ES2389285T3 - Péptidos bioactivos cortos y procedimientos para su uso - Google Patents

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Abstract

Un peptido aislado, en el que la secuencia de aminoacidos del peptido consiste en la SEC ID No 43, SEC ID No20, SEC ID No 25, SEC ID No 26, SEC ID No 35, SEC ID No 39, SEC ID No 81, SEC ID No 91, SEC ID No 92, SEC IDNo 129 o la SEC ID No 138.

Description

Péptidos bioactivos cortos y procedimientos para su uso
5 Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional de EE.UU. con número de serie 60/279.505; presentada el 28 de marzo de 2001 y sobre la solicitud pendiente de patente de EE.UU. con número de serie 09/820,053 presentada el 28 de marzo de 2001.
Campo de la invención
La invención se refiere a péptidos de longitud corta que contienen los residuos aminoacídicos de fenilalanina, leucina, alanina y lisina (F, L, A, y K; “péptidos FLAK”) en su secuencia primaria. En concreto, se divulgan los
15 péptidos FLAK que tienen actividades antimicrobianas, antifúngicas, anticancerosas y otras actividades biológicas deseables.
Antecedentes de la invención
Tanto en la literatura científica como en las patentes concedidas se han comunicado varios péptidos bioactivos. Históricamente, los péptidos se han aislado de fuentes naturales y recientemente han sido objeto de estudios de relación estructura-función. Adicionalmente, los péptidos naturales han servido como puntos de partida para el diseño de análogos peptídicos sintéticos.
25 En R.EW. Hancock in 1997 (Lancet 349: 418-422) se publicó una revisión de antibióticos peptídicos. 418-422). Se debatieron la estructura, la función y las aplicaciones clínicas de varias clases de péptidos. En 1998 se publicó una revisión adicional de antibióticos peptídicos catiónicos (Hancock, R.EW. y Lehrer, R. Trends Biotechnol. 16: 82-88). Normalmente, los péptidos son moléculas antipáticas de 12 a 45 aminoácidos de longitud. Los péptidos permeabilizan las membranas celulares que conducen al control de agentes microbianos. El potencial clínico de los péptidos catiónicos de defensa del huésped fue debatido por R.EW. Hancock en 1999 (Drugs 57(4): 469-473; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(6): 1317-1323). Se debaten las propiedades antibacterianos, antifúngicos, antivirales, anticancerosas y de cicatrización de heridas de la clase de péptidos.
Se han publicado revisiones de las características estructurales de los péptidos antimicrobianos helicales y sus
35 supuestos mecanismos de acción (véase, por ejemplo, Dathe, M. y Wieprecht, T. Biochimica-et Biophysica Acta 1462: 71-87 (1999); Epand, R.M. y Vogel H.J. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 11-28 (1999)). Los parámetros estructurales que se cree que son capaces de modular la actividad y la selectividad incluyen la helicidad, el momento hidrofóbico, la hidrofobicidad, el ángulo delimitado por las superficies de la hélice hidrofílica/hidrofóbica y el cambio.
Se han notificado una amplia selección de péptidos en alfa-hélice naturales. Los siguientes son representativos de las muchas referencias en el campo.
Las cecropinas son una familia de péptidos en α-hélice aislados de insectos. Las cecropinas se conocen por sus
45 propiedades antibacterianas, como se describen en las patentes de EE.UU. Nº 4,355,104 y4,520,016. EN general, las cecropinas tienen actividad contra bacterias gramnegativas, pero no contra todas las bacterias gramnegativas. Se descubrió que las cecropinas no tenían actividad contra las células eucarióticas (Andreu, y col., Biochemistry 24: 163-188 (1985); Boman, y coI., Developmental and Comparative Immunol. 9: 551-558 (1985); Steiner y coI., Nature
292: 246-248 (1981 )). Las cecropinas de Drosophila y Hyalphora se presentaron como que tienen actividad contra varias cepas de hongos (Ekengren, S. y Hultmark, D., Insect Biochem. y Molec. BioI. 29: 965-972 (1999)). Se ha comunicado que la cecropina A del mosquito Aedes aegypti es diferente de la mayoría de las cecropinas de insectos en cuanto a que carece de triptófano y de amidación en C-terminal (Lowenberger, C. y coI., J. BioI. Chem. 274 (29): 20092-20097 (1999)).
55 Las ranas del género Rana producen una amplia selección de péptidos antimicrobianos en su piel (Goraya, J. y col., Eur. J. Biochem. 267: 894-900 (2000)). Se notificaron péptidos tan cortos como de 13 aminoácidos y se agruparon en familias estructurales. Las secuencias mostraron poca o ninguna identidad de secuencia con los péptidos aislados de ranas de otros generales, tales como los péptidos magainina y dermaseptina.
La patente de EE.UU. Nº 5,962,410 divulgó la inhibición de patógenos eucarióticos y la estimulación de linfocitos y fibroblastos con péptidos líticos tales como cecropinas y sarcotoxinas. Varios péptidos presentados incluyen cecropina B, cecropina SB-37, cecropina A, cecropina D, Shiva-1, lepidopteran, sarcotoxina 1A, sarcotoxina 1B, y sarcotoxina 1C.
65 Reed, W.A. y col., Transgenic Res. 6: 337-347 (1997) notificaron ratones transgénicos productores del péptido lítico de clase cecropina Shiva 1. La infección de los ratones transgénicos con una exposición a Brucella abortus tuvo como resultado una reducción del número de bacterias respecto a la infección de ratones no transgénicos.
La magainina es un péptido en α-hélice de 23 aminoácidos aislado de la piel de la rana africana Xenopus laevis (Zasloff M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 5449-5453 (1987).
5 En las células sanguíneas de oveja, seres humanos, ganado vacuno, cerdos, ratones y conejos se encuentran péptidos en α-hélice de 23 a 28 aminoácidos asociados con catelina (Zanetti, M. y coI., FEBS Lett. 374: 1-5 (1995)).
Las actividades antimicrobianas de la buforina II, la cecropina P1, la indolicidina, la magainina II, la nisina y la ranalexina fueron comunicadas por Giacomette, A. y col., (Peptides 20: 1265-1273 (1999)). Los péptidos mostraron las actividades variables contra bacterias y levaduras.
Se han preparado y analizado varios péptidos sintéticos tanto in vitro como in vivo.
15 La patente de EE.UU. Nº 5,861,478 ha divulgado péptidos líticos sintéticos de aproximadamente 20 a 40 aminoácidos que adoptan una conformación en α-hélice. Los péptidos son eficaces en el tratamiento de las infecciones microbianas, heridas y cáncer. Los péptidos divulgados incluyen cecropina B, SB-37*, LSB-37, SB-37, Shiva 1 y 10-12, péptido señal de β-fibrina, Manitou 1-2, Hecato 1-3, Anubis 1-5 y 8, y Vishnu 1-3 y 8.
El Baghian, A. y col. describió hecato como un análogo peptídicos sintético de melitina (Peptides 18(2): 177-183 (1997)). Los péptidos difieren en la distribución de su carga, pero no en su conformación en alfa-hélice antipática. El hecato inhibió el virus del herpes simple (HSV-1), mientras que no afecta de forma adversa al crecimiento celular y la síntesis de proteínas.
25 Los péptidos sintéticos D2A21, D4E1, D2A22, D5C, D5C1, D4E y D4B se describieron en Schwab, U. y col., to Antimicrob. Agents and Chemotherapy 43(6): 1435-1440 (1999). Se presentaron las actividades contra varias cepas bacterianas.
Juvvadi, P. y col. (J. Peptide Res. 53: 244-251 (1999)) prepararon y analizaron los péptidos híbridos hechos de péptidos de cecropina y melitina. Los híbridos se sintetizaron para investigar los efectos de la secuencia, la dirección del enlace amida (dipolo de hélice), la carga, la anfipaticidad y la hidrofobicidad sobre la capacidad de formación de canales y sobre la actividad antibacteriana. Se ha sugerido que la secuencia y la dirección del enlace amida son requisitos estructurales importantes para la actividad de los híbridos.
35 Un híbrido de melitina de abeja-cecropina de insecto de 26 aminoácidos, y análogos de los mismos, se describieron en un estudio de resistencia a sales (Friedrich, C. y coI., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(7): 1542-1548 (1999)). Se descubrió que un residuo de triptófano en la segunda posición era crucial para la actividad. Se encontró que cambios modestos en la secuencia conducían a cambios sustanciales en las propiedades de los péptidos.
Se han publicado los efectos de los residuos de prolina sobre las propiedades antibacterianas de los péptidos en αhélice (Zhang,
L. y coI., Biochem. 38: 8102-8111 (1999)). Se ha comunicado que la adición de prolinas cambiaba las propiedades de inserción en la membrana y la sustitución de una única prolina puede cambiar un péptido antimicrobiano en una toxina.
45 Se preparó una serie de péptidos que tienen entre 18 y 30 aminoácidos con el fin de analizar los efectos de los cambios en la secuencia y la carga sobre las propiedades antibacterianas (Scott, M.G., y col., Infect. lmmun. 67(4): 2005-2009 (1999)). No se encontró ninguna correlación significativa entre la carga o la hidrofobicidad y la actividad antimicrobiana de los péptidos. Se encontró como tendencia general que los péptidos cortos eran menos activos que los péptidos largos, aunque los autores expresaron que este efecto sería, probablemente, dependiente de la secuencia.
Las “modelinas”, un grupo de péptidos sintéticos, se prepararon y analizaron para comparar las relaciones entre secuencia y estructura (Bessalle, R. y col. Med. Chem. 36: 1203-1209 (1993)). Los péptidos de 16 y 17 aminoácidos
55 que tienen caras opuestas hidrofóbicas e hidrofílicas eran altamente hemolíticos y antibacterianos. Los péptidos más pequeños tendían a tener actividades biológicas menores.
Se encontró que un péptido híbrido de cecropina-melitina y un péptido amidado de platija protegían al salmón de infecciones producidas por Vibrio anguillarum in vivo (Jia, X. y coI., Appl. Environ. Microbiol. 66(5): 1928-1932 (2000)). Se usaron bombas osmóticas para liberar una dosis continua de cualquiera de los péptidos en el pez.
Se ha comunicado que los péptidos antipáticos son capaces de potenciar la cicatrización de heridas y estimular el crecimiento de fibroblastos y queratinocitos in vivo (patentes de EE.UU. Nº 6.001.805 y 5.561.107). Se ha notificado la preparación de plantas transgénicas que expresan péptidos líticos como una proteína de fusión con ubiquitina
65 (patente de EE.UU. Nº 6,084,156). Se ha notificado la preparación de péptidos líticos ricos en lisina metilada, que muestran una resistencia proteolítica mejorada (patente de EE.UU. Nº 5,717,064).
Aunque existe una serie de péptidos naturales y sintéticos, existe la necesidad de mejores péptidos bioactivos y procedimientos para su uso.
Sumario de la invención
5 Se divulgan péptidos cortos (es decir, de no más de 23 aminoácidos de longitud) que contienen residuos aminoacídicos de fenilalanina, leucina, alanina y lisina en su secuencia primaria. Los péptidos muestran actividades biológicas antibacterianas, antifúngicas, anticancerosas y también producen estimulación y proliferación de fibroblastos y linfocitos humanos.
Descripción de los listados de secuencias
Los siguientes listados de secuencias forman parte de la presente especificación y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a una 15 o más de estas secuencias en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Tabla 1
SEC ID Nº
Nombre P-No Secuencia primaria
Hecato AC #1010
1 FALALKALKKALKKLKKALKKAL-COOH
2
Hecato AM 2 FALALKALKKALKKLKKALKKAL-NH2
3
S8-37 AG#1 018 5 MPKWKVFKKIEKVGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALGGOOH
4
Shiva 10 AM 11 FAKKLAKKLKKLAKKLAKLALAL-NH2
5
S8-37 AM 12 MPKWKVFKKIEKVGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALGNH2
6
Shiva 10 AG #1015 13 FAKKLAKKLKKLAKKLAKLALAL-GOOH
7
Magainina 2 16 GIGKFLHSAKKFGKAFVGGIMNS-NH2
8
FLAK01 AM 23 FALAAKALKKLAKKLKKLAKKAL-N H2
9
FLAK03 AM 24 FALALKALKKLLKKLKKLAKKAL-N H2
10
FLAK04 AM 25 FALALKALKKLAKKLKKLAKKAL-NH2
11
FLAK05 AM 26 FALAKLAKKAKAKLKKALKAL-N H2
12
FLAK06 AM 27 FALALKALKKLKKALKKAL-NH2
13
FLAK06 AG 28 FALALKALKKLKKALKKAL-GOOH
14
FLAK06 R-AG 29 FAKKLAKKLKKLAKLALAL-GOOH
15
KALV 30 VALALKALKKALKKLKKALKKAL-NH2
16
FLAK 17 AM 34 FALALKKALKALKKAL-NH2
17
FLAK 26 AM 35 FAKKLAKLAKKLAKLAL-N H2
18
FLAK 25 AM 36 FAKKLAKLAKKLAKLALAL-N H2
19
Hecato 20Ac 37 FALALKALKKAL-(O)-K-(O)-KLKKALKKAL-GOOH
20
FLAK43 AM 38 FAKKLAKLAKKLLAL-NH2
21
FLAK44AM 39 FAKKLAKLAKKALAL-N H2
22
FLAK62 AM 40 FALAKKALKKAKKAL-N H2
23
FLAK 06R-AM 41 FAKKLAKKLKKLAKLALAK-NH2
24
MSI-78 AM 42 GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK-NH2
25
FLAK50 43 FAKLLAKLAKKLL-N H2
26
FLAK51 44 FAKKLAKLALKLAKL-NH2
27
FLAK57 45 FAKKLAKKLAKLAL-NH2
28
FLAK71 46 FAKKLKKLAKLAKKL-N H2
29
FLAK?? 47 FAKKALKALKKL-NH2
30
FLAK50V 48 VAKLLAKLAKKLL-N H2
-31
FLAK50F 49 FAKLLAKLAKKL-N H2
32
FLAK26V AM 50 VAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2
33
GAME-15 53 KWKLFKKIGAVLKVL-NH2
34
FLAK50G 54 FAKLLAKLAKKAL-NH2
35
FLAK500 55 FAKLLAKALKKLL-N H2
36
FLAK50E 56 FAKLLKLAAKKLL-N H2
37
FLAK80 57 FAKLLAKKLL-NH2
38
. FLAK81 58 FAKKLAKALL-NH2
39
FLAK82 59 FAKKLAKKLL-NH2
40
FLAK83M 60 FAKLAKKLL-NH2
41
FLAK 26 Ac 61 FAKKLAKLAKKLAKLAL-GOOH
42
Indolicidina 63 ILPWKWPWWPWRR-NH2
43
FLANK 17G 64 FAKALKALLKALKAL-NH2
44
FLAK50H 65 FAKLLAKLAKAKL-NH2
SEC ID Nº
Nombre P-No Secuencia primaria
45
FLAKSOG 66 FAKLLAKLAKLKL-N H2
46
Shiva Oeriv P69+KWKL 70 FAKKLAKKLKKLAKKLAKKWKL-NH2
47
Shiva 10 (1-18 AG) 71 FAKKLAKKLKKLAKKLAK-GOOH
48
Shiva 10 péptido 71 +KWKL 72 FAKKLAKKLKKLAKKLAKKWKL-GOOH
49
GA(1-7)Shiva10(1-16) 73 KWKLFKKKTKLFKKFAKKLAKKL-NH2
50
FLAK 54 74 FAKKLAKKLAKAL-N H2
51
FLAK 56 75 FAKKLAKKLAKLL-NH2
52
FLAK 58 76 FAKKLAKKLAKAAL-N H2
53
FLAK 72 77 FAKKLAKKAKLAKKL-N H2
54
FLAK 75 79 FAKKLKKLAKKL-NH2
55
Shiva 10 (1-16) Ac 80 KTKLFKKFAKKLAKKLKKLAKKL-GOOH
56
GA(1-7)Shiva10 (1-16)-GOOH 81 KWKLFKKKTKLFKKFAKKLAKKL-GOOH
57
Indolocidina-ac 91 ILPWKWPWWPWRR-GOOH
58
FLAK50B FAKALAKLAKKLL-NH2
59
FLAK50J 93 FAKLLAKLAKKAA-NH2
60
FLAK501 94 FAKLLALALKLKL-NH2
61
FLAK50K 95 FAKLLAKLAKAKA-NH2
62
FLAK50L 96 FAKLLAKLAKAKG-NH2
63
Shiva-11 98 FAKKLAKKLKKLAKKLAKLALALKALALKAL-NH2
64
Shiva 11 [(1-16)ME (2-9]-GOOH 99 FAKKLAKKLKKLAKKLlGAVLKV-GOOH
65
FLAK50N 101 FAKLLAKALKLKL-N H2
66
FLAK 500 102 FAKLLAKALKKAL-NH2
67
FLAK50P 103 FAKLLAKALKKL-N H2
68
GA (1-&Hecato (11/23) 104 KWKLFKKALKKLKKALKKAL-N H2
69
PYL-ME 105 KIAKVALAKLGIGAVLKVLlTGL-NH2
70
FLAG26-01 106 FAKKLAKLAKKL-NH2
71
Vishnu3 107 MPKEKVFLKIEKMGRNIRN-NH2
72
Melitina 108 GIGAVLKVLTIGLPALISWIKRKRQQ-NH2
73
FLAK26-02 109 FAKKLAKLAKKLAKAL-NH2
74
FLAG26-03 110 FAKKLLAKALKL-N H2
75
FLAK50 Q1 111 FAKFLAKFLKKAL-NH2
76
FLAK50 Q2 112 FAKLLFKALKKAL-N H2
77
FLAK50 Q3 113 FAKLLAKFLKKAL-N H2
78
FLAK50 Q4 114 FAKLLAKAFKKAL-NH2
79
FLAK50 Q5 117 FAKLFAKAFKKAL-NH2
80
FLAK50 Q6 118 FAKLLAKALKKFL-N H2
81
FLAK50 Q7 119 FAKLLAKALKKFAL-NH2
82
FLAK50 Q8 120 FAKLLAKLAKKFAL-NH2
83
FLAK50 Q9 121 FAKLFAKLAKKFAL-NH2
84
FLAK50 Q10 122 FKLAFKLAKKAFL-NH2
85
FLAK50 T1 123 FAKLLAKLAK-NH2
86
FLAK50 T2 124 FAKLLAKLAKKVL-NH2
87
FLAK50 T3 125 FAKLLAKLAKKIL-NH2
88
FLAK50 T4 126 FAKLLAKLAKKEL-NH2
89
FLAK50 T5 127 FAKLLAKLAKKSL-NH2
90
FLAK90 128 FAKLA-NH2
91
FLAK91 129 FAKLF-NH2
92
FLAK92 130 KAKLF-NH2
93
FLAK93 131 KWKLF-NH2
94
FLAK50 Z1 132 FGKGIGKVGKKLL-NH2
95
FLAK50 Z2 133 FAFGKGIGKVGKKLL-NH2
96
FLAK50 Z3 134 FAKAIAKIAFGKG IGKVGKKLL-N H2
97
FLAK50 Z4 135 FAKLWAKLAFGKGIGKVGKKLL-NH2
98
FLAK50 Z5 136 FAKLWAKLAKKL-NH2
99
FLAK50 Z6 137 FAKGVGKVGKKAL-NH2
100
FLAK50 Z7 138 FAFGKGIGKIGKKGL-NH2
101
FLAK50 Z8 139 FAKIIAKIAKIAKKILNH2
102
FLAK50Z9 140 FAFAKIIAKIAKKII-NH2
103
FLAK94 141 FALALKA-NH2
104
FLAK93B 142 KWKLAKKALALL-NH2
SEC ID Nº
Nombre P-No Secuencia primaria
105
FLAK50 Z10 143 FAKHAKIAKKI-NH2
106
FLAK96 144 FALALKALKKAL-N H2
107
FLAK97 145 FALKALKK-NH2
108
FLAK98 146 KYKKALKKLAKLL-NH2
109
FKRLA 147 FKRLAKIKVLRLAKIKR-NH2
110
FLAK91 B 148 FAKLAKKALAKL-NH2
111
FLAK92B 149 KAKLAKKALAKLL-NH2
112
FLAK99 150 KLALKLALKALKAAKLA-NH2
113
FLAK50T6 151 FAKLLAKLAKK-NH2
114
FLAK5077 152 FAKLLAKLAKKGL-N H2
115
FLAK95 153 FALKALkKLKKALKKAL-NH2
116
FLAK50TB 154 VAKLLAKLAKKVL-NH2
117
FLAK50T9 155 YAKLLAKLAKKAL-NH2
118
FLAK100-C02H 156 KLLKLLLKLYKKLLKLL-COOH
119
FAGVL 157 FAVGLRAIKRALKKLRRGVRKVAKOL-NH2
120
Modelina-5 159 KLAKKLAKLAKLAKAL-N H2
121
Modelina-5-C02H 160 KLAKKLAKLAKLAKAL-COOH
122
Modelina-8 161 KWKKLAKKW-NH2
123
Modelina-8-C02H 162 KWKKLAKKW-COOH
124
Modelina-1 163 KLWKKWAKKWLKLWKAW-NH2
125
Modelina-1-C02H 164 KLWKKWAKKWLKLWKA-COOH
126
FLAK120 165 FALALKALKKL-NH2
127
FLAK121 166 FALAKALKKAL-NH2
128
FLAK96B 167 FALALKLAKKAL-N H2
129
FLAK96G 168 FALLKL-NH2
130
FLAK96F 169 FALALKALKK-NH2
131
FLAK96C 170 FALKALKKAL-NH2
132
FLAK960 171 FALLKALKKAL-NH2
133
Modelina-8B 172 KWKK-NH2
134
Modelina-8C 173 KWKKL-NH2
135
Modelina-80 174 KFKKLAKKF-NH2
136
Modelina-8E 175 KFKKLAKKW-NH2
137
Flak 96 176 FALALKALKKA-NH2
138
Flak 961 177 FALLKALLKKAL-NH2
139
Flak 96J 178 FALALKLAKKL-NH2
140
Flak 96L 179 LKKLAKLALAF-NH2
141
FLAK-120G 180 VALALKALKKL-N H2
142
FLAK-1200 181 FALALKLKKL-NH2
143
FLAK-120C 182 FALALKAKKL-N H2
144
FLAK-120B 183 FALA-NH2
145
FLAK-120F 184 WALAL-NH2
146
Magainina2wisc 300 GIGKFLHAAKKFAKAFVAEIMNS-NH2
147
02A21 301 FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF-NH2
148
KSL-1 302 KKWFKVKPK-NH2
149
KSL-7 303 FKVKFKVKVK-NH2
150
LSB-37 306 LPKWKVFKKIEKVGRNIRNGIVKAGPAIAVLGEAKALGNH2
151
Anubis-2 307 FAKKLAKKLKKLAKKLAKLAKKL-N H2
152
FLAK17CV 501 VAKALKALLKALKAL-N H2
153
FLAK50Q1V 502 VAKFLAKFLKKAL-N H2
154
02A21 V 503 VAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF-NH2
155
FLAK25AMV 504 VAKKLAKLAKKLAKLALAL-N H2
156
FLAK43AMV 505 VAKKLAKLAKKLLAL-N H2
157
FLAK500V 506 VAKLLAKALKKLL-N H2
158
HECATO AMV 507 VALALKALKKALKKLKKALKKAL-N H2
159
HECATO ACV 508 VALALKALKKALKKLKKALKKAL-COOH '
160
FLAK04AMV 509 VALALKALKKLAKKLKKLAKKALNH2
161
FLAK03AMV 510 VALALKALKKLLKKLKKLAKKAL-N H2
162
O-Shiva 10 AC 67 (O)-FAKKLAKKLKKLAKKLAKLALAL-COOH
163
Shiva 11 AC 100 FAKKLAKKLKKLAKKLAKLALALKALALKA-COOH
164
Shiva 10 (1-18)AM 69 FAKKLAKKLKKLAKKLAK-NH2
165
FLAK50M 97 FAKLLALALKKAL-N H2
Descripción detallada de la invención
En general, la invención está dirigida a los péptidos que tienen propiedades biológicas deseables y su uso. Es sorprendente que los péptidos son eficaces debido a su corta longitud en comparación con otros péptidos descritos 5 en la técnica.
Péptidos
Una realización de la invención está dirigida a un péptido aislado, en el que la secuencia aminoácido del péptido consiste en las SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 35, SEC ID Nº 39, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 91, SEC ID Nº 92, SEC ID Nº 129 o la SEC ID Nº 138.
Preferentemente, la secuencia del péptido es la SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 129, SEC ID Nº 91 o la SEC ID Nº 92.
15 La divulgación también se refiere a péptidos que pueden ser similares a cualquiera de los péptidos descritos anteriormente y, preferentemente, son similares a la SEC ID Nº 25 o la SEC ID Nº 43 según se determine mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad entre los péptidos es, preferentemente, de al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El porcentaje de identidad se determina usando una alineación de secuencia mediante el producto comercial CLUSTALW. El número de aminoácidos alineados se dividen por la longitud del péptido más corto y el resultado se multiplica por 100 % para determinar el porcentaje de identidad. Si la longitud del péptido más corto es menos de 10 aminoácidos, el número de aminoácidos alineados se divide por 10 y el resultado y se multiplica por 100 % para determinar el porcentaje de identidad.
25 Los péptidos pueden comprender aminoácidos D o L. Los péptidos pueden comprender todos los aminoácidos D. Los péptidos pueden tener un extremo C ácido (-CO2H) o un extremo C amida (-CONH2, -CONHR, o -CONR2).
Procedimientos de uso
Una realización adicional de la invención está dirigida hacia el uso de los péptidos descritos anteriormente como un medicamento. El uso, preferentemente, no produce lesiones ni mata las células de mamífero no infectadas normales. El uso a dosis terapéuticas, preferentemente, no produce lesiones ni mata las células de mamífero no infectadas normales o no neoplásicas. El uso puede implicar el uso de un único péptido o puede implicar el uso de múltiples péptidos.
35 Una realización de la invención es el uso de los péptidos descritos anteriormente para inhibir o matar células microbianas (microorganismos). Los microorganismos pueden ser células bacterianas, células fúngicas, protozoos, virus o células eucarióticas infectadas con microorganismos patogénicos. En general, el procedimiento está dirigido al contacto de microorganismos con el péptido. La etapa del contacto se puede realizar in vivo, in Vitro, tópicamente, oralmente, transdérmicamente, sistémicamente o mediante cualquier otro procedimiento conocido para los expertos en la técnica. Preferentemente, la etapa de contacto se realiza a una concentración suficiente para inhibir o matar los microorganismos. La concentración del péptido puede ser al menos aproximadamente 0,1 μM, al menos aproximadamente 0,5 μM, al menos aproximadamente 1 μM, al menos aproximadamente 10 μM, al menos aproximadamente 20 μM, al menos aproximadamente 50 μM, al menos aproximadamente 100 μM.
45 Los procedimientos de uso pueden estar dirigidos hacia la inhibición o destrucción de microorganismos tales como bacterias, bacterias grampositivas, bacterias gramnegativas, micobacterias, levaduras, hongos, algas, protozoos, virus y organismos intracelulares. Ejemplos específicos incluyen, entre otros, Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Chlamydia, Candida albicans, Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trypanosoma cruzi o Plasmodium falciparum. La etapa de contacto se puede realizar mediante inyección sistémica, inyección oral, subcutánea, IP, IM, inyección IV o mediante aplicación tópica. Para inyección, la dosis puede estar entre cualquiera de las concentraciones siguientes: aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, and aproximadamente 100 mg/kg. La etapa de contacto se puede realizar en un mamífero, un gato, un perro, una vaca, un caballo, un cerdo, un ave, un pollo, una planta, un
55 pez o un ser humano.
Los péptidos útiles para aplicaciones antibacterianos incluyen las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 15, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 23, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 27, SEC ID Nº 28, SEC ID Nº 30, SEC ID Nº 31, SEC ID Nº 32, SEC ID Nº 34, SEC ID Nº 35, SEC ID Nº 36, SEC ID Nº 41, SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 45, SEC ID Nº 46, SEC ID Nº 50, SEC ID Nº 51, SEC ID Nº 52, SEC ID Nº 55, SEC ID Nº 56, SEC ID Nº 57, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 60, SEC ID Nº 65, SEC ID Nº 66, SEC ID Nº 67, SEC ID Nº 68, SEC ID Nº 74, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 80, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 84, SEC ID Nº 86, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 93, SEC ID Nº 106, SEC ID Nº 108, SEC ID Nº 112, SEC ID Nº 115, SEC ID Nº 126, SEC ID Nº
65 128, SEC ID Nº 162, SEC ID Nº 163, SEC ID Nº 164 y la SEC ID Nº 165.
Los péptidos útiles para aplicaciones antifúngicas incluyen las SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 30, SEC ID Nº 35, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 66, SEC ID Nº 67, SEC ID Nº 80, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 84, SEC ID Nº 85, SEC ID Nº 86, SEC ID Nº 106, SEC ID Nº 108, SEC ID Nº 115, SEC ID Nº 116, SEC ID Nº 126, SEC ID Nº 128, SEC ID Nº 131, SEC ID Nº 143,
5 SEC ID Nº 163 y la SEC ID Nº 165.
Los péptidos descritos anteriormente se pueden usar para inhibir o matar las células cancerosas. En general, el procedimiento está dirigido al contacto de las células cancerosas con el péptido. La etapa del contacto se puede realizar in vivo, in Vitro, tópicamente, oralmente, transdérmicamente, sistémicamente o mediante cualquier otro procedimiento conocido para los expertos en la técnica. Preferentemente, la etapa de contacto se realiza a una concentración suficiente para inhibir o matar las células cancerosas. La concentración del péptido puede ser de al menos aproximadamente 0,1 µM, al menos aproximadamente 0,5 µM, al menos aproximadamente1 µM, al menos aproximadamente10 µM, al menos aproximadamente 20 µM, al menos aproximadamente 50 µM, o al menos aproximadamente100 µM. En general, las células cancerosas pueden ser cualquier tipo de células cancerosas. Las 15 células cancerosas pueden ser sarcomas, linfomas, carcinomas, leucemias, células de cáncer de mama, células de cáncer de colon, células de cáncer de piel, células de cáncer de ovarios, células de cáncer cervical, células de cáncer testicular, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de próstata y células de cáncer de piel. La etapa de contacto se puede realizar mediante inyección subcutánea, inyección IP, inyección IM, inyección IV, inyección directa en el tumor o aplicación tópica. Para inyección, la dosis puede estar entre cualquiera de las concentraciones siguientes: aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 1.mg/Kg, aproximadamente 5 mg/kg aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg and aproximadamente 100 mg/kg. La etapa de contacto se puede realizar en un mamífero, un gato, un perro, una vaca, un caballo, un cerdo, un ave, un pollo, una planta, un pez o un ser humano. La inhibición de las células cancerosas puede ser, en general, cualquier inhibición del crecimiento de las células cancerosas en comparación con las células
25 cancerosas sin tratamiento peptídico. Preferentemente, la inhibición es de al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e idealmente 100 % de inhibición del crecimiento. La inhibición se puede conseguir mediante lisis de las células cancerosas o por otros medios. El péptido inhibidor de cáncer se puede usar sinérgicamente con otros agentes quimioterapéuticos contra el cáncer.
Los péptidos útiles para aplicaciones anticancerosas incluyen las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 18, SEC ID Nº 19, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 29, SEC ID Nº 30, SEC ID Nº 32, SEC ID Nº 35, SEC ID Nº 46, SEC ID Nº 51, SEC ID Nº 56, SEC ID Nº 57, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 60, SEC ID Nº 68, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 86, SEC ID Nº 152 y la SEC ID Nº 162.
35 Un procedimiento para promocionar la estimulación y/o proliferación de células puede comprender poner en contacto las células y una composición, en el que la composición comprende un péptido. El péptido puede ser cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. La concentración del péptido en la composición puede ser de aproximadamente 0,01 µM a aproximadamente 500 µM, aproximadamente 0,1 µM a aproximadamente 100 µM, aproximadamente 1 µM a aproximadamente 5.0µM, o aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM. En general, las células pueden ser cualquier tipo de células y, preferentemente, son células de mamífero, incluidas específicamente, entre otras, fibroblastos y leucocitos, incluidas linfocitos y fagocitos. La estimulación y/p proliferación metabólica de las células aumenta en al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 % o 200 % respecto a las mismas células que no están en
45 contacto con la composición. La composición puede comprender además un factor de crecimiento. Las propiedades de estimulación y proliferación de algunos de los péptidos FLAK son prometedoras para su aplicación en el cuidado de la piel, la cicatrización de heridas y en la inmunomodulación de sistemas inmunitarios de mamífero comprometidos.
Los péptidos útiles para aplicaciones de estimulación y proliferación incluyen las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 15, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 27, SEC ID Nº 28, SEC ID Nº 30, SEC ID Nº 32, SEC ID Nº 34, SEC ID Nº 45, SEC ID Nº 46, SEC ID Nº 50, SEC ID Nº 51, SEC ID Nº 55, SEC ID Nº 56, SEC ID Nº 57, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 59, SEC ID Nº 60, SEC ID Nº 61, SEC ID Nº 65, SEC ID Nº 66, SEC ID Nº 71, SEC ID Nº
55 74, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 80, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 90, SEC ID Nº 91, SEC ID Nº 92, SEC ID Nº 108, SEC ID Nº 115, SEC ID Nº 116, SEC ID Nº 126, SEC ID Nº 127, SEC ID Nº 129, SEC ID Nº 132, SEC ID Nº 137, SEC ID Nº 138, SEC ID Nº 139, SEC ID Nº 140, SEC ID Nº 141, SEC ID Nº 142, SEC ID Nº 143, SEC ID Nº 144, SEC ID Nº 145, SEC ID Nº 159, SEC ID Nº 162, SEC ID Nº 164 y la SEC ID Nº 165.
Un procedimiento para estimular la cicatrización de heridas de la piel o tejidos del organismo oculares o internos dañados por el envejecimiento normal, enfermedad, lesiones o mediante cirugía u otros procedimientos médicos puede comprender administrar en la herida de un animal una composición, en la que la composición comprende cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. La concentración del péptido en la composición puede ser de aproximadamente 0,01 µM a aproximadamente 500 µM, aproximadamente 0,1 µM a aproximadamente 100 µM, 65 aproximadamente 1 µM a aproximadamente 50.0µM, o aproximadamente 1 µM a aproximadamente 10 µM. La composición se puede administrar en la herida por vía tópica o mediante liberación sistémica. En general, el animal
puede ser cualquier tipo de animal, preferentemente es un mamífero y, más preferentemente, es un ser humano, una vaca, un caballo, un gato, un perro, un cerdo, una cabra o una oveja. La estimulación de la cicatrización de heridas es, preferentemente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 % o 200 % respecto a la misma herida que no está en contacto con la composición.
5 Los péptidos útiles para aplicaciones de cicatrización de heridas incluyen las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 8, SEC ID Nº 10, SEC ID Nº 11, SEC ID Nº 12, SEC ID Nº 13, SEC ID Nº 14, SEC ID Nº 15, SEC ID Nº 16, SEC ID Nº 17, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 27, SEC ID Nº 28, SEC ID Nº 30, SEC ID Nº 32, SEC ID Nº 34, SEC ID Nº 45, SEC ID Nº 46, SEC ID Nº 50, SEC ID Nº 51, SEC ID Nº 55, SEC ID Nº 56, SEC ID Nº 57, SEC ID Nº 58, SEC ID Nº 59, SEC ID Nº 60, SEC ID Nº 61, SEC ID Nº 65, SEC ID Nº 66, SEC ID Nº 71, SEC ID Nº 74, SEC ID Nº 75, SEC ID Nº 77, SEC ID Nº 80, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 87, SEC ID Nº 90, SEC ID Nº 91, SEC ID Nº 92, SEC ID Nº 93, SEC ID Nº 115, SEC ID Nº 116, SEC ID Nº 126. “SEC ID Nº 129 y la SEC ID Nº: 138.
La potenciación aditiva o sinérgica de la actividad de un agente terapéutico puede comprender preparar una
15 composición, en la que la composición comprende un péptido y un agente terapéutico. Como alternativa, la potenciación aditiva o sinérgica de la actividad de un agente terapéutico puede comprender co-terapia con un péptido (o péptidos) usado junto con otros agentes terapéuticos. El péptido puede ser cualquiera de los péptidos descritos anteriormente. En general, el agente terapéutico puede ser cualquier agente terapéutico y es, preferentemente, un antibiótico, un agente antimicrobiano, un factor de crecimiento, un agente quimioterapéutico, un agente antimicrobiano, lisozima, un agente quelante o EDTA. Preferentemente, la actividad de la composición es mayor que la actividad de la misma composición que contiene el agente terapéutico pero que carece del péptido. La composición o co-terapia se puede usar en aplicaciones in vitro, in vivo, tópica, oral, IV, IM, IP o transdérmica. La estimulación de la activación de la composición que contiene el agente terapéutico y el péptido es, preferentemente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 % o 200 % respecto a
25 la actividad del agente terapéutico solo.
En general, se prefiere cualquier péptido que es activo de forma autónoma contra una diana para usar para incrementar, de forma aditiva o sinérgica, la actividad de otro agente terapéutico contra la diana. Si hay varios péptidos candidatos para una aplicación de sinergia dada, los péptidos menos tóxicos se considerarían más favorablemente.
Los péptidos de la presente invención descritos anteriormente se pueden usar en el tratamiento de los pacientes con un diagnóstico de fibrosis quística (FQ), dichas infecciones pulmonares a menudo son caudadas por P. aeruginosa. La FQ produce, entre otros efectos, inflamación e infección de los pulmones. Los péptidos de la invención pueden
35 poseer propiedades antiinflamatorias, lo que les convierte en útiles para el tratamiento de las infecciones pulmonares en pacientes con FQ. El péptido se puede administrar al paciente con FQ mediante cualquier procedimiento aceptable, incluyendo inhalación o liberación sistémica. El péptido se puede administrar en una única dosis, en múltiples dosis o como liberación continua.
Muchas de las especies fúngicas responsables de enfermedades de transmisión sexual (ETS) son inhibidas y destruidas por los péptidos de la invención descritos anteriormente. Ejemplos de dichas especies incluyen C. albicans, C. glabrata y C. tropicalis. Los péptidos de la invención se pueden usar adicionalmente contra otros agentes responsables de ETS, incluidos virus y bacterias. Los péptidos se pueden administrar al paciente con ETS mediante cualquier procedimiento aceptable, tal como liberación tópica, oral o sistémica. El péptido se puede
45 administrar en una única dosis, en múltiples dosis o como liberación continua. El péptido se puede administrar por cualquier forma aceptable, tal como una crema, gel o líquido.
Los péptidos de la invención tienen actividad contra las bacterias aisladas de granos de acné, Propionibacterium acnes, y pueden además poseer propiedades antiinflamatorias. El péptido puede estar presente en una composición terapéutica clínica o en una composición cosmética. El péptido se puede administrar por cualquier forma aceptable, tal como una crema, gel o líquido. El péptido se puede administrar por cualquier forma aceptable, tal como administración tópica. El péptido se puede usar en un procedimiento de tratamiento o de un modo preventivo para reducir o eliminar futuros brotes de acné.
55 Se ha demostrado que los péptidos de la invención estimulan el colágeno y los fibroblastos y que estimulan la cicatrización de heridas. La inclusión de los péptidos de la invención en formulaciones cosméticas puede ser útil en los mercados anti-envejecimiento y rejuvenecimiento.
Los péptidos de la invención tienen una potencia elevada contra las bacterias más asociadas con las infecciones de heridas. S. aureus, S. pyogenes y P. aeruginosa. Los péptidos también estimulan la cicatrización de heridas y la reducción de la inflamación. El péptido se puede administrar por cualquier forma aceptable, tal como una crema, gel o líquido. El péptido se puede administrar por cualquier forma aceptable, tal como administración tópica o administración sistémica.
65 Los ejemplos siguientes se han incluido para demostrar las formas de realización preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención y, por tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. No obstante, los expertos en la técnica deberían, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en las formas de realización específicas que se divulgan y seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin desviarse del alcance de la invención tal como se
5 expone en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cepas microbianas
10 En la tabla siguiente se enumeran los diversos microorganismos usados a lo largo de los Ejemplos.
Tabla 2
Microorganismo
Referencia o fuente
Escherichia coli
ATCC25922
Staphylococcus aureus
ATCC6538 y ATCC25923
Pseudomonas aeruginosa
ATCC9027 y ATCC27853
Staphylococcus intermedius
ATCC19930 y ATCC20034
Cy ida albicans
ATCC10231
Escherichia coli UB 1005
D. Clark, FEMS Microb. Lett. 21:189-195,1984
Salmonella typhimurium 14028S
Fields y coI., Science243: 1059-1 062, 1989
Staphylococcus aureus SAP0017
Aislamiento clínico resistente a meticilina del Prof. 1 Chow,Vancouver General hospital
Staphylococcus epidermidis C621
Aislamiento clínico de David. Speer
Streptococcus pyogenes
ATCC19615
Streptococcus pyogenes M76
Del Prof. R. Gallo (UCSD)
Streptococcus pneumoniae
ATCC6305-C718
Streptococcus pneumoniae
ATCC49619-C719
Pseudomonas aeruginosa H187
Angus, y col., AAC 21 :299-309, 1982
Pseudomonas aeruginosa H374 (nfxB efflux mutant)
Masuda, N., y col., AAC, 36: 1847-1851, 1992
Pseudomonas aeruginosa H744 nalB mutante de eflujo con multiples resistencias
Poole, K., y col. J. Bacteriol. 175-7363-7372, 1993
Pseudomonas aeruginosa 100609
Cepa resistente a tobramicina del Prof. D. Woods (U. Calgary)
Pseudomonas aeruginosa 105663
Cepa resistente a tobramicina del Prof. D. Woods (U. Calgary)
Candida albicans 105
Del Prof Barbara Dill (UBC)
Candida guilliermondii
ATCC8492
Candida tropicalis
ATCC13803
Candida glabrata
ATCC15126
Propionibacterium acnes
ATCC6919
Propionibacterium acnes
ATCC11827
Acinetobacter baumannii
ATCC19606
15 Ejemplo 2: Ensayos antimicrobianos I
Los datos para el siguiente ensayo antimicrobiano de los péptidos se han obtenido realizando mediciones de la DO en experimentos de cultivo celular in vitro con y sin péptido añadido. El protocolo usado es el siguiente.
20 Las líneas celulares incluyeron Staphylococcus aureus ATCC 6538 o 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
o 27853. Los medios usados fueron medio con antibiótico 3 (Difco), medio con antibiótico 2 (Difco) y solución salina al 0,85 %. Los controles usados fueron solución salina fisiológica y gentamicina a 50, 25, 10, 5,1 y 0,1 ppm.
25 La preparación de todos los medios, soluciones madre u diluciones se produjo en una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Las células bacterianas se cultivaron en fresco en agar con medio antibiótico 2 inclinado (pH 7,0 a 25 ºC). Las bacterias se suspendieron y diluyeron en medio antibiótico 3 hasta aproximadamente 104 ufc/ml y se usaron como inóculo. Las soluciones de muestra (100 μl/pocillo) se añadieron a las placas de acuerdo con la distribución de la placa. Se añadió el inóculo (100 μl/pocillo) hasta alcanzar una concentración final de 5 x 103 ufc/ml.
30 Los controles negativos recibieron 100 µl de solución salina y 100 µl de medio de crecimiento. Los controles positivos recibieron 100 µl de solución salina y 100 µl de inóculo. Las placas bacterianas se incubaron a 37 ºC durante 24 horas.
La absorbancia se leyó a 620 nm tras agitación a las células resuspendidas. La concentración mínima inhibitoria (CMI) se definió como la concentración de péptido más baja que inhibe completamente el crecimiento del organismo de ensayo.
5 El ensayo de levaduras se realizó en medio RPMI 1640 (pH 7,0 a 25° C).
Los datos presentados en la Tabla 3 se obtuvieron usando el protocolo anterior. No obstante, los datos para la Tabla 4 se obtuvieron con un protocolo modificado, en el que el medio fue caldo de soja con tristona, la fuerza del inóculo fue de aproximadamente 104 UFC por ml y los valores determinados fueron concentraciones mínimas bactericidas
10 (CMB) o concentraciones mínimas fungicidas (CMF).
La tabla 3 siguiente describe las propiedades antimicrobianas de los péptidos medidas como los valores de CMI o CMF en µg/ml. Staph6538 es Staphylococcus aureus, número de registro en la ATCC 6538; paerug9027 es Pseudomonas aeruginosa número de registro en la ATCC 9027, la levadura es Saccharomyces cerevisiae. 15 Tabla 3
NDmbre
SEC ID Nº Número P staph6538 paerug9027 Levad ura
Hecato AC # 1010
1 1 5 10 >
Hecato AM
2 2 25 100 25
SB-37 AC # 1018
3 5 100 50. >
SB-37 AM
5 12 > 100 >
Shiva 10AC#1015
6 13 10 > >
FLAK01 AM
8 23 5 50 100
FLAK04 AM
10 25 10 5 25
FLAK05 AM
11 26 10 15 >
FLAK06 AM
12 27 10 10 25
KALV
15 30 > > ND
FLAK 17 AM
16 34 5 50 25
FLAK 26 AM
17 35 5 200 25
Hecato 2DAc
19 37 5 100 50
FLAK43 AM
20 38 5 50 50
FLAK44AM
21 39 100 25 100
FLAK62 AM
22 40 100 25 100
FLAK 06R-AM
23 41 10 10 ND
MSI-78 AM
24 42 10 > 200
FLAK50
25 43 5 100 25
FLAK51
26 44 5 5 50
FLAK57
27 45 5 100 100
FLAK71
28 46 10 5 50
FLAK77
29 47 200 100 50
FLAK50V
30 48 5 5 25
FLAK50F
31 49 10 200 50
FLAK26V AM
32 50 5 15 50
CAME-15
33 53 5 15 50
FLAK50C
34 54 5 50 50
FLAK500
35 55 200 5 25
FLAK50E
36 56 200 5 50
FLASK80
37 57 100 200 200
FLAK81
38 58 100 100 200
FLAK82
39 59 > > >
FLAK83M
40 60 200 100 200
FLAK 17 C
43 64 5 > 200
FLAK 50H
44 65 15 50 200
FLAK 50G
45 66 5 50 100
Shiva deriv P69+KWKL
46 70 10 > 100
Shiva 10 (1-18_AC
47 71 15 15 200
CA(1-7)Shiva10(1-16)
49 73 50 15 100
FLAK 54
50 74 15 5 100
FLAK 56
51 75 5 5 50
FLAK 58
52 76 10 100 200
NDmbre
SEC ID Nº Número P staph6538 paerug9027 Levad ura
FLAK 72
53 77 200 100 200
FLAK 75
54 79 100 200 100
Shiva 10(1-16) Ac
55 80 10 100 100
CA(1-7)Shiva10(1-16)-COOH
56 81 10 > >
Undolocidin-ac
57 91 10 > >
FLAK50B
58 92 5 5 50
FLAK501
60 94 10 > >
FLAK50K
61 95 100 200 >
FLAK50L
62 96 > > >
Shiva-11
63 98 > > >
Shiva 11 [(1-16)ME(2-9)]-COOH
64 99 100 > >
FLAK 50N
65 101 10 25 100
FLAK 500
66 102 5 10 50
FLAK 50P
67 103 10 25 100
CA(1-&Hecato(11/23)
68 104 10 10 200
PYL-ME
69 105 200 200 >
FLAG26-01
70 106 100 25 100
Vishnu3
71 107 > > >
Melitina
72 108 5 > 25
FLAK26-02
73 109 > 200 200
FLAG26-03
74 110 > 200 200
FLAK50 Q1
75 111 5 100 200
FLAK50 Q2
76 112 50 200 100
FLAK50 Q3
77 113 10 200 200
FLAK50 Q4
78 114 50 15 100
FLAK50 Q5
79 117 100 200 200
FLAK50 Q6
80 118 10 100 100
FLAK50 Q7
81 119 50 25 50
FLAK50 Q8
82 120 50 200 200
FLAK50 Q9
83 121 50 > 100
FLAK50 T1
85 123 50 200 100
FLAK50 T2
86 124 5 100 100
FLAK50 T3
87 125 10 100 50
FLAK50 T4
88 126 > > >
FLAK50 T5
89 127 100 25 100
FLAK90
90 128 > 100 200
FLAK91
91 129 100 25 100
FLAK92
92 130 200 200 200
FLAK93
93 131 25 10 100
FLAK50 Z1
94 132 > 100 >
FLAK50 Z2
95 133 > > >
FLAK50 Z3
96 134 100 > 200
FLAK50 Z4
97 135 15 10 50
FLAK50 Z5
98 136 100 50 100
FLAK50 Z6
99 137 > > >
FLAK50 Z7
100 138 > > >
FLAK50 Z8
101 139 50 25 200
FLAK50 Z9
102 140 > > >
FLAK94
103 141 15 50 200
FLAK93B
104 142 100 50 100
FLAK50 Z10
105 143 100 50 200
FLAK96
106 144 5 50 50
FLAK97
107 145 200 100 200
FLAK98
108 146 10 10 50
FKRLA
109 147 5 5 200
FLAK91 B
110 148 > 200 200
FLAK92B
111 149 50 100 200
FLANK99
112 150 100 10 >
FLAK50T6
113 151 > > 200
NDmbre
SEC ID Nº Número P staph6538 paerug9027 Levad ura
FLAK50T7
114 152 100 50 100
FLAK95
115 153 5 25 100
FLAK50T8
116 154 100 100 50
FLAK50T9
117 155 > > >
FLAK100-C02H
118 156 15 > >
FAGVL
119 157 200 > >
FLAK120
126 165 10 25 25
FLAK121
127 166 > > >
FLAK96B
128 167 10 25 100
FLAK96G
129 168 50 100 >
FLAK96F
130 169 100 100 100
FLAK96C
131 170 200 100 100
FLAK960
132 171 25 50 100
FLAK 96
137 176 > > >
FLAK 96J
139 178 200 100 >
FLAK 96L
140 179 50 50 100
FLAK-120G
141 180 200 > >
FLAK-1200
142 181 100 200 100
FLAK-120C
143 182 > > >
FLAK-120B
144 183 200 100 200
FLAK-120F
145 184 25 100 100
FLAK 50M
165 97 5 50 50
> indica más de 200 µg/ml; ND = ND determinado
En la tabla 4 siguiente se describen las propiedades antimicrobianas de los péptidos medidas como las concentraciones mínimas bactericidas o mínimas fungicidas (Candida). Los valores de CMB o CMF están en µg/ml.
E. coli es Escherichia coli, número de registro en la ATCC 25922; P. aerug es Pseudomonas aeruginosa, número de registro en la ATCC 27853, S. aur. es Staphylococcus aureus, número de registro en la ATCC 25923; Candida es Candida albicans, número de registro en la ATCC 10231
Tabla 4
SEC ID Nº
Nº P E. coli A.25922 P.aerug A.27853 S. aur A.25923 Candida A.1 0231
1
1
25 30 25 >50
2
2
25 10 25 >50
3
5 50 >60 40 ND
4
11 40 25 25 >50
5
12 50 >60 75 ND
6
13 8 15 30 >50
8
23 15 25 30 >50
9
24 >80 30 >40 >50
10
25 40 30 40 >50
11
26 >80 >40 >40 >50
12
27 10 8 8 >50
13
278 40 10 >40 >40
14
27C 10 4 >40 >40
15
30 10 15 40 >50
16
34 15 15 40 >40
17
35 8 8 10 >40
18
36 30 15 10 >40
19
37 8 8 40 >50
20
38 15 30 15 ND
21
39 >40 >40 >40 ND
22
40 30 40 >40 ND
23
41 40 40 40 ND
24
42 10 30 10 ND
25
43 8 15 4 15
26
44 10 55 30 >50
27
45 30 40 80 >50
29
47 >50 >50 >50 >50
SEC ID Nº
Nº P E. coli A.25922 P.aerug A.27853 S. aur A.25923 Candida A.1 0231
30
48 8 25 4 10
31
49 40 30 50 30
32
50 50 25 25 >50
33
53 15 15 10 30
34
54 15 40 15 30
35
55 4 10 4 25
36
56 50 10 55 30
37
57 >50 >50 >50 >50
38
58 >50 >50 >50 >50
39
59 >50 >50 >50 >50
40
60 >50 >50 >50 >50
41
61 4 50 >80 >40
42
63 10 50 15 60
43
64 10 30 4 >50
44
65 >55 >50 >55 >50
45
66 40 50 30 40
46
70 40 30 40 >50
47
71 50 40 >50 >50
48
72 >50 40 >50 >50
50
74 >55 50 >55 >55
51
75 40 30 >55 30
52
76 40 >55 >55 >50
53
77 >50 >50 >50 >50
54
79 >50 >50 >50 >50
55
80 30 15 >50 >50
58
92 40 25 15 25
59
93 >50 >50 >50 >50
60
94 >50 >50 >50 >50
61
95 >50 >50 >50 >50
62
96 >50 >50 >50 >50
65
101 300 >50 >50 40
66
102 25 30 25 15
67
103 30 30 >50 25
69
105 25 >50 ND >50
70
106 50 >50 ND >50
71
107 ND >50 >50 >50
72
108 >50 >50 25 >50
73
109 ND ND 80 >50
74
110 8 >50 >50 >50
75
111 30 ND 40 INACT
76
112 30 INACT INACT INACT
77
113 INACT INACT INACT 40
79
117 INACT INTACT INACT INACT
80
118 8 25 10 25
81
119 15 30 4 25
82
120 INACT INACT INACT INACT
83
121 INACT INACT INACT 50
84
122 30 30 25 15
85
123 40 INACT INACT 25
86
124 10 40 8 15
87
125 40 40 INACT 40
88
126 INACT INTACT INACT INACT
89
127 INACT INACT INACT INACT
90
128 INACT INACT INACT INACT
91
129 INACT INACT INACT INACT
92
130 INTACT INACT INACT INACT
93
131 INACT INACT INACT INACT
94
132 INACT INACT INACT INACT
95
133 INACT INACT INTACT INACT
96
134 INACT INACT INACT INACT
SEC ID Nº
Nº P E. coli A.25922 P.aerug A.27853 S. aur A.25923 Candida A.1 0231
97
135 INACT 40 INACT 25
98
136 INACT INACT INACT INACT
99
137 INACT INACT INACT INACT
100
138 INACT INACT INACT INACT
101
139 INACT INACT INACT INACT
102
140 INACT INACT INACT INACT
103
141 INACT INACT INACT INACT
104
142 INACT INACT INACT INACT
105
143 INACT INACT INACT INACT
106
144 10 25 25 25
107
145 INACT INACT INACT 100
108
146 10 >250 75 10
109
147 25 75 >250 >250
110
148 150 >250 >250 100
111
149 150 >250 >250 100
112
150 75 >250 >250 50
113
151 >250 >250 >250 100
114
152 150 150 >250 50
115
153 10 25 .5 25
116
154 50 100 >250 25
117
155 >250 >250 >250 >250
118
156 100 >250 >250 >250
119
157 75 >250 >250 >250
120
159 10 10 >250 50
121
160 >250 >250 >250 >250
122
161 150 >250 >250 25
123
162 50 >250 >250 100
124
163 25 50 25 25
125
164 25 25 25 25.
126
165 10 25 25 10
127
166 >250 >250 >250 >250
128
167 25 >250 10 25
129
168 75 100 >250 150
130
169 200 >250 >250 75
131
170 25 >250 150 25
132
171 75 100 >250 50
133
172 >250 >250 >250 >250
134
173 >250 >250 >250 150
162
67 25 30 30 >50
165
97 25 >50 25 25
INACT se refiere a ausencia de actividad detectable. ND indica ND hay datos disponibles
Ejemplo 3: Ensayos antimicrobianos II
La actividad antimicrobiana contra un abanico más amplio de patógenos (incluidas cepas clínicas) que se analizó en 5 el Ejemplo 2. Cabe destacar que para los ensayos en el Ejemplo 2 y el Ejemplo 3 se usaron protocolos algo diferentes.
Para este ejemplo se determinaron las CMI usando una versión ligeramente modificada del procedimiento de microdilución en caldo del NCCLS (National Committee for Clinical laboratory Standards) como se ha descrito 10 anteriormente (Steinberg y col., AAC41: 1738,1997). Brevemente, los agentes antimicrobianos se prepararon como concentrados 10X en el disolvente más adecuado. Para el péptido se usó ácido acético al 0,01 % que contiene 0,2 % de seroalbúmina bovina como proteína transportadora. Los inóculos se prepararon resuspendiendo las colonias de un BAP en medio y ajustando la suspensión para que concordara con la de un patrón de McFarland 0,5. La suspensión se diluyó en medio fresco (recomendado por el NCCLS para el organismo), para dar de 2 x 105 a 7 x 105 15 UFC/ml para bacterias o de 2 x 103 a 7 x 103 UFC/ml para Candida. Después de dispensar alícuotas de 100 µl de la suspensión microbiana en cada pocillo de una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos se añadieron 11 µl del compuesto de ensayo. La CMI se definió como la concentración más baja de fármaco que evitó una turbidez visible tras de 16 a 20 horas (bacterias) o de 46 a 50 horas (Candida) a 35 ºC. Para anaerobios facultativos, la incubación se realizó en dióxido de carbono al 7 % y para los anaerobios estrictos en un ambiente sin oxígeno
20 mantenido usando un “bote” para anaerobios estándar. Todas as CMI se realizaron tres veces y se determinó el valor medio.
Tabla 5: Actividad contra bacterias grampositivas
Péptidos (SEC ID Nº)
S. aureus (MRSA) S. epidermidis C621 S. pyogenes M76
P23 (8)
32 16 16
P25 (10)
16 4 8
P26 (11)
32 4 4
P27 (12)
16 4 4
P34 (16)
16 8 4
P35 (17)
8 4 4
P37 (19)
8 4 8
P41 (23)
64 4 8
P42 (24)
16 2 4
P43 (25)
4 2 2
P44 (26)
8 4 4
P46 (28)
64 8 8
P49(31)
64 8 8
P50 (32)
4 4 8
P54 (34)
16 8 8
P55 (35)
4 2 4
P59 (39)
8 8 2
P60 (40)
32 4 8
P61 (41)
32 8 16
P63* (42)
32 16 8
P64* (43)
8 4 4
P72 (48)1
16 4 16
P73 (49)
16 4 16
P75(51)
32 8 8
P94* (60)
16 8 8
P97 (165)
8 4 4
P105* (69)
32 8 16
P111 (75)
8 4 4
P119(81)
8 4 8
P124 (86)
8 4 16
P146 (108)
16 8 8
P153(115)
16 4 2
P157(119)
32 4 8
P177 (138)
8 4 8
P301 (147)
8 4 8
P504 (155)
4 4 8
P510 (161)
8 4 8
P2 (2)
32 8 4
P27 (12)
8 4 4
La negrita indica actividad de amplio espectro; *indica selectivo de grampositivas
Tabla 6: Actividad contra bacterias grampositivas
Péptidos (SEC ID Nº)
S. pyogenes S. pneumoniae S. pneumoniae P.acne
P23 (8)
8 16 16 4
P25 (10)
4 64 8 2
P26 (11)
4 >128 16 4
P26(12)
4 32 8 4
P34 (16)
4 8 8 8
P35 (17)
16 4 4
P37 (19)
8 64 16 4
P41 (23)
8 64 32 4
P42 (24)
4 32 8 2
P43 (25)
2 8 4 2
P44 (26)
4 8 16 4
P46 (28)
16 64 128
P49(31)
8 64 32
P50 (32)
4 32 16 4
P54 (34)
8 64 64
P55 (35)
2 8 4 4
Péptidos (SEC ID Nº)
S. pyogenes S. pneumoniae S. pneumoniae P.acne
P59 (39)
2 16 4 2
P60 (40)
8 128 >128 4
P61 (41)
16 128 32 2
P63* (42)
8 128 16
P64* (43)
4 8 2 2
P72 (48)
16 >128 16 2
P73 (49)
16 >128 64 4
P75(51)
4 >128 64 16
P94* (60)
8 64 128
P97 (165)
4 32 16 8
P105* (69)
16 64 32 16
P111 (75)
2 16 4 4
P119(81)
8 128 32 8
P124 (86)
16 >128 64 8
146(108)
8 >128 128 16
P153(115)
2 32 8 4
P157(119)
8 128 16 4
P177 (138)
4 32 16 8
P301 (147)
8 >128 8 2
P504 (155)
16 64 8 4
P510 (161)
8 64 16 2
P2A* (2)
8 128 32
P97 (165)
8 32 32 16
P27 (12)
4 16 4 4
La negrita indica actividad de amplio espectro; *indica selectivo de grampositivas; S. pyogenes ATCC19615; S. pneumoniae C718; S. pneumoniae C719; P.acne ATCC-6919
Tabla 7: Actividad contra bacterias gramnegativas
Péptidos (SEC ID Nº)
E.coli UB1 005 S. typhimurium 14028S P. aeruginosa H374
P12 (5)
1 4 8
P39 (21)
4 16 16
P41 (23)
2 4 4
P46 (28)
4 8 4
P61 (41)
2 4 4
P71 (47)
2 8 4
P100 (163)
0,5 4 8
P109 (73)
16 32 8
P110(74)
16 32 8
P157(119)
8 8 8
P306 (150)
4 4 8
P46 (28)
8 16 4
P29 (14)
8 8 16
Tabla 8: Actividad contra bacterias gramnegativas
Péptido
P. aeruginosa H187 C. glabrata ATCC15126
P12 (5)
16 128
P39 (21)
32 16
P41 (23)
8 32
P46 (28)
16 32
P61 (41)
8 32
P71 (47)
8 32
P100 (163)
32 >128
P109 (73)
64 128
P110(74)
64 128
P157(119)
8 64
P306 (150)
16 >128
P46 (28)
8 32
P29(14)
32 128
Tabla 9: Actividad contra cepas bacterianas de Pseudomonas
Péptidos (SEC ID Nº)
P. aeruginosa H374 P. aeruginosa H187 P. aeruginosa Tb 105663 P. aeruginosa Tb 00609
P12 (5)
8 16 8 8
P25 (10)
8 8 8 8
P27 (12)
8 8 16 16
P35 (17)
8 8 4 4
P37 (19)
8 8 16 16
P39 (21)
16 32 32 32
P41 (23)
4 8 8 8
P42 (24)
4 8 8 8
P43 (25)
8 8 8 8
P44 (26)
8 8 16 8
P45 (27)
8 16 32 32
P46 (28)
4 16 32 16
P50 (32)
4 4 8 4
P55 (35)
8 8 16 8
P59 (39)
8 8 8 8
P61 (41)
4 8 8 16
P71 (47)
4 8 16 16
P72 (48)
4 8 8 8
P73 (49)
8 16 16 16
P97 (165)
8 16 16 16
P111 (75)
8 8 32 16
P119 (81)
8 16 16 16
P124 (86)
16 32 64 64
P146 (108)
2 4 8 8
P153 (115)
4 8 8 8
P157 (119)
8 8 16 16
P177 (138)
16 16 32 32
P301 (247)
4 8 8 8
P306 (150)
8 16 32 16
P504 (155)
8 8 16 8
P510 (161)
8 8 16 16
P2 (2)
16 16 16 32
P13 (6)
16 16 16 16
P27 (12)
8 8 8 8
P11 (4)
16 16 16 16
La negrita indica actividad de amplio espectro.

Tabla 10: Comparación de las actividades antibacterianas y antifúngicas de péptidos seleccionados
Las siguientes tablas comparan las propiedades antifúngicas y antibacterianas de una muestra representativa de péptidos.
Péptido (SEC ID Nº)
C. albicans 105 C. tropicalis ATCC 13803 C. giabrata ATCC15126
P40 (22)
32 1 32
P47 (29)
32 1 64
P49 (31)
16 2 16
P74 (50)
16 1 16
P77 (53)
16 1 64
P79 (54)
32 2 128
P101 (65)
32 4 32
P103 (67)
16 2 16
P106 (70)
32 2 64
P113 (77)
32 4 32
P122 (84)
32 4 64
P154(116)
64 8 128
P167 (128)
64 8 128
P169 (130)
64 8 128
Tabla 11: Comparación de las actividades antibacterianas y antifúngicas de péptidos seleccionados
Péptidos (SEC ID Nº)
E. coli UB1005 S. typhimurium 14028S P. aeruginosa H187 S. aureus SAP0017
P40 (22)
64 >128 >128 >128
P47 (29)
64 >128 64-128 >128
P49(31)
32 64 16-64 64
P74 (50)
16 64 32-128 >128
P77 (53)
64 >128 64-128 >128
P79 (54)
32 >128 >128 >128
P101 (65)
32 128 32-128 128
P103 (67)
32 128 64 64
P106 (70)
64 >128 >128 >128
P113 (77)
32 44 32-128 32
P122 (84)
64 128 32-128 128
P154(116)
64 >128 >128 >128
P167 (128)
32 64 128 128
P169 (130)
32 64 128 >128

Tabla 12: Actividades de amplio espectro
Muchos de los péptidos FLAK divulgados tienen actividad contra una amplia serie de microorganismos. Las tablas siguientes ilustran estas propiedades para una muestra representativa de péptidos.
Péptidos (SEC ID Nº)
E. coli UB 1005 S. typhimutium 1402S P. aeruginosa H374 P. aeruginosa H187
P25 (10)
8 8 8 8
P27 (12)
8 16 8 8
P35 (17)
2 4 8 8
P37 (19)
4 8 8 8
P42 (24)
4 8 4 8
P43 (25)
8 8 8 8
P44 (26)
1 4 8 8
P45 (27)
4 32 8 16
P50 (32)
2 4 4 4
P55 (35)
4 4 8 8
P59 (39)
8 8 8 8
P72 (48)
2 8 4 8
P73 (49)
8 16 8 16
P97 (165)
8 16 8 16
P111 (75)
16 16 8 8
P119(81)
4 8 8 16
P124 (86)
16 16 16 32
P146 (108)
2 4 2 4
P153(115)
8 8 4 8
P177 (138)
8 16 16 16
P301 (147)
8 8 4 8
P504 (155)
4 4 8 8
P510 (161)
8 16 8 8

Tabla 13: Actividades de amplio espectro
Péptidos (SEC ID Nº)
S. aureus SAP0017 S. epidermis C621 C. albicans 105 C. glabrata ATCC15126
P25 (10)
16 4 32 32
P27 (12)
16 4 32 32
P35 (17)
8 4 32 16
P37(19)
8 4 32 32
P42 (24)
16 2 32 64
P43 (25)
4 2 8 16
P44 (26)
8 4 8 16
P45 (27)
32 16 16 16
P50 (32)
4 4 16 16
Péptidos (SEC ID Nº)
S. aureus SAP0017 S. epidermis C621 C. albicans 105 C. glabrata ATCC15126
P55 (35)
4 2 16 8
P59 (39)
8 8 32 16
P72 (48)
16 4 32 64
P73 (49)
16 4 32 128
P97 (165)
8 4 16 16
P111 (75)
8 4 32 32
P119(81)
8 4 16 16
P124 (86)
8 4 16 16
P146 (108)
16 8 8 16
P153(115)
16 4 16 16
P177 (138)
8 4 16 16
P301 (147)
8 4 32 32
P504 (155)
4 4 64 64
P510 (161)
8 4 32 64
P27 (12)
8 4 16 16
Aunque los péptidos FLAK generalmente son activos contra una serie de agentes microbianos, no todos los péptidos son igual de eficaces contra todos los microorganismos. Las tablas siguientes presentan algunas combinaciones de péptidos y microorganismos en las que se observó que el péptido tenía mala actividad.

Tabla 14: Actividades antimicrobianas bajas observadas
Péptidos (SEC ID Nº)
E. coli UB1005 S. typhimurium 14028S P. aeruginosa H374
P57 (37)
>128 >128 >128
P58 (38)
>128 >128 >128
P65 (44)
128 >128 64
P76 (52)
16 128 64
P93 (59)
128 > 128 128
P95 (61)
>128 >128 >128
P96 (62)
>128 >128 >128
P107 (71)
>128 >128 >128
P112 (76)
>128 >128 >128
P114 (78)
32 128 >128
P120 (82)
>128 >128 128
P121 (83)
>128 >128 >128
P123 (85)
64 >128 >128
P126 (88)
>128 >128 >128
P127 (89)
128 >128 >128
P128 (90)
128 >128 >128
P129 (91)
64 >128 >128
P130 (92)
>128 >128 >128
P131 (93)
>128 >128 >128
P132 (94)
128 >128 >128
P133(95)
>128 >128 >128
P134 (96)
128 >128 128
P136 (98)
128 >128 >128
P137 (99)
>128 >128 >128
P138 (100)
>128 >128 >128
P139 (101)
64 >128 >128
P140(102)
>128 >128 >128
P141(103)
>128 >128 >128
P142 (104)
64 128 >128
P143 (105)
>128 >128 >128
P145 (107)
>128 >128 >128
P147 (109)
64 128 128
P148 (110)
128 >128 >128
P149 (111)
32 >128 128
P151 (113)
>128 >128 128
P152 (114)
32 >128 >128
P155 (117)
>128 >128 >128
Péptidos (SEC ID Nº)
E. coli UB1005 S. typhimurium 14028S P. aeruginosa H374
P166 (127)
>128 >128. >128
P168 (129)
128 >128 128
P169 (130)
64 64 128
P170 (131)
64 >128 >128
P171 (132)
32 >128 >128
P174 (135)
>128 >128 >128
P175 (136)
>128 >128 >128
P180 (141)
>128 >128 >128

Tabla 15: Actividades antimicrobianas bajas observadas
Péptidos (SEC ID Nº)
P. aeruginosa H374 S. aureus SAP0017 S. epidermidis C621 Candida albicans 105
P57 (37)
>128 >128 >128 128
P58 (38)
>128 >128 >128 64
P65 (44)
64 >128 >128 64
P76 (52)
64 >128 >128 64
P93 (59)
128 >128 >128 64
P95 (61)
>128 >128 >128 >128
P96 (62)
>128 >128 >128 >128
P107 (71)
>128 >128 >128 >128
P112 (76)
>128 >128 64 128
P114 (78)
>128 >128 64 64
P120 (82)
128 >128 >128 64
P121 (83)
>128 >128 >128 64
P123 (85)
>128 >128 16 64
P126 (88)
>128 >128 >128 >128
P127 (89)
>128 >128 64 32
P128 (90)
>128 >128 128 128
P129 (91)
>128 >128 32 128
P130 (92)
>128 >128 >128 >128
P131 (94)
>128 >128 >128 128
P132 (94)
>128 >128 >128 128
P133(95)
>128 >128 >128 >128
P134 (96)
128 >128 128 64
P136 (98)
>128 >128 128 64
P137 (99)
>128 >128 >128 >128
P138 (100)
>128 >128 >128 >128
P139 (101)
>128 >128 64 128
P140(102)
>128 >128 >128 >128
P141(103)
>128 >128 >128 >128
P142 (104)
>128 >128 128 64
P143 (105)
>128 >128 >128 >128
P145 (107)
>128 >128 >128 64
P147 (109)
128 >128 64 64
P148 (110)
>128 >128 128 128
P149 (111)
128 >128 >128 128
P151 (113)
128 >128 >128 128
P152 (114)
>128 >128 32 128
P155 (117)
>128 >128 >128 >128
P166 (127)
>128 >128 >128 >128
P168 (129)
128 >128 128 128
P169 (130)
128 >128 32 64
P170 (131)
>128 0,128 >128 128
P171 (132)
>128 >128 128 >128
P174 (135)
>128 >128 >128 >128
P175 (136)
>128 >128 >128 >128
P180 (141)
>128 >128 >128 >128
Ejemplo 4: Ensayos anti-cáncer
Los ensayos con células cancerosas se realizaron de un modo similar a los ensayos antimicrobianos descritos anteriormente, excepto porque el procedimiento de ensayo usó el protocolo de pigmento MTT. La viabilidad de las 5 células se determina mediante la respuesta al pigmento. En el procedimiento siguiente se añadieron aproximadamente ,5 x 104 células por pocillo y se determinó la viabilidad con las células en un estado semiconfluente. El ensayo se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Tras la adición del péptido, la placa se fijó durante 24 horas. Se añadió MTT (5 mg/ml en RPMI 1640 sin rojo fenol, 20 μl) a cada pocillo, incluidos los pocillos de control positivo no tratados con péptido. La placa se incubó a 37ºC durante 4 horas. Se retiró el 10 contenido líquido de cada pocillo y a cada pocillo se añadió isopropanol con HCl 0,1M (100 µl). La placa se selló con Parafilm para prevenir la evaporación del isopropanol. Se deja la placa en reposo durante 5-10 minutos con el fin de solubilizar el precipitado. A cada pocillo se añadió agua (100 µl). La absorbancia se determinó con un instrumento lector de ELISA. La intensidad del color a 540 nm es proporcional a la viabilidad de las células. Los resultados para cada concentración de péptido se representan respecto a los controles no tratados y los valores de DL50 se
15 determinan a partir de los gráficos.
WI38 (Nº ATCC CCL75) es una línea de fibroblastos normales de células diploides pulmonares, MCF7 (Nº ATCC HTB22) es una línea de células tumorales de adenocarcinoma de mama, SW480 (Nº ATCC CCL228) es una línea de células tumorales de adenocarcinoma de colon, BMKC es una línea de melanoma clonada de la línea de
20 melanoma de Bowes HMCB (Nº ATCC CRL9607), H1299 (Nº ATCC CRL5803) es una línea tumoral de carcinoma pulmonar macrocítico, HeLaS3 (Nº ATCC CCL2.2) línea de células tumorales de carcinoma epitelial cervical y PC3 (Nº ATCC CRL1435) es una línea de células tumorales de adenocarcinoma de próstata. Las cifras son valores de DI50 (µg/ml). Los datos de las seis dianas se presentan en las siguientes Tablas 16 y 17.
25 Tabla 16
Nombre
SEC ID Nº Nº P W138 MCF7 SW480 BMKC
HECATO AC
1 1 27 54 6 72
HECATO AM
2 2 66 23 46 128
SB37COOH
3 5 130 175 82 120
SB-37 AM
5 12 950 540 > >
SHIVA 10 AC
6 13 57 > NO NO
FLAK01 AM
8 23 34 62 5 27
FLAK03 AM
9 24 55 26 38 85
FLAK04 AM
10 25 24 10 12 36
FLAK05 AM
11 26 96 74 8 94
FLAK06 AM
12 27 37 14 26 44
FLAK06 AC
13 27B 101 65 59 93
FLAK06 R-AC
14 27C 520 140 210 300
KALV
15 30 93 72 62 140
FLAK 17 AM
16 34 40 21 35 53
FLAK 26 AM
17 35 8 9 14 7
FLAK 25 AM
18 36 19 9 30 56
HECATE 20Ac
19 37 80 14 57 150
FLAK43 AM
20 38 12 17 13 21
FLAK44AM
21 39 300 130 435 510
FLAK62 AM
22 40 > 760 > >
FLAK 06R-AM
23 41 175 98 120 290
MSI-78 AM
24 42 67 31 34 140
FLAK50
25 43 5 9 9 7
FLAK51
26 44 36 140 32 47
FLAK57
27 45 200 260 180 160
FLAK71
28 46 200 300 160 150
FLAK??
29 47 > 575 > 700
FLAK50V
30 48 41 23 47 43
FLAK50F
31 49 135 40 100 115
FLAK26V AM
32 50 43 32 46 40
CAME-15
33 53 32 45 40
FLAK50C
34 54 97 60 90
FLAK50D
35 55 32 16 14 16
FLAK 50E
36 56 250 500 215 205
FLAK80
37 57 900 > 740 740
FLAK81
38 58 > > > >
FLAK82
39 59 77 31 42 155
Nombre
SEC ID Nº Nº P W138 MCF7 SW480 BMKC
FLAK83M
40 60 > > > >
FLAK 26 Ac
41 61 93 105 100 140
INDOLICIDINA
42 63 NO 64 345 200
FLAK 17C
43 64 37 80 35
FLAK 50H
44 65 320 475 345 250
FLAK 50G
45 66 240 90 145 200
SHIVA DERIV P69+KWKL
46 70 34 44 11 94
SHIVA 10(1-18_AC
47 71 355 190 250 445
PÉPTIDO SHIVA 10 71+KWKL
48 72 125 93 82 290
CA(1-7)Shiva10(1-16)
49 73 160 150 70 360
FLAK 54
50 74 335 465 340 460
FLAK 56
51 75 80 42 17 24
FLAK 58
52 76 445 970 400 750
FLAK 72
53 77 > > > 125
FLAK 75
54 79 > 540 > 830
SHIVA 10 (1-16) Ac
55 80 28 29 35 76
CA(1-7)ShivaI0(1-16)-COOH
56 81 8 63 13 12
INDOLOCIDINA-ac
57 91 9 12 30 180
FLAK50B
58 92 43 23 51 46
FLAK501
60 94 6 65 NO 11
FLAK50K
61 95 250 > > 820
FLAK50L
62 96 > > > >
Shiva-11
63 98 47 96 125 94
SHIVA 11[(1-16)ME(2-9] -COOH
64 99 34 95 120 94
FLAK 50N
65 101 300 250 170 160
FLAK 500
66 102 73 60 57 60
FLAK 50P
67 103 26 46 90 75
CA(1-&HECATO(11/23)
68 104 24 11 54 100
PYL-ME
69 105 430 635 > NO
FLAG26-0 1
70 106 > 620 570 690
VISHNU3
71 107 > > > >
MELITINA
72 108 16 9 23 18
FLAK26-02
73 109) > > > >
FLAG26-03
74 110 45 180 325 400
FLAK50 Q1
75 111 24 35 27 26
FLAK50 Q2
76 112 420 500 800 445
FLAK50 Q3
77 113 170 150 180 115
FLAK50 Q4
78 114 > 730 > >
FLAK50 Q5
79 117 > > > >
FLAK50 Q6
80 118 170 70 115 135
FLAK50 Q7
81 119 45 54 46 36
FLAK50 Q8
82 120 600 730 630 660
FLAK50 Q9
83 121 625 400 800 670
FLAK50 Q10
84 122 720 360 570 700
FLAK50 T1
85 123 600 615 > 635
FLAK50 T2
86 124 21 18 9 10
FLAK50 T3
87 125 90 90 125 220
FLAK50 T4
88 126 > > > >
FLAK50 T5
89 127 760 440 400 535
FLAK90
90 128 500 500 530 330
FLAK91
91 129 > > 550 >
FLAK92
92 130 > > > >
FLAK93
93 131 > 600 555 >
FLAK50 Z1
94 132 > > > >
FLAK50 Z2
95 133 > > > >
FLAK50 Z3
96 134 > > 740 >
FLAK50 Z4
97 135 110 54 80 155
FLAK50 Z5
98 136 > 500 600 530
FLAK50 Z6
99 137 > > > >
FLAK50 Z7
100 138 > > > >
FLAK50 Z8
101 139 550 625 > 525
FLAK50 Z9
102 140 > > > >
Nombre
SEC ID Nº Nº P W138 MCF7 SW480 BMKC
FLAK94
103 141 420 430 560 465
FLAK93B
104 142 73 44 38 38
FLAK50 Z10
105 143 > > > >
FLAK96
106 144 750 150 285 250
FLAK97
107 145 > > > >
FLAK98
108 146 270 110 380 185
FKRLA
109 147 83 106 185 110
FLAK91 B
110 148 380 315 > 330
FLAK92B
111 149 > > > >
FLAK99
112 150 125 160 235 190
FLAK50T6
113 151 > > > >
FLAK50T7
114 152 620 430 740 >
FLAK95
115 153 130 64 61 165
FLAK50T8
116 154 600 315 750 330
FLAK50T9
117 155 > > > >
FLAK100-C02H
118 156 230 135 345 520
FAGVL
119 157 500 240 330 600
Modelina-5
120 159 82 61 140 140
Modelina-5-C02H
121 160 700 320 370 220
FLAK120
126 165 470 360 240 240
FLAK 121
127 166 > > > >
FLAK96B
128 167 260 230 360 240
FLAK96G
129 168 > 630 > 590
FLAK96F
130 169 > 510 > 530
FLAK96C
131 170 > 940 > >
FLAK960
132 171 615 305 770 600
Modelina-80
135 174 > > > >
Modelina-8E
136 175 > > 70 >
Flak 96H
137 176 > > > >
Flak 961
138 177 270 190 310 310
Flak 96J
139 178 405 770 > 640
Flak 96L
140 179 540 555 > 920
FLAK-120G
141 180 940 950 600 770
FLAK-1200
142 181 500 550 870 830
FLAK-120C
143 182 > > > >
FLAK-120B
144 183 > > > >
FLAK-120F
145 184 800 260 440 600
Magainina2 wisc
146 300 52 22 60 130
02A21
147 301 66 64 76 140
KSL-1
148 302 800 340 > 700
KSL-7
149 303 355 315 530 330
LSB-37
150 306 320 50 240 170
Anubis-2
151 307 75 38 73 83
FLAK 17 CV
152 501 26 23 NO NO
FLAK50 Q1V
153 502 64 92 NO NO
02A21V
154 503 150 210 NO NO
FLAK 25 AM V
155 504 110 130 NO NO
FLAK43 AM V
156 505 85 86 NO NO
FLAK500 V
157 506 75 45 NO NO
HECATO AM V
158 507 285 340 NO NO
HECATO AC V
159 508 190 160 NO NO
FLAK04AM V
160 509 95 84 NO NO
03AMV
161 510 77 62 NO NO
O-Shiva 10 AC
162 67 4 7 NO NO
Shiva 11 AC
163 100 95 175 82 120
Shiva 10 (1-18)AM
164 69 101 45 63 66
Nota: > indica más de 1000; ND indica no determinado; los números están en µg/ml.
Tabla 17
Nombre
SEC ID Nº P No. W138 H1299 HeLaS3 PC3
HECATO AC
1 1 27 44 95 6
HECATO AM
2 2 66 140 50 44
SB37COOH
3 5 130 220 150 NO
SB-37 AM
5 12 950 720 > 630
SHIVA 10 AC
6 13 57 > > 83
FLAK01 AM
8 23 34 64 82 41
FLAK03 AM
9 24 55 72 145 38
FLAK04 AM
10 25 24 37 20 12
FLAK05 AM
11 26 96 84 150 125
FLAK06 AM
12 27 37 16 25 8
FLAK06 AC
13 27B 101 54 80 16
FLAK06 AM
14 27C 520 170 260 280
KALV
15 30 93 125 190 65
FLAK 17 AM
16 34 40 24 62 9
FLAK 26 AM
17 35 8 16 27 5
FLAK 25 AM
18 36 19 57 NO 19
HECATE 20Ac
19 37 80 150 NO 64
FLAK43 AM
20 38 12 33 35 10
FLAK44AM
21 39 300 420 620 310
FLAK62 AM
22 40 > > > 435
FLAK 06R-AM
23 41 175 245 185 140
MSI-78 AM
24 42 67 150 NO 66
FLAK50
25 43 5 6 15 12
FLAK51
26 44 36 72 22 45
FLAK57
27 45 200 330 160 170
FLAK71
28 46 200 290 280 280
FLAK77
29 47 > > > >
FLAK50V
30 48 41 17 44 32
FLAK50F
31 49 135 140 NO 77
FLAK26V AM
32 50 43 7 33 54
CAME-15
33 53 32 65 30 40
FLAK50C
34 54 97 80 190 90
FLAK50D
35 55 32 7 15 47
FLAK 50E
36 56 250 370 300 435
FLAK80
37 57 900 > 830 >
FLAK81
38 58 > > > >
FLAK82
39 59 77 180 NO 81
FLAK83M
40 60 > > > >
FLAK 26 Ac
41 61 93 127 170 66
INDOLICIDINA
42 63 NO 270 345 290
FLAK 17 C
43 64 37 30 30 46
FLAK 50H
44 65 320 450 210 470
FLAK50G
45 66 240 130 140 170
SHIVA DERIV P69+KWKL
46 70 34 63 28 82
SHIVA 10 (1-18_AC
47 71 355 320 570 270
PÉPTIDO SHIVA 10 71+KWKL
48 72 125 160 240 63
CA(1-7)Shiva10(1-16)
49 73 160 115 270 97
FLAK 54
50 74 335 670 260 660
FLAK 56
51 75 80 80 74 54
FLAK 58
52 76 445 860 380 675
FLAK 72
53 77 > > > >
FLAK 75
54 79 > > > >
SHIVA 10 (1-16) Ac
55 80 28 64 97 28
CA(1-7)Shiva10(1-16)-COOH
56 81 8 22 19 170
Indolocidina-ac
57 91 9 64 20 31
FLAK50B
58 92 43 25 670 83
FLAK50J
59 93 530 320 > 690
FLAK501
60 94 6 NO > NO
FLAK50K
61 95 250 > > >
FLAK50L
62 96 > > > >
Nombre
SEC ID Nº P No. W138 H1299 HeLaS3 PC3
Shiva-11
63 98 47 53 175 52
SHIVA 11[(1-16)ME(2-9]-COOH
64 99 34 54 180 28
FLAK 50N
65 101 300 340 170 730
FLAK 500
66 102 73 27 43 66
FLAK 50P
67 103 26 150 70 330
CA(1-&HECATE(11/23)
68 104 24 52 130 18
PVL-ME
69 105 430 > > NO
FLAG26-01
70 106 > 920 700 >
VISHNU3
71 107 > > > >
MELlTILINA
72 108 16 25 35 13
FLAK26-02
73 109 > > > >
+FLAG26-03
74 110 45 95 540 >
FLAK50 Q1
75 111 24 8 7 11
FLAK50 Q2
76 112 420 470 660 640
FLAK50 Q3
77 113 170 50 190 240
FLAK50 Q4
78 114 > > > >
FLAK50 Q5
79 117 > > > >
FLAK50 Q6
80 118 170 74 87 330
FLAK50 Q7
81 119 45 33 30 140
FLAK50 Q8
82 120 600 620 810 >
FLAK50 Q9
83 121 625 460 830 >
FLAK50 Q10
84 122 720 830 780 800
FLAK50 T1
85 123 600 > 940 >
FLAK50 T2
86 124 21 30 14 10
FLAK50 T3
87 125 90 76 220 145
FLAK50 T4
88 126 > > > >
FLAK50 T5
89 127 760 770 610 >
FLAK90
90 128 500 > 700 >
FLAK91
91 129 > 790 550 >
FLAK92
92 130 > > > >
FLAK93
93 131 > > > >
FLAK50 Z1
94 132 > > > >
FLAK50 Z2
95 133 > > > >
FLAK50 Z3
96 134 > > > >
FLAK50 Z4
97 135 110 115 215 310
FLAK50 Z5
98 136 > 450 400 900
FLAK50 Z6
99 137 > > > >
FLAK50 Z7
100 138 > > > >
FLAK50 Z8
101 139 550 850 > >
FLAK50 Z9
102 140 > > 285 >
FLAK94
103 141 420 > > NO
FLAK93B
104 142 73 115 55 60
FLAK50 Z10
105 143 > > > >
FLAK96
106 144 750 225 275 350
FLAK97
107 145 > > 240 >
FLAK98
108 146 270 93 640 440
FKRLA
109 147 83 93 > 340
FLAK91 B
110 148 380 660 > >
FLAK92B
111 149 > > > >
FLAK99
112 150 125 185 320 74
FLAK50T6
113 151 > > > >
FLAK50T7
114 152 620 410 > >
FLAK95
115 153 130 50 140 97
FLAK50T8
116 154 600 400 > 640
FLAK50T9
117 155 > > > NO
FLAK100-C02H
118 156 230 NO > 260
FAGVL
119 157 500 315 > 375
Modelina-5
120 159 82 74 275 145
Modelina-5-C02H
121 160 700 470 550 450
FLAK120
126 165 470 56 400 340
FLAK121
127 166 > > >
FLAK96B
128 167 260 300 325 320
Nombre
SEC ID Nº P No. W138 H1299 HeLaS3 PC3
FLAK96G
129 168 > > > >
FLAK96F
130 169 > 640 > >
FLAK96C
131 170 > > > >
FLAK960
132 171 615 540 820 600
Modelina-80
135 174 > > > >
Modelina-8E
136 175 > > 510 >
Flak 96H
137 176 > > > >
Flak 961
138 177 270 240 380 120
Flak 96J
139 178 405 > > >
Flak 96L
140 179 540 > > >
FLAK-120G
141 180 940 > 760 >
FLAK-1200
142 181 500 > > >
FLAK-120C
143 182 > > > >
FLAK-120B
144 183 > > > >
FLAK-120F
145 184 800 370 302 570
Magainina2wisc
146 300 52 60 125 45
02A21
147 301 66 77 170 45
KSL-1
148 302 800 720 > >
KSL-7
149 303 355 345 > 530
LSB-37
150 306 320 120 250 370
Anubis-2
151 307 75 160 100 66
O-Shiva 10 AC
163 100 95 220 150 NO
Shiva 10 (1-18)AM
164 69 101 71 190 81
En las Tablas 16 y 17 se puede ver que todas las dianas expuestas eran inhibidas por uno o más de los péptidos en una medida apreciable (es decir DL50 menor de 50 µg/ml). La Tabla 18 siguiente muestra que 44 (29 %) de los 150 péptidos analizados eran activos con algunos valores de DL50 iguales o menores de 50; 26 de los péptidos eran
5 activos en algunas dianas en o por debajo del valor de DL50 de 25-, y 16 péptidos eran muy activos en una o más cepas diana con valores de DL50 iguales o menores de 10.
La Tabla 19 siguiente muestra un amplio espectro de actividad contra seis tipos de células cancerosas para varios péptidos activos. Se observa que cada diana tiene uno o más péptidos candidatos principales inhibidores del 10 crecimiento celular a un nivel de DL50 de 10 o menos.
Tabla 18: Péptidos FLAK que muestran una actividad sustancial contra las líneas de células cancerosas
Valores de DL50
Número de péptidos activos Porcentaje de 150 péptidos analizados
< o =50 µg/ml
44 29%
< o =25 µg/ml
26 17%
< o =10 µg/ml
16 11%

Tabla 19: Actividad y especificidad de los péptidos FLAK contra seis células cancerosas diana
DL50
Número de péptidos activos por diana
MCF7 (mama)
SW480 (colon) BMKC (melanoma) H 1299 (pulmón) HeLaS3 (cérvix) PC3 (próstata)
< o =50 µg/ml
31 25 19 19 17 20
< o =25 µg/ml
17 13 8 10 8 11
< o =10 µg/ml
6 5 3 4 1 5
Ejemplo 5: Estimulación y proliferación de leucocitos
20 La viabilidad in Vitro de leucocitos humanos en presencia de diferentes péptidos a diferentes concentraciones se determinó mediante un protocolo Alamar Blue. Alamar Blue (Promega, Madison, WI) es un pigmento indicador formulado para medir cuantitativamente la proliferación y citotoxicidad de las células. El pigmento consiste en un indicador de oxidación-reducción (redox) que da un cambio colorimétrico y una señal fluorescente en respuesta a la actividad metabólica celular.
25 Protocolo del ensayo: Se extrajo sangre de un varón de 50 años de edad y se centrifugó a 1.500 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se aspiraron las células de la capa leucocítica en la interfaz glóbulos rojos-plasma. Las células de la capa leucocítica (principalmente linfocitos) se transfirieron después a tubos de centrífuga de 15 ml
que contenían 5 ml de medio RPMI 1640 + 10 % de suero bovino fetal (Gibco, Grand Island, NY). Se añadió medio adicional a los tubos para llevar el volumen hasta 10 ml. La suspensión de la capa leucocítica se estratificó cuidadosamente en 5 ml de Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y se centrifugó a 1.500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. La interfaz, que es principalmente PBMC (células mononucleares de sangre 5 periférica) se aspiró y transfirió a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml y se resuspendió en 2 ml de RPMI 1640 frío y se llevó hasta 15 ml con medio RPMI 1640 frío. Las células se centrifugaron a 1.500 rpm durante 10 minutos. Después se aspiró el sobrenadante y se descartó. El sedimento celular se resuspendió en 1 ml de RPMI 1640 frío y se llevó hasta 15 ml con medio RPMI. Esta etapa se repitió dos veces, excepto que en la última etapa, las células se resuspendieron en 1 ml de RPMI 1640 frío y se realizaron recuentos celulares con un hemocitómetro de acuerdo con
10 el catálogo de cultivo celular Sigma.
Como control se usó mitógeno de la hierba carmín, junto con controles positivos y negativos. Las células control negativo se destruyeron con metanol al 70 %. Las células control positivo (+) se incubaron en medio RPMI (sin tratar). A las células se añadieron 20 ml de AlamarBlue y las lecturas se realizaron tras 24 horas, 48 horas, 72 horas
15 y 96 horas usando un fluorímetro (excitación 544/transmisión 590 nm).
Los cálculos se realizaron usando la fórmula siguiente. La muestra tratada con el péptido y el control positivo se ajustaron por el control negativo.
Usando el protocolo descrito justo antes se realizó detección selectiva de aproximadamente 100-150 péptidos por sus acciones estimuladoras y/o inhibidoras sobre el crecimiento de los leucocitos humanos ("WBC") en comparación con el crecimiento de células control positivo no tratadas. Los datos de la Tabla 20 siguiente muestran que varios
25 péptidos FLAK seleccionados son estimuladores a concentraciones bajas (0,1 a 1,0 μg/ml), mientras que algunos de los péptidos se convierten en inhibidores (que producen la muerte celular) a concentraciones mayores. Varios de los péptidos (es decir, las SEC ID Nº 5, 143 y 160) son estimuladores (y/o proliferativos) a todas las concentraciones hasta 500 µg/ml.
30 La tinción Alamar Blue usada en el protocolo atraviesa las membranas celulares y nucleares, y se metaboliza en las mitocondrias para producir el cambio de color. Por tanto, la respuesta fluorimétrica resultante es un resultado de la actividad total de las mitocondrias producida por la estimulación y/o mitosis celular (proliferación celular). El incremento de los valores (para las células tratadas, como porcentaje de los valores para las células no tratadas) con un incremento del tiempo de incubación (120 horas frente a 48 horas) se puede atribuir al incremento de la
35 proliferación celular además de la estimulación de la actividad metabólica celular producida por el péptido.
La Tabla 20 presenta la estimulación/proliferación de células tratadas con péptido, como porcentaje de control positivo sin tratar, para leucocitos humanos (glóbulos blancos, "WBC") en presencia de determinados péptidos FLAK. La tabla también muestra para cada uno de estos péptidos su toxicidad (valores DL50) para los glóbulos rojos
40 (RBC) humanos y para los fibroblastos humanos (WI38). Dichos péptidos determinados que son estimuladores para los glóbulos blancos a concentraciones peptídicas bajas (es decir, 10 µg/ml o menos) y son inhibidores o tóxicos para los glóbulos blancos a concentraciones más altas también son relativamente más tóxicos para los glóbulos rojos y para los fibroblastos que los péptidos que son estimuladores y no inhibidores para los glóbulos blancos incluso a concentraciones tan altas como de 500 µg/ml.
45 En experimentos limitados con otro protocolo distinto al Alamar Blue descrito anteriormente, se ha determinado cualitativamente que los péptidos que producen estimulación y proliferación de leucocitos son activos en los componentes de las células fagocíticas y linfocíticas del sistema linfático de los mamíferos. Como tales, ciertos de los péptidos FLAK estimuladores que son relativamente no tóxicos para las células de mamífero a niveles de dosis
50 terapéuticas se pueden usar como inmunomoduladores para tratar seres humanos u otros mamíferos con sistemas inmunitarios comprometidos. Dicho tratamiento se puede administrar sistémicamente in vivo o mediante tratamiento extracorpóreo de sangre entera o de componentes de la sangre que se van a reinfundir en el donante. Dicha terapia serviría para contrarrestar la deficiencia inmunitaria en pacientes neutropénicos causada por la edad, la enfermedad
o la quimioterapia, y estimularía respuestas inmunitarias naturales para prevenir o combatir infecciones patogénicas
55 y el crecimiento de ciertas líneas celulares cancerosas o potenciar los procesos de cicatrización de heridas que implican al sistema linfoide. La Tabla 21 es un ejemplo más detallado (con un péptido, SEC ID Nº 109 del fenómeno que muestra las relaciones entre la concentración y el tiempo a medida que efectúan la estimulación, proliferación e inhibición de los leucocitos.

Tabla 20: Estimulación/proliferación de linfocitos (WBC) humanos por determinados péptidos FLAK
Péptidos seleccionados
Porcentaje de estimulación de la actividad de las células tratadas con péptido con respecto al control Toxicidad del péptido*
SEC ID Nº
PNO. 0,1 µg/ml 1 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml 500 µg/ml RBC DL/ 50 WI-38 DL/ 50
2
2
117 118 119 121 119 30 66
5*
12 111 115 118 116 101 >1000 950
10
117 104 99 27 27 60 24
12
27 108 110 99 30 23 125 37
17
35 82 76 61 18 16 200 8
20
38 79 82 78 37 36 350 12
25
43 78 82 71 14 12 20 5
30
48 74 68 62 13 13 130 60
58
92 112 112 98 35 26 300 25
61
95 110 115 116 124 114 >1000 >1000
165
97 107 109 106 27 22 350 850
66
102 100 102 97 37 17 500 210
71
107 101 100 108 109 110 >1000 >1000
115
153 93 92 37 72 29 780 130
119*
157 88 108 54 117 89 850 500
147*
301 100 94 83 22 20 10 66
150*
306 97 101 94 109 112 >1000 320
* no es un péptido FLAK; los tiempos de incubación fueron 48 horas para todas las muestras
Tabla 21: Estimulación/proliferación de leucocitos (WBC) humanos e inhibición por el péptido FLAK de SEC IND Nº (P25)
Tiempo de incubación
0,1 µg/ml 1µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml 500 µg/ml
24 horas
111 98 88 10 10
48 horas
117 104 99 27 27
72 horas
119 105 102 31 32
96 horas
128 112 110 38 40
120 horas
135 118 119 43 45
Nota: Los valores numéricos son el porcentaje de estimulación/proliferación de células tratadas con el péptido respecto a las células control (100 %)
Ejemplo 6: Estimulación y proliferación de fibroblastos
10 El ensayo de proliferación celular cyQUANT proporciona un procedimiento cómodo, rápido y sensible para determinar la densidad de las células en cultivo. El ensayo tiene un intervalo de detección lineal que se extiende desde 50 o menos hasta al menos 50.000 células en volúmenes de 200 µl usando una concentración de un solo pigmento. El ensayo es ideal para estudios de proliferación celular, así como para recuentos celulares de rutina y se
15 puede usar para monitorizar la adhesión de las células a las superficies.
Procedimiento: Diferentes líneas celulares se mantuvieron con diferente medio de acuerdo con la ATCC. Las células se digirieron con 8 ml de tripsina (0,25 % Fisher, Pittsburgh, PA). La suspensión celular se centrifugó durante 10 minutos a 100 rpm. El sobrenadante se retiró y desechó sin alterar el sedimento celular. Se preparó una suspensión 20 celular concentrada en 1,0 ml de medio para obtener una densidad de aproximadamente 105 a 106 células/ml. La densidad celular real se determinó contando las células usando un hemocitómetro con el método de azul tripán. El número de células se ajustó para obtener un número igual de células por 200 µl de volumen. Las células se sembraron en placas con 0 % de FBS, 2 % de FBS, 3 % de FBS y 5 % de FBS. Las placas se incubaron a 37 ºC durante un tiempo suficiente para dejar que las células se unan. Para los estudios de proliferación a largo plazo se
25 retiraron 100 µl de medio de cada pocillo todos los días y se reemplazaron con medio fresco.
En el momento deseado se retiró el medio de las células adherentes en una placa de 96 pocillos. Estas células ya se trataron con agentes de ensayo. Las células se congelaron en la placa a -70 ºC durante 30 minutos. Las células se descongelaron a temperatura ambiente. A cada célula de muestra se añadió CyQuant GR seco/tampón de lisis
30 celular (200 µl). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos protegidas de la luz. La fluorescencia se midió usando fmax a 485-538 nm.
Se usó el protocolo CyQuant anterior para examinar posible estimulación y/o proliferación peptídica de fibroblastos. En la Tabla 22 siguiente se muestran datos para determinados péptidos que demuestran su efecto sobre fibroblastos (WI38). En la tabla, la sustancial propiedad estimuladora y/o proliferativa de determinados péptidos como función de la concentración es evidente. La Tabla 23 muestra que el efecto de estimulación y/o proliferación de fibroblastos se potencia para determinados péptidos en presencia de otros factores de crecimiento. Esto se muestra mediante la adición de suero bovino fetal (FBS) al medio. Valores numéricos mostrados en las Tablas 22 y 23 son la actividad de
5 estimulación/proliferación expresada como un porcentaje del control (células no tratadas). Las células control y las células tratadas con péptido son con medio y FBS, como se ha indicado. Los valores inferiores al 100 % (para control) indican acción inhibidora del péptido, especialmente a concentraciones superiores a 10 µg/ml.

Tabla 22: Estimulación de fibroblastos humanos (WI-38) por determinados péptidos FLAK 10
Estimulación de la actividad de las células tratadas con péptido con respecto al control
SEC ID Nº
Nº P Tiempo de inc. (h)** % FBS en serum 0,1 µg/ml 1 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml
2
2
48 2 125 156 122 35
4
11 48 2 149 145 166 113
5*
12 48 3 111 116 109 120
10
25 48 2 137 143 120 73
12
27 48 2 134 115 104 116
25
43 48 3 93 99 83 14
30
48 48 3 117 117 109 110
72
3 119 123 139 144
32
50 72 3 108 123 127 56
35
55 48 3 101 109 116 25
72
3 91 98 101 6
61
95 72 3 101 90 94 93
66
102 72 3 123 121 126 122
71 *
107 72 3 114 104 98 86
80
118 72 3 163 193 192 184
108
146 72 3 109 101 84 74
115
153 72 3 125 125 132 106
119*
157 72 3 126 118 104 119
126
165 72 3 133 119 79 129
147*
301 48 3 87 98 95 58
150*
306 48 3 102 103 101 94
* no es un peptide FLAK. ** tiempo de incubación en horas.
Tabla 23: Efecto de los factores de crecimiento sobre la estimulación de fibroblastos (WI38)
Concentración del péptido*
SEC ID Nº
Número P % FBS en serum 0,1 µg/ml 1 µg/ml 10 µg/ml 100 µg/ml
2
2
0 2,5 -27 26 -3 57 27 23 -82 -66
4
11 0 2,5 19 50 34 52 50 62 -40 14
8
23 0 2,5 21 16 78 23 10 58 -48 75
80
118 0 3 12 61 -4 70 -7 68 -1 72
Nota: Los valores numéricos son el porcentaje de la viabilidad celular por encima o por debajo del control.
15 Ejemplo 7: Ensayo de toxicidad-Hemólisis de glóbulos rojos (RBC) e inhibición de leucocitos (WBC) y fibroblastos (WI38)
La Tabla 24 siguiente resume los datos de toxicidad de RBC, WBC, y Wl38 para péptidos FLAK típicos. Los tres
20 valores para RBC, WBC, y Wl38 (DL50) son, en general, indicadores direccionales consistentes de la toxicidad peptídica. Al elegir un péptido para un posible tratamiento de una indicación dada, es importante que coincida la actividad terapéutica y la especificidad del péptido con sus posibles propiedades tóxicas. El péptido de la SEC ID Nº 5 no es un péptido FLAK, sino que es SB-37, un homólogo cercano de la cecropina B. Anteriormente se ha demostrado que no es tan activo como los péptidos FLAK como agente antibacteriano, pero posee propiedades de
25 cicatrización de heridas, como se ha demostrado in vivo en un modelo de ratas. Probablemente esto es el resultado de sus efectos estimuladores y proliferativos sobre leucocitos y fibroblastos de mamífero.
Los protocolos para estimulación de glóbulos blancos y WI38 se han tratado anteriormente. El protocolo para glóbulos rojos se presenta en la Tabla 24.
Tabla 24: Toxicidad in vitro de determinados péptidos FLAK sobre los glóbulos rojos (RBC), leucocitos humanos (WBC) y fibroblastos humanos (WI38)
SEC ID Nº
Número P RBC DL50 µg/ml WBC DL50 µg/ml Wl38 DL50 µg/ml
5
12 >1000 >500 60
10
25 60 79 60
11
26 900 185 100
12
27 125 78 60
16
34 200 77 200
17
35 200 64 25
20
38 350 160 100
25
43 20 70
25
30
48 130 78 70
35
55 30 80 28
58
92 300 51 400
66
102 300 115 45
El protocolo para glóbulos rojos es el siguiente: Las posiciones en los pocillos de cada dilución y los controles no tratados se registran en la tapa de una placa de 96 pocillos. Cuando las células habían llegado a la confluencia, se
10 retiró el medio y se sustituyó con diluciones de la muestra preparadas recientemente hasta un volumen final de 200 µl. El agente de ensayo se añadió a los pocillos designados de la placa de 96 pocillos. A los pocillos de control positivo se añadieron 200 µl de medio fresco y a los pocillos de control negativo se añadieron 200 µl de etanol al 70 %. La placa se incubó durante la noche a 37ºC y 5 % de CO2 y una humedad de al menos el 90 %. A todos los pocillos se
15 añadió solución de AlamarBlue (20 µl) a temperatura ambiente. Las placas se leyeron espectrifluorométricamente (excitación 544 nm, emisión 590 nm). Las placas se incubaron durante 3 horas a 37ºC 5 % de CO2, y una humedad de al menos un 90 %. Las placas se leyeron de nuevo a 3 y 24 horas de incubación. El criterio de valoración DL50 se determinó a partir del gráfico leyendo desde donde el punto del 50 por ciento hace intersección en la curva de respuesta a la dosis a la concentración a lo largo del eje x. Esta concentración es el valor de DL50. El valor de DL50
20 para los agentes de ensayo en una clase de agente de ensayo único se puede usar para clasificar-ordenar sus toxicidades relativas o correlacionar con los datos in vivo.
Este ensayo hemolítico se basa en el presentado en el Journal of Peptide Research 53: 82-90 (1999). La preparación de todos los medios, soluciones madre y diluciones se realizó en una campana de flujo laminar para 25 evitar la contaminación. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con los protocolos de seguridad que pertenecen a la manipulación y eliminación de fluidos del cuerpo humano.
Los glóbulos rojos (TBC) se lavaron tres veces con PBS (tampón fosfato 35 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,0). Se prepararon glóbulos rojos suspendidos en PBS (0,4 % (v/v); aproximadamente 10 ml por 15 péptidos). Las 30 suspensiones (100 µl) se alicuotaron a cada tubo con muestra y control. Las soluciones de péptido diluidos en serie (100 µl) se pipetearon en los tubos de muestra. Los tubos de control negativo contenían 100 µl de PBS; los tubos de control positivo contenían 100 µl de 1 % de detergente Triton-X100. Todos los tubos se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Los tubos se retiraron del incubador y se centrifugaron a 1.000 g durante 5 minutos. El sobrenadante (100 µl) se pipeteó en una placa de 96 pocillos de cloruro de polivinilo. Se midió la absorbancia a 414 nm (A414) y se usó
35 para calcular el porcentaje de hemólisis de acuerdo con la fórmula siguiente.
El porcentaje de hemólisis se representa contra la concentración de péptido y la concentración a la cual se 40 determina el 50 % de hemólisis (DL50). La Tabla 25 siguiente detalla los resultados del ensayo hemolítico usando los péptidos tratados en el presente documento.
Tabla 25
Nombre del péptido
SEC ID Nº Número P DL50 µg/ml
Hecato AC#1 01 0
1 1 100
Hecato AM
2 2 10
SB-37 AC #1018
3 5 >
Shiva 10 AM
4 11 76
SB-37 AM
5 12 >
Shiva 10 AC #1015
6 13 50
Magainina 2
7 16 550
AM
8 23 300
FLAK03 AM
9 24 10
FLAK04 AM
10 25 16
FLAK05 AM
11 26 90
FLAK06 AM
12 27 125
FLAK06 AC
13 27B 700
FLAK06 R-AC
14 27C 250
KALV
15 30 150
FLAK 17 AM
16 34 200
FLAK 26 AM
17 35 200
FLAK 25 AM
18 36 85
Hecate 2DAc
19 37 30
FLAK43 AM
20 38 350
FLAK44AM
21 39 >
FLAK62 AM
22 40 >
FLAK 06R-AM
23 41 40
MSI-78 AM
24 42 300
FLAK50
25 43 20
FLAK51
26 44 90
FLAK57
27 45 700
FLAK71
28 46 900
FLAK77
29 47 >
FLAK50V
30 48 200
FLAK50F
31 49 225
FLAK26V AM
32 50 420
CAME-15
33 53 20
FLAK50C
34 54 250
FLAK500
35 55 20
FLAK50E
36 56 600
FLAK80
37 57 >
FLAK81
38 58 >
FLAK82
39 59 1000
FLAK83M
40 60 >
FLAK 26 Ac
41 61 390
Indolicidina
42 63 375
FLAK 17 C
43 64 6
FLAK50H
44 65 950
FLAK50G
45 66 600
Shiva deriv P69+KWKL
46 70 80
Shiva 10 (1-18_AC
47 71 >
Shiva 10 péptido 71 +KWKL
48 72 110
CA(1-7)Shiva10(1-16)
49 73 90
FLAK 54
50 74 >
FLAK 56
51 75 750
FLAK 58
52 76 >
FLAK 72
53 77 >
FLAK 75
54 79 >
Shiva 10(1-16) Ac
55 80 900
CA(1-7)Shiva10(1-16)-COOH
56 81 8
Indolocidina-ac
57 91 40
FLAK50B
58 92 300
FLAK50J
59 93 >
FLAK501
60 94 350
Nombre del péptido
SEC ID Nº Número P DL50 µg/ml
FLAK50K
61 95 >
FLAK50L
62 96 >
Shiva-11
63 98 60
Shiva 11[(1-16)ME(2-9)]-COOH
64 99 25
FLAK50N
65 101 550
FLAK 500
66 102 500
FLAK50P
67 103 650
CA(1-&Hecato(11/23)
68 104 70
PYL-ME
69 105 ND
FLAG26-01
70 106 >
Vishnu3
71 107 >
Melitina
72 108 <
FLAK26-02
73 109 >
FLAG26-03
74 110 >
FLAK50 Q1
75 111 60
FLAK50 Q2
76 112 >
FLAK50 Q3
77 113 1000
FLAK50 Q4
78 114 >
FLAK50 Q5
79 117 >
FLAK50 Q6
80 118 700
FLAK50 Q7
81 119 400
FLAK50 Q8
82 120 >
FLAK50 Q9
83 121 >
FLAK50 Q10
84 122 >
FLAK50 T1
85 123 1000
FLAK50 T2
86 124 55
FLAK50 T3
87 125 >
FLAK50 T4
88 126 >
FLAK50 T5
89 127 >
FLAK90
90 128 >
FLAK91
91 129 >
FLAK92
92 130 >
FLAK93
93 131 >
FLAK50 Z1
94 132 >
FLAK50 Z2
95 133 >
FLAK50 Z3
96 134 >
FLAK50 Z4
97 135 900
FLAK50 Z5
98 136 >
Z6
99 137 >
FLAK50 Z7
100 138 20
FLAK50 Z8
101 139 >
FLAK50 Z9
102 140 >
FLAK94
103 141 900
FLAK93B
104 142 900
FLAK50 Z10
105 143 >
FLAK96
106 144 600
FLAK97
107 145 >
FLAK98
108 146 180
FKRLA
109 147 300
FLAK91 B
110 148 >
FLAK92B
111 149 >
FLAK99
112 150 650
FLAK50T6
113 151 >
FLAK50T7
114 152 880
FLAK95
115 153 800
FLAK50T8
116 154 450
FLAK50T9
117 155 >
FLAK100-C02H
118. 156 10
FAGVL
119 157 850
Modelina-5
120 159 ND
Modelina-5-C021 H
121 160 >
FLAK120
126 165 350
Nombre del péptido
SEC ID Nº Número P DL50 µg/ml
FLAK121
127 166 >
FLAK96B
128 167 200
FLAK96G
129 168 600
FLAK96F
130 169 >
FLAK96C
131 170 >
FLAK960
132 171 550
Modelina-80
135 174 >
Modelina-8E
136 175 >
Flak 96
137 176 >
Flak 961
138 117 400
Flak 96J
139 178 >
Flak 96L
140 179 850
FLAK-120G
141 180 >
FLAK-1200
142 181 >
FLAK-120C
143 182 >
FLAK-120B
144 183 >
FLAK-120F
145 184 850
Magainina2wisc
146 300 250
02A21
147 301 10
KSL-1
148 302 >
KSL-7
149 303 500
LSB-37
150 306 >
Anubis-2
151 307 >
FLAK17CV
152 501 15
FLAK50Q1V
153 502 100
02A21 V
154 503 20
FLAK25AMV
155 504 70
FLAK43AMV
156 505 620
FLAK500V
157 506 120
HECATE AMV
158 507 20
HECATEACV
159 508 70
FLAK04AMV
160 509 40
FLAK03AMV
161 510 10
O-Shiva 10 AC
162 67 40
Shiva 11 AC
163 100 >
Shiva 10 (1-18)AM
164 69 900
NDta: > indica más de 1004; ND= ND determinado
Ejemplo 8: Efectos de la sustitución de valina
Cambiar una secuencia peptídica en la que el primer aminoácido es valina y, en particular, cuando el primer
5 aminoácido se cambia de fenilalanina a valina, puede conducir a propiedades deseables. La toxicidad para los glóbulos rojos y los fibroblastos (VJI38) se puede disminuir, aunque sin disminuir significativamente otras propiedades deseables. La Tabla 26 siguiente muestra numerosos ejemplos (¡4) de reducir la toxicidad indicada de un péptido como se ve a partir del incremento de la viabilidad de los glóbulos rojos y los fibroblastos cuando se tratan con el péptido. Los valores de DL50 se expresan en µg/ml.
10 Tabla 26 Aunque los efectos de la reducción de la toxicidad para las células de mamífero por la sustitución de valina se acompañan de modestas reducciones de la actividad terapéutica contra patógenos microbianos y células cancerosas, hay algunos casos en los que la sustitución de valina tiene como resultado un incremento deseable de
SEC ID Nº
Nº P Secuencia Hemólisis RBC DL50 WI-38 DL50
2
2
FALALKALKKALKKLKKALKKALNH2 12 66
15
30 VALALKALKKALKKLKKALKKAL-NH2 150 93
17
35 FAKKLAKLAKKLAKLAL-NH2 150 25
32
50 VAKKLAKLAKKLAKLAL-N H2 420 45
25
43 FAKLLAKLAKKLL-NH2 20
25
30
48 VAKLLAKLAKKL-NH2 130 160
86
124 FAKLLAKLAKKVL-NH2 55 21
116
154 VAKLLAKLAKKVL-NH2 870 110
SEC ID Nº
Nº P Secuencia Hemólisis RBC DL50 WI-38 DL50
126
165 FALALKALKKL-NH2 350 850
141
180 VALALKALKKL-NH2 850 1000
43
64 FAKALKALLKALKAL-NH2 6 37
152
501 VAKALKALLKALKAL-NH2 15 26
75
111 FAKFLAKFLKKAL-NH2 5 25
153
502 VAKFLAKFLKKAL-NH2 100 64
147
301 FAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF-NH2 10 66
154
503 VAKKFAKKFKKFAKKFAKFAFAF-NH2 20 150
18
36 FAKKLAKLAKKLAKLALAL-N H2 12 19.
155
504 VAKKLAKLAKKLAKLALAL-N H2 70 110
20
38 FAKKLAKLAKKLLAL-NH2 350 100
156
505 VAKKLAKLAKKLLAL-NH2 620 85
35
55 FAKLLAKALKKLL-NH2 20 32
157
506 VAKLLAKALKKLL-N H2 120 75
1
1
FALALKALKKALKKLKKALKKAL-GOOH 20 27
159
508 VALALKALKKALKKLKKALKKAL-GOOH 70 190
10
25 FALALKALKKLAKKLKKLAKKAL-NH2 16 24
160
509 VALALKALKKLAKKLKKLAKKAL-NH2 40 95
9
24 FALALKALKKLLKKLKKLAKKAL-NH2 10 55
161
510 VALALKALKKLLKKLKKLAKKAL-N H2 10 77
5 la actividad terapéutica. Esto se puede ver en la Tabla 27 siguiente, en la que se muestra que la sustitución de valina, en algunos casos, ha aumentado la actividad del péptido contra la bacteria gramnegativa Pseudomonas.
La hemólisis y los valores de WI38 representan valores de DL50. Los valores de P. aerug. Representan los valores de CMI en μg/ml contra Pseudomonas aeruginosa, número de registro en la ATCC 9027. 10 Tabla 27
SEC ID Nº
Nº P Secuencia Hemólisis WI38 P. aerug
17
35 FAKKLAKLAKKLAKLAL 100 25 200
32
50 VAKKLAKLAKKLAKLAL 420 45 15
25
43 FAKLLAKLAKKLL 20 25 100
30
48 VAKLLAKLAKKLL 200 160 5
86
124 FAKLLAKLAKKVL 300 21 100
116
154 FAKLLAKLAKKVL 450 110 100
Ejemplo 9: Efectos de la sustitución de tirosina
15 Cambiar una secuencia peptídica en la que el segundo aminoácido es tirosina puede conducir a propiedades deseables. FLAK98 (P-146, SEC ID Nº 108) es un péptido FLAK atípico debido a la presencia de una tirosina (Y) en la segunda posición. El significado de esta modificación y la secuencia global del péptido es que la estructura producida es probable que se pliegue fácilmente en una alfa-hélice a pH neutro (Montserret y coI., Biochemistry 39:
20 8362-8373, 2000). La capacidad para asumir una estructura alfa-helicoidal a pH neutro puede justificar la potencia y el amplio espectro de actividad vistos co este péptido. Montserret y col. demostraron que las secuencias como estas son dirigidas hacia su plegamiento no solo por fuerzas hidrofóbicas sino también por fuerzas electrostáticas. La sustitución de la tirosina por un aminoácido en los péptidos FLAK puede conducir, en general, a mejores propiedades.
25 Ejemplo 10: Péptidos preferidos actualmente
Los péptidos preferidos se pueden seleccionar a partir de los datos experimentales descritos anteriormente. Los péptidos antimicrobianos preferidos para bacterias grampositivas o gramnegativas se pueden seleccionar como 5 valores de CMI inferiores o iguales a aproximadamente 10 µg/ml o como valores de CMB inferiores o iguales a aproximadamente 25 µg/ml. Los péptidos antifúngicos preferidos se pueden seleccionar por tener valores de CMI o CMB inferiores o iguales a aproximadamente 25 µg/ml. Los péptidos anticancerosos preferidos se pueden seleccionar por tener valores de DL50 inferiores o iguales a aproximadamente 25 µg/ml.
10 La Tabla 28 siguiente enumera péptidos representativos preferidos actualmente en los que “X” indica que el péptido es un péptido preferido para la propiedad de dicha columna. La “longitud” del péptido es el número de residuos aminoacídicos en la secuencia.

Tabla 28 15
SEC ID Nº
Número P Longitud (AA) Anti-bacteriano Antifúngico Anticanceroso
1
1
23 X X
2
2
23 X X X
4
11 23 X
6
13 23 X
8
23 23 X X
10
25 23 X X
11
26 21 X X X
12
27 19 X X
13
27B 19 X X X
14
27C 19 X
15
30 23 X
16
34 16 X X X
17
35 17 X X X
18
36 19 X X
19
37 23 X X
20
38 15 X X
23
41 19 X
25
43 13 X X X
26
44 15 X X
27
45 14 X
28
46 15 X
29
47 12 X
30
48 13 X X X
31
49 12 X
32
50 17 X X
34
54 13 X
35
55 13 X X X
36
56 13 X
39
59 10 X
41
61 15 X
43
64 15 X
45
66 13 X
46
70 23 X X
47
71 18 X
48
72 22 X
50
74 13 X
75
13 X X
52
76 14 X
55
80 23 X
56
81 23 X X
57
91 15 X X
58
92 13 X X X
60
94 13 X X
65
101 13 X
66
102 13 X X
67
103 12 X X
68
104 20 X X
SEC ID Nº
Número P Longitud (AA) Anti-bacteriano Antifúngico Anticanceroso
74
110 12 X
75
111 13 X X
77
113 13 X
80
118 13 X X
81
119 14 X X
84
122 13 X X
85
123 10 X
86
124 13 X X X
87
125 13 X
93
131 5 X
106
144 12 X X
108
146 13 X X
112
150 17 X
115
153 17 X X
116
154 13 X
126
165 11 X X
128
167 12 X X
131
170 10 X
143
182 10 X
152
501 15 X X
155
504 13 X
157
506 23 X X
161
510 23 X X
162
67 23 X X
163
100 13 X X
164
69 23 X
165
97 13 X X
Los péptidos preferidos para estimulación y proliferación también se pueden seleccionar. La Tabla 29 siguiente enumera péptidos representativos preferidos en los que “X” indica que el péptido es un péptido preferido para la propiedad de dicha columna. Se prefieren los péptidos que son estimuladores para leucocitos a una concentración
5 de 0,1 µg/ml a 1,4 µg/ml, ya que a esta concentración los péptidos no son tóxicos para los glóbulos rojos, los fibroblastos WI-38 o leucocitos humanos. Se prefieren los péptidos que son estimuladores para fibroblastos a de 0,1 µg/ml a 1,0 µg/ml, ya que a esta concentración los péptidos no son tóxicos.
• En la Tabla 29, añada péptidos P146 (SEC 108) (Longitud= 13) y P98 (SEC 165) (Longitud= 13). Estos 10 péptidos deberían tener X en las columnas de leucocitos y de fibroblastos.
Tabla 29: Péptidos preferidos para estimulación/proliferación de leucocitos y fibroblastos Ejemplo 11: Efectos sinérgicos con lisozima
SEC ID Nº
Número P Longitud Leucocitos Fibroblastos
1
29 23 X X
2
2
23 X X
5
12 38 X X
6
13 23 X X
8
23 23 X X
10
25 23 X X
11
26 21 X X
12
27 19 X X
13
27B 19 X X
14
27C 19 X X
15
30 23 X X
16
34 16 X X
17
35 17 X X
20
38 15 X
27
45 14 X
28
46 15 X
30
48 13 X
32
50 17 X
34
54 13 X
45
66 13 X X
6
70 23 X X
SEC ID Nº
Número P Longitud Leucocitos Fibroblastos
50
74 13 X X
51
75 13 X X
55
80 23 X
56
81 23 X
57
91 15 X X
58
92 13 X X
59
93 13 X
60
94 13 X
61
95 13 X X
65
101 13 X
66
102 13 X
71
107 19 X X
74
110 12 X
75
111 13 X
77
113 13 X
80
118 13 X
81
119 14 X
87
125 13 X X
90
128 5 X X
91
129 5 X
92
130 5 X
108
146 13 X X
115
153 17 X
116
154 13 X
126
165 11 X
127
166 11 X
129
168 6 X X
132
171 11 X
137
176 11 X
138
177 12 X
139
178 11 X X
140
179 11 X X
141
180 11 X X
142
181 10 X X
143
182 10 X X
144
183 5 X X
145
184 5 X X
159
508 23 X X
162
67 23 X X
164
69 18 X
165
97 13 X X
Se analizó la sinergia entre los péptidos líticos y la lisozima. Se inoculó leche esterilizada con bacterias hasta 5 x 105 por ml. Péptido Shiva-10 (SEC ID Nº 4) se añadió a 10 µg/ml y se añadió lisozima de pollo a 1 mg/ml. Se determinó el porcentaje de destrucción de las bacterias.
Tabla 30
Staph. aureus
Pseudo aeruginosa
Péptido y lisozima
0% 100%
Péptido
0% 0%
Lisozima
0% 0%
10 Se determinó la sinergia entre cecropina SB-37 (SEC ID Nº 5) y la lisozima contra Pseudomonas syringae pV. tabaci (PSPT), Pseudomonas solanacearum (PS), Erwinia caratovora subsp. carotova (EC), y Xanthomonas campestris pv. campestris (XC). Se determinaron los valores de DL50 (µM).
Tabla 31
S8-37
Lisozima S8-37 y Lisozima
PSPT
5,2 > 0,19
PS
64 > 16
EC
1,48 > 0,44
XC
0,57 > 0,027
> indica más de 1.000.
Se determinó la sinergia entre Shiva-1 y la lisozima. El porcentaje de viabilidad de Pseudomonas aeruginosa se determinó respecto a los controles blanco. La lisozima se usó a la misma concentración molar que el péptido.
Tabla 32
Concentración del péptido (µM)
SB-37 Shiva-1 Lisozima (10x) Shiva-1 y Lisozima (10x)
0
100 100 100 100
0,01
100 100 100 56,6
0,1
79,4 69,6 82,2 25,8
1
48,8 37,9 52,1 4,4
5
38,5 1,5 7,9 0,2
7,5
0,7 0,1 0,6 0
25
0 0 0,4 0
10 Se determinó la sinergia entre Shiva-1 y la lisozima. Se determinó el porcentaje de viabilidad de S. intermedius 19930, S. intermedius 20034 y S. aureus grampositivas respecto a los controles blanco. La lisozima se usó a diez veces la concentración molar que el péptido.
15 Tabla 33: S. intermedius 19930 Los experimentos de sinergia también se pueden realizar usando péptidos en presencia de EDTA, que potencia los péptidos de forma aditiva o sinérgica.
Concentración del péptido (μM)
SB-37 Shiva-1 Lisozima (10x) Shiva-1 y Lisozima (10x)
0
100 100 100 100
0,01
100 100 100 100
0,1
94,7 81,8 100 79,2
0,5
69,4 65 81,3 65,1
1
42,5 42,1 53 43
5
36,1 35,2 49,5 17,2
10
5,6 1,2 34,4 1,1
50
0 0 22 0

Tabla 34: S. intermedius 20034
Concentración del péptido (μM)
SB-37 Shiva-1 Lisozima (10x) Shiva-1 and Lisozima (10x)
0
100 100 100 100
0,01
100 100 100 100
0,25
85,4 87,1 100 85,1
0,5
68 80 59 53,4
0,75
62,2 60,1 42,3 41
5
35,1 4,1 38,3 43
50
0 0 10 0

Tabla 35: S. aureus
Concentración del péptido (μM)
SB-37 Shiva-1 Lisozima (10x) Shiva-1 y Lisozima (10x)
0
100 100 100 100
0,01
100 100 100 100
0,1
100 100 100 100
0,5
81 50,1 100 100
1
47,5 24,4 51 31,2
5
31,8 15,9 18,4 82
10
5,6 4,5 13,3 4,5
50
1,9 1,6 9,5 1,4
Ejemplo 12: Efectos sinérgicos con antibióticos
5 Sinergia entre el péptido Shiva-1 (SEC ID Nº 4) y varios agentes antimicrobianos se investigó contra Escherichia coli 25922. La tabla siguiente ilustra los efectos beneficiosos de la combinación del péptido con los agentes, en los que los números son la concentración bactericida mínima (CMB, µg/ml).
10 Tabla 36
Agente
Sin péptido Con péptido
Shiva-10
50 n/a
Ticarcilina
100 50 (15 µg/ml péptido)
Cefoperazona
150 2,5 (15 µg/ml péptido)
Doxycyclina
5 1(15 µg/ml péptido)
Neomycina
100 5 (5 µg/ml péptido)
Amikacina
150 50 (5 µg/ml péptido)
Tetracilina
10 2,5 (5 µg/ml péptido)
La sinergia entre el péptido Shiva-1 (SEC ID Nº 4) y varios agentes antimicrobianos se investigó contra Staph aureus 29213. La tabla siguiente ilustra los efectos beneficiosos de la combinación del péptido con los agentes, en los que 15 los números son la concentración bactericida mínima (CMB, µg/ml).
Tabla 37
Agente
Sin péptido Con péptido
Shiva-10
200 n/a
Ampicilina
5 2,5
Ticarcilina
25 15
Cefoperazona
10 2,5
Tobramicina
25 10
Tetraciclina
10 1
20 La sinergia entre el péptido FLAK 26AM (P35; SEC ID Nº 17) y varios agentes antimicrobianos se investigó contra la CMB de Staph. aureus 29213. La tabla siguiente ilustra los efectos beneficiosos de la combinación del péptido con los agentes, en los que los números son la concentración bactericida mínima (CMB, µg/ml).
Este experimento determinó la CMB del péptido en ausencia del agente antimicrobiano o en presencia de la 25 concentración indicada del agente antimicrobiano.
Tabla 38
Agente
CMB del péptido
FLAK 26AM alone
50
Vancomicina (1 ppm)
32
Cefoperazona (0,25 ppm)
20
30 La sinergia entre la doxiciclina y varios péptidos se investigó contra P. aeruginosa 27853. La tabla siguiente ilustra los efectos beneficiosos de la combinación de doxiciclina y los péptidos, en los que los números son la concentración bactericida mínima (CMB, µg/ml). Cuando se combina con los péptidos, la doxiciclina se mantuvo a una concentración de 10 ppm.
35 Tabla 39
Agente
Sin doxaciclina Con doxaciclina
Ooxaciclina
n/a 100
SB-37 (P5 SEC ID Nº 3)
200 30
FLAK 26AM (P35 SEC ID Nº 17)
50 32
Se investigó la sinergia entre tetraciclina y varios péptidos contra la CMB de Escherichia coli 25922. La tabla 40 siguiente ilustra los efectos beneficiosos de la combinación de tetraciclina y los péptidos, en los que los números son la concentración bactericida mínima (CMB, µg/ml). Cuando se combina con los péptidos, la concentración de
tetraciclina se mantuvo a1,5 ppm.
Tabla 40
AgentE
Sin tetraciclina Con tetraciclina
Tetraciclina
n/a 10
FLAK06AM (P27 SEQ 10 NO:12)
75 25
FLAK 26AM (P35 SEQ 10 NO:17)
50 20
5 Ejemplo 13: Efectos sinérgicos con agentes quimioterapéuticos
Otros investigadores han notificado que los péptidos líticos que son inhibidores de las células cancerosas actuarán de forma sinérgica con los fármacos quimioterapéuticos del cáncer convencionales. Los péptidos FLAK no son una
10 excepción. La Tabla 41 siguiente demuestra que, por ejemplo, determinados péptidos FLAK son sinérgicos con tamoxifeno en la inhibición de la línea MCF7 de las células de cáncer de mama. La Tabla 42 enumera otros candidatos peptídicos anticancerosos más activos para la aplicación sinérgica con tamoxifeno u otros fármacos de terapia contra el cáncer.
15 Las Tablas 41 y 42 también muestran toxicidad de los péptidos seleccionados contra glóbulos rojos, glóbulos blancos y células W138. Cuando se usan a niveles no tóxicos muy bajos, determinados péptidos anticancerosos pueden potenciar sinérgicamente otros agentes quimioterapéuticos para permitir su uso eficaz a niveles de dosis sustancialmente menores con los consiguientes efectos secundarios menores.
20 Tabla 41: Sinergia de los péptidos FLAK con tamoxifeno sobre las células MCF7
Agente activo
DL50 en células MCF7
SEC ID Nº (Nº P)
AgentE MCF7 DL50 µg/ml Péptido conc. µg/ml Tamo. conc. µg/ml Total conc. µg/ml
Tamoxifeno
20 0 20 20
164 (69)
Son con Tamox. 79 2,5 4,6 7,1
145 (184)
Son con Tamox. 240 10 4 14
121 (160)
Son con Tamox. 240 11 3,7 14,7
106 (144)
Son con Tamox. 310 35 7,7 42,7
SEC ID Nº (Nº P)
MCF7 DL50 µg/ml RBC DL50 µg/ml W138 DL50 µg/ml WBC DL50 µg/ml
164 (69)
79 900 60 140
145(184)
240 850 1000 410
121 (160)
240 > 1000 700 900
106(144)
310 600 740 320
17 (35)
9 200 25 25
32(50)
32 420 40 420
20 (38)
17 350 100 54

Tabla 42: Otros candidatos peptídicos altamente activos para aplicaciones anticancerosas sinérgicas
SEC ID Nº (Nº P)
MCF7 DL50 µg/ml RBC DL50 µg/ml W138 DL50 µg/ml WBC DL50 µg/ml
17 (35)
9 200 25 25
32 (50)
32 420 40 420
20 (38)
17 350 100 54
25 Ejemplo 14: Efectos sinérgicos con factores de crecimiento
Anteriormente en el Ejemplo 17 y la Tabla 23 se ha demostrado que ciertos de los péptidos FLAK son sinérgicos con otros mitógenos o factores de crecimiento en las propiedades estimuladoras y/o proliferativas de los péptidos.
30 Ejemplo 15: Efectos sinérgicos con ácido nalidíxico y cloranfenicol
Se investigaron los efectos sinérgicos de los péptidos de la invención con cloranfenicol o ácido nalidíxico contra los mutantes de eflujo de Pseudomonas aeruginosa. Los valores de CMI se determinaron para el ácido nalidíxico o el cloranfenicol solo como basales. Los péptidos se añadieron a su concentración CMI1/4 y se determinó la 35 concentración de ácido nalidíxico o cloranfenicol hasta llegar a la CMI. La Tabla 43 muestra los efectos sinérgicos de
los péptidos con ácido nalidíxico contra P. aeruginosa H374, la Tabla 44 muestra los efectos sinérgicos de los péptidos con ácido nalidíxico contra P. aeruginosa H774 y la Tabla 45 muestra los efectos sinérgicos de los péptidos con cloranfenicol contra P. aeruginosa H374. El índice de concentración inhibidora fraccional (CIF) se usó para determinar la sinergia entre los péptidos y los antibióticos. Se analizador diluciones en serie por dos en presencia de una cantidad constante de péptido, igual a un cuarto de la CMI del péptido. El índice CIF se determinó del siguiente modo: CIF= 0,25 + CMIantibiótico en combinación/CMIantibiótico solo. Un índice CIF de 0,5 o menor se considera sinergia.
Tabla 43
Péptido en combinación (1/4 CMI)
P. aeruginosa H374 CMI Nal-comb. FIC Péptido en combinación (1/4 MIC) P. aeruginosa H374 MICNal-comb' FIC lndex
( µg/ml )
Índice
( µg/ml )
( µg/ml )
Nal solo
5000 - P80 2500 0,75
P12
2500 0,75 P81 5000 1,25
P23
2500 0,75 P97 5000 1,25
P24
5000 1,25 P100 2500 0,75
P25
2500 0,75 P101 5000 1,25
P26
2500 0,75 P102 5000 1,25
P27
2500 0,25 P103 625 0,375
P30
5000 1,25 P109 2500 0,75
P31
2500 0,75. P110 2500 0,75
P34
2500 0,75 P111 2500 0,75
P35
10 2,25 P118 2500 0,75
P37
2500 0,75 p119 2500 0,75
P39
1250 0,5 P124 2500 0,75
P41
5000 1,25 P146 625 375
P42
5000 1,25 P150 1250 0,5
P43
5000 1,25 P153 5000 1,25
P44
5000 1,25 P157 2500 0,75
P45
2500 0,75 P177 5000 1,25
P46
2500 0,75 P300 312 0,312
P49
2500 0,75 P301 625 0,375
P50
5000 1,25 P306 5000 1,25
P54
5000 1,25 P307 625 0,375
P55
5000 1,25 P504 5000 1,25
P56
2500 0,75 P508 5000 1,25
P59
2500 0,75 P510 625 0,375
P60
1250 0,5
P61
5000 1,25
P64
5000 1,25
P66
5000 1,25
P69
2500 0,75
P71
2500 0,75
P72
2500 0,75
P73
2500 0,75
P75
2500 0,75
Tabla 44
Péptido en combinación
P. aeruginosa H744 Péptido en combinación P. aeruginosa H744
CMI de Nal-com. ( µg/ml )
FIC lndex CMI Nal-com. ( µg/ml ) FIC lndex
Nal solo
624 - P80 624 1,25
P12
312 0,75 P81 624 1,25
P23
624 1,25 P97 78 0,375
P24
624 1,25 P100 624 1,25
P25
156 0,5 P101 624 1,25
P26
624 1,25 P102 624 1,25
P27
624 1,25 P103 624 1,25
P30
624 1,25 P109 624 1,25
P31
624 1,25 P110 624 1,25
P34
624 1,25 P111 624 1,25
Péptido en combinación
P. aeruginosa H744 Péptido en combinación P. aeruginosa H744
CMI de Nal-com. ( µg/ml )
FIC lndex CMI Nal-com. ( µg/ml ) FIC lndex
P35
624 1,25 P118 624 1,25
P37
624 1,25 P119 624 1,25
P39
624 1,25 P124 624 1,25
P41
624 1,25 P146 624 1,25
P42
624 125 P150 312 0,75
P43
624 1,25 P153 624 1,25
P44
624 1,25 P157 624 1,25
P45
624 1,25 P177 312 0,75
P46
624 1,25 P300 156 0,5
P49
624 1,25 P301 624 1,25
P50
624 1,25 P306 312 0,75
P54
624 1,25 P307 156 0,5
P55
624 1,25 P504 1248 2,25
P56
624 1,25 P510 624 1,25
p59
624 1,25
P60
624 1,25
P61
624 1,25
P64
624 1,25
P66
624 1,25
P69
312 0,75
P71
624 1,25
P72
312 0,75
P73
624 1,25
P75
624 1,25
Tabla 45
Péptido en combinación (1/4 CMI)
P.aeruginosa H374 Péptido en combinación (1/4 CMI) P. aeruginosa H374
CMI Cm-comb. ( µg/ml )
FIC lndex CMI Cm-comb' ( µg/ml ) Índice FIC
Cm solo
16 - P80 4 0,5
P12
16 1,25 P81 16 1,25
P23
8 0,75 P97 16 1,25
P24
16 1,25 P100 16 1,25
P25
4 0,5 P101 16 1,25
P26
8 0,75 P102 16 1,25
P27
8 0,75 P103 8 0,75
P30
16 1,25 P109 16 1,25
P31
16 1,25 P110 16 1,25
P34
16 1,25 P111 16 1,25
P35
16 1,25 P113 16 1,25
P37
4 0,5 P118 16 1,25
P39
8 0,75 P119 16 1,25
P41
16 1,25 P124 16 1,25
P42
16 1,25 P146 4 0,5
P43
16 1,25 P150 8 0,75
P44
16 1,25 P153 8 0,75
P45
16 1,25 P157 8 0,75
P46
8 0,75 P177 8 0,75
P49
8 0,75 P300 16 1,25
P50
16 1,25 P301 16 1,25
P54
16 1,25 P306 8 0,75
P55
16 1,25 P307 2 0,375
P56
16 1,25 P504 16 1,25
P59
8 0,75 P508 8 0,75
P60
4 0,5 P510 4 0,5
P61
16 1,25
P64
16 1,25
P66
16 1,25
P69
8 0,75
Péptido en combinación (1/4 CMI)
P.aeruginosa H374 Péptido en combinación (1/4 CMI) P. aeruginosa H374
CMI Cm-comb. ( µg/ml )
FIC lndex CMI Cm-comb' ( µg/ml ) Índice FIC
P71
8 0,75
P72
8 0,75
P73
8 0,75
P75
8 0,75
Ejemplo 16: Actividad contra cepas resistentes a fármacos
Se analizaron los péptidos por su actividad contra cepas sensibles y resistentes a tobramicina. Como se muestra en
la Tabla 46 siguiente, los péptidos P56 (SEC ID Nº 36), P74 (SEC ID Nº 50) y P25 (SEC ID Nº 87) mostraron mayor
actividad contra Pseudomonas ATCC 13096 resistente a tobramicina (tr) que contra Pseudomonas ATCC 27853
sensible a tobramicina (ts). Los mismos tres péptidos mostraron mayor actividad contra la cepa clínica 960890198
3c resistente a tobramicina (Tabla 46).
Tabla 46
Péptido
Pseudomonas 13096 tr Pseudomonas 27853 ts
SEC ID Nº 36 (P56)
16 125
SEC ID Nº50 (P74)
16 125
SEC ID Nº 87 (P125)
4 31
Tabla 47
Péptido
Pseudomonas 960890198-3c tr ts Pseudomonas 27853 ts
SEC ID Nº 36 (P56)
> 50 125
SEC ID Nº 50 (P74)
25 125
SEC ID Nº (P92)
50 63
Ejemplo 17: Cicatrización de heridas
15 Los péptidos de la invención se pueden usar en composiciones para liberación tópica o sistémica en aplicaciones de cicatrización de heridas. Las composiciones pueden ser un líquido, crema, pasta u otra formulación farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener otros agentes biológicamente activos. Las composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables.
20 Los péptidos FLAK han mostrado una potencia elevada contra las bacterias más asociadas con las infecciones de heridas.
S. aureus, S. pyogenes y P. aeruginosa (p.ej., Tablas 5, 6 y 7). Los péptidos han demostrado también la capacidad para ayudar en la cicatrización de heridas y, quizá, reducir la inflamación. Estas propiedades son todas características esenciales de productos de tratamiento de heridas y de infección de heridas. 25 Los péptidos preferidos actualmente para cicatrización de heridas mostrados en la Tabla 48 más adelante son péptidos que se prefieren para estimulación de leucocitos o fibroblastos o de ambos y para propiedades antibacterianas.
30 Tabla 48: Péptidos preferidos actualmente para cicatrización de heridas Ejemplo 18: Cicatrización de heridas con péptidos FLAK demostrada in vivo
SEC ID Nº
Nº P SEC ID Nº Nº P SEC ID Nº Nº P
1
1
50 74 93 131
2
2
51 75 108 146
5
12 55 80 115 153
6
13 56 81 116 154
8
23 57 91 126 165
10
25 58 92 127 166
11
26 59 93 129 168
12
27 60 94 132 171
13
278 61 95 137 176
14
27C 65 101 138 177
15
30 66 102 139 178
16
34 71 107 140 179
17
35 74 110 141 180
20
38 75 111 142 181
27
45 77 113 143 182
28
46 80 118 144 183
30
48 81 119 145 184
SEC ID Nº
Nº P SEC ID Nº Nº P SEC ID Nº Nº P
32
50 87 125 159 508
34
54 90 128 162 67
45
66 91 129 164 69
46
70 92 130 165 97
La patente de EE.UU. Nº 5,861,478 divulgó cicatrización de heridas in vivo en un modelo de ratas en el que el
5 agente de cicatrización era el péptido LSB-37. LSB-37 se identifica en el presente documento como SEC ID Nº 150 (péptido P306) y se evalúa en el presente documento a modo de comparación con los péptidos FLAK más pequeños que son objeto de la presente invención. Como se indica en el Ejemplo 17, los péptidos FLAK, basados en ensayos in Vitro extensos, son prometedores como agentes de cicatrización de heridas. Esto se ha demostrado en pruebas in vivo de determinados péptidos FLAK ( y otros) en un modelo de cicatrización de heridas tópica en animales
10 pequeños desarrollado para este fin.
El objetivo del estudio era evaluar los efectos de ciertos péptidos seleccionados sobre (i) el índice de cierre de heridas, (ii) la respuesta inflamatoria y (iii) el engrosamiento de la epidermis sobre una quemadura cutánea inducida químicamente. Se escogió la rata sin pelo como modelo de ensayo adecuado. En el estudio se usaron ratas hembra
15 sin pelo de 100 a 150 gramos de peso y de 8 a 12 semanas de edad.
Se descubrió que pieles basadas en fenol comunicadas en la literatura y en comunicaciones privadas eran sistémicamente tóxicas para usar en este estudio, en el que seis parches de ensayo (pieles) con un área de superficie total de > 2 pulgadas cuadradas se indujeron en un único animal. Como alternativa, se usó ácido
20 tricloroacético (TCA) al 70 % disuelto en etanol al 70 % para inducir los parches de erosión dérmica. Las oclusiones de piel de 30 minutos produjeron quemaduras de tercer grado con erosión completa de la epidermis y la dermis. Como agente de quemadura química, el tratamiento con TCA produjo en las ratas mucho menos trauma y mortalidad que lo observado con el modelo de fenol.
25 Las etapas del procedimiento del protocolo experimental fueron del siguiente modo:
1. Se anestesió al animal (40 mg/kg de fenobarbital).
2. Se tomaron fotografías en color del dorso del animal (con seis pieles separadas) antes de cada tratamiento 30 y, después, a diario.
3. La superficie de la piel de la rata se preparó limpiando con etanol al 70 %. Los discos de papel de filtro (diámetro de 1,1 cm) se empaparon en TCA al 70 %/etanol.
35 4. Los discos se colocaron en el dorso de la rata sin pelo durante 30 minutos (6 discos que proporcionan 2 discos control (sin tratamiento con péptido) y 4 discos para pieles que van a recibir tratamiento con péptido).
5. Tras una quemadura de 30 minutos se retiraron los discos. Veinticuatro horas después se aplicaron
diferentes soluciones peptídicas (1.500 ppm en solución salina) a cuatro pieles y se aplicó solución salina a 40 las dos pieles control.
6. Las soluciones peptídicas (y solución salina para los controles) se aplicaron a las seis heridas con un cepillo suave cada día.
45 7. Llevó aproximadamente un mes para que las heridas cicatrizaran (cierre completo de la herida con epidermis estabilizada), tras lo cual se sacrificó al animal.
8. La piel tratada se recogió, se tiñó una sección con tricromo y se montó sobre portaobjetos.
50 EL porcentaje de cierre de heridas para cada piel (seis sitios) se midió todos los días hasta sacrificar al animal. El porcentaje de cierre se determinó midiendo sobre las fotografías del animal el área de calva restante respecto al área de la cicatriz inicial tras la quemadura. Estas mediciones se realizaron digitalizando y analizando las pieles usando el programa Sigma Plot ProScan 4.
55 Tras un cierre completo de la herida, una porción de cada piel todavía tenía un área enrojecida inflamada que se cuantificó mediante el análisis Sigma Plot de la fotografía del animal, como un porcentaje de la cicatriz curada total. Esto proporcionó una medida del tratamiento de la quemadura tras TCA de la respuesta inflamatoria en cada sitio de la piel.
60 La extensión del engrosamiento de la epidermis (hiperqueratosis) en cada sitio también se determinó mediante medición con el programa Sigma Plot aplicado a los portaobjetos con la sección teñida de las diversas áreas de cicatrización y la piel sin tratar normal (control) rodeando a las pieles. A aumentos de 100X a 320X, las microfotografías de los portaobjetos de color proporcionaron una potente herramienta para dicha cuantificación de la
5 extensión de hiperqueratosis evidente en cada piel.
El tratamiento de los portaobjetos de la sección con tinciones selectivas produjo evidencia identificable de la presencia de leucocitos y fibroblastos en las áreas heridas. Esto también se cuantificó mediante el programa Sigma Plot. Se ha probado que es una herramienta útil en la determinación in vivo de los mecanismos por los cuales
10 diferentes péptidos afectaron al proceso de cicatrización de heridas, incluida la estimulación/proliferación de leucocitos y la estimulación/proliferación de fibroblastos, y los efectos quimiotácticos de los péptidos en la cicatrización de heridas in vivo.
El modelo animal descrito anteriormente y los protocolos se usaron en el ensayo de aproximadamente 20 de los
15 péptidos indicados en la Tabla 48 (y otros péptidos por comparación) como péptidos FLAK preferidos para cicatrización de heridas. A modo de ejemplo, los resultados siguientes en un experimento con cuatro péptidos evaluados en un único animal se muestran en la Tabla 49. Estos péptidos son las SEC ID Nº 66 (P102), SEC ID Nº 71 (P102), SEC ID Nº 115 (P153) y la SEC ID Nº: 119 (P157). El péptido de la SEC ID Nº 71 (P107) no es un péptido FLAK, sino que es un derivado de LSB-37 (SEC ID
20 Nº 150; P06). En los experimentos anteriores, se ha mostrado que estos dos péptidos tienen propiedades de cicatrización de heridas similares in vivo. La SEC ID Nº 119 (P157) es un péptido que no es FLAK, notificado en la literatura, que es un péptido de comparación.
La Tabla 49 soporta la conclusión de que varios péptidos evaluados para tras los tratamientos de heridas
25 demostraron capacidad para limitar las respuestas inflamatorias de quemaduras tras TCA. La SEC ID Nº 71 y la SEC ID Nº: 115 fueron superiores a este respecto y también mostraron la menor evidencia de hiperqueratosis (engrosamiento epidérmico). Dado que el experimento se realizó para el cierre completo de heridas a los 26 días, estos mismos dos péptidos mostraron una pequeña ventaja en el índice de cierre de heridas sobre los otros péptidos y no péptidos en tratamiento posterior a la herida. Estos dos péptidos también mostraron sustancialmente ausencia
30 de hiperqueratosis en comparación con el control no tratado de quemadura con TCA.
En general, los dos péptidos citados anteriormente mostraron la mejor actividad de cicatrización de heridas. No obstante, el experimento se realizó en condiciones estériles que normalmente no se producen en situaciones de heridas en un animal en la vida real. Dado que dichas heridas tópicas son objeto de infección, debe considerarse
35 que las mejores propiedades antibacterianas de la SEC ID Nº 66 (P102) y la SEC ID Nº: 115 (P153) los convierten en candidatos lógicos para aplicaciones de cicatrización de heridas.

Tabla 49: Ejemplo de cicatrización de heridas con el péptido FLAK in vivo seleccionado (modelo de rata)
Cierre De heridas
Área de respuesta inflamatoria Engrosamiento de la epidermis Leucocitos en el área de ensayo Fibroblastos en el área de ensayo
% de herida inicial
% de cicatriz curada % de Control (solo TCA) % de piel normal % de piel normal
MUESTRA DE PIEL
Piel normal
N/A N/A N/A 100 100
Quemadura con TCA sin tratar (control)
98,4 15 30 200 275
Quemaduras tratadas con péptido:
SEC ID Nº 66 (P102)
96,7 27 50 370 220
SEC ID Nº :71 (P107)
100 0 33 400 420
SEC ID Nº 115(P153)
99,1 7 25 235 350
SEC ID Nº : 119(P157):
95,2 25 80 265 450
40 Ejemplo 19: Tratamiento de la fibrosis quística (FQ)
La FQ es el trastorno genético autosómico recesivo más frecuente en Norteamérica, que produce inflamación e infección en los pulmones de 30.000 niños al año en EE.UU. Más del 90 % de las infecciones pulmonares de FQ se
45 deben a P .aeruginosa y más del 95 % de estos pacientes mueren por daños pulmonares. Ciertos péptidos FLAK son activos contra cepas resistentes a múltiples fármacos Pseudomonas aeruginosa y contra aislamientos clínicos de pacientes con FQ (Tablas 9, 43 y 44). Estos incluyen cepas resistentes a TOBI, el actual fármaco de elección para esta afección. Además, anteriormente se ha demostrado que los péptidos tales como estos (péptidos en alfahélice) tienen propiedades antiinflamatorias (Scott y col., J. lmmunol. 165: 3358-3365, 2000) y, por tanto, no sería sorprendente si los péptidos FLAK también exhiben esta propiedad. La combinación de un antiinflamatorio y un papel antiinfeccioso hace de estos péptidos candidatos extremadamente buenos como nuevos agentes terapéuticos para el pulmón con FQ.
5 Ejemplo 20: Tratamiento de enfermedades de transmisión sexual (ETS)
Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) son un problema significativo en Norteamérica que cuesta a los EE.UU. solos 1,0 billones de dólares americanos al año en costes de tratamiento. Uno de los problemas principales es la incidencia creciente de cepas de Candida resistentes a antifúngicos, principalmente a fluconazol, incluidas 10 especies tales como C. albicans, C. glabrata y C. tropicalis. Ciertos péptidos FLAK han mostrado una actividad significativa contra estas tres especies (Tablas 13 y 10) y presentan una oportunidad muy viable para el desarrollo de un agente antifúngico tópico para prevenir la diseminación de la enfermedad fúngica. Existen pruebas en la literatura que sugieren que los péptidos FLAK pueden también tener actividad contra otros agentes de ETS, incluidos virus y bacterias, que sugiere que también puede ser posible una aplicación de amplio espectro. Ciertos
15 péptidos FLAK demuestran un espectro amplio de actividad (Tablas 12 y 13).
Ejemplo 21: Tratamiento del acné
El acné está causado por una combinación de infección e inflamación que conduce a daño tisular y formación de
20 cicatriz. Se ha demostrado que los péptidos FLAK tienen actividad contra la bacteria principal aislada de úlceras producidas por acné, Propionibacterium acne y también probablemente exhiban actividades antiinflamatorias (Scott y coI., J. lmmunol. 165: 3358-3365, 2000). Además, los péptidos FLAK también han mostrado una tendencia a incrementar la velocidad y la eficiencia de la cicatrización de heridas, incrementar la proliferación de fibroblastos e incrementar la producción de colágeno y laminina. Todas estas características proporcionan evidencias
25 convincentes para la aplicación de los péptidos FLAK para el tratamiento del acné como terapéutica clínica o como cosmético.
Ejemplo 22: Aplicaciones cosméticas
30 Las características de los péptidos FLAK, tales como estimulación de colágeno, estimulación de fibroblastos y cicatrización de heridas, hacen del potencial de uso de dichos péptidos en cosmética, tales como productos antienvejecimiento y de rejuvenecimiento algo muy atractivo.
Ejemplo 23: Uso de péptidos FLAK en la industria alimentaria
35 Las principales causas de enfermedades relacionadas con la industria alimentaria son bacterias gramnegativas, tales como Salmonella typhimurium y Escherichia coli. Una serie de péptidos FLAK demostraron una actividad específica contra estos organismos (Tablas 7 y 12). La aplicación de estos péptidos al tratamiento y, también, la prevención de enfermedades transmitidas por alimentos es, por tanto, una aplicación atractiva. Por ejemplo, el uso
40 de dichos péptidos para la descontaminaicón de las superficies de preparación de alimentos es una aplicación específica y potencialmente nueva.
Ejemplo 24: Aplicación sistémica de los péptidos en suero
45 Una serie de péptidos se introdujo en suero de oveja a 1.280 ug/ml y se incubó a 37 ºC durante 30 minutos o 2 horas (Tabla 50). Posteriormente, las CMI en suero contra Pseudomonas aeruginosa se obtuvieron para determinar la extensión de la inactivación en suero de los péptidos. De los péptidos analizados, dos (P153 y P508) fueron solubles a 1,280 µg/ml en 70 % de suero y sus actividades disminuyeron únicamente de un modo modesto por exposición a suero. Esto sugiere que P153 y P508 pueden funcionar en suero y son buenos candidatos para una aplicación
50 sistémica.

Tabla 50: Inactivación en suero de los péptidos
Péptido
Solubilidad CMI 30 min de tratamiento (µg/ml) CMI 2 h de tratamiento (µg/ml)
P24
Precipitado 40 20 20 20
P31
Precipitado 20 20 20 20
P69
Precipitado 20 20 20 20
P81
Precipitado 20 20 20 20
P153
Soluble 10 5 20 5
P508
Soluble 40 20 40 20
KB142
Precipitado 20 20 20 20
KB146
Precipitado 20 20 20 20
Ejemplo 25: Estimulación de colágeno y laminina por los péptidos FLAK
Se cultivaron líneas celulares de fibroblastos en condiciones estándar y se analizaron por colágeno y laminina usando un sistema de ELISA fabricado por Panvera (Madison, WI). Los anticuerpos para colágeno y laminina fueron
5 fabricados por Takara Shuzo Co., Ltd Japón. La Tabla 51 siguiente muestra que uno de los cuatro péptidos mostraba una estimulación significativa de la producción de colágeno y laminina. Los otros tres péptidos analizados no estimularon ni inhibieron la producción (es decir, no se observó ningún efecto).
Tabla 51: Estimulación de colágeno y laminina 10
Péptido
Estimulación de colágeno Estimulación de laminina
TGFβ (control)
60% --
P153 (SEC ID Nº 115)
120% 32%
P165 (SEC ID Nº : 126)
0% 0%
P94 (SEC ID Nº 60)
0% 0%
P12 (SEC ID Nº :5)
0% 0%
Listado de secuencias
<110> Owen, Donald R. 15
<120> PÉPTIDOS BIOACTIVOS CORTOS Y PROCEDIMIENTOS PARA SU USO
<130> HELlX028 20 <140>
<141>
<160> 165 <170> Patentln Ver. 2.1 25
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 30
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> PRT 40 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23) 45 <223> AMIDACIÓN
<400> 2
<210> 3
<211> 38
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 3
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 15
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN 20
<400> 4
25 <210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
30 <220>
<221> MOD RES
<222> (38)
<223> AMIDACIÓN
35 <400> 5
<210>
6 40 <211> 23
<212> PRT 35 <213> SINTÉTICO
<400> 6
<210>
7 5 <211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 10 <221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 7 15
<210> 8
<211> 23 20 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 25 <222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> PRT 35 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23) 40 <223> AMIDACIÓN
<400> 9 <210> 10
<211> 23 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (21) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 11
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<220>
<221> MOD RES
<222> (19)
<223> AMIDACIÓN 40
<400> 12
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 13
10 <210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
15 <400> 14
<210> 15 20 <211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 15 30
<210> 16
<211> 16 35 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 40 <222> (16)
<223> AMIDACIÓN
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> PRT 50 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 17
10 <210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
15 <220>
<221> MOD_RES
<222> (19)
<223> AMIDACIÓN
20 <400> 18
<210> 19 25 <211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 30 <221> MOD RES
<222> (13).. (14)
<223> Xaa = D-Iysine
<400> 19 35
<210> 20
<211> 15 40 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 45 <222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 20
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 5
<220>
<221> MOD-RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN 10
<400> 21
15 <210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
20 <220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
25 <400> 22
<210> 23 30 <211> 19
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 35 <221> MOD RES
<222> (19)
<223> AMIDACIÓN
<400> 23 40
<210> 24
<211> 22 45 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 50 <222> (22)
<223> AMIDACIÓN
<400> 24 <210> 25
<211> 13 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 25
<210> 26
<211> 15
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (15) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 26
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<220>
<221> MOD RES
<222> (14)
<223> AMIDACIÓN 40
<400> 27
45 <210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
50 <220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 28
5 <210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
10 <220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
15 <400> 29
<210> 30 20 <211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 30 30
<210> 31
<211> 12 35 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 40 <222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 31
<210> 32
<211> 17
<212> PRT 50 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (17) 55 <223> AMIDACIÓN
<400> 32
5 <210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
10 <220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
15 <400> 33
<210> 34 20 <211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 34 30
<210> 35
<211> 13 35 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 40 <222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 35
<210> 36
<211> 13
<212>
PRT 50 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 36
<210> 37
<211> 10
<212>
PRT 10 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (10) 15 <223> AMIDACIÓN
<400> 37
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 25
<220>
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN 30
<400> 38
35 <210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
40 <220>
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
45 <400> 39
<210> 40 50 <211> 9
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 55 <221> MOD RES
<222> (9) .
<223> AMIDACIÓN
<400> 40
<210> 41
<211> 17
<212> PRT 10 <213> SINTÉTICO
<400> 41
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 20
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN 25
<400> 42
30 <210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
35 <220>
<221> MOD_RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
40 <400> 43
<210> 44 45 <211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> <221> MOD_RES 50 <222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 44 <210> 45
<211> 13 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 45
<210> 46
<211> 22
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (22) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 46
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<400> 47
40 <210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
45 <400> 48 <210> 49
<211> 23 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 49
<210> 50
<211> 13
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 50
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN 40
<400> 51
45 <210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (14)
<223> AMIDACIÓN
<400> 52
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 53
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 54
<210> 55
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 55
<210> 56
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 56
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 57
<210> 58
<211> 13
<212> PRT 15 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 58
25
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)<223> AMIDACIÓN
35
<400> 59
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
45 <220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 60
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 61
<210> 62
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 62
<210> 63
<211> 31
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (31)
<223> AMIDACIÓN
<400> 63
45 <210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 64
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 65
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 66
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 67
<210> 68
<211> 20
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (20)
<223> AMIDACIÓN
<400> 68
5 <210> 69
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
10 <220>
<221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
15 <400> 69
<210> 70 20 <211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 70 30
<210> 71
<211> 19 35 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 40 <222> (19)
<223> AMIDACIÓN
<400> 71
<210> 72
<211> 26
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (26)
<223> AMIDACIÓN
<400> 72
<210> 73 15 <211> 16
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (16)
<223> AMIDACIÓN
<400> 73 25
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 35 <222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 74
<210> 75
<211> 13
<212> PRT 45 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 75
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 76
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 77
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 78
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 79
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 80
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (14)
<223> AMIDACIÓN
<400> 81
<210> 82
<211> 14
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (14) <223> AMIDACIÓN
<400> 82
<210> 83
<211> 14
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (14)
<223> AMIDACIÓN
<400> 83
5 <210> 84
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
15 <400> 84
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 85
<210> 86
<211> 13 35 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 86
<210> 87
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 87
<210> 88
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 99
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 100
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (16)
<223> AMIDACIÓN
<400> 101 <210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 102
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (7)
<223> AMIDACIÓN
<400> 103
<210> 104
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 104
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 105
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 106
<210> 107
<211> 8
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (8)
<223> AMIDACIÓN
<400> 107
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 108
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 109
5 <210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
15 <400> 110
<210> 111
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220> 25 <221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 111 35
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 45 <222> (17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 112
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 113
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 114
<210> 115
<211> 1
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 115
<210> 116
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 116
<210> 117
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 117
<210> 118
<211> 17
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 118
<210> 119
<211> 26
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (26)
<223> AMIDACIÓN
<400> 119
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (16)
<223> AMIDACIÓN
<400> 120 <210>121
<211> 16
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 121
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (9)
<223> AMIDACIÓN
<400> 122
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 123
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (17)
<223> AMIDACIÓN
<400> 124
<210> 125
<211> 16
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 125 <210> 126
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 126
<210> 127
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 127
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 128
<210> 129
<211> 6
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> AMIDACIÓN
<400> 129
<210> 130 5 <211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 130 15
<210>131
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES 25 <222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 131
<210> 132
<211> 11
<212> PRT 35 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 132
<210> 133
<211> 4
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (4)
<223> AMIDACIÓN
<400> 133
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (5)
<223> AMIDACIÓN
<400> 134
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (9)
<400> 135
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (9)
<223> AMIDACIÓN
<400> 136
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 137
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)
<223> AMIDACIÓN
<400> 138
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 139
<210> 140
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 140
<210> 141
<211> 11
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (11)
<223> AMIDACIÓN
<400> 141
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 142
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 143
<210> 144
<211> 4
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (4)
<223> AMIDACIÓN
<400> 144
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (5)
<223> AMIDACIÓN
<400> 145
<210> 146
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 146
<210>147
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 147
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 148
<210> 149
<211> 10 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (10)
<223> AMIDACIÓN
<400> 149
<210> 150
<211> 38
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (38) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 150
30 <210>151
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<220>
<221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN 40
<400> 151
45 <210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 152
<210> 153 15 <211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
<400> 153 25
<210> 154
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 35 <222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 154
<210> 155
<211> 19
<212> PRT 45 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)
<223> AMIDACIÓN
<400> 155
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (15)
<223> AMIDACIÓN
<400> 156
<210> 157
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (13) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 157
<210> 158
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 158
45 <210> 159
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 159
<210> 160
<211> 23 5 <212> PRT
<213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES 10 <222> (23)
<223> AMIDACIÓN
<400> 160
<210> 161
<211> 23
<212> PRT 20 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (23) 25 <223> AMIDACIÓN
<400> 161
<210> 162
<211> 23
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 35
<400> 162
40 <210> 163
<211> 30
<212> PRT
<213> SINTÉTICO
<400> 163
<210> 164
<211> 18
<212> PRT 10 <213> SINTÉTICO
<220>
<221> MOD RES
<222> (18) 15 <223> AMIDACIÓN
<400> 164
<210> 165
<211> 13
<212> PRT
<213> SINTÉTICO 25
<220>
<221> MOO RES
<222> (13)
<223> AMIDACIÓN
30 <400>165

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un péptido aislado, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido consiste en la SEC ID Nº 43, SEC ID Nº 20, SEC ID Nº 25, SEC ID Nº 26, SEC ID Nº 35, SEC ID Nº 39, SEC ID Nº 81, SEC ID Nº 91, SEC ID Nº 92, SEC ID 5 Nº 129 o la SEC ID Nº 138.
  2. 2. El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es SEC ID Nº 43.
  3. 3. El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es SEC ID Nº 129. 10
  4. 4. El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es SEC ID Nº 91 o la SEC ID Nº 92.
  5. 5. El péptido de la reivindicación 1, en el que el extremo C del péptido está amidado.
    15 6. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, para su uso como medicamento.
  6. 7. Una composición que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un transportador farmacéuticamente aceptable del mismo.
    20 8. La composición de la reivindicación 7, en la que la composición está en forma de un aerosol, emulsión, líquido, loción, crema, pasta, pomada o espuma.
  7. 9. La composición de la reivindicación 7 para usar en administración tópica en la piel.
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