está directamente relacionada con la biosíntesis de ABA. Actualmente no está claro cómo LOS5/ABA3 está implicado en la regulación de ciertos genes por frío o ABA.

En contraste con la temperatura baja, el estrés por sequía puede estimular drásticamente la biosíntesis de novo de ABA, y, por lo tanto, ABA está más íntimamente implicado en respuestas a estrés por sequía/sal (Ingram y Bartels, 1996; Bray, 1993). Se ha creído que la regulación génica por sequía implica tanto vías dependientes de ABA como vías independientes de ABA (Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 1997). Puesto que genes tales como RD29A, KIN1 y COR47 tienen tanto el complejo ABRE como los elementos DRE/CRT, presumiblemente pueden ser activados por 5 un estrés abiótico solo en ausencia de ABA. Un análisis utilizando mutantes aba1 o abi mostró ciertamente que éste es probablemente el caso (Thomashow, 1999; Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 1997). Sin embargo, nuestros resultados con mutantes los5 presentan claramente un cuadro bastante diferente. Bajo estrés osmótico, la expresión de RD29A-LUC está casi suprimida en los5 (Figuras 1F y 1G). Mediante los análisis por transferencia de RNA también se halló que la mutación los5 casi bloquea la inducción de COR15, KIN1, RD22, P5CS y RAB18 por estrés 10 por sal y sequía (PEG) (Figuras 2 y 9D) y altera intensamente la inducción de RD29A, COR47 y ADH por los estreses (Figuras 2 y 9D). Para determinar si el efecto de los5 sobre la expresión génica regulada por estrés osmótico es explicado por una deficiencia de ABA, aplicamos ABA junto con estrés por sal y analizamos la expresión de RD29A-LUC. El resultado indica que ABA restablece la expresión de RD29A-LUC hasta los niveles del tipo silvestre tanto en los5-1 como en los6/aba1 (Figura 6A). Nuestro análisis previo por transferencia de RNA con las 15 plantas de tipo silvestre mostró que, bajo esta condición de tratamiento, la expresión de luminiscencia de RD29A-LUC refleja fielmente el patrón de la expresión de RD29A endógeno (Xiong et al., 1999b). Estos resultados sugieren que los defectos observados en la expresión génica regulada por sal/sequía en plantas mutantes los5 son muy probablemente una consecuencia de una deficiencia de ABA. Actualmente no se puede descartar completamente la posibilidad alternativa de que LOS5 pueda tener papeles aún desconocidos en la regulación de la señalización por 20 estrés osmótico "independiente de ABA" que no estén relacionados con la biosíntesis de ABA. Esto es porque la magnitud reducida de la inducción génica por sequía o sal en aba1/los6 no fue tan drástica como en los5 (Figura 6A), aunque estos mutantes muestran un grado similar de deficiencia de ABA por medición cuantitativa masiva.

Parece que la mutación los5 ejerce poco efecto sobre la expresión de DREB2A regulada por estrés salino (Figura 10E). Esto plantea la posibilidad de que la función de DREB2A pueda requerir un(os) factor(es) dependiente(s) de 25 ABA para activar la expresión de genes cadena abajo. Previamente, nuestro análisis genético utilizando RD29A-LUC como marcador molecular ha mostrado que puede que las vías de señalización dependientes de ABA y las independientes de ABA no actúen independientemente unas de otras. Más bien, existen vastas conexiones o "interferencias" entre ellas (Ishitani et al., 1997; Xiong et al., 1999a). La presente caracterización molecular de mutantes los5 arroja además dudas sobre la independencia de ABA de las vías de transducción de señales por 30 estrés "independientes de ABA", al menos en cuanto se refiere a los genes DRE/CRT. Además, se ha mostrado que la expresión ectópica de DREB2A solo no activa la expresión de genes cadena abajo (Liu et al., 1998). Como ha sido sugerido por Liu et al. (1998), la actividad de DREB2A en cuanto a activar genes sensibles al estrés puede requerir modificaciones postranscripcionales. Por lo tanto, es posible que la fosforilación/desfosforilación de DREB2A o las funciones de sus cofactores puedan depender de moléculas reguladas por ABA, tales como ABI1, 35 ABI2, CDPKs, u otros numerosos factores reguladores sensibles a ABA (por ejemplo, Leung et al., 1997; Leung y Giraudat, 1998; Finkelstein y Lynch, 2000; Rock, 2000; y Merlot et al., 2001). Esta interdependencia entre ABA y la señalización por estrés puede ser la base de los mecanismos para el efecto sinérgico de ABA y el estrés por sequía/sal sobre la regulación de genes sensibles al estrés, como se observa en el presente estudio (Figura 6A) y en otra parte (Bostock y Quatrano, 1992; Xiong et al., 1999b). 40

Ejemplos

Habiéndose descrito de forma general esta invención, se puede obtener una comprensión ulterior por referencia a ciertos ejemplos específicos que se proporcionan en esta memoria sólo con fines de ilustración y no están destinados a ser restrictivos a menos que se especifique otra cosa.

Ejemplo 1 45

Caracterización del locus LOS5/ABA3

Aislamiento de mutantes los5

Se obtuvo Arabidopsis thaliana (ecotipo C24) que expresaba el transgén RD29A-LUC (al que se hace referencia como "el tipo silvestre) por transformación mediada por Agrobacterium (Ishitani et al., 1997). Se sometieron semillas de tipo silvestre RD29A-LUC a mutagénesis mediante metanosulfonato de etilo (Ishitani et al., 1997). Se plantaron 50 M2 en placas de agar al 0,6% que contenían base salina Murashige y Skoog (base salina MS; JRH Biosciences, Lenex, Kansas) de graduación total y se germinaron y cultivaron a 22 ± 2 °C bajo luz blanca continua. Los plantones de una semana de edad fueron explorados en cuanto a mutantes con expresión (es decir, luminiscencia) alterada de RD29A-LUC en respuesta a una temperatura baja, ABA o estrés osmótico, usando una cámara CCD termoeléctricamente enfriada. Para la obtención de imágenes de luminiscencia, se pulverizó luciferina 1 mM en 55 Triton X-100 al 0,01% sobre las plantas y luego se mantuvieron éstas en la oscuridad durante 5 minutos antes de la obtención de imágenes. Todas las imágenes se obtuvieron con un tiempo de exposición de 5 minutos. La intensidad de luminiscencia de cada plantón fue cuantificada con el software WinView.

Tratamiento con estrés y ABA

Para el tratamiento con ABA, se pulverizó uniformemente ácido (±)-cis,trans-abscísico 100 µM en H2O sobre las hojas de los plantones y se incubaron las plantas a temperatura ambiental bajo luz blanca-fría durante 4 horas (para la obtención de imágenes de luminiscencia) o 3 horas (para el análisis de RNA). Para el tratamiento con NaCl o PEG, se transfirieron los plantones de las placas MS a papel de filtro saturado con disolución MS complementada con NaCl 300 mM o 30% de polietilenglicol (peso molecular de 6000) y se incubaron durante 5 horas. A menos que 5 se afirme otra cosa, el tratamiento con frío para el análisis de imágenes y el análisis de RNA se realizó incubando plantones que crecían en placas a 0 °C en la oscuridad durante 48 horas (para la obtención de imágenes) o 12 horas (para el análisis de RNA). Puesto que un tratamiento más prolongado a -5 o -10 °C dará lugar a la congelación de los medios de agar, estos tratamientos a temperatura de congelación sólo duraron 3 horas. Después del tratamiento, las placas se pusieron a temperatura ambiental durante 2 horas para su descongelación antes de la 10 adquisición de imágenes de luminiscencia. Para el tratamiento con ABA más NaCl, se transfirieron los plantones a un papel de filtro saturado con NaCl 300 mM en disolución MS y se pulverizó inmediatamente ABA 100 µM. Las plantas fueron luego incubadas bajo luz blanca-fría durante 4 horas antes de la obtención de imágenes mediante luciferasa. Para el tratamiento a baja temperatura más ABA, se incubaron brevemente los plantones en placas de agar a 0 ± 1 °C durante 10 minutos y luego se pulverizó ABA 100 µM y se incubaron los plantones en la oscuridad a 15 0 ± 1 °C durante 48 horas antes del análisis de las imágenes.

Análisis genético de mutantes los5 y clonación de LOS5 basada en mapas

Para el análisis genético, se cruzaron los mutantes los5 con el tipo silvestre y se aislaron otros mutantes con fenotipos de luminiscencia similares. Los plantones F1 y F2 fueron sometidos a un análisis de luminiscencia y fueron calificados en cuanto a fenotipos de luminiscencia los5. También se cruzó los5-1 con mutantes aba1, aba2 y aba3 20 (obtenidos del Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, Ohio). Parte de los plantones F1 y F2 resultantes se trató con NaCl 300 mM para el análisis de imágenes de luminiscencia y parte se plantó directamente en suelo para la calificación de fenotipos marchitos bajo humedad reducida. Para el mapeo genético de la mutación los5, se cruzó el mutante los5-1 del ecotipo C24 con plantas de tipo silvestre del ecotipo Columbia. Se dejó que las plantas F1 resultantes se autopolinizaran y se seleccionaron mutantes los5-1 homocigóticos en la población F2 segregadora 25 basándose en su luminiscencia reducida cuando se trataron con frío, y se utilizó un tratamiento testigo con ABA para descartar aquellos que no tenían el transgén RD29A-LUC. También se examinó una parte de los plantones en cuanto a su luminiscencia reducida bajo tratamiento con NaCl. El mapeo de LOS5 se llevó a cabo del modo previamente descrito (Lee et al., 2001). Se desarrollaron marcadores de SSLP inspeccionando secuencias liberadas de DNA genómico en cuanto a repeticiones simples, utilizando el programa RepeatMasker 30 (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker). Como marcadores moleculares para el mapeo, se usaron parejas de cebadores que flanquean estas repeticiones simples, que generan productos de PCR con polimorfismos de tamaño en geles de agarosa al 4% entre los ecotipos C24 y Columbia.

Análisis de RNA

Se trataron plantones de 10 días de edad, en placas de agar MS, con frío, ABA, NaCl o PEG del modo descrito en la 35 sección anterior. Para el tratamiento por sequía, plantones en fase de roseta en suelo puesto en macetas fueron segregados de la superficie del suelo, y se dejó que perdieran el 20% de su peso en estado fresco. Los materiales deshidratados fueron luego incubados en un recipiente con humedad relativa del 100% durante 3 horas o 6 horas antes de ser congelados en N2 líquido para la extracción de RNA. El RNA total de las plantas testigo o tratadas fue extraído y analizado del modo descrito (Ishitani et al., 1998). Las sondas específicas de genes fueron las descritas 40 (Ishitani et al., 1998; Lee et al., 2001).

Ensayos de tolerancia al estrés

Para el ensayo de sensibilidad a la congelación, plantones de tipo silvestre y los5 que crecían en suelo puesto en macetas en una cámara de crecimiento (22 ± 2 °C, 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) durante 3 semanas fueron primero incubados a 4 °C bajo luz durante 48 horas para que se aclimataran al frío. Después de esta 45 aclimatación al frío, las plantas fueron sometidas a congelación a -7 °C durante 5 horas. Una vez acabado el tratamiento, las plantas fueron inmediatamente transferidas a 4 °C bajo luz blanca y fueron incubadas durante la noche. A la mañana siguiente, las plantas fueron colocadas en una cámara de crecimiento. Se calificó el daño en los plantones en los momentos que se indican en el texto.

Para los ensayos de tolerancia a NaCl, plantones de 7 días de edad de los5-1 y de tipo silvestre que crecían en 50 placas de MS (solidificadas con agar al 1,2%) fueron transferidos a placas de agar MS complementadas con NaCl en diferentes concentraciones. Luego se colocaron las placas verticalmente a 22 ± 2 °C bajo luz blanca y se midió diariamente la elongación de las raíces durante hasta 10 días. Para medir en los plantones la pérdida de iones inducida por el tratamiento con PEG, plantones los5-1 y de tipo silvestre de una semana de edad que crecían en placas de agar MS fueron cuidadosamente separados de la placa, enjuagados brevemente en agua destilada y 55 colocados en disoluciones que contenían 30% de polietilenglicol (PEG) (peso molecular de 6000) durante 5 horas. Después del tratamiento, los plantones fueron enjuagados brevemente en agua destilada y puestos inmediatamente en un tubo con 5 ml de H2O. El tubo fue luego suavemente agitado durante 3 horas antes de que se midiera el contenido de electrolitos. Se realizaron cuatro duplicados de cada tratamiento.

Mediciones de pérdida de agua

Para la medición de la pérdida de agua, plantas en fase de roseta fueron segregadas de la superficie del suelo y fueron inmediatamente pesadas en una cubeta de plástico para pesaje. La cubeta con las plantas fue luego colocada sobre una mesa de laboratorio (humedad relativa de ~ 30%) y fue pesada a intervalos de tiempo designados. Hubo cuatro duplicados para cada línea. El porcentaje de pérdida de peso en estado fresco se calculó 5 basándose en el peso inicial de las plantas.

Ensayos de prolina

Plantones de una semana de edad de los5-1 y de tipo silvestre cultivados en placas de agar MS fueron sometidos a la pulverización de ABA 50 µM o fueron transferidos a un papel de filtro en una placa Petri saturada con NaCl 150 mM y fueron incubados a 22 ± 2 °C bajo luz blanca durante 24 horas. Después del tratamiento, las muestras fueron 10 congeladas en nitrógeno líquido y fueron mantenidas a -80 °C para el ensayo de prolina. La concentración de prolina se determinó del modo descrito por Bates et al. (1973).

Medición de ABA

Se cortaron hojas en roseta de plantas mutantes y de tipo silvestre de 3 semanas de edad cultivadas en suelo y se pusieron sobre una mesa de laboratorio. Una vez que las hojas hubieron perdido el 30% del peso inicial en estado 15 fresco (a lo largo de un periodo de aproximadamente 2 horas), se colocaron con toallitas de papel húmedas en una bolsa de plástico herméticamente cerrada durante 5 horas adicionales. Las hojas testigo no estresadas se colocaron directamente en una bolsa de plástico con alta humedad y herméticamente cerrada sin haber perdido peso en estado fresco. Los tejidos fueron luego congelados en nitrógeno líquido y fueron triturados hasta un polvo. Se suspendió un gramo de los tejidos en 15 ml de una disolución de extracción que contenía metanol al 80%, 100 mg/l 20 de hidroxitolueno butilado y 0,5 g/l de monohidrato de ácido cítrico. La suspensión fue agitada durante la noche a 4 °C y fue centrifugada a 1000 g durante 20 minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo nuevo y fue secado bajo vacío. El residuo seco se disolvió con 100 µl de metanol mas 900 µl de disolución salina tamponada con Tris (Tris 50 mM, MgCl2·6H2O 0,1 mM, NaCl 0,15 M, pH de 7,8). Luego se determinó la concentración de ABA en la disolución utilizando el kit Phytodetek para inmunoensayos de ABA (Idetek, Inc., Sunnyvale, California). 25

Ejemplo 2

La sobreexpresión del gen LOS5 aumenta la tolerancia de las plantas al estrés por sequía

Puesto que las mutaciones con pérdida de función en el gen LOS5 daban lugar a una expresión desregulada de genes sensibles al estrés y aumentaban la sensibilidad al estrés por sequía y sal, se planteó la hipótesis de que la expresión aumentada de LOS5 podría afectar al patrón de expresión génica bajo estrés y aumentar la tolerancia de 30 las plantas a la sequía.

Para probar esta posibilidad, se fusionó transcripcionalmente cDNA de longitud completa de LOS5 con el promotor 35S de CaMV y un potenciador transcripcional. El inserto fue clonado en el vector binario pCAMBIA 1200. El plásmido resultante fue transferido a ecotipos Columbia y C24 de Arabidopsis (que contienen el gen informador RD29A-LUC), respectivamente. Se seleccionaron cerca de 70 transformantes en cada fondo de ecotipo para otros 35 ensayos. Para examinar el impacto de la sobreexpresión del gen LOS5 sobre la regulación génica por estrés y las relaciones de agua de las plantas, se examinaron plantones de plantas transgénicas en cuanto a 1) su expresión del transgén RD29A-LUC bajo un tratamiento por estrés salino; 2) sus índices de transpiración midiendo el índice de pérdida de agua de hojas segregadas; y 3) la tolerancia a la sequía en plantas que crecen en suelo.

Los resultados con 7 líneas en el fondo C24 indicaron que, tras el tratamiento con NaCl 300 mM, el nivel de 40 expresión para el gen informador RD29A-LUC en la línea que sobreexpresa LOS5 es de 39 a 96 por ciento mayor que en las plantas de tipo silvestre. Durante un periodo de 4 horas, el índice de transpiración de agua de las hojas segregadas de las plantas que sobreexpresan LOS5 es significativamente menor que el de las plantas de tipo silvestre en tres líneas ensayadas. Esta transpiración reducida también se pudo ver cuando se dejó que las hojas segregadas se secaran en la condición ambiental (véase la Figura 12). La transpiración reducida aumentará 45 significativamente la tolerancia de las plantas a la sequía.

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Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para aumentar la tolerancia a la sequía o la tolerancia a la sal en una planta, que comprende hacer que se sobreexprese una cofactor de molibdeno sulfurasa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en la planta.
2. 2. El método de la Reivindicación 1, en donde la cofactor de molibdeno sulfurasa es codificada por un ácido 5 nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.