ES2387121T3 - Suplementos dieteticos basados en frutos de jusara y asai - Google Patents

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Abstract

Una composición de suplemento dietético que comprende pulpa de fruto de Euterpe edulis (jusará) liofilizada, enla que la composición:(a) comprende una concentración de antocianina total superior a 1 miligramo por gramo de peso total;(b) tiene un valor de CAROFL superior a 350 micromoles de ET por gramo de peso total; y(c) tiene un contenido en agua residual inferior al 3 por ciento en peso del peso total.

Description

Suplementos dietéticos basados en frutos de jusará y asaí
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos de fabricación de suplementos dietéticos basados en frutos, 5 estables, de sabor agradable liofilizados, y usos de los mismos.
Antecedentes de la invención
Durante las últimas décadas, los radicales libres han llegado a ser cada vez más apreciados por su importancia para la salud humana y la enfermedad. Muchas enfermedades comunes y potencialmente mortales, incluyendo ateroesclerosis, cáncer, y envejecimiento, tienen reacciones de radicales libres como mecanismo subyacente de daño.
10 Durante este periodo de tiempo, la comprensión conceptual de la interacción de los radicales libres con los organismos vivos ha evolucionado y proporcionado oportunidades sin precedentes para mejorar la calidad e incluso la duración de la vida humana.
Uno de los tipos más comunes de radicales libres son las especies reactivas del oxígeno (ERO). Éstas son los productos de la respiración celular normal y del metabolismo y en general están reguladas por antioxidantes 15 producidos en el cuerpo. Debido a los agentes medioambientales tales como la contaminación, y a factores del estilo de vida, tales como el tabaco o el ejercicio, la producción de radicales libres se incrementa. Este incremento puede llevar a un desequilibrio corporal, en especial mientras el cuerpo envejece y los mecanismos que producen antioxidantes pierden su capacidad para producir estos compuestos a su tasa necesaria, dando como resultado el estrés oxidativo. El daño resultante puede variar desde la alteración de los procesos biológicos, la destrucción de las
20 células, y la mutación de material genético, lo que puede producir la aparición de cáncer.
El uso potencial de los complementos alimenticios para la protección contra los efectos del estrés oxidativo y la progresión de enfermedades degenerativas y el envejecimiento, ha sido objeto de un número creciente de estudios realizados durante las últimas dos décadas. Actualmente en el mercado hay muchos productos que contienenantioxidantes en diferentes niveles. Éstos vienen en forma de alimentos, líquidos y complementos nutricionales. Las
25 fuentes más ricas de estos nutrientes esenciales se encuentran comúnmente en frutos y hortalizas que tienen compuestos tales como vitamina C, Vitamina E, beta-caroteno y otros.
La hipótesis antioxidante postula que el aporte con antioxidantes alimenticios puede aliviar el desequilibrio redox asociado a enfermedad. Los antioxidantes cumplen la función de unirse a estos radicales libres y estabilizarlos y eliminarlos del sistema, reduciendo así la cantidad de daño que pueden provocar los radicales libres.
30 Hasta la fecha se han desarrollado antioxidantes sintéticos tales como BHA (hidroxianisol butilado), BHT (hidroxitolueno butilado) y NDGA (ácido nordihidroguaiarético). A modo de ejemplos de antioxidantes naturales, existen enzimas antioxidantes tales como superóxido dismutasa, peroxidasa, catalasa y glutatión peroxidasa, y sustancias antioxidantes no enzimáticas, tales como tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), carotenoide y glutatión.
35 Sin embargo, los antioxidantes sintéticos pueden provocar reacciones alérgicas y oncogénesis debido a su fuerte toxicidad en el cuerpo, y alterarse fácilmente por calor debido a su sensibilidad a la temperatura. Por otro lado, los antioxidantes naturales son más seguros que los antioxidantes sintéticos en el cuerpo, pero tienen el problema de un efecto débil. Por lo tanto, se ha requerido el desarrollo de un antioxidante natural nuevo que no tenga problema respecto a la seguridad de uso y que además tenga una actividad antioxidante excelente.
40 Muchos estudios han demostrado las propiedades protectoras de los flavonoides polifenólicos. Se ha informado de propiedades antimutagénicas, anticarcinógenas e inmunoestimulantes de los flavonoides. Los flavonoides son un gran grupo de polifenoles naturales que se encuentran en frutos, hortalizas, cereales, corteza, té y vino que tienen un potencial eliminador de radicales libres in vitro probado.
Las antocianinas son compuestos naturales que son responsables de los colores rojo, púrpura, y azul de muchos
45 frutos, hortalizas, granos de cereales y flores. Por ejemplo, los colores de las bayas, tales como arándanos americanos, arándanos europeos, fresas, frambuesas, variedad de mora Boysen, variedad de mora Marion, arándanos rojos, se deben a muchas antocianinas diferentes. Se han identificado en la naturaleza, más de 300 antocianinas estructuralmente distintas. Debido a que las antocianinas son naturales, han suscitado mucho interés para su uso como colorantes para alimentos y bebidas. Las proantocianinas son otra clase de compuestos de
50 flavonoides que se encuentran en frutos y hortalizas y, aunque son incoloros, tienen actividades antioxidantes.
Recientemente, se ha intensificado el interés por los pigmentos de antocianinas debido a sus posibles beneficios para la salud como antioxidantes alimenticios (Bobbio F. O. et al. (2002), Acta Alimentaria 31, páginas. 371-377; Kitagawa
R. et al. (1994), Journal of Food Science 59, páginas. 844-848). Por ejemplo, los pigmentos de antocianina de los
arándanos europeos (Vaccinium myrtillus) se han utilizado ampliamente para mejorar la agudeza visual y para tratar 55 trastornos circulatorios. Existen pruebas experimentales de que determinadas antocianinas y flavonoides tienen
propiedades antiinflamatorias. Además, existen informes de que las antocianinas administradas por vía oral son beneficiosas para tratar diabetes y úlceras y pueden tener actividades antivíricas y antimicrobianas. Se cree que la base química de estas propiedades deseables de los flavonoides está relacionada con su capacidad antioxidante. Por tanto, las características antioxidantes asociadas con las bayas y otros frutos y hortalizas se han atribuido a su contenido en antocianina.
Actualmente en el mercado hay muchos productos que contienen antioxidantes en diferentes niveles. Éstos vienen en forma de alimentos, líquidos y complementos nutricionales. Las fuentes más ricas de estos nutrientes esenciales se encuentran comúnmente en frutos y hortalizas que tienen compuestos tales como vitamina C, Vitamina E, antocianinas, beta-caroteno y otros. Los antioxidantes cumplen la función de unirse a estos radicales libres y estabilizarlos y eliminarlos del sistema, reduciendo así la cantidad de daño que pueden provocar los radicales libres.
Dado que muchos frutos y hortalizas contienen estos nutrientes esenciales, es muy importante poder evaluar la capacidad de los antioxidantes en estos alimentos para absorber los radicales libres. Los investigadores de USDA en la Universidad de Tufts desarrollaron una prueba de laboratorio conocida como CARO (capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno), que clasifica los diferentes alimentos según su contenido en antioxidantes y su capacidad para unir estos radicales libres. A través de esta prueba, los diferentes alimentos se pueden comparar y analizar para determinar su capacidad antioxidante.
Hay una necesidad de identificar los frutos u hortalizas con puntuaciones de CARO altas y de desarrollar y producir complementos alimenticios basados en ellas.
Breve sumario de la invención
La presente invención como se define en las reivindicaciones se refiere a la identificación del fruto del asaí y del fruto de la jusará (palmito) con puntuaciones de CARO altas y actividad inhibidora de la ciclooxigenasa. En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de suplemento dietético que comprende pulpa de fruto liofilizada en la que la concentración de antocianina total es mayor de aproximadamente 1 miligramo por gramo de peso total, la composición tiene un valor de CAROFL mayor de aproximadamente 350 micromoles de TE por gramo de peso total y un contenido en agua residual menor de aproximadamente un 3 por ciento del peso total. En una realización, la composición de suplemento dietético de la invención comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento con una composición de suplemento dietético que comprende pulpa de fruto liofilizada en la que la composición tiene un valor de inhibición de la ciclooxigenasa mayor de aproximadamente 15 mg equivalentes de Aspirina® por gramo de peso total y un contenido en agua residual menor de aproximadamente un 3 por ciento en peso del peso total.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de una composición de suplemento dietético basado en frutos, estable y de sabor agradable que comprende pelar los frutos para aislar la pulpa del fruto del fruto; congelar la pulpa del fruto hasta una temperatura por debajo de aproximadamente -5 ºC; y liofilizar la pulpa del fruto bajo condiciones para proporcionar un polvo de pulpa granulada, liofilizada con un contenido en agua residual menor de un 3 por ciento en peso, en el que el polvo de pulpa de fruto liofilizada es más estable y de sabor más agradable que una preparación de pulpa de fruto. La etapa de pelado consiste en pelar mecánicamente los frutos durante un período de tiempo de entre aproximadamente 2 minutos a 5 minutos aproximadamente y la etapa de pelado se lleva a cabo usando aproximadamente 1 litro de agua por 2 kg de frutos. Aún en otra realización, el procedimiento de fabricación de la composición de suplemento dietético proporciona una composición de suplemento dietético basado en frutos que tiene un valor de CAROFL mayor de aproximadamente 350 micromoles de TE por gramo de peso total. En otra realización preferida, el procedimiento de fabricación de la composición de suplemento dietético proporciona una composición de suplemento dietético basado en frutos que tiene un valor de inhibición de la ciclooxigenasa mayor de aproximadamente 15 mg equivalentes de Aspirin® por gramo de peso total.
Aún en otro aspecto, la invención proporciona una composición de suplemento dietético para su uso en la prevención
o el tratamiento de una enfermedad o un daño inducido por reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición de suplemento dietético basado en frutos de la invención, en la que la composición desactiva los radicales libres y reduce el daño inducido por radicales libres patológicos. En una realización, la enfermedad o daño se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación y daño tisular inducido por una toxina ambiental.
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de suplemento dietético para su uso en el alivio de los efectos perjudiciales de reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero que sufre una enfermedad o un daño inducido por reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición de suplemento dietético basado en frutos de la invención, en la que la composición desactiva los radicales libres y reduce el daño inducido por radicales libres patológicos. En una realización, la enfermedad o daño se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de
colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación, y daño tisular inducido por una toxina ambiental.
Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de suplemento dietético para su uso en la inhibición de la actividad de la enzima ciclooxigenasa en un mamífero, comprendiendo administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende una composición de suplemento dietético basado en frutos de la invención. En una realización, la composición de suplemento dietético basada en frutos comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición de suplemento dietético basada en frutos se administra por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en: vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intracerebral, intracerebelar, intrabronquial, intratecal, tópica y aerosol.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de suplemento dietético para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o un daño asociado con la actividad de la enzima ciclooxigenasa en un mamífero, comprendiendo administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende la composición de suplemento dietético basada en frutos de la invención. En una realización, la composición de suplemento dietético basada en frutos comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición de suplemento dietético basada en frutos se administra por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en: vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intracerebral, intracerebelar, intrabronquial, intratecal, tópica y aerosol. En otra realización, la enfermedad
o daño se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación, y daño tisular inducido por una toxina ambiental.
Estos y otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada de la invención proporcionada a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor por referencia a los siguientes dibujos que son únicamente con fines ilustrativos:
La FIG. 1 es una gráfica que muestra un espectro de absorción representativo de polvo de asaí liofilizada.
La FIG. 2 es una gráfica que muestra el perfil de antocianina de polvo de jusará liofilizado como se determina por la técnica cromatográfica de CL/EM/EM.
La FIG. 3 es un diagrama esquemático que muestra las estructuras químicas de las antocianinas en polvo de jusará liofilizado.
La FIG. 4 es una gráfica que muestra el perfil de antocianina de polvo de asaí liofilizada como se determina por la técnica cromatográfica de CL/EM/EM.
La FIG. 5 es un diagrama esquemático que muestra las estructuras químicas de las antocianinas en polvo de asaí liofilizada.
La FIG. 6 es una gráfica que muestra el perfil de compuesto fenólico de polvo de jusará liofilizado como se determina por la técnica de HPLC y de espectroscopía de masas.
La FIG. 7 es un diagrama esquemático que muestra las estructuras químicas de los compuestos fenólicos en polvo de jusará liofilizado.
La FIG. 8 es una gráfica que muestra los perfiles de proantocianina de polvo de asaí liofilizada y de polvo de jusará liofilizado como se determina por una técnica cromatográfica.
La FIG. 9 es un diagrama esquemático que muestra las estructuras químicas de compuesto fenólico en polvo de asaí liofilizada y en polvo de jusará liofilizado.
La FIG. 10 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de hortalizas seleccionadas como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 11 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de frutos frescos como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 12 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de frutos frescos
seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 13 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizada y de polvo de jusará liofilizado con frutos frescos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 14 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante asaí liofilizada con frutos frescos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 15 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante polvo de asaí liofilizada con hortalizas frescas seleccionadas como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 16 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de frutos, hortalizas y frutos secos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 17 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de frutos secos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 18 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de asaí deshidratada con frutos deshidratados seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 19 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante polvo de asaí liofilizada con hortalizas frescas seleccionadas como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 20 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de asaí deshidratada con frutos deshidratados seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CARO.
La FIG. 21 es una gráfica de histograma que compara la actividad antioxidante de hortalizas seleccionadas por la técnica de análisis de CAROHO.
La FIG. 22 es un diagrama esquemático de gráfico de flujo que detalla la preparación de zumo del fruto de asaí.
La FIG. 23 es un diagrama esquemático del aparato de pelado usado en la preparación del zumo del fruto de asaí.
La FIG. 24 es un diagrama esquemático de gráfico de flujo que detalla un procedimiento de preparación de polvo de asaí liofilizada.
Descripción detallada de la invención
Por lo tanto, se apreciará que determinados aspectos, modos, realizaciones, variaciones y características de la invención se describen a continuación en diversos niveles de detalle para proporcionar una comprensión en profundidad de la presente invención. En general, esta divulgación proporciona composiciones de suplemento dietético beneficiosas, combinaciones de estas composiciones con otras composiciones de suplemento dietético y procedimientos relacionados de producción y uso de las mismas.
En consecuencia, los diversos aspectos de la presente invención se refieren a usos terapéuticos o profilácticos de determinadas composiciones de suplemento dietético particulares para evitar o tratar una enfermedad o un daño inducido por reacciones de radicales libres patológicos. Los diversos aspectos de la presente invención se refieren además a usos terapéuticos o profilácticos de determinadas composiciones de suplemento dietético particulares para evitar o tratar una enfermedad o un daño asociado con el incremento en la actividad de la enzima ciclooxigenasa. En consecuencia, a continuación siguen diversas realizaciones particulares que ilustran estos aspectos.
Se apreciará que se pretende que los diversos modos de tratamiento o prevención de afecciones médicas que se describen signifiquen "sustancial", lo que incluye un tratamiento o prevención total, pero también menor de total, y en los que se logra algún resultado biológica o médicamente relevante.
Definiciones
Un "sujeto", como se usa en el presente documento, es preferentemente un mamífero, tal como un ser humano, pero también puede ser un animal, por ejemplo, animales domésticos (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).
Una "cantidad eficaz" de un compuesto, como se usa en el presente documento, es una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, por ejemplo, una cantidad que de como resultado la prevención de o una disminución en los síntomas asociados con una enfermedad que se está tratando. La cantidad de compuesto administrado al sujeto dependerá del tipo y de la gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales
como salud general, edad, sexo, peso corporal y la tolerancia a los fármacos. También dependerá del grado, gravedad y tipo de enfermedad. El experto podrá determinar las dosificaciones apropiadas dependiendo de éstos y otros factores. Normalmente, una cantidad eficaz de los compuestos de la presente invención, suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico, varía de desde aproximadamente 0,000001 mg por kilogramo de peso corporal por día hasta aproximadamente 10.000 mg por kilogramo de peso corporal por día. Preferentemente, los intervalos de dosificación son desde aproximadamente 0,0001 mg por kilogramo de peso corporal por día hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar en combinación unos con otros, o con uno o más compuestos terapéuticos adicionales.
"Asaí" es una especie muy conocida de palmera característica de la región norte de Brasil, conocida como Pará. La asaí se caracteriza por un tronco delgado y frutos redondos agrupados de forma ovalada que son de color morado oscuro, a veces incluso tirando a negro cuando está maduro. El nombre en Latín para asaí es Euterpe oleracea, Martius; familia, Palmáceas. También se conoce en inglés como "palmera de la col". En Brasil se conoce como: açaí-do-Pará, açaí-do-baixo Amazonas, palmito de açaí, acaizeiro, açal, assaí, jiçara, juçara, palmiteiro, piria; en Colombia se conoce como: assai y manaca; y uacai; y en Suriname se conoce como: manaka, pinapalm, prasara, wapoe y wasei. El término asaí también incluye otra subespecie de Euterpe, E. catinga Wallace, que también se encuentra en Brasil y se denomina "asaí". Finalmente, el término asaí también incluye otra subespecie de Euterpe, E. precatoria Martius, que se encuentra en Bolivia y se conoce en las regiones de Sudamérica y también se denomina "açaí" y "juçara".
"Jusará" es otra especie de palmera. El nombre en Latín para jusará es: Euterpe edulis, Martius; familia, Palmáceas. También se conoce en Brasil como: assai, açai, plamito, palmito doce, iuçara, palmito juçara, ripeira, içara, juçara, ensarova, palmiteiro. El término jusará también incluye otra subespecie de Euterpe, E. espiritosantensis Fernandes, que también se encuentra en Brasil, denominada como "juçara". Finalmente, el término asaí también incluye otra subespecie de Euterpe, E. precatoria Martius, que se encuentra en Bolivia y se conoce en las regiones de Sudamérica y también se denomina "açaí" y "juçara".
Las referencias citadas en toda esta solicitud se considerarán en su totalidad.
Propiedades antioxidantes y sus usos
La presente invención identificó los frutos de dos familias de palmeras, asaí y jusará, que tienen puntuaciones de CARO significativamente mayores que cualquier otro fruto u hortaliza sometida a prueba.
Se sabe que los frutos de asaí contienen una alta proporción de ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados, y una concentración relativamente baja de grasas saturadas y ácidos grasos trans. También se sabes que los frutos de asaí son ricos en lípidos, fibras y proteína, y que contienen vitamina E y antocianinas, dos antioxidantes conocidos. Sin embargo, estos frutos han sido infrautilizados en el pasado debido a que los frutos de asaí son muy propensos a un deterioro rápido debido a la oxidación y a la contaminación microbiana por bacterias, hongos y levaduras. En consecuencia, el fruto y el zumo obtenido a partir de los frutos de asaí se deterioran rápidamente, y pierden rápidamente su palatabilidad y sus propiedades antioxidantes (casi la mitad de las antocianinas se degradan en dos días después de que se recoge el fruto). En un esfuerzo por superar el rápido deterioro del fruto y el zumo de asaí, y, por lo tanto, para exponer el producto a mercados más amplios, algunas empresas han intentado congelar la pulpa del fruto. Sin embargo, congelar simplemente la pulpa del fruto de asaí de esta manera requiere una monitorización cuidadosa de la temperatura (incluso dando como resultado desviaciones relativamente pequeñas de la temperatura la activación de las enzimas de deterioro y de agentes de fermentación. Además, cuando se descongela esta pulpa de fruto congelada para su uso, estos agentes también se activan dando como resultado la arenosidad a la pulpa.
Los problemas anteriores, entre otros, se han resuelto por la presente invención. Específicamente, como se describe en los ejemplos a continuación, la presente invención proporciona una composición de suplemento dietético basado en asaí estable y de sabor agradable con una concentración de antocianinas significativamente mayor y con puntuaciones de CARO mayores que cualquier otra composición de fruto u hortaliza liofilizada sometida a prueba.
Como resultado de la presente invención, ahora es evidente que el fruto de asaí proporciona una fuente muy buena para un suplemento dietético. Antes de la presente invención, el fruto se usó principalmente como una bebida energética o como parte de un dulce congelado con una vida útil en almacenamiento corta. Las composiciones de suplemento dietético basadas en asaí de la presente invención proporcionan un producto estable y de sabor agradable que tiene una vida útil en almacenamiento significativamente mayor, mientras que se incrementas las propiedades antioxidantes del fruto de asaí. La presente invención permite no sólo que las características altamente alimenticias del fruto se conserven, sino que se potencien significativamente, y que se disfruten sin los problemas asociados de degradación rápida.
Mientras que el análisis anterior se centra principalmente en el fruto de asaí y en los complementos alimenticios derivados del mismo, la presente invención también proporciona composiciones de suplemento dietético basados en jusará que también contienen una concentración de antocianinas significativamente mayor y que producen puntuaciones de CARO mayores que cualquier otra composición de fruto u hortaliza liofilizada sometida a prueba. Como se describirá a continuación, también se encontró que el fruto de jusará, y los complementos alimenticios
derivados del mismo tiene niveles muy altos de proantocianidinas y que presenta actividades antioxidantes altas contra el radical hidroxi y peroxinitrito.
De acuerdo con la presente invención, el fruto de asaí y el zumo del fruto de jusará, los complementos alimenticios y otras composiciones derivadas del fruto de asaí y del fruto de jusará se usan para tratar, invertir y/o proteger contra los efectos perjudiciales de los radicales libres y del estrés oxidativo.
Radicales libres y estrés oxidativo
Durante las últimas décadas, los radicales libres, moléculas altamente reactivas y destructivas, han llegado a ser cada vez más apreciados por su importancia para la salud humana y la enfermedad. Muchas enfermedades humanas comunes y potencialmente mortales, incluyendo ateroesclerosis, cáncer, y envejecimiento, tienen reacciones de radicales libres como mecanismo subyacente de daño.
Un radical libre es una molécula con uno o más electrones desapareados en su orbital externo. Muchas de estas especies moleculares se centran en oxígeno (y a veces nitrógeno). De hecho, el oxígeno molecular que respiramos es un radical libre. Estas moléculas altamente inestables tienden a reaccionar rápidamente con moléculas adyacentes, donando, extrayendo o incluso intercambiando su(s) electrón/electrones del orbital externo. Esta reacción no sólo cambia la molécula objetivo, adyacente a veces de forma significativa, sino que a menudo pasa el electrón desapareado junto al objetivo, generando un segundo radical libre u otra ERO, que después puede seguir reaccionando con un nuevo objetivo. De hecho, gran parte de la alta reactividad de la ERO se debe a la generación de dichas reacciones en cadena moleculares, que amplifican eficazmente sus efectos muchas veces. Los antioxidantes proporcionan protección porque pueden eliminar la ERO antes de que provoque daños a las diferentes moléculas biológicas, o evitar que el daño oxidativo se extienda, por ejemplo, interrumpiendo la reacción en cadena de radicales de la peroxidación de lípidos.
ERO y salud humana
Debido a que el cuerpo humano está expuesto continuamente a radicales libres y otras ERO, tanto de fuentes externas (luz del sol, otras formas de radiación, contaminación) como generados de forma endógena, el daño tisular mediado por ERO es una vía común final de varios procesos patológicos.
Daño por radiación
El daño por radiación representa una causa importante de enfermedad mediada por ERO. Ejemplos extremos incluyen reacciones fisicoquímicas en el centro del sol y en el centro de una explosión termonuclear. Con respecto a los niveles de radiación encontrados más comúnmente, dependiendo de la situación, aproximadamente dos tercios del daño sufrido no está mediado por la propia radiación, sino por las ERO generadas de forma secundaria. Esto se aplica no sólo a las formas de toxicidad aguda de daño por radiación, sino también a los efectos a largo plazo, mutagénicos (y, por tanto, cancerígenos).
Una importante aplicación clínica de este principio se encuentra regularmente en el tratamiento de cáncer por tratamiento con radiación. A menudo los tumores grandes superan sus reservas de sangre y las células tumorales mueren en el centro, a pesar de estar bien oxigenadas en la periferia. Entre estas dos regiones está un área del tumor que está mal oxigenada, sin embargo, sigue siendo viable. El tratamiento por radiación de estos tumores es particularmente eficaz en la periferia, en la que está disponible una concentración abundante de oxígeno para formar ERO tumoricidas. El centro mal oxigenado se daña hasta un grado significativamente más pequeño. Mientras las células muertas en el centro no sobreviven en cualquier caso, las células mal oxigenadas, aún viables, entre estas dos áreas pueden sobrevivir a una dosis segura del tratamiento por radiación, y posteriormente iniciar una reaparición local tardía del tumor. Esta es una importante razón por la que muchos tumores grandes se tratan por una combinación de tratamiento por radioterapia (para destruir el tumor y sus bordes de avance) y la extirpación quirúrgica de la masa del tumor, incluyendo estas células restantes particularmente peligrosas.
Cáncer y otras neoplasias malignas
El cáncer y otras neoplasias malignas implican un crecimiento celular sin restricciones y la proliferación basada en cambios en la información genética de la célula. En la mayoría de los casos, por ejemplo, uno o más genes que normalmente constriñen el crecimiento celular y la replicación se muta(n), o de otro modo, se inactiva(n). Estas deficiencias genéticas corresponden directamente con supresiones y cambios en la secuencia en el código genético, residentes en el ADN de la célula. Una causa común final visa frecuentemente de este daño de ADN es daño por radicales libres. La multitud de daños sufridos por nuestro ADN en una base diaria, la mayoría se reparan por mecanismos de reparación de ADN normales dentro de la célula, aunque algunos dan como resultado la muerte celular. Dado que estos daños son esporádicos y se distribuyen de forma aleatoria dentro del genoma, la mayoría de los daños de AND carecen de importancia clínica, dando como resultado la pérdida de unas pocas células entre millones. Sin embargo, cuando una única célula sufre un daño que influye en la regulación del crecimiento, puede proliferar de forma desproporcionada y crecer rápidamente para dominar la población de células por selección natural positiva. El resultado es un tumor, con frecuencia uno maligno, en el que la restricción del crecimiento y la proliferación es particularmente deficiente. Por lo tanto, el daño por radicales libres al material genético es una vía común final
importante para la carcinogenia.
Se pueden generar ERO dentro de la célula no sólo por fuentes de radiación externas, sino también dentro del cuerpo como un subproducto de procesos metabólicos normales. Una fuente importante de radicales libres endógenos es el metabolismo de algunos fármacos, contaminantes, y otros productos químicos y toxinas, denominados colectivamente xenobióticos. Mientras que algunos de ellos son directamente tóxicos, muchos otros generan flujos masivos de radicales libres por medio de procesos metabólicos que el cuerpo usa para desintoxicarlos. Un ejemplo es el metabolismo del herbicida paraquat. En el pasado, las autoridades responsables del control de drogas usaron este herbicida para destruir plantas de marihuana. Los cultivadores comprendieron que podían cosechar el cultivo pulverizado antes de que se marchitara, y aún vender el producto rociado con paraquat. Muchos de los que fumaron este producto murieron como consecuencia de un daño pulmonar fulminante. Afortunadamente, se ha abandonado este enfoque como una forma particularmente inhumana forma de resolver el problema de las drogas.
Aunque la historia de paraquat es un ejemplo particularmente llamativo de un mecanismo metabólico de toxicidad por radicales libres, muchos xenobióticos comúnmente encontrados, incluyendo el humo del tabaco, los contaminantes del aire e incluso el alcohol, son tóxicos, y a menudo cancerígenos en gran medida, en virtud de los radicales libres generados por su catabolismo dentro de nuestro cuerpo. Por otra parte, existen pruebas suficientes de que una dieta rica en frutos y hortalizas, que son ricas en antioxidantes naturales, y bajas en grasas saturadas (un objetivo particularmente vulnerable para el daño por ERO), reduce el riesgo de ateroesclerosis y cáncer.
Ateroesclerosis
La ateroesclerosis sigue siendo la principal causa de muerte y discapacidad prematura de las sociedades desarrolladas. Por otra parte, las predicciones actuales estiman que, para el año 2020, las enfermedades cardiovasculares, en particular la ateroesclerosis, pasarán a ser la principal causa global de la carga total de enfermedad, definida como los años restantes de de vida saludable por discapacidad o muerte prematura. La ateroesclerosis es un proceso complejo que conduce al infarto de miocardio, apoplejía y pérdida de las extremidades por trombo en las arterias con placa ateroesclerótica. Esta placa es una forma de grasa oxidada. Cuando los radicales libres reaccionan con lípidos, la consecuencia es la peroxidación lipídica, el mismo proceso por el que la mantequilla se vuelve rancia cuando se expone al oxígeno del aire. Aunque varios factores influyen en el desarrollo y la gravedad de la ateroesclerosis, un factor importante es la peroxidación mediada por ROS para las lipoproteínas de baja densidad del organismo (LDL o "colesterol malo"). El enfoque alimenticio de la prevención de una cardiopatía y apoplejía se basa parcialmente en añadir antioxidantes alimenticios para limitar la oxidación de LDL, como así como disminuir la ingesta de grasa en sí. Estos enfoques ya han realizado avances significativos en la mortalidad por cardiopatía, pero las composiciones de la presente invención pueden ofrecer una prevención farmacológica segura en el futuro que no sea dependiente de la fuerza de voluntad como son la dieta y el ejercicio.
Enfermedades neurológicas y neurodegenerativas
Las enfermedades neurológicas y neurodegenerativas afectan a millones de estadounidenses. Estas incluyen depresión, trastorno obsesivo-compulsivo, Alzheimer, alergias, anorexia, esquizofrenia, así como otras afecciones neurológicas que resultan de la modulación impropia de los niveles de neurotransmisores o de la modulación impropia de las funciones del sistema inmunitario, así como trastornos del comportamiento tales como ADD (trastorno de déficit de atención) y ADHD (trastorno de hiperactividad con déficit de atención). Parece que varias de estas enfermedades tienen una toxicidad por ERO como componente central de su mecanismo subyacente de destrucción de células nerviosas, incluyendo, pero sin limitarse a, esclerosis lateral amiotrófica (ALS o enfermedad Gehrig Lou), enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.
Daño por isquemia/reperfusión
Cuando un órgano está privado de su suministro de sangre (isquemia) se daña, no sólo por la pérdida temporal de oxígeno, sino también por los ERO que se generan por la reacción con el oxígeno que se reintroduce en la reperfusión, cuando se restablece el suministro de sangre. En algunas situaciones clínicas, este daño se puede evitar dando antioxidantes, a veces incluso después del período de isquemia, pero justo antes de la reperfusión. Por ejemplo, la preservación de los riñones, hígado y otros órganos en soluciones que contienen antioxidantes, así como otros agentes, es ahora una rutina previa a su trasplante. Otro ejemplo es el uso de fármacos que bloquean la función de las enzimas que generan radicales libres antes de detener el corazón para una cirugía cardiaca. Estos fármacos ayudan a evitar el daño por reperfusión cuando se reinicia el corazón y se restablece el flujo. También se ha encontrado que este mecanismo de daño por reperfusión desempeña un papel importante en los pacientes que padecen una insuficiencia multiorgánica después de traumatismo, cirugía masiva o choque. La insuficiencia multiorgánica es ahora la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos, y se están realizando grandes esfuerzos para entender mejor cómo los ERO contribuyen a este síndrome.
Envejecimiento
El envejecimiento es un proceso extremadamente complejo que ha logrado mantenerse relativamente poco claro para el conocimiento científico. Ahora existen pruebas de que el envejecimiento es una serie de procedimientos, es decir, una serie de mecanismos controlados, y no sólo la acumulación pasiva de desgaste a lo largo de los años. Si el
envejecimiento es una serie de procedimientos, algunos de estos procedimientos son potencialmente controlables, o al menos modificables. Uno de los más importantes de estos procesos se compone de una acumulación de los daños moleculares que están mediados por radicales libres y otros ERO. Estudios recientes indican que la manipulación terapéutica del metabolismo de ERO también puede prolongar el ciclo de vida total de ratones en un grado significativo.
Trastorno autista
El autismo es un trastorno neurológico incapacitante que afecta a miles de norteamericanos y que abarca varios subtipos, con diversas causas teóricas y pocos tratamientos beneficiosos documentados. Los trastornos del espectro autista pueden estar presente en el momento del nacimiento, o pueden tener un comienzo tardío, por ejemplo, a edades comprendidas entre los dos o tres años. No existen marcadores biológicos de corte claros para el autismo. El diagnóstico del trastorno se realiza considerando el grado en que el niño coincide con el síndrome de comportamiento, que se caracteriza por capacidades comunicativas malas, peculiaridades en las capacidades sociales y cognitivas y patrones de comportamiento de inadaptación.
Se han desarrollado varios tratamientos diferentes para el autismo. Muchos de los tratamientos, sin embargo, tratan los síntomas de la enfermedad, en lugar de las causas. Por ejemplo, se han empleado tratamientos que varían desde el psicoanálisis a la psicofarmacología en el tratamiento del autismo. Aunque algunos síntomas clínicos se pueden enmascarar por estos tratamientos, se ha demostrado una mejora modesta, en el mejor de los casos, en una pequeña fracción de los casos. Sólo un pequeño porcentaje de personas autistas lleguen a poder realizar funciones como adultos autosuficientes.
En un estudio preliminar, se proporcionó un suplemento dietético basado en asaí a un niño autista con un habla muy limitada y posteriormente se informó de que el niño tenía un habla significativamente potenciada.
Propiedades y usos del inhibidor de la ciclooxigenasa
La presente invención identificó los frutos de dos familias de palmeras, asaí y jusará, que tienen propiedades inhibidoras significativas, de ambas isoformas de la ciclooxigenasa, COX-1 y COX-2. Las ciclooxigenasas (a veces denominada prostaglandina endoperóxido sintasa) están implicadas en la síntesis de prostaglandinas. Se considera que la expresión de COX-1 es constitutiva, ya que se observa que los niveles basales de ARNm de COX-1 y proteína están presentes y generan prostaglandinas para las funciones fisiológicas normales. En contraste, la expresión de COX-2 es inducible.
De acuerdo con la presente invención, el fruto de asaí y el zumo del fruto de jusará, los complementos alimenticios y otras composiciones derivadas del fruto de asaí y del fruto de jusará se usan para tratar, invertir y/o evitar enfermedades o daños asociados con un incremento en la actividad de la ciclooxigenasa.
Defensa de la mucosa gastroduodenal
El epitelio gástrico está bajo un asalto constante por varios factores nocivos endógenos, incluyendo HCl, pepsinógeno/pepsina y sales de bilis. Además, un flujo continuo de sustancias exógenas, tales como medicamentos, alcohol y bacterias, se encuentran en la mucosa gástrica. Un sistema biológico altamente complejo está en su lugar para proporcionar una defensa contra el daño mucosal y para reparar cualquier daño que se pueda producir.
Las prostaglandinas desempeñan un papel central en la defensa/reparación epitelial gástrica. La mucosa gástrica contiene niveles abundantes de prostaglandinas. Estos metabolitos de ácido araquidónico regulan la liberación de bicarbonato mucosal y moco, inhiben la secreción de células parietales, y son importantes para el mantenimiento del flujo sanguíneo mucosal y de la restitución de células epiteliales. Las prostaglandinas se derivan del ácido araquidónico esterificado, que se forma de fosfolípidos (membrana celular) por la acción de la fosfolipasa A2. Una enzima clave que controla la etapa limitante de la velocidad en la síntesis de prostaglandinas es la ciclooxigenasa (COX), que está presente en dos isoformas (COX-1, COX-2), teniendo cada una características distintas en cuanto a estructura, distribución tisular y expresión. La COX-1 se expresa en un huésped de tejidos, incluyendo el estómago, plaquetas, riñón y células endoteliales. Esta isoforma se expresa de una manera constitutiva y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la integridad de la función renal, la agregación plaquetaria y la integridad de la mucosa gastrointestinal. En contraste, la expresión de COX-2 es inducible por estímulos inflamatorios, y se expresa en macrófagos, leucocitos, fibroblastos y células sinoviales. Los efectos beneficiosos de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) en la inflamación tisular se deben a la inhibición de COX-2. Los inhibidores de COX-2 tienen el potencial para proporcionar el efecto beneficioso de la disminución de la inflamación tisular mientras que minimizan la toxicidad en el tubo gastrointestinal.
Artritis reumatoide
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad crónica multisistémica de causa desconocida. Aunque existe una diversidad de manifestaciones sistémicas, el rasgo característico de la AR es la sinovitis inflamatoria persistente, que implica normalmente las articulaciones periféricas en una distribución simétrica. El potencial de la inflamación sinovial para provocar la destrucción del cartílago y las erosiones óseas y cambios posteriores en la integridad de las
articulaciones es el distintivo de la enfermedad.
La primera línea de tratamiento médico de AR es el uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y analgésicos sencillos para controlar los síntomas y signos del proceso inflamatorio local. Estos agentes son rápidamente eficaces para mitigar los signos y síntomas, pero parece que ejercen un efecto mínimo sobre la progresión de la enfermedad. Los AINE bloquean la actividad de las enzimas de Cox y, por lo tanto, la producción de prostaglandinas, prostaciclina y tromboxanos. Como consecuencia, tienen propiedades analgésicas, antiinflamatorias y antipiréticas. Además, los agentes pueden ejercer otros efectos antiinflamatorios. Puesto que estos agentes están todos asociados con un amplio espectro de efectos secundarios tóxicos, las composiciones de suplemento dietético de la presente invención pueden proporcionar una alternativa no tóxica a los AINE.
Cáncer
Se han estudiado las ciclooxigenasas en diversos cánceres, y parece que COX-1 o COX-2 tienen un papel en diversas formas de cáncer. Por ejemplo, se ha mostrado que tanto COX-1 como COX-2 se expresan altamente en cáncer de pulmón, en el ratón. (Bauer et al., 2000, Carcinogenesis 21, 543-550). Se informó de que COX-1 se induce por carcinógenos del tabaco en macrófagos humanos y está correlacionado con la activación de NFkB. (Rioux & Castonguay, 2000, Carcinogenesis 21, 1745-1751). Se informó de que COX-1 pero no COX-2 se expresa en adenocarcinomas ováricos humanos. (Dor et al., 1998, J. Histochem. Cytochem. 46, 77-84). De acuerdo con Ryu et al. (2000, Gynecologic Oncology 76, 320-325), la expresión de COX-2 es alta en el estadio 1 D de cáncer de cuello uterino. Se informó de que COX-2 se sobreexpresa en cáncer de cuello uterino. (Kulkarni et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7,429-434). Finalmente, se informó de que COX-1 se regula por aumento en el carcinoma de cuello uterino y se propusieron inhibidores de COX-1 para el tratamiento de la afección neoplásica del cuello uterino. Sales et al., solicitud de patente de los EE. UU. 20030220266.
De acuerdo con la presente invención, el fruto de asaí y el zumo del fruto de jusará, los complementos alimenticios y otras composiciones derivadas del fruto de asaí y del fruto de jusará se usan para tratar, invertir y/o evitar cánceres asociados con un incremento en la actividad de la ciclooxigenasa.
Composiciones farmacéuticas y formulaciones
Los complementos alimenticios basados en frutos de la presente invención se pueden usar en bebidas, tónicas, infusiones o productos alimenticios solos, o en combinación con otros complementos alimenticios o terapéuticos. Los complementos alimenticios basados en frutos de la invención se pueden usar solos o formulados adicionalmente con compuestos, vehículos, o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables, con un perfil de administración favorable, es decir, adecuados para administrar a un sujeto. Estas composiciones comprenden típicamente el suplemento dietético basado en frutos de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, se pretende que "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluya todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, compuestos antibacterianos y antifúngicos, compuestos isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Los ejemplos preferidos de estos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y seroalbúmina humana al 5%. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de estos medios y compuestos para las sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto cuando alguno de los medios o compuestos convencionales sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. En las composiciones también se pueden incorporar compuestos activos complementarios.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración destinada. Ejemplos de vías de administración incluyen vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intracerebral, intracerebelar, intrabronquial, intratecal, tópica y aerosol. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico.
Las composiciones orales incluyen en general un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina, comprimidos oblongos o comprimir en comprimidos. Con el fin de una administración terapéutica oral, los complementos alimenticios basados en frutos de la invención se pueden incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para su uso como colutorio, en el que el compuesto en el vehículo fluido y se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Se pueden incluir como parte de la composición compuestos de unión o materiales coadyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa, un compuesto disgregante, tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotex; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un compuesto edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un compuesto saborizante, tal como menta, salicilato de metilo, saborizante de naranja.
Los complementos alimenticios basados en frutos de la invención también se pueden preparar como composiciones
farmacéuticas en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para suministro rectal.
En una realización, los complementos alimenticios basados en frutos de la invención se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los procedimientos pata la preparación de estas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones de liposomas también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstas se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos para el experto en la técnica, por ejemplo como se describe en la patente de los EE.UU. nº 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para su facilidad de administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente pequeñas adaptadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención está dictada y dependen directamente de las características únicas del suplemento dietético basado en frutos y del efecto terapéutico particular que se debe conseguir y de las limitaciones inherentes en la técnica de formar tal compuesto activo para el tratamiento de individuos. Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones de administración.
La invención se define además por referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden practicar muchas modificaciones, tanto a materiales como a procedimientos, sin alejarse del propósito y del interés de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 Análisis de la composición de asaí liofilizada
El análisis de la composición de asaí liofilizada OPTACAI; n.º de lote: 231003/0410-C se detalla a continuación en la tabla 1 y la tabla 2.
7DEOD
Especificaciones
Producto: Polvo de asaí Nombre común: Asaí Nombre botánico: Euterpe oleracea M Familia botánica: Palmae Parte de planta usada: Pulpa de fruto congelada Procedimiento de recogida: Recolección silvestre Procedimiento de identificación: HPLC
Aspecto Polvo (cumple) Color Morado oscuro (cumple) Olor Característico (cumple) Aroma Característico (cumple) Excipiente Ninguno Procedimiento de secado Liofilizado a vacío Tamaño de malla 100% a través de una malla 80 Envasado Plástico y cartón Vida útil 2 años bajo condiciones apropiadas Contenido en humedad 1% Rehidratación 1:13 agua
Análisis de alimentos
Impurezas
Calorías 534 Calorías de grasas 292 Grasa total 32,5 g Grasa saturada 8,1 g Colesterol 13,5 mg Sodio 30,4 mg Hidratos de carbono totales 52,2 g Fibra 44,2 g Azúcares 1,3 g Proteína 8,1 g Humedad 3,4 g Cenizas 3,8 g
Metales pesados totales <10 ppm Plomo 22 ppb Residuo de plaguicida Recolección silvestre Residuo de disolvente Ninguno
Microbiología
Recuento de bacterias aerobias total Recuento de hongos total (moho/levaduras) Escherichia coli (45 ºC/g) Salmonella Staphylococcus
<10.000 CFU/g 440 Ausente Ausente Ausente
Tabla 2
ANALITO
RESULTADO/UNIDAD UNIDAD/GRAMO
Beta caroteno
34.800 UI 348 UI
Vitamina C (ión ascorbato)
1.183 mg 11,83 mg
Vitamina E (d-alfa tocoferol)
648 UI 6,48 UI
Vitamina D
1.252 UI 12,52 UI
Vitamina Bi (tiamina)
17,5 mg 0,175 mg
Vitamina B2 (riboflavina)
22,9 mg 0,229 mg
Vitamina B3 (niacina/niacinamida)
129,1 mg 1,291 mg
Vitamina B6 (piridoxina)
31,9 mg 0,319 mg
Ácido fólico
600 mg 0,006 mg
Vitamina B12 (cianocobalamina)
400 mg 0,004 mg
Biotina
1,8 mg 0,006 mg
Inositol
254,2 mg 2,452 mg
Calcio
55,1 mg 0,551 mg
Hierro
0,1 mg 0,001 mg
Yodo
700 μcg 0,007 mg
Magnesio
730 mg 7,302 mg
Cinc
0,6 mg 0,006 mg
Selenio
200 μcg 0,002 mg
Cobre
500 μcg 0,005 mg
Manganeso
19 mg 0,190 mg
Cromo
6200 μcg 0,062 mg
Molibdeno
0,00 mg 0,000 mg
Potasio
3310 mg 33,10 mg
Boro
5,6 mg 0,056 mg
Metales pesados
Resultado
Plomo (Pb)
22,0 ppb
A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el 5 contenido en humedad de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 926.08. Se midió el contenido en proteína de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.20. Se midió el contenido en grasa de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 933.05. Se midió el contenido en ceniza de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º
935.42. Se calculó el contenido en hidratos de carbono de muestra la de prueba por diferencia. Se calculó el contenido
10 calórico de la muestra de prueba usando factores de Atwater. Se midieron los azúcares usando un procedimiento de la AOAC de referencia n.º 982.14. Se midió la fibra alimenticia total en la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.43. Se midió el contenido en colesterol de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 994.10. Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33. Se midió el contenido en sodio, calcio y hierro de la
15 muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 984.27. Se midió el contenido en vitamina C de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 967.22. Se midió el contenido en vitamina A de la muestra de prueba por el procedimiento de Reynolds y Judds, Analyst, 109:489, 1984. Se llevaron a cabo pruebas microbiológicas esencialmente como se detalla en el ejemplo 36 (infra). Se analizaron los
minerales/metales traza por el procedimiento IPC/EM (Aligent HP-7500a) por IBC Labs (Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ).
Ejemplo 2 Análisis de la composición de asaí liofilizada
Se realizó el análisis de la composición de polvo de baya FD de asaí liofilizada (n.º de lote 231003/0410-C) por IBC Labs (Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 3.
Tabla 3
ANALITO
RESULTADO UNIDAD
Vitamina A (como beta-caroteno)
348 UI/g
Vitamina C (como ión ascorbato)
11,83 mg/g
Vitamina E (como d-alfa tocoferol)
6,48 UI/g
Vitamina D (como cotecalciferol)
12,52 UI/g
Vitamina B-1 (como tiamina)
0,175 mg/g
Vitamina B-2 (como riboflavina)
0,229 mg/g
Vitamina B-3 (como niacina/niacinamida)
1,291 mg/g
Vitamina &-6 (como piridoxina)
0,319 mg/g
Vitamina B-12 (como cianocobalamina)
0,004 mg/g
Ácido pantoténico (como anión libre)
0,561 mg/g
Biotina
0,018 mg/g
Ácido fólico
0,006 mg/g
Inositol
2,452 mg/g
Calcio
0,551 mg/g
Ión magnesio
7,302 mg/g
Ión cobre
0,005 mg/g
Ión cromo
0,062 mg/g
Ión cinc
0,006 mg/g
Ión hierro
0,001 mg/g
Ión sodio
0,290 mg/g
Ión manganeso
0,190 mg/g
Ión selenio
0,002 mg/g
Ión boro
0,056 mg/g
Ión potasio
33,10 mg/g
Ión molibdeno
0,000 mg/g
Ión yodo
0,007 mg/g
Ión plomo
22,0 ppb
A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el contenido en humedad de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 926.08. Se 10 midió el contenido en proteína de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.20. Se midió el contenido en grasa de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 933.05. Se midió el contenido en ceniza de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º
935.42. Se calculó el contenido en hidratos de carbono de muestra la de prueba por diferencia. Se calculó el contenido
calórico de la muestra de prueba usando factores de Atwater. Se midieron los azúcares usando un procedimiento de la 15 AOAC de referencia n.º 982.14. Se midió la fibra alimenticia total en la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.43. Se midió el contenido en colesterol de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 994.10. Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33. Se midió el contenido en sodio, calcio y hierro de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 984.27. Se midió el contenido en vitamina C
5 de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 967.22. Se midió el contenido en vitamina A de la muestra de prueba por el procedimiento de Reynolds y Judds, Analyst, 109:489, 1984. Se analizaron los minerales/metales traza por el procedimiento IPC/EM (Aligent HP-7500a) por IBC Labs (Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ).
Ejemplo 3 Análisis nutricional de asaí liofilizada
10 Se realizó un análisis nutricional para una porción de 100 g de asaí liofilizada por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago Heights, IL; laboratorio ID n.º 170547501). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 4.
Tabla 4
ANALITOS MARCADOS
DATOS ANALÍTICOS POR 100 G DATOS ANALÍTICOS POR PORCIÓN DATOS REDONDEADOS POR PORCIÓN % DE VALOR DIARIO
Calorías
533,9 533,9 530
Calorías de grasas
292,6 292,6 290
Grasa total
(G) 32,51 32,51 33 51
Grasa saturada
(G) 8,09 8,09 8 40
Colesterol
(MG) 13,5 13,5 15 5
Sodio
(MG) 30,4 30,4 30 1
Hidratos de carbono totales
(G) 52,2 52,2 52 17
Fibra alimenticia
(G) 44,23 4,23 44 176
Azúcares
(G) 1,26 1,26 1
Proteína (F = 6,25)
(G) 8,11 8,11 8
Vitamina A
(UI) 1002 1002 20
Vitamina C
(MG) <1,0 <1,0 *
Calcio
(MG) 260 260 25
Hierro
(MG) 4,4 4,4 25
ANALITOS QUE CONTRIBUYEN
Humedad
(G) 3,39 3,39
Ceniza
(G) 3,78 3,78
Beta caroteno
(UI) <5 <5
Retinol
(UI) 1002 1002
Vit. A % Beta caroteno
*
* Contiene menos del 2% del valor diario de este nutriente,
FERFIL DE AZÚCAR
Fructosa
0,39 Glucosa 0,76
Lactosa
<0,10 Maltosa 0,11
Sacarosa
<0,10
Para calcular los valores contenidos en un tamaño de porción de 25 g, se dividen todos los valores por un factor de 4, una porción de bebidas típica es de 25 g.
A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el contenido en humedad de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 926.08. Se midió el contenido en proteína de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.20. 5 Se midió el contenido en grasa de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 933.05. Se midió el contenido en ceniza de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º
935.42. Se calculó el contenido en hidratos de carbono de muestra la de prueba por diferencia. Se calculó el contenido calórico de la muestra de prueba usando factores de Atwater. Se midieron los azúcares usando un procedimiento de la AOAC de referencia n.º 982.14. Se midió la fibra alimenticia total en la muestra de prueba usando el procedimiento de 10 la AOAC de referencia n.º 991.43. Se midió el contenido en colesterol de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 994.10. Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33. Se midió el contenido en sodio, calcio y hierro de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 984.27. Se midió el contenido en vitamina C de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 967.22. Se midió el contenido en
15 vitamina A de la muestra de prueba por el procedimiento de Reynolds y Judds, Analyst, 109:489, 1984.
Ejemplo 4 Análisis nutricional del fruto de jusará liofilizado
Se realizó un análisis nutricional para una porción de 100 g de fruto de jusará liofilizado por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago Heights, IL; laboratorio ID n.º 171378581). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 5.
Tabla 5
ANALITOS MARCADOS
DATOS ANALÍTICOS POR 100 G DATOS ANALÍTICOS POR PORCIÓN DATOS REDONDEADOS POR PORCIÓN % DE VALOR DIARIO
Calorías
370,2 370,2 370
Calorías de grasas
22,4 22,4 20
Grasa total
(g) 2,48 2,48 2,5 4
Grasa saturada
(g) 0,68 0,68 0,5 2
Colesterol
(mg) <1,0 <1,0 0 0
Sodio
(mg) 25,5 25,5 25 1
Hidratos de carbono totales
(g) 86,3 86,3 86 29
Fibra alimenticia
(g) 0,83 0,83 <1 4
Azúcares
(g) <0,10 <0,10 0
Proteína (F = 6,25)
(g) 0,68 0,68 <1
Vitamina A
(UI) 179 179 4
Vitamina C
(mg) <1,0 <1,0 *
Calcio
(mg) 33,0 33,0 4
Hierro
(mg) 0,53 0,53 2
ANALITOS QUE CONTRIBUYEN
Humedad
(g) 8,62 8,62
Ceniza
(g) 1,93 1,93
Beta caroteno
(UI) 179 179
Retinol
(UI) <5 <5
Vit. A % Beta caroteno
100
* Contiene menos del 2% del valor diario de este nutriente,
FERFIL DE AZÚCAR
Dextrosa
<0,10 (g/100g) Fructosa <0,10 (g/100g)
Lactosa
<0,10 (g/100g) Maltosa <0,10 (g/100g)
Sacarosa
<0,10 (g/100g)
A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los
Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el contenido en humedad de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 926.08. Se midió el contenido en proteína de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.20. Se midió el contenido en grasa de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 933.05. 5 Se midió el contenido en ceniza de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º
935.42. Se calculó el contenido en hidratos de carbono de muestra la de prueba por diferencia. Se calculó el contenido calórico de la muestra de prueba usando factores de Atwater. Se midieron los azúcares usando un procedimiento de la AOAC de referencia n.º 982.14. Se midió la fibra alimenticia total en la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 991.43. Se midió el contenido en colesterol de la muestra de prueba usando el
10 procedimiento de la AOAC de referencia n.º 994.10. Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33. Se midió el contenido en sodio, calcio y hierro de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 984.27. Se midió el contenido en vitamina C de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 967.22. Se midió el contenido en vitamina A de la muestra de prueba por el procedimiento de Reynolds y Judds, Analyst, 109:489, 1984.
15 Ejemplo 5 Análisis cuantitativo de esteroles en polvo de asaí liofilizada
Se determina la composición de esteroles de polvo de asaí liofilizada (polvo de asaí n.º 001; Flora ID N.º 210823003) por cromatografía de gases de alta resolución (HRGC) (Flora Research Laboratories, Grand Pasan, O) como se resume en la tabla 6.
Tabla 6
ANALITO
PORCENTAJE EN PESO
B-Sitosterol
0,044 = 0,44 mg/g
Campesterol
<0,003 = 0,3 mg/g
Siqmasterol
0,004 = 0,04 mg/g
Esteroles totales
0,048
20 Se determinó el contenido en esteroles de la muestra de prueba por cromatografía de gases en una Hewlett Packard 5890 serie 11 equipada con FID y muestreador automático usando el Procedimiento INA 109.001. Se usó 5-alfa-colestano como estándar (Matreya, Inc. Pleaseant Gap, PA). La columna usada para estos análisis fue una Restek Rtx-5, 5% de difenil-95% de dimetil polisiloxano, 60 m x 0,25 mm, 0,25 μm de grosor de película.
Ejemplo 6 Análisis de los análisis de humedad residual de asaí liofilizada
25 Se determinó la humedad residual de las preparaciones de asaí antes y después de la liofilización por el procedimiento del Instituto Adolfo Lutz (1976)(UNIVERSIDAD DE SAO PAULO, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Departamento de alimentos y nutrición experimental, Laboratorio de análisis de alimentos). El porcentaje de humedad de pulpa de asaí en bruto fue de un 85,37+/0,14%. El porcentaje de humedad residual de pulpa de asaí liofilizada fue de un 1,06%. El total de antocianinas (mg/100 g de pulpa de asaí) fue de 239,32 +/- 0,74 como se determina por el procedimiento de
30 Francis y Fuleki, (J. Food Sci, v.33, p. 72-77, 1968) La FIG. 1 muestra un espectro de absorción representativo observado de polvo de asaí liofilizada.
Ejemplo 7 Análisis de antocianinas y compuestos fenólicos en preparaciones de jusará y asaí
I. GENERAL
A. Proantocianidinas
35 Las proantocianidinas pueden ayudar a explicar la "paradoja francesa", por qué existen tasas bajas de cardiopatía coronaria en provincias francesas conocidas por alimentos ricos en grasas y consumo de vino tinto. El vino tinto se podría considerar una tintura de alcohol de varios flavonoides potentes, incluyendo proantocianidinas procedentes de semillas de uva. En un estudio que hace reflexionar, Fulvio Ursini, M.D., de la Universidad de Padova, Italia, alimentó a voluntarios con comida rica en grasas y sin vino tinto. Se encontró que los niveles de peróxido en plasma posprandial
40 eran mucho menores en los que bebían vino. (Ursini F, et al. Post-prandial plasma peroxides: a possible link between diet and atherosclerosis. Free Rad Biol Med 1998; 25:250-2.)
Una corriente continua de estudios en animales e in vitro complementada con pruebas epidemiológicas y unos pocos estudios preliminares en humanos revelan numerosos beneficios para la salud asociados a estos compuestos. El principal de los beneficios es la protección antioxidante contra la cardiopatía y el cáncer.
45 Las proantocianidinas (de forma más técnica las proantocianidinas oligoméricas y, por tanto, el sobrenombre COF) son una clase de flavonoides. Anteriormente denominadas "taninos condensados", todas las proantocianidinas son
químicamente similares, siendo las únicas diferencias ligeros cambios en la forma y los enlaces de sus anillos de polifenol. En la naturaleza, una mezcla de diferentes proantocianidinas siempre se encuentran juntas, variando desde unidades individuales hasta moléculas complejas de muchas unidades unidas (oligómeros).
Las proantocianidinas son un grupo altamente especializado de bioflavonoides, que se ha estudiado extensivamente desde finales de 1960 por sus propiedades de fortalecimiento de la pared vascular y la actividad eliminadora de radicales libres. Las proantocianidinas son uno de los eliminadores de radicales libres más potentes conocidos, que poseen un efecto antioxidante hasta 50 veces más potente que la vitamina E, y hasta 20 veces mayor que la vitamina
C. Las proantocianidinas también tienen una afinidad por las membranas celulares, proporcionando un soporte nutricional para reducir la permeabilidad y fragilidad capilar. Aunque los bioflavonoides están muy extendidos en la naturaleza, el poderoso compuesto proantocianidina es el más abundante y está disponible a partir de la corteza del pino marítimo y de las semillas de uva, o pepitas.
El extracto de arándano europeo contiene antocianidinas con propiedades potenciadoras vasculares visuales y demostradas reivindicadas. Se reivindica que el arándano europeo reduce la fatiga visual y mejora el ajuste de luz a oscuridad a través de su afinidad por el sistema rodopsinopsina, el sistema de pigmento que media tanto para la visión de luz y oscuridad como para la adaptación a los espacios con poca luz. Sin embargo, dos estudios militares realizados en Israel y en los Estados Unidos no han conseguido encontrar dicho beneficio del extracto de arándano europeo. Sin embargo, el extracto puede promover las propias defensas antioxidantes enzimáticas de la retina.
En el sistema vascular, el extracto de antocianidina soporta la integridad de las paredes vasculares incrementando los niveles de vitamina C dentro de las células, disminuyendo el efecto permeabilizador de determinadas enzimas proteolíticas/lisosómicas, estabilizando las membranas celulares y estimulando la síntesis de colágeno y el tejido de sustancia básica conjuntivo.
Las pepitas de uva (semillas) son una fuente potente de proantocianidinas, o picnogenoles. Jacques Masquelier, (Ph.D.), que promovió la investigación sobre proantocianidinas y acuñó el término "picnogenol", usó el extracto de semillas de uva en su segunda fase de investigaciones sobre proantocianidinas.
Estudios in vitro sugieren que las OPC también proporcionan protección contra el cáncer. Las OPC en bayas de la familia de Vaccinium, incluyendo arándanos americanos, arándano escandinavo (lingonberry) y arándano rojo, bloquean el crecimiento tumoral evitando la síntesis de proteínas en células tumorales, lo que evita que se multipliquen. (Bomser J. y Madhavi D.L. In vitro anticancer activity of fruit extracts from Vaccinium species. Planta Med, 1996; 62:212-6.) También en el laboratorio, las OPC del salvado de cebada transformaron células de leucemia mieloide humana en células que dejaron de ser cancerosas. (Tamagawa K. y Fukushima S. Proanthocyanidins from barley bran potentiate retinoic acid-induced granulocytic and sodium butyrate-induced monocytic differentiation of HL6O cells. Biosci Biotechnol Biochem, 1998; 62:1483-7.) Otro estudio in vitro encontró que un extracto de semillas de uva patentado destruyó células cancerosas; inhibió el crecimiento de células de mama, pulmón, estómago y de leucemia mielógena hasta en un 73 por ciento; y potenció el crecimiento celular normal. (Ye, X. y Krohn. R.L. The cytotoxic effects of a novel 1 H636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells. Mol Cell Biochem, 1999; 196:99-108.)
Las proantocianidinas pueden proteger el cuerpo de varios agentes potencialmente tóxicos. El acetaminofeno, el ingrediente activo en Tylenol™, es una potente toxina hepática, que provoca anualmente 75.000 casos de intoxicación que requiere hospitalización en los Estados Unidos. Los experimentos en animales han demostrado que una semana de tratamiento previo con 100 mg/kg de un extracto de semillas de uva patentado evita daños hepáticos de acetaminofeno. Se evaluó el daño orgánico estudiando las células hepáticas para determinar el daño y también por monitorización de la salud del animal. (Ray SD, et al. A novel proanthocyanidin 1H636 grape seed extract increases in vivo bcl-XI expression and prevents acetaminophen-induced programmed and unprogrammed cell death in mouse liver. Arch Biochem Biophys., 1999; 369(1):42-58.)
Las proantocianidinas puede hacer más que evitar la enfermedad; pueden ayudar a ralentizar el proceso de envejecimiento y a reducir los signos visibles del envejecimiento. El daño por oxidación provoca los signos más visibles del envejecimiento en la piel. Evitando este daño, la piel se mantendrá con un aspecto más joven. Una manera de lograr esto es reducir los efectos perjudiciales de la luz ultravioleta (UV). Los productos de protección solar han incorporado una variedad de antioxidantes con la intención que impidan el daño solar a la piel. En un estudio, las OPC de semillas de uva ejercieron un efecto antioxidante solo a un nivel de potencia a la par de la vitamina E (protegiendo diferentes ácidos grasos poliinsaturados de la peroxidación de lípidos inducida por la luz UV). (Carini M., et al. The protection of polyunsaturated fatty acids in micellar systems against UVB-induced photo-oxidation by procyanidins from Vitis vinifera L., and the protective synergy with vitamin E. Intl J Cosmetic Sci., 1998; 20:203-15.) En este mismo estudio, las OPC de uva interaccionaron sinérgicamente con la vitamina E, reciclando la forma inactivada de la vitamina en la forma activa y actuando así como una carga de vitamina E virtual.
Parte del proceso de envejecimiento es la degradación de la piel por la enzima elastasa, que se libera con la respuesta inflamatoria. Las OPC bloquean específicamente la elastasa, manteniendo así la integridad de la elastina. (Meunier MT. y Villie F. The interaction of Cupressus sempervirens L. proanthocyanidolic oligomers with elastase and elastins. J Pharm Beig., 1994;49: 453-61.)
Las OPC pueden incluso ayudar en el crecimiento de una cabellera abundante, si los resultados de los experimentos con animales se aplican a los seres humanos. Investigadores japoneses afeitaron ratones y descubrieron que un 40 por ciento de su pelo volvía a crecer de forma natural. Cuando se aplica a la piel una solución de un 1 por ciento de cualquiera de tres proantocianidinas, sin embargo, entre un 70 y un 80 por ciento del pelo volvía a crecer. Estudios en
5 tubos de ensayo confirman que las OPC realmente estimulan los queratinocitos del pelo para producir tres veces más pelo que en los controles. (Takahashi T, et al. Procyanidin oligomers selectively and intensively promote proliferation of mouse hair epithelial cells in vitro and activate hair follicle growth in vivo. J Invest Dermatol., 1999;112:310-6.)
B. Compuestos fenólicos: Luteolín-4'-glucósido
Inhibe la producción de citocinas proinflamatorias en macrófagos. Un flavonoide anticancerígeno: intoxica 10 topoisomerasa de tipo I de ADN eucariota.
II. MEDIDA DE ANTOCIANINAS EN POLVO DE JUSARÁ LIOFILIZADO
Se midió el perfil de antocianinas de polvo de jusará liofilizado por CL/EM/EM y se muestra en la FIG. 2. Los resultados de CL/EM/EM para los picos mostrados en la FIG. 2 se resumen a continuación en la tabla 7.
Se realizó un análisis de antocianina y OPC (compuestos fenólicos) como se detalla a continuación. Brevemente, se
15 extrajo simultáneamente de forma diferencial una muestra en polvo en agua y acetato de etilo. Se recogió cada capa y se filtró vacío de sólidos. Se analizaron las antocianinas intactas de la capa de agua por HPLC en una columna de C-18 Zorbax 5 μm 150 X 4,6 mm usando una fase móvil de gradiente (1 ml/min. caudal) que consiste en A (0,5% de ácido fosfórico) B (agua: acetonitrilo: ácido acético: ácido fosfórico 50:48,5:1:0,5) y el siguiente programa inicial 100% de A, 20 min 80% de A, 30 min 40% de A, 36 min 80% Identificación/ cuantificación realizada por estándares externos.
20 Se analizaron las proantocianinas oligoméricas de la capa de acetato de etilo después del secado por evaporación, y la reconstitución en metanol anhidro. Se realizó la cromatografía en una columna Luna de fenilo-hexilo de 3 μm, 250 x 3,5 mm usando una fase móvil de gradiente (1 ml/min de flujo) que consiste en A (agua: acetonitrilo: ácido acético 89:9:2) B (agua: acetonitrilo - 20:80) y el siguiente programa inicial 100% de A, 25 min 60% de A, 32 min 100% de B, 40 min 100% A. Identificación/cuantificación realizada por los primeros principios basados en coeficientes de extinción de
25 estructuras de anillo de epicatequina y catequina parental.
Tabla 7
Pico
Tiempo de retención Ión molecular Iónico de producto
I
27,29 449 287
II
28,78 595 449.287
Las estructuras de las antocianinas del polvo de jusará liofilizado se muestran en la FIG. 3.
III. MEDIDA DE ANTOCIANINAS EN POLVO DE ASAÍ LIOFILIZADA
Se midió el perfil de antocianinas de polvo de asaí liofilizada por CL/EM/EM y se muestra en la FIG. 4. Los resultados 30 de CL/EM/EM para los picos mostrados en la FIG. 4 se resumen a continuación en la tabla 8.
Tabla 8
Pico
Tiempo de retención Ión molecular Iónico de producto
I
27,42 449 287
II
29,19 595 449.287
Se realizó el análisis como se detalla anteriormente. Las estructuras de las antocianinas del polvo de asaí liofilizada se muestran en la FIG. 5.
IV. CONTENIDO DE ANTOCIANINAS PARA POLVO DE JUSARÁ LIOFILIZADO Y POLVO DE ASAÍ LIOFILIZADA
35 Los contenidos de antocianinas medidos en polo de jusará liofilizado y de asaí liofilizada se resumen a continuación en la tabla 9.
Tabla 9 Contenido de antocianinas
Antocianina (mg/g)
Jusará Asaí
Cianidín-3-glucósido
3,43 1,77
Cianidín-3-glucósido-cumarato
17,56 3,93
Total:
20,99 5,7
Se realizó el análisis como se detalla anteriormente.
V. CARACTERIZACIÓN DE FENÓLICOS INDIVIDUALES DEL POLVO DE JUSARÁ LIOFILIZADO
Se midió el perfil de compuestos fenólicos individuales en polvo de jusará liofilizado por HPLC y espectroscopía de masas y se muestra en la FIG. 6. Los resultados de HPLC para los picos mostrados en la FIG. 6 se resumen a continuación en la tabla 10.

Tabla 10 Identidad de pico fenólico y sus datos de espec. de masas
Pico
Tiempo de retención *[M-1] **M Estructura
1
5,72 153 154 Ácido protocatéquico
2
8,23 289 290 Catequina
3
19,24 449 450 Eriodictiol-7-glucósido
4
20,17 447 448 Luteolín-4-glucósido
5
20,84 463 464 Isoquercitrina
6
21,64 547 548 Desconocido
7
22,46 433 434 Quercetín-3-arabinósido
8
24,32 287 288 Eriodictiol
9
25,63 249 250 Desconocido
10
27,02 285 286 Luteolín-4'-glucósido
11
29,77 299 300 Crisoeriol
12
32,66 343 344 Eupatropina
13
33,49 285 286 Kaempferol
* ión molecular (modo negativo); * * peso molecular
Las estructuras de los compuestos fenólicos individuales presentes en el polvo de jusará liofilizado se muestran en la
10 FIG. 7. No se detectaron cantidades significativas de compuestos fenólicos en polvo de asaí liofilizado. Se realizó el análisis como se detalla anteriormente.
VI. MEDIDA DE PROANTOCIANIDINAS EN EL POLVO DE JUSARÁ LIOFILIZADO Y POLVO DE ASAÍ LIOFILIZADA
Se determinó cromatográficamente el perfil de proantocIanidina de polvo de asaí liofilizada y polvo de jusará liofilizado
15 y se muestra en la FIG. 8. Como se detalla en la FIG. 8, el perfil de proantocianinas. B1 son epicatequina y catequina. Los picos B2 a B8 representan la procianidina de tipo B de dímeros a octámeros. A2 son dímeros con un enlace inter-flavano de tipo A como se refleja en los espectros de masas. Los resultados de los picos mostrados en la FIG. 8 se resumen a continuación en la tabla 11.

Tabla 11 Contenido de proantocianidinas en muestras liofilizadas
Proantocianidinas (mg/g, media ± DE, n = 3)
Jusará Asaí
Monómeros
0,35 0,21
Dímeros
0,52 0,30
Trímeros
0,29 0,25
Tetrámeros
0,87 0,32
Pentámeros
0,50 0,31
Hexámeros
1,03 0,52
Heptámeros
0,60 0,32
Octámeros
0,72 0,39
Nonámeros
1,40 0,64
Decámeros
0,55 0,34
Polímeros
18,53 9,28
Total:
25,38 12,89
Jusará contiene un nivel muy alto de proantocianidinas, así como, actividades antioxidantes altas contra el radical hidroxilo y peroxinitrito. La FIG. 9 muestra estructuras representativas de proantocianidinas detectadas en polvo de asaí liofilizada y polvo de jusará liofilizado. Se realizó el análisis como se detalla anteriormente.
Ejemplo 8 Análisis de la composición del contenido en antocianina de polvo de baya de asaí Liofilizada
Se realizó el análisis de la composición del contenido en antocianina de polvo de baya FD de asaí liofilizada (n.º de lote MAL001) por IBC Labs (Integrated Biomolecule Corporation, Tucson, AZ). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 12.
Tabla 12
Analito
Resultado Unidad
Antocianinas
Cianidín-3-glucósido
1,566 mg/g
Cianadín-3-glucósido-6' cumarato
4,121 mg/g
Antocianinas totales:
5,687 mg/g
Grado de oligomerización de OPC (incluye lineal/ramificada)
Uno
0,5944 mg/g
Dos
0,4082 mg/g
Tres
0,7988 mg/g
Cuatro
0,8124 mg/g
Cinco
0,6821 mg/g
Seis
0,5223 mg/g
Siete
0,4046 mg/g
Ocho
0,3121 mg/g
Nueve y más
7,2067 mg/g
Proantocianinas oligoméricas totales:
11,7416 mg/g
Se realizó el análisis de antocianina y OPC de acuerdo con la metodología empleada por Brunswick Laboratories. Brevemente, se extrajo simultáneamente de forma diferencial una muestra en polvo en agua y acetato de etilo. Se recogió cada capa y se filtró vacío de sólidos. Se analizaron las antocianinas intactas de la capa de agua por HPLC en una columna de C-18 Zorbax 5 !m 150 X 4,6 mm usando una fase móvil de gradiente (1 ml/min. caudal) que consiste 5 en A (0,5% de ácido fosfórico) B (agua: acetonitrilo: ácido acético: ácido fosfórico -50:48,5:1:0,5) y el siguiente programa inicial 100% de A, 20 min 80% de A, 30 min 40% de A, 36 min 80% Identificación/ cuantificación realizada por estándares externos. Se analizaron las proantocianinas oligoméricas de la capa de acetato de etilo después del secado por evaporación, y la reconstitución en metanol anhidro. Se realizó la cromatografía en una columna Luna de fenilo-hexilo de 3 !m, 250 x 3,5 mm usando una fase móvil de gradiente (1 ml/min de flujo) que consiste en A (agua: 10 acetonitrilo: ácido acético 89:9:2) B (agua: acetonitrilo - 20:80) y el siguiente programa inicial 100% de A, 25 min 60% de A, 32 min 100% de B, 40 min 100% A. Identificación/cuantificación realizada por los primeros principios basados en coeficientes de extinción de estructuras de anillo de epicatequina y catequina parental.
Ejemplo 9 Análisis de ácidos grasos de asaí liofilizada
Se realizó un análisis de ácidos grasos para pulpa de asaí liofilizada por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago 15 Heights, IL; laboratorio ID n.º 170547512). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 13, tabla 14 y tabla 15.
Tabla 13
ÁCIDOS GRASOS SATURADOS
FÓRMULA % ÁCIDOS GRASOS SATURADOS FÓRMULA %
Butírico
4:0 <0,1 Palmítico 16,0 24,1
Captoico
6:0 <0,1 Margánico 17:0 0,1
Caprílico
8:0 <0,1 Esteárico 18:0 1,6
Cáprico
10,0 <0,1 Nonadecanoico 19:0 <0,1
Undecanoico
11:0 <0,1 Eicosanoico 20:0 <0,1
Láurico
12:0 0,1 Behénico 22:0 <0,1
Tridecanoico
13:0 <0,1 Tricosanoico 23,0 <0,1
Mirístico
14:0 0,2 Lignocérico 24:0 <0,1
Pentadecanoico
15:0 <0,1
Tabla 14
ÁCIDOS GRASOS MONOINSATURADOS
FÓRMULA % ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS FÓRMULA %
Tridecenoico
13:1 <0,1 Linoleico 18:2 12,5
Miristoleico
14:1 <0,1 Linolénico 18:3 0,8
Pentadecenoico
15:1 <0,1 Gamma linolénico 18:3G <0,1
Palmitoleico
16:1 4,3 Elcosadienoico 20:2 <0,1
Margaroleico
17:1 0,1 Eicosatrienoico 20:3 <0,1
Oleico
18:1C 56,2 Homogamma linolénico 20:3G <0,1
Elaídico
18:1T <0,1 Araquidónico 20:4 <0,1
Gadoleico
20:1 <0,1 Elcosapentaenoico 20:5 <0,1
Erúcico
22:1 <0,1 Docosadienoico 22:2 <0,1
Nervónico
24:1 <0,1 Docosahexaenoico 22:6 <0,1
Tabla 15 A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33.
Ácidos grasos monoinsaturados totales
60,60 61% monoinsaturados
Ácidos grasos saturados totales
26,10 26% saturados
Ácidos grasos poliinsaturados totales
13,30 13% poliinsaturados
Ejemplo 10 Análisis de ácidos grasos de fruto de jusará liofilizado
Se realizó un análisis de ácidos grasos de fruto de jusará liofilizado por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago Heights, IL; laboratorio ID n.º 171378575). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 16, tabla 17 y tabla 18.
Tabla 16
ÁCIDOS GRASOS SATURADOS
FÓRMULA % ÁCIDOS GRASOS SATURADOS FÓRMULA %
Butírico
4:0 <0,1 Palmítico 16,0 24,1
Captoico
6:0 <0,1 Margánico 17:0 0,1
Caprílico
8:0 <0,1 Esteárico 18:0 1,7
Cáprico
10,0 <0,1 Nonadecanoico 19:0 <0,1
Undecanoico
11:0 <0,1 Eicosanoico 20:0 0,2
Láurico
12:0 0,1 Behénico 22:0 <0,1
Tridecanoico
13:0 <0,1 Tricosanoico 23,0 <0,1
Mirístico
14:0 0,1 Lignocérico 24:0 <0,1
Pentadecanoico
15:0 <0,1
Tabla 17
ÁCIDOS GRASOS MONOINSATURADOS
FÓRMULA % ÁCIDOS GRASOS POLIINSATURADOS FÓRMULA %
Tridecenoico
13:1 <0,1 Linoleico 18:2 10,0
Miristoleico
14:1 <0,1 Linolénico 18:3 1,1
Pentadecenoico
15:1 <0,1 Gamma linolénico 18:3G <0,1
Palmitoleico
16:1 4,3 Eicosadienoico 20:2 <0,1
Margaroleico
17:1 0,1 Eicosatrienoico 20:3 <0,1
Oleico
18:1C 56,2 Homogamma linolénico 20:3G <0,1
Elaídico
18:1T <0,1 Araquidónico 20:4 <0,1
Gadoleico
20:1 <0,1 Eicosapentaenoico 20:5 <0,1
Erúcico
22:1 <0,1 Docosadienoico 22:2 <0,1
Nervónico
24:1 <0,1 Docosahexaenoico 22:6 <0,1
Tabla 18
Ácidos grasos poliinsaturados totales
11,10
Ácidos grasos monosaturados totales
60,20
Ácidos grasos saturados totales
28,70
A menos que se especifique de otro modo, todos los procedimientos se realizaron como se describe en los Procedimientos oficiales de análisis de la AOAC internacional, 17ª Edición, 2000 (en adelante, AOAC). Se midió el perfil de ácidos grasos de la muestra de prueba usando el procedimiento de la AOAC de referencia n.º 969.33.
Ejemplo 11 Análisis de aminoácidos de asaí liofilizada
I. ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO CON DERIVACIÓN POST-COLUMNA
Se realizó un análisis de aminoácidos por los procedimientos generales descritos a continuación.
A. Principio
Este procedimiento determina cuantitativamente el contenido en aminoácidos por hidrólisis con ácido clorhídrico 6 N seguido de cromatografía de intercambio iónico. Se usa o-ftaldehído para derivación post-columna y posterior detección fluorimétrica.
B. Alcance
Este procedimiento es aplicable a ingredientes, sustancia que contiene la proteína de alimentos mezclada.
C. Puntos críticos
Evitar el tiempo de evaporación en exceso mientras se secan las muestras. Puede tener lugar la pérdida de algunos aminoácidos.
D. Reactivos y productos químicos y protocolo
1.
Agua, grado de HPLC, EM Science EM WX0004-1 o sistema de purificación de agua interno.
2.
O-ftaldehído, grado de reactivo, Anresco 0317.
3.
Solución estándar de aminoácido, 2,5 pmoles/ml, Sigma A9531.
4.
Metanol, grado de HPLC, chempure 831-295 o equivalente.
5.
Solución de Brij 3, 30% (p/p), Sigma 430Agr.6
6.
2-Mercaptoetanol, (2-hidroxietilmercaptano), Sigma M-6250.
7.
L-norleucina, Sigma N-6877.
8.
Tampones Pickering, pH 2,2, 3.28, y 7,40, laboratorios Picketing Na 220, Na 328, y Na 740.
9.
Hidróxido de potasio, gránulos, Chempure 831-706.
10.
Hidróxido de sodio, gránulos, Chempure 832-050.
11.
Ácido clorhídrico, solución volumétrica 6 N, Chempure RR-155.
12.
Ácido etilendiaminotetraacético EDTA, sal de tetrasodio, hidrato, Sigma ED4SS.
13.
Fuente de nitrógeno.
14.
Ácido bórico, Chempure 830-314.
15.
Estándar interno de Norleucina - Pesar sobre una balanza analítica a 0,1 mg, 0,1640 g de Norleucina. Transferir a un matraz aforado de 1000 ml. Añadir 250 ml de agua de HPLC. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y mezclar. Preparar al volumen con agua de HPLC, mezclar y someter a sonicación. Esta solución contendrá 1,25 pxn/ml de L-norleucina. Refrigerar para evitar el crecimiento bacteriano.
16.
Solución estándar de aminoácidos - Calentar el vial de solución estándar de aminoácidos hasta temperatura ambiente. Pipetear 5,0 ml en un matraz aforado de 50 ml. Pipetear 10,0 ml de 1,25 pm/ml de estándar interno de L-norleucina en el mismo matraz de 50 ml. Preparar al volumen con agua de HPLC. Mezclar bien y someter a sonicación durante varios minutos. Transferir el estándar en viales de muestra Waters de 4 ml. Almacenar a 0 ºC.
17.
Solución de hidróxido de potasio, 50% - Sobre una balanza de carga superior, pesar 150 g de hidróxido de potasio en un recipiente de Nalgene de 1 litro tarado. Disolver con 150 g de agua desionizada, agitar como sea necesario. Dejar que la solución enfríe hasta temperatura ambiente antes de su uso.
18.
Tampón de ácido bórico - Pesar 122 g de ácido bórico en un vaso de precipitados de 2000 ml y añadir 1800 ml de agua de HPLC. Ajustar el pH hasta 11,0 con solución de hidróxido potásico al 50%. Transferir la solución a 4 litros de jarra de vidrio y llenar al volumen (4 litros)con agua de HPLC y mezclar bien. El pH de la solución final debe ser de
10,4.
19. Fase móvil de tampón Pickering:
a.
pH 3,28 - Este tampón se puede usar como es desde el frasco. Filtrar a través de una membrana de filtro de 0,45 pm y desgasificar antes del uso de HPLC por vacío bajo sonicación.
b.
pH 7,40 - Este tampón se puede usar como es desde el frasco. Filtrar a través de una membrana de filtro de 0,45 pm y desgasificar antes del uso de HPLC por vacío bajo sonicación.
20.
Hidróxido de sodio, 0,2 N - Pesar 16 g gránulos de hidróxido de sodio en un matraz aforado de 2 litros. Añadir aproximadamente 1000 ml de agua de HPLC y mezclar hasta que se disuelva el hidróxido de sodio. Pesar 0,5 g de EDTA, añadir al aforado. Preparar al volumen con agua de HPLC, mezclar y filtrar a través de una membrana de filtro de 0,45 mm. Usar una jarra de 1 galón (7,785 litros) de plástico como recipiente para HPLC. Filtrar de forma periódica.
21.
O-ftaldehído, Pesar 1,4 g de cristales de o-ftaldehído (OPA) en un vaso de precipitados de 50 ml. Añadir 20 ml de metanol de grado de HPLC y someter a sonicación hasta que se disuelvan los cristales. Añadir solución a un matraz aforado de 2 litros que contiene aproximadamente 500 ml de tampón de ácido bórico y mezclar. En una campana, añadir 4,0 ml de 2-mercaptoetanol (hedor!). Llenar al volumen con tampón de ácido bórico y mezclar. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 pm. Verter la solución filtrada en dos frascos Nalgene de 1 litro y añadir 3,0 ml de Brij-35 en cada bote. Tapar los frascos con nitrógeno y mezclar bien. Refrigerar hasta que se necesite. La solución de OPA es estable durante aproximadamente 1 semana bajo estas condiciones (puede extenderse hasta 2 semanas).
E. Equipo y aparatos
1.
Autoinyector modelo 712 B de Waters o equivalente.
2.
Bomba modelo 6000 de Waters (2), 2100 de Waters o equivalente.
3.
Digital Pro 380 con programa informático Expert de Waters o equivalente.
4.
Detector fluorimétrico FS-950 de Kratos o equivalente.
5.
Bomba post columna URS 051 de Kratos o equivalente.
6.
Calentador de columna de Fiatron, Eppendorf CII-30 o equivalente.
7.
Horno Isotemp de Fisher, modelo 215 P o equivalente.
8.
Concentrador Speed Vac. de Savant, modelo SVC-20011.
9.
Trampa de condensación refrigerada de Savant, modelo RT-490.
10.
Trampa química de Savant, modelo SCT-120.
11.
Cartucho desechable de Savant para neutralización de vapor ácida, modelo DC12OA.
12.
Bomba de vacío Direct drive de precisión, modelo Dd-310 o equivalente.
13.
Vacuómetro, estación de trabajo Pico-Tag de Waters o equivalente.
14.
Agitador vórtex de pulso pequeño Glass-Col, modelo S8216, Glas-Col PV6.
15.
Medidos Beckman pH140, Beckman 123118 o equivalente.
16.
Balanza analítica Mettler, modelo AE16O o equivalente.
17.
Aparato de filtración de disolvente de Millipore, Waters 85116.
18.
Columna de intercambio iónico cargada con sodio de interacción, con precolumna. Cromatografía de interacción AMI 1.
19.
Baño ultrasónico de Bransonic modelo 220.
20.
Balanza de carga superior Mettler, modelo P-1000.
21.
Pipeman. Gilson, 1 ml y 5 ml, Rainin P4000 y P-5000.
22.
Puntas de pipeta lit. Universal, 1 ml SoS ml, Rainin.
23.
Jeringuilla de Plastipak con Luer-Lok, 3 cm3 x 1/10 cm3, BI) 9585 o equivalente.
24.
Filtros de jeringuilla, polipropileno, Teflón, 0,45 micrómetros, Nalgene 199-2045.
25.
Membrana Magna Nailon 66 de 47 mm de diámetro, 0,45 micrómetros de tamaño de poro, Fisher N045P0410
26.
Dispensador Repipet II, S ml, Fisher 13-687-62A.
27.
Puntas de pipeta fir Universal, 200 - 100C) d. VWR 53508-819.
28.
Tubos de cultivo desechables, 12 x 75 mm, vidrio de borosilicato, VWR 60825-550 o equivalente
29.
Montaje de vial de muestra, 4 ml, incluye grifo y septos PFTE, Waters 73018.
30.
Inserción de bajo volumen con resorte, plástico, para vial de muestra de 4 ml. Waters 72163.
31.
Válvula Firestone, purga rápida, Ace Glass mc, 8766.
32.
Tubos de cultivo, desechables, 20 x 150 mm, tapón de rosca, vidrio de borosilicato, VWR 60826.280.
33.
Tapón de rosca para tubos de cultivo desechables, 20 mm 0]), forro PTFB, VWR 60828-570.
34.
Molino de centrífuga Brinkman, modelo ZM-1 (con tamiz de 0,5 mm) o equivalente.
F. Preparación de muestra:
Se molió la muestra lo más fina posible mientras que se mantuvo la pérdida de humedad al mínimo. Se molió la muestra a través de un molino de centrífuga de Brinkman modelo ZM-1, o equivalente, usando un tamiz de 0,5 mm para obtener una molienda fina .
G. Procedimiento:
1.
Se calibró la balanza analítica y se ajustó a cero.
2.
Es útil tener conocimiento del contenido en proteínas de la muestra antes de pesar para realizar el análisis de aminoácidos. En este sentido, se pesó un equivalente de la muestra para 20 mg de proteína en una balanza analítica. (Consultar el suplemento para la determinación de aminoácidos libres.) Para una muestra casi pura, se pesaron aproximadamente 38 mg. Se registró el peso en un se registraron en un cuaderno de laboratorio. Después se transfirió cuantitativamente la muestra a un tubo de cultivo con rosca superior de giro de 20 x 150 marcada.
3.
Usando el dispensador Repipet II, se añadieron 15 ml de ácido clorhídrico 6 N a cada tubo de cultivo. Debido a la molienda y a la cantidad limitada de muestra tomada, se evitó cualquier modificación que pueda provocar una pérdida de muestra del tubo de cultivo.
4.
En la campana, se añadieron 75 microlitros de 2-mercaptoetanol a cada tubo de cultivo (Nota 1). Esto permitió una mejor determinación del pico de L-metionina.
5.
Cada tubo de cultivo se sometió al procedimiento de Firestone (Nota 2), alternando entre nitrógeno (6,9x104-8,3x104 Pa (10-12 psi)) y vacío, al menos 5 veces cada uno.
6.
Mientras la muestra estuvo bajo nitrógeno, se enroscaron las tapas hacia PTFE.
7.
Se colocaron los tubos de cultivo en un horno a 110 ºC ± 2 ºC durante 24 horas.
8.
Se montó el sistema de evaporación Savant. Se inició la alimentación del sistema al menos 2 horas antes de su uso, por lo tanto, la unidad de refrigeración tiene una cantidad suficiente de tiempo hasta alcanzar la temperatura final de trabajo de - 92 ºC. Se desgasificó cuidadosamente el petróleo en la bomba de vacío. Esto se hizo, según fue necesario, abriendo la válvula de lastre de gas en la bomba y encendiendo la bomba. En general, fue suficiente una hora. Se apagó la bomba y se cerró la válvula de lastre de gas después de su terminación.
9.
Después de 24 horas, se retiraron los tubos de cultivo del horno y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente.
10.
Se añadieron 5 ml de agua de grado de HPLC a cada tubo de cultivo. Se desenroscó la tapa y se mezcló bien.
11.
Se añadieron 5 ml de estándar interno de Norleucina (1,25 pm/ml) a cada tubo de cultivo (Nota 3). (En este punto se puede detener el análisis hasta el día siguiente, si es necesario. Almacenar el tubo de cultivo a 0 ºC si se necesita almacenar durante la noche.)
12.
Usando de una Pipetman de 1 ml , se transfirieron 2 ml de hidrolizado en un tubo de cultivo desechable de 12 x 75 mm marcado.
13.
Se abrió la tapa del concentrador Speed Vac. y se colocaron los tubos que contenían los 2 ml de hidrolizado en posiciones alrededor del rotor de modo que la carga estuviera bien equilibrada.
14.
Se cerró la tapa, se abrió la ventilación y se inició la centrífuga. Cuando el rotor alcanzó su rpm de funcionamiento, se cerró la ventilación del vacuómetro y se inició la bomba de vacío. El proceso de evaporación puede tener lugar durante la noche, si es necesario. Esto sería así, si se evaporaron muchas muestras, comenzando al final del día (Nota 4).
5 15. Cuando las muestras están secas (lecturas de vacuómetro menores de 500 mililitros), se abrió lentamente la ventilación para que entrara aire en la cámara. Se apagó la bomba y, una vez que se ha ventilado completamente la cámara , se apagó la centrífuga, se retiraron los tubos.
16. Se añadieron 3 ml de diluyente de sodio 220 de Pickering a cada tubo y se sometieron momentáneamente a sonicación antes de la agitación con vórtex.
10 17. Se unió un filtro de 0,45 pm a una jeringuilla de 3 ml. Se filtró el hidrolizado preparado en un vial de 4 ml marcado que contenía una inserción de bajo volumen de Waters con resorte, después se colocó sobre una bandeja automuestreadora 712B WISP.
18. Condiciones de HPLC:
a. Se desgasificaron todos los tampones y soluciones de OPA por sonicación bajo vacío. Se colocaron las líneas de
15 tampones en una solución tampón adecuada y la línea de OPA en solución de OPA. Se equilibró la columna con tampones 3,28 con el caudal a 0,5 ml/minuto durante al menos 20 minutos.
b.
Se ajustó el control de sensibilidad sobre fluorímetro a 450, intervalo hasta 0,5, tiempo constante de 1 segundo, supresión de fondo que "to".
c.
Se ajustó la temperatura del calentador de la columna a 60 ºC y se monitorizó durante el funcionamiento.
20 d. Se inició la bomba de OPA y se ajustó el caudal a 0,50 ml/minuto (ajustando a la baja si fuera necesario).
e. Se colocó un estándar en posición n.º1 y n.º 2 en WISP. Se construyeron las tablas de procedimiento múltiple y/o de procedimiento y se inyectó 20 F1 de estándar. Se dejó un tiempo de funcionamiento de 60 minutos. Se observó el cromatograma resultante. Se inyectó una tercera vez si la cromatografía no era satisfactoria.
f.
Se hizo funcionar con un estándar después de cada cinco muestras. Se generarán factores de respuesta 25 actualizaron y se usarán para inyecciones posteriores.
g. Si el pico estaba fuera de la ventana, se volvieron a procesar las muestras y se ajustó el tiempo de retención en la tabla de calibración para que coincida con el de la muestra. Se imprimieron y se almacenaron los cromatograma nuevos corregidos.
h.
Elución de gradiente usando 2 tampones: Usando el software de Waters, se estableció un gradiente satisfactorio 30 usando 2 tampones para elución de aminoácidos. Sigue la tabla de bomba 19:
Tabla 19, Perfil estándar de tabla de bomba
Tiempo
Flujo % de A % de B Curva N.º, Caudal total
Inicial
0,500 100 0 - 0,500
35,0
0,500 0 100 6 0,500
45,0
0,500 0 100 11 0,500
45,5
0,500 100 0 11 0,500
Donde A = Tampón Pickering Na 328; B = Tampón Pickering Na 740
J. Cálculos: Factor de respuesta = Cantidad de aminoácidos (mg) x Área de norleucina (estándar interno) Área de aminoácidos
35 Entonces, RF x Área de muestra de aminoácidos = Concentración de aminoácidos (mg)
Ámbito de estándar interno de norleucina
Dado que el volumen de muestra determina la concentración final, la concentración de aminoácidos fija el volumen de
muestra = concentración final de aminoácidos.
K. Notas:
1.
Se puede usar ácido mercaptoacético en su lugar, si fuera necesario - si se usa Brij-35-dad para preservar Lrs quek.
2.
El procedimiento de Firestone consistió en la evacuación y el purgado de forma alterna con nitrógeno de la
5 solución de muestra de ácido en un baño sonicado. Esto desgasificó la solución y creó una atmósfera inerte sobre el ácido minimizando así la oxidación de los aminoácidos durante la hidrólisis.
3.
Usando una Pipetman de 5 ml, calibrar con agua a temperatura ambiente hasta 5,000 B ± 0,005 g.
4.
Con buen vacío, se pueden congelar las muestras en los tubos. Si es así, después de aproximadamente 45 a 60
minutos, retirar los tubos y calentar el hidrolizado en un vaso de precipitados que contiene agua caliente. Colocar los 10 tubos de nuevo en el rotor y continuar la evaporación.
L. Validación:
M. Control de calidad:
1. Seguir las prácticas de aseguramiento de calidad estándar detalladas en el Manual de aseguramiento de calidad.
15 2. Se debe incluir un estándar de control (estándar secundario) en cada funcionamiento de muestras. Actualmente, se emplea caseína como control.
3.
Se deben registrar los resultados del estándar de control en el cuaderno de laboratorio.
4.
Los funcionamientos por duplicado del estándar no deben variar en más de un 8%.
5.
Se deben iniciar y fechar los cuadernos por el analista que realiza la prueba.
20 6. Se deben revisar, entender, iniciar y fechar las entradas del cuaderno por otro analista en el departamento.
N. Referencias:
1.
JAOAC: Vol. 65, N.º 2, 1982, páginas 496-497. Calculated Protein Efficiency Ration.
2.
Degussa- Literature Digest for the Feedstuffs Industry-Amino Acid Analysis. Chemie/AnwendungstechnikHanau Stadtteil Wolfgang, Rep. Fed. de Alemania.
25 3. The Peptides, Vol. 4, Amino Acid Analysis of Peptides, Ch 5. p. 217-259, JR Benson, P.C. Louie and LA. Bradsbaw. Copyright 1981, Academic Press, Inc.
4.
USDA Chemistry Laboratory Guidebook, G-41
5.
IAOAC: Vol. 68, N.º 5,1985, p. 811-821. SamplePreparation for Chromatography of Amino Acids:Acid Hydrolysis of Proteins.
30 II. ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS DE PULPA DE ASAÍ LIOFILIZADA Se realizó un análisis de aminoácidos de pulpa de asaí liofilizada por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago Heights, IL; laboratorio ID n.º 170547512). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 20.
Tabla 20 (continuación)
Analito - Aminoácidos Completo *
Resultados **
Ácido aspártico
0,83
Treonina
0,31
Serina
0,32
Ácido glutámico
0,80
Glicina
0,39
Alanina
0,46
Analito - Aminoácidos Completo *
Resultados **
Valina
0,51
Metionina
0,12
Isoleucina
0,38
Leucina
0,65
Tirosina
0,29
Fenilalanina
0,43
Lisina
0,66
Histidina
0,17
Arginina
0,42
Prolina
0,53
Hidroxiprolina
<0,01
Cistina
0,18
Tripotófano
0,13
* Procedimiento de referencia - USDA 6,011 (1986)
**Los análisis de aminoácidos se presentan como p/p% (g/100g),
Ejemplo 12: Análisis de aminoácidos de fruto de jusará liofilizado
Se realizó un análisis de aminoácidos de fruto de jusará liofilizado por Silliker, Inc. Illinois Laboratory (Chicago Heights, IL; laboratorio ID n.º 171378575; como se detalla en el ejemplo 11). Los resultados se detallan a continuación en la tabla 21.
Tabla 21
Analito - Aminoácidos Completo *
Resultados **
Ácido aspártico
0,12
Treonina
0,04
Serina
0,05
Ácido glutámico
0,10
Glicina
0,04
Alanina
0,05
Valina
0,05
Metionina
0,02
Isoleucina
0,03
Leucina
0,06
Tirosina
0,02
Fenilalanina
0,04
Lisina
0,05
(continuación)
Analito - Aminoácidos Completo *
Resultados **
Histidina
0,02
Arginina
0,04
Prolina
0,05
Hidroxiprolina
<0,01
Cistina
0,03
Tripotófano
0,06
* Procedimiento de Referencia - USDA MSS2 (1993)
**Los análisis de aminoácidos se presentan como p/p% (g/100g)
Ejemplo 13 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y hortalizas seleccionadas por 5 análisis de CAROFL
I. ENSAYO DE CARO GENERAL
El ensayo de CARO fue desarrollado por Cao et al., y se informó por primera vez en 1993: "Cao G, Alesslo HM, Cutler RG, Oxygen radical absorbance capacity assay for antioxidant:. Free Rad. Biol. Med. 1993:14:303-11". Se realizaron modificaciones para automatizar el procedimiento analítico y se informaron en la literatura en 1995: "Automated Assay
10 of Oxygen Radical Absorbance Capacity with the COBAS FARA II Guohua Cao, Carl P. Verdon. Akin H.B. WU, Hong Wang y Ronald L. Prior, CLINICAL CHEMISTRY, Vol. 41, N.º 12, 1995".
Desde este punto, el ensayo automatizado de CARO recibió amplia cobertura y utilización, y como tal, los valores de CARO se han vuelto comunes en la investigación y en la comercialización de productos naturales. Brunswick Laboratories adquirió dos analizadores COBAS FARA 11 en 1997, repitieron el procedimiento automatizado como se
15 desarrolló por Cao, Prior, et al, y hasta la fecha, ha establecido una base de datos de antioxidantes que consiste en más de 5000 puntos de datos de ORAC para frutos, hortalizas, bebidas, granos, alimentos funcionales/manipulados, extractos, y otras fuentes de productos naturales.
Brunswick Laboratories, trabajando con la USDA, introdujo una nueva sonda de fluorescencia, fluoresceína, que se ha probado con varios cientos de muestras, en una comparación directa con beta-ficoeritrina. La fluoresceína, a diferencia
20 de beta-PE, no interacciona con las muestras de prueba, y como es una sustancia sintética, la fluoresceína no tiene una variabilidad medible de lote a lote. Lo más importante, las muestras sometidas a múltiples veces bajo las mismas condiciones mantienen resultados consistentes y repetibles.
El desarrollo del ensayo de ORAC usando fluoresceína como sonda de fluorescencia se ha llevado a cabo en cooperación con los promotores del ensayo de ORAC automatizado original, en el que se utilizó beta-PE como sonda
25 de fluorescencia. En base a estudios extensamente mecánicos, ambas partes se cierran al ensayo de CARO basado en fluoresceína como el nuevo procedimiento de CARO estándar. Los dos ensayos de ORAC se distinguen en el presente documento usando el subíndice PE para ficoeritrina, y FL para fluoresceína, CAROPE y CAROFL
II. ANÁLISIS DE POLVO DE ASAÍ LIOFILIZADA Y COMPARACIÓN CON HORTALIZAS SELECCIONADAS
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizado (Brunswick Lab ID. 02-0104; Brunswick Laboratories,
30 Wareham, MA) con la actividad antioxidante de hortalizas seleccionadas determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 10). Se midió el valor de CARO de polvo de asaí liofilizada como 442 !moles TE/g. Este valor fue más de 10 veces superior al valor de CARO de la lombarda (42 !moles TE/g) (Fig. 10). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies de oxígeno reactivas (ERO) más
35 comunes que se encuentra en el cuerpo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 14 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y frutos frescos seleccionados por análisis de CAROFL
40 Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizada (231003/0410-C; Brunswick Lab ID. 03-2096; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos frescos seleccionados determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 11). Como se muestra en la FIG. 11, el valor de
CARO de polvo de asaí liofilizada (536 !moles TE/g) fue más de 2 veces mayor que los valores de CARO de la asaí fresca (185 !moles TE/g) o bien de la frambuesa negra (164 !moles TE/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 15 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y frutos frescos seleccionados por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizada (Brunswick Lab ID. 02-0104; Brunswick Laboratories,Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos frescos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 12). Se midió el valor de CARO de polvo de asaí liofilizada como 442 !moles TE/g. Este valor fue más de 2 veces superior al valor de CARO de la frambuesa negra (164 !moles TE/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 16 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y frutos seleccionados por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizada (Brunswick Lab ID. 02-0104; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos seleccionados como se determina por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 13). Como se muestra en la FIG. 13, el valor de CARO de polvo de asaí liofilizada fue de 442 !moles TE/g. El Valor de CARO para polvo de jusará liofilizado fue de 1193 TE/g. El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra los radicales peroxilo, que es una de las especies de oxígeno reactivas (ERO) más comunes que se encuentra en el cuerpo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 17 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí deshidratada y frutos frescos seleccionados por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí deshidratado (23100/0410-C; Brunswick Lab ID. 03-2096; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos frescos seleccionados determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 14). Como se muestra en la FIG. 14, el valor de CARO del polvo de asaí liofilizado (536 μmoles ET/g) fue mayor que el valor de CARO de la frambuesa negra deshidratada (164 μmoles ET/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 18 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y hortalizas frescas seleccionadas por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizada (231003/0410-C; Brunswick Lab ID. 03-2096; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de hortalizas frescas seleccionadas determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 15). Como se muestra en la FIG. 15, el valor de CARO del polvo de asaí liofilizado (536 μmoles ET/g) fue mayor que el valor de CARO de la lombarda (42 μmoles ET/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 19 Análisis comparativo del potencial antioxidante de frutos, hortalizas y frutos secos seleccionados por análisis de CARO
La FIG. 16 muestra la actividad antioxidante de frutos, hortalizas y frutos secos como se determina por la técnica de análisis de CARO (Brunswick Laboratories, Wareham, MA; como se detalla anteriormente). El análisis de CAROFL , utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra los radicales peroxilo, que es una de las especies de oxígeno reactivas (ERO) más comunes que se encuentran en el cuerpo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo
hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 20 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizada y frutos secos seleccionados por análisis de CAROFL
5 Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizado (Brunswick Lab ID. 02-0104; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos secos seleccionados determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente). Se midió el valor de CARO de polvo de asaí liofilizada como 442 !moles TE/g. Este valor fue más de 2 veces superior al valor de CARO de la pacana (164 !moles TE/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los
10 antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 21 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí deshidratada y frutos y hortalizas 15 deshidratadas seleccionadas por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí deshidratada (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos y hortalizas deshidratadas seleccionadas determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 18). Como se muestra en la FIG. 18, el valor de CARO del polvo de asaí deshidratada (536 μmol ET/g) fue mayor que el valor de CARO de la frambuesa negra deshidratada (340 μmol ET/g).
20 El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
25 Ejemplo 22 Análisis comparativo del potencial antioxidante de asaí deshidratada y hortalizas frescas seleccionadas por análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí deshidratada (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de hortalizas frescas seleccionadas determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 19). Como se muestra en la FIG. 19, el valor de CARO del polvo de asaí liofilizado (536 30 μmoles ET/g) fue mayor que el valor de CARO de la lombarda (42 μmoles ET/g). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en
35 micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Ejemplo 23 Análisis comparativo del potencial antioxidante de frutos y hortalizas por análisis de CAROhidro
La tabla 22 resume la actividad antioxidante de frutos y hortalizas deshidratados (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) como se determina por la técnica de análisis de CAROhidro (como se detalla anteriormente). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los
40 antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Frutos / Hortalizas
Puntuaciones de CAROhidro
Remolachas
120
Frambuesa negra
340
Brócoli
130
Zanahorias
50
Cerezas
100
Baya del Saúco
240 (muestra única)
Judías verdes
70
Espino
130
(continuación)
Pimiento rojo
90
Frambuesa roja
210
Espinaca
150
Tomate
60
Arándanos americanos salvajes
260
Baya de Goji
220 (muestra única)
Todos los valores son CAROhidro por gramo. Todos son promedios de muestras múltiples, a menos que se establezca de otro modo.
Ejemplo 24 Análisis comparativo del potencial antioxidante de frutos y hortalizas por análisis de CAROhidro
La tabla 23 resume la actividad antioxidante de frutos y hortalizas deshidratados (Brunswick Laboratories, Wareham, MA) como se determina por la técnica de análisis de CAROhidro (como se detalla anteriormente). El análisis de CAROFL, utilizando fluoresceína como la sonda fluorescente, proporcionó una medida de la capacidad eliminadora de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo.
Tabla 23
Frutos / Hortalizas
Puntuaciones de CAROhidro
Remolachas
120
Frambuesa negra
340
Brócoli
130
Zanahoria
50
Cerezas
100
Arándano rojo
125
Baya del Saúco
240 (muestra única)
Judías verdes
70
Pimiento verde
160
Espino
130 (muestra única)
(continuación)
Frutos / Hortalizas
Puntuaciones de CAROhidro
Pimiento rojo
90
Frambuesa roja
210
Espinaca
150
Tomate
60
Arándanos americanos salvajes
260
Baya de Goji
220 (muestra única)
Todos los valores son CAROhidro por gramo. Todos son promedios de muestras múltiples, a menos que se establezca de otro modo.
(MHPSOR 25 Análisis Comparativo del potencial antioxidante de asaí liofilizado y de frutos y hortalizas 5 deshidratados mediante análisis de CAROFL
Se comparó la actividad antioxidante de polvo de asaí liofilizado (231003/0410-C; Brunswick Lab ID. 03-2096; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) con la actividad antioxidante de frutos y hortalizas deshidratados seleccionados determinada por la técnica de análisis de CAROFL (como se detalla anteriormente) (FIG. 20). Como se muestra en la FIG. 20, el valor de CARO del polvo de asaí liofilizado (536 μmol ET/g) fue mayor que el valor de CARO 10 de la frambuesa negra deshidratada (340 μmol ET/g). El análisis de CAROFL, utilizando flouresceína como la sonda flourescente, proporcionó una medida de la capacidad de eliminación de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por
15 gramo.
(MHPSOR 26 Análisis del potencial antioxidante de asaí liofilizado mediante análisis de trans-resveratrol
Se determinó que la actividad antioxidante del polvo de asaí liofilizado (231003/0410-C; Brunswick Lab ID. 03-2096; Brunswick Laboratories, Wareham, MA) mediante análisis de trans-resveratrol (como se detalla a continuación) era de 1,1 μg/g.
20 Las muestras se analizaron usando una cromatografía de HPLC usando un HPLC de HP serie 1100 equipado con una Phenomenex Luna de fenilo-hexilo (250 x 4,6 mm) con prefiltro de 2 bandas y muestreador automático/inyector, bomba binaria de HPLC, calentador de columna, detector de haz de diodos y detector de fluorescencia. La fase móvil A2 fue H2O DI: acetonitrilo: ácido acético (89:9:2 v/v). La fase móvil B2 fue acetonitrilo: H2O DI (80:20v/v). Todas las muestras biológicas se almacenaron en un congelador a -80ºC hasta el momento del análisis. Todas las muestras
25 secas y de frutos se extrajeron con 20 ml de metanol (MeOH). Después de la extracción, las muestras se sonicaron durante 1 h. Todas las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm a 4ºC durante 5 min. Las muestras se analizaron a un caudal de 1 ml/min con un tiempo de recorrido de 35 min y un tiempo posterior al recorrido de 10 min. El tiempo de retención fue de aproximadamente 26 min. El gradiente se estableció como sigue: 10 min al 0% de B; 25 min al 40% de B; 32 min al 100% de B; y 35 min al 100% B. Se monitorizó la absorción a 280 nm. La cuantificación de compuestos por
30 HPLC es el procedimiento de determinación de la concentración desconocida de un compuesto en una solución conocida. Implica inyectar una serie de concentraciones conocidas de la solución de compuesto estándar de resveratrol en el HPLC para la detección. La cromatografía de estas concentraciones conocidas dará una serie de picos que se correlacionan con la concentración del compuesto inyectado.
(MHPSOR 27 Análisis de las actividades antioxidantes contra el radical hidroxilo y peroxinitrito en 35 preparaciones de jusará y asaí
I. GENERAL
A. Peroxinitrito
El peroxinitrito es un producto citotóxico de óxido nítrico (NO) y superóxido. El peroxinitrito es un oxidante mucho más fuerte y mucho más tóxico que el óxido nítrico o el superóxido actuando por separado.
40 Una variedad de patologías se asocian con la formación de peroxinitrito, un potente oxidante formado a partir de la reacción de NO con superóxido. Esta reacción es la reacción más rápida que se sabe que experimenta el NO y transforma dos radicales relativamente no reactivos en un oxidante más reactivo, el peroxinitrito. El peroxinitrito se forma invariablemente en cantidades mayores cuando se produce más NO y/o cuando prevalece un nivel elevado de O2-.
5 El peroxinitrito es un potente oxidante implicado en una serie de procesos patofisiológicos. El peroxinitrito viaja libremente a través de membranas celulares lipídicas. El coeficiente de permeabilidad calculado para el peroxinitrito es comparable con el del agua y es aproximadamente 400 veces mayor que el del superóxido, por lo que es una molécula efectora biológica, no sólo por su reactividad sino también su capacidad de difusión. (Lee, J., Marla, S.S. Peroxynitrite rapidly permeates phospholipid membranes. Proc Natl Acad Sci., 1997.)
10 En este sentido, patologías tales como la diabetes, la ateroesclerosis y el daño por isquemia y reperfusión, se asocian con el estrés oxidativo caracterizado por un nivel elevado de O2- que puede dar lugar a un incremento de la formación de peroxinitrito. Pruebas recientes sugieren también que la esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer se asocian con la formación de peroxinitrito. Además, también se ha implicado al peroxinitrito durante la isquemia y la reperfusión, y durante la sepsis y el síndrome de dificultad respiratoria del adulto. La isquemia y la reperfusión van
15 acompañadas de un incremento de superóxido debido a la activación de la xantina oxidasa y la NAPDH oxidasa, respectivamente. Por tanto, es probable que el peroxinitrito esté implicado en una serie de patologías en las que se produce un desequilibrio de NO y O2-. La formación de peroxinitrito es deseable para la inmunidad no específica, pero posiblemente no durante la señalización por NO.
El peroxinitrito se forma en biología a partir de la reacción de óxido nítrico y superóxido. La enzima superóxido 20 dismutasa (SOD) disminuye el superóxido y evita la formación de peroxinitrito (véase la revisión del inventor: Pryor,
W.A. y Squadrito, G.L. (1995). Am. J. Physiol. (Lung Cell. Mol. Physiol. 12) 268, L699-L722). The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitric oxide with superoxide). El peroxinitrito es un potente oxidante y puede oxidar por sí mismo muchas biomoléculas. No obstante, en sistemas biológicos, reacciona principalmente con dióxido de carbono para formar intermedios reactivos, tales como ONOOCO2-, O2NOCO2-, COO3- y NO2. De estos
25 intermedios, sólo el COO3-y el NO2 participan en reacciones bimoleculares con moléculas objetivo biológicas; los aductos de CO2 ONOOCO2-y O2NOCO2- tienen tiempos de vida demasiado cortos y se descomponen antes de que puedan reaccionar bimolecularmente.
Se sabe que el estrés oxidativo, tal como el provocado por el peroxinitrito, daña el endotelio vascular, un proceso que puede dar lugar a la ateroesclerosis (Thom, S.R. e Ischiropoulos, H. Mechanism of oxidative stress from low levels of
30 carbon monoxide. Health Effects Institute Research Report, número 80, 1997).
B. Radical hidroxilo
Si la función de los radicales es destruir moléculas y tejidos, entonces el radical hidroxilo sería el radical de los radicales. Reacciona a velocidades de difusión con prácticamente cualquier molécula que se encuentre en su camino, incluidas macromoléculas tales como el ADN, lípidos de membrana e hidratos de carbono. En términos de ADN, el
35 radical hidroxilo puede inducir roturas de cadena, así como cambios químicos en la desoxirribosa y en las bases de purina y pirimidina.
Las proteínas dañadas, muchas de ellas enzimas esenciales en las neuronas, pierden su eficacia y la función celular se reduce. La oxidación de proteínas en muchos tejidos, incluido el cerebro, se ha propuesto como una explicación para los déficits funcionales asociados con el envejecimiento.
40 La radical hidroxilo es una especie de radical de tercera generación que deriva del peróxido de hidrógeno (H2O2), que, a su vez, deriva del radical superóxido a través de la acción de la enzima superóxido dismutasa.
El peróxido de hidrógeno se reduce a radicales hidroxilo por las enzimas glutatión peroxidasa y catalasa en presencia de metales de transición, tales como hierro o cobre.
II. RESULTADOS
45 Se determinaron las actividades antioxidantes del polvo de asaí liofilizado y el polvo de jusará liofilizada (Brunswick Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA) mediante la técnica de análisis de CARO (como se detalla anteriormente) y se resumen a continuación en la tabla 24.
Tabla 24 Medida de las actividades antioxidantes contra el radical hidroxilo y peroxinitrito
Muestras
CAROH CARON
Jusará
85 134
Asaí
52 34
El resultado de CAROH de la tabla 24 se expresa como equivalentes en micromoles de ácido gálico por gramo. El resultado de CARON de la tabla 24 se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox por gramo.
Ejemplo 28 Análisis de la actividad de tipo superóxido dismutasa y la actividad inhibidora de la ciclooxigenasa de preparaciones de asaí y jusará
I. ENSAYO DE ACTIVIDAD DE ELIMINACIÓN DE SUPERÓXIDO (O2-) (SOD)
A. Antecedentes
Se calcula que el uno por ciento del oxígeno total consumido por un adulto (70 kg de masa corporal) se convierte en anión superóxido. Un adulto en reposo utiliza 3,5 ml de O2/kg/min, lo que daría como resultado 0,147 mol/día de O2-. Se cree que el O2- es la causa de otras especies reactivas de oxígeno tales como peróxido de hidrógeno, peroxinitrito y radicales hidroxilo (a partir de peróxido de hidrógeno). Por lo tanto, la capacidad de eliminación del O2-en el cuerpo humano es la primera línea de defensa contra el estrés oxidativo. De hecho, se ha informado de que la sobreexpresión de superóxido dismutasa y catalasa en moscas transgénicas prolongó el tiempo de vida hasta un tercio, quizás debido a la disminución del estrés oxidativo reflejada por un menor contenido en carbonilo de proteínas (Orr y Sohal, Science
263:
1128-1130, 1994. La capacidad de eliminación de superóxido en sangre es un parámetro muy importante para el estado antioxidante propio. Este ensayo está diseñado para cuantificar con precisión este parámetro de una forma de alto rendimiento.
B.
Procedimiento experimental
Instrumentos
Sistema de manejo de líquidos Precision 2000 de ocho canales y lector de fluorescencia y de UV-VWAS de microplacas Synergy HT, ambos de Bio-tek Inc. (Winooski, VT).
Reactivos
La hidroetidina fue de Polysciences, Inc. (Warrington, PA). La xantina oxidasa (de suero de leche, número de catálogo X4875), la xantina, la superóxido dismutasa (de eritrocitos bovinos, número de catálogo S 2515) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
i. Preparación de reactivos
Tampón. El tampón consiste en tampón de fosfato 75 mM (pH 7,4) que contiene ácido dietilentriamino pentaacético 100 ìM (DTPA). Para preparar el tampón, se pesaron 0,0393 g de dietilentriamina (DTPA) y se añadieron 10 ml de solución de trabajo de tampón de CARO. Esto proporcionó 10 ml de disolución madre de DTPA 10 mM. A continuación, a 198 ml de solución de trabajo de tampón de CARO se les añadieron 2 ml se solución madre de DTPA. Esto proporcionó 200 ml de solución de trabajo de tampón de O2- 100 ìM con DTPA.
Xantina oxidasa. La suspensión de xantina oxidasa (en frigorífico) de Sigma se diluyó 20 veces con tampón para dar una solución homogénea. Se tomaron 19 ml de tampón de O2- y se añadió 1,0 ml de suspensión de xantina oxidasa. Esto proporcionó 20 ml de solución de trabajo de xantina oxidasa, que se preparó nuevamente a diario.
Solución de xantina. La xantina (15 mg) se pesó y se colocó en una botella de vidrio transparente. Se añadieron 5 ml de hidróxido de sodio 0,1 N (NaOH 0,1 N) y la solución se agitó con vórtex y se sonicó hasta que se disolvió el sólido. Se añadieron 95 ml de tampón de O2-y se agitó con vórtex. Esto proporcionó 100 ml de solución de xantina. La solución se mantuvo a temperatura ambiente para evitar la precipitación de la xantina. La solución de xantinas se preparó nuevamente a diario.
Solución de trabajo de hidroetidina (HE). Solución madre de dihidroetidio -Se añadieron 0,04 g de dihidroetidio a 20 ml de acetonitrilo. Esto proporcionó 20 ml de solución madre de HE (2 mg/ml), que se almacenó en viales de alícuota pequeña a -80ºC. A continuación, se añadieron 0,125 ml de solución madre de dihidroetidio (HE) a 24,875 ml de solución de xantina. La solución se sonicó y se calentó hasta que se hizo transparente. Esto proporcionó 25 ml de solución de trabajo de hidroetidina (HE), que se preparó nuevamente a diario.
Solución de trabajo de superóxido dismutasa (SOD). Se reconstituyeron treinta mil unidades de SOD (Sigma) en diez ml de solución de tampón. La solución se dividió en pequeñas alícuotas (0,4 ml de solución madre por vial) y se mantuvo a -20ºC. Esto proporcionó 3.000 unidades, que se diluyeron a 30 unidades para su uso (véase más adelante). Se añadieron 200 ìl de solución madre de SOD de 3.000 a 19,8 ml de tampón de O2- para proporcionar 20 ml de solución de trabajo de SOD de 30 unidades.
Control. La solución madre era solución madre de tetracloruro 5,10,15,20 de manganeso (III) 1144 μM que se almacenó a -80ºC. Para preparar la solución de trabajo, la solución madre se diluyó 100 veces con tampón de O2- y se agitó con vórtex. Tomando 9,9 ml de tampón de O2-y añadiendo 100 ìl de solución madre de manganeso, 10 ml de solución de trabajo de manganeso 11,44 ìM, que se colocaron en los pocillos G1 y G12 como controles.
Procedimientos de ensayo
El ensayo se llevó a cabo en un sistema de manejo de líquidos Precision 2000 con una microplaca de 96 pocillos usando el protocolo siguiente:
•
En la placa uno (polipropileno) se añadieron 200 μl de muestras a los pocillos B1, C1, E1, F1 y B12, C12, E12, F12.
•
Se añadieron 200 ìl de solución de trabajo de SOD a los pocillos D1 y D12.
•
Se añadieron 200 ìl de tampón de O2- a los pocillos A1, H1, A12 y H12.
•
Se añadieron 200 ìl de solución de trabajo de manganeso a los pocillos G1 y G12.
•
Los reactivos se cargaron en los recipientes sobre la rejilla B del Precision 2000 como sigue: 20 ml de tampón de O2-B1 20 ml de HE en B2 20 ml de xantina oxidasa en B4
•
Se llevó acabo una dilución x2 (CAROx2) en un Precision 2000. Se llevó a cabo una dilución de modo que todas las muestras, el estándar y el blanco se diluyeron 2, 4, 8, 16 y 32 veces.
•
Se transfirieron 25 ìl de las soluciones de cada pocillo a una placa de reacción (poliestireno, 320 μl) seguido por la adición de 150 ìl de solución de trabajo de HE.
•
Se incubó la placa de lectura durante 20 min a 37ºC.
•
Después de la incubación, se añadió xantina oxidasa ejecutando el programa de adición de AAPH (B4). Esto permite la adición de 25 ìl de solución de trabajo de xantina oxidasa a todos los pocillos de la placa n.º 2.
•
Después de la adición de xantina oxidasa, se colocó la placa en el lector de placas.
•
La placa y la fluorescencia se leyeron cada minuto durante diez minutos con filtro de excitación a 485 ± 25 nm y filtro de emisión a 590 ± 30 nm. Las lecturas se refirieron al pocillo inferior de D1, fijado arbitrariamente a 5000 unidades. En el diseño esquemático de la placa dos (poliestireno) cada pocillo contiene 150 μl de solución de trabajo de HE, 25 μl de muestra y 25 μl de xantina oxidasa (añadida tras 30 de precalentamiento).
C.
Procesamiento de datos
A partir de los datos sin procesar, se obtuvo una curva lineal y se calcularon las pendientes de las curvas por medio del programa KC-4 usado para controlar el lector de placas. Las pendientes se exportaron y se ejecutaron cálculos adicionales mediante el programa informático Microsoft Excel.
Cinética química simplificada
El O2- se generó continuamente mediante la siguiente reacción catalizada por la xantina oxidasa. La velocidad de producción de superóxido fue constante y de pseudo orden cero con respecto a la xantina, que estaba en gran exceso en comparación con la xantina oxidasa.
xantina + O2 - ácido úrico + O2-(1)
El superóxido formado se hizo reaccionar con HE o se eliminó con superóxido dismutasa.
HE + O2- - HE oxidado (2)
2 O2-- O2 + H2O2 (3)
O2- + Muestra - P (4)
Suponiendo una concentración de estado estacionario para el O2-, el incremento de las tasas de fluorescencia en ausencia (Vo) y presencia (V) de eliminador de O2- (SOD) tienen la relación siguiente:
Vo/V = 1+ k3[SOD]/(k2.[HE]) (5)
La gráfica de Vo/V frente a [SOD] dará una curva lineal con intercepción en (0,1) y pendiente de k3/k2[HE]. Para una muestra desconocida, la proporción entre las pendientes de lo desconocido y el estándar fue:
{k3/[HE]}/{ks/k2[HE]} = k3 / ks (6)
La ecuación (5) daría la actividad SOD relativa de una muestra con unidades de medida de equivalentes en unidades de SOD por gramo o por litro de la muestra, dependiendo de las concentraciones usadas al representar gráficamente la curva de Vo/V frente a la concentración de una muestra.
II.
ENSAYOS DE CICLOOXIGENASA
A.
Introducción
La inflamación es la respuesta de nuestro sistema inmunitario frente a la intrusiones por patógenos tales como virus y microbios, así como por agresiones químicas o físicas/*- . La inflamación, en ocasiones dolorosa, es normalmente una respuesta curativa. Pero en algunos casos la inflamación progresa a un estado crónico, asociado con enfermedades debilitantes tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple o incluso cáncer. La investigación en biología experimental y de sistemas ha aclarado los procesos de inflamación complejos. Una forma, entre muchos otras, de mantener la inflamación controlada es inhibir la actividad de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) que se asocia directamente con la inflamación. También se descubrió que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) son excelentes inhibidores de COX. Las acciones beneficiosas de los AINE pueden asociarse con la inhibición de COX-2, mientras que sus efectos secundarios dañinos (el más común es la toxicidad gastrointestinal) se asocian con la inhibición de COX-1. Estos inhibidores de COX sintéticos incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno y celecoxib (celebrexTM). Más esfuerzos en investigación han ido descubriendo inhibidores de COX-2 más selectivos y activos como una nueva generación de AINE.
Históricamente, se han utilizado remedios con plantas medicinales para la inflamación durante miles de años. De hecho, lo que Celso definió aproximadamente el el año 40 a.C. como 'rubor, calor, dolor, tumor' (enrojecimiento, calor, dolor y edema) son, en la actualidad, los síntomas de la inflamación. Recientemente se ha estudiado el mecanismo de acción de los extractos botánicos a nivel de biología molecular usando un ensayo inhibidor de COX-1 y COX-2 como guía para el aislamiento de componentes eficaces a partir de mezclas de plantas medicinales. Este enfoque también permite una mejor evaluación y optimización de la eficacia de los complementos de plantas medicinales analgésicos y antiinflamatorios en la industria nutricéutica. Para satisfacer la necesidad industrial de medir la capacidad de inhibición de COX de muestras de origen botánico, se adoptó un ensayo in vitro de selección de inhibidores de COX-1 y COX-2, con modificaciones que mejoran la eficacia y reducen el coste. En el presente documento se describen los detalles del ensayo de actividad inhibidora de COX-1 y COX-2 que es aplicable a productos botánicos.
B Principio del ensayo
Tanto COX-1 como COX-2 catalizan la oxigenación del ácido araquidónico para formar prostaglandinas (FIG. 1). La actividad enzimática puede medirse mediante las velocidades de consumo de oxígeno. De hecho, la unidad de actividad de la enzima se define como "una unidad de enzima consume un nmol de oxígeno por minuto a 37ºC en tampón Tris-HCl 0,1 M a pH 8,0, que contiene ácido araquidónico 100 mM, EDTA 5 mM, fenol 2 mM y hematina 1 mM". La concentración de oxígeno se monitoriza en tiempo real por medio de un Oxytherm (FIG. 2), un sistema de medida de la concentración de oxígeno, adquirido de Hansatech. La velocidad de consumo de oxígeno inicial se obtiene a partir de la curva cinética. En presencia de inhibidores, la velocidad inicial disminuye. La CI50, la concentración a la que la velocidad de consumo de oxígeno inicial disminuye en un 50%, se usa para expresar la actividad de inhibición de COX-1 y 2. La selectividad se expresa como las proporciones de CI50 para COX-1 y COX-2. Normalmente, las muestras se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO), etanol o agua.
C. Detalles experimentales
(1) Condiciones de ensayo:
Instrumentos:
Oxytherm
Tampón:
Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, con EDTA 5 mM, fenol 2 mM y hemo 1 mM
Temperatura:
37ºC
[O2] inicial:
212 mM
Volumen de enzima:
5 ml (o ~100 unidades)
Volumen total:
0,5 ml
Volumen de muestra:
5 ml
Sustrato:
5 ìl de ácido araquidónico (Conc. 10 mM en una solución de NaOH 0,01 M)
Hemo: 5 ml (conc. final 1 mM)
Velocidad de registro de datos: 5 lecturas por segundo
(2) Procedimientos experimentales:
Se añadió medio ml de tampón Tris (incubado en horno a 37ºC) a la cámara de reacción seguido de 5 ml de hemo 100 mM en DMSO. A la solución, se le añadieron 5 ml de solución de enzima COX-1 (o 10 ml de COX-2) (usada como se recibió del proveedor). La mezcla se agitó durante un minuto. Se añadieron cinco ml de muestra (DMSO o etanol) y se incubaron durante un minuto. Se añadieron cinco ml de ácido araquidónico y se monitorizó la velocidad de reacción. Se obtuvo la velocidad inicial a partir de la pendiente de las curvas cinéticas.
Extracción y disolución de las muestras: Las muestras sólidas se extrajeron usando dimetilsulfóxido (DMSO), etanol, acetona al 50% en agua o agua, dependiendo de su solubilidad. Las muestras líquidas de base acuosa se probaron directamente o se diluyeron con agua en caso necesario. Las muestras de base oleosa se disolvieron en DMSO o etanol para su análisis.
Control de calidad:
Con el fin de garantizar la validez de los datos y el funcionamiento normal del sistema Oxytherm, se aplicaron varias medidas de control de calidad.
(1)
El inhibidor de COX-1 y 2 conocido indometacina se usó como muestra de control de calidad. La indometacina tiene una CI50 de 0,1 mM para COX-1 y de 6,0 mM para COX-2. La CI50 de la indometacina se midió para cada lote de enzima. Con un funcionamiento adecuado, el sistema Oxytherm debería dar una CI50 de la indometacina dentro del 20% del valor normal para ambas enzimas.
(2)
Cada solución de muestra se prueba por duplicado o triplicado para obtener un valor promedio de la CI50.
(3)
Se efectuó un blanco (100% de actividad) entre cada cinco soluciones de muestra para garantizar la reproducibilidad.
CI50: La concentración de una muestra cuando el 50% de la actividad enzimática está inhibida. Una CI50 más baja significa una actividad más alta. Proporción de CI50: Esta cifra indica la selectividad de la muestra en la inhibición de enzimas COX. Cuando la proporción es uno, no existe selectividad. Si la proporción es menor de uno, la muestra inhibe COX-1 mejor que COX-2. Si la proporción es mayor de uno, la muestra inhibe mejor COX-2. La desviación estándar es de aproximadamente el 20%.
D. Referencias:
1.
Nathan, Nature 2002, 420: 846-52.
2.
Tracey, Nature 2002, 420: 853-59.
3.
Couzer y Mamett, Chemical Rev. 2003, ASAP.
4.
Wu et al., J. Agri. Food Chem., 2002, 50: 701-05.
5.
Smith y Marnett, Biochim, Biophys. Acta 1991, 1083, 1-17.
6.
Johnson et al., Arch. Biochem. Biophys. 1995, 324: 26-34.
7.
Kulmacz y Lands W.E.M. Requirements for hydroperoxide by the cyclooxygenase and peroxidase activities of prostaglandin H synthase. Prostaglandins 1983, 25, 531-40.
III. EL POTENCIAL DE ELIMINACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO DE POLVOS DE ASAÍ Y JUSARÁ LIOFILIZADA
Se midieron los potenciales de eliminación de anión superóxido de polvo de asaí liofilizado y polvo de jusará liofilizada como se detalla anteriormente (Brunswick Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA). La superóxido dismutasa (SOD) de una fuente natural más estudiada es la SOD de brote de trigo. La actividad SOD para los brotes de trigo es de 160 a 500 unidades de base por gramo. Por comparación, los polvos de asaí liofilizado y de jusará liofilizada presentaron una capacidad de eliminación de superóxido sustancialmente alta, como se resume a continuación en la tabla 25.
Tabla 25
Muestra
SOD (unidad/g) * Inhibición de COX (mg/g) **
Asaí
1.614 19
Jusará
6.657 60
* El resultado se expresa como equivalentes en unidades de SOD por gramo ** El resultado se expresa como equivalentes en mg de Aspirina por gramo
La actividad ciclooxigenasa (COX) (COX tipo 1, es decir, COX I; y COX tipo 2, es decir, COX II) se midió en presencia
5 y ausencia de polvo de asaí liofilizado y de polvo de jusará liofilizada (Brunswick Lab ID. Brunswick Laboratories, Wareham, MA) como se detalla anteriormente. Como se resume en la tabla 25 (anteriormente) y en la tabla 26 (a continuación), el polvo de asaí liofilizado y el polvo de jusará liofilizada inhibieron la enzima COX. Como se muestra en la tabla 26, el polvo de asaí liofilizado y el polvo de jusará liofilizada inhibieron ambas isoenzimas, COX I y COX II. Por lo tanto, el polvo de asaí liofilizado y el polvo de jusará liofilizada son eficaces en la prevención y el tratamiento de
10 enfermedades inflamatorias asociadas con la actividad de COX I y COX II, por ejemplo, la artritis.
Tabla 26
Muestra
COX I (mg/ml) COX II (mg/ml)
Asaí
6,96 12,50
Jusará
2,20 10,92
* Los resultados se expresan como CI50 (concentración de inhibición del 50% de la actividad enzimática)
Ejemplo 29 Análisis comparativo del potencial antioxidante de frutos y hortalizas mediante análisis de CAROHO
15 La FIG. 21 muestra la actividad antioxidante de frutos y hortalizas determinada mediante la técnica de análisis de CARO (Brunswick Laboratories, Wareham, MA; como se detalla anteriormente). El análisis de CAROFL, utilizando flouresceína como la sonda flourescente, proporcionó una medida de la capacidad de eliminación de los antioxidantes contra el radical peroxilo, que es una de las especies reactivas de oxígeno (ERO) más comunes encontradas en el organismo. La CAROhidro refleja la capacidad antioxidante soluble en agua. El Trolox, un análogo hidrosoluble de la
20 vitamina E, se usó como el estándar de calibración y el resultado de CARO se expresa como equivalentes en micromoles de Trolox (ET) por gramo. Los resultados de CAROH de la FIG. 21 se expresa como equivalentes en micromoles de ácido gálico por gramo.
Ejemplo 30 Preparación de zumo de asaí
La FIG. 22 es un diagrama de flujo que detalla la preparación de zumo de asaí, incluido el lavado de los frutos y su
25 pasteurización. Una mejor conservación de los frutos y del zumo permitirá el consumo del alimento al mismo tiempo que conservará su valor nutricional y facilitará la organización de su comercialización entre cosechas. Las etapas de preparación y procesamiento del zumo de asaí se muestran en la FIG. 22.
El pelado del fruto puede hacerse de varias formas diferentes y las condiciones de ablandamiento cambian de un productor a otro.
30 I. OPTIMIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE PULPA -ABLANDAMIENTO Y PELADO MECÁNICO.
El pelado del fruto puede realizarse de diferentes maneras, cada productor tiene su propia forma de procesar el asaí (temperatura y tiempo de ablandamiento, cantidad de agua por kg de frutos, tiempo que permanece el fruto en la máquina). Fue necesario optimizar y sistematizar el procedimiento de extracción de pulpa con el fin de mantener la
35 reproducibilidad entre las experiencias de los inventores y garantizar una buena producción.
El pelado del fruto de asaí tiene lugar, casi siempre, en un pelador mecánico con eje vertical, elaborado y usado específicamente para el fruto de asaí. En la FIG. 23 se muestra una imagen de una máquina peladora mecánica representativa. Se diseñó para procesar 2 kg de asaí de cada vez, para minimizar la cantidad de frutos en cada procesamiento.
40 El tiempo y temperatura del agua para empapar el fruto varían de un fabricante a otro. El fruto puede empaparse en
agua corriente a temperatura ambiente durante varias horas antes de batirlo o puede ablandarse en agua templada durante un periodo de tiempo corto (10-20 minutos).
En el laboratorio, se probaron varios tiempos de reblandecimiento (0, 5, 10, 15, 20, 30 minutos) y temperaturas del agua de empapado (30, 40, 45, 50 y 60ºC). Aunque los resultados indican que no se produjeron diferencias significativas entre las diferentes condiciones de ablandamiento, se observó un mayor rendimiento cuando el asaí se ablandó en agua a 45ºC durante 20 minutos.
El tiempo total de pelado, así como la cantidad de agua y la manera en que se usó durante este tiempo, constituyen variables muy importantes para el rendimiento y la densidad del zumo. Se probaron cinco tiempos totales de pelado (variando desde 2:30 hasta 5:00) y para cada uno, se probaron varios tiempos de pelado antes de añadir la primera dosis de agua y varias formas de introducir el agua dentro de la máquina de pelado (el tiempo de goteo del zumo al final del pelado se fijó en 45 segundos). La cantidad total de agua fue de 1 litro por 2 kg de frutos (con el fin de obtener un zumo ideal; no muy fuerte, no muy suave).
A partir de estos estudios, se observó que el tiempo total de pelado y la forma de añadir agua al interior de la máquina peladora tienen un efecto muy significativo en los rendimientos en sustancias secas. A partir de esas experiencias, se estableció el protocolo siguiente para la preparación del zumo:
1.
Pesar 2 kg de materia prima (asaí).
2.
Preparar 5 recipientes con 200 ml de agua cada uno.
3.
Colocar el asaí en la máquina, encenderla en el tiempo 0.
4.
Después de un minuto de pelado, añadir el primer contenedor de 200 ml de agua inmediatamente.
5.
Después de 1 min 30 s; 2 min; 2 min 30 s; y 3 minutos, añadir uno de cada uno de los cuatro recipientes restantes.
6.
Dejarlo gotear durante desde 45 segundos hasta 3 min 45 s.
Se analizó el impacto de reciclaje de parte del zumo. Aunque esta técnica para la preparación del zumo es muy popular, no se observaron diferencias en los rendimiento de sustancias secas.
II. EVOLUCIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS DEL FRUTO DE ASAÍ DESPUÉS DE SU COSECHA.
Cuando se comparan las características y cualidades del asaí en la cosecha y a la mitad de la cosecha, se observaron cambios significativos en las cualidades organolépticas y en las cifras de los indicadores científicos (microbiológicos, su peso, color). Por ejemplo, el asaí de la cosecha vendida en Belm es barato y abundante. Es de buena calidad porque, dado que proviene de lugares cercanos a Belm, no sufre cambios durante el transporte. Por otra parte, entre cosechas, el asaí se produce en cantidades inferiores y sus características organolépticas son inferiores a las del asaí de la época de cosecha y es más caro. El asaí producido entre cosechas proviene de lugares más lejanos (Marañón, isla de Marajó) y se somete a un largo viaje antes de llegar al puerto de Belm. El tiempo entre la cosecha y la venta/consumo del fruto es muy importante (48 horas es prácticamente el tiempo máximo que dura el fruto después de la cosecha a temperatura ambiente).
Se observó un incremento de la carga microbiana en el asaí adquirido entre cosechas en comparación con el de la época de cosecha. Durante la época de cosecha, la carga promedio de microorganismos por gramo en asaí fresco fue de 106 microorganismos por gramo de pulpa seca, lo que supone 10 ml de zumo. Entre cosechas, la carga promedio de microorganismos por gramo se incrementó hasta 109, lo que indica una carga microbiana 1000 veces mayor. En consecuencia, fue necesario determinar si el incremento de contaminación fue provocado principalmente debido a la baja calidad de las palmeras de esas regiones, las malas condiciones de transporte o debido al incremento del tiempo posterior a la cosecha, dando lugar al crecimiento natural de los microorganismos ya presentes en la superficie del fruto. Se estudió la influencia del tiempo transcurrido entre la cosecha y el procesamiento y después se relacionó con el incremento de la carga microbiana.
Se midió la carga microbiana a varios intervalos de tiempo durante un periodo de 30 horas en frutos frescos (tomados 10 h después de la cosecha). Los resultados indican que existía un incremento medible y regular de la carga microbiana original del fruto. La carga microbiana es de aproximadamente 105-106 microorganismos (bacterias, moho y levaduras) por gramo de pulpa seca justo después de la cosecha y después de 40 horas alcanza un valor máximo, ligeramente superior a 109 microorganismos por gramo de pulpa seca. Dado que la carga microbiana observada 40 horas después de la cosecha fue muy similar a la de la mitad de la cosecha, puede concluirse que la variación de la carga microbiana en la época de cosecha y fuera de ella está provocada principalmente por el incremento natural de los microorganismos en la superficie del fruto más que por la baja calidad de las palmeras de esas regiones.
Por lo tanto, el asaí debería usarse justo después de su cosecha, antes del incremento significativo de la carga microbiana, para evitar una alteración de la calidad del producto (no sólo un cambio natural provocado por el
incremento de microorganismos, sino también un cambio provocado por la necesidad de usar el tratamiento térmico radical con el fin de conservar el producto). Sin embargo, a continuación se evalúan procedimientos que reducen la carga microbiana.
III. LIMPIEZA
Se estudió la eficacia de los procedimientos de limpieza en la disminución de la carga microbiana del zumo. Los estudios se realizaron usando el asaí a mitad de la cosecha, lo que significa asaí que tiene un nivel de contaminación considerable. La limpieza del fruto con agua higiénica con una concentración del 0,1% (v/v), antes del procesamiento, permitió reducir la carga microbiana de 2 a 400 veces (en relación con el asaí limpiado con agua potable sin adición de sustancias químicas).
IV. LAVADO
El procedimiento de lavado se considera la etapa principal del procesamiento del zumo de asaí, porque reduce la carga microbiana antes del procesamiento del asaí sin modificar su textura significativamente. En el caso del fruto de asaí, el lavado antes de las etapas de procesamiento se ha descrito como de ayuda para conservar la calidad e integridad del zumo y, por lo tanto, conservar las cualidades organolépticas, de textura y nutricionales del zumo de asaí. (Tournas, 1994).
El lavado consiste en colocar los frutos en agua caliente o hirviendo o vapor durante algún tiempo antes del procesamiento (Cruess, 1995). La elección del tratamiento, dirigido a la disminución de los agentes contaminantes presentes en la superficie del fruto, se explica por la estructura física del fruto. El fruto sólo tiene una capa pequeña de pulpa superficial, un tiempo de contacto corto entre la pulpa y el agua caliente o el vapor da lugar a una eficacia positiva del tratamiento a una temperatura no muy alta o un tiempo no muy prolongado.
Se han realizado estudios, no sólo con asaí de la época de cosecha, sino también con asaí de mitad de cosecha, probando a varias temperaturas diferentes (desde 75ºC hasta 100ºC) y varios tiempos de lavado (desde 5 s hasta 10 min). (Rogez et al., 1996). Los tratamientos tuvieron un impacto significativo en la reducción de la carga bacteriana (bacterias, moho y levaduras). Sin embargo, las condiciones de lavado no fueron eficaces para la inactivación de las peroxidasas, ya que estas enzimas son más resistentes térmicamente. Sólo las temperaturas más altas durante los periodos más prolongados de tiempo de lavado pudieron reducir parcialmente la actividad de las peroxidasas (hasta un 20%). Pero los tratamientos más duros (es decir, temperaturas superiores a 80ºC con tiempos superiores a 10 segundos) provocaron una separación de las sustancias grasas del zumo (aceite amarillento) observadas en la superficie del zumo. Esta modificación de la textura redujo la aceptabilidad del producto por el consumidor, debido a su aspecto.
Dado que las pérdidas de las características organolépticas son mucho mayores con lavado más radical, sin ser capaz de reducir más la carga microbiana, se seleccionaron la temperatura de 80ºC y el tiempo de 10 segundos como las mejores condiciones de lavado para el fruto de asaí.
Ejemplo 31 Procedimientos de preparación de bebida de asaí y estándares para la preparación
I. INSTRUCCIONES DE MEZCLADO
El asaí 14:1 deshidratado requiere 13 partes de agua/líquido por 1 parte de deshidratado en peso. La variedad de posibles bebidas usando asaí es casi ilimitada. A continuación se proporcionan tres ejemplos:
Mezcla 1: Se añadieron veinticinco gramos de polvo de asaí a 325 ml de agua fría. La mezcla se combinó a velocidad media durante al menos 30 segundos para hidratar el polvo adecuadamente. Si la mezcla puede reposar durante un minuto más o menos, mejorará la textura.
Mezcla 2: Se añadieron veinticinco gramos de polvo de asaí a 200 ml de agua y 125 gramos de hielo, se combinó durante 30 segundos. La mezcla se dejó reposar durante un minuto.
Mezcla 3: El uso de 125 ml de leche o nata en lugar de hielo proporciona un delicioso batido.
Debido a que el asaí tiene poco azúcar y vitamina C no hay mucha oxidación/fermentación que evitar. Se recomienda la presencia tanto de azúcar como de vitamina C. El sabor del asaí puro es bastante suave y el color es un marrón muy oscuro. La adición de 1-2 cucharadas de azúcar u otro edulcorante complementa el sabor de forma muy agradable. El color puede hacerse más rojo mediante la adición de vitamina C (un ácido). La adición de colorante alimenticio rojo también creará un aspecto más apetitoso o atractivo. Además, la adición de un plátano a la mezcla, así como el espolvoreado de granola y el aderezo del fruto, también puede proporcionar alternativas creativas para la preparación de bebidas de asaí.
II. EQUIPO:
Mezcladora; balanza de gramos; dispositivo de medida de mililitros
III. ESTÁNDARES DE CALIDAD E IDENTIDAD PARA LA PULPA DE ASAÍ
1. Objetivo
La presente normativa tiene como objetivo el establecimiento de unos estándares mínimos de identidad y calidad que debería cumplir la pulpa integral de asaí y el asaí que se van a usar como bebida. La presente normativa no se aplica 5 a la pulpa de asaí para cualquier otro uso.
2. Definición
La pulpa integral de asaí y el asaí son productos extraídos de la parte comestible del fruto del árbol de asaí (Euterpe oleracea, Mart.) después de haberse ablandado mediante un procedimiento tecnológico adecuado.
3. Clasificación
10 El producto se clasificará de acuerdo con la cantidad de agua/líquido añadido a la pulpa, como sigue:
3.1 La pulpa integral de asaí es la pulpa extraída del asaí sin la adición de agua, por procedimientos mecánicos y sin filtración. Puede someterse a un procedimiento de conservación físico.
3.2 Asaí espeso o especial (tipo A) es la pulpa extraída con la adición de agua, que presenta más del 14% de sólidos totales y un aspecto muy denso.
15 3.3 Asaí medio o normal (tipo B) es la pulpa extraída con la adición de agua, que presenta más del 11% y hasta el 14% de sólidos totales y un aspecto denso.
3.4
Asaí fino o popular (tipo C) es la pulpa extraída con la adición de agua, que presenta más del 8% y hasta el 11% de sólidos totales y un aspecto no denso.
4.
Ingredientes básicos
20 La pulpa integral de asaí y el asaí se obtienen a partir de frutos frescos, maduros y sanos, de acuerdo con las especificaciones descritas anteriormente, y sin polvo, parásitos o microorganismos que pueden hacer que el producto sea inapropiado para su consumo.
5. Ingredientes opcionales
5.1 Agua
25 El agua usada para la extracción de pulpa debe ser potable.
5.2 Acidulante
En el caso del asaí pasteurizado mantenido a temperatura ambiente, puede añadirse ácido cítrico de acuerdo con la 'Normativa de Buenas Prácticas de Fabricación' (GMP).
6. Composición
30 6.1 La pulpa integral de asaí y el asaí deben presentar una composición de acuerdo con las características del fruto, sin modificaciones, mezclas con otras especies de frutos o cualquier práctica ilegal.
6.2 La pulpa integral de asaí debe cumplir las siguientes características físicas, químicas y organolépticas:
6.2.1 Físicas y químicas
Tabla 27
Mínimo
Máximo
Sólidos totales (g/100 g)
40,0 60,0
Proteínas (g/100 g)
5,0 -
Lípidos totales (g/100 g)
20,0 -
Hidratos de carbono totales (g/100 g)
51,0 -
Obs: g = gramos de material seco (sólidos totales)
35
6.2.2 Organolépticas
43
Aspecto físico: Pastoso, presenta puntos oscuros que sobresalen de la piel que envuelve el fruto. Color: morado violeta característico para la pulpa de asaí y verde claro para la pulpa de asaí verde. Olor: Característico (véase más adelante).
6.3 El asaí (especial, normal o popular) debe cumplir las siguientes características físicas, químicas y organolépticas:
6.3.1 - Físicas y químicas
Tabla 28
Mínimo
Máximo
pH (g/100 g)
4,00 6,20
Acidez total, de ácido cítrico (g/100 g)
- 0,27 (popular)
0,35 (normal)
0,45 (especial)
Lípidos totales
20,0 60,00
Proteínas (g/100,00 g)
8,0 -
Azúcares totales (g/100 g)
- 40,0
Obs: g = gramos de material seco (sólidos totales)
6.3.2 Organolépticas
10 Aspecto físico: La emulsión debe permanecer estable incluso si se calienta hasta 80ºC.
Color: morado violeta característico para la pulpa de asaí y verde claro para la pulpa de asaí verde.
Olor: Característico (véase más adelante).
6.4 La pulpa integral de asaí y el asaí pueden contener partes no comestibles del fruto dentro de los límites que no cambian las características de calidad y organolépticas del producto. La pulpa integral de asaí y el asaí deben cumplir
15 todas las demás características físicas, químicas, microscópicas, microbiológicas y organolépticas fijadas en los estándares de calidad para la pulpa de fruto en general.
6.5 El límite máximo de la suma de mohos y levaduras en la pulpa integral de asaí y en el asaí es de 5 x 103
7 Aditivos
La pulpa integral de asaí y el asaí destinados al consumo directo en envases de 1 kg como máximo deben mantenerse
20 a lo largo del procedimiento físico, estando prohibido el uso de conservantes químicos o sustancias colorantes, excepto la coloración obtenida a partir del fruto de asaí.
Ejemplo 32 Preparación de asaí liofilizado
En la FIG. 24 se detalla un procedimiento para preparar polvo de asaí liofilizado. Como se muestra, se cosecharon los frutos de asaí y se retiraron los huesos. Después se retiró la pulpa y se congeló. Se liofilizó la pulpa de muchos frutos 25 de asaí para proporcionar un polvo liofilizado. El polvo de asaí liofilizado era estable en comparación con las preparaciones no procesadas de la pulpa de fruto de asaí, que se degradaban rápidamente en horas, lo que les daba un sabor desagradable. La adición de ácido cítrico a la pulpa de asaí durante el procesamiento y antes de la congelación fue útil en la estabilización adicional de la preparación de pulpa de fruto. El ácido cítrico puede usarse para estabilizar otras preparaciones de pulpa de fruto, por ejemplo, jusará, procesados por los procedimientos de la
30 presente invención.
La producción de asaí es una secuencia de acontecimientos particularmente implacable debido a las enzimas y a una carga proporcionalmente alta de agentes fermentadores en la piel del fruto en comparación con la cantidad de pulpa retirada del fruto. Por esta razón, la producción de asaí se limitaba tradicionalmente al consumo local e inmediato.
La pulpa de fruto de asaí congelada deben mantenerse a una temperatura de -5ºC o menos. A temperaturas
35 superiores, las enzimas y los agentes de fermentación se activan y cambian las características de la pulpa de fruto. Un efecto es la creación de compuestos insolubles, la arena mencionada anteriormente, que resulta evidente con este
último lote. Estos compuestos insolubles se encontraron en los primeros lotes de asaí deshidratado (de dos procesadores) y se descubrió que los provocaba la descongelación de la pulpa durante la preparación para la deshidratación. Este problema se resolvió no permitiendo que la pulpa de fruto de asaí congelada se predescongelara antes de la deshidratación por liofilización. Esto es, una vez que la pulpa de fruto de asaí se congela, no puede 5 permitirse que se descongele a una temperatura superior a aproximadamente -5ºC antes de la deshidratación por liofilización. La pulpa de fruto de asaí preparada sin predescongelación antes de la deshidratación proporcionó un polvo de asaí liofilizado granulado que se rehidrató de forma muy satisfactoria y mantuvo la calidad del color, la textura y el sabor. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un suplemento dietético a base de fruto en el que la pulpa de fruto se prepara mediante un procedimiento en el que, una vez que la pulpa se
10 aísla y se congela, no se permite que se predescongele antes de la deshidratación. Este procedimiento es útil en la preparación de polvos de fruto liofilizado de muchos frutos, por ejemplo, pero sin limitarse a, fruto de asaí y fruto de jusará, que puede rehidratarse y mantienen la calidad del color, la textura y el sabor.
El polvo de fruto liofilizado granulado se almacenó protegido de la luz en una bolsa forrada de plástico hasta su uso.
Ejemplo 33 Pruebas de exposición de la preparación de asaí liofilizado para evaluar su estabilidad frente a 15 microbios seleccionados
I. OBJETIVO
El objetivo de este estudio era realizar una prueba de exposición preliminar para evaluar la estabilidad microbiológica de un producto al exponerlo a una cepa de cada uno de levadura, moho, bacterias de ácido láctico, Salmonella y Staphylococcus aureus. (Silliker Laboratories Research Center, South Holland, IL).
20 II. APLICACIONES
Este estudio ofrece el análisis de un producto para evaluar organismos y dos patógenos potencialmente causantes de deterioro. Es adecuado recopilar datos iniciales acerca de un producto y/o comparar una serie de formulaciones de producto durante el desarrollo.
III. LIMITACIONES
25 Con sólo una cada de cada organismo de exposición, existe la posibilidad de que el producto sea resistente al crecimiento por esa cepa pero sensible a otras cepas. En los organismos de exposición que crecen en el producto de control, no se determinará hasta el final del estudio. Este estudio está limitado por intervalos de tiempo, temperaturas de almacenamiento y el alcance del informe. El estudio no predice los resultados más allá de 4 semanas.
IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
30 A. Producto de prueba
Se recibió del cliente una bolsa de 3,5 kg metálica de producto que podía volver a cerrarse con la etiqueta "fruto de asaí-liofilizado". El producto se almacenó a temperatura ambiente hasta el inicio del estudio.
B. Organismos expuestos
El producto se expuso a cepas liofilizadas de Aspergillus niger (moho), Zygosaccharomyces bailii (levadura),
35 Lactobacillus fructivorans (bacteria de ácido láctico), Salmonella typhimurium y Staphylococcus aureus de la Silliker Research Culture Collection (SRCC) como se resume en la tabla 29. El número de células o esporas viables se comprobó mediante procedimientos de recuento en placa.
Tabla 29
Organismo
Número SRCC
Aspergillus niger
1131
Zygosaccharomyces bailii
764
Lactobacilus fructivorans
464
Salmonella typhimurium
449
Staphylococcus aureus
713
40 C. Preparación de muestras de prueba y almacenamiento El producto se dividió de forma aséptica en 6 recipientes estériles en porciones de 100 gramos. Una porción sirvió 45
como control negativo. Las otras porciones se inocularon con uno de los cultivos a aproximadamente 10.000 unidades formadoras de colonias por gramo. Después de la inoculación, las muestras se mezclaron a fondo y se almacenaron a 75ºF (23,88ºC).
D. Análisis de muestras
5 La porción de control inoculada se analizó para evaluar los organismos de exposición en los días 0 y 28. Las porciones inoculadas se analizaron en los días 0, 7, 14, 21 y 28. Se tomó una sola muestra de 11 gramos de cada porción en cada intervalo y se analizó mediante procedimientos de recuento en placa para evaluar los organismos de exposición.
V. RESULTADOS Y ANÁLISIS
La estabilidad microbiológica en un producto alimenticio puede determinarse exponiéndolo a microorganismos que
10 provocan su deterioro y patógenos. Cuando el nivel de los organismos de exposición no se incrementa durante el almacenamiento, la formulación de producto es resistente al crecimiento microbiano y se considera microbiológicamente estable.
Los resultados se muestran en la tabla 30 y la tabla 31. Como muestran los datos, los recuentos de levaduras, moho, bacterias de ácido láctico, Salmonella y Staphylococcus aureus no se incrementaron ni en el control ni en las porciones
15 inoculadas del producto durante su almacenamiento. Por tanto, el producto de asaí liofilizado fue microbiológicamente estable durante al menos 28 días al exponerlo a levaduras, moho, bacterias de ácido láctico, Salmonella y Staphylococcus aureus y almacenarlo a 75ºF (23,88ºC). Como se muestra a continuación, este producto fue estable frente a la exposición.

Tabla 30. Muestras de control no inoculadas de fruto de asaí liofilizado
Intervalo
Levadura (ufc/g) Moho (ufc/g) Bacterias de ácido láctico (ufc/g) Salmonela (ufc/g) Estafilococo (ufc/g)
Día 0
20 <10 20 <10 <10
Día 28
10 <10 20 <10 <10
ufc/g = unidades formadoras de colonias por gramo
Tabla 31. Muestras inoculadas de fruto de asaí liofilizado
Intervalo
Levadura (ufc/g) Moho (ufc/g) Bacterias de ácido láctico (ufc/g) Salmonela (ufc/g) Estafilococo (ufc/g)
Día 0
470 44.000 3.400 190 44,000
Día 7
180 50.000 2.800 80 100
Día 14
10 10.000 580 170 50
Día 21
20 27.000 800 30 <10
Día 28
30 4.700 230 10 <10
ufc/g = unidades formadoras de colonias por gramo
VI. ESTUDIOS DE VIDA ÚTIL EN ASAÍ LIOFILIZADO
Los estudios de vida útil en preparaciones de asaí liofilizado fueron realizados por Silliker Laboratories como se 25 resume en la tabla 32 a continuación.

Tabla 32. Resultados de vida útil
Mes
Recuento en placa aerobio(UFC/g) Levadura (UFC/g) MOHO (UFC/g) BACTERIAS DE ÁCIDO LÁCTICO (UFC/g)
0
- 20 <10 20
1
- 10 <10 20
2
1.500 30 40 10
3
50 <10 <10 10
4
750 <10 <10 <10
5
500 <10 <10 180
6
660 <10 <10 180
7
1.200 <10 <10 <10
8
360 <10 <10 <10
9
<10 <10 10 <10
10
<10 <10 10 <10
11
<10 <10 <10 <10
12
<10 <10 <10 <10
UFC/g = unidades formadoras de colonias por gramo
El sabor, olor y aspecto de un alimento (cualidades organolépticas) son los criterios fundamentales usados por los consumidores para juzgar la aceptabilidad de un alimento. Estas cualidades comienzan a cambiar a medida que la flora microscópica del alimento (bacterias, levadura y moho) crecen y metabolizan los nutrientes disponibles. En general, los cambios organolépticos no son detectables hasta que la población microbiana es alta. El número de
5 organismos necesarios para provocar el deterioro varía con el artículo alimenticio y el/los tipo(s) de microorganismos que crecen en él. En general, sin embargo, el fin del periodo de validez limita la duración del almacenamiento. Por lo tanto, el periodo de validez del producto de fruto de asaí liofilizado fue de al menos 12 meses almacenado a 75ºF (23,88ºC).
Ejemplo 34 Estudio de la toxicidad oral aguda de la pulpa de fruto de asaí liofilizada con un periodo de 10 observación de 14 días posterior al tratamiento en ratas (prueba límite)
Se realizaron estudios para evaluar la toxicidad oral aguda de la pulpa de fruto de asaí liofilizada con un periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en ratas (prueba límite) ((Código del estudio: PCDL-0221; Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd., 9. Mexik6i Street Budapest, H-1149).
I. INFORMACIÓN GENERAL:
15 A. Dosis
Una única dosis límite oral de 2.000 mg/kg de peso corporal de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' (número de lote: 22.10) se aplicó a ratas por vía oral mediante sonda. Se observó a los animales para evaluar la mortalidad y síntomas tóxicos durante 14 días. Se llevó a cabo un examen patológico general en el 15º día. El peso corporal de los animales se correspondió con su especie y edad a lo largo del estudio. No se produjo ninguna muerte después de la
20 administración oral de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' a una dosis de 2.000 mg/kg. No se observaron síntomas clínicos tóxicos. La autopsia programada llevada a cabo en el día 15 no reveló cambios patológicos generales tóxicos. Se concluyó que no se observaron efectos adversos a una única dosis oral de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' en las ratas macho y hembra.
B. Objetivo
25 Desarrollar datos sobre los posibles efectos toxicológicos de la administración de una única dosis oral de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' en ratas. Se espera que el artículo de prueba se use como suplemento dietético.
C. Tipo de estudio
Estudio toxicológico preclínico en cumplimiento con los principios de la normativa de buenas prácticas de laboratorio para estudios de laboratorio no clínicos de la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos y la ley
30 húngara de 1998: XXVIII, que regula la protección de los animales. Prueba límite.
D. Desviaciones del protocolo del estudio
i. Características de la sustancia T 61 usada para el exterminio. Fabricante
Protocolo original: Hoechst Veterinãr GmbH
Informe final: Intervet International
35 Motivo: Se ha cambiado el nombre del fabricante.
ii. Mortalidad
Protocolo original: Se realizan observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de entonces.
Informe final: Se realizaron observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de 5 entonces al principio y al final del día de trabajo, así como una vez los fines de semana, hasta la mañana del 15º día.
Motivo: Se han descrito los procedimientos con más precisión que originalmente
iii. Estado general, aspecto externo, comportamiento y síntomas clínicos
Protocolo original: Durante el periodo posterior al tratamiento, se revisan los animales dos veces al día hasta la mañana del 15º día.
10 Informe final: Durante el periodo posterior al tratamiento, se revisaron los animales dos veces al día hasta la mañana del 15º día, excepto los fines de semana, cuando los animales se revisaron una vez.
Motivo: Se han descrito los procedimientos con más precisión que originalmente
II.
ARTÍCULOS DE PRUEBA Y DE REFERENCIA
A.
Características del artículo de prueba
15 Las características del artículo de prueba se detallan a continuación en la tabla 33. Tabla 33
Nombre del artículo:
Pulpa de fruto de asaí - liofilizada
Nombre botánico:
Euterpe oleracea, Familia: Palmae
Parte de planta usada:
Pulpa de fruto fresco congelada
Fabricante:
Greater Continents do Brasil Ltda. Rua Alabastro, 55-112, Aclimacão 01531-010 São Paulo, SP Brasil
N.º de lote:
22.10
Número de identificación del PCDL:
2002/22885
Rehidratación:
1:13 agua
Humedad residual:
máx. 3%, resultado: 1%
Características físicas:
polvo liofilizado granulado morado oscuro con olor y sabor característico, higroscópico
Condiciones de almacenamiento:
refrigerado de acuerdo con la USP (2-8ºC, humedad no controlada), volver a cerrar rápidamente si se abre.
B. Análisis microbiológico
Se llevó a cabo una prueba límite microbiológica de acuerdo con la USP por el Departamento de Microbiología del PCDL.
20 C. Características del artículo usado para suspender el artículo de prueba
i. Metilcelulosa
La metilcelulosa (N.º de lote 127H1066; Caducidad 02/2003) se obtuvo comercialmente de Sigma y se almacenó a temperatura ambiente antes de su uso.
ii. Agua destilada
25 El agua destilada (N.º de lote A0010102; Caducidad 03/2003) se obtuvo comercialmente del PCDL y se almacenó a temperatura ambiente antes de su uso.
iii. Características del artículo usado para la sobreanestesia antes de la autopsia
El T 61 (N.º de lote 09W008; Caducidad 05/2006) que contenía 0,2 g de embutramida, 0,0005 g de clorhidrato de tetracaína y 0,05 g de yoduro de mebezonio por ml se obtuvo comercialmente de Intervet International y se almacenó
a temperatura ambiente en una caja segura para fármacos tóxicos antes de su uso.
iv. Formulación del artículo de prueba
Se pesó la cantidad necesaria de artículo de prueba y se suspendió en una solución que contenía metilcelulosa al 1% no antes de 30 min antes de su administración. Se preparó la siguiente suspensión: Dosis nominal 2.000 mg/kg: 5,0 g 5 de pulpa de fruto de asaí y 50 ml de solución de metilcelulosa al 1%. La suspensión se agitó durante el tratamiento con un agitador magnético Radelkis de tipo OP-951.
v. Control de la concentración del artículo de prueba formulado
Se tomaron muestras de la sustancia de prueba formulada para comprobar la concentración y la homogeneidad. La comprobación de la concentración y la homogeneidad se realizó mediante gravimetría. Las concentraciones de las tres
10 muestras medidas por triplicado en la parte superior, intermedia e inferior de la suspensión (comprobación de la homogeneidad) estaban dentro de los límites aceptables de ± 10%, es decir, superior: +4,4 ± 4,6%, intermedia: +4,0 ± 4,8%, inferior: +5,4 ± 2,8%.
III.
SISTEMA DE PRUEBA
A.
Animales
15 En los presentes estudios se usaron ratas Sprague Dawley, Crl: CD BR (6-7 semanas de edad a su llegada). Los machos presentaban pesos corporales que variaban desde 143,9 hasta 159,4 g. Las hembras presentaban pesos corporales que variaban desde 140,5 hasta 161,4 g. Un conjunto de animales encargados: 30 (15 machos, 15 hembras). Número de animales que intervinieron en el estudio: Se obtuvieron comercialmente 20 ratas (10 machos, 10 hembras) de Charles River Hungary Ltd. Los animales estaban LPE a su llegada y se alojaron en un entorno
20 convencional durante el estudio. La rata se usa comúnmente para estudios toxicológicos de acuerdo con las recomendaciones internacionales. La cepa Sprague Dawley es un modelo de laboratorio bien conocido con suficientes datos históricos.
Los animales se identificaron mediante la técnica de numeración en la oreja y se alojaron en jaulas de cinco del mismo sexo. Las jaulas se etiquetaron con etiquetas que indicaban los números de ID de las ratas, el código del estudio, la
25 identificación del grupo, la vía de administración, el sexo y las fechas de inicio y de final del periodo de experimentación.
Las condiciones de alojamiento de los animales se resumen a continuación en la tabla 34. Las condiciones ambientales se resumen a continuación en la tabla 35.

Tabla 34 Condiciones de alojamiento de los animales
Nivel higiénico:
convencional
Tipo de jaulas para animales:
de macrolona de tipo II
Tamaño de la jaula: altura x anchura x profundidad:
17,5 cm x 22,5 cm x 37,5 cm
Limpieza:
cambiando el fondo de las jaulas tres veces por semana
Número de animales por jaula:
5
Número de la sala de alojamiento de los animales:
123
Tabla 35 Condiciones ambientales
Intercambio de aire:
aproximadamente 15 veces/hora
Temperatura:
22 ± 3ºC
Humedad relativa:
30-70%
Iluminación:
artificial, ciclos de luz-oscuridad de 12 horas.
La temperatura y la humedad relativa se registraron continuamente. Se dio a los animales acceso libre a la dieta estandarizada para ratas y ratones VRF-1 excepto por el periodo de ayuno durante la noche anterior al tratamiento, durante el tratamiento y durante las dos primeras horas de la observación posterior al tratamiento. La composición de
35 la dieta fue controlada por el fabricante Altromin GmbH, D-4937 Lage/Lippe Lange Str. 42. La dieta se identificó por la fecha de fabricación (30.09.2002), estabilidad: 4 meses. Las ratas tenían acceso libre a agua corriente por medio de bebederos. El agua que beben se controla mensualmente por el Departamento de Microbiología del PCDL. Los animales se observaron durante 5 días antes del tratamiento. En el estudio sólo se usaron animales sanos, sin ningún síntoma clínico.
40 El reparto de los animales en grupos se realizó con una tabla aleatoria generada por ordenador. Los animales se
asignaron aleatoriamente a grupos basándose en su peso corporal, de forma que la distribución de los pesos corporales en los grupos individuales eran similares.
IV. DISEÑO EXPERIMENTAL
Los niveles de dosis y la división en grupos se resumen a continuación en la tabla 36. Tabla 36
Nº de grupo
Tratamiento Dosis Número de animales N.º de identificación
mg/kg
Machos Hembras Machos Hembras
1
Pulpa de fruto de asaí 2.000 10 - 851-860 -
2
Pulpa de fruto de asaí 2.000 - 10 - 861-870
El fundamento para la selección de la dosis es el siguiente. La dosis diaria humana de pulpa de fruto de asaí esperada es de aprox. 1.000 mg al día, lo que corresponde a 14 mg/kg de peso corporal de un adulto (70 kg) o 50 mg/kg para un niño de 4 años (20 kg). La dosis límite de 2.000 mg/kg aplicada en este estudio corresponde a 140 veces la dosis diaria si la consumiera un adulto o 40 veces ésta si se calculan 5 g para el peso corporal de un niño.
10 V. ADMINISTRACIÓN
La aplicación fue oral mediante sonda. La vía de aplicación se seleccionó en cumplimiento de las directrices internacionales. La vía oral es la vía esperada de exposición humana al artículo de prueba. La aplicación del artículo de prueba se administró en una única dosis. El artículo de prueba se administró en un volumen de 20 ml/kg de peso corporal. El periodo de experimentación consistió en 5 días de aclimatación, el día de tratamiento, un periodo de
15 observación de 14 días posterior al tratamiento incluido el día de tratamiento y el 15º día: autopsia.
VI.
OBSERVACIONES, EXÁMENES
A.
Mortalidad
Se realizaron observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de entonces al principio y al final de los día de trabajo, así como una vez los fines de semana, hasta la mañana del 15º día. La hora de
20 la muerte debería haberse registrado con la mayor precisión posible.
B. Estado general, aspecto externo, comportamiento y síntomas clínicos
Se llevó a cabo la observación clínica minuciosa de las ratas una vez antes de la exposición, y después, tras el tratamiento durante 6 horas de forma continua. Durante el periodo subsiguiente, se revisaron los animales dos veces al día hasta la mañana del 15º día, excepto los fines de semana, cuando los animales se revisaron una vez. Los síntomas
25 que debían observarse incluían cambios en la piel, pelaje, ojos y membranas mucosas visibles; aparición de secreciones y excreciones y actividad autónoma (por ejemplo, lagrimeo, piloerección, diarrea, tamaño de la pupila, pauta respiratoria inusual). Además, se registraron cambios potenciales en la marcha, la postura y la respuesta frente a la manipulación, así como la presencia de somnolencia, temblor, movimientos clónicos y tónicos, estereotipos o comportamiento extraño.
30 C. Peso corporal
Los animales se pesaron a su llegada al laboratorio, en el día de la aleatorización, en el día de tratamiento, así como en los días 2º, 8º y 15º del experimento antes de la autopsia.
VII.
AUTOPSIA Y EXAMEN HISTOLÓGICO
A.
Autopsia
35 Todas las ratas que sobrevivieron tras finalizar el periodo de observación posterior al tratamiento se exterminaron por sobreanestesia con T61 y se les realizó la autopsia. Se observaron minuciosamente y se registraron los estados externo e interno. No se realizó el examen microscópico de los órganos.
VIII. EVALUACIÓN, ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los grupos de machos y hembras se evaluaron por separado.
40 A. Valores paramétricos
Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar de los pesos corporales.
B. Valores no paramétricos (mortalidad y síntomas clínicos)
Se tabularon la incidencia de la mortalidad, los síntomas clínicos y los hallazgos generales.
IX. PROCEDIMIENTOS
Los experimentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar del Departamento de Toxicología del Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd.
5 X. PROTECCIÓN DE LOS ANIMALES En aras del bienestar de los animales se evitó el uso innecesario de animales. El director del estudio fue el responsable de ordenar el exterminio cuidadoso de los animales claramente moribundos. El presente procedimiento (prueba límite) usa un número reducido de animales de experimentación en comparación con otras pruebas de toxicidad aguda conocidas y reconocidas.
10 XI. REGISTRO Y ARCHIVO DE DATOS Todos los datos originales se mantienen, como dictan los procedimientos operativos estándar, en formularios
apropiados como sigue: Pesaje del compuesto de prueba Libro de registro del animalario
15 Libros de registro de peso corporal Libros de registro de mortalidad y observaciones clínicas Registros postmortem
Los datos obtenidos en el curso del estudio se recogieron en una carpeta del estudio. El protocolo del estudio, todos los datos generados durante y como consecuencia del estudio, los documentos y toda la información en relación con el 20 estudio, una muestra de control del artículo de prueba y el informe final se almacenarán al menos durante 15 años en los archivos del PCDL y entonces se ofrecerán al patrocinador.
XII.
RESULTADOS
A.
Mortalidad
La mortalidad observada en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resume a continuación en 25 la tabla 37.
Tabla 37
Grupo 1 MACHOS
Grupo 2 HEMBRAS
Tratamiento
Muerte / número de animales
Pulpa de fruto de asaí; 2.000 mg/kg, vía oral
0/10 0/10
La tabla 38 resume los datos de mortalidad individual para sujetos de prueba macho en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 38. Machos
Grupo*Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
851
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
852
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
853
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
854
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
855
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
856
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
857
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
858
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
859
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
860
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: 0 = Sin mortalidad; * Día 1 = Día de tratamiento
La tabla 39 resume los datos de mortalidad individual para sujetos de prueba hembra en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 39. Hembras
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
861
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
862
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
863
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
864
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
865
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
866
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
867
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
868
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
869
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
870
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: 0 = Sin mortalidad; * Día 1 = Día de tratamiento
No se produjo ninguna muerte tras la administración oral única de una dosis de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de asaí
-
liofilizada' a ratas. Todos los machos y hembras sobrevivieron hasta el final del periodo de observación de 14 días.
B.
Síntomas clínicos
Los síntomas clínicos observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 40.
Tabla 40
Grupo 1
Grupo 2
MACHOS
HEMBRAS
Tratamiento
Síntoma / número de animales
Pulpa de fruto de asaí; 2000 mg/kg, vía oral
0/10 0/10
La tabla 41 resume los síntomas clínicos individuales para sujetos de prueba macho en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata 10 (prueba límite).

Tabla 41. Machos
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
851
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
852
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
853
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
854
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
855
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
856
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
857
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
858
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
859
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
860
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: SS = Sin síntomas; * Día 1 = Día de tratamiento
La tabla 42 resume los datos de síntomas clínicos individuales para sujetos de prueba hembra en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 42. Hembras
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
861
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
862
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
863
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
864
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
865
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
866
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
867
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
868
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
869
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
870
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: SS = Sin síntomas; * Día 1 = Día de tratamiento
No se observaron síntomas tóxicos en el día de la aplicación ni durante el periodo de 14 días posterior al tratamiento de observación de los animales tratados.
C. Pesos corporales
Los pesos corporales de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 43.

Tabla 43. MACHOS
Grupo 1
Pesos corporales [g]
Tratamiento *
Día de llegada Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
Tamaño del grupo:
10 10 10 10 10 10
Media:
151,3 198,8 182,2 205,4 260,5 310,0
± D.E.:
5,52 6,60 6,43 7,95 16,10 14,23
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los pesos corporales de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 44.
10 Tabla 44. HEMBRAS
Grupo 1
Pesos corporales [g]
Tratamiento *
Día de llegada Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
Tamaño del grupo:
10 10 10 10 10 10
Media:
148,9 177,6 161,2 180,4 202,6 232,8
± D.E.:
7,08 6,93 5,71 4,25 15,80 7,66
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los cambios en el peso corporal de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 45.

Tabla 45. MACHOS
Grupos
Cambios en el peso corporal [g]
Tratamiento *
Día 1 Días 2-7 Días 8-14
Tamaño del grupo:
10 10 10
Media:
182,2 205,4 260,5
± D.E.:
6,43 7,95 16,10
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral)
Los cambios en el peso corporal de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 46.

Tabla 46. HEMBRAS
Grupos
Cambios en el peso corporal [g]
Tratamiento *
Día 1 Días 2-7 Días 8-14
Tamaño del grupo:
10 10 10
Media:
19,2 22,2 30,2
± D.E.:
3,34 13,00 15,73
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral)
Los pesos corporales individuales de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 47.

Tabla 47. MACHOS
Grupo
Pesos corporales [g]
Código de animal * Grupo 1
Día de llegada Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
851
159,4 207,8 187,8, 214,2 287,2 314,0
852
154,4 205,9 191,1 214,7 264,6 313,1
853
154,3 204,2 186,6 212,3 269,8 319,8
854
153,4 201,3 187,2 211,6 268,6 330,1
855
153,7 200,8 182,7 209,2 268,2 323,2
856
147,4 199,1 177,5 200,0 242,2 308,7
857
156,4 197,8 184,3 203,6 261,4 292,5
858
145,6 192,1 178,1 196,1 265,2 286,4
859
143,9 191,4 175,8 197,4 232,2 316,4
860
144,1 187,8 170,7 194,4 245,2 295,3
Tamaño del grupo:
10 10 10 10 10 10
Media:
151,3 198,8 182,2 205,4 260,5 310,0
± D.E.:
5,52 6,60 6,43 7,95 16,10 14,23
* Grupo 1: Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los pesos corporales individuales de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 48.
Tabla 48. HEMBRAS
Grupo
Pesos corporales [g]
Código de animal * Grupo 1
Día de llegada Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
861
141,0 190,2 170,5 183,1 228,3 237,8
862
142,4 184,5 168,3 187,1 231,5 236,4
863
143,1 181,9 165,6 182,0 210,7 225,9
(continuación)
Grupo
Pesos corporales [g]
Código de animal * Grupo 1
Día de llegada Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
864
149,7 179,9 164,3 184,6 203,1 237,3
865
156,2 177,9 160,6 182,5 193,8 235,7
866
149,7 177,2 156,0 177,5 189,4 227,4
867
154,2 174,3 158,8 174,6 191,1 222,8
868
161,4 171,9 156,5 180,2 191,1 235,8
869
140,9 171,1 158,4 178,4 193,6 222,6
870
140,5 166,8 153,2 174,1 193,2 245,9
Tamaño del grupo:
10 10 10 10 10 10
Media:
148,9 177,6 161,2 180,4 202,6 232,8
± D.E.:
7,08 6,93 4,71 4,25 15,80 7,66
* Grupo 1: Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento

Tabla 49. MACHOS
Los cambios en el peso corporal individual de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 49.
Cambios en el peso corporal [g] **
Código de animal *
Día 1 Días 2-7 Días 8-14
851
26,4 73,0 26,8
852
23,6 49,9 48,5
853
25,7 57,5 50,0
854
24,4 57,0 61,5
855
6,5 59,0 55,0
856
22,5 42,2 66,5
857
19,3 57,8 31,1
858
18,0 69,1 21,2
859
21,6 34,8 84,2
860
23,7 50,8 50,1
Tamaño del grupo:
10 10 10
Media:
23,2 55,1 49,5
± D.E.:
2:88 11,41 19,22
* Grupo 1: Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** Diferencias calculadas a partir de pesos corporales pesados en los días 1 y 2, los días 2 y 8, así como en los días 8 y 15, respectivamente.
Los cambios en el peso corporal individual de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 50.

Tabla 50. HEMBRAS
Cambios en el peso corporal [g] **
Código de animal *
Día 1 Días 2-7 Días 8-14
861
12,6 45,2 9,5
862
18,8 44,4 4,9
863
16,4 28,7 15,2
864
20,3 18,5 34,2
865
21,9 11,3 41,9
866
21,5 11,9 38,0
867
15,8 16,5 31,7
868
23,7 10,9 44,7
869
20,0 15,2 29,0
870
20,9 19,1 52,7
Tamaño del grupo:
10 10 10
Media:
19,2 22,2 30,2
± D.E.:
3,34 13,00 15,73
* Grupo 1: Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** (1) Diferencias calculadas a partir de pesos corporales pesados en los días 1 y 2, los días 2 y 8, así como en los días 8 y 15, respectivamente. (2) El peso corporal y el aumento de peso corporal de los animales se correspondió con su especie y edad a lo largo del estudio.
D. PATOLOGÍA GENERAL
Los hallazgos de patología general para los animales de prueba se resumen en la tabla 51. Tabla 51
Grupo 1 -MACHOS
Grupo 2 - HEMBRAS
Hallazgo de patología general / número de animales
Tratamiento
Externo * Interno ** Externo Interno
Pulpa de fruto de asaí ***
0/10 0/10 0/10 0/10
* Externo: Animal de desarrollo promedio. Piel, pelaje y membranas mucosas están intactos; ** Interno: órganos sin cambios patológicos; *** 2.000 mg/kg, vía oral.
Los hallazgos de patología general para los animales de prueba macho se resumen en la tabla 52. Tabla 52. MACHOS
Grupo
Día 15
Código de animal *
Externo Interno
851
Ningún hallazgo ** Ningún hallazgo
852
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
(continuación)
Grupo
Día 15
Código de animal *
Externo Interno
853
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
854
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
855
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
856
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
857
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
858
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
859
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
860
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); ** "Ningún hallazgo" significa: Externo: Animal de desarrollo promedio. Piel, pelaje y membranas mucosas están intactos; Interno: órganos sin cambios patológicos.
Todos los animales sobrevivieron hasta la autopsia programada, el día 15, y ninguno mostró cambios patológicos tóxicos.
E. Evaluación
5 No se produjo ninguna muerte tras la aplicación oral única de una dosis de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada'. No se produjeron síntomas clínicos tóxicos. La autopsia programada en el día 15 no reveló cambios patológicos generales tóxicos. Se concluyó que no se observaron efectos adversos a una única dosis oral de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de asaí - liofilizada' en las ratas macho y hembra.
Ejemplo 35 Estudio de la toxicidad oral aguda de la pulpa de fruto de jusará 'liofilizada' con un periodo de 10 observación de 14 días posterior al tratamiento en ratas (prueba límite)
Se realizaron estudios para evaluar la toxicidad oral aguda de la pulpa de fruto de jusará liofilizada con un periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en ratas (prueba límite) ((Código del estudio: PCDL-0222; Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd., 9. Mexik6i Street Budapest, H-1149).
I. INFORMACIÓN GENERAL:
15 A. Dosificación
Una única dosis límite oral de 2.000 mg/kg de peso corporal de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' (número de lote: 2208) se aplicó a ratas por vía oral mediante sonda. Se observó a los animales para evaluar la mortalidad y síntomas tóxicos durante 14 días. Se llevó a cabo un examen patológico general en el 15º día. El peso corporal de los animales se correspondió con su especie y edad a lo largo del estudio. No se produjo ninguna muerte después de la 20 administración oral de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' a una dosis de 2.000 mg/kg. No se observaron síntomas clínicos tóxicos. La autopsia programada llevada a cabo en el día 15 no reveló cambios patológicos generales tóxicos. Se concluyó que no se observaron efectos adversos a una única dosis oral de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de jusará
-
liofilizada' en las ratas macho y hembra.
B.
Objetivo
25 Desarrollar datos sobre los posibles efectos toxicológicos de la administración de una única dosis oral de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' en ratas. Se espera que el artículo de prueba se use como suplemento dietético.
C. Tipo de estudio
Estudio toxicológico preclínico en cumplimiento con los principios de la normativa de buenas prácticas de laboratorio para estudios de laboratorio no clínicos de la Dirección Federal de Fármacos y Alimentos de Estados Unidos y la ley 30 húngara de 1998: XXVIII, que regula la protección de los animales. Prueba límite.
D. Desviaciones del protocolo del estudio
i. Características de la sustancia T 61 usada para el exterminio. Fabricante
Protocolo original: Hoechst Veterinãr GmbH Informe final: Intervet international Motivo: Se ha cambiado el nombre del fabricante.
5 ii. Mortalidad
Protocolo original: Se realizan observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de entonces. Informe final: Se realizaron observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de
entonces al principio y al final de los día de trabajo, así como una vez los fines de semana, hasta la mañana del 15º día. 10 Motivo: Se han descrito los procedimientos con más precisión que originalmente
iii. Estado general, aspecto externo, comportamiento y síntomas clínicos
Protocolo original: Durante el periodo posterior al tratamiento, se revisan los animales dos veces al día hasta la mañana del 15º día. Informe final: Durante el periodo posterior al tratamiento, se revisaron los animales dos veces al día hasta la mañana
15 del 15º día, excepto los fines de semana, cuando los animales se revisaron una vez. Motivo: Se han descrito los procedimientos con más precisión que originalmente
II.
ARTÍCULOS DE PRUEBA Y DE REFERENCIA
A.
Características del artículo de prueba
Las características del artículo de prueba se detallan a continuación en la tabla 53. 20 Tabla 53
Nombre del artículo:
Pulpa de fruto de jusará - liofilizada
Nombre botánico:
Euterpe edulis, Familia: Palmae
Parte de planta usada:
Pulpa de fruto fresco congelada
Fabricante:
Greater Continents do Brasil Ltda. Rua Alabastro, 55-112, Aclimacao 01131-010 Sao Paulo, SP Brasil
N.º de lote:
2208
Número de identificación del PCDL:
2002/22886
Humedad residual:
máx. <2%
Características físicas:
polvo liofilizado granulado morado oscuro con olor y sabor característico, higroscópico
Condiciones de almacenamiento:
refrigerado de acuerdo con la USP (2-8ºC, humedad no controlada), volver a cerrar rápidamente si se abre.
B. Análisis microbiológico
Se llevó a cabo una prueba límite microbiológica de acuerdo con la USP por el Departamento de Microbiología del PCDL.
25 C. Características del artículo usado para suspender el artículo de prueba
i. Metilcelulosa
La metilcelulosa (N.º de lote 127H1066; Caducidad 02/2003) se obtuvo comercialmente de Sigma y se almacenó a temperatura ambiente antes de su uso.
ii. Agua destilada
El agua destilada (N.º de lote A0010102; Caducidad 03/2003) se obtuvo comercialmente del PCDL y se almacenó a temperatura ambiente antes de su uso.
iii. Características del artículo usado para la sobreanestesia antes de la autopsia
5 El T 61 (N.º de lote 09W008; Caducidad 05/2006) que contenía 0,2 g de embutramida, 0,0005 g de clorhidrato de tetracaína y 0,05 g de yoduro de mebezonio por ml se obtuvo comercialmente de Intervet International y se almacenó a temperatura ambiente en una caja segura para fármacos tóxicos antes de su uso.
iv. Formulación del artículo de prueba
Se pesó la cantidad necesaria de artículo de prueba y se suspendió en una solución que contenía metilcelulosa al 1% 10 no antes de 30 min antes de su administración.
Se preparó la siguiente suspensión: Dosis nominal 2.000 mg/kg: 5,0 g de pulpa de fruto de jusará y 50 ml de solución de metilcelulosa al 1%. La suspensión se agitó después durante el tratamiento con un agitador magnético Radelkis de tipo OP-951.
v. Control de la concentración del artículo de prueba formulado
15 Se tomaron muestras de la sustancia de prueba formulada para comprobar la concentración y la homogeneidad. La comprobación de la concentración y la homogeneidad se realizó mediante gravimetría.
Las concentraciones de las tres muestras medidas por triplicado en la parte superior, intermedia e inferior de la suspensión (comprobación de la homogeneidad) estaban dentro de los límites aceptables de ± 10%, es decir, superior: +9,4 ± 4,2%, intermedia: +9,4 ± 4,6%, inferior: +6,6 ± 2,0%.
20 III. SISTEMA DE PRUEBA
A. Animales
En los presentes estudios se usaron ratas Sprague Dawley, Crl: CD BR (6-7 semanas de edad a su llegada). Los machos presentaban pesos corporales que variaban desde 143,8 hasta 151,9 g. Las hembras presentaban pesos corporales que variaban desde 144,2 hasta 161,6 g. Un conjunto de animales encargados: 30 (15 machos, 15
25 hembras). Número de animales que intervinieron en el estudio: 20 (10 machos, 10 hembras). Se obtuvieron comercialmente de Charles River Hungary Ltd. Los animales estaban LPE a su llegada y se alojaron en un entorno convencional durante el estudio. La rata se usa comúnmente para estudios toxicológicos de acuerdo con las recomendaciones internacionales. La cepa Sprague Dawley es un modelo de laboratorio bien conocido con suficientes datos históricos.
30 Los animales se identificaron mediante la técnica de numeración en la oreja y se alojaron en jaulas de cinco del mismo sexo. Las jaulas se etiquetaron con etiquetas que indicaban los números de ID de las ratas, el código del estudio, la identificación del grupo, la vía de administración, el sexo y las fechas de inicio y de final del periodo de experimentación.
Las condiciones de alojamiento de los animales se resumen a continuación en la tabla 54.
35 Tabla 54
Nivel higiénico:
convencional
Tipo de jaulas para animales:
de macrolona de tipo II
Tamaño de la jaula: altura x anchura x profundidad:
17,5 cm x 22,5 cm x 37,5 cm
Limpieza:
cambiando el fondo de las jaulas tres veces por semana
Número de animales por jaula:
5
Número de la sala de alojamiento de los animales:
123
Las condiciones ambientales de los animales se resumen a continuación en la tabla 55.
Tabla 55
Intercambio de aire:
aproximadamente 15 veces/hora
Temperatura:
22 ± 3ºC
Humedad relativa:
30-70%
Iluminación:
artificial, ciclos de luz-oscuridad de 12 horas.
La temperatura y la humedad relativa se registraron continuamente.
5 Se dio a los animales acceso libre a la dieta estandarizada para ratas y ratones VRF-1 excepto por el periodo de ayuno durante la noche anterior al tratamiento, durante el tratamiento y durante las dos primeras horas de la observación posterior al tratamiento La composición de la dieta fue controlada por el fabricante Altromin GmbH, D-4937 Lage/Lippe Lange Str. 42. La dieta se identificó por la fecha de fabricación (30.09.2002), estabilidad: 4 meses. Las ratas tenían acceso libre a agua corriente por medio de bebederos. El agua que beben se controla mensualmente por el
10 Departamento de Microbiología del PCDL. Los animales se observaron durante 5 días antes del tratamiento. En el estudio sólo se usaron animales sanos, sin ningún síntoma clínico.
El reparto de los animales en grupos se realizó con una tabla aleatoria generada por ordenador. Los animales se asignaron aleatoriamente a grupos basándose en su peso corporal, de forma que la distribución de los pesos corporales en los grupos individuales eran similares.
15 IV. DISEÑO EXPERIMENTAL
Los niveles de dosis y la división en grupos se resumen a continuación en la tabla 56.
Tabla 56
Número de grupo
Tratamiento Dosis Número de animales Números de identificación
mg/kg
Machos Hembras Machos Hembras
1
Pulpa de fruto de jusará 2.000 10 - 871-880 -
2
Pulpa de fruto de jusará 2.000 - 10 - 881-890
El fundamento para la selección de la dosis es el siguiente. La dosis diaria humana de pulpa de fruto de jusará
20 esperada es de aprox. 1.000 mg al día, lo que corresponde a 14 mg/kg de peso corporal de un adulto (70 kg) o 50 mg/kg para un niño de 4 años (20 kg). La dosis límite de 2.000 mg/kg aplicada en este estudio corresponde a 140 veces la dosis diaria si la consumiera un adulto o 40 veces ésta si se calculan 5 g para el peso corporal de un niño.
V. ADMINISTRACIÓN
La aplicación fue oral mediante sonda. La vía de aplicación se seleccionó en cumplimiento de las directrices
25 internacionales. La vía oral es la vía esperada de exposición humana al artículo de prueba. La aplicación del artículo de prueba se administró en una única dosis. El artículo de prueba se administró en un volumen de 20 ml/kg de peso corporal. El periodo de experimentación consistió en 5 días de aclimatación, el día de tratamiento, un periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento incluido el día de tratamiento y el 15º día: autopsia.
VI. OBSERVACIONES, EXÁMENES
30 A. Mortalidad
Se realizaron observaciones durante las 4 horas posteriores al tratamiento y dos veces al día a partir de entonces al principio y al final de los días de trabajo, así como una vez los fines de semana, hasta la mañana del 15º día. La hora de la muerte debería haberse registrado con la mayor precisión posible.
B. Estado general, aspecto externo, comportamiento y síntomas clínicos
35 Se llevó a cabo la observación clínica minuciosa de las ratas una vez antes de la exposición, y después, tras el tratamiento durante 6 horas de forma continua. Durante el periodo subsiguiente, se revisaron los animales dos veces al día hasta la mañana del 15º día, excepto los fines de semana, cuando los animales se revisaron una vez. Los síntomas que debían observarse incluían cambios en la piel, pelaje, ojos y membranas mucosas visibles; aparición de
secreciones y excreciones y actividad autónoma (por ejemplo, lagrimeo, piloerección, diarrea, tamaño de la pupila, pauta respiratoria inusual). Además, se registraron cambios potenciales en la marcha, la postura y la respuesta frente a la manipulación, así como la presencia de somnolencia, temblor, movimientos clónicos y tónicos, estereotipos o comportamiento extraño.
C. Peso corporal
Los animales se pesaron a su llegada al laboratorio, en el día de la aleatorización, en el día de tratamiento, así como en los días 2º, 8º y 15º del experimento antes de la autopsia.
VII.
NECROPSIA Y EXAMEN HISTOLÓGICO
A.
Autopsia
Todas las ratas que sobrevivieron tras finalizar el periodo de observación posterior al tratamiento se exterminaron por sobreanestesia con T61 y se les realizó la autopsia. Se observaron minuciosamente y se registraron los estados externo e interno. No se realizó el examen microscópico de los órganos.
VIII. EVALUACIÓN, ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los grupos de machos y hembras se evaluaron por separado.
A. Valores paramétricos
Se calcularon los valores medios y las desviaciones estándar de los pesos corporales.
B. Valores no paramétricos (mortalidad y síntomas clínicos)
Se tabularon la incidencia de la mortalidad, los síntomas clínicos y los hallazgos generales.
IX. PROCEDIMIENTOS
Los experimentos se realizaron de acuerdo con los procedimientos operativos estándar del Departamento de Toxicología del Pharmaceutical Control and Development Laboratory Co. Ltd.
X. PROTECCIÓN DE LOS ANIMALES
En aras del bienestar de los animales se evitó el uso innecesario de animales. El director del estudio fue el responsable de ordenar el exterminio cuidadoso de los animales claramente moribundos. El presente procedimiento (prueba límite) usa un número reducido de animales de experimentación en comparación con otras pruebas de toxicidad aguda conocidas y reconocidas.
XI. REGISTRO Y ARCHIVO DE DATOS
Todos los datos originales se mantienen, como dictan los procedimientos operativos estándar, en formularios apropiados como sigue: Pesaje del compuesto de prueba Libro de registro del animalario Libros de registro de peso corporal Libros de registro de mortalidad y observaciones clínicas
Registros postmortem Los datos obtenidos en el curso del estudio se recogieron en una carpeta del estudio. El protocolo del estudio, todos los datos generados durante y como consecuencia del estudio, los documentos y toda la información en relación con el estudio, una muestra de control del artículo de prueba y el informe final se almacenarán al menos durante 15 años en los archivos del PCDL y entonces se ofrecerán al patrocinador.
XII.
RESULTADOS
A.
Mortalidad
La mortalidad observada en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resume a continuación en la tabla 57.
Tabla 57
Grupo 1 -MACHOS
Grupo 2 -HEMBRAS
Tratamiento
Muerte / número de animales
Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral
0/10 0/10
La tabla 58 resume los datos de mortalidad individual para sujetos de prueba macho en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 58. Machos
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
871
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
872
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
873
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
874
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
875
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
876
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
877
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
878
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
879
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
880
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: 0 = Sin mortalidad; * Día 1 = Día de tratamiento
La tabla 59 resume los datos de mortalidad individual para sujetos de prueba hembra en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 59. Hembras
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
881
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
882
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
883
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
884
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
885
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
886
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
887
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
888
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
889
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
890
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: 0 = Sin mortalidad; * Día 1 = Día de tratamiento
No se produjo ninguna muerte tras la administración oral única de una dosis de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' a ratas. Todos los machos y hembras sobrevivieron hasta el final del periodo de observación de 14 días.
B. Síntomas clínicos
Los síntomas clínicos observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 60.
Tabla 60
Grupo 1 -MACHOS
Grupo 2 -HEMBRAS
Tratamiento
Muerte / número de animales
Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral
0/10 0/10
La tabla 61 resume los síntomas clínicos individuales para sujetos de prueba macho en el estudio de toxicidad oral 10 aguda de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 61. Machos
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
871
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
872
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
873
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
874
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
875
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
876
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
877
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
878
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
879
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
880
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: SS = Sin síntomas; * Día 1 = Día de tratamiento
La tabla 62 resume los síntomas clínicos individuales para sujetos de prueba hembra en el estudio de toxicidad oral aguda de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' con periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento en rata (prueba límite).

Tabla 62. Hembras
Grupo *Código de animal
DÍAS DEL PERIODO DE OBSERVACIÓN
Día 1*
Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 Día 8 Día 9 Día 10 Día 11 Día 12 Día 13 Día 14 Día 15
881
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
882
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
883
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
884
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
885
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
886
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
887
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
888
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
889
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
890
SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS
* Pulpa de fruto de asaí (2.000 mg/kg, vía oral); Observaciones: SS = Sin síntomas; * Día 1 = Día de tratamiento
No se observaron síntomas tóxicos en el día de la aplicación ni durante el periodo de 14 días posterior al tratamiento de observación de los animales tratados.
C. Pesos corporales
Los pesos corporales de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 63.

Tabla 63. MACHOS
Grupo 1 Tratamiento *
Pesos corporales [g]
Día de llegada
Día de aleatorización Día -1 Día 2 Día 8 Día 15
Grupo tamaño: Media: ± D.E.:
10 148,1 3,37 10 198,6 6,33 10 181,8 6,84 10 195,6 14,97 10 255,5 8,98 10 313,8 19,09
* Pulpa de fruto de jusará (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los pesos corporales de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 64.
10 Tabla 64. HEMBRAS
Grupo 1 Tratamiento
Pesos corporales [g]
Día de llegada
Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
Grupo tamaño: Media: ± D.E.:
10 152,6 6,25 10 177,8 7,46 10 162,7 7,13 10 279,9 9,61 10 204,9 5,81 10 227,2 19,25
Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral), ** Un día antes del tratamiento
Los cambios en el peso corporal de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 65.

Tabla 65. MACHOS
Grupos *
Cambios en el peso corporal [g]
Día 1
Día 2 Día 8
Tamaño del grupo: Media: ± D.E.:
10 13,8 10,76 10 60,0 10,28 10 58,3 20,36
* Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral
Los cambios en el peso corporal de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 66.

Tabla 66. HEMBRAS
Grupos *
Cambios en el peso corporal [g]
Día 1
Días 2-7 Días 8-14
Tamaño del grupo:
10 10 10
Media: ± D.E.:
16,9 4,92 25,4 5,62 22,3 14,59
* Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral
Los pesos corporales individuales de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 67.

Tabla 67. MACHOS
Grupo * Código de animal
Pesos corporales [g]
Día de llegada
Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
871
146,3 208,2 191,5 213,4 265,7 328,7
872
151,9 205,3 185,1 208,7 255,1 314,2
873
147,9 202,5 188,8 209,3 265,9 310,5
874
143,8 202,2 178,5 204,7 263,5 323,5
875
148,9 200,1 180,3 207,1 261,5 332,7
876
145,6 198,9 178,3 181,4 258,8 284,3
877
153,9 196,2 188,3 194,0 248,8 322,0
878
146,9 192,6 183,3 186,7 242,9 334,9
879
144,3 190,7 171,3 174,0 250,8 279,6
880
151,2 189,2 172,5 176,2 242,2 307,3
Tamaño del grupo: Media: ± D.E.:
10 148,1 3,37 10 198,6 6,33 10 181,8 6,84 10 195,6 14,97 10 255,5 8,98 10 313,8 19,09
* Pulpa de fruto de jusará (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los pesos corporales individuales de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 68.

Tabla 68. HEMBRAS
Grupo * Código de animal
Pesos corporales [g]
Día de llegada
Día de aleatorización Día-1 ** Día 2 Día 8 Día 15
881
154,2 193,4 174,4 197,1 216,0 263,8
882
159,9 185,6 175,0 187,4 21 L4 256,3
883
144,2 182,0 167,0 184,4 204,0 237,1
884
161,6 178,1 162,9 185,4 206,5 223,1
885
158,6 178,1 160,0 185,1 207,2 225,5
886
150,3 175,9 159,4 173,4 197,0 208,9
887
155,7 172,3 156,3 167,6 200,4 216,2
888
148,8 171,4 158,6 174,1 200,2 211,5
889
147,5 170,7 157,5 169,7 200,2 218,1
890
145,3 170,5 155,8 171,5 206,5 211,5
Tamaño del grupo:
10 10 10 10 10 10
Media:
152,6 177,8 162,7 179,6 204,9 227,2
± D.E.:
6,25 7,46 7,13 9,61 5,81 19,25
* Pulpa de fruto de jusará (2.000 mg/kg, vía oral); ** Un día antes del tratamiento
Los cambios en el peso corporal individual de sujetos de prueba macho observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 69.
Tabla 69. MACHOS
Grupos * Código de animal
Cambios en el peso corporal [g] **
Día 1
Días 2-7 Días 8-14
871
21,9 52,3 63,0
872
23,6 46,4 59,1
873
20,5 56,6 44,6
874
26,2 58,8 60,0
875
26,8 54,4 71,2
876
3,1 77,4 25,5
877
5,7 54,8 73,2
878
3,4 56,2 92,0
879
2,7 76,8 28,8
880
3,7 66,0 65,1
Tamaño del grupo: Media: ± D.E.:
10 13,8 10,76 10 60,0 10,28 10 58,3 20,36
* Pulpa de fruto de jusará (2,000 mg/kg, vía oral); ** Diferencias calculada a partir de pesos corporales pesados en los días 1 y 2, los días 2 y 8, así como en los días 8 y 15, respectivamente
Los cambios en el peso corporal individual de sujetos de prueba hembra observados en el periodo de observación de 14 días posterior al tratamiento se resumen a continuación en la tabla 70.

Tabla 70. HEMBRAS
Grupos * Código de animal
Cambios en el peso corporal [g] **
Día 1
Días 2-7 Días 8-14
881
22,7 18,9 47,8
882
12,4 240 44,9
883
17,4 19,6 33,1
884
22,5 21,1 16,6
885
25,1 22,1 18,3
886
14,0 23,6 11,9
887
11,3 32,8 15,8
888
15,5 26,1 11,3
889
12,2 30,5 17,9
890
15,7 35,0 5,0
Tamaño del grupo: Media: ± D.E.:
10 16,9 4,92 10 25,4 5,62 10 22,3 14,59
* Pulpa de fruto de jusará (2,000 mg/kg, vía oral); ** Diferencias calculada a partir de pesos corporales pesados en los días 1 y 2, los días 2 y 8, así como en los días 8 y 15, respectivamente
El peso corporal y el aumento de peso corporal de los animales se correspondió con su especie y edad a lo largo del estudio.
D. Patología general
Los hallazgos de patología general para los animales de prueba se resumen en la tabla 71. 10 Tabla 71
Grupo 1 -MACHOS
Grupo 2 -HEMBRAS
Tratamiento
Externo Interno Externo Interno
hallazgo / número de animales
Pulpa de fruto de jusará; 2.000 mg/kg, vía oral
0/10 0/10 0/10 0/10
Los hallazgos de patología general para los animales de prueba macho se resumen en la tabla 72.

Tabla 72. MACHOS
Grupos * Código de animal
Día 15
Externo
Interno
871
Ningún hallazgo ** Ningún hallazgo
872
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
873
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
874
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
875
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
876
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
877
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
878
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
879
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
880
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
* Pulpa de fruto de jusará (2.000 mg/kg, vía oral); ** "Ningún hallazgo" significa lo siguiente: Externo: Animal de desarrollo promedio. Piel, pelaje y membranas mucosas están intactos; Interno: órganos sin cambios patológicos.
Los hallazgos de patología general para los animales de prueba hembra se resumen en la tabla 73. Tabla 73. HEMBRAS
Grupos * Código de animal
Día 15
Externo
Interno
881
Ningún hallazgo ** Ningún hallazgo
882
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
883
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
884
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
885
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
886
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
887
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
888
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
889
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
890
Ningún hallazgo Ningún hallazgo
* Pulpa de fruto de jusará (2.000 mg/kg, vía oral); ** "Ningún hallazgo" significa lo siguiente: Externo: Animal de desarrollo promedio. Piel, pelaje y membranas mucosas están intactos; Interno: órganos sin cambios patológicos.
Todos los animales sobrevivieron hasta la autopsia programada, el día 15, y ninguno mostró cambios patológicos tóxicos.
E. EVALUACIÓN
10 No se produjo ninguna muerte tras la aplicación oral única de una dosis de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de jusará liofilizada'. No se produjeron síntomas clínicos tóxicos. La autopsia programada en el día 15 no reveló cambios patológicos generales tóxicos. Se concluyó que no se observaron efectos adversos a una única dosis oral de 2.000 mg/kg de 'pulpa de fruto de jusará - liofilizada' en las ratas macho y hembra.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición de suplemento dietético que comprende pulpa de fruto de Euterpe edulis (jusará) liofilizada, en la que la composición:
    (a)
    comprende una concentración de antocianina total superior a 1 miligramo por gramo de peso total;
    (b)
    tiene un valor de CAROFL superior a 350 micromoles de ET por gramo de peso total; y
    (c)
    tiene un contenido en agua residual inferior al 3 por ciento en peso del peso total.
  2. 2.
    La composición de la reivindicación 1, en la que la composición de suplemento dietético comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  3. 3.
    Un procedimiento de producción de una composición de suplemento dietético estable y de sabor agradable a base de jusará de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    (a)
    pelar los frutos de jusará para aislar la pulpa de fruto de jusará de los frutos de jusará;
    (b)
    congelar la pulpa de fruto de jusará hasta una temperatura inferior a -5ºC; y
    (c)
    liofilizar la pulpa de fruto de jusará bajo condiciones para proporcionar un polvo de pulpa de jusará liofilizado granulado con un contenido en agua residual de menos del 3 por ciento en peso.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la composición de suplemento dietético a base de jusará tiene un valor de CAROFL de más de 350 micromoles de ET por gramo de peso total.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la composición de suplemento dietético a base de jusará tiene un valor de inhibición de ciclooxigenasas mayor de 15 equivalentes en mg de Aspirina® por gramo de peso total.
  6. 6.
    Una composición de suplemento dietético para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad o una lesión inducida por reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero, en la que es para administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición de suplemento dietético a base de jusará de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la composición desactiva los radicales libres y reduce el daño inducido por radicales libres patológicos.
  7. 7.
    La composición de suplemento dietético de la reivindicación 6, en la que la enfermedad o lesión se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación y daño tisular inducido por una toxina ambiental.
  8. 8.
    Una composición de suplemento dietético para el uso de aliviar los efectos perjudiciales de reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero que sufre una enfermedad o una lesión inducida por reacciones de radicales libres patológicos en un mamífero, en la que es para administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición de suplemento dietético a base de jusará de la reivindicación 1 o 2, en la que la composición desactiva radicales libres y reduce el daño inducido por radicales libres patológicos.
  9. 9.
    La composición de suplemento dietético de la reivindicación 8, en la que la enfermedad o lesión se selecciona del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación y daño tisular inducido por una toxina ambiental.
  10. 10.
    Una composición de suplemento dietético para su uso en inhibir la actividad enzimática ciclooxigenasa en un mamífero, en la que es para administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende la composición de suplemento dietético a base de jusará de la reivindicación 1 o 2.
  11. 11.
    La composición de suplemento dietético de la reivindicación 10, en la que la composición comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  12. 12.
    La composición de suplemento dietético de la reivindicación 10, en la que la composición es para administrar por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en: vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intracerebral, intracerebelar, intrabronquial, intratecal, tópica y aerosol.
  13. 13.
    Una composición de suplemento dietético para su uso en evitar o tratar una enfermedad o una lesión asociada
    con una actividad enzimática ciclooxigenasa incrementada en un mamífero, en la que es para administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición que comprende la composición de suplemento dietético a base de jusará de la reivindicación 1 o 2.
  14. 14. La composición de suplemento dietético de la reivindicación 13, en la que la composición comprende 5 adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. La composición de suplemento dietético de la reivindicación 13, en la que la composición es para administrar por una vía de administración seleccionada del grupo que consiste en: vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intracerebral, intracerebelar, intrabronquial, intratecal, tópica y aerosol.
    10 16. La composición de suplemento dietético de la reivindicación 13, en la que la enfermedad o lesión está seleccionada del grupo que consiste en: cáncer, cáncer de colon, cáncer de mama, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, enfermedad vascular, artritis, úlcera, síndrome de dificultad respiratoria aguda, daño por isquemia y reperfusión, trastornos neurodegenerativos, autismo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad gastrointestinal, daño tisular inducido por inflamación, y daño tisular
    15 inducido por una toxina ambiental.
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