ES2393762T3

ES2393762T3 - Procedimientos y composiciones para detectar miméticos de ligandos de receptores

Info

Publication number: ES2393762T3
Application number: ES07822465T
Authority: ES
Inventors: Vladimir Khazak; Lutz Weber
Original assignee: Alphaptose GmbH
Current assignee: Alphaptose GmbH
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-11-09
Publication date: 2012-12-27
Anticipated expiration: 2027-11-09
Also published as: AU2007316587B2; CN101606061B; DK2089711T3; CA2669012C; CA2669012A1; EP2089711A2; WO2008055995A2; US20100111930A1; EP2089711B1; WO2008055995A3; JP5773569B2; AU2007316587A1; US8324188B2; JP2010508836A; CN101606061A

Abstract

Procedimiento para determinar si una molécula pequeña es una sustitución funcional para un ligando de proteína o péptido de un receptor celular en el tratamiento de enfermedades en las que la modulación de este receptor conducirá a un efecto terapéutico, procedimiento que comprende: medir los efectos biológicos de tanto el ligando de proteína o de péptido como la molécula pequeña sobre un panel de al menos 3 líneas celulares permanentes y/o líneas primarias diferentes que expresan dicho receptor celular; y a condición de que los efectos biológicos sobre este panel de células de ambos compuestos sean cualitativamente similares, guardando relación los resultados con la presencia cuantitativa del receptor celular en la célula respectiva del panel.

Description

Procedimientos y composiciones para detectar miméticos de ligandos de receptores

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para determinar la utilidad de moléculas pequeñas como miméticos de ligandos de receptores y a su aplicación terapéutica

Antecedentes de la invención

Problemas para encontrar miméticos de ligandos de receptores. La modulación de funciones biológicas mediante ligandos de receptores agonistas o antagonistas normalmente tiene como objetivo tanto bloquear como moderar abiertamente rutas bioquímicas activas o activar o restaurar rutas que se cree que se refieren a o son causantes de una cierta enfermedad.

A diferencia de proteínas y anticuerpos endógenos o xenobióticos que presentan muy frecuentemente actividades biológicas altamente específicas, las moléculas pequeñas son mucho menos específicas. Debido a su tamaño limitado, las moléculas pequeñas se unen a varias dianas diferentes que pueden conducir a efectos secundarios no deseados y hace que su desarrollo como agentes terapéuticamente útiles sea un reto. Por ejemplo, se necesitan estudios preclínicos y clínicos cuidadosos para establecer una ventana de dosis terapéuticamente útil, para descubrir efectos inespecíficos y sus implicaciones en el desarrollo de fármacos. Particularmente, el descubrimiento de moléculas pequeñas selectivas que son miméticos funcionales de ligandos de receptores de proteínas presenta un reto al descubrimiento de fármacos, ya que los sitios de interacción y sus áreas entre el receptor y su ligando natural están superando con mucho el área de interacción proporcionada por moléculas pequeñas (P. Chene, Chem. Med. Chem 2006, 1: 400-411). Las moléculas prototipo que se han encontrado en cribados biológicos primarios tienen frecuentemente el potencial para también interaccionar con otros receptores y que no son específicos en un nivel celular.

Además, aunque ha sido posible encontrar moléculas pequeñas que son antagonistas de una interacción receptor/ligando dada, se considera más desafiante identificar agonistas. Por tanto, hay una clara necesidad de un procedimiento que pueda distinguir miméticos de ligandos de receptores de moléculas pequeñas selectivos y funcionales de moléculas que son “promiscuas” uniéndose a múltiples dianas en una forma no deseada.

Problemas para encontrar tratamientos de combinación útiles. Aunque se han hecho avances significativos en muchas enfermedades y especialmente en la terapia de tumores, frecuentemente todavía se proporciona un beneficio limitado por agentes únicos como monoterapias. Esto no es sorprendente, dado que las rutas moleculares que son responsables de enfermedades son frecuentemente redundantes y variables entre pacientes individuales o entre subclones de células dentro del mismo paciente. Por tanto, frecuentemente es poco probable que un tratamiento que se basa en una única diana ofrezca control o terapia de enfermedad duradero en la mayoría de los pacientes (J.E. Dancey y H.X. Chen, Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5: 649-659). El uso de combinaciones de fármacos ofrece un principio de terapia bien establecido, especialmente en terapia contra el cáncer, para proporcionar una mejor terapia y beneficio a pacientes. Con pocas excepciones, los tratamientos con fármacos útiles para cáncer usan una combinación de agentes de actividad conocida y espectros mínimamente solapantes de toxicidad, a sus dosis óptimas y según programas que son compatibles con la recuperación de células normales. Sólo algunas de estas combinaciones quimioterapéuticas han sido críticamente evaluadas pre-clínicamente y todavía pocas de estas combinaciones son sinérgicas, proporcionando mayor beneficio en su combinación que por los efectos aditivos de sus actividades individuales. Muchos tratamientos de combinación presentes han sido probados en estudios clínicos, usando un enfoque de ensayo y error con pacientes humanos.

Este enfoque ampliamente empírico en el desarrollo clínico hacia terapias de combinación ha sido justificado por la falta de medios de identificación de qué tumores podrían ser sensibles a una combinación de agentes individuales: hay una falta considerable de correlación entre los resultados de experimentos in vitro e in vivo de laboratorio y estudios humanos clínicos debido a las limitaciones inherentes de modelos de enfermedad in vitro e in vivo. Además, líneas de células cancerosas permanentes como, por ejemplo, las proporcionadas por organizaciones como la ATCC o las usadas por el Instituto nacional del cáncer muestran alteraciones considerables en propiedades biológicas y patrones de quimiosensibilidad cuando se comparan con los tumores originales de los que se derivan. Dos estudios han mostrado la correlación limitada entre las pruebas in vitro en el panel de 60 líneas celulares en el Instituto nacional del cáncer, xenoinjertos in vivo y eficacia clínica de agentes citotóxicos (J.I. Johnson, Br. J. Cancer 2001, 84: 1424-1431; T. Voskoglou-Nomikos y col., Clin. Cancer Res. 2003, 9: 4227-4239).

Segundo, también se necesitan procedimientos para proporcionar información sobre secuencias de tratamiento óptimas de la combinación. Por ejemplo, los estudios de laboratorio han revelado que el inhibidor de EGFR gefitinib es más eficaz in vitro en combinación con agentes citotóxicos convencionales administrados como un 'pulso' a alta dosis antes de paclitaxel cuando se compara con administración concurrente continua (D.B. Solit, Clin. Cancer Res. 2005, 11: 1983-1989).

En otro enfoque, un panel de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CCPNP) no mutantes y mutantes de EGFR humano se usó para analizar las características moleculares que determinan la respuesta a gefitinib solo o en combinación con quimioterapia (S. Van Schaeybroeck y col., Mol. Cancer Ther. 2006, 5(5): 1154

5 1165).

Por tanto, procedimientos para diseñar racionalmente y validar experimentalmente combinaciones de fármacos sinérgicas se necesitan urgentemente ya que se espera que proporcionen beneficio terapéutico prolongado y duradero para pacientes con cáncer.

10 La apoptosis está mediada por receptores unidos a la membrana. La muerte celular programada, llamada apoptosis, media en el mantenimiento de la homeostasis de tejidos, regulando la eliminación de células de la piel y el tubo gastrointestinal y la remodelación de hueso en respuesta a desencadenantes medioambientales. La apoptosis también previene enfermedades inhibiendo infección vírica sistémica, eliminando linfocitos T y linfocitos B

15 auto-reactivos para prevenir autoinmunidad y extirpando células que adquieren propiedades potencialmente oncogénicas. Las desregulación de la apoptosis desempeña una función en muchos procesos de enfermedad. La activación inapropiada de la apoptosis está asociada a trastornos neurodegenerativos tales como enfermedad de Parkinson y de Alzheimer, o lesión miocárdica observada después de reperfusión de tejido cardíaco tras un infarto. Además, si se detectan epítopes extraños sobre la superficie celular, la apoptosis puede ser inducida selectivamente

20 por linfocitos citolíticos espontáneos (NK) o linfocitos T citotóxicos (CTL) del sistema inmunitario. La resistencia a apoptosis o un mayor umbral en el que las células experimenten apoptosis está asociada a mutaciones en muchos genes, tales como el gen supresor de tumores p53. Las células hiperproliferantes que tienen defectos en las rutas apoptósicas pueden demostrar una ventaja de supervivencia, conduciendo a progresión más maligna y por último lugar a cáncer.

25 La ruta de apoptosis intrínseca (o mitocondrial) y la extrínseca (o mediada por receptores) son dos mecanismos por los que puede producirse la apoptosis.

En la ruta intrínseca, la consecuencia funcional de la señalización proapoptósica es la perturbación de la membrana

30 mitocondrial y la liberación de citocromo c en el citoplasma. Aquí, el citocromo c forma un complejo con el factor 1 activador de proteasa apoptósica (APAF1) y la forma inactiva de caspasa-9, llamada el apoptosoma. Este complejo hidroliza el trifosfato de adenosina para escindir y activar la caspasa-9. Esta caspasa iniciadora avanza para escindir y activar las moléculas ejecutoras, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7. La liberación de citocromo c de las mitocondrias es un acontecimiento temprano de la apoptosis que precede a la activación de caspasas y

35 endonucleasas. La liberación de citocromo c también conduce a la formación de especies reactivas del oxígeno (ERO).

La apoptosis inducida por la ruta apoptósica extrínseca está mediada por la activación de receptores de muerte de la superficie celular. Después de la activación mediada por ligando de un receptor de muerte, el dominio de muerte 40 intracelular conservado atrae la molécula adaptadora intracelular, dominio de muerte asociado a Fas (FADD). La molécula adaptadora recluta caspasa-8 y caspasa-10 para el receptor de muerte, formando el complejo de señal inductora de muerte (DISC), en el que se escinden y activan. En algunas células, estas caspasas iniciadoras son suficientes para escindir y activar las moléculas ejecutoras terminales, caspasa-3, caspasa-6, y caspasa-7. Sin embargo, algunas células también requieren la activación del sistema de apoptosis basado en mitocondrias para

45 amplificar la señal de receptores de muerte. La caspasa-8 y la caspasa-10 escinden y activan el dominio que interacciona con el factor proapoptósico citoplásmico Bcl-2 (BID), que transloca a la mitocondria e induce liberación del factor iniciador de apoptosis citocromo c (E. K. Rowinsky, Clin. Oncol. 2005, 23: 9394-9407). Se conocen varios receptores diferentes de la familia de receptores de muerte, además de sus ligandos naturales (Tabla 1.):

50 Tabla 1: Receptores de muerte y sus ligandos Mientras que muchos agentes citotóxicos como cis-platino o doxorubicina, además de radioterapia, parecen activar la ruta de apoptosis intrínseca, la inducción de apoptosis elegida como diana por la ruta apoptósica extrínseca representa una estrategia terapéutica sin explotar, pero emergente, para destruir células cancerosas. La activación de receptores de la superficie celular por el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) produce la estimulación directa de las rutas de señalización apoptósicas (estimulación extrínseca). Las moléculas que activan directamente estos receptores, tales como anticuerpos monoclonales agonistas para el receptor TRAIL o Fas (tal como CH-11) y ligando TRAIL o Fas recombinante (FasL), están siendo evaluadas como posibles monoterapias y como parte de terapias de combinación con fármacos quimioterapéuticos existentes y otras modalidades terapéuticas.

Receptor: Ligando

TNFR1 (DR1): TNF-a, LT-a

FAS (CD95, APO-1, DR2): FasL

TRAIL-R1 (DR4): TRAIL

TRAIL-R2 (DR5): TRAIL

DR3 (APO2): TL1, VEG1

DR6: ?

NGFR: NGF

EDAR: Eda

TRAIL, TNF1, FasL y otros ligandos de la superfamilia TNF demostraron la capacidad para tanto iniciar la apoptosis como destruir células transformadas, células víricamente infectadas y linfocitos T y linfocitos B crónicamente activados (S.R. Wiley y col., Immunity 1995, 3: 673-682; P.T. Daniel y P.H. Krammer, J. Immunol. 1994, 152: 56245632).

Sin embargo, la administración terapéutica sistémica de TNFa recombinante (y similarmente TRAIL en estudios de animales) en pacientes con cáncer produce una respuesta inflamatoria masiva, además de hepatotoxicidad directa

(A.L. Jones y P. Selby, Cancer. Surv. 1989, 8: 817-836).

Una versión de TRAIL recombinante, Apo2L/TRAIL (PRO1762), está siendo actualmente estudiada en ensayos clínicos de fase I (A. Almasan y A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Rev. 2003, 14: 337-348).

HGS-ETR1 (mapatumumab; Human Genome Sciences), un anticuerpo monoclonal agonista completamente humano que elige TRAIL-R1 como diana, está en evaluaciones de fase II en pacientes con tumores malignos avanzados. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos para TRAIL-R2 (HGS-ETR2; Human Genome Sciences), tales como HGS-TR2J, también han entrado en fase clínica y están actualmente en desarrollo clínico de fase I. HGS-ETR2 y HGS-TR2J tienen perfiles fisioquímicos y cinéticos ligeramente diferentes que garantizan la exploración de ambos en fase clínica (R. Humphreys y col., Ann. Oncol. 2004, 15: iii102, resumen 383PD; R. Humphrey y col., Presented at the 16th EORTC-NCI-AACR Symposium on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Ginebra, Suiza, 28 de septiembre-1 de octubre de 2004, resumen 204).

Especialmente prometedoras aparecen las estrategias terapéuticas en las que se combinan agentes que activan tanto la ruta extrínseca como intrínseca. Así, ETR1 o ETR2 muestran sinergias con cis-platino, camptotecina, topotecan, doxorubicina, gemcitabina, FU, vincristina, o paclitaxel in vitro, que muestran incluso actividad en líneas celulares que no entran en apoptosis mediante tratamiento con cualquier de los agentes individuales (E.K. Rowinsky, Clin. Oncol. 2005, 23: 9394-9407).

Por tanto, parece altamente deseable encontrar moléculas pequeñas que sean agonistas del receptor FAS y este receptor y su anticuerpo agonista CH-11 deben proporcionar un ejemplo de validación del procedimiento para encontrar miméticos de ligandos de receptores moléculas pequeñas según la presente invención.

Resistencia a múltiples fármacos (RMF). La RMF es un obstáculo importante para el tratamiento eficaz de cáncer. Los cánceres resistentes a fármacos son tanto inherentemente intratables (resistencia intrínseca) como han progresado hasta desarrollar resistencia a una amplia variedad de agentes anticancerígenos durante el transcurso del tratamiento (resistencia adquirida). El término RMF se usa para describir la capacidad de células tumorales expuestas a un único agente citotóxico a desarrollar resistencia a una amplia gama de fármacos estructuralmente y funcionalmente sin relacionar. Se conocen numerosos mecanismos para contribuir a este fenómeno, que incluyen expresión en exceso de bombas de expulsión de fármaco, aumento de la actividad de mecanismos de reparación de ADN, alteración de enzimas diana para fármaco y expresión en exceso de enzimas que participan en la desintoxicación y eliminación de fármacos. Debido a que la mayoría de los enfoques de quimioterapia provocan en último lugar sus efectos por apoptosis, las alteraciones al nivel del control de la apoptosis proporcionan todavía otro mecanismo por el que puede producirse resistencia a fármacos. Esta revisión se basará en algunas de las estrategias que se han usado en un intento por quimiosensibilizar tumores resistentes manipulando rutas de apoptosis desreguladas.

Los mecanismos de resistencia a fármacos pueden mediarse por alteraciones en las rutas de apoptosis: la decisión en cuanto a si una célula experimenta apoptosis o continúa progresando por el ciclo celular depende de la interacción de un complejo conjunto de genes y proteínas que interaccionan para regular la progresión del ciclo celular. La resistencia a fármacos puede emerger si las células alteran la expresión de proteínas que regulan la propagación de señales que se producen a partir de lesiones celulares tales como quimioterapia para proteger contra apoptosis. Aunque todavía no se entienden completamente muchos detalles de la ruta apoptósica, se sabe que varias proteínas son reguladores importantes de este proceso.

Un prototipo de molécula pequeña. Para validar el procedimiento para encontrar miméticos de ligandos de receptores de moléculas pequeñas según la presente invención y para demostrar su utilidad, los inventores seleccionaron adicionalmente una molécula pequeña bien establecida en la materia. Esta molécula se denomina aquí AP-121” (designaciones alternativas son edelfosina, ET-18-OCH3, 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina, rac-1-O-octadecil-2-O-metilglicero-3-fosfocolina o algunas veces alquil-lisofosfolida o ALP). AP-121 es un éter-lípido, más precisamente un alquil-lisofosfolípido, que tiene la siguiente fórmula química:

AP-121 es un análogo sintético del factor activador de las plaquetas (PAF; 1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3fosfocolina), que globalmente se cree que participa en una variedad de procesos fisiológicos tales como inflamación, respuesta inmunitaria, reacciones alérgicas, reproducción y también se ha mostrado que es eficaz como agente

10 antitumoral en mamíferos.

La quimioterapia contra el cáncer globalmente tiene como objetivo ralentizar el crecimiento de o destruir células cancerosas, a la vez que evita la lesión a células y tejidos de alrededor. Por consiguiente, los agentes anticancerígenos más eficaces son aquellos que pueden elegir selectivamente como diana células cancerosas,

15 mientras que dejan células normales relativamente sin afectar.

Los éter-lípidos son conocidos por ser agentes anticancerígenos eficaces in vitro y en modelos animales. Se han propuesto varios mecanismos de acción para la toxicidad de éter-lípidos hacia células cancerosas, que incluyen la falta de células de enzimas de escisión de alquilo. La incapacidad resultante para metabolizar los éter-lípidos

20 conduce a su acumulación intracelular y a la consecuente lesión a la organización de lípidos de la membrana celular. Otros posibles mecanismos de la acción de éter-lípidos incluyen efectos sobre niveles de fosforilación de proteína intracelular, y la rotura del metabolismo de lípidos celulares. Las células normales normalmente poseen los medios para prevenir o vencer los posibles efectos tóxicos de los éter-lípidos, pero no las células cancerosas.

25 AP-121 parece presentar múltiples actividades biológicas, que incluyen inhibición de la ruta de supervivencia de PI3K-Akt/PKB, interacción con proteína cinasa C, activación intracelular del receptor de muerte Fas/CD95, acidificación intracelular, promoción de la producción de citocinas y alteración de la función de la membrana plasmática y síntesis de lípidos (G. Arthur y R. Bittman, Biochim. Biophys. Acta 1998, 1390: 85-102; D Berkovic, Gen. Pharmacol. 1998, 31: 511-517).

30 Se encontró que una formulación liposómica de AP-121, ELL-12, era más eficaz que AP-121 libre contra leucemia, metástasis de cáncer de pulmón y melanoma en programas de dosificaciones menores y no tóxicas (I. Ahmad y col., Cancer Res. 1997, 57: 1915-1921).

35 En otro ejemplo, AP-121 se ha administrado por vía oral disuelto en leche a pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado en un ensayo de fase II (P. Drings y col., Onkologie 1992, 15: 375-382).

En particular, los datos in vitro y algunos datos de animales sugieren una actividad “no específica” muy amplia en una gama de tumores, que claramente no podrían demostrarse en los ensayos humanos publicados. Además,

40 algunos de los datos biológicos obtenidos también son contradictorios, que pueden atribuirse a los diferentes sistemas de ensayo tales como diferentes líneas celulares que se han usado, o las diferentes condiciones experimentales o la experiencia de los científicos implicados.

Por ejemplo, AP-121 se ha descrito y se comercializa como una molécula experimental que es un activador de

45 proteína cinasa C unida a membrana (PKC) en células HL-60 a una concentración de 20 µg/ml (E.C. Heesbeen y col., FEBS Lett. 1991, 290: 231-4). Se ha encontrado que AP-121 es competitivo con fosfatidilserina que se une al dominio regulador de PKC. AP-121 también se describió como un inhibidor de PKC (L.W. Daniel y col., Cancer Res. 1995, 55: 4844-9). Otros encontraron que PKC se inhibe a concentraciones de AP-121 medias, pero se activó a bajas y altas concentraciones (J. D. Aroca y col., Eur. J. Biochem. 2001, 268: 6369-78). Otros describen que PKC no

50 participa en la acción citotóxica de AP-121 en células HL-60 y K562 (E.C. Heesbeen y col., Biochem. Pharmacol. 1994, 47: 1481-8). AP-121 inhibió progresivamente la actividad de PKC alta a medida que aumentó la concentración hasta el 30% en moles del lípido total, por encima de la cual el efecto fue uno de activación. Sobre PKC épsilon, AP121 tuvo un efecto trifásico, activando la enzima a bajas concentraciones, inhibiéndola a concentraciones ligeramente mayores y luego activándola de nuevo a mayores concentraciones (P. Conesa-Zamora y col., Biochim.

55 Biophys. Acta 2005, 1687: 110-9).

También se ha descrito que AP-121 inhibe la asociación entre Ras y Raf-1, una interacción de proteínas conocida que promueve el crecimiento tumoral (P. Samadder y col., Anticancer Research 2003, 23: 2291-5). Las dosis inferiores a micromolares de AP-121 indujeron la rápida internalización, pero no la activación, del receptor de factor

de crecimiento epidérmico (EGFR), un agente anticancerígeno conocido, y la activación de MAPK/ERK concomitante en células A431 (G.A. Ruiter y col., Int. J. Cancer 2002, 102: 343-50). AP-121 redujo el número de sitios de receptor sin afectar la afinidad de receptores de EGF en las líneas celulares MCF-7 y ZR-75-1 de cáncer de mama. Cuando se añadió a concentraciones micromolares (5-25 µM), AP-121 inhibe la activación de MAPK/ERK 5 inducida por el factor de crecimiento, a dosis nM (10-500 nM). La activación de la ruta de MAPK/ERK por AP-121 en células A431 sin estimular la proliferación celular: sorprendentemente, AP-121 (500 nM) también desencadenó el rápido agrupamiento e internalización de EGFR en células A431 (H. Kosano y O. Takatani, Cancer Research 1988,

48: 6033-6).

También se ha descrito que AP-121 inhibe la fosforilación y activación de cinasa p70 S6 en células MCF-7 (G. Arthur y col., Anticancer Research 2005, 25: 95-100). La inhibición de Na,K-ATPasa y la bomba de sodio por AP-121 se describió por otros (K. Oishi y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 157: 1000-6). Se describió la activación de cinasa del extremo NH2 de c-Jun y la posterior estimulación de apoptosis por A-121 (C. Gajate y col., Mol. Pharmacol. 1998, 53: 602-12).

15 La inhibición de la ruta de PI3K-AKT/PKB por AP-121 parece importante, ya que la elevada actividad de Akt y PI3K y las mutaciones en PTEN, su regulador negativo, están asociadas a tumor maligno y convierten las células en insensibles a inducción por apoptosis (M.I. Berggren, y col., Cancer Research 1993, 53: 4297-302). Así, AP-121 pueden inhibir la activación de PI3K funcional por insulina. En la dirección 3' de AKT, AKT desactiva SEK-1, que es un activador de la cascada de SAPK/JNK. Así, la desactivación de AKT con AP-121 permite activar las proteínas de SAPK/JNK pro-apoptósicas (véase la Tabla 2., G.A. Ruiter, y col., Anticancer Drugs 2003, 14: 167-73).

Tabla 2: Valores de DE50 (µM) para la inducción de apoptosis por AP-121 de ALP, HePC y perifosina en las líneas celulares de carcinoma epitelial humano A431 y HeLa (media ± DE de tres experimentos independientes). 25

AP-121: HePC Perifosina

A431: 15,47 ±2,9 17,27 ±3,0 23,17 ±2,7

HeLa: 5,17 ±1,6 8,17 ±0,4 9,27 ±1,8

Se describió la inhibición de fosfolipasa C por AP-121, conduciendo a un bloque de receptor 1 muscarínico y receptor 8 de opiodes, con una posible aplicación de AP-121 en antinocicepción. (L.F. Horowitz y col., J. Gen. Physiol 2005, 126: 243-62).

La apoptosis desencadenada por AP-121 es prevenida por el aumento de la expresión de fosfocolina citidiltransferasa (CTP) (I. Baburina y S. Jackowski, J. Biol. Chem. 1998, 279: 2169-2173), sugiriendo CTP como diana primaria de AP-121.

35 Se hizo una conexión con la inhibición del receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P) S1P1 que media en la supresión de la migración de linfocitos T (G. Dorsam y col., J. Immunol. 2003, 171: 3500-7). S1P previene los contrastes de la apoptosis resultante de niveles elevados de ceramida inducida por TNFa, anticuerpo anti-Fas, esfingomielinasa o ceramida permeable a células. La regulación por incremento de la enzima esfingosina cinasa responsable de su producción puede contribuir a RMF protegiendo la célula de apoptosis (O. Cuvillier y col., Nature 1996, 381: 800-3). Células de Jurkat tratadas con anticuerpo monoclonal anti-Fas (clon CH-11) se sometieron a amplia muerte celular en el plazo de 3 h. La ligación de Fas induce activación de SAPK/JNK en linfocitos T de Jurkat. La ligación de Fas induce escisión de PARP mediante un aumento significativo en la actividad de PARP proteolítica de caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, S1P disminuyó marcadamente la actividad de caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 (O.

45 Cuvillier y col., J. Biol. Chem., 1998, 273: 2910-16).

Gajate publicó la capacidad de AP-121 para inducir el agrupamiento del receptor FAS en montones de lípidos razonando que esto produce la capacidad de AP-121 para inducir apoptosis (C. Gajate y col., J. Exp. Med. 2004,

200: 353-365). Esta diana AP-121 putativa también se mostró en células de linfoma y líneas celulares (C. Gajate y F. Mollinedo, Blood 2001, 98: 3860-3863). Por otra parte, Spiegel y colaboradores atribuyen estas propiedades proapoptósicas a la liberación de citocromo c de mitocondrias (O. Cuvillier y col., Blood 1999, 94: 3583-3582), independiente del receptor FAS. AP-121 es internalizado en montones de lípidos de células tumorales mediante endocitosis (A.H. van der Luit y col., J. Biol. Chem. 2002, 277: 39541; A.H. van der Luit, y col., J. Biochem. 2003,

374: 747). Una vez en la célula, AP-121 desencadena el reclutamiento de la proteína del dominio de muerte

55 asociado a Fas, procaspasa-8 y procaspasa-10, cinasa c-Jun del extremo N y Bid, las moléculas críticas para la iniciación de la apoptosis (C. Gajate y col., Exp. Med. 2004, 200: 353). Así, el receptor de muerte (FAS-R) y las rutas apoptósicas mitocondriales están espaciosamente unidos, produciendo rotura del potencial transmembrana mitocondrial, producción de especies reactivas del oxígeno, activación de caspasa-3, escisión de poli(ADP-ribosa) polimerasa y fragmentación de ADN (C. Gajate y col., Int. J. Cancer 2000, 86, 208.).

En comparación con las actividades biológicas informadas de AP-121 en líneas celulares que están en el intervalo micromolar bajo, el efecto más potente descrito hasta la fecha a nuestro presente conocimiento es la actividad antiangiogénica de 60 nanomolar en células endoteliales HMEC1 (D. Candal, Cancer Chemother. Pharmacol. 1994,

34: 175-178).

Basándose en estos datos biológicos de diversas células y líneas celulares, parece que se necesita un procedimiento para descubrir un efecto biológico de AP-121, si lo hay, que sea de relevancia terapéutica para una indicación terapéutica específica.

A pesar de la incertidumbre de su efecto biológico, el documento US 5.149.527 describe composiciones inmunopotenciadoras que comprenden éter-lípidos como agentes adecuados que dan lugar a necrosis tumoral y/o regresión en sujetos que previamente han recibido terapia satisfactoria, que destruye tumores y estimula macrófagos citotóxicos. Los agentes deben administrarse en un momento en el que la formación de macrófagos específicamente citotóxicos para el tumor ha sido generada por terapia previa. Sin embargo, no se ha proporcionado ningún dato para soportar esta actividad de AP-121.

AP-121 se ha descrito como un compuesto útil para tratar cáncer (documento DE 02 619 686) administrando a los mamíferos una cantidad farmacéuticamente eficaz de AP-121 para reducir el tamaño de tumores y también se ha descrito en los documentos US 6.514.519 y EP 1 079 838, siendo especialmente adecuado para el tratamiento de tumores cerebrales malignos primarios y secundarios.

El documento US 6.235.729 se refiere a un procedimiento para inhibir la progresión tumoral ralentizando o inhibiendo la invasividad y metástasis tumoral que comprende la etapa de administrar a dicho individuo una dosis farmacológicamente eficaz de un inhibidor de fosfolipasa C tal como AP-121. Preferentemente, el inhibidor de fosfolipasa C disminuye la fosfolipasa Cy. Globalmente, un inhibidor de fosfolipasa C tal se administraría en una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg. Aunque no se proporcionan datos para soportar la reivindicación, la dosis informada no reflejará la baja actividad de AP-121, encontrada en pruebas in vitro en cualquier parte.

También se ha informado que AP-121 es útil para tratar esclerosis múltiple (EM; documentos EP 2 363 901, DE 03 530 767) o artritis reumatoide (AR) o espondilitis anquilosante (EA; documento EP 474 712), por inhibición de linfocitos T citotóxicos CD4+ o CD8+ activados (CTL).

Resumen de la invención

La presente invención comprende un procedimiento para determinar si una molécula pequeña es un mimético funcional de ligandos de receptores terapéuticamente útil. La presente divulgación también se refiere a procedimientos de tratamiento y de diagnóstico terapéuticamente útiles y composiciones que contienen AP-121 tanto solo como en combinación con otros compuestos terapéuticamente útiles y procedimientos para establecer su utilidad terapéutica.

Según la presente invención, el efecto biológico de un ligando de receptores funcionales tal como una proteína, péptido o anticuerpo endógeno o artificialmente preparado se mide contra un panel de al menos tres células humanas primarias diferentes o líneas celulares permanentes solas y en combinación con un panel de otros compuestos que dan lugar a una matriz de resultados biológicos. En paralelo, el mimético de ligando de moléculas pequeñas putativo también se mide contra el mismo panel de al menos tres células humanas primarias diferentes o líneas celulares permanentes solas y en combinación con el mismo panel de otros compuestos para dar una segunda matriz de resultados biológicos. Si la similitud, como se calcula por un algoritmo matemático tradicional, de estas dos matrices es superior a un umbral predefinido, la molécula pequeña puede considerarse un mimético de ligandos de receptores verdadero que va a usarse como agente terapéutico. Además, el procedimiento según la presente invención también administra combinaciones terapéuticamente útiles de moléculas pequeñas que pueden actuar sinérgicamente en enfermedades en las que la modulación de dicho receptor proporciona un efecto terapéutico.

En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar si una molécula pequeña es una sustitución funcional para un ligando de proteína o péptido de un receptor celular en el tratamiento de enfermedades en las que la modulación de este receptor conducirá a un efecto terapéutico, procedimiento que comprende:

medir los efectos biológicos de tanto el ligando de proteína o de péptido como la molécula pequeña en un panel de al menos 3 líneas celulares permanentes y/o líneas primarias diferentes que expresan dicho receptor celular; y

a condición de que los efectos biológicos sobre este panel de células de ambos compuestos sean cualitativamente similares, guardando relación los resultados con la presencia cuantitativa del receptor celular en la célula respectiva del panel.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento novedoso para determinar si una molécula pequeña es un mimético funcional y terapéuticamente útil de un ligando de receptor.

Una “molécula pequeña”, como se usa aquí, comprende, entre otros, péptidos, proteínas, moléculas de ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos, además de compuestos químicos de bajo peso molecular.

Los péptidos y proteínas que pueden usarse en la presente invención comprenden moléculas que se produce naturalmente, además de diseñadas artificialmente, por ejemplo, por medio de tecnología de ADN recombinante o por síntesis química. Tienen una longitud de normalmente al menos 800 aminoácidos, preferentemente de al menos 600 aminoácidos, más preferentemente de al menos 400 aminoácidos, y lo más preferentemente de al menos 200 aminoácidos.

Ejemplos de ácidos nucleicos que pueden usarse en la presente invención incluyen ácidos nucleicos que se producen naturalmente tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), además de análogos de ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud y pueden ser moléculas tanto monocatenarias como bicatenarias.

Ejemplos de hidratos de carbono que pueden usarse en la presente invención incluyen monosacáridos tales como glucosa o fructosa, disacáridos tales como lactosa o sacarosa, además de oligosacáridos y polisacáridos tales como almidón, prefiriéndose monosacáridos.

Ejemplos de lípidos que pueden usarse en la invención incluyen ácidos grasos, triacilglicéridos, esfingolípidos y fosfolípidos. En realizaciones preferidas de la invención, las moléculas pequeñas están seleccionados de éter-lípido, preferentemente alquil-lisofosfolípidos, prefiriéndose particularmente AP-121.

El término “compuesto químico de bajo peso molecular”, como se usa aquí, denota una molécula, preferentemente una molécula orgánica, que comprende al menos dos átomos de carbono, pero preferentemente no más de siete enlaces de carbono, que tiene un peso molecular en el intervalo entre 100 y 2.000 Dalton, preferentemente entre 100 y 1.000 Dalton, y que opcionalmente incluye uno o dos átomos de metal. Ejemplos de tales moléculas incluyen, entre otros, imidazoles, indoles, isoxazoles, oxazoles, piridinas, pirimidinas y tiazoles.

Como primera etapa del procedimiento según la presente invención tiene que seleccionarse un receptor diana terapéuticamente relevante, además de un ligando adecuado que ejerza un efecto modulador, en el cual el término “efecto modulador”, como se usa aquí, comprende tanto un efecto antagonista (es decir, bloqueo o inhibición) como agonista (es decir, activación) sobre la señalización en la dirección 3' del receptor seleccionado. Este ligando seleccionado puede ser el ligando endógeno del receptor seleccionado o cualquier otra proteína o péptido, tal como un anticuerpo, que se sabe que presenta este efecto. Este ligando no necesita presentar propiedades que sean útiles para moléculas tipo fármaco, sino que es importante que el ligando presente su efecto selectivamente y carezca de propiedades que dificulten o hagan imposible su uso como herramienta para el cribado basado en células. Además, tiene que seleccionarse una molécula pequeña que sea un mimético de ligandos de receptores putativo, junto con un panel de al menos una, preferentemente al menos dos, y más preferentemente al menos tres otras moléculas que se sabe que presentan un efecto biológico.

En una segunda etapa del presente procedimiento tiene que seleccionarse un panel de al menos tres líneas primarias de origen humano diferente y/o líneas celulares derivadas de ser humano permanentes. Estas líneas celulares expresarán preferencialmente el receptor seleccionado en diferentes niveles, y/o con un estado de mutación diferente y/o diferente concentración en la membrana celular, asegurando que una correlación del efecto biológico con tales niveles de receptor pueda derivarse del efecto biológico medido.

En una tercera etapa se miden los efectos biológicos de los diversos compuestos seleccionados. Según la presente invención, bajo el término “efecto biológico” puede usarse una variedad de ensayos biológicos basados en células para medir tal efecto. Por ejemplo, pueden medirse, pero no se limitan a, expresión génica tal como RT-PCR, detección del nivel de proteínas o acontecimientos biológicos más complejos tales como inhibición de la proliferación, formación de colonias, angiogénesis o apoptosis.

El “efecto biológico” según la presente invención también puede ser un resumen o resultado promedio de varios ensayos biológicos, tanto por experimentación repetida, usando diferentes concentraciones, como implicando ensayos de diferente naturaleza. Así, un efecto biológico puede ser una concentración inhibidora del 50% (CI50), dosis eficaz (DE50), índice de combinación (IC) o similar. Según el presente procedimiento, los compuestos se miden ahora del siguiente modo para obtener dos matrices de resultados biológicos: primero se miden los efectos biológicos del ligando de receptor en cada línea celular individual (de 1 a N, siendo N el número de células diferentes), preferencialmente repitiendo el mismo experimento múltiples veces para obtener resultados fidedignos. A continuación, el ligando de receptor se combina en relaciones predefinidas con cada uno de los otros compuestos individualmente para obtener mezclas de dos compuestos.

Estas mezclas de dos compuestos también pueden contener mezclas del mismo ligando y compuesto, pero en diferentes relaciones (1 a M, siendo M el número de mezclas de compuestos diferentes). Tras esto se miden los efectos biológicos de cada mezcla en cada línea celular individual (de 1 a N, siendo N el número de diferentes

5 células), preferencialmente repitiendo el mismo experimento múltiples veces para obtener resultados fidedignos. Como resultado, los inventores obtienen una matriz de dos dimensiones (A1) de resultados biológicos.

En una cuarta etapa, la tercera etapa se repite reemplazando el ligando de receptor con la molécula pequeña putativa que también se mide de la misma forma contra el mismo panel de al menos tres líneas primarias humanas o

10 líneas celulares permanentes diferentes solas y en combinación con el mismo panel de otros compuestos para dar una segunda matriz bidimensional (A2) de resultados biológicos. Para fines de ilustración, las matrices A1 y A2 pueden tomar el siguiente formato:

A1

Ligando (L): Ligando + Comp 1 Ligando + Comp 2 ... Ligando + Comp M

Célula 1: 0,50 0,40 0,30 0,30

Célula 2: 1,80 2,90 0,40 5,00

...

Célula N: 0,10 0,10 0,00 0,20

A2

Mol peq (MP): MP + Comp 1 MP + Comp 2 ... MP + Comp M

Célula 1: 0,40 0,30 0,35 0,40

Célula 2: 1,20 3,00 0,20 4,00

...

Célula N: 0,40 0,20 0,20 0,40

En una quinta etapa del procedimiento según la presente invención, las matrices A1 y A2 se normalizan de tal forma 20 que cada efecto biológico se exprese como su relación con el mayor efecto biológico observado en cada una de las diferentes células, conduciendo a matrices B1 y B2 derivadas.

Estas matrices B1 y B2 bidimensionales normalizadas pueden tomar la siguiente forma:

25 B1

Ligando (L): Ligando + Comp 1 Ligando + Comp 2 ... Ligando + Comp M

Célula 1: 0,17 0,14 0,10 0,10

Célula 2: 0,62 1,00 0,14 1,72

...

Célula N: 0,03 0,03 0,00 0,07

B2

Mol peq (MP): MP + Comp 1 MP + Comp 2 ... MP + Comp M

Célula 1: 0,10 0,08 0,09 0,10

Célula 2: 0,30 0,75 0,05 1,00

...

Célula N: 0,10 0,05 0,05 0,10

En una sexta etapa del procedimiento según la presente invención se establece la similitud entre la matriz B1 y B2. Hay muchos algoritmos matemáticos tradicionales para calcular tal similitud, estos algoritmos no son parte de la presente invención, pero pueden derivarse de cualquier libro de texto matemático del estado de la técnica o herramientas de software establecidas para evaluar la similitud de perfiles de expresión génica. También pueden usarse diferentes índices de similitud para calcular tal similitud tal como, por ejemplo, el coeficiente de Cosine, Dice, Euclid, Forbes Hamman, Jaccard, Kulczynski, Manhattan, Pearson, Rogers-Tanimoto, Russel-Rao, Simpson, Tanimoto o Yule descrito en (J.D. Holliday y col., Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening 2002, 5: 155-166).

Como etapa intermedia de este cálculo, los inventores pueden obtener una matriz de similitud unidimensional (S) a partir de la que puede determinarse la similitud contra cada línea celular:

S: similitud

Célula 1: 0,96

Célula 2: 0,65

...

Célula N: 0,960

10 Si la similitud calculada es superior a un umbral predefinido, la molécula pequeña puede considerarse como un mimético de ligandos de receptores verdadero que va a usarse como agente terapéutico. Este umbral predefinido puede determinarse tanto midiendo una molécula pequeña que se sabe que tiene actividad biológica, pero que no es un ligando de receptor.

15 Además, el procedimiento según la presente invención también administra combinaciones terapéuticamente útiles de moléculas pequeñas que pueden actuar sinérgicamente en enfermedades en las que la modulación de dicho receptor proporciona un efecto terapéutico.

La presente divulgación también se refiere a tratamientos terapéuticamente útiles, procedimientos de diagnóstico y

20 composiciones que contienen AP-121 como mimético de ligandos de receptores FAS de CH-11, tanto solos como en combinación con otros compuestos terapéuticamente útiles y procedimientos para establecer su utilidad terapéutica. Preferentemente, las composiciones de la presente divulgación son formas de dosificación farmacéuticas administrables por vía oral, particularmente preferentemente formas de dosificación sólidas tales como comprimidos, píldoras, cápsulas y gránulos. Además, y diferente a CH-11, AP-121 proporciona beneficio terapéutico a pacientes

25 cuando se compara con CH-11 o un anticuerpo similar ya que está biodisponible por vía oral y es bien tolerado (P. Drings y col., Onkologie 1992, 15: 375-382).

La invención se describe adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos, que son únicamente con el fin de ilustrar realizaciones específicas de la presente invención, y no deben interpretarse de ningún modo como limitantes

30 del alcance de la invención. Los materiales usados en las siguientes pruebas están tanto comercialmente disponibles como se preparan fácilmente a partir de materiales comercialmente disponibles por aquellos expertos en la materia.

Figuras

35 Figura 1 representa los efectos in vitro de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina (concentración final 10 µM), radiación (ionizante) (dosis absorbida de 5 unidades de Gray; indicada como “RT”) y una combinación de las mismas sobre la muerte celular programada (apoptosis) y la tasa de supervivencia de células de adenocarcinoma de próstata humano sensible a andrógenos LNCaP.

40 La apoptosis se determinó usando el ensayo Apo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7, Promega, Inc., Madison, WI, EE.UU., según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de células cancerosas vivas se estimó por medio de exclusión con colorante de azul de tripano como se ha descrito (Freshney, R.I. (1994) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 3ª ed. Wiley-Liss. Nueva York. EE.UU.) Las células se expusieron a radiación seis horas después (Fig. 1A),

45 concomitantemente con (Fig. 1B) o seis horas antes de la administración de 1-O-octadecil-2-Ometil-glicero-3-fosfocolina (Fig. 1C). El ensayo de caspasa se realizó 12 horas después de la exposición a radiación. Los datos respectivos mostrados representan el promedio de dos experimentos independientes.

50 Figura 2 representa los efectos in vitro de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina (30 mg/kg de peso corporal/día administrada intraperitonealmente durante 15 días; Fig. 2A), radiación (ionizante) (dosis absorbida de 5 unidades de Gray administrada en el día 7; Fig. 2C) y una combinación de las mismas (Fig. 2B) sobre células LNCaP cultivadas ortotópicamente en las próstatas de ratones sin pelo (siete ratones/grupo). El crecimiento tumoral se evaluó determinando el nivel en suero del

55 antígeno prostático específico (PSA) usando un kit de prueba comercialmente disponible, además del volumen tumoral por medio de resonancia magnética nuclear.

Ejemplos y procedimientos experimentales

Ejemplo 1: Etapa de selección

5 Para demostrar la utilidad práctica del procedimiento, los inventores han elegido como ejemplo el receptor FAS para el que se busca un ligando pequeño activante, el anticuerpo agonista CH-11 como ligando de receptor adecuado, además de AP-121 como mimético de CH-11 putativo. Los fármacos conocidos camptotecina, temozolamida, adriamicina y tarceva se eligieron como panel de compuestos adicionales para las mediciones de combinación.

10 Como panel de prueba biológica, los inventores seleccionaron las líneas celulares de tumor cerebral U87MG, A172, LN-18, LN-229, U118MG y T98G que tienen diferentes niveles de mutaciones en p53 y PTEN, además de la expresión del receptor FAS:

Nº: Línea celular p53 pTEN FasL Fas ATCC Nº

1: U87 no mut mut. (deleción) + no mut HTB-14

2: A172 no mut mut. (deleción) + no mut CRL-1620

3: LN18 mut no mut + no mut CRL-2610

4: LN299 mut no mut + no mut CRL-2611

5: T98G mut mut. (deleción) + no mut CRL-1690

6: U-118MG mut mut. (deleción) ? no mut HTB-15

15 Se han identificado receptores de muerte Fas en la mayoría de las células de glioblastoma y los niveles de expresión se corresponden con el grado de tumor maligno (O. Tachibana y col., Cancer Res. 1995, 55: 5528-30). La apoptosis y la supervivencia en astrocitomas de alto grado como se relaciona con la expresión de Fas de tumor (APO-1/CD95) (Frankel y col., Neurooncol. 2002, 59: 27-34).

20 La expresión de proteínas del receptor Fas, ligando de Fas (FasL), Bcl-2 y TGFh2 establece una correlación con la supervivencia en gliomas humanos iniciales y recurrentes (R.J. Strege y col., J. Neurooncol. 2004, 67: 29-39). La coexpresión de Fas y ligando de Fas se ha descrito en tumores de la glía malignos y líneas celulares (N. Husain y col. Acta Neuropathol. (Berl) 1998, 95: 287-90).

25 Sin embargo, debido a que la mayoría de las células de glioblastoma son resistentes a apoptosis inducida por ligando de Fas, el aprovechar la ruta inductora de muerte en gliomas requerirá la sensibilización por otros medios: los tumores cerebrales pediátricos ex vivo expresan Fas (CD95) y FasL (CD95L) y son resistentes a inducción de apoptosis. (C.D. Riffkin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 14871-14876). La regulación por incremento de Fas de tumor (APO-1/CD95) produce un aumento de los tiempos de apoptosis y supervivencia para ratas con

30 gliomas malignos intracraneales (B. Frankel y col., Neurosurgery 2001, 49: 168-75).

El clon del anticuerpo anti-Fas humano activante CH-11 de Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EE.UU. (catálogo Nº05-201), la IgM purificada por inmunoafinidad de ratón; el anticuerpo reconoce Fas (43kD) y tiene actividad citolítica en células humanas que expresan Fas. Células WR19L y L929 murinas transfectadas con ADNc

35 que codifica FasL humano experimentan apoptosis en respuesta al anticuerpo. El anticuerpo no reconoce TNF y no reacciona de forma cruzada con FasL de ratón. Después de 24 h se destruye el 86% de las células Jurkat humanas.

En un documento fundamental (A. Algeciras-Schimnich y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100: 11445-50), líneas celulares humanas se clasificaron como tipo II si FasL soluble fue citotóxico o como tipo I si no fue. Sin

40 embargo, CH-11, diferente a FasL soluble, también es citotóxico para algunas células de tipo II. Tanto FasL como CH-11 pueden ejercer una actividad sinérgica sobre células.

Por tanto, los inventores concluyen que el hallazgo de una molécula pequeña que es un mimético de CH-11 podría ser de uso terapéutico en situaciones en las que las células tumorales no son sensibles a todas o no son

45 suficientemente sensibles a FasL endógeno o en situaciones en las que no se expresa FasL suficiente en el tejido enfermo.

Ejemplo 2: Líneas celulares y reactivos

50 Se compraron U-118MG (glioblastoma/astrocitoma, p53 mut, PTEN mut), T98G (glioblastoma multiforme, p53 mut, PTEN mut), A172 (glioblastoma, p53 no mut, PTEN mut) y U87MG (glioblastoma/astrocitoma p53 no mut, PTEN mut) de ATCC.

U-118MG y A172 se incubaron en medio DMEM complementado con 10% de SBF y P/S, T98G y U87MG se 55 incubaron en medio DMEM complementado con disolución 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (Gibco), 10% de SBF y P/S según recomendaciones de ATCC. AP-121 se preparó como disolución madre 5 mM en agua estéril destilada; temozolomida (TMZ) (Haorui Pharma-Chem, Inc., Edison, NJ) se preparó como 100 mM en DMSO filtrado estéril; adriamicina (ADR) (Sigma) se preparó como 1 mM en agua estéril destilada; camptotecina (CTP) (Sigma) se preparó como disolución 10 mM en NaOH 0,1 N; tarceva (Proteinkinase, Alemania) se preparó como disolución 5

5 mM en DMSO estéril. Todas las mezclas madres se mantuvieron a -20ºC.

Ejemplo 3: Ensayo de proliferación WST-1

2000 células se sembraron en cada pocillo de placas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante la noche

10 a 37ºC en 5% de CO2. El crecimiento de las células sembradas en placa se midió añadiendo 7,5 µM de reactivo WST-1 (Roche Applied Sciences, Alemania) a 3 pocillos de control y midiendo la absorbancia a 650 nm y a 450 nm, respectivamente, con un lector de placas SpectraMax250. Si los valores de DO650-DO450 fueron superiores a 0,5, el resto de la placa se usó para incubación con AP-121, otros agentes farmacológicos o control de disolvente durante 96 horas.

15 Después de esta incubación, el reactivo WST-1 se añadió a los pocillos y los valores de DO650-DO450 se calcularon como antes. Se ensayaron seis pocillos para cada condición y se determinó la desviación estándar: todos los experimentos se realizaron al menos tres veces independientemente. Después de la elucidación de valores individuales de CI50 para cada compuesto se realizó el tratamiento de combinación simultánea de AP-121 y el

20 agente quimioterapéutico a su relación de CI50; el índice de combinación (IC) se determinó por el paquete de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO). Los datos se evaluaron calculando las medias del índice de combinación (IC) en el que un IC de <0,3 indica un fuerte efecto sinérgico, 0,3<IC<0,7 un efecto sinérgico, 0,7<IC<0,9 sinergia moderada, 0,9<IC<1 efecto aditivo e IC>1 efecto antagonista, respectivamente.

25 Para las medidas de la combinación de fármacos de proliferación de células con AP-121, la DE50 se determinó para cada fármaco. Se usaron 6 concentraciones diferentes de cada fármaco en las mediciones del índice de combinación y en comparación con +/-células, y en comparación con controles sin compuesto. Cada combinación se repitió 6 veces a 2 momentos de tiempo diferentes (24 y 96 horas), cada uno de los experimentos anteriores se repitió 3 veces para obtener resultados válidos.

30 Por ejemplo, una medición tal se muestra a continuación, midiéndose la línea celular U118, y una mezcla de AP-121 y temozolamida (TMZ), como la diferencia de absorción óptica a 450 frente a 650 nm. Las dos filas superiores denotan las concentraciones micromolares de AP-121 o TMZ en seis relaciones diferentes, la fila A contiene los medios con compuestos, pero sin añadir células, la fila B a G células y se añade la mezcla de compuestos

35 respectiva, la fila H1-H3 son con células, pero sin la mezcla de compuestos, añadiendo agua en lugar de la mezcla de compuestos, H4-H6 es la misma que H1-H3, pero con agua que contiene 1% de DMSO, se añade reactivo WST a todos los pocillos, con excepción de H1-H3.

AP-121: 20 10 5 2,5 1,25 0,625

TMZ: 1000 500 250 125 62,5 31,2500

A: 0,172 0,19 0,183 0,184 0,191 0,201

B: 0,22 0,309 0,368 0,362 0,457 0,494

C: 0,229 0,322 0,39 0,383 0,451 0,437

D: 0,251 0,339 0,397 0,418 0,461 0,478

E: 0,253 0,333 0,421 0,424 0,417 0,482

F: 0,254 0,322 0,384 0,426 0,456 0,475

G: 0,258 0,327 0,4 0,392 0,447 0,444

H: 0,896 0,926 0,97 0,39 0,383 0,398

40 De este experimento, y la DE50 previamente determinada de cada compuesto individual contra cada línea celular, el índice de combinación se calculó como se muestra a continuación en el resumen experimental para cada mezcla de compuestos y línea celular usando el programa Calcusyn.

RESUMEN EXPERIMENTAL: A continuación sólo se describen algunos datos seleccionados del experimento completo. Ejemplo 4: Índices de combinación (IC) de AP-121 Fecha: 15 de agosto de 2006

LÍNEA CELULAR U87MG

COMBINACIÓN AP-121-TMZ

(1:40)

AP-121-CPT

(250:1)

AP-121-ADR

(100:1)

AP-121-Tarceva

(2:1)

AP-121-CH-11

(1:100)

Valores de IC a

DE50: DE75 DE90 MEDIA

0,477: 0,418 0,396 0,431

0,849: 0,652 0,502 0,668

0,945: 0,695 0,536 0,725

1,610: 1,985 2,460 2,018

1,328: 1,888 2,684 1,967

IC<0,5 0,5<IC<0,75 0,5<IC<0,75 IC>1,0 IC>1,0

Fecha: 24 de agosto de 2006

LÍNEA CELULAR U87MG

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,608 0,702 0,838 0,716 0,5<IC<0,75

(1:50)

AP-121-CPT

1,057 0,608 0,378 0,681 0,5<IC<0,75

(200:1)

AP-121-ADR

0,525 0,447 0,470 0,481 IC<0,5

(50:1)

AP-121-Tarceva

1,448 1,103 0,934 1,162 IC>1,0

(1:2)

Fecha: 7 de septiembre de 2006

Valores de IC a

COMBINACIÓN: DE50 DE75 DE90 MEDIA

AP-121-TMZ (1:50): 0,311 0,485 0,870 0,555

AP-121-CPT (250:1): 2,076 2,269 2,579 2,308

AP-121-ADR (50:1): 0,671 0,857 1,098 0,875

AP-121-Tarceva (1:2): 2,122 2,550 3,248 2,640

Fecha: 15 de agosto de 2006

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,659 0,216 0,073 0,316 IC<0,5

(1:10)

AP-121-CPT

0,554 0,378 0,284 0,405 IC<0,5

(250:1)

AP-121-ADR

0,622 0,472 0,402 0,499 IC<0,5

(50:1)

AP-121-Tarceva

1,157 0,662 0,406 0,742 0,5<IC<0,75 SINERGIA

(1:5)

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

Fecha: 24 de agosto de 2006

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,602 0,360 0,238 0,400 IC<0,5

(1:10)

AP-121-CPT

0,634 0,492 0,382 0,503 IC<0,5

(250:1)

AP-121-ADR

1,410 1,013 0,734 1,052 IC=1,0

(50:1)

AP-121-Tarceva

0,971 0,628 0,407 0,669 0,5<IC<0,75

(1:2) Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,529 0,463 0,480 0,491 IC<0,5

(1:10)

AP-121-CPT

0,893 0,874 0,872 0,880 IC<0,5

(250:1)

AP-121-ADR

0,770 0,767 0,775 0,771 IC<0,5

(50:1)

AP-121-Tarceva

0,612 0,589 0,588 0,596 0,5<IC<0,75

(1:5)

Fecha: 15 de agosto de 2006

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,756 0,595 0,560 0,637 0,5<IC<0,75

(1:40)

AP-121-CPT

0,541 16,227 613,210 209,992 IC>1,0

(2500:1)

AP-121-ADR

0,380 0,766 1,793 0,980 IC=1,0

(100:1)

AP-121-Tarceva

0,598 0,408 0,336 0,448 IC<0,5

(1:2)

AP-121-CH-11

0,561 1,038 2,089 1,230 IC>1,0

(1:100) Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,637 0,450 0,514 0,534 0,5<IC<0,75

(1:50)

AP-121-CPT

1,178 1,805 4,051 2,345 IC>1,0

(2000:1)

AP-121-ADR

0,804 0,381 0,222 0,469 IC<0,5

(50:1)

AP-121-Tarceva

2,498 1,561 1,717 1,925 IC>1,0

(1:2) Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

0,578 0,462 0,381 0,474 IC<0,5

(1:50)

AP-121-CPT

1,644 1,996 2,446 2,028 IC>1,0

(1000:1)

AP-121-ADR

1,231 1,025 0,857 1,038 IC=1,0

(50:1)

AP-121-Tarceva

1,391 0,949 0,677 1,005 IC=1,0

(1:5)

Fecha: 24 de agosto de 2006

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

4,735 5,368 6,090 5,397 IC>1,0

(1:50)

AP-121-CPT

29,352 16,143 9,274 18,256 IC>1,0

(10:1)

AP-121-ADR

1,944 2,691 3,732 2,789 IC>1,0

(5:1)

AP-121-Tarceva

6,529 6,744 7,022 6,765 IC>1,0

(1:10) Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA AP-121-TMZ

1,026 1,030 1,043 1,033 IC=1,0

(1:100)

AP-121-CPT

1,146 1,073 1,022 1,080 IC>1,0

(20:1)

AP-121-ADR

1,235 1,188 1,147 1,190 IC>1,0

(10:1)

AP-121-Tarceva

1,589 1,684 1,990 1,754 IC>1,0

(1:20)

Ejemplo 5: Índices de combinación de CH-11

COMBINACIÓN: DE50 Valores de IC a DE75 DE90 MEDIA

CH-11/TMZ (1:100) CH-11/CPT (71:1) CH-11/ADR (10:1) CH-11/Tarceva (1:2,5): 0,015 0,247 0,326 0,144 0,006 0,141 0,305 0,071 0,004 0,201 0,485 0,076 0,008 0,196 0,372 0,097 IC<0,5 IC<0,5 IC<0,5 IC<0,5

5

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

Fecha: 24 de agosto de 2006

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA CH-11/TMZ

SINERGIA

0,125 0,126 0,151 0,134 IC<0,5

(1:8)

FUERTE CH-11/CPT

0,872 2,992 10,439 4,768 IC>1,0

(143:1)

CH-11/ADR

0,831 1,430 2,477 1,579 IC>1,0

(26:1)

CH-11/Tarceva

0,608 0,636 0,683 0,643 0,5<IC<0,75

SINERGIA

(1:8)

Fecha: 1 de septiembre de 2006

ANTAGONISMO

ANTAGONISMO

Valores de IC a COMBINACIÓN DE50 DE75 DE90 MEDIA CH-11/TMZ

0,046 0,055 0,079 0,060 IC<0,5

(1:8)

CH-11/CPT

1,049 1,475 2,110 1,545 IC>1,0

(143:1)

CH-11/ADR

1,629 3,368 7,003 4,000 IC>1,0

(26:1)

CH-11/Tarceva

0,272 0,310 0,361 0,314 IC<0,5

(1:8)

Valores de IC a

COMBINACIÓN: DE50 DE75 DE90 MEDIA

CH-11/TMZ (1:100): 5,723 10,152 19,618 11,831 IC>1,0

CH-11/CPT (30:1): 7,937 6,804 6,764 7,168 IC>1,0

CH-11/ADR (10:1): 0,612 0,166 0,102 0,293 IC<0,5

CH-11/Tarceva (1:8): 0,708 0,163 0,144 0,338 IC<0,5

ANTAGONISMO

ANTAGONISMO

SINERGIA

FUERTE

SINERGIA

FUERTE

En otro análisis, los siguientes valores de CI50 (µM) se determinaron para las diferentes combinaciones de AP-121 empleadas.

Línea celular: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva Estado de mutación

U87MG: 8,5 0,04 425,2 0,11 854 5,9 p53no mut, pTEN-mut

A172: 4,6 0,02 38,3 0,07 >1000 18,8 p53no mut, pTEN-mut

LN-18: 1,3 0,04 553,5 0,09 <31,25 20 p53mut, pTEN-no mut

LN-229: 4,3 0,02 278,4 0,13 521,5 3,9 p53mut, pTEN-no mut

U118MG: 3,6 0,004 381,5 0,12 490,7 18,8 p53mut, pTEN-mut

T98G: 4,1 0,02 608,3 0,17 517,8 14,4 p53mut, pTEN-mut

Para el cálculo de los valores de CI50, las combinaciones de AP-121 administradas a las líneas celulares respectivas fueron del siguiente modo:

Combinaciones de U87MG

AP-121/: 1 250:1 1:40 100:1 1:100 2:1

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,625 0,0025 25 0,00625 62,5 0,3125

5: 1,25 0,005 50 0,0125 125 0,625

4: 2,5 0,01 100 0,025 250 1,25

3: 5 0,02 200 0,05 500 2,5

2: 10 0,04 400 0,1 1000 5

1: 20 0,08 800 0,2 2000 10

Combinaciones de A172

AP-121/: 1 250:1 1:10 50:1 1:200 1:5

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,3125 0,00125 3,125 0,00625 62,5 1,5625

5: 0,625 0,0025 6,25 0,0125 125 3,125

4: 1,25 0,005 12,5 0,025 250 6,25

3: 2,5 0,01 25 0,05 500 12,5

2: 5 0,02 50 0,1 1000 25

1: 10 0,04 100 0,2 2000 50

Combinaciones de LN-18

AP-121/: 1 20:1 1:100 10:1 1:100 1:20

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,15625 0,00781 15,625 0,01562 31,25 3,125

5: 0,3125 0,01562 31,25 0,03125 62,5 6,25

4: 0,625 0,03125 62,5 0,0625 125 12,5

3: 1,25 0,0625 125 0,125 250 25

2: 2,5 0,125 250 0,25 500 50

1: 5 0,25 500 0,5 1000 100

Combinación de LN-229

AP-121/: 1 200:1 1:50 50:1 1:100 1:1

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,3125 0,00156 15,625 0,00625 31,25 0,3125

5: 0,625 0,00313 31,25 0,0125 62,5 0,625

4: 1,25 0,00625 62,5 0,025 125 1,25

3: 2,5 0,0125 125 0,05 250 2,5

2: 5 0,025 250 0,1 500 5

1: 10 0,05 500 0,2 1000 10

Combinación de U118MG

AP-121/: 1 2500:1 1:40 100:1 1:50 1:2

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,625 0,00025 25 0,00625 31,25 1,25

5: 1,25 0,0005 50 0,0125 62,5 2,5

4: 2,5 0,001 100 0,025 125 5

3: 5 0,002 200 0,05 250 10

2: 10 0,004 400 0,1 500 20

1: 20 0,008 800 0,2 1000 40

Combinación de T98G

AP-121/: 1 200:1 1:100 25:1 1:100 1:5

Compuesto: AP-121 CPT TMZ ADR CH11 Tarceva

6: 0,3125 0,0015625 31,25 0,0125 31,25 1,5625

5: 0,625 0,003125 62,5 0,025 62,5 3,125

4: 1,25 0,00625 125 0,05 125 6,25

3: 2,5 0,0125 250 0,1 250 12,5

2: 5 0,025 500 0,2 500 25

1: 10 0,05 1000 0,4 1000 50

10 Resumen: Sinergia de AP-121 con compuestos adicionales con respecto al estado mutacional de las células usadas

Combinaciones de AP121 p53 PTEN línea celular

1 Sinergia/aditivo no mut mut U87MG, A172 2 Sinergia/aditivo/antagonista mut mut U118MG, T98G 3 Antagonista mut no mut LN229, LN18

Ejemplo 6. Matriz de datos de DE50 biológicos para el ligando de receptor y la molécula pequeña 15 A partir de estos datos, las siguientes matrices de datos A2 y A1 pueden derivarse usando los datos de DE50 respectivos para AP-121 y las mezclas de compuestos correspondientes:

Células/ED50, µM: AP-121 CPT+AP121 TMZ+AP121 ADR+AP121 Taroeva+AP121

U87MG A172 U118MG: 6,8 4,2 4,8 0,016 0,009 0,002 75,3 9,3 176 0,04 0,04 0,04 4,9 9,6 15,5

y para CH-11:

Células/DE50, µM: CH11 CPT+CH11 TMZ+CH11 ADR+CH11 Tarceva+CH11

U87MG A172 U118MG: 854 1055 320,6 0,007 0,007 0,004 4,1 1,7 83,6 0,026 0,025 0,02 0,54 3,3 4,6

Por consiguiente, las matrices normalizadas B2:

Células/DE50, µM: AP-121 CPT+AP121 TMZ+AP121 ADR+AP121 Tarceva+AP121

U87MG A172 U118MG: 1,00 0,62 0,71 1,00 0,56 0,13 0,43 0,05 1,00 1,00 1,00 1,00 0,32 0,62 1,00

y B1 se calculan:

Células/DE50, µM: CH11 CPT+CH11 TMZ+CH11 ADR+CH11 Tarceva+CH11

U87MG A172 U118MG: 0,81 1,00 0,30 1,00 1,00 0,57 0,05 0,02 1,00 1,00 0,96 0,77 0,12 0,72 1,00

A partir de B1 y B2 puede calcularse una matriz S de similitud promediando simplemente los valores de similitud 15 para cada compuesto o mezcla de compuestos por célula

Células/DE50, µM: similitud

U87MG: 0,85

A172: 0,80

U118MG: 0,78

similitud total:: 0,81

en la que un valor de similitud de 1,00 se corresponde con la mayor similitud posible y 0,00 con el menor solapamiento posible de actividad biológica.

20 En conjunto, los datos del Ejemplo 6 demuestran que usando el procedimiento según la presente invención, un anticuerpo agonista específico contra el receptor Fas CH-11 como ligando de receptor selectivo y AP-121 como mimético de ligandos de receptores putativo de moléculas pequeñas, además de varios compuestos adicionales en las mezclas de compuestos respectivas, pueden mostrar que el efecto biológico de AP-121 es similar al ejercido por

25 CH-11.

El mismo procedimiento de evaluación también puede aplicarse a las matrices de índices de combinación del Ejemplo 4 y 5 en lugar de las DE50 como efectos biológicos, que proporciona un valor de alta similitud de aproximadamente 0,6 entre CH-11 y AP-121.

30 Además, se observó un fuerte efecto sinérgico en las tres líneas celulares junto con temozolamida, la presente terapia convencional para glioblastoma multiforme y astrocitoma anaplásico.

Ejemplo 7:

Usando el procedimiento explicado brevemente en el Ejemplo 4 y 5 también se observó un fuerte efecto sinérgico para cisplatino (DDP)/AP-121 y gemcitabina (GMZ)/AP-121 en líneas de células de cáncer de pulmón no pequeño. DDP y GMZ se compraron ambos de Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EE.UU. Se usaron las siguientes líneas celulares: A549 (negativa para FAS), NCI-H460 (positiva para FAS) y HCC827 (positiva para FAS), todas obtenidas de ATTC, Rockville, MD, EE.UU.

A549: CI50 µM

IC: Relación DE50 DE75 DE90 Media de IC Efecto AP-121 GMZ DDP

AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi: 2500:1 5000:1 1000:1 1,778 1,542 1,343 48,906 18,706 7,465 200,939 68,248 23,399 1,6 25,0 97,5 Antagonismo Antagonismo Antagonismo 8 6 0,009 0,0006

AP-121-96 h

2000:1: 0,721 0,642 0,576 0,65 Sinergia

GMZ-48 h

GMZ-48 h-: Fuerte

1:2000: 0,290 0,286 0,284 0,29

AP-121-96h: sinergia

AP-121-48 h

GMZ-96 h GMZ-96 h: 2000:1 >100 >100 >100 >100 Antagonismo

AP-121-48 h AP-121-DDP: 1:2000 >100 >100 >100 >100 Antagonismo

combi AP-121-DDP: 1:3 54,199 217,923 886,111 386,1 Antagonismo Fuerte 8 155,4

combi AP-121-DDP: 1:5 0,231 0,386 0,652 0,42 sinergia Fuerte 6 12,7

combi AP-121-DDP: 1:10 0,200 0,336 0,570 0,37 sinergia 6 12,7

combi AP-121-DDP: 1:5 0,582 0,665 0,761 0,67 Sinergia 6,9 3,8

combi: 01:10 0,537 0,601 0,673 0,60 Sinergia 6,9 3,8

NCI-H460: CI50 µM

IC: Relación DE50 DE75 DE90 Media de IC Efecto AP-121 GMZ DDP

AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi: 20:1 50:1 250:1 7,954 4,248 2,002 5,736 2,696 1,605 4,182 1,793 1,391 6,0 2,9 1,7 Antagonismo Antagonismo Antagonismo 1,5 1,4 1,4 0,003 0,006

AP-121-96 hGMZ-48 h: 100:1 0,660 0,728 0,851 0,75 Sinergia

NCI-H460: CI50 µM

IC: Relación DE50 DE75 DE90 Media de IC Efecto AP-121 GMZ DDP

GMZ-48 hAP-121-96 h: 1:100 0,193 0,334 0,611 0,38 Fuerte sinergia

AP-121-48 h

100:1: 0,573 0,570 0,598 0,58 Sinergia

GMZ-96 h

GMZ-96 h

1:100: 0,776 0,742 0,726 0,75 Sinergia

AP-121-48 h

AP-121-DDP

combi AP-121-DDP: 1:3 1,966 2,138 2,325 2,1 Antagonismo 1,5 51,7

combi AP-121-DDP: 1:5 2,650 1,870 1,368 2,0 Antagonismo 1,4 2,5

combi AP-121-DDP: 1:10 2,372 1,785 1,373 1,8 g Antagonismo

combi AP-121-DDP: 1:5 0,860 0,822 0,786 0,82 Sinergia 2 1,3

combi: 1:10 0,881 0,852 0,824 0,85 Sinergia 2 1,3

HCC827: CI50 µM

IC: Relación DE50 DE75 DE90 Media de IC Efecto AP-121 GMZ DDP

AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi AP-121-GMZ combi: 20:1 10:1 50:1 0,967 1,912 3,780 19,894 2,935 0,493 28,988 3,856 0,805 2,2 7,8 11,2 Antagonismo Antagonismo Antagonismo 0,85 1,6 1,6 0,078 0,002

AP-121-96 h

100:1: 0,653 0,737 0,841 0,74 Sinergia

GMZ-48 h

GMZ-48 h-: Fuerte

1:100: 0,183 0,274 0,416 0,29

AP-121-96 h: sinergia

AP-121-48 h

100:1: 1,072 0,964 0,870 0,97 Aditivo

GMZ-96 h

GMZ-96 h

1:100: 0,743 0,532 0,383 0,55 Sinergia

AP-121-48 h

AP-121-DDP

combi AP-121-DDP: 1:5 2,696 3,172 3,735 3,2 Antagonismo 0,85 >50

combi AP-121-DDP: 1:10 0,668 0,668 0,667 0,67 Sinergia 1,6 3,4

combi AP-121-DDP: 1:50 0,566 0,627 0,695 0,63 Sinergia 1,6 3,4

combi: 1:10 1,348 1,150 0,981 1,16 Antagonismo 2,4 3,5

HCC827: CI50 µM

IC: Relación DE50 DE75 DE90 Media de IC Efecto AP-121 GMZ DDP

AP-121-DDP combi: 1:50 0,190 0,251 0,331 0,26 Fuerte sinergia 2,4 3,5

Ejemplo 8:

Se sabe que las líneas de células de cáncer de próstata expresan receptor FAS, que algunas de ellas no son

5 sensibles a FAS (O.W. Rokhlin y col., Cancer Res. 1997, 57: 1758-68). LNCaP es una línea de células de cáncer de próstata que tiene sensibilidad reducida a irradiación, mientras que el anticuerpo Fas agonista CH-11 sensibiliza células a apoptosis inducida por irradiación (K. Kimura y E.P. Gelmann, Cell Death and Differentiation 2002, 9: 972980; véase también el siguiente ejemplo). Por tanto, los inventores han realizado experimentos en animales inyectando células LNCaP en la próstata de ratones y, después del crecimiento tumoral, administraron AP-121 con diferentes dosis de 0-30 mg/kg de inyecciones intraperitoneales e irradiación concomitante.

En los animales tratados se observó un efecto dependiente de la dosis, reduciéndose los niveles de PSA (antígeno prostático específico) después de algunos días de tratamiento y encogimiento del tamaño del tumor después de una semana de tratamiento, que muestra la efectividad de AP-121 para imitar el efecto biológico del anticuerpo agonista

15 CH-11 en un experimento in vivo terapéuticamente relevante.

Ejemplo 9: Efectos de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina en el tratamiento de cáncer de próstata

El cáncer de próstata es un tipo de cáncer que se desarrolla en la próstata, una glándula en el aparato reproductor masculino. El cáncer de próstata se descubre casi siempre por examen físico o cribando análisis de sangre tales como el análisis de PSA (antígeno prostático específico). El análisis de PSA mide el nivel en sangre de antígeno prostático específico, una serina proteasa similar a calicreína. Su función normal es licuar el semen gelatinoso después de la eyaculación, permitiendo que los espermatozoides naveguen más fácilmente por el cuello uterino. Niveles de PSA superiores a aproximadamente 4 ng/ml se consideran globalmente indicativos de un riesgo de

25 desarrollar cáncer de próstata. Sin embargo, el PSA no es un análisis perfecto y así debe corroborarse por análisis adicionales tales como la detección de ARNm de PCA-3 asociado a células en la orina.

Los dos tratamientos más comunes para cáncer de próstata localmente avanzado o de alto riesgo son radioterapia (RT) y privación de andrógenos (AD), que es terapia hormonal.

Se investigaron, respectivamente, los efectos de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina sola y en combinación con RT, AD o RT+AD sobre el grado de muerte celular programada (apoptosis) y la supervivencia de células de cáncer de próstata.

35 Primero se midieron los efectos in vitro de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina, radiación (ionizante) y una combinación de las mismas sobre la muerte celular programada (apoptosis) y la tasa de supervivencia de células de adenocarcinoma de próstata humano sensible a andrógenos LNCaP. La línea celular LNCaP se estableció a partir de una lesión metastásica de adenocarcinoma. Las células se trataron con una concentración final de 1-O-octadecil2-O-metil-glicero-3-fosfocolina 10 µM y radiación (ionizante) correspondiente a una dosis absorbida de 5 unidades de Gray.

La apoptosis se determinó usando el ensayo Apo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7, Promega, Inc., Madison, WI, EE.UU., según las instrucciones del fabricante. El porcentaje de células tumorales vivas se estimó por medio de exclusión con colorante de azul de tripano como se ha descrito (Freshney, R.I. (1994) Culture of Animal Cells: A

45 Manual of Basic Technique. 3ª ed. Wiley-Liss. Nueva York. EE.UU.)

Las células se expusieron a radiación seis horas después (Fig. 1A), concomitantemente con (Fig. 1B) o seis horas antes de la administración de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina (Fig. 1C). El ensayo de caspasa se realizó 12 horas después de la exposición a radiación. Los datos respectivos mostrados representan el promedio de dos experimentos independientes.

Cuando 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina se administró seis horas antes de exponer las células a radiación, el tratamiento combinado produjo una supervivencia de sólo aproximadamente el 45% de las células tumorales en comparación con aproximadamente el 85% en los controles sin tratar. Por consiguiente, en las células

55 tratadas se observó un aumento significativo (> 2,5 veces) en la respuesta apoptósica (como se determina por ensayo de caspasa-3/7). El tratamiento individual con radiación o 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina produjo tasas de supervivencia intermedias de aproximadamente el 75% y aproximadamente el 60%, respectivamente (Fig. 1A).

En el caso de una administración concomitante de radiación y 1-O-octadecil-2-O-metilglicero-3-fosfocolina a las células se determinó que la tasa de supervivencia era aproximadamente el 55%, que está en el mismo intervalo que se observa para el tratamiento químico individual (aproximadamente el 50%). La exposición de las células sólo a radiación produjo una tasa de supervivencia de aproximadamente el 80%, que es comparable a los controles sin tratar (aproximadamente el 86%). Sorprendentemente, los resultados de los ensayos de caspasa-3/7 fueron

5 similares para el tratamiento individual y combinado (Fig. 1B).

Cuando 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina se administró seis horas después de exponer las células a radiación, el tratamiento combinado produjo una supervivencia de aproximadamente el 40% de las células, que está en el mismo intervalo que se observa para el tratamiento químico individual (aproximadamente el 45%). La

10 exposición de las células sólo a radiación produjo una tasa de supervivencia de aproximadamente el 70%. El grado de apoptosis observado aumentó aproximadamente el 25% en las células sólo expuestas a tratamiento químico con respecto a las células expuestas al tratamiento combinado (Fig. 1C).

Basándose en los resultados anteriores parece como si la administración de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3

15 fosfocolina antes de exponer las células a radiación produjera el efecto más significativo sobre las tasas de supervivencia de células y respuesta apoptósica.

En otro enfoque, 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina 10 µM (concentración final; “CHEM”) y radiación (ionizante) (5 unidades de Gray; “RT”) se administraron simultáneamente a las células LNCaP, pero el posterior 20 periodo de incubación se prolongó a 24 horas. La apoptosis se midió usando el ensayo Apo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7 como se ha descrito anteriormente y se expresó como unidades de fluorescencia relativa (UFR). El porcentaje de células apoptósicas se determinó por análisis de citometría de flujo de células teñidas positivas para anexina V-PE y teñidas negativas para 7-AAD (7-aminoactinomicina D) (ambos comprados de BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) según protocolos convencionales establecidos. Los resultados se resumen en la siguiente tabla.

25 Los datos representan medias ± EEM para tres experimentos independientes.

Tratamiento: % de células positivas para anexina V-PE Actividad de caspasa-3/7 (UFR)

Control: 3,6 ± 0,2 193 ±39

CHEM: 18,6 ± 1,0 580 ± 207

RT: 5,0 ± 0,6 242 ± 36

CHEM+RT: 31,7 ± 1,0* 1514 ± 102*

La significancia estadística de los resultados se calculó usando la ANOVA unidireccional, prueba de LSD. * p < 0,0001 en comparación con cada uno de los tratamientos individuales CHEM y RT, respectivamente.

30 El potenciamiento de la apoptosis en las células tratadas con “CHEM+RT” también se observó en células NCaP C42 y LNCaP-Res insensibles a andrógenos (datos no mostrados).

A continuación se investigó la interacción de la administración de 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina

35 (“CHEM”) y la privación de andrógenos (“PA”). Células LNCaP se privaron de andrógeno durante dos días por absorción con carbón vegetal de suero según procedimientos establecidos muy conocidos en la técnica. CHEM se añadió en una concentración final de 5 µM y 10 µM, respectivamente. Además, se probó si la adición del andrógeno sintético R1881 (“R1881”) dos días antes de la administración de CHEM produjo la inversión del efecto.

40 La apoptosis se midió usando el ensayo Apo-ONE™ Homogeneous Caspase-3/7 como se ha descrito anteriormente y se expresó como unidad de fluorescencia relativa (UFR). El porcentaje de células apoptósicas se determinó por tinción con anexina V-PE/7-AAD como se ha descrito anteriormente. El ensayo de caspasa-3/7 y la tinción con anexina se realizaron 22 horas después del tratamiento con CHEM. Los resultados se resumen en la siguiente tabla.

Contr.: 9,6 235

Contr. + CHEM 5 µM: 13,0 380

Contr. + CHEM 10 µM: 17,5 436

PA: 12,6 81

PA + CHEM 5 µM: 15,4 126

PA + CHEM 10 µM: 27,4 115

PA + R1881: 7,0 130

PA + R1881 + CHEM 5 µM: 14,6 453

PA + R1881 + CHEM 10 µM: 21,6 962

Como es evidente de los resultados anteriores, la administración de 1-O-octadecil-2-O-metilglicero-3-fosfocolina a células LNCaP privadas de andrógenos produjo un aumento significativo dependiente de la dosis en la respuesta apoptósica. Además, este efecto no se invirtió añadiendo un andrógeno sintético al medio antes del tratamiento con 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina.

Adicionalmente, en un estudio preliminar se investigaron los efectos in vivo de 1-O-octadecil-2-O-metilglicero-3fosfocolina, radiación (ionizante) y una combinación de las mismas sobre células LNCaP cultivadas ortotópicamente en las próstatas de ratones sin pelo (siete ratones/ grupo).

Se administró 1-O-octadecil-2-O-metil-glicero-3-fosfocolina intraperitonealmente en una dosis de 30 mg/kg de peso corporal/día administrada intraperitonealmente durante 15 días (Fig. 2A; actualmente están en marcha estudios usando diferentes vías de administración tales como por vía oral o por sonda nasogástrica). La radiación (ionizante) se corresponde con una dosis absorbida de 5 unidades de Gray administrada en el día 7 (Fig. 2B). El tratamiento combinado se ilustra en la Fig. 2C. El crecimiento tumoral se evaluó determinando el nivel en suero del antígeno prostático específico (PSA) usando un kit de prueba comercialmente disponible, además del volumen tumoral por medio de resonancia magnética nuclear.

Como puede apreciarse, el tratamiento combinado produjo una disminución significativa de los niveles en suero de PSA con respecto a cualquier tratamiento individual (“PBS” representa solución salina tamponada con fosfato) que demuestra que los resultados in vitro también pueden transferirse a un entorno in vivo.

La presente invención descrita ilustrativamente aquí puede ponerse en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente desvelados aquí. Así, por ejemplo, los términos “que comprende”, “que incluye”, “que contiene”, etc., deben leerse ampliamente y sin limitación. Adicionalmente, los términos y expresiones empleados aquí se han usado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Así, debe entenderse que, aunque la presente invención se ha desvelado específicamente por realizaciones preferidas y características opcionales, modificaciones y variaciones de las invenciones plasmadas en las mismas desveladas aquí pueden ser recurridas por aquellos expertos en la materia, y que tales modificaciones y variaciones se consideran que están dentro del alcance de la presente invención.

La invención se ha descrito ampliamente y genéricamente aquí. Cada una de las especies y agrupaciones subgenéricas más estrechas que se encuentran dentro de la divulgación genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier materia del género, independientemente de si el material suprimido se cita o no específicamente aquí.

Otras realizaciones están dentro de las siguientes reivindicaciones. Además, si las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, aquellos expertos en la materia reconocerán que la invención también se describe así en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para determinar si una molécula pequeña es una sustitución funcional para un ligando de proteína

o péptido de un receptor celular en el tratamiento de enfermedades en las que la modulación de este receptor conducirá a un efecto terapéutico, procedimiento que comprende:

medir los efectos biológicos de tanto el ligando de proteína o de péptido como la molécula pequeña sobre un panel de al menos 3 líneas celulares permanentes y/o líneas primarias diferentes que expresan dicho receptor celular; y a condición de que los efectos biológicos sobre este panel de células de ambos compuestos sean cualitativamente similares, guardando relación los resultados con la presencia cuantitativa del receptor celular en la célula respectiva del panel.
2.

El procedimiento según la reivindicación 1, en el cual los efectos biológicos de tanto la molécula pequeña como el ligando de receptor de proteína o péptido sobre el panel de células se miden individualmente y en combinación.
3.

El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el cual los efectos biológicos de tanto la molécula pequeña como el ligando de receptor de proteína o péptido se miden en presencia de al menos un compuesto adicional, en el cual el al menos un compuesto adicional está seleccionado del grupo que consiste en una proteína, un péptido o una molécula pequeña.
4.

El procedimiento según la reivindicación 3, en el cual los efectos biológicos de tanto la molécula pequeña como el ligando de receptor de la proteína o péptido, además de sus combinaciones respectivas con el al menos un compuesto adicional, son similares.
5.

El procedimiento según la reivindicación 4, en el cual determinar la similitud de los efectos biológicos de los compuestos medidos comprende una matriz de datos biológicos de al menos tres líneas celulares y/o líneas primarias y al menos tres compuestos, medidos individualmente y/o en combinaciones de dos y/o combinaciones de tres o más compuestos, y en el cual la similitud entre la molécula pequeña y el ligando de receptor de la proteína o péptido se calcula a partir de esta matriz de datos biológicos.
6.

El procedimiento según la reivindicación 5, en el cual la similitud de la molécula pequeña y el ligando de receptor como se calcula a partir de la matriz de datos biológicos es mayor que un umbral para diferenciar combinaciones a posteriori al azar a partir de compuestos terapéuticamente útiles y/o combinaciones de compuestos.
7.

El procedimiento según la reivindicación 3, que comprende además: determinar si la combinación de la molécula pequeña con el al menos un compuesto adicional produce un efecto biológico sinérgico.
8.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual la molécula pequeña es un fosfolípido, y en particular AP-121.
9.

El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el cual el ligando de la proteína o péptido es un ligando de receptor FAS seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo FAS agonista y una proteína de unión a FAS.
10.

El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además identificar una molécula pequeña como activador del receptor FAS, que comprende:

medir los efectos de tanto un ligando de proteína o péptido del receptor FAS como una molécula pequeña sobre un panel de al menos 3 líneas celulares permanentes y/o líneas primarias diferentes con diferentes niveles de expresión del receptor FAS, en el cual los efectos biológicos respectivos sobre este panel de células de ambos compuestos son cualitativamente similares y establecen directamente una correlación con la presencia cuantitativa del receptor FAS en la célula respectiva del panel.
11.

El procedimiento según la reivindicación 10, en el cual los efectos biológicos de tanto la molécula pequeña como el ligando de proteína o péptido del receptor FAS son cada uno medidos solos y en combinación con al menos un compuesto adicional, siendo dicho compuesto una proteína, un péptido u otra molécula pequeña.
12.

El procedimiento según la reivindicación 11, en el cual la molécula pequeña es AP-121 y el al menos un compuesto adicional está seleccionado del grupo de agentes antitumorales que consiste en 16-aza-epotilona B, aldesleucina, amifostina, aranosa, bevacizumab, bleocina, bleomicina, BMS-184476, bortezomib, calcitriol, camptotecina, canertinib, canfosfamida, capecitabina, carboplatino, carmustina, cefixima, ceftriaxona, celecoxib, celmoleucina, cetuximab, ciclosporina, cisplatino, clodronato, ciclofosfamida, citarabina, dasitinib, deoxorubicina, desoxiepotilona B, dietilestilbestrol, diflomotecan, docetaxel, doxorubicina, edatrexato, efaproxiral, EKB-569, epirubicina, epratuzumab, erlotinib, etopósido, exatecan, fludarabina, fluorouracilo, ácido folínico, galarubicina, gefinitib, gemcitabina, gemtuzumab, gimatecan, glufosfamida, granisetron, homoharringtonina, ácido hialurónico,

ibandronato, ibritumomab, ifosfamida, imatinib, interferón alfa, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, irinotecan, isoflavona, isotretinoína, ixabepilona, ketoconazol, lapatinib, leflunomida, lenograstim, leucovorin, lexidronam, linezolid, lometrexol, lurtotecan, MEN10755, melfalan, metrotrexato, mitomicina, neridronato, neuradiab, nimesulida, nitroglicerina, 06-bencilguanina, omeprazol, ortataxel, oxaliplatino, paclitaxel, patupilona, pegfilgrastim, pelitinib,

5 pemetrexed, pentostatina, perifosina, plevitrexed, ácido poliprenoico, quinupristina, raloxifeno, raltitrexed, ramosetron, ácido retinoico, risedronato, rituximab, rofecoxib, rubitecan, S-9788, sabarubicina, sargramostim, satraplatino, SN-38, sorafenib, ácido suberanilohidroxámico, sutent, tamoxifeno, taxotero, tazaroteno, tegafur, temozolamida, tesmilifeno, tetrodotoxina, talidomida, tipifarnib, topotecan, trabectedin, trastuzumab, traszutumab, treosulfan, tretinoína, vatalanib, vincristina, vinorelbina, ZD-6474, zoledronato y zosuquidar.
13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el cual la molécula pequeña es AP-121 y el al menos un compuesto adicional está seleccionado del grupo de agentes antivíricos que consisten en 3TC, abacavir, adefovir dipivoxil, aciclovir, amprenavir, amantadina, amoxovir, AZT, clevudina, delavirdina, d4T, emtricitabina, entecavir, famciclovir, ganciclovir, indinavir, lamivudina, nelfinavir, nevirapina, oseltamavir, rimantadina, ritonavir, saquinavir,

15 septrina, telbivudina, tenofovir, valaciclovir, valtorcitabina, valopicitabina o zanamivir.
14. El procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, que comprende además:

medir el efecto biológico de la combinación de AP-121 con el al menos un compuesto adicional; y 20 determinar si un efecto biológico sinérgico está afectado por dicha combinación sobre el panel de células.

actividad de caspasa

FIG. 1 A

sola umol/ml umol/ml+RT

FIG. 1 (Cont.)

C

actividad de caspasa