CN114009755A - 阿萨伊的发酵方法及发酵产物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阿萨伊的发酵方法及发酵产物。该发酵方法包括：步骤S1，制备阿萨伊果浆原液；步骤S2，利用微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，其中，微生物选自副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。利用上述微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，使得其中的蛋白质和脂肪酸得到有效分解，且提高了阿萨伊的抗氧化值，增加了其抗氧化性能；同时发酵过程产生新的挥发性香气成分，改善了发酵产物的滋气味；发酵物具有阿萨伊和益生菌的双重功效，可更好的满足人体营养需求。不需要食品添加剂，也不需要其他材料改善滋气味，使得原材料处理过程简单、成本低，更适合工业化生产。

Description

阿萨伊的发酵方法及发酵产物

技术领域

本发明涉及阿萨伊发酵技术领域，具体而言，涉及一种阿萨伊的发酵方法及发酵产物。

背景技术

阿萨伊

是天然热带棕榈树属的果实，又称“巴西莓”，在果实未成熟时果皮为绿色，当完全成熟时变成深紫色，其大小类似于葡萄，大约有28种果实，其中有三种主要品种生产可食用水果：Euterpe edulis Mart.(EE)、Euterpe precatoria Mart.(EP)和Euterpe oleracea Mart.(EO)，广泛分布于亚马逊流域的巴西、秘鲁、哥伦比亚等地。

阿萨伊作为一种新的“超级水果”受到广泛关注，当果实成熟时含有抗氧化物质包括是花青素、原花青素和其它黄酮类化合物，其中花青素3-葡萄糖苷和花青素3-芸香糖苷是花青素的主要成分，黄酮类化合物包括异红草素、葒草素、异牡荆黄素、金雀花素等，此外对阿萨伊的总类胡萝卜素和总花青素抗氧化活性的研究得出，两者一起有助于果实的抗氧化活性。

国内外大量试验研究表明阿萨伊可以抑制DPPH自由基、阴离子超氧化物、过氧自由基、羟基自由基和脂质体的氧化，具有高抗氧化活性，被亚马逊河流域的居民称为“紫色黄金”，作为药食两用天然植物资源，在世界范围内引起广泛关注。

但由于阿萨伊原液滋气味较差，苦涩味较重，此外将阿萨伊运到亚马逊地区之外成本高，导致其在产品、不同地域上应用存在一定局限。发酵后的阿萨伊不仅改善了滋气味具有愉悦的发酵风味，此外其自由基吸收能力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁离子还原能力、总SOD活性均强于阿萨伊原果浆，可作为功能性原料广泛应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中，剂型包括粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、胶囊、凝胶糖果等。

日本专利JP6714367B2提供了含阿萨伊的饮料和减少涩味的方法，在含阿萨伊的饮料中加入黄原胶以降低阿萨伊饮料的涩味，该发明是通过加入食品添加剂改善阿萨伊的滋气味。

杨婧娀等人及专利申请BR102016030517A2公开了阿萨伊果果汁经过酵母菌发酵制备成阿萨伊果发酵酒，果酒具有优异的味觉和芳香结构，此外能加速细胞膜之间的流动性、促进营养吸收和体内废物的排除、净化消化系统脂肪残留物等生理功能。该现有技术是利用酵母菌对阿萨伊进行发酵制备发酵果酒，该产品中酒精度较高，导致受众受限。而且，发酵后产物的抗氧化性能不能得到提高甚至是保持。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种阿萨伊的发酵方法及发酵产物，以解决现有技术中的阿萨伊的发酵产物抗氧化能力不能充分发挥的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种阿萨伊的发酵方法，发酵方法包括：步骤S1，制备阿萨伊果浆原液；步骤S2，利用微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，其中，微生物选自副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。

进一步地，上述微生物包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌，优选副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的重量比为0.2～12:0.5～1.5:0.2～2，优选为0.5～1.5:1:1.5～0.5。

进一步地，上述步骤S2中，发酵的温度为24～40℃，优选为30～37℃、优选发酵的时间为1～10天，进一步优选发酵的时间为5～8天。

进一步地，上述步骤S2包括：将微生物接种在MRS培养基中进行扩大培养，得到活化菌种，优选活化菌种中微生物的菌种数量在10⁶～10⁸CFU/mL；将活化菌种与阿萨伊果浆原液混合进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，优选活化菌种的接种量为0.1～4wt％。

进一步地，上述步骤S1包括：步骤S11，将阿萨伊进行打浆，得到阿萨伊果浆；步骤S12，对阿萨伊果浆进行酶解和灭酶，得到阿萨伊果浆原液，酶解采用果胶酶和/或纤维素酶进行。

进一步地，上述步骤S12包括：将阿萨伊果浆进行匀浆处理后调节阿萨伊果浆的pH值至5.5～7.5之间，得到预处理果浆，优选匀浆的转速为5000～6000r/min、时间为10～20min；将预处理果浆与果胶酶和/或纤维素酶混合后进行酶解，得到酶解后果浆，优选果胶酶相对于预处理果浆的质量比例为0.01～0.10:100，优选纤维素酶相对于预处理果浆的质量比例为0.02～0.12:100；酶解后，对酶解后果浆中的果胶酶和/或纤维素酶进行灭酶处理，得到阿萨伊果浆原液。

进一步地，上述酶解的温度为40～60℃，酶解的时间为0.5～3h，优选酶解过程中进行搅拌，搅拌的速度为300～500r/mim。

进一步地，在酶解和灭酶处理之间，上述步骤S12还包括：

将酶解后果浆、碳源和氮源混合形成混合体系并将混合体系的pH值调节至6～7，优选氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽，碳源包括相对于阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。

进一步地，上述灭酶的温度在95～120℃之间、灭酶时间为10～20min。

根据本发明的另一方面，提供了一种阿萨伊的发酵产物，该发酵产物采用上述任一种的发酵方法得到。

应用本发明的技术方案，利用上述微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，使得其中的蛋白质和脂肪酸得到有效分解，且提高了阿萨伊的抗氧化值，增加了其抗氧化性能；同时发酵过程产生新的挥发性香气成分，改善了发酵产物的滋气味；上述微生物均为可食用菌种，因此使得阿萨伊的发酵物具有阿萨伊和益生菌的双重功效，可更好的满足人体营养需求。且本申请不需要食品添加剂，也不需要其他材料改善滋气味，使得原材料处理过程简单、成本低，更适合工业化生产。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的实施例1的四种不同菌种发酵后阿萨伊发酵液的ORAC值；

图2示出了根据本发明的实施例1三种不同菌种发酵后阿萨伊发酵液的ORAC值；

图3示出了根据本发明的实施例2的不同接种量对阿萨伊发酵液ORAC值的影响；

图4示出了根据本发明的实施例2的不同菌种比例对阿萨伊发酵液ORAC值的影响；

图5示出了根据本发明的实施例2的不同氮源添加量对阿萨伊发酵液ORAC值的影响；

图6示出了根据本发明的实施例2的不同发酵温度对阿萨伊发酵液ORAC值的影响；

图7示出了根据本发明的实施例2的不同发酵时间对阿萨伊发酵液ORAC值的影响；

图8示出了根据本发明的实施例3的不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线；

图9示出了根据本发明的实施例3的Trolox标准曲线；

图10示出了根据本发明的实施例3的两种阿萨伊样品的DPPH自由基清除能力；

图11示出了根据本发明的实施例3的两种阿萨伊样品的DPPH自由基清除能力；

图12示出了根据本发明的实施例3的Trolox标准品绘制的ABTS标准曲线；

图13示出了根据本发明的实施例3的FeSO₄标准曲线；

图14示出了根据本发明的实施例3的γ-氨基丁酸混标图谱；

图15示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊果浆的γ-氨基丁酸的测定图谱；

图16示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊发酵液的γ-氨基丁酸的测定图谱；

图17-a示出了根据本发明的实施例3的乳酸标准品的离子色谱图；

图17-b示出了根据本发明的实施例3的7种有机酸标准品的离子色谱图；

图18-a示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊果浆冻干粉的乳酸离子色图谱；

图18-b示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊果浆冻干粉的7种有机酸离子色图谱；

图19-a示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊发酵液冻干粉的乳酸离子色图谱；

图19-b示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊发酵液冻干粉的7种有机酸离子色图谱；

图20示出了根据本发明的实施例3的黄酮标准品的液相色谱图；

图21示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊果浆的液相色谱图；

图22示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊发酵液的液相色谱图；

图23示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊果浆的气质色图谱；

图24示出了根据本发明的实施例3的阿萨伊发酵液的气质色图谱；

图25示出了根据本发明的实施例4的阿萨伊果浆冻干粉的扫描电镜图；

图26示出了根据本发明的实施例4的阿萨伊发酵液冻干粉的扫描电镜图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

如本申请背景技术所分析的，现有技术的阿萨伊的发酵产物的抗氧化能力不能充分发挥。为了解决该问题，本申请提供了一种阿萨伊的发酵方法及发酵产物。

在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种阿萨伊的发酵方法，该发酵方法包括：步骤S1，制备阿萨伊果浆原液；步骤S2，利用微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，其中，微生物选自副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。

本申请利用上述微生物对阿萨伊果浆原液进行发酵处理，使得其中的蛋白质和脂肪酸得到有效分解，且提高了阿萨伊的抗氧化值，增加了其抗氧化性能；同时发酵过程产生新的挥发性香气成分，改善了发酵产物的滋气味；上述微生物均为可食用菌种，因此使得阿萨伊的发酵物具有阿萨伊和益生菌的双重功效，可更好的满足人体营养需求。且本申请不需要食品添加剂，也不需要其他材料改善滋气味，使得原材料处理过程简单、成本低，更适合工业化生产。

上述各菌种均可从相应的菌种种类中进行选择，比如副干酪乳杆菌选择保藏编号为CGMCC NO:14813的副干酪乳杆菌，植物乳杆菌选择保藏编号为CGMCC NO:14812的植物乳杆菌，肠膜明串珠菌为保藏编号选择CICC NO:22177的肠膜明串珠菌，嗜酸乳杆菌选择保藏编号为CICC 20710的嗜酸乳杆菌。

为了充分发挥微生物中各菌种的优势，优选上述微生物包括副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌，优选上述副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的重量比为0.2～12:0.5～1.5:0.2～2，进一步优选为0.5～1.5:1:1.5～0.5。

由于发酵温度过高，会导致发酵风味变差，为了优化上述微生物的生长繁殖，优选上述步骤S2中，发酵的温度为24～40℃，优选为30～37℃、时间为1～10天，优选为5～8天。

在一些实施例中，为了提高发酵效率，先对微生物进行扩大培养，然后再进行接种，优选上述步骤S2包括：将微生物接种在MRS培养基中进行扩大培养，得到活化菌种，优选活化菌种中微生物的菌种数量在10⁶～10⁸CFU/mL；将活化菌种与阿萨伊果浆原液混合进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，优选活化菌种的接种量为0.1～4wt％，进一步优选为1～2wt％。通过上述扩大培养，将微生物的菌种数量扩大且激活活性，并且以优选的接种量进行接种，进一步有效调节了发酵产物的抗氧化性能。

阿萨伊的脂肪酸中不饱和脂肪酸较多，主要包括：油酸、棕榈油酸和亚油酸。脂肪酸在发酵过程中易产生不良风味和气味，阿萨伊果清洗打浆后会出现脂肪球上浮形成脂肪圈，加之果汁中纤维素、蛋白等大分子颗粒悬浮物絮凝下沉，易出现分层现象，使微生物与底物不能充分接触进行发酵。为了进一步提高微生物的对脂肪酸和蛋白的发酵效果，在一些实施例中，上述步骤S1包括：步骤S11，将阿萨伊进行打浆，得到阿萨伊果浆；步骤S12，对阿萨伊果浆进行酶解和灭酶，得到阿萨伊果浆原液，酶解采用果胶酶和/或纤维素酶进行。通过上述酶解处理，结合上述微生物，使脂肪酸的代谢产物的风味和气味更加柔和易于接受，从而使发酵产物的挥发性香气成分增加，具有更愉悦的风味。

在一些实施例中，上述步骤S12包括：将阿萨伊果浆进行匀浆处理后调节阿萨伊果浆的pH值至5.5～7.5之间，得到预处理果浆，优选地，匀浆的转速为5000～6000r/min，时间为10～20min；将预处理果浆与果胶酶和/或纤维素酶混合后进行酶解，得到酶解后果浆，优选果胶酶相对于预处理果浆的质量比例为0.01～0.10:100，优选纤维素酶相对于预处理果浆的质量比例为0.02～0.12:100；酶解后，对酶解后果浆中的果胶酶和/或纤维素酶进行灭酶处理，得到阿萨伊果浆原液。通过上述方式进行匀浆，提高了匀浆的效果；通过对果胶酶和纤维素酶的用量控制，提高了大分子物质的酶解效率。

上述酶解的温度可以参考各果胶酶和/或纤维素酶的活性温度，为了在酶解时提高各组分的稳定性，优选上述酶解的温度为40～60℃，酶解的时间为0.5～3h。为了提高酶解效率，优选酶解过程中进行搅拌，搅拌的速度为300～500r/mim。

另外，为了使上述各菌种充分代谢，在一些实施例的酶解和灭酶处理之间，步骤S12还包括：将酶解后果浆、碳源和氮源混合形成混合体系并将混合体系的pH值调节至6～7，优选氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽，进一步优选氮源包括相对于阿萨伊原液重量1.5～2.5％的小麦低聚肽，碳源包括相对于阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。在酶解和灭酶处理之间添加氮源和碳源，优化了氮源、碳源和酶解后果浆的混合均匀性。

为了避免酶对其中的果胶和纤维素过度酶解，优选上述灭酶的温度在95～120℃之间、灭酶时间为10～20min。

在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种阿萨伊的发酵产物，该发酵产物采用上述任一种的发酵方法得到。

本申请的阿萨伊的发酵物抗氧化性得到了改善。其中，蛋白质含量和脂肪含量相对于发酵前大大减少，而其中的游离氨基酸和挥发性香气成分明显增多，这与蛋白质和脂肪减少的结果是一致的，因此在很大程度上丰富了阿萨伊发酵物的风味。且发酵产物的蛋白质和脂肪减少，小分子的氨基酸增多，提高了阿萨伊的可吸收性。本申请的发酵产物的口感得到改善，而且发酵产物更天然的同时具有阿萨伊和益生菌的双重营养。

经过对发酵产物的进一步检测发现，发酵产物中的γ-氨基丁酸含量也有增加，比如在一些实施例中，上述发酵产物还包括γ-氨基丁酸，γ-氨基丁酸的重量份为0.001～0.01份，优选为0.005～0.006份。γ-氨基丁酸是发酵产生的生理活性物质，是一种抑制性神经递质，具有降血压、抗惊厥、改善脑机能和调节睡眠的作用，因此也赋予发酵产物一定的降血压、改善睡眠的效果。

通常的游离氨基酸包括天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)，但是其中某些氨基酸的含量变化比较明显。

同样以100重量份的发酵前阿萨伊湿重来计算，发酵前各游离氨基酸的重量份均在0.01份以下。发酵产物中，亮氨酸的重量份为0.01～0.06份，优选为0.025～0.030，谷氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.015～0.02份，丙氨酸的重量份为0.01～0.05份，优选为0.014～0.016，缬氨酸的重量份为0.01～0.03份，优选为0.010～0.015，苯丙氨酸的重量份为0.01～0.04份，优选为0.008～0.012。上述各氨基酸共同赋予了阿萨伊的发酵产物酸甜鲜的滋味。

阿萨伊的发酵产物中黄酮类物质的种类和总含量和发酵前基本维持相当，在一些实施例中，经检测，上述黄酮类物质包括3’,4’羟基-川陈皮素、3’羟基-川陈皮素、4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、4’羟基-桔皮素、川陈皮素、桔皮素、5’羟基-川陈皮素和5’羟基-桔皮素中的一种或多种。在一些实施例中，以占黄酮类物质的质量百分含量计，优选黄酮类物质包括18～20％的所述3’,4’羟基-川陈皮素、0.5～1.0％的3’羟基-川陈皮素、1.5～2.2％的4’羟基-川陈皮素、25～30％的甜橙黄酮、4.0～5.0％的4’羟基-桔皮素、1.0～1.5％的川陈皮素、18～22％的桔皮素、13～18％的5’羟基-川陈皮素和5～10％的5’羟基-桔皮素，上述各物质含量相对于发酵前有所变化，对发酵产物的抗氧化作用提升具有一定的贡献。

在一些实施例中，阿萨伊的发酵产物的酸味得到明显改善，经过分析发现，以100份的发酵产物的干物质计，发酵产物还包括5.0～15.0份有机酸，优选包括8～12份有机酸，优选有机酸包括乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、苹果酸、酒石酸、草酸和柠檬酸中的任意一种或多种。优选乳酸的重量份为3.5～6.0份，优选为5.0～6.0份，乙酸的重量份为1.5～4.0份，优选为3.0～4.0份，柠檬酸的重量份小于0.030份。上述有机酸的总量相对于发酵之前成倍增加，尤其是其中的乙酸含量增加了近20倍，从而赋予了阿萨伊的发酵产物更充分的酸味，更好地掩盖了其涩味。

在本申请的一些实施例中，该发酵产物包括：0.05～0.30份灰分、1.0～3.0份的蛋白质、2.5～4.0份的脂肪、0.40～0.80份多酚类物质、0.05～0.15份游离氨基酸、0.8～1.20份黄酮类物质以及0.003～0.005份挥发性香气成分。在一些发酵产物的样品中，经检测，挥发性香气成分的重量份为0.004～0.005份，优选挥发性香气成分包括乙醛、二甲基硫、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇中的一种或多种，以占所述挥发性成分的质量百分含量计，优选所述挥发性成分包括20～25％的所述乙醛、1.5～2.0％的所述二甲基硫、2.0～2.3％的所述甲酸乙酯、5.0～5.5％的所述乙酸乙酯、30～35％的所述正丙醇、8.5～10％的所述异丁醇和25～30％的所述异戊醇。其中的二甲基硫、甲酸乙酯和异丁醇都是发酵后新产生的香气成分，其他各香气成分相对于发酵前的含量具有显著提升。在一些实施例中，发酵产物包括：0.25～0.30份的灰分、2.7～3.0份的蛋白质、2.8～3.2份的脂肪、0.48～0.52份多酚类物质、0.10～0.15份游离氨基酸、1.0～1.1份黄酮类物质以及0.004～0.0045份挥发性香气成分。

如本申请背景技术所分析的，阿萨伊具有优异的抗氧化作用，发酵后的发酵产物的仍然具有较好的抗氧化特性，优选上述发酵产物的ORAC值为180～400μmol/g Trolox，优选为180～250μmol/g Trolox。

在本申请另一种典型的实施方式中，提供了一种包含阿萨伊发酵产物的产品，该阿萨伊发酵产物为上述任一种的发酵产物，上述产品选自食品、保健品、药品和化妆品中的任意一种。本申请的液态发酵产物，如果应用到液体剂型产品中，可先进行澄清、均质、瞬时杀菌、灌装、巴士杀菌、冷却过程处理；如果应用到粉剂剂型产品中，可进行喷雾干燥或冷冻干燥处理。由于本申请的阿萨伊的发酵产物比原阿萨伊果浆具有更高的氧化自由基吸收能力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁离子还原能力、总SOD活性，并改善了阿萨伊的滋气味，可作为功能性原料应用于食品、保健食品、药品和化妆品等行业中。

以下各实施例的发酵过程均在以下过程中的基础上对某些条件进行调整：

(1)原料准备：阿萨伊果清洗后进行打浆，巴氏杀菌后得阿萨伊果浆，-25℃保存待用；

(2)原料预处理：①匀浆：设定匀浆机转速5600r/min，匀浆时间15min；②调pH：调节pH值，从4.15调节至6～7；③酶解：加入质量含量为阿萨伊果浆0.05％的果胶酶、0.05％的纤维素酶，50℃，搅拌400rpm，酶解1h；④添加碳源、氮源：添加碳氮源并混合均匀(氮源小麦低聚肽(来源于北京中食海氏生物技术有限公司)的添加质量为阿萨伊果浆的2.5％、碳源葡萄糖的添加质量为阿萨伊果浆的0.5％)，调整pH至6.4～6.8；⑤灭酶：115℃、15min进行灭酶，得到阿萨伊果浆原液；

(3)菌种活化：将菌种接种于以MRS肉汤并添加1.25％～1.5％的小麦低聚肽培养基中，37℃，静置培养24h，菌种数量达到10⁷cfu/mL，再接种于阿萨伊果浆原液中静置发酵。

实施例1

菌种分别为肠膜明串珠菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、瑞士乳杆菌、发酵乳杆菌、戊糖片球菌，其中，肠膜明串珠菌保藏编号为CICC 22177、嗜酸乳杆菌保藏编号为CICC 20710、唾液乳杆菌保藏编号为CICC 23175、德氏乳杆菌保加利亚亚种保藏编号为CICC 20271、嗜热链球菌保藏编号为CICC 20370、瑞士乳杆菌保藏编号为CICC 20289、发酵乳杆菌保藏编号为CICC 22808、戊糖片球菌保藏编号为CICC 23190，以上菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。副干酪乳杆菌保藏编号为CGMCC NO:14813，植物乳杆菌保藏编号为CGMCC NO:14812。

除肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌外，其余菌株发酵阿萨伊时，酸度没有明显变化。为了同时兼顾不同发酵温度下的风味口感，选取上述4株菌种进行后续试验，定期取样并测定ORAC值，具体测定结果如表1-1和图1所示。结果显示，随着发酵时间的延长，ORAC值呈现不规律的增减趋势，这说明，阿萨伊经过菌种发酵，自身的物质被微生物利用转化。不同菌种也呈现不一样的变化规律，肠膜明串珠菌在第二天的ORAC值达到最高148.96±5.48μmol/L Trolox，嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌在第三天就达到最高，分别为167.02±5.16μmol/L Trolox和154.34±4.17μmol/L Trolox，而副干酪乳杆菌在第6天才达到最高147.05±4.39μmol/L Trolox。这可能与不同菌种的代谢特性存在差异性有关，因此考虑对菌种进行复配优化，协同发酵，使每株菌种在不同发酵阶段起到不同作用，提高ORAC值。另外，在37℃的发酵温度下，阿萨伊发酵液会有脂肪腐败的不愉快味道，因此考虑降低温度以避免因脂肪腐败导致风味变化。

表1-1四种菌发酵后阿萨伊发酵液的ORAC值

阿萨伊原液在30℃下放置7天，味道没有明显变化，可以作为发酵温度。嗜酸乳杆菌在30℃下发酵后总酸没有增加，ORAC值无明显变化，可能是在此温度下嗜酸乳杆菌不能正常生长繁殖。因此，选择副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌3株作为后续发酵优化菌种，对应的ORAC值最高分别提高了33.19％、30.57％和14.05％。进一步地，三种菌发酵过程的ORAC值测定结果表1-2和图2所示。

表1-2三种菌发酵后阿萨伊发酵液的ORAC值

实施例2

(1)单因素试验

①接种量的影响

在氮源添加量为2wt％、发酵时间为8天、发酵温度为30℃、菌种比例为1:1:1的条件下，考察不同接种量(0.9wt％、1.5wt％、2.1wt％、2.7wt％、3.3wt％)对发酵液中ORAC值的影响。如图3所示，在接种量为1.5wt％的条件下，发酵液的ORAC值最高，随着接种量的增加，ORAC值逐渐降低，因此选择1wt％、1.5wt％和2wt％作为后续正交试验水平的1、2、3。

②菌种比例的影响

在氮源添加量为2wt％、发酵时间为8天、发酵温度为30℃、接种量为1.5wt％的条件下，考察不同菌种重量比例(副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝0.2:1:1.8、0.5:1:1.5、1:1:1、1.5:1:0.5、1.8:1:0.2)对发酵液中ORAC值的影响。如图4所示，随着副干酪乳杆菌比例的增加，植物乳杆菌比例的减少，发酵液ORAC值逐渐升高，当比例达到1:1:1，发酵液的ORAC值最高，随后又逐渐降低。因此选择0.5:1:1.5、1:1:1和1.5:1:0.5作为后续正交试验水平的1、2、3。

③氮源添加量的影响

在接种量为1.5wt％、发酵时间为8天、发酵温度为30℃、菌种比例为1:1:1的条件下，考察不同氮源添加量(1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％)对发酵液中ORAC值的影响。如图5所示，随着氮源添加量的逐渐增加，发酵液ORAC值逐渐升高，在添加量为2wt％的条件下，达到最高值，随后又逐渐降低。综合考虑成本的情况下，选取1.5wt％、2wt％和2.5wt％作为后续正交试验水平的1、2、3。

④发酵温度的影响

在接种量为1.5氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽％、发酵时间为8天、氮源添加量为2氮源包括相对于阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽％、菌种比例为1:1:1的条件下，考察不同发酵温度(24℃、27℃、30℃、33℃、37℃)对发酵液中ORAC值的影响。如图6所示，随着发酵温度的逐渐增加，发酵液ORAC值基本呈逐渐升高趋势，在30℃和37℃的条件下，ORAC值达到最高值。但考虑到37℃下，发酵后有不愉快风味，且考虑到乳酸菌的生长繁殖特性，则直接选取30℃作为后续发酵温度，后续不再作为优化参数。

⑤发酵时间的影响

在接种量为1.5wt％、发酵温度为30℃、氮源添加量为2wt％、菌种比例为1:1:1的条件下，考察不同发酵时间(2天、4天、6天、8天、10天)对发酵液中ORAC值的影响。如图7所示，随着发酵时间的延长，发酵液ORAC值呈先降低，后升高，再降低趋势，在第6天，发酵液ORAC值达到最高值。则选取6天、8天和10天作为后续正交试验水平的1、2、3。

(2)正交试验

以接种量(A)、菌种比例(B)、发酵时间(C)、氮源添加量(D)为试验因素，采用四因素三水平进行正交试验，结果见表2-1。根据正交试验优化的结果，由极差R值可知，阿萨伊经复合乳酸菌发酵后ORAC值高低的影响因素主次顺序均为接种量＞氮源添加量＞发酵时间＞菌种比例，最优发酵工艺条件组合为A₁B₁C₁D₃，即接种量为1％，菌种比例为副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝0.5:1:1.5，发酵时间为6d，氮源添加量为2.5％。通过验证，在此最佳条件下，发酵液的ORAC值为273.28±6.55μmol/L Trolox，比原液的ORAC值提高了55.85％，没有异味，有阿萨伊特定风味。

表2-1

实施例3

将阿萨伊果浆按照接种量为1.5wt％，氮源添加量为2.5％，菌种比例为副干酪乳杆菌：肠膜明串珠菌：植物乳杆菌＝0.5:1:1.5进行接种，静置于30℃进行发酵，发酵时间为6d制备成的阿萨伊发酵物，其中肠膜明串珠菌CICC 22177，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。副干酪乳杆菌和植物乳杆菌为实验室自行分离鉴定，保藏于中国普通微生物菌保藏管理中心，副干酪乳杆菌保藏编号为CGMCC14813和植物乳杆菌保藏编号CGMCC14812。

将实施例和对比例(即阿萨伊果浆)进行冷冻干燥后与海砂混合充分研磨，经过有机溶剂进行萃取，测定其亲水性ORAC值(H-ORAC值)、亲油性ORAC值(L-ORAC值)、DPPH自由基清除能力(图10)、羟基自由基清除能力(图11)、ABTS自由基清除能力、FRAP值、总SOD活性。

其中，ORAC是氧自由基吸收能力(Oxygen Radical Absorbance Capacity)的缩写。其中H-ORAC值用于评价水溶性抗氧化物质的ORAC值。不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线和标准曲线如图8和图9所示，y＝0.0874x-0.0795，R2＝0.9998。根据标准曲线，计算H-ORAC值。发酵后，阿萨伊的H-ORAC值由453.64±24.28μmol/g Trolox提高到708.77±12.46μmol/g Trolox，提高了56.24％。

通过RMCD将脂溶性物质纳入其空腔而增加水溶性，用于测定L-ORAC值，来评价脂溶性物质的氧自由基吸收能力。根据标准曲线，计算阿萨伊果浆和发酵液的L-ORAC值。发酵后阿萨伊样品的L-ORAC值由141.80±10.40μmol/g Trolox提高到168.28±13.18μmol/g，提高了26.48％。

DPPH自由基清除能力是利用电子转移和电荷中和原理，评价物质抗氧化能力的一项重要指标。DPPH自由基在有机环境中是一种稳定的N离子自由基，在517nm波长处具有最大吸收峰。当体系中有自由基清除剂时，DPPH自由基的单电子被清除剂中和，其溶液颜色由紫色变为浅黄或无色，直接表现为吸光度数值的下降。

羟基自由基是在生物系统中形成的极其活泼的自由基，其可以引发细胞膜的脂质过氧化，对人体危害性极高。其中羟自由基清除能力呈明显的量效关系，在实验浓度范围内与浓度呈正相关。

以ABTS为显色引发剂，其原理为加入氧化剂后，ABTS试剂在水溶液环境中可生成稳定的蓝绿色自由基ABTS+，并在734nm处有最大吸收。加入抗氧化性物质后ABTS+的电荷被中和，颜色变浅吸光值随之下降，下降趋势可反应出所检测物质抗氧化性的强弱。根据Trolox标准品绘制的ABTS标准曲线如图12所示。

铁还原能力(Ferric reducing antioxidant power，FRAP)是一种快速且简单的抗氧化能力检测指标，可作为测定物质还原能力的一种方法。根据图13所示的FeSO₄标准曲线，计算样品的FRAP值，FRAP值越大，抗氧化能力越强。

超氧化物歧化酶(SOD)是一类重要的抗氧化酶，广泛存在与人类和各种生物中，具有很强的抗氧化作用，能够清除体内超氧离子自由基，保护机体免受自由基的伤害，在抗癌、抗衰老、抗炎症、抗辐射等疾病中具有不可忽视的作用。

再采用气相色谱-质谱联用仪(配EI离子源)进行挥发性香气成分测定，采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析化学成分，此外对阿萨伊发酵前后的冻干粉进行感官评价测定，结果如下。其中的冷冻干燥工艺为：样品提前预冻1h，温度达到-40℃～-30℃，转入干燥阶段，真空度20Pa以下，冷冻干燥24～30h。

表3-1

名称	阿萨伊果浆冻干粉	阿萨伊发酵液冻干粉
			H-ORAC(μmol/g Trolox)	453.64±24.28	708.77±12.46
L-ORAC(μmol/g Trolox)	141.80±10.40	168.28±13.18
			ABTS(mmol/g Trolox)	0.44±0.03	0.45±0.08
FRAP(mmol/g FeSO<sub>4</sub>)	0.43±0.01	0.55±0.02
			SOD酶活力(units)	0.78±0.04	1.35±0.01

从抗氧化值的测定可以看出，发酵前后阿萨伊样品的ORAC值(H-ORAC值+L-ORAC值)分别为595.45±30.71、877.05±20.58μmol/g Trolox，发酵后ORAC值提高了47.29％。发酵后DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、FRAP值、总SOD活性都有所提高。

阿萨伊果浆和发酵液的气质色谱图如图23和图24所示，经计算，两种阿萨伊产品的挥发性香气成分结果表3-2所示。

表3-2阿萨伊果浆和发酵液的挥发性成分

果浆的挥发性香气成分为4种，含量由高到低分别为正丙醇、乙醛、异戊醇、乙酸乙酯，发酵液产生挥发性香气成分7种，含量由高到低分别为正丙醇、异戊醇、乙醛、异丁醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、二甲基硫。发酵后挥发性成分含量提高，并且增加了异丁醇、甲酸乙酯、二甲基硫3种挥发性成分。由此可知，通过发酵工艺可以改善阿萨伊的产品风味。

感官评价采用评分检验法，对发酵前后的阿萨伊冻干粉进行感官评定，评价指标有色泽、香味、滋味，各指标的评分标准见表3-3感官综合评分为三个指标评分之和，即感官综合评分＝色泽评分+香味评分+滋味评分。

表3-3感官评价标准

感官评价共有30位有品尝经验的工作人员作为评价员进行评分，统计评价结果如表3-4所示，进行分析。

表3-4感官评价表

由表3-4可以看出，实施例3制作的阿萨伊发酵液冻干粉具有较好的口感、香味和色泽。

另外，还对阿萨伊果浆和所得到的发酵液进行基础理化成分含量、氨基酸组成和γ-氨基丁酸含量、有机酸含量、黄酮含量进行检测。

对阿萨伊果浆和发酵液的理化成分(水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚、原花青素)进行了分析，分析方法分别依据：GB 5009.3、GB 5009.4、GB 5009.5、GB 5009.6、NY/T 1600、DB12/T 885，由表4-1可见，阿萨伊果浆的水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚和原花青素含量分别为88.99±0.12、0.02±0.00、1.30±0.07、3.60±0.16、0.82±0.03、0.44±0.04g/100g，阿萨伊发酵液的水分、灰分、蛋白质和脂肪、多酚和原花青素含量分别为89.09±0.15、0.26±0.01、2.77±0.06、2.99±0.18、0.50±0.02、0.12±0.01g/100g，发酵后，阿萨伊的水分、灰分、蛋白质含量提高，脂肪、总多酚、原花青素含量降低。

表4-1阿萨伊原液和发酵液的基础理化成分

阿萨伊果浆和发酵液的游离氨基酸含量分别如表4-2所示。发酵后，阿萨伊的氨基酸含量有所提高，与蛋白质测定结果一致。阿萨伊果浆中丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸含量较高，发酵液中亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量较高。这些氨基酸共同赋予了阿萨伊产品酸甜鲜的滋味。

γ-氨基丁酸是微生物代谢产生的生理活性物质，是某些发酵产品中含量丰富的抑制性神经递质，具有降血压、抗惊厥、改善脑机能和调节睡眠的作用。图14为γ-氨基丁酸混标图谱，图15、图16分别为阿萨伊原液和发酵液的γ-氨基丁酸的测定图谱。经计算，阿萨伊果浆和发酵液的γ-氨基丁酸含量分别为0.004g/100mL、0.006g/100mL，由此可见，发酵后阿萨伊的γ-氨基丁酸含量有所提高。

表4-2阿萨伊果浆和发酵液的游离氨基酸含量

有机酸标准品的离子色谱图见图17-a和17-b，阿萨伊果浆冻干粉和发酵液冻干粉的有机酸测定图谱如图18-a和18-b、图19-a和19-b所示。经计算，有机酸含量结果如表4-3所示。发酵后，阿萨伊的有机酸总含量提高。阿萨伊原液中柠檬酸、丙酸、乳酸含量较高，发酵后乳酸、乙酸、丙酸含量较高。乳酸菌是一类发酵碳水化合物产生乳酸的微生物，经过发酵，阿萨伊中的总酸含量明显提高，其中乳酸含量提高最多。

表4-3阿萨伊果浆和发酵液的有机酸含量

黄酮标准品的液相色谱图见图20，阿萨伊果浆和发酵液的9种黄酮的液相色谱图见图21、图22。经计算，黄酮含量结果如表4-4所示。发酵后，阿萨伊的9种黄酮总含量降低。阿萨伊原液中4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、5’羟基-桔皮素含量较高，发酵后甜橙黄酮、桔皮素、3’,4’羟基-川陈皮素含量较高。

表4-4阿萨伊果浆和发酵液的黄酮含量

进一步对发酵前后的样品进行扫描电镜分析，

利用扫描电镜从整体形态、颗粒大小等方面对阿萨伊发酵前后样品的微观形貌进行研究。分别在500倍和1000倍放大倍数下对阿萨伊果浆和发酵液的冻干粉进行扫描电镜观察，结果见图25、图26。可以看出，发酵前阿萨伊成不规则块状，发酵后，阿萨伊颗粒发生明显变化，呈现出不规则的片层状及桥状骨架。可能是由于发酵工艺中的均质、酶解以及复合乳酸菌发酵作用使得阿萨伊发酵前后微观形貌发生变化。

总结：

(1)利用扫描电镜从整体形态、颗粒大小等方面对阿萨伊发酵前后样品的微观形貌进行研究。分别在500倍和1000倍放大倍数下进行扫描电镜观察，可以看出，发酵前阿萨伊成不规则块状，发酵后，阿萨伊颗粒发生明显变化，形成不规则的片层状及桥状骨架。

(2)通过电子舌系统对阿萨伊发酵前后样品的5种基本味(酸、涩、苦、咸、鲜)和甜味进行评价。结果显示，阿萨伊原液和发酵液在甜味和酸味上存在一定差异，发酵后，阿萨伊甜味减少，酸味增加。

(3)阿萨伊原液和发酵液的理化成分(水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚、原花青素)测定结果表明，阿萨伊原液的水分、灰分、蛋白质、脂肪、多酚和原花青素含量分别为88.99±0.12、0.02±0.00、1.30±0.07、3.60±0.16、0.82±0.03、0.44±0.04g/100g，阿萨伊发酵液的水分、灰分、蛋白质和脂肪、多酚和原花青素含量分别为89.09±0.15、0.26±0.01、2.77±0.06、2.99±0.18、0.50±0.02、0.12±0.01g/100g，发酵后，阿萨伊的水分、灰分、蛋白质含量提高，脂肪、总多酚、原花青素含量降低。

(4)氨基酸(水解氨基酸和游离氨基酸)组成分析结果表明，发酵后，阿萨伊的氨基酸含量有所提高。水解氨基酸测定结果显示，阿萨伊原液中谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸含量较高，发酵液中谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量较高。游离氨基酸测定结果显示，阿萨伊原液中丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸含量较高，发酵液中亮氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量较高。

(5)γ-氨基丁酸测定结果表明，阿萨伊原液和发酵液的γ-氨基丁酸含量分别为0.004、0.006g/100mL，发酵后阿萨伊的γ-氨基丁酸含量有所提高。

(6)通过离子色谱图对阿萨伊原液和发酵液的8种有机酸含量进行了分析，结果表明，发酵后，阿萨伊的8种有机酸总含量提高。阿萨伊原液中柠檬酸、苹果酸、酒石酸含量较高，发酵后乳酸、乙酸、丙酸含量较高。发酵后乳酸含量明显得到提高。

(7)通过高效液相色谱对阿萨伊原液和发酵液的9种黄酮含量进行了分析，结果表明，发酵后，阿萨伊的9种黄酮总含量降低。阿萨伊原液中4’羟基-川陈皮素、甜橙黄酮、5’羟基-桔皮素含量较高，发酵后甜橙黄酮、桔皮素、3’4’羟基-川陈皮素含量较高。

(8)通过气相色谱-质谱联用仪对阿萨伊原液和发酵液的挥发性香气成分进行了分析，结果表明，原液的挥发性香气成分为4种，发酵液产生挥发性香气成分7种，发酵后挥发性成分含量提高，并且增加了异丁醇、乙酯、甲酸乙酯、二甲基硫4种挥发性成分。

(9)通过液相色谱-质谱联用仪对阿萨伊原液和发酵液的化学成分进行了分析，主要分析鉴定出了98个化学成分，多为黄酮类、有机酸类、花青素类及其他种类化学成分。发酵前后化学成分种类和含量有所变化，在发酵的过程中，发酵菌种通过产生多种酶类以及其他初级、次级代谢产物，对阿萨伊进行分解代谢，能够将许多人体不能直接吸收利用的大分子化合物降解成小分子化合物，并产生新的活性物质和新的功能。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阿萨伊的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括

步骤S1，制备阿萨伊果浆原液；

步骤S2，利用微生物对所述阿萨伊果浆原液进行发酵处理，得到阿萨伊的发酵产物，其中，所述微生物选自副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述微生物包括所述副干酪乳杆菌、所述肠膜明串珠菌和所述植物乳杆菌，优选所述副干酪乳杆菌、所述肠膜明串珠菌和所述植物乳杆菌的重量比为0.2～12:0.5～1.5:0.2～2，优选为0.5～1.5:1:1.5～0.5。

3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述发酵的温度为24～40℃，优选为30～37℃、优选所述发酵的时间为1～10天，进一步优选发酵的时间为5～8天。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

将所述微生物接种在MRS培养基中进行扩大培养，得到活化菌种，优选所述活化菌种中所述微生物的菌种数量在10⁶～10⁸CFU/mL；

将所述活化菌种与所述阿萨伊果浆原液混合进行发酵处理，得到所述阿萨伊的发酵产物，优选所述活化菌种的接种量为0.1～4wt％。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

步骤S11，将所述阿萨伊进行打浆，得到阿萨伊果浆；

步骤S12，对所述阿萨伊果浆进行酶解和灭酶，得到所述阿萨伊果浆原液，所述酶解采用果胶酶和/或纤维素酶进行。

6.根据权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，所述步骤S12包括：

将所述阿萨伊果浆进行匀浆处理后调节所述阿萨伊果浆的pH值至5.5～7.5之间，得到预处理果浆，优选所述匀浆的转速为5000～6000r/min、时间为10～20min；

将所述预处理果浆与果胶酶和/或纤维素酶混合后进行所述酶解，得到酶解后果浆，优选所述果胶酶相对于所述预处理果浆的质量比例为0.01～0.10:100，优选所述纤维素酶相对于所述预处理果浆的质量比例为0.02～0.12:100；

酶解后，对所述酶解后果浆中的果胶酶和/或所述纤维素酶进行灭酶处理，得到所述阿萨伊果浆原液。

7.根据权利要求5或6所述的发酵方法，其特征在于，所述酶解的温度为40～60℃，所述酶解的时间为0.5～3h，优选所述酶解过程中进行搅拌，所述搅拌的速度为300～500r/mim。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的发酵方法，其特征在于，在所述酶解和所述灭酶处理之间，所述步骤S12还包括：

将所述酶解后果浆、碳源和氮源混合形成混合体系并将所述混合体系的pH值调节至6～7，优选所述氮源包括相对于所述阿萨伊原液重量1～3％的小麦低聚肽，所述碳源包括相对于所述阿萨伊原液重量0.2～1％的葡萄糖。

9.根据权利要求5至7中任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述灭酶的温度在95～120℃之间、灭酶时间为10～20min。

10.一种阿萨伊的发酵产物，其特征在于，所述发酵产物采用权利要求1至9中任一项所述的发酵方法得到。

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