ES2384654T3

ES2384654T3 - Sistema antimicrobiano e inmunoestimulador que incluye una enzima oxidorreductasa

Info

Publication number: ES2384654T3
Application number: ES07827107T
Authority: ES
Inventors: John Reginald Barrett; James Joseph Brennan; Thomas Patrick Patton
Original assignee: INSTITUTE OF Tech SLIGO
Current assignee: INSTITUTE OF Tech SLIGO
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2007-10-05
Publication date: 2012-07-10
Anticipated expiration: 2027-10-05
Also published as: US20140023597A1; MX2009003683A; AU2007303769A1; AU2007303769B2; EP2068949A1; US20100135926A1; CA2665531C; GB0619786D0; US9522177B2; JP5563822B2; IL197900A; JP2010505817A; EP2068949B1; ZA200902992B; ATE549040T1; NZ576754A; HK1128637A1; CA2665531A1; IE20070710A1; WO2008041218A1

Abstract

Sistema inmunoestimulante y antimicrobiano estable en su almacenamiento que incluye glucosa oxidasa, D-glucosa,azúcares añadidos elegidos entre uno o varios entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa y peróxido de hidrógeno enuna solución acuosa, en el que la glucosa o xidasa se encuentra presente en una actividad de, al menos, U para 100gdel sistema;la D-glucosa se encuentra presente de un 20 a un 85% en peso, respecto al peso del sistema total;los azúcares adicionales elegidos entre uno o varios entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa se encuentranpresentes de un 5 a un 70% en peso, respecto al peso del sistema total;el agua se encuentra presente de un 10 a un 20% en peso, respecto al peso del sistema total;el sistema tiene un pH aproximadamente de 4 a 8; y en el que el sistema facilita una liberación de hidrógeno en dosetapas en la que(a) el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena y estable en su almacenamiento es biodisponible enel sistema con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata; y(b) la liberación prolongada de peróxido de hidrógeno adicional durante, al menos, un periodo de veinticuatrohoras, se produce en el momento de la rehidratación del sistema.

Description

Sistema antimicrobiano e inmunoestimulador que incluye una enzima oxidorreductasa

Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a un sistema antimicrobiano e inmunoestimulatorio, a sus aplicaciones y a un procedimiento para la producción de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulatorio.

Antecedentes de la invención

Las composiciones antimicrobianas conocidas incluyen tratamientos convencionales como antisépticos y antibióticos. Otros tratamientos incluyen geles con plata, compuestos con metales pesados y soluciones de peróxido de hidrógeno y sustancias activas naturales y farmacéuticas sintéticas. Sin embargo, los tratamientos con antibióticos presentan desventajas a causa de la aparición de una resistencia a estos. Asimismo, unos niveles elevados de peróxido de hidrógeno tienen un efecto tóxico. Por otro lado, el peróxido de hidrógeno en una solución es normalmente inestable y resulta difícil proporcionar un sistema de entrega prolongado para este material. De ahí que se hayan desechado por muchas razones los tratamientos antimicrobianos convencionales.

Asimismo, existen muchos sistemas antimicrobianos producidos de forma natural basados en la capacidad de determinados agentes oxidantes para alterar los procesos metabólicos de bacterias, hongos y virus. Por ejemplo, la WO 03/090800 se refiere a los apósitos que incluyen los hidrogeles hidratados y las enzimas. En concreto, esta patente describe la necesidad de mantener el sustrato de la enzima físicamente separada de la enzima oxidorreductasa antes del uso del apósito. Esto evita una reacción no garantizada y no deseada, tal y como indica la WO 03/090800. Por lo tanto, el apósito de la WO 03/090800 solo funciona cuando se ha utilizado o aplicado a una herida, es decir, después de entrar en contacto con un sustrato de enzima apropiado.

Asimismo, recientemente ha vuelto a resurgir el interés por la eficacia terapéutica de la miel, en concreto, en el ámbito de la curación de heridas. Como producto natural, la miel ofrece una alternativa atractiva a los tratamientos convencionales. Incluso si la miel se ha utilizado durante centenares de años para el tratamiento de las heridas, solo ha sido recientemente cuando se han buscado sus propiedades antibacterianas. Esta investigación sostiene que la actividad antibacteriana de la miel se debe a varias propiedades clave incluida una presión osmótica elevada, un bajo contenido en agua, el agua disponible (Aw), un bajo pH resultante en un entorno acídico, un sistema de glucosa oxidasa derivado de la formación de peróxido de hidrógeno, un bajo contenido proteínico, un elevado índice de carbono respecto al nitrógeno, un bajo potencial de reducción-oxidación (Eh) debido al alto contenido de azúcares reductores, sus agentes químicos, la pinocembrina, la lisozima, los ácidos (fenólicos), los terpenos, el alcohol bencílico y/o las sustancias volátiles (probablemente, elementos fitoquímicos influenciados por enzimas de la abeja).

Algunos tipos de miel tienen una actividad antimicrobiana. Durante los últimos años, se ha reconocido que la miel de Manuka tiene una actividad superior que la mayoría de las mieles. La miel de Manuka proviene del árbol Manuka, Leptospermum scoparium, originario de Nueva Zelanda. La miel de Manuka es conocida por su uso en el tratamiento de infecciones que aparecen en heridas y por su actividad antibacteriana. La percepción habitual en este ámbito es que la Manuka contiene un factor antibacteriano único y se han realizado muchas investigaciones para intentar caracterizar esta sustancia antimicrobiana. Recientemente, se ha probado la Miel de Manuka para determinar y cuantificar su actividad antibacteriana y su factor antibacteriano único. Los investigadores de este ámbito han sometido la miel de Manuka a ensayos de neutralización de catalasa y han observado que, cuando la cantidad de catalasa añadida a las muestras de miel de Manuka es suficiente para destruir todo el peróxido de hidrógeno producido se sigue observando una actividad antibacteriana. Esto ha provocado que se perciba en este ámbito que se trata de un factor no peróxido, indicado en la literatura como Actividad no peróxida y factor único de la Manuka (UMF), presente en la miel de Manuka y que causa una actividad antibacteriana. Sin embargo, a pesar de la considerable cantidad de investigación dirigida a identificar la/s substancia/s que media/n en una actividad no peróxida o en el UMF, hoy en día, se desconoce la naturaleza de dicha actividad y dicha sustancia no ha sido claramente identificada.

Algunas de las desventajas asociadas a los tratamientos convencionales se han indicado anteriormente. Asimismo, la miel natural como agente antibacteriano presenta un gran número de desventajas. En primer lugar, la miel natural está compuesta por una mezcla diversa de componentes orgánicos e inorgánicos identificados y no identificados en diferentes concentraciones. A este respecto, se puede demostrar un nivel de variabilidad que puede ser inaceptable para su uso en diversas aplicaciones clínicas. En segundo lugar, la miel se utiliza principalmente para una aplicación tópica. Por ejemplo, si la miel se diluye por su absorción en el intestino, ésta se diluiría demasiado y no tendría ninguna actividad detectable. En último lugar, la miel es un producto natural con un gran número de compuestos adicionales y algunos de estos

pueden provocar una reacción alérgica en el momento de su aplicación. Por lo tanto, se necesita un sistema antimicrobiano que supere las desventajas anteriormente mencionadas y que pueda facilitar una actividad antibacteriana similar o mejor que la miel natural. En concreto, es necesario llevar a cabo más investigaciones sobre el papel antibacteriano de la miel de Manuka, sobre todo, para averiguar el mecanismo de su acción antibacteriana.

Por lo tanto, es necesario investigar estos tratamientos convencionales y naturales para generar más compuestos antimicrobianos sin el gran número de desventajas normalmente asociadas a dichos tratamientos.

De hecho, si las características positivas de dichos tratamientos convencionales y naturales pudieran utilizarse sin los efectos secundarios negativos o las propiedades nocivas se conseguiría un sistema antibacteriano mejorado alternativo de una importancia médica y comercial considerable.

Estado de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, existe un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable para su almacenamiento que incluye una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa;

en el que el sustrato para la enzima oxidorreductasa se encuentra presente hasta en un 90% en peso y el agua se encuentra presente hasta en un 20% en peso a partir del peso de la totalidad del sistema. El sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8 y el sistema libera peróxido de hidrógeno en dos etapas en las que

(a): el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena y estable para su almacenamiento es biodisponible en el sistema con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata; y

(b): la liberación prolongada de peróxido de hidrógeno adicional durante, al menos, un periodo de veinticuatro horas, se produce en el momento de la rehidratación del sistema.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se facilita un sistema, tal y como se ha definido, para su uso en un método terapéutico.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se facilita un sistema, tal y como se ha definido, para su uso en aplicaciones cosméticas.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se facilita un método de tratamiento de las infecciones microbianas y/o de reparación y/o regeneración de tejidos dañados y/o de células de un paciente, incluidos los pasos de aplicación de una cantidad eficaz del sistema, tal y como se ha definido, a una zona infectada de un paciente mediante una aplicación tópica, enteral y/o parenteral.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se facilita un proceso de fabricación de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en su almacenamiento que incluye una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa, tal y como se ha definido, que incluye las siguientes etapas

a.: calentar el agua hasta una temperatura de, al menos, 60º C, preferiblemente de alrededor de 75ºC a 95ºC;

b.: añadir el sustrato para la enzima oxidorreductasa al agua caliente para formar una solución de azúcar en el agua,

c.: enfriar la solución de azúcar en el agua hasta que alcance una temperatura inferior a alrededor de 40ºC para permitir la conservación de la actividad enzimática;

d.: añadir la enzima oxidoreductasa a la solución de azúcar en el agua de la etapa (c) agitándola para formar peróxido de hidrógeno en un índice controlado predeterminado; y

e.: enfriar la mezcla resultante derivada de la etapa (d) hasta una temperatura ambiente para producir una solución con peróxido de hidrógeno creado de forma endógena, estable en su almacenamiento y biodisponible, con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata.

Descripción detallada de la invención

En la especificación, los términos "antimicrobiano" o "antibacteriano" se utilizan de forma intercambiable y se refieren a la actividad biocida o bioestática contra diferentes tipos de microorganismos incluyendo, pero no de forma limitativa, las bacterias, hongos, virus, levaduras, microorganismos parasíticos o patogénicos y/o mohos.

En la especificación, el término “en peso”, “porcentaje de su peso” o “w/w %” se refiere al peso del compuesto o sistema final. Estos valores w/w son intercambiables con w/v.

De acuerdo con el principal aspecto de la presente invención, existe un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable para su almacenamiento que incluye una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa;

en el que el sustrato para la enzima oxidorreductasa se encuentra presente hasta en un 90% en peso y el agua se encuentra presente hasta en un 20% en peso a partir del peso de la totalidad del sistema. El sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8 y el sistema facilita una liberación de peróxido de hidrógeno en dos etapas en las que

De forma ventajosa, este sistema puede almacenarse de forma estable y se trata de un sistema con un solo componente listo para un uso inmediato que facilita una doble funcionalidad en términos de actividad antimicrobiana e inmunoestimuladora. Asimismo, hemos encontrado que el sistema de la presente invención presenta una eficacia mejorada en términos de efecto antimicrobiano e inmunoestimulador en comparación con la miel de Manuka y con los antimicrobianos convencionales como los apósitos de plata.

El efecto antimicrobiano del sistema de la presente invención se consigue por la liberación de peróxido de hidrógeno en dos etapas. De forma ventajosa, el sistema de la presente invención libera el peróxido de hidrógeno en dos etapas de una forma regulada, definida y reproducible.

Una de las principales ventajas del presente sistema es que facilita peróxido de hidrógeno estable para su almacenamiento para una liberación inmediata. Este depósito endógeno facilita peróxido de hidrógeno de forma inmediata y produce un efecto antimicrobiano inmediato. Esta es una de las considerables ventajas de la presente invención respecto a la miel natural y a los demás sistemas conocidos. De forma adicional, tras la rehidratación, el sistema facilita un segundo nivel de actividad de peróxido de hidrógeno que implica la liberación sostenida de peróxido de hidrógeno durante, al menos, un periodo de veinticuatro o cuarenta y ocho horas.

De acuerdo con una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena, estable en su almacenamiento, se encuentra biodisponible en el sistema a un nivel de, al menos, 10, preferiblemente, 75 mg de peróxido de hidrógeno por litro o partes por millón para su liberación inmediata. Sin embargo, se entiende que el nivel de peróxido de hidrógeno producido de forma endógena, inmediatamente biodisponible en el sistema, dependerá de la cantidad de enzima oxidorreductasa presente en el sistema. Por lo tanto, el nivel podría ser muy superior a 10 o 75mg de peróxido de hidrógeno por litro del sistema si el nivel de la enzima oxidorreductasa utilizado es elevado. De hecho, si se aumenta la concentración de enzima oxidorreductasa y/o el sustrato de la enzima oxidorreductasa, el conjunto de peróxido de hidrógeno endógeno aumentará. Por ejemplo, hemos encontrado que aproximadamente 175U de enzima oxidorreductasa para un sistema de 100g genera un conjunto endógeno de aproximadamente 10mg de peróxido de hidrógeno por litro. Asimismo, aproximadamente 1400U de enzima oxidorreductasa para un sistema de 100g genera un conjunto endógeno de aproximadamente 25mg de peróxido de hidrógeno por litro.

Esta reserva endógena inicial de peróxido de hidrógeno presente en el sistema se almacena de forma estable y permanece en el sistema hasta que se libera el segundo nivel de peróxido de hidrógeno. Este aspecto de estabilidad en su almacenamiento es otra ventaja de la presente invención. En el contexto de esta aplicación, el hecho de ser estable en su almacenamiento implica que el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena se mantiene en el sistema durante un periodo de aproximadamente 3 meses hasta aproximadamente 36 meses. Además, el sistema no se degrada, separa ni pierde actividad durante este periodo. La caducidad esperada para el sistema bajo unas condiciones normales es de aproximadamente 36 meses. Asimismo, cuando el sistema se somete a esterilización, por ejemplo, mediante radiación, éste no se deteriora en calidad ni actividad.

Con el uso o aplicación del sistema de la presente invención, se libera un segundo nivel de peróxido de hidrógeno cuando el nivel de peróxido de hidrógeno liberado sostenido producido en el momento de la rehidratación del sistema es de, al menos, 10 mg, preferiblemente de 20mg de peróxido de hidrógeno por litro o partes por millón. De Nuevo, el nivel de peróxido de hidrógeno liberado sostenido generado dependerá de la cantidad de enzima oxidorreductasa y/o de sustrato para la enzima oxidorreductasa presente en el sistema. Ventajosamente, se ha encontrado después del periodo establecido y la posterior dilución/ rehidratación que la cantidad de peróxido de hidrógeno liberado sostenido supera a la miel natural. Asimismo, hemos encontrado ventajosamente que la liberación sostenida de más peróxido de hidrógeno en el sistema de la invención se produce durante, al menos, un periodo de veinticuatro a cuarenta y ocho horas.

De forma general, el efecto inmunoestimulador del sistema de la presente invención se media con la interleukina-1. El sistema de la presente invención promueve la liberación de interleukina-1 (IL-1) de las células de la piel. La IL-1 es una citoquina también segregada por macrófagos, monocitos y células dendríticas. Se trata de una parte importante de la respuesta inflamatoria del cuerpo contra la infección. Aumenta la expresión de los factores de adhesión sobre las células endoteliales para permitir la transmigración de leucocitos a los lugares de la infección. También actúa sobre el centro termorregulador del cerebro aumentando la temperatura corporal en forma de fiebre. Por lo tanto, también se llama pirógeno endógeno. El aumento de la temperatura corporal ayuda al sistema inmune corporal a combatir la infección. Esta es la fase inicial de una respuesta inmune inflamatoria que aumenta la actividad antimicrobiana del sistema. La respuesta inflamatoria juega un papel central en la curación de las heridas mediante la defensa contra una posible infección y participando en la reparación y regeneración de la célula y el tejido. El efecto antimicrobiano del sistema de la presente invención se ve ayudado y complementado por un efecto inmunoestimulador que ayuda en la regeneración y reparación de los tejidos y/o células dañados.

El sistema de la presente invención se basa en los hallazgos inesperados de nuestra investigación que son contrarios a la percepción aceptada en este ámbito. Hemos establecido que el UMF no juega un papel en la actividad antimicrobiana/ antibacteriana de la miel de Manuka y que no se puede detectar peróxido de hidrógeno endógeno en la miel de Manuka diluida o no diluida. Hemos encontrado que la ruta de la glucosa oxidasa no se encuentra operativa en su aplicación inicial de la miel de Manuka y solo puede facilitar un efecto antimicrobiano después de la dilución de la miel tras un periodo de tiempo. Al contrario de la percepción común en este ámbito, concluimos que la eficacia antimicrobiana de la miel de Manuka se ve afectada por un contenido de agua disponible de crecimiento limitado, un pH inicial bajo marcado y la producción de peróxido de hidrógeno a través de la glucosa – solo en la ruta de la glucosa oxidasa.

El sistema de la presente invención utiliza ventajosamente estos nuevos e inesperados hallazgos y facilita un sistema que proporciona un nivel regulado, definido y reproducible de actividad antimicrobiana y demuestra una diferencia y aumento considerable en la actividad respecto al producto de miel natural. Por lo tanto, el sistema de la presente invención soluciona las diferentes desventajas en términos de variabilidad, actividad, viscosidad y componentes adicionales que pueden provocar una reacción alérgica asociada al producto de miel natural, la miel de Manuka.

Un beneficio adicional del sistema de la invención es la capacidad para alterar la cantidad de ingredientes activos y de excipientes permitiendo la producción de una gama de formulaciones con diferentes fuerzas y propiedades. Esto incluye la capacidad para optimizar el pH para el sitio de destino correspondiente.

Asimismo, el sistema de la presente invención permite un elevado nivel de control de la calidad en relación con la seguridad y la eficacia, consistencia de lote, determinación de potencia y mayor control de impurezas al mantener los requisitos actuales de Buena Práctica de Fabricación (cGMP).

Existe otra ventaja adicional del sistema de la presente invención que no provocará ninguna reacción alérgica gracias a su composición definida. De forma ventajosa, esto permite unas instrucciones de etiquetado precisas tal y como requiere la normativa de la UE en los productos farmacológicos activos.

Idealmente, la enzima oxidorreductasa se selecciona de uno o más de los siguientes compuestos: glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, colesterol oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa, colina oxidasa, piruvato oxidasa, glicolato oxidasa y/o aminoácido oxidasa. Se entiende que cada enzima oxidorreductasa actúa en un sustrato específico. Los sustratos correspondientes para estas enzimas oxidorreductasas son la D-glucosa, la hexosa, el colesterol, la Dgalactosa, la piranosa, la colina, el piruvato, el glicolato y/ o los aminoácidos, respectivamente. Se entenderá que se puede utilizar una mezcla de una o más enzimas de oxidorreductasa y uno o más sustratos de enzimas de oxidorreductasa Preferiblemente, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, galactosa oxidasa y/o piranosa oxidasa y el sustrato correspondiente para la enzima oxidorreductasa es la D-glucosa, la hexosa, la D-galactosa y/o la piranosa.

De acuerdo con una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa y el sustrato es D-glucosa.

Idealmente, el agua se encuentra presente en el sistema a un nivel de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 20% en peso, respecto al peso del sistema total. Más preferiblemente, el agua puede estar presente en el sistema a un nivel de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 15% en peso, respecto al peso del sistema total. La cantidad de agua presente inicialmente en el sistema es un aspecto crucial de la invención. La adición de un exceso de agua puede conducir a la inestabilidad del sistema puesto que un exceso de agua puede aumentar hasta provocar la hidrólisis de la glucosa oxidasa de manera que es importante que el agua solo esté inicialmente presente dentro de los parámetros definidos. Asimismo, el sistema necesita la suficiente agua para permitir la generación de H2O2, facilitar la aplicación y evitar la precipitación de azúcares durante el almacenamiento.

Idealmente, la enzima oxidorreductasa se encuentra presente en el sistema con una actividad de, al menos, 10U por 100g del sistema. De forma general, una unidad (U) es la cantidad de enzima que provoca la oxidación de un micromol de glucosa por minuto a 25ºC y con un pH de 7,0. Se entiende que habrá suficiente enzima oxidorreductasa presente para catalizar el sustrato y formar el peróxido de hidrógeno necesario. Preferiblemente, la enzima oxidorreductasa se encuentra presente en el sistema con una actividad de, al menos, 100U, 1400 U o incluso 5600U por 100g del sistema.

Idealmente, el sistema según cualquiera de las reivindicaciones tiene con un pH que va aproximadamente de 4 a 8, preferiblemente, de 5 a 7, y más preferiblemente de alrededor de 5,5. El pH es importante ya que juega un papel primordial en muchos aspectos terapéuticos de la presente invención, por ejemplo, la curación de heridas y también asegura que la oxidorreductasa tenga unas condiciones correctas para una actividad óptima. Por ejemplo, la miel de Manuka tiene un pH variable de alrededor de 4. Este pH es inapropiado para una actividad de la enzima oxidorreductasa óptima y no es apropiado para tratar las heridas. Por lo tanto, la capacidad para manipular el pH es deseable y es una considerable ventaja de la presente invención. Ventajosamente, el pH del presente sistema puede establecerse determinando el pH deseado para una determinada aplicación. Los agentes amortiguadores pueden utilizarse para manipular el pH. De forma opcional, el sistema también incluye un agente amortiguador, preferiblemente ácido carbónico/ bicarbonato y/o ácido fosfórico/ hidrogenofosfato disódico. Preferiblemente, el agente amortiguador se disuelve previamente y sustituye parte del agua del sistema. Se pueden utilizar diferentes concentraciones de agente amortiguador en función del pH que se desee obtener.

También opcionalmente, el sistema puede incluir azúcares añadidos. Con el término “azúcares añadidos” hacemos referencia a azúcares no incluidos en el término “sustrato para la enzima oxidorreductasa”. En esta situación, los azúcares añadidos pueden estar presentes de un 5% a un 80%, preferiblemente de un 10 a un 70% en peso respecto al peso total del sistema.

Idealmente, los azúcares añadidos se encuentran presentes en combinación con el sustrato para la enzima oxidorreductasa con un índice de azúcares añadidos en el sustrato de aproximadamente 10:1 a 0.01:1, preferiblemente, de 3.5:1 a 0.05:1. El índice superior preferido de 3.5:1 se basa en un sustrato mínimo de contenido de enzima oxidorreductasa de un 20%, un contenido de agua mínimo de un 10% y un contenido de azúcar añadido máximo de un 70%. El índice inferior preferido de 0.05:1 se basa en un sustrato máximo para el contenido de enzima oxidorreductasa del 85%, un contenido mínimo de agua de un 10% y un contenido de azúcares añadidos de un 5%.

Por lo tanto, de acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, el sustrato para la enzima oxidorreductasa, preferiblemente glucosa, se encuentra presente de 20 a 85 w/w% y los azúcares añadidos, preferiblemente sacarosa, fructosa y/o maltosa, se encuentran presentes de 5 a 70 w/w%. Al menos, 10 w/w% de agua se encuentra presente.

En otra forma de realización preferida de este aspecto de la invención, los azúcares añadidos pueden seleccionarse de uno o más de los siguientes compuestos: sacarosa, fructosa y/o maltosa. Idealmente, el sustrato para la enzima oxidorreductasa, preferiblemente glucosa o cualquier otro sustrato apropiado y los azúcares añadidos se encuentran presentes en el sistema dentro de los siguientes rangos (a partir del peso de la totalidad del sistema):

Sustrato para la enzima oxidorreductasa: Rango (w/w%)

Glucosa: De 10 a 85

Azúcares añadidos

Fructosa: De 8 a 50

Maltosa: De 4 a 15

Sacarosa: De 0,5 a 3

Idealmente, el índice de sustrato de fructosa para la enzima oxidorreductasa es: maltosa: la sacarosa es de aproximadamente 1.5:4:2:1 a aproximadamente 3.5:4:1:0.1. Un índice preferido es aproximadamente de 4.5:4:1:1.7.

De acuerdo con otro forma de realización de este aspecto de la invención, el sistema también puede incluir, al menos, un 10 ingrediente modificador de la viscosidad. Idealmente, el ingrediente modificador de la viscosidad se selecciona entre los siguientes compuestos:

Metilcelulosa Carboximetilcelulosa

15 Hidroxipropilmetilcelulosa Hidroxietilcelulosa Hidroxipropilcelulosa Carbopol Alcohol polivinílico

20 Pirrolidona polivinílica Aceites vegetales hidrogenados Goma xantana u otras gomas naturales Polietileno glicoles (con un peso molecular bajo y elevado) Parafina (líquida, semisólida y sólida) y/o

25 Glicerol.

También se pueden utilizar otros ingredientes convencionales que modifiquen la viscosidad.

De forma opcional, los ingredientes que modifican la viscosidad pueden ser azúcares añadidos, tal y como se ha definido 30 anteriormente. Por ejemplo, un cambio en los índices de los azúcares añadidos puede provocar un aumento o disminución correspondiente de la viscosidad del sistema.

Se entiende que los azúcares añadidos y/o los ingredientes que modifican la viscosidad se añaden para facilitar las propiedades físicas necesarias para la aplicación específica del sistema. Por ejemplo, si el sistema se utiliza de forma

35 tópica, debe contar con la viscosidad suficiente para adherirse a la superficie de aplicación. En esta situación, puede ser aconsejable utilizar un ingrediente que modifique la viscosidad y/o los índices presentes de azúcares añadidos. En otra situación, puede resultar ventajoso modificar la viscosidad de manera que el sistema pueda ser una preparación intramamaria eficaz.

40 De acuerdo con una forma de realización preferida de este aspecto de la presente invención, se facilita un sistema inmunoestimulante y antimicrobiano estable para su almacenamiento que incluye glucosa oxidasa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa;

en el que la D-glucosa se encuentra presente hasta en un 90%, preferiblemente el 85% en peso y el agua se encuentra 45 presente hasta en un 20% en peso de la totalidad del sistema. El sistema tiene un pH de aproximadamente 4 a 8 y el sistema facilita una liberación de peróxido de hidrógeno en dos etapas en la que

De acuerdo con otra forma de realización de este aspecto de la invención, se facilita un sistema de componente único inmunoestimulatorio y antimicrobiano que puede almacenarse de forma estable que incluye

a.: una solución saturada de azúcares que incluye glucosa y agua con un índice de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 5:1 en la que el agua se encuentra presente hasta un 20% en peso respecto a la totalidad de la composición.

b.: de aproximadamente 0,01% a un 1% del peso de la glucosa oxidasa; y

c.: peróxido de hidrógeno derivado de forma endógena para una liberación inmediata;

en el que la composición tiene un pH de aproximadamente 4 a 8, la biodisponibilidad del peróxido de hidrógeno se mantiene en el sistema y se produce una liberación sostenida de más peróxido de hidrógeno durante la rehidratación.

El sistema de la presente invención puede tener diferentes formas físicas, incluyendo pero no de forma limitativa, preparaciones líquidas, sólidas o semisólidas. Para preparar formulaciones sólidas o semisólidas, los ingredientes del sistema deberían ser manipulados para reducir el contenido de agua y aumentar el contenido de otros componentes.

El sistema de la presente invención puede tener la forma de una preparación líquida. Las preparaciones líquidas incluyen, pero no de forma limitativa, jarabes, pasta, esprays, gotas, pomadas, cremas, lociones, aceites, linimentos y/o geles. Un gel convencional incluye un gel alcohólico como el isopropanol, el etanol o el propanol y/ o un hidrogel.

De forma alternativa, el sistema de la presente invención puede tener la forma de una preparación sólida o semisólida. Unas preparaciones sólidas o semisólidas incluyen, pero no de forma limitativa, cápsulas, gránulos, cápsulas en gel, hidrogeles, pastillas, píldoras y/ o glóbulos. Se puede adoptar otro medio utilizado para la administración de medicamentos, por ejemplo, se puede contemplar la administración liposomal.

De acuerdo con una forma de realización preferida de la invención, se facilita una composición farmacéutica que incluye el sistema de la invención junto con, al menos, un excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra forma de realización, se facilita un apósito que incluye el sistema o la composición farmacéutica de la invención. Dichos apósitos incluyen gasas, vendajes, películas, geles, espumas - Lyofoam®, hidrocoloides-Granuflex®, alginatos - Kaltostat ® (Comvita), hidrogeles - Intrasite Gel® y pastas polisacáridas, gránulos y gotas.

De acuerdo con una forma particular de realización de la invención, el sistema puede estar presente con una matriz del apósito. Idealmente, el índice del sistema respecto a la matriz del apósito puede ser de aproximadamente 1:1, aunque se contemplan otros índices. La matriz del apósito puede ser un colágeno o una matriz de colágeno-GAG (glicosaminoglicano).

Se entiende que el sistema o la composición farmacéutica de la invención puede estar presente en diferentes formas de administración. Estas formas incluyen, pero no de forma limitativa, las formas adaptadas a la administración, tópica, enteral o parenteral.

Las formas apropiadas para la administración tópica incluyen ungüentos, cremas, lociones, aceites, linimentos, líquidos y/o geles tópicos. Por ejemplo, el sistema de la presente invención puede aplicarse, de forma epicutánea, intranasal, intraocular y/o mediante gotas para los oídos. Una forma de realización particular de este aspecto de la invención facilita el sistema o la composición farmacéutica de la invención en una forma adaptada para la administración intramamaria. En esta situación, el sistema o la composición farmacéutica de la invención puede adaptarse para su administración como parte de un sellador de pezones y una reserva intramamaria administrada a través del conducto del pezón. Otras composiciones pueden adaptarse como tejidos, vendajes o apósitos. Esto resulta particularmente ventajoso para el tratamiento de infecciones como la mastitis y tiene aplicaciones tanto médicas como veterinarias.

Otra forma apropiada para la administración tópica incluye el sistema o la composición farmacéutica de la invención cuando el sistema o la composición tiene una forma adaptada para la administración mediante una banda o bandas de película soluble. En esta situación, el sistema de la presente invención es soluble en el momento de su aplicación.

La administración enteral incluye, pero no de forma limitativa, la administración oral. Otras formas de administración oral incluyen supositorios y enemas. Las formas apropiadas para su administración oral incluyen las cápsulas, gránulos, cápsulas de gel, pastillas, píldoras, glóbulos, hilo dental, pasta de dientes, enjuague bucal, bandas de película soluble y/o formas adaptadas para su administración como parte de un protector bucal. De acuerdo con otra forma de realización de este aspecto, el sistema o la composición farmacéutica es una forma apropiada para una administración controlada o para una liberación sostenida. Por ejemplo, la forma de administración oral puede tener un revestimiento entérico para facilitar una administración controlada o con una liberación sostenida. Este aspecto de liberación sostenida es importante para el tratamiento de infecciones de campylobacter en las aves y para el tratamiento de infecciones con criptosporidium en el ganado.

Las formas de administración parenteral incluyen, pero no de forma limitativa, la inyección. Por ejemplo, el sistema puede adaptarse a la inyección mediante la administración intramamaria. Esto resulta particularmente útil para el tratamiento de la mastitis. La inyección intramamaria realizada de esta forma implica la inyección directa en el conducto del pezón mediante un tubo o jeringa con una boquilla del tamaño apropiado, por ejemplo, de alrededor de 1,0mm. En esta situación, la inyección se dirige a una cavidad o absceso del cuerpo.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el sistema puede estar presente en otra forma y para otro uso junto con una composición cosmética. Idealmente, el sistema de la presente invención se encuentra en, al menos, un excipiente o adyuvante cosmético. Dichos excipientes o adyuvantes cosméticos se utilizan normalmente en este ámbito.

Las aplicaciones cosméticas cubren diferentes aplicaciones del cuidado personal. Idealmente, para estos tipos de aplicaciones, el sistema puede facilitarse en una forma adaptada para aplicaciones tópicas aunque también se contemplan otras formas de administración anteriormente mencionadas.

Dichas aplicaciones cosméticas incluyen, pero no de forma limitativa, el tratamiento de las enfermedades del cabello o el tratamiento del olor corporal. Las enfermedades del cabello incluyen la caspa y el sistema de la presente invención elimina la piel muerta que se acumula en el cuero cabelludo. Asimismo, puesto que la caspa también tiene un aspecto infeccioso, el sistema de la presente invención también puede tratar cualquier infección microbiana subyacente. Este aspecto de infección microbiana se discute a continuación con más detalle. El sistema de la presente invención puede utilizarse como una alternativa al uso convencional del peróxido de hidrógeno para el control del olor corporal y para cualquier infección microbiana asociada que cause o aumente un problema de olor corporal. Asimismo, el sistema puede utilizarse en el tratamiento de enfermedades cutáneas, por ejemplo, para el acné. Este aspecto se detalla a continuación.

Adicionalmente, el sistema puede facilitarse en forma de solución de barrera profiláctica de mano o como una solución de saneamiento de mano. Este tipo de solución barrera de mano puede facilitarse en forma de crema, loción, hidrogel, etc. y se utiliza como un producto para lavar las manos con unas propiedades ventajosas para la prevención profiláctica de una infección microbiana.

Otra aplicación cosmética incluye el uso del sistema de la presente invención en un método de blanqueamiento dental. Los blanqueamientos dentales convencionales implican la aplicación de una solución de peróxido de hidrógeno o de blanqueante en las superficies externas de los dientes, normalmente bajo la supervisión de un dentista. Puesto que el peróxido penetra en los dientes, estos adquieren un color más claro. Ventajosamente, el sistema de la presente invención se facilita en una forma adaptada a la administración oral mediante una banda o bandas de película soluble, hilo dental, pasta de dientes, enjuague bucal y/o formas adaptadas para la administración mediante un protector bucal. La administración utilizando estos medios permite aclarar el color de los dientes allí donde el peróxido de hidrógeno se libera del sistema de la presente invención. El sistema de la presente invención libera de forma sostenida del peróxido de hidrógeno que es ideal para el blanqueamiento dental. Asimismo, el sistema está hidratado y es fácilmente tolerado por lo que supera las desventajas asociadas a los sistemas de blanqueamiento convencionales que utilizan peróxido de hidrógeno per se.

Por lo tanto, el sistema de la presente invención puede utilizarse como una fuente alternativa de peróxido de hidrógeno para sustituir el uso del blanqueamiento utilizado en un gran número de aplicaciones para el cuidado personal.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se facilita un sistema o composición farmacéutica de la invención para su uso en un método terapéutico.

De acuerdo con una forma de realización de la invención, se facilita un sistema o composición farmacéutica de la invención para su uso en un método terapéutico o para el tratamiento de una infección microbiana. Asimismo, el sistema

: o composición farmacéutica de la invención también puede utilizarse en la prevención profiláctica de dichas infecciones microbianas.

De forma adicional y de acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, se facilita el sistema o composición farmacéutica de la invención para la regeneración y/o reparación de tejidos y/o de células de los tejidos o células dañados. Se entiende que el sistema o composición farmacéutica de la invención aumenta una respuesta inmune mediante la estimulación ideal de la liberación de interleukina-1 (IL-1). Las propiedades inmunoestimulatorias del sistema

: o composición farmacéutica de la presente invención son responsables de la estimulación, regeneración y reparación de los tejidos y/o células dañados. Se entiende que las células incluyen, pero no de forma limitativa, las células epidérmicas.

El sistema o composición farmacéutica de la presente invención facilita una doble funcionalidad tanto antimicrobiana como inmunoestimuladora. De forma ventajosa, esta doble funcionalidad permite que el sistema se utilice para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas y profilácticas.

Idealmente, la infección microbiana que puede tratarse utilizando el sistema de la presente invención es cualquier infección microbiana que pueda tratarse con peróxido de hidrógeno.

Se entiende que la infección microbiana puede estar causada por bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas, bacterias acidorresistentes, virus, levaduras, microorganismos parásitos o patógenos y/o hongos. Las bacterias acidorresistentes incluyen las micobacterias, como la Mycobacterium tuberculosis que provoca la TB. Dichas infecciones microbianas pueden ser causadas, de forma no limitativa, por Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococci beta hemolíticos del grupo A, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Staphylococcus Aureus (MRSA) resistente a la meticilina, Botrytis cinerea y/ o Mycobacterium tuberculosis.

Asimismo, la infección microbiana puede estar causada por Cryptosporidium, un patógeno protozoo del Phylum Apicomplexa El Cryptosporidium causa una enfermedad diarreica llamada criptosporidiosis. Otros patógenos apicomplejos cubiertos por la presente invención incluyen el parásito Plasmodium de la malaria y el Toxoplasma, agente causante de la toxoplasmosis.

Ventajosamente, la presente invención puede utilizarse en el tratamiento o en la prevención profiláctica del MRSA o de otros microorganismos y bacterias resistentes a los antibióticos. De hecho, la invención resuelve el problema de las cadenas de microorganismos resistentes a los antibióticos de una forma no tóxica. Asimismo, hemos observado que no existe resistencia a nuestro sistema en relación con la aplicación de la nisina que genera la resistencia mostrada en los Ejemplos. Se trata de una importante ventaja de la presente invención respecto a los sistemas convencionales. Para esta aplicación, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse de forma tópica, por ejemplo, como un ungüento tópico, crema, loción, aceite, linimento, líquido y/o gel. De forma opcional, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse como parte de un tejido o como un paño limpiador para la piel. Este tipo de administración puede ser importante en la prevención profiláctica de las infecciones de MRSA y del tipo MRSA.

La infección microbiana puede ser una infección bucal, ocular y/ o de oídos. La infección bucal puede ser una enfermedad de las encías, una ulceración bucal y/ o un trastorno en la higiene bucal. El trastorno de higiene bucal puede ser la halitosis y/ o la gingivitis. De forma alternativa, la infección bucal puede ser una infección de garganta o una infección nasal, incluidas las infecciones por estafilococos nasales. Una infección ocular puede incluir una conjuntivitis.

Otras enfermedades son la mastitis, incluida la mastitis húmeda y/ o seca. La mastitis es una enfermedad importante tanto en humanos como en animales y está inicialmente causada por una infección microbiana a través de la piel dañada, el bloqueo del conducto del pezón o el contacto con superficies infectadas. En concreto, la mastitis tiene una tremenda importancia económica para la industria lechera puesto que las terapias antibióticas utilizadas requieren que la leche se retire de la cadena alimenticia durante un periodo de hasta 4 días tras la finalización de la terapia. Esto reduce considerablemente el rendimiento lechero. De ahí que se estén evaluando terapias alternativas a las terapias convencionales con antibióticos. Los microorganismos más comunes causantes de la mastitis que se han encontrado son:

Staphylococcus aureus Staphylococcus albus Especies de estreptococos Escherichia coli Especies de salmonella Mycobacterium tuberculosis Mastitis micótica – Candida albicans y Criptococcus neoformans Ventajosamente, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en el tratamiento de la mastitis. Este tipo de tratamiento no implica el uso de antibióticos. Como tal, es muy importante para la industria lechera. Tal y como se ha indicado anteriormente, el sistema o composición farmacéutica de la invención puede tener una forma adaptada a la administración intramamaria, por ejemplo, en una forma adaptada para la administración como parte de un sellador de pezones, tejido, paño limpiador para la piel, vendaje o apósito o en una forma apropiada para la inyección intramamaria.

Adicionalmente, la infección microbiana puede ser una infección cutánea y/o de las uñas.

De forma alternativa, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en el tratamiento de una infección por hongos en la piel y/o en las uñas. Las infecciones por hongos en la piel incluyen el pie de atleta y/ o la sarna en humanos. En medicina veterinaria, las enfermedades por hongos en la piel incluyen la gomosis, sarna y el control de las infecciones zoonóticas de la piel. Las infecciones por hongos en las uñas incluyen la onicomicosis.

Adicionalmente, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en el tratamiento de los trastornos cutáneos. El trastorno cutáneo puede ser el acné, eczemas y/ o psoriasis. Ventajosamente, se ha encontrado que el sistema de la presente invención es tan eficaz como las terapias convencionales para combatir el acné. Se entiende que el acné y los eczemas también pueden tener un componente de infección microbiana tratada el sistema. Asimismo, unas infecciones microbianas secundarias de lesiones psoriásicas por arañazos pueden tratarse con el sistema de la presente invención. El efecto inmunoestimulatorio del sistema de la presente infección también puede ayudar a regenerar y a reparar los tejidos y células cutáneas dañados.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, el sistema o la composición farmacéutica pueden utilizarse en un método para el cuidado de las heridas, incluido el tratamiento de una herida y/ o el tratamiento o gestión de la sepsis de las heridas. La herida puede ser una herida aguda, herida crónica, herida quirúrgica, quemadura crónica y/ o quemadura aguda. Este aspecto de la invención implica tanto el tratamiento de las infecciones microbianas como la regeneración/ reparación de los tejidos y células dañados, preferiblemente de las células epidérmicas. Una forma de realización particular de este aspecto implica la utilización del sistema o composición farmacéutica de la presente invención en un método de la gestión del estoma. El estoma puede resultar de una colostomía, ileostomía, jejunostomía y/ o gastrostomía. Otras formas de realización implican el tratamiento de úlceras diabéticas o de heridas.

Alternativamente, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en la prevención profiláctica de la sepsis de las heridas.

Se entiende que el sistema de la presente invención puede utilizarse tanto en aplicaciones de medicina veterinaria como humana.

Algunas de estas aplicaciones humanas específicas se han definido con anterioridad. Sin embargo, tal y como se ha definido anteriormente, el sistema o composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en el tratamiento de las infecciones microbianas generales y en el tratamiento o la gestión de los trastornos cutáneos, el cuidado de heridas y/ o el tratamiento de quemaduras. El tratamiento o la gestión de heridas y de quemaduras puede implicar tanto el efecto antimicrobiano como inmunoestimulatorio del sistema de la presente invención.

Las aplicaciones veterinarias importantes también implican el tratamiento de infecciones microbianas y el tratamiento o la gestión del cuidado de heridas y/o el tratamiento de quemaduras. Sin embargo, las enfermedades específicas incluyen la mastitis húmeda y seca en el ganado y otros animales domésticos, las infecciones cutáneas crónicas en perros (infecciones subcutáneas por estafilococos), la otitis externa (infecciones del oído), cuidados bucales de los animales, infecciones por campilobacter en pollos, coliosis, infecciones microbianas entéricas en cerdos, aves y ganado, las infecciones por criptosporidium, la eliminación de infecciones zoonóticas, los apósitos, por ejemplo, la eliminación de quemaduras y el tratamiento de abscesos. La presente invención presenta las ventajas particulares en el uso veterinario permitiendo el tratamiento de infecciones microbianas sin necesidad de introducir antibióticos en la cadena alimenticia.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se facilita el uso del sistema o de la composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones microbianas o para la prevención profiláctica de una infección microbiana.

Adicionalmente, se facilita el uso del sistema o composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento que repare y/ o regenere los tejidos y/ o células dañados. El sistema o la composición farmacéutica de la presente invención mejora idealmente una respuesta inmune estimulando la liberación de interleukina-1 (IL-1) tal y como se ha definido anteriormente.

La infección microbiana puede estar causada por bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas, bacterias acidorresistentes, virus, levaduras, microorganismos parásitos o patógenos y/o hongos. Las bacterias acidorresistentes incluyen las micobacterias, como la Mycobacterium tuberculosis que provoca la TB. Dichas infecciones microbianas pueden ser causadas, de forma no limitativa por Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococci beta hemolíticos del grupo A, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Staphylococcus Aureus (MRSA) resistente a la meticilina, Botrytis cinerea y/ o Mycobacterium tuberculosis.

El término “infección microbiana”, tal y como se utiliza en la presente invención, se ha definido con anterioridad. De nuevo, también se han mencionado unos ejemplos específicos de estos tipos de infecciones. La infección microbiana puede ser una infección bucal, ocular y/ o de oídos. La infección bucal puede ser una enfermedad de las encías, una ulceración bucal y/ o un trastorno en la higiene bucal. El trastorno de higiene bucal puede ser la halitosis y/ o la gingivitis. De forma alternativa, la infección bucal puede ser una infección de garganta o una infección nasal, incluidas las infecciones por estafilococos nasales. Una infección ocular puede incluir una conjuntivitis. Alternativamente, la infección microbiana puede ser una infección cutánea y/o de las uñas. Alternativamente, la infección microbiana puede ser una infección de uñas y/ o una infección cutánea, como el pie de atleta y/ o la sarna.

Otra forma de realización preferida de la invención incluye el tratamiento de la mastitis, incluida la mastitis húmeda y/ o seca.

Adicionalmente, se facilita el uso del sistema o composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno cutáneo. El trastorno cutáneo puede ser acné, eczemas y/ o psoriasis que pueden tener un componente microbiano.

Adicionalmente, se facilita el uso del sistema o composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una herida y/ o para el tratamiento o la gestión de la sepsis de heridas. La herida puede ser una herida aguda, herida crónica, herida quirúrgica, quemadura crónica y/ o quemadura aguda. Adicionalmente, se facilita el uso del sistema o composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento para la gestión del estoma. El estoma puede resultar de una colostomía, ileostomía, jejunostomía y/ o gastrostomía.

Adicionalmente, se facilita el uso del sistema o composición farmacéutica de la presente invención para la fabricación de un medicamento para su uso en la prevención profiláctica de la sepsis de heridas.

Se entiende que la infección microbiana, el trastorno cutáneo, la herida u otro trastorno pueden tratarse con un método que incluye la administración tópica, enteral y/ o parenteral del sistema o de la composición farmacéutica de la presente invención, tal y como se ha definido anteriormente.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se ha facilitado un método de tratamiento de las infecciones microbianas y/o la reparación y/o regeneración de tejidos dañados y/o de células de un paciente, incluidos los pasos de aplicación de una cantidad eficaz del sistema o composición farmacéutica de la presente invención a una zona infectada de un paciente mediante una aplicación tópica, enteral y/o parenteral.

De nuevo, el término “infección microbiana”, tal y como se utiliza en la presente invención y como se ha definido anteriormente con ejemplos específicos de estos tipos de infecciones, se aplica a este aspecto de la presente invención. El método también puede implicar el tratamiento de un trastorno cutáneo, herida y/ o tratamiento o gestión de la sepsis de una herida, tal y como se ha definido con anterioridad.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se entiende que el sistema de la presente invención puede utilizarse para la esterilización de composiciones, incluida el agua o productos, como dispositivos en el ámbito quirúrgico. Por lo tanto, el sistema de la presente invención puede utilizarse en la descontaminación del agua o para la esterilización de dispositivos en momentos como la acampada y las emergencias.

De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se ha facilitado un proceso de fabricación de un sistema antimicrobiano e inmunoestimulador estable en su almacenamiento que incluye una enzima oxidorreductasa, un sustrato para la enzima oxidorreductasa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa que incluye las siguientes etapas

e.: enfriar la mezcla resultante derivada de la etapa (d) hasta que alcance una temperatura ambiente para generar un sistema con peróxido de hidrógeno producido de forma endógena, estable en su almacenamiento y biodisponible, con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata.

El tratamiento caliente no controlado de azúcares tiende a producir una caramelización que provoca una formulación que adquiere una coloración de amarillo a marrón. Para eliminar la caramelización y producir una material claro, el proceso de fabricación mencionado ha sido desarrollado para que la adición de azúcares y su disolución por calentamiento se seleccione cuidadosamente para evitar el proceso de caramelización.

Preferiblemente, el proceso incluye la siguiente etapa de añadir un agente amortiguador al sistema para conseguir un pH de alrededor de 4 a 8, preferiblemente de 5 a 7, más preferiblemente de 5,5. El agente amortiguador puede añadirse durante o después de la etapa (d).

Idealmente, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa, hexosa oxidasa, colesterol oxidasa, galactosa oxidasa, piranosa oxidasa, colina oxidasa, piruvato oxidasa, glicolato oxidasa y/ o aminoácido oxidasa y el sustrato para la enzima oxidorreductasa es D-glucosa, hexosa, colesterol, D-galactosa, piranosa, colina, piruvato, glicolato y/ o aminoácido.

De acuerdo con una forma de realización preferida, la enzima oxidorreductasa es glucosa oxidasa y el sustrato para la enzima oxidorreductasa es D-glucosa.

Opcionalmente, los azúcares añadidos, tal y como se han definido anteriormente, pueden añadirse al sistema en la etapa (b). Estos azúcares añadidos pueden incluir uno o más de los siguientes ingredientes: sacarosa, fructosa y/ o maltosa.

Idealmente, cuando se añaden uno o más azúcares, cada azúcar se añade de forma secuencial después de que el azúcar anterior se haya disuelto completamente en el agua de la etapa (a).

De acuerdo con otra forma de realización de este aspecto de la invención, los azúcares se añaden en la secuencia siguiente: fructosa, glucosa, maltosa y sacarosa. Cada azúcar se disuelve completamente en el agua calentándola a aproximadamente 90ºC antes de añadir el siguiente azúcar. De forma alternativa, los azúcares pueden prepararse tal y como se ha indicado anteriormente al vacío a aproximadamente - 0,5 bares. Este vacío reduce el punto de ebullición de los azúcares a una temperatura de menos de 90ºC evitando la decoloración.

Opcionalmente, al menos un ingrediente modificador de la viscosidad puede añadirse al sistema durante el proceso mencionado. Idealmente, el ingrediente modificador de la viscosidad se selecciona entre el polietilenoglicol, el glicerol y/

o la parafina líquida. También se pueden utilizar otros ingredientes convencionales que modifiquen la viscosidad.

Otro aspecto de la presente invención facilita un proceso para la fabricación de un sistema antimicrobiano de un componente único de acuerdo con la invención que incluye las etapas de:

a.: calentar el agua, preferiblemente a aproximadamente 85 +/-10°C;

b.: añadir glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa al agua calentada, en la que cada azúcar se añade siguiendo un orden predefinido, preferiblemente secuencial, solo después de que el azúcar anterior se haya disuelto completamente en el agua en la etapa (a);

c.: enfriar la solución de azúcar en el agua hasta una temperatura inferior a alrededor de 40ºC para permitir la conservación de la actividad enzimática;

d.: añadir la enzima oxidorreductasa a la solución de la etapa (c) agitándola para formar peróxido de hidrógeno en un índice controlado predeterminado; y

e.: enfriar la mezcla resultante a temperatura ambiente para producir una solución viscosa con peróxido de hidrógeno biodisponible.

Cuando el sistema de la presente invención se realiza de acuerdo con el procedimiento anterior, el sistema de la invención puede envasarse en un recipiente opaco e impermeable. Esto evitará la producción posterior de peróxido de hidrógeno que solo podrá reiniciarse en una atmósfera aeróbica.

El sistema generado de acuerdo con el proceso anterior puede ser una solución líquida, sólida o una preparación semisólida. Después de la fabricación, el sistema puede ser procesado creando el producto final deseado, es decir, en una forma de administración, ya sea sólida o semi-sólida apropiada para las diferentes formas de administración anteriormente indicadas. Por ejemplo, el sistema puede combinarse con un gel alcohólico para facilitar una forma de gel apropiada para su administración. Adicionalmente, el sistema puede incorporarse en varios apósitos comercialmente disponibles.

El sistema también puede estar sometido a una esterilización posterior a su fabricación, por ejemplo, mediante radiación. Dicha esterilización posterior a su fabricación no tiene un efecto negativo en el sistema de la presente invención.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos con referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Fig. 1a muestra un perfil de inhibición de la miel de Manuka con Staphylococcus aureus. La miel de Manuka muestra un perfil de inhibición de segundo nivel. La actividad de inhibición microbiana de primer nivel se produce entre diluciones de alrededor de un 50% hasta aproximadamente 6,25% y el segundo nivel de actividad de inhibición microbiana se produce en diluciones de 3,125% a aproximadamente 0,195%;

La Fig. 1b muestra un perfil de inhibición microbiana de la miel de Manuka con un pH ajustado con Staphylococcus aureus. El hecho de ajustar el pH de la miel de Manuka de su pH natural de alrededor de 4,0 a un pH de 6,8 no afecta el perfil de inhibición microbiana;

La Fig. 1c muestra un perfil de inhibición microbiana de la miel de Manuka con un pH ajustado al que se ha añadido un exceso de catalasa con el Staphylococcus aureus. El pH de la miel de Manuka ajustado a alrededor de un pH neutro seguido de la adición de la catalasa en exceso altera el perfil de inhibición microbiana de la miel. El primer nivel de inhibición microbiana solo se ve ligeramente afectado pero el segundo nivel se ve considerablemente afectado lo que indica que el efecto antibacteriano en el segundo nivel es principalmente el resultado de la liberación de peróxido de hidrógeno;

La Fig. 2 muestra un perfil de inhibición microbiana de la miel de Manuka y una formulación prototipo con Staphylococcus aureus. La formulación prototipo demuestra una mayor actividad en comparación con aquella de la miel de Manuka;

La Fig. 3a muestra los resultados de un ensayo sobre inhibición microbiana que utiliza un gel a base de formulaciones de prototipo con Staphylococcus aureus, E. coli y Candida Albicans. Los dos geles a base de celulosa demuestran una disminución de la estabilidad y la formulación de gel a base de celulosa tampoco es tan activa como la formulación prototipo, tal como demuestran las zonas más pequeñas de inhibición en los ensayos de difusión (comparar la Fig. 3a (geles) con la Fig. 3b (formulación prototipo));

La Fig. 3b muestra los resultados de un ensayo de inhibición microbiana de las formulaciones prototipo con Staphylococcus aureus. Unas zonas mayores de inhibición muestran una actividad evidente;

La Fig. 4a muestra los resultados del ensayo de inhibición microbiana de la glucosa// glucosa oxidasa utilizando formulaciones con diferentes bacterias. Los ensayos de inhibición microbiana de 4 réplicas de un 75% de D-glucosa con un 0,5% de GOX 5600U7g en pozos y su actividad antimicrobiana con un número diferente de bacterias. Estas formulaciones demuestran un grado limitado de actividad antibacteriana. Esta actividad se encuentra por debajo de aquella observada con la formulación antimicrobiana prototipo descrita en el ejemplo 2, tal y como se muestra en las zonas más pequeñas de inhibición en los ensayos de difusión de pozo/ disco (comparar Fig. 4a (geles) con la Fig. 4b (prototipo));

La fig. 4b muestra los resultados del ensayo de inhibición microbiana de la formulación prototipo con diferentes bacterias; La fig. 5a muestra la actividad del A3IS con unas concentraciones diferentes de enzima GOX (5600U/g) con S. aureus. Se ha medido la variación del contenido de la glucosa oxidasa en el A3IS y su efecto en el perfil de inhibición. La actividad antibacteriana del A3IS aumenta proporcionalmente a la concentración de glucosa oxidasa. Un efecto antibacteriano sustancial se alcanza con una concentración enzimática de un 0,05%.

La fig. 5b muestra una generación de H2O2 en el tiempo mediante el A3IS con un 0,5 % de 5600 U/g de enzima GOX Aldrich sigma diluida en un 50% (C1), un 25% (C2), un 12,5% (C3) o un 6,25% en agua desionizada (DI). El A3IS genera un aumento considerable de los niveles de peróxido de hidrógeno en comparación con la miel de Manuka diluida en un 50% de agua DI;

La fig. 5c muestra una generación de H2O2 en el tiempo mediante A3IS. La producción de H2O2 mediante A3IS con un 0,5% de 5600 U/g de enzima GOX Aldrich sigma y diluido en un 25% de agua DI se mantiene durante un periodo de, al menos, 48h;

La fig. 5d muestra que la actividad antimicrobiana del A3IS aumenta con un aumento de la concentración de la glucosa oxidasa. La potencia/ eficacia depende de la concentración de glucosa oxidasa en las formulaciones del A3IS. Los resultados muestran un aumento de la eficacia con una concentración mayor de glucosa oxidasa cuando se ha ensayado con Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli;

La fig. 6 muestra los resultados de estabilidad y la retención de una reserva de H2O2 mediante A3IS durante un periodo de 10 meses. La reserva disponible de H2O2 producida mediante A3IS es estable en su almacenamiento. El nivel de H2O2 disponible presente ha sido inicialmente determinado inmediatamente después de situarlo en tubos y, de nuevo, tras un periodo de 7 y 10 meses. No existe una evidencia de una pérdida del H2O2 disponible en la formulación del A3IS indicando, por lo tanto, la estabilidad. Se han obtenido unos resultados similares con un gran número de otros lotes.

La fig. 7a muestra una actividad antimicrobiana en una formulación del A3IS con Staphylococcus aureus durante 3 meses. La actividad antimicrobiana en una formulación del A3IS con Staphylococcus aureus demuestra un nivel consistente de actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo, tal y como determinan las zonas de inhibición medidas en cada punto de tiempo de muestra y los resultados dibujados usando unos límites de confianza de un 95% durante un periodo de 3 meses.

La fig. 7b muestra la actividad antimicrobiana en una formulación del A3IS con Staphylococcus aureus durante 14 meses. La actividad antimicrobiana en una formulación del A3IS con Staphylococcus aureus muestra un nivel consistente de actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo, tal y como determinan las zonas de inhibición medidas en cada punto de tiempo de muestra y los resultados indicados usando unos límites de confianza de un 95% durante un periodo de 14 meses.

La Fig. 8a muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra el Staphylococcus aureus, con el método de la curva de letalidad NCCLS. La actividad de la actividad antimicrobiana del A3IS contra el Staphylococcus aureus, tal y como se determina mediante un método de letalidad NCCLS. El A3IS ha aumentado su eficacia en comparación con la miel de Manuka y en comparación con el apósito de plata;

La Fig. 8b muestra la actividad antimicrobiana del A3IS con el Staphylococcus aureus, un método específico de un fabricante de dispositivos médicos. La actividad antimicrobiana del A3IS contra el Staphylococcus aureus, tal y como ha determinado un protocolo específico de un fabricante de dispositivos médicos. El A3IS ha aumentado su eficacia en comparación con la miel de Manuka y en comparación con el apósito de plata;

La Fig. 8c. muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra los Streptococci beta hemolíticos del grupo A. Los resultados de un ensayo de inhibición (con repeticiones de 3 días) para el A3IS, Medihoney® y un 10% de gel de fenol probado contra 5 aislados clínicos de Streptococci beta hemolíticos del grupo A. El A3IS tiene un pH de 5,5 normal (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo), se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. La formulación del A3IS muestra tener una eficacia in vitro comparable a un gel con un 10% de fenol y es superior a Medihoney®;

La Fig. 8d muestra una actividad antimicrobiana del A3IS contra el Campylobacter. Indica los resultados de un ensayo de inhibición (con repeticiones de 3 días) para A3IS, la miel de Manuka y un gel con un 10% de fenol probados con 5 aislados clínicos de Campylobacter spp. La formulación del A3IS tiene un pH normal de 5,5 (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo), se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. Los resultados indican una eficacia in vitro considerable de anti-Campylobacter y la superioridad del A3IS respecto a la miel de Manuka;

La Fig. 9a muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra el P. acnes. La actividad del A3IS contra el P. acnes bajo diferentes condiciones de incubación: aeróbico claro y oscuro, anaeróbico claro y oscuro. El A3IS muestra un nivel elevado de actividad contra el P. acnes, indicando los materiales potenciales para la aplicación tópica contra el acné.

La Fig. 9b muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra el P. acnes. Se muestra la actividad antimicrobiana del A3IS y los productos comerciales para combatir el acné actualmente disponibles, incluidos algunos productos comerciales con antibióticos. El A3IS muestra un elevado nivel de actividad comparable a los productos para combatir el acné comercialmente disponibles indicando los materiales potenciales para la aplicación tópica contra el acné.

La Fig. 10 muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra 8 cadenas de MRSA, durante tres días diferentes y en comparación con un 10% de fenol estándar y la miel de Manuka. La formulación del A3IS tiene un pH normal de 5,5 (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo), se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. Los resultados demuestran una eficacia considerable in vitro contra el MRSA y la superioridad del A3IS sobre la miel de Manuka y sobre un gel con un 10% de fenol.

La Fig. 11a muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra el MRSA comparada con un 10% de fenol estándar y con la miel de Manuka. La formulación del A3IS tiene un pH normal de 5,5 (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo), se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. Los resultados muestran una eficacia considerable in vitro contra el MRSA y la superioridad del A3IS sobre la miel de Manuka y sobre un gel con un 10% de fenol.

La Fig.11b muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra aislados clínicos de la mastitis en comparación con los antibióticos. El ensayo de inhibición del A3IS (con repeticiones de 3 días) en comparación con cuatro antibióticos (Vancomycin, Streptomycin, Tetracycline y Chloramphenicol) probados con 22 aislados clínicos de la mastitis causada por organismos de Staphylococcus aureus. El A3IS demuestra una eficacia in vitro superior a todos estos antibióticos. El aislado clínico número 15 es resistente al Vancomycin, Streptomycin y Tetracycline y muestra solo una ligera sensibilidad al Cloramfenicol, sin embargo, demuestra sensibilidad al A3IS.

La fig.11c muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra aislados clínicos de la mastitis respecto a productos contra la mastitis comercialmente disponibles. El ensayo de inhibición del A3IS (con repeticiones de 3 días) en comparación con cuatro productos con multiantibióticos contra la mastitis, comercialmente disponibles, probados con 22 aislados clínicos de la mastitis causada por organismos de Staphylococcus aureus. La formulación del A3IS muestra una eficacia in vitro comparada a tres de los productos comerciales más importantes y es superior a uno de esos productos.

La Fig.11d muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra aislados clínicos de la mastitis respecto a la solución con un 2% de nisina. Un ensayo de inhibición del A3IS (con repeticiones durante 3 días) en comparación con una solución con un 2% de nisina con 21 aislados clínicos de la mastitis provocada por organismos de Staphylococcus aureus. La formulación del A3IS demuestra tener una eficacia in vitro superior a la solución con un 2% de nisina. Nota: el aislado clínico número 15 de la Fig. 11b no se pudo recuperar del almacenamiento y no se ha incluido en este ensayo;

La Fig. 11e muestra el desarrollo de la resistencia a la nisina. Una colonia resistente a un 2% de nisina (indicada con la flecha), en la zona de inhibición durante un estudio de la eficacia de la nisina. No se han observado colonias resistentes al A3IS.

La Fig. 12a muestra una valoración de la toxicidad MTT del A3IS con NHFs (Fibroblastos humanos normales. Incluidos en el ensayo con una concentración de un 50% del A3IS, una gama de concentraciones de plata comercial con gel y un zinc comercial con un producto en gel, en comparación con la ázida sódica (control positivo). El A3IS muestra menos toxicidad que el producto de plata comercial que contiene gel o de zinc comercial que contiene gel;

La Fig. 12b muestra una valoración de toxicidad MTT del A3IS con NHKs (queratinocitos humanos normales). Se incluye en el ensayo una concentración de un 50% del A3IS, una gama de concentraciones de plata comercial con gel y un zinc comercial con un producto en gel, en comparación con la ázida sódica (control positivo). El A3IS muestra menos toxicidad que el producto de plata comercial que contiene gel o de zinc comercial que contiene gel;

La Fig. 12c muestra una valoración de citotoxicidad con un revestimiento de agar del A3IS en células L929. Se incluye en el ensayo una concentración de un 50% del A3IS, una gama de concentraciones de plata comercial con gel y un zinc comercial con un producto en gel, en comparación con la ázida sódica (control positivo). El A3IS muestra menos toxicidad que el producto de plata comercial que contiene gel o de zinc comercial que contiene gel;

La Fig. 12d muestra el A3IS y otro ensayo de irritación de MTT de material de ensayo durante un periodo de 24 horas utilizando un modelo de piel en 3D Skinethic®. El A3IS muestra menos irritación en este ensayo de tres dimensiones que los productos comercialmente disponibles ensayados.

La Fig. 12e muestra una sección transversal colorada con hematoxilina/ esosina (H&E) de piel en 3D Skinethic ® expuesta al producto de gel con plata comparativo. Hay que tener en cuenta que la formulación con plata causa la separación de la capa epidérmica de la capa basal;

La Fig. 12f muestra una sección transversal colorada de hematoxilina/ eosina (H&E) de piel en 3D Skinethic ® expuesta al producto de gel con plata comparativo. Hay que tener en cuenta que la formulación con plata causa la separación de la capa epidérmica de la capa basal;

La Fig. 12g muestra la sección transversal colorada con hematoxilina/ eosina de la piel en 3D Skinethic® expuesta al A3IS. Hay que tener en cuenta que el A3IS no causa la separación de la capa epidérmica de la capa basal;

La Fig. 12h muestra la sección transversal colorada con hematoxilina/ eosina de la piel en 3D Skinethic® expuesta al A3IS. Hay que tener en cuenta que el A3IS no causa la separación de la capa epidérmica de la capa basal;

La Fig. 13a muestra la inducción de la liberación de IL-1 por el A3IS. Muestra el ensayo ELISA del sobrenadante de un ensayo de irritación en 3D, durante un periodo de 48 horas, midiendo y comparando la liberación de IL-1 cuando está expuesto a la formulación del A3IS, a un control positivo de ázida sódica, y a un producto comercial de gel con plata. Los resultados indican que el IL-1 se libera de las células cutáneas expuestas a la formulación del A3IS.

La Fig. 13b muestra la inducción de la liberación de LDH por el A3IS Muestra el ensayo ELISA del sobrenadante del ensayo de irritación en 3D, durante un periodo de 48 horas, midiendo y comparando la liberación de dehidrogenasa lactata (LDH) cuando se expone al A3IS., un control positivo de ázida sódica y a un producto de gel comercialmente disponible con plata. La lactato deshidrogenasa es liberada por células expuestas a componentes destructivos. Los resultados indican que la formulación del A3IS. es menos tóxica que los productos en gel comercialmente disponibles que contienen plata.

La fig. 14 muestra el A3IS antes y después de la esterilización mediante radiación gamma. La radiación gamma no reduce la actividad, tal y como muestran los ensayos de inhibición de la zona con S. aureus, E. coli y pseudomonas aeruginosa;

La Fig. 15a muestra el A3IS en una matriz de colágeno-GAG y unos apósitos comerciales en los que se ha probado la actividad antibacteriana contra el S. aureus. El A3IS demuestra una actividad antibacteriana superior a aquella observada con los apósitos de plata disponibles utilizados como control;

Las Figs. 15b y 15c muestran la infiltración en la matriz de colágeno-GAG por el NHFs. La infiltración por NHFs de las matrices de colágeno-GAG. Durante un periodo de 4 días, tras la adición de las secciones de prueba, se ha observado que el NHF une y crece dentro y a lo largo de las matrices de colágeno-GAG, tal y como se indica con la flecha.

La Fig. 16a muestra el A3IS en un gel alcohólico probado usando un bioensayo de difusión de superficie para determinar zonas de inhibición con el S. aureus. Las zonas de inhibición son pequeñas debido a la propiedad de absorción de la matriz de gel, pero existe una clara zona alrededor de ésta;

La Fig. 16b muestra la estabilidad del A3IS en un gel alcohólico. El A3IS en una formulación de gel alcohólico se ha sometido a un estudio de estabilidad a corto plazo de 6 semanas, incluido un ciclo de congelación y se ha probado usando un ensayo de biodifusión de superficie para determinar zonas de inhibición contra el S. aureus. Los resultados han indicado que la formulación en gel ha mantenido la estabilidad a lo largo del periodo de prueba.

La Fig. 17 muestra una investigación comparativa de la eficacia del A3IS. Se ha incluido el A3IS en la superficie de una gama de apósitos comercialmente disponibles Kaltosta® (Comvita), Kendal® (Telfa) y una matriz de colágeno-GAG (glicosaminoglicano), tal y como se ha descrito anteriormente y ha permitido su difusión en un revestimiento durante varias horas. Se han cortado unas secciones y se han situado en placas de agar, previamente inoculadas con S. aureus,

E. coli y P. aeruginosa. La eficacia antibacteriana de los apósitos impregnados con A3IS se han comparado, a continuación, con apósitos de Aquacel ® (Convatec) y Betadine® (Seton) comercialmente disponibles que contenían plata elemental y iodina. Los apósitos del A3IS son tan eficaces, desde el punto de vista antimicrobiano, como Aquacel(R) (Convatec) y Betadine(R) (Seton) y un apósito comercialmente disponible que utiliza plata elemental y iodina.

La fig. 18a muestra la actividad antimicrobiana del A3IS respecto a la onicomicosis. Onicomicosis presente en la uña del pie antes del tratamiento con A3IS;

La fig. 18b muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra la onicomicosis. A3IS cubierto con un vendaje con un relleno humedecido con agua. A continuación, la uña se cubre con un apósito oclusivo;

La Fig. 18c muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra la onicomicosis. Fotografía 48 horas después de iniciar el tratamiento con el A3IS. Es evidente que el aspecto de la uña ha cambiado y tiene ahora un color más oscuro; y

La Fig. 18d muestra la actividad antimicrobiana del A3IS contra la onicomicosis. Fotografía 8 semanas después de iniciar el tratamiento con el A3IS. La franja de uña no infectada es claramente visible, lo que indica que los dermatofitos han sido eliminados.

Ejemplos:

Materiales y procedimientos generales Miel de manuca: Manuka Care 18+® (Comvita) o Medihoney® se ha preparado con un 50% en volumen de caldo nutriente. Se han

elaborado 11 series 1 en 2 diluciones del 50% en volumen de preparación en caldo nutriente y se han utilizado en una prueba de inhibición microbiana obteniendo la concentración más baja de un 0,01%. Azúcares: (D+) glucosa, D (-) fructosa, (D+) maltosa y (D+) sacarosa (Sigma Aldrich)

Glucosa oxidasa Se ha utilizado un 0,5% de polvo de glucosa oxidasa (5600U/100g) en la fabricación del A3IS. 240U/mg de glucosa oxidasa (Biozyme UK) (1U es la cantidad de enzima que provoca la oxidación de un micromol de glucosa por minuto a 25ºC y con un pH de 7,0) y 100U/mg a 250U/mg de glucosa oxidasa (Sigma Aldrich) (1U oxidará 1,0 moles de D-glucosa en D-gluconolactona y H2O2 por minuto, con un pH de 5,1 a 35ºC) también se han utilizado en los siguientes ejemplos.

Ajuste del pH: A una solución con un 50% en volumen de miel de Manuka se le ha ajustado el pH a 6,5 con 1 M NaOH y a una muestra

de mezcla de azúcar sin glucosa oxidasa se le ha ajustado el pH a 3,8 con 1 M HCI. El pH se ha medido con un medidor del pH (Hanna Instruments HI 931410). Preparaciones con un azúcar: Las soluciones con un 50% en peso solo de glucosa, solo de fructosa y solo de sacarosa se han preparado y diluido

serialmente de forma similar que la miel de Manuka. Medición del contenido de humedad y agua disponible (Aw): La determinación del contenido de humedad se hizo mediante un aparato de titulación Carl Fisher (Suiza). La

determinación del Aw se realizó usando un Aqua Lab Aw meter, modelo series 3Te, Decagon Devices Inc, Pullman, Washington, (Kind permission Glanbia Innovation Centre, Kilkenny).

Ensayo con H2O2: El peróxido de hidrógeno se ha determinado siguiendo el método de (kerkvkiet 1996 y Serrano, y otros, 2004), mediante la tira de ensayo Merckoquant (nº 10011, Merck, Alemania).

Eliminación del H2O2: La catalasa (Sigma Chemical Co, de hígado de bovino, cat. Nº C-30 12,800U/mg) se ha añadido a unas diluciones de miel de Manuka normal (pH inicial de 4) y a diluciones de miel de Manuka con un pH ajustado (pH inicial de 6,8) con las mismas concentraciones utilizadas por Taormina y otros, Allen y otros y Molan y otros, 1988). Normalmente, la concentración añadida es 100 veces superior a la cantidad medida de H2O2 presente.

Tratamiento de calor de la miel de Manuka:

Un solución con un 50% de miel de Manuka en un caldo de nutriente ha sido sometida a un tratamiento de calor a una temperatura de 85 +/- 5ºC en un baño con agua. Esta temperatura se ha mantenido durante un periodo de 60 minutos o de 120 minutos. Un solución con un 50% de miel de Manuka en un caldo de nutriente se ha curado en un autoclave a 121 psi durante 15 minutos. De estas preparaciones con miel tratada con calor, se han preparado diluciones para su ensayo.

Cadenas microbianas:

Escherichia coli (NCIMB 8545), Staphylococcus aureus (NCIMB 9518) y Pseudomonas aeruginosa (NCIMB 8626) han crecido en agar nutriente o en un caldo nutriente, durante 24 horas, a 37°C.

Candida albicans (NCIMB 3179) y Saccharomyces cerevisiae han crecido en agar sabouraud dextrosa o en un caldo de sabouraud dextrosa, durante 24 horas, a 37°C.

Propionibacterium acnes (P. acnes ATCC/NTC 11827) ha crecido anaeróbicamente en agar sangre o en un caldo nutriente, durante 72 horas, a 37°C.

22 aislados de una mastitis clínica por Staphylococcus aureus obtenida de Sligo regional Veterinary Laboratories han crecido en un agar nutriente o en un caldo nutriente durante 24 horas, a 37ºC.

Para un ensayo realizado en el Sligo Regional General Hospital, cinco aislados clínicos de streptococci beta hemolíticos del grupo A crecieron en agar sangre o en un caldo nutriente, durante 24 horas, a 37ºC.

Campylobacter coli (NCTC 11366) ha crecido en un agar con infusión cerebro corazón o en un caldo de infusión cerebro corazón, durante 72 horas, a 37ºC.

Campylobacter jejuni (NCTC 11322) y tres aislados clínicos han crecido en un agar con infusión cerebro corazón o en un caldo con infusión cerebro corazón, durante 72 horas, a 37ºC.

MRSA (ATCC 43300) y siete aislados clínicos han crecido en agar con nutriente o en un caldo con infusión cerebro corazón, durante 72 horas, a 37ºC.

Los aislados de molde de laboratorio han crecido en agar con sabouraud dextrosa o en un caldo de dextrosa, durante 48 horas, a 25ºC.

Botytis cinerea ha crecido en agar con sabouraud dextrosa o en un caldo de dextrosa, durante 48 horas, a 25ºC.

El crecimiento bacteriano se controla midiendo la densidad óptica del cultivo (OD) en un espectrofotómetro (Anthos 2010) con una longitud de onda de 620 nm.

Procedimientos de difusión de pozo/ disco – para la medición de la inhibición microbiana

Se han inoculado unas placas de agar mediante un cultivo exudado durante un día en una superficie plana. Las placas se mantienen a una temperatura ambiente, durante 15 minutos, antes de su uso. Los pozos con 8,2mm de diámetro se perforan en la superficie del agar. Ciento ochenta µl de muestra se sitúan en cada pozo. Las muestras se difunden en el agar, alrededor del pozo y se ensayan para ver si producen una zona de inhibición. Las placas se incuban durante 24, 48

o 72 horas y las zonas de inhibición se miden mediante un lector de zona automático Autodata. Se registra el diámetro de las zonas, incluido el diámetro del pozo (8,2mm).

Para los ensayos de disco, se sitúan unos discos absorbentes estériles (de 8,2mm de diámetro) en unas diluciones de muestra, durante 10 minutos antes de aplicarlos directamente a placas de agar inoculadas. Las muestras difunden del disco al agar y se ensayan para ver si producen una zona de inhibición. Las placas se incuban durante 24, 48 o 72 horas

y las zonas de inhibición se miden mediante un lector de zona automático Autodata. Se registra el diámetro de las zonas, incluido el diámetro del disco (8,2mm).

Cuantificaciones bactericidas de la miel

El ensayo de difusión del agar (ADA) es el procedimiento generalmente preferido por las cuantificaciones bactericidas de la miel y determina la potencia biológica de los componentes/ activos – antibióticos, y se utiliza para los análisis de lote de producción de la miel de Manuca y param los procedimientos de liberación (Gribbles Analytical Laboratories Kerkvliet, J.D., 1996. Screening method for the determination of peroxide accumulation in honey and relation with UMF content (Journal of Apiculture Research 35, 3, pp.110-117). Sin embargo, la naturaleza subjetiva de este ensayo limita la interpretación de los resultados. También requiere mucho tiempo y es laboriosa ya que necesita la preparación y enfriamiento de las placas, la perforación de los pozos de ensayo en agar y la medición manual de las zonas de inhibición después de 24 horas de incubación. La calidad de los resultados depende ampliamente de la técnica y del juicio, y la precisión sugerida no puede obtenerse cuando la zona de inhibición es confusa o no es perfectamente circular.

Otros procedimientos para la medición de la inhibición microbiana

El crecimiento microbiano o la inhibición del crecimiento puede detectarse mediante una variedad de procedimientos biológicos, incluidos, el recuento microscópico directo, la absorción, la bioluminiscencia, los ensayos que incorporan un indicador de crecimiento colorimétrico y fluorométrico, la turbidez, el peso en seco y las zonas de inhibición.

Ensayo SDectroDotométrico

Hemos desarrollado un ensayo espectrofotométrico mediante 96 placas de microtitulación de pozo (Patton T. et al Journal of Microbiological Methods (2006) páginas 84-95) y hemos comparado este método con los procedimientos estándar de difusión de pozo/ disco para evaluar las ventajas potenciales de este bioensayo en relación con las propiedades antibacterianas de la miel de Manuka. Se ha conseguido un aumento de la automatización y una mayor eficacia mediante el ensayo espectrofotométrico que puede generar con rapidez grandes cantidades de datos que permiten un análisis estadístico detallado de los resultados. El procedimiento es más sensible y más susceptible de proporcionar análisis estadísticos que los ensayos normalmente utilizados, permitiendo unos estudios cinéticos más extensivos incluso en presencia de concentraciones de miel más reducidas (Tabla 1). El ensayo es capaz de detectar unos niveles inhibitorios por debajo de aquellos registrados para los ensayos de difusión de pozo o disco. Este ensayo facilita un procedimiento rápido y sensible para averiguar la actividad de la miel de Manuka.

Tabla 1

Disco: Pozo Espectrofotométrico

Ensayo MIC50
Ensayo MIC50
Ensayo MIC50

Especie microbiana

Escherichia coli: 22,4% 24,5% 5,6%

Staphylococcus aureus: 25,7% 22,6% 0,78%

Bacillus cereus: 24% 21,9% 2,00%

Candida albicans: Sin inhibición Sin inhibición 40%

Los valores de MIC50 indican que el porcentaje de miel de Manuka presente provocó una inhibición de un 50% en el crecimiento de un microorganismo de ensayo.

Las diluciones de miel se inocularon con un 5% de cultivo de ensayo en volumen durante un día. Doscientos microlitros de cada dilución, usando 8 réplicas por dilución se aplicaron a los pozos de 96 placas de microtitulación de un pozo con un fondo plano para evitar la contaminación cruzada (Costar, Coming Ltd. NY). Los pozos de control recibieron 200 microlitros de un 5% de caldo inoculado de cultivo. La densidad óptica se determina en un espectrofotómetro a 620nm antes de la incubación, (T0). Las placas se incubaron durante 24 horas en la oscuridad en un agitador orbital Certomat MO a 100 rpm para evitar la adherencia y el aglutinamiento. Después de 24 horas, las placas volvieron a leerse en un espectrofotómetro a 620nm, (T24). Los resultados mostrados son medias de ocho determinaciones repetidas cinco veces durante tres días separados.

El OD para cada replica a T0 se sustrajo del OD para cada réplica a T24 Al OD ajustado de cada pozo de control se le asignó un valor de un 100% de crecimiento. La inhibición del crecimiento de los pozos de ensayo para cada dilución se determinó mediante la fórmula:

5 Porcentaje de inhibición = 1 (Pozo de ensayo OD / OD del pozo de control correspondiente) x 100 para cada fila de las 96 placas de pozo, por ejemplo, fila OD 1, columna 1, pozo 1 (ensayo) se divide por el valor OD.

Este rendimiento replica los valores de inhibición para cada dilución de miel. Todos los ensayos se han repetido un mínimo de tres veces en tres días diferentes usando un mínimo de tres placas por ensayo, es decir, cada punto de dato

10 indicado tiene una media de un mínimo de 72 puntos de determinación.

La desviación estándar asociada a los valores de inhibición calculados de media para los pozos replicados se ha determinado como barras de error asociadas para cada punto de dato de las gráficas. Cuando la medición de resultados registró un valor de inhibición negativo (promoción del crecimiento), se ha registrado como una estimulación usando la

15 fórmula:

Porcentaje de crecimiento = (Ensayo OD/ Control OD) x 100

Ejemplo 1: caracterización de actividades antimicrobianas en la miel de Manuka – Ausencia de peróxido de hidrógeno 20 endógeno.

Mediante el bioensayo espectrofotométrico descrito, se ha determinado la actividad antimicrobiana de la miel de Manuka comercialmente disponible con diferentes ejemplos para asegurar la consistencia. Los resultados mostrados en la fig. 1a demuestran que la miel de Manuka facilita un primer nivel de actividad de inhibición microbiana con diluciones del 50% a

25 aproximadamente el 6,25% y un segundo nivel de actividad de inhibición microbiana con diluciones de 3,125% a aproximadamente 0,195%.

Este efecto del segundo nivel lo han producido unos mecanismos separados. La inhibición microbiana inicial en una dilución de miel baja (50% - 6,25%) resulta de una combinación de un pH bajo y un Aw de crecimiento limitado (agua

30 disponible) y, de una forma mucho menor, por el peróxido de hidrógeno que solo es producido, de nuevo, con la dilución y después de un periodo considerable de tiempo. No existe peróxido de hidrógeno endógeno detectable presente en la miel de Manuka diluida o no diluida, tal y como muestra la Tabla 2.

Tabla 2

% dilución: 50.00 25.00 12.50 6.25

Miel de Manuka H2O2 mg/L (Tiempo 0 horas): pH 3,89 0 pH 4,35 0 pH 4,96 0 pH 5,95 0

Miel de Manuka H2O2 mg/L (Tiempo 3 horas): pH 3,89 0 pH 4,35 35 pH 4,96 35 pH 5,95 65

Perfil de generación de H2O2 de la miel de Manuka

A medida que se ha diluido la concentración de la miel y después del periodo transcurrido, se ha producido peróxido de 40 hidrógeno contribuyendo al efecto antimicrobiano.

El hecho de ajustar el pH de la miel de Manuka de su pH natural de alrededor de 4,0 a un pH de 7,0 no afecta considerablemente el perfil antimicrobiano Fig. 1b; Cuando las diluciones de miel de Manuka tienen un pH ajustado cercano al neutro seguido por una adición excesiva de catálisis, el perfil antimicrobiano de la miel se altera Fig. 1c. El

45 primer nivel de inhibición antimicrobiana solo se ve ligeramente afectado pero el segundo nivel se ve considerablemente afectado indicando que el efecto antibacteriano en el segundo nivel es principalmente el resultado de la liberación de peróxido de hidrógeno;

La creencia de que una actividad no peróxida también llamada factor único de la manuca (UMF) existe se debe a un

50 error en el procedimiento experimental. De forma específica, el fallo de otros grupos de investigación para neutralizar el pH de la miel de Manuka antes de añadir la catalasa hace que la catalasa añadida resulte ineficaz puesto que el pH de la miel es demasiado acídico para la actividad de la catalasa. Puesto que la miel a la que se ha añadido el exceso de catalasa sigue teniendo actividad antimicrobiana ha persistido la creencia de que existe un UMF. Tal y como muestra la Fig. 1b, el hecho de ajustar el pH de la miel de Manuka a un pH de 6,80 no afecta la actividad antimicrobiana. Un pH de 6,80 es cercano al pH óptimo para la actividad de la catalasa y, de acuerdo con esta condición, la catalasa añadida neutraliza la actividad del peróxido de hidrógeno alterando el perfil de la actividad antimicrobiana de la miel.

De forma sorprendente, también se ha encontrado que la ruta de la glucosa oxidasa no es operativa inmediatamente al aplicar la miel de Manuka y solo es operativa tras la dilución de la miel y después de que haya transcurrido un periodo de tiempo.

Ejemplo 2: Un sistema de generación de peróxido de hidrógeno de liberación sostenida y endógeno antimicrobiano prototipo

Una formulación prototipo con 31 +/- 5g de glucosa: 35 +/- 5g de fructosa: 7 +/- 2g de maltosa: 1,5 +/- de sacarosa se ha hecho mezclando los ingredientes, preparando una mezcla hasta un volumen final de 100 ml en agua destilada desionizada (DI), la mezcla se ha curado en autoclave. Se ha añadido glucosa oxidasa a un 0,05% en peso, que es una concentración similar a aquella obtenida con la miel de Manuka.

La Fig.2 muestra los resultados de un ensayo antimicrobiano con S. aureus usando esta formulación prototipo. La formulación prototipo de este ejemplo ha demostrado una actividad superior en comparación con la miel de Manuka. Es probable que el papel crítico desempeñado por la ruta enzimática de la glucosa oxidasa en el efecto antibacteriano aumente una vez libre de impurezas y reaccione limitando los componentes (como la catalasa) presentes en la miel. Este prototipo demuestra una actividad bactericida muy eficaz.

Ejemplo 2.1: Un sistema de generación prototipo de peróxido de hidrógeno de liberación sostenida y endógeno antimicrobiano en gel

Los agentes gelificantes, que son ingredientes comunes en las formulaciones farmacéuticas tópicas, se han añadido a la formulación prototipo y se han ensayado. Los geles probados incluyen celulosa reconstituida con agua y agentes de celulosa reconstituidos con alcohol (1. carbomero, 2. metocel, 2. polivinilpirrolidona y 4. goma xantana a un 25 en un hidrogel que incorpora la formulación prototipo). Los dos geles a base de celulosa han demostrado una disminución de la estabilidad. Es posible que el impedimento estérico y la hidrólisis de la glucosa oxidasa provoque una pérdida de la actividad antibacteriana. Incluso antes de la pérdida de actividad a causa de la disminución de la estabilidad, las formulaciones de gel a base de celulosa son tan activas como la formulación prototipo, tal como demuestran las zonas más pequeñas de inhibición en los ensayos de difusión (comparar la Fig. 3a (geles) con la Fig. 3b (formulación prototipo));

Ejemplo 2.2: Un sistema de generación de peróxido de hidrógeno con liberación sostenida y endógena antimicrobiana prototipo – formulación con un azúcar y gel enzimático

En un intento de resolver la estabilidad del gel descrita en el ejemplo 2.1, solo se han hecho las formulaciones con glucosa y glucosa oxidasa. Las formulaciones con glucosa con un 30 a un 80% de glucosa en agua se autoclavan y se calientan despacio hasta alcanzar el punto de ebullición para ayudar a disolver el azúcar. Durante la disolución mediante hervido, se han añadido varios agentes gelificantes y, a continuación, se han enfriado por debajo de los 40ºC y se ha añadido un 0,1% de glucosa oxidasa. Se ha probado la actividad antibacteriana de estas formulaciones (Fig. 4a).

Estas formulaciones demuestran solo un grado limitado de actividad antibacteriana y esta actividad se encuentra por debajo de aquella observada con la formulación antimicrobiana prototipo descrita en el ejemplo 2, tal y como se muestra en las zonas más pequeñas de inhibición en los ensayos de difusión de pozo/ disco (comparar la Fig. 4a (geles) con la Fig. 4b (prototipo));

Además de la reducción de actividad, estas formulaciones con unas altas concentraciones de glucosa se solidifican haciendo que las formulaciones sean inutilizables cuando se sitúan en tubos de aluminio. Los tubos con formulaciones con unas concentraciones bajas de glucosa han mostrado una ausencia de estabilidad, tal y como se ha demostrado con la reducción de actividad antimicrobiana a lo largo del tiempo.

Ejemplo 2.3: Características mejoradas de la formulación de un sistema de generación de peróxido de hidrógeno con liberación sostenida, endógeno, antimicrobiano – variando la concentración de carbohidrato y agua

Este ejemplo describe intentos por minimizar la cantidad de agua presente en formulaciones, de acuerdo con la invención, para reducir los problemas relativos a la estabilidad ya que un exceso de agua puede producir una hidrólisis de la glucosa oxidasa. Las formulaciones siguen necesitando suficiente agua para permitir la generación de H2O2, facilitar la aplicación y evitar la precipitación de azúcares durante el almacenamiento. Se mezclan y calientan varias

5 concentraciones de azúcares, tal y como se describe en el ejemplo 2.2 para determinar la fuente principal para la precipitación y la textura granular observada en las formulaciones anteriores. A partir de este análisis, las concentraciones de azúcar se han ajustado para reducir este efecto. Tras la adición de la enzima, se prueban unas formulaciones apropiadas para determinar la actividad antibacteriana.

10 Se ha encontrado que la concentración de agua podría reducirse desde un 20% a un 10% que es la concentración mínima que permite actividad enzimática, facilitar la aplicación y evitar la precipitación del azúcar.

El tratamiento caliente no controlado de azúcares tiende a producir una caramelización que provoca una formulación con una coloración de amarillo a marrón. Para eliminar la caramelización y producir una material claro, el proceso de

15 fabricación mencionado ha sido desarrollado para que la adición de azúcares y su disolución por calentamiento se seleccione cuidadosamente para evitar el proceso de caramelización. Se añade a esta formulación la enzima glucosa oxidasa y se ha valorado la actividad antibacteriana, la estabilidad y la adecuación para la aplicación. Estas mejoras de la formulación prototipo forman la base de todas las futuras formulaciones/ sistemas descritos en la presente invención.

20 Ejemplo 3: Sistema antimicrobiano con un solo componente con una reserva de peróxido de hidrógeno endógena y una liberación sostenida.

Se ha elaborado una formulación para un sistema antimicrobiano con un solo componente (en adelante, el “Sistema antimicrobiano” o A3IS o A31S, de acuerdo con la Tabla 3.

Tabla 3

Ingrediente: Porcentaje en peso

Agua purificada: 13,5 ajustado para hacer el 100%

Polvo de fructosa: 35% +/- 5

Polvo de glucosa: 38% +/- 5

Polvo de maltosa: 10% +/- 5

Polvo de sacarosa: 1.5% +/- 1

Polvo de glucosa oxidasa: 0,5% de enzima (5600U/g) predisuelta en un 1,5% de agua purificada.

TOTAL: 100%

30 El pH del A3IS se establece con un pH de 5,5. Este bajo pH se encuentra dentro del rango de actividad de la glucosa oxidasa (pH 4,0 – 7,0 pH óptimo de 5,5). Si fuera necesario, se puede añadir un amortiguador para obtener el pH deseado, tal y como se muestra en la Tabla 4. El amortiguador se disuelve previamente en agua purificada y sustituye una parte del agua purificada de la formulación anterior.

Tabla 4

Amortiguador opcional Ingredientes para un pH de 5,5: Porcentaje en peso

Ácido cítrico / citrato sódico: 0,918% disuelto previamente en un 2% de agua purificada para un pH de 5,5

Ácido fosfórico / fosfato de hidrógeno disódico: Un 1,598% disuelto previamente en un 2% de agua purificada para un pH de 5,5

5 Se entenderá que los diferentes índices de ingredientes amortiguadores pueden utilizarse en función del pH deseado.

Se entenderá que el Prototipo, tal y como se describe en el ejemplo 2 y el A3IS descrito facilitan formulaciones apropiadas para su uso de acuerdo con la invención. Los ejemplos siguientes muestran el análisis de varias características del A3IS.

10 Los azúcares descritos en la Tabla 3 se han añadido en la siguiente secuencia: fructosa, glucosa, maltosa y sacarosa. Cada carbohidrato se disuelve completamente en el agua calentándola a aproximadamente 90ºC antes de añadir el siguiente carbohidrato. De forma alternativa, los azúcares pueden prepararse como se ha indicado pero al vacío a 0,5 bares, reduciendo el punto de ebullición de los azúcares a una temperatura de menos de 90ºC evitando la decoloración.

15 Cuando los carbohidratos se disuelven totalmente y se limpian, la mezcla puede enfriarse por debajo de los 60ºC y se pueden añadir ingredientes amortiguadores opcionales previamente disueltos en el agua, en la mezcla principal.

Cuando la mezcla base está a una temperatura por debajo de los 40ºC, temperatura que permite la retención de la

20 actividad enzimática, la enzima glucosa oxidasa se ha disuelto previamente en el agua, se ha añadido y se ha dispersado en la mezcla. La mezcla podrá enfriarse a temperatura ambiente. Una vez fría, la mezcla se pone en tubos de aluminio que se sellan. Los tubos se almacenan a temperatura ambiente.

Ejemplo 3.1: Un sistema de generación de peróxido de hidrógeno con liberación sostenida y endógena antimicrobiana 25 prototipo – Variando la concentración y el tipo de enzima

Se sabe que la miel contiene varias enzimas además de la glucosa oxidasa, incluida la diastasa y la invertasa. Las enzimas diastasa e invertasa se han incorporado a la formulación prototipo del Ejemplo 2 para determinar si pueden mejorar la actividad antibacteriana global permitiendo una liberación más lenta pero sostenida de H2O2, actuando en

30 diferentes carbohidratos en la fórmula.

Hemos investigado varias combinaciones y concentraciones de la enzima para determinar esta actividad antibacteriana potencialmente mejorada. Se han añadido la diastasa y la invertasa en diferentes combinaciones al A3IS. y se han comparado con el A3IS. solo con glucosa oxidasa. No hemos encontrado ninguna mejora en la actividad antibacteriana

35 en ninguna de las formulaciones con varias enzimas.

También se han incorporado y comparado diferentes concentraciones de glucosa oxidasa mediante un ensayo espectrofotométrico para determinar su relación de cantidad/ actividad. La actividad antibacteriana del A3IS. aumenta proporcionalmente a la concentración de glucosa oxidasa. Un efecto antibacteriano sustancial se alcanza con una

40 concentración enzimática de un 0,05% (Fig. 5a).

Esto demuestra que puede conseguirse una gama de actividad antibacteriana variando la concentración de glucosa oxidasa. La enzima puede dispersarse con facilidad a través del material durante la mezcla.

45 Ejemplo 4: A3IS – un sistema de generación innovador y aumentado de peróxido de hidrógeno

El peróxido de hidrógeno se ha cuantificado siguiendo el método de (kerkvkiet 1996 y Serrano, y otros, 2004), mediante la tira de ensayo Merckoquant (nº 10011, Merck, Alemania). Los resultados se han expresado en miligramos de H2O2 por litro. La adecuación del procedimiento para la determinación del peróxido de hidrógeno se ha verificado añadiendo a las

50 diluciones de miel de Manuka preparadas líquido H2O2 y verificando que el ensayo puede detectar con precisión la cantidad presente de H2O2.

La Tabla 5 y la Fig. 5b muestran que el A3IS, con un 0,5% de 5600U/g de enzima Sigma Aldrich GOX y diluido en un 50% (C1), un 25% (C2), y un 12,5% (C3) o un 6,25% en agua desionizada (DI) genera unos niveles mayores de peróxido de hidrógeno en comparación con la miel de Manuka diluida en un 50% de agua destilada (DI).

Tabla 5

Muestra / mg H2O2 / l

Tiempo hr.: C1 C2 C3 C4 Manuca

0: 25 15 15 10
0

1: 55 25 20 10 15

2: 100 90 50 50 35

3: 90 90 75 60 55

4: 75 75 80 50 50

5: 75 75 75 65 40

6: 75 75 75 75 40

9: 75 75 50 50 35

La Fig. 5c muestra que el aumento de la producción de peróxido de hidrógeno (A3IS. diluido en un 25% en agua DI) se 10 mantiene durante un periodo de, al menos, 48 horas.

Ejemplo 4.1: A3IS – Aumento de la actividad antimicrobiana con un aumento de la concentración de la glucosa oxidasa

La Fig. 5d muestra una relación de respuesta a la dosis entre el rango de concentración de la glucosa oxidasa y el efecto 15 antimicrobiano con S. aureus, tal y como se ha medido utilizando un bioensayo de inhibición espectrofotométrica.

La Fig. 5d también demuestra que es posible dirigir la cuestión de la potencia/ eficacia, puesto que las formulaciones producidas pueden ajustarse mediante variaciones de la concentración de glucosa oxidasa que se incorpora durante la fabricación con los resultados mostrados con Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

Ejemplo 5: A3IS – Reserva de peróxido de hidrógeno endógeno

Cuando el A3IS. se mezcla con agua con un rango de dilución del 50% al 0,1%, se ha detectado inmediatamente la liberación de peróxido de hidrógeno. La Tabla 6 muestra que se ha detectado hasta 75 mg/L de peróxido de hidrógeno a

25 T=0. Esto contrasta con la miel de Manuka que falla al registrar cualquier liberación de peróxido en el minuto cero (Ver ejemplo 1 Tabla 2) y demuestra la presencia de una considerable reserva endógena de peróxido de hidrógeno generada durante el proceso de formulación.

Asimismo, después de tres horas de incubación de muestras diluidas, la cantidad de peróxido detectada en el A3IS 30 supera considerablemente aquella detectada en la miel natural, Tabla 6.

Tabla 6

Esta reserva endógena mostrada varía entre 10 y 75 mg/l de peróxido de hidrógeno en función de la cantidad de GOX presente en el A3IS y se muestra en la Fig. 5a, 5b y en la Tabla 6. Dicha reserva facilita ventajosamente peróxido de hidrógeno y su actividad antimicrobiana que actúan inmediatamente con la aplicación del A3IS. Al combinarla con un nivel más elevado de peróxido de hidrógeno, producido con la dilución, debería contribuir a aumentar considerablemente el efecto antimicrobiano en comparación con otros sistemas como la miel de Manuka.

Ejemplo 6: A3IS – La reserva de peróxido de hidrógeno endógeno es estable en su almacenamiento

Una característica sorprendente y ventajosa del A3IS es la retención de la actividad antimicrobiana y de la reserva de hidrógeno en el tiempo, tal y como se muestra en la Fig. 6.

La reserva de H2O2 disponible, producida por el A3IS es estable en su almacenamiento ya que los lotes situados de forma estable conservan los mismos niveles de H2O2, tal y como se ha detectado cuando los lotes han sido inicialmente producidos. La retención con estabilidad de H2O2 inmediatamente disponible es una característica única de las formulaciones del A3IS Mediante el uso de un ensayo de difusión de pozo para valorar la actividad antimicrobiana, demostramos que se mantiene un nivel consistente de actividad antimicrobiana en el tiempo. La Fig. 7a muestra las zonas de inhibición medidas en cada punto temporal de muestra y los resultados indican unos límites de confianza de un 95% durante un periodo de tres meses. De forma similar, la Fig. 7b muestra una estabilidad prolongada de la actividad antimicrobiana durante un periodo de 9 meses. Los datos de una estabilidad mayor indican que la formulación del A3IS no muestra ninguna pérdida de actividad incluso después de un periodo de 14 meses.

Mediante el uso de un ensayo de difusión de pozo para valorar la actividad antimicrobiana, demostramos que se mantiene un nivel consistente de actividad antimicrobiana en el tiempo. La Fig. 7a muestra las zonas de inhibición medidas en cada punto temporal de muestra y los resultados indican unos límites de confianza de un 95% durante un periodo de tres meses. De forma similar, la Fig. 7b muestra una estabilidad prolongada de la actividad antimicrobiana durante un periodo de 9 meses. Los datos de una estabilidad mayor indican que la formulación del A3IS no muestra ninguna pérdida de actividad incluso después de un periodo de 14 meses.

Ejemplo 7: A3IS– Potente actividad antimicrobiana contra el Staphylococcus aureus

El A3IS ha demostrado tener una actividad antimicrobiana contra el Staphylococcus aureus. La Fig. 8a y la Fig. 8b muestran unas curvas de eliminación de bacterias realizadas mediante el uso de dos protocolos separados, las directrices NCCLS, procedimiento (Fig. 8a) y un protocolo específico de un fabricante de dispositivos médicos (Fig. 8b), durante un periodo de 6,0 horas. El A3IS ha aumentado su eficacia en comparación con la miel de Manuka y en comparación con el apósito de plata;

La Fig. 8c. muestra los resultados de un ensayo de inhibición (con repeticiones de 3 días) para el A3IS, Medihoney® y un gel con un 10% de fenol probado contra 5 aislados clínicos de Streptococci beta hemolíticos del grupo A. El A3IS tiene un pH de 5,5 normal (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo), y se ha incluido un control negativo de A3IS sin GOX. La formulación del A3IS demuestra tener una eficacia in vitro comparable con un gel con un 10% de fenol y es superior a Medihoney®;

Ejemplo 8: A3IS – Potente actividad antimicrobiana contra el Campylobacter

El A3IS ha demostrado tener una actividad antimicrobiana contra el Campylobacter. La Fig. 8d muestra los resultados de un ensayo de inhibición (con repeticiones de 3 días) para la formulación del A3IS, la miel de Manuka y un gel con un 10% de fenol probado contra 5 aislados clínicos del Campylobacter spp. La formulación del A3IS tiene un pH normal de 5,5 (material A de ensayo) y un pH de 7 (material B de ensayo) y se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. Los resultados indican una eficacia in vitro considerable contra el Campylobacter y la superioridad del A3IS respecto a la miel de Manuka;

Ejemplo 9: A3IS – Potente actividad antimicrobiana contra el Propionibacterium acnes

El A3IS ha demostrado tener una actividad antimicrobiana contra el Propionibacterium acnes (P. acnes).

La Fig. 9a muestra los resultados de inhibición del A3IS contra el P. acnes en diferentes condiciones de incubación: aeróbico claro y oscuro, anaeróbico claro y oscuro. El A3IS demuestra un nivel elevado de actividad respecto al P. acnes, indicando los materiales potenciales para la aplicación tópica contra el acné. Los resultados para el A3IS se encuentran actualmente disponibles en productos comerciales para combatir el acné incluidos algunos productos comerciales que incorporan antibióticos, tal y como se muestra en la Fig. 9b. Estos resultados indican que el A3IS es comparable desde el punto de vista de la eficacia contra el acné in vitro con productos para combatir el acné comercialmente disponibles con clindamicina y peróxido benzoilo.

Ejemplo 10 A3IS - Potente actividad antimicrobiana contra el MRSA

La formulación del sistema antimicrobiano ha demostrado tener una actividad antimicrobiana contra 8 cadenas de MRSA en tres diferentes días y en comparación con un 10% de fenol estándar y con la miel de Manuka de la Fig. 10. Se ha inducido una formulación del A3IS con un pH normal de 5.5 (material A de ensayo) y con un pH de 7 (material de ensayo B) y se ha incluido un control negativo del A3IS sin GOX. Los resultados demuestran una eficacia considerable contra el MRSA y la superioridad del A3IS sobre la miel de Manuka y un control de un gel con un 10% de fenol. Las zonas de inhibición se muestran en la Fig. 11a. El material A de ensayo se ha ajustado a un pH de 5,5 y la muestra de ensayo B se ha ajustado a un pH de 7. La Fig. 11a muestra la mejora de los resultados del A3IS de aproximadamente de un 300% respecto a la miel de Manuka. Esto demuestra claramente que el A3IS tiene unas propiedades superiores y ventajosas respecto a la miel de Manuka.

Ejemplo 11: A3IS – Potente actividad antimicrobiana contra los aislados clínicos de la mastitis y la retención de actividad en la leche cruda

La Fig. 11b muestra los resultados en un ensayo de inhibición del A3IS (repeticiones de 3 días) en comparación con cuatro antibióticos (Vancomycin, Streptomycin, Tetracycline y Chloramphenicol) probados con 22 aislados clínicos de la mastitis causada por organismos de Staphylococcus aureus. La formulación del A3IS demuestra una eficacia in vitro superior a todos estos antibióticos. El aislado clínico número 15 es resistente al Vancomycin, Streptomycin y Tetracycline y muestra solo una ligera sensibilidad al Cloramphenicol, sin embargo, demuestra sensibilidad al A3IS.

La Fig. 11c muestra los resultados de un ensayo de inhibición (con una repetición de tres días) para el A3IS probado con 22 aislados clínicos de la mastitis provocada por organismos de Staphylococcus aureus. La formulación del A3IS demuestra una eficacia in vitro comparable con tres de los productos comercialmente disponibles con multiantibióticos contra la mastitis, probados con 22 aislados clínicos de la mastitis causada por organismos de Staphylococcus aureus.

La Fig. 11d muestra los resultados de un ensayo de inhibición (con una repetición de tres días) para el A3IS probado con un 2% de solución de nisina en 21 aislados clínicos de la mastitis provocada por organismos de Staphylococcus aureus. La formulación del A3IS demuestra tener una eficacia in vitro superior a la solución con un 2% de nisina. Nota: El aislado clínico número 15 de la fig. 11b no ha podido recuperarse del almacenamiento y no se ha incluido en este ensayo;

La Fig. 11e muestra la presencia de una colonia resistente a un 2% de nisina en la zona de inhibición durante el estudio de eficacia de la nisina. Las colonias resistentes al A3IS nunca se han observado en estudios de eficacia basados en la zona de ensayos de inhibición ni se han regenerado los cultivos producidos tras espectrofotometrías basadas en ensayos de inhibición del A3IS.

Se han inoculado cinco ml de leche cruda con 0,1 ml de un cultivo de un día de Staphylococcus aureus (con aproximadamente 5 x 107 cfu / ml) y se han añadido 0,5 ml de formulación del A3IS. Esta mezcla se ha incubado durante un día a 37ºC. A continuación, la mezcla se ha analizado buscando la producción de H2O2 y la supervivencia del Staphylococcus aureus inoculado. Se han detectado niveles en exceso de H2O2 en 100mg/l de esta leche y se han recuperado pocos Staphylococcus inoculados. La mezcla no muestra ningún signo de acidosis que podría esperarse tras un día de incubación a esta temperatura. Por el contrario, la leche cruda a la que no se añadió el A3IS está ácida y con coágulos. Este descubrimiento indica que el A3IS conserva su actividad incluso en un medio complejo como es la leche cruda.

Ejemplo 12: A3IS – Medición de la toxicidad/ irritación in vitro

La toxicidad/ irritación se determina utilizando fibroblastos humanos normales (NHFs ECACC 90011807) y queratinocitos humanos normales (NHKs CC-2501) crecidos en un medio esencial mínimo Eagle (EMEM) con 2 mM de L-Glutamina, un 10% de suero bovino fetal (FBS), incubado a 37ºC en un 5% de CO2. Se han realizado tres repeticiones de dos ensayos dimensionales con 24 y 12 placas pozo, utilizando 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-de bromuro difeniltetrazolio neutro y rojo (MTT), Sigma. Se han llevado a cabo ensayos de células de contacto directo con un “Kit de ensayo toxicológico in vitro” para valorar la viabilidad después de la incubación con unos materiales de ensayo durante 8 horas (control positivo de ázida sódica, concentraciones de gel de plata, gel de zinc, A3IS y soportes frescos – control negativo).

ISO 10993, pruebas de citotoxicidad de revestimiento de agar: también se ha utilizado un procedimiento in vitro con células L929 (fibroblastos de ratón ECACC 85011425). En resumen, se ha incubado una monocapa confluyente de células y, a continuación, se ha recubierto con una capa de medio fresco (EMEM, 2mM L-glutamina, 5% de FBS, 2% de penicilina-streptomicina) con 1,5g/l de agar suave y se ha dejado que solidifique. Una décima parte de la superficie se ha cubierto con materiales de ensayo (previamente descritos) y se ha incubado durante 24 horas. Se han retirado con cuidado los materiales de ensayo después de la incubación y se ha añadido una coloración vital (rojo neutro) en un medio fresco. Después de la incubación, se ha retirado, las células se han lavado y, a continuación, se ha extraído el tinte de las células y se ha cuantificado espectrofotométricamente la viabilidad celular.

Un modelo dérmico en tres dimensiones (Skinethic, Francia) también se ha utilizado para determinar el efecto de irritación de la formulación y se han realizado controles de queratinocitos diferenciados como el stratum corneum, un equivalente a la piel cultivada. El ensayo utiliza un modelo de piel epidérmica en tres dimensiones y se ha llevado a cabo en diferentes puntos temporales. El modelo de epidermis humana reconstituida está compuesto por una construcción de tejido epidérmico multicapa, vivo, aéreo, producido por introducciones de policarbonato en suero libre y en un medio químicamente definido, con una ultra estructura normal y una funcionalidad equivalente a la epidermis humana in vivo. Unos tejidos de epidermis humana reconstituida in vitro cuadruplicada, de 17 días, (con un tamaño de 0,63 cm2) se ha dosificado tópicamente con 2-10 mg/cm2 de la formulación de 3 a 24 horas y se ha valorado la viabilidad del tejido mediante un ensayo MTT, usando el protocolo validado de valoración de riesgo del Instituto Federal Alemán (BFR-ZEBET).

Se ha analizado el sobrenadante de cultivo celular del ensayo de irritación descrito anteriormente usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) IL-1 (R&D Systems), y lactato deshidrogenasa (LDH) ELISA (R&D Systems) para medir la citoquina y la enzima con el fin de valorar el efecto inmunoestimulatorio e irritante de los materiales de ensayo.

Las secciones cruzadas de los modelos de piel en 3D utilizados para el ensayo de irritación están colorados con hematoxilina y eosina (H&E), el procedimiento técnico ha incluido:

Fijación: Los tejidos se han estabilizado mecánica y bioquímica con un fijador. La fijación es formalina amortiguada neutra, con un 10% de formaldehido en una solución salina fosfatada (PBS).

Inhibición: La técnica utilizada es la inhibición con cera. Las muestras se han sumergido progresivamente en unas concentraciones aumentadas (20%, 30%, 40%, 50%, 80% y 100%) de etanol puro para deshidratar el tejido, a continuación, se ha añadido un quitamanchas, xileno (100%) y, finalmente, cera de parafina fundida en caliente (impregnación) y se han dejado enfriar y endurecer.

Seccionamiento: A continuación, el tejido de muestra se ha seccionado en secciones de 5 micrómetros mediante un micrótomo. Después, estos cortes se han situado en una lámina de vidrio para colorarlos.

Coloración: Para ver el tejido en un microscopio, las secciones se coloran con hematoxilina y eosina (H&E) para valorar el índice de degradación epidérmica de la superficie causado por cada material de ensayo.

La Fig. 12a y la Fig. 12b muestran los resultados de la valoración de toxicidad inicial del A3IS mediante los ensayos de viabilidad MTT en el NHFs (Fibroblastos humanos normales) y NHKs (queratinocitos humanos normales). Se ha calculado el porcentaje de toxicidad de acuerdo con la fórmula: % de toxicidad = 1 (media OD de los pozos de material de ensayo / media OD de los pozos de control correspondientes (sin material de ensayo añadido)) x 100. Se incluye en el ensayo un 50% de concentración del A3IS, un rango de concentraciones de una plata comercial con gel y zinc comercial con producto en gel, comparado con ázida sódica (control positivo). Para el ensayo de toxicidad, la concentración del material de ensayo utilizado se empleó dos veces para el ensayo de irritación, 100mg por pozo y el tiempo de contacto se prolongó a 8 horas.

La Fig. 12c muestra los resultados de la Norma Internacional ISO, un ensayo del revestimiento de agar 10993-5 para valorar la citotoxidad durante 24 horas usando rojo neutro en L929s. Se ha calculado el porcentaje de toxicidad de acuerdo con la fórmula: % de toxicidad = 1 (media OD de los pozos de material de ensayo / media OD de los pozos de control correspondientes (ázida sólida añadida)) x 100. Se incluye en el ensayo un 50% de concentración del A3IS, un rango de concentraciones de una plata comercial con gel y zinc comercial con producto en gel, comparado con ázida sódica (control positivo). El control positivo de ázida sódica da una toxicidad del 100%. Para el agar, el ensayo de toxicidad del revestimiento de los materiales de ensayo utilizados ha sido similar a aquel utilizado para los ensayos de contacto directo inicial de 100mg por pozo y el tiempo de contacto se ha extendido a 24 horas.

Los resultados del ensayo de irritación de los materiales de ensayo para un rango de tiempos de contacto utilizando el modelo de piel en 3D Skinethic® se muestra en la Fig. 12d. El modelo de epidermis humana reconstituida está compuesto por una construcción de tejido epidérmico multicapa, vivo, aéreo, producido por introducciones de policarbonato en suero libre y en un medio químicamente definido, con una ultra estructura normal y una funcionalidad equivalente a la epidermis humana in vivo. Los efectos de este contacto directo en las muestras de piel en 3D se muestran en las secciones cruzadas coloradas de hematoxilina/eosina (H&E) de las Fig. 12e y Fig. 12f para comparar la plata con producto en gel. Las Fig. 12g y 12h muestran secciones cruzadas coloradas de acuerdo con la formulación del A3IS en las muestras de piel en 3D. Los resultados muestran que la formulación de plata provoca la separación de la capa epidérmica de la capa basal mientras que la muestra de formulación del A3IS no muestra ningún daño.

Unos tejidos de epidermis humana reconstituida in vitro cuadruplicada, de 17 días, (con un tamaño de 0,63 cm2) se ha dosificado tópicamente con 2-10 mg/cm2 de la formulación de 3 a 24 horas y se ha valorado la viabilidad del tejido mediante un ensayo MTT, usando el protocolo validado de valoración de riesgo del Instituto Federal Alemán (BFR-ZEBET). Se ha calculado el porcentaje de irritación de acuerdo con la fórmula: % Irritación = 1- (media OD de pieles de material de ensayo /media OD de las pieles de control correspondientes (sin material de ensayo añadido)) X 100. El A3IS ha demostrado una irritación menor en el ensayo en tres dimensiones que los productos ensayados comercialmente disponibles.

Ejemplo 13: A3IS – Inducción a la liberación de IL-1 inflamatoria de las células epidérmicas

La Fig. 13a muestra el resultado del ensayo ELISA del sobrenadante de un ensayo de irritación en 3D durante un periodo de 48 horas, midiendo y comparando la liberación de IL-1 cuando está expuesto a la formulación del A3IS, a un control positivo de ázida sódica, y un producto de gel con plata comercial. Los resultados indican que el IL-1 se ha liberado de las células epidérmicas expuestas a la formulación del A3IS. La Fig. 13b ilustra la medición de la lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio celular utilizado durante el protocolo de ensayo de la irritación. Los resultados muestran una liberación de LDH por parte de las células tras su exposición a la formulación del A3IS, un control positivo de ázida sódica y una plata comercialmente disponible con producto en gel. La lactato deshidrogenasa es liberada por células expuestas a componentes destructivos. Los resultados indican que la formulación del A3IS es menos tóxica que los productos en gel comercialmente disponibles que contienen plata.

Ejemplo 14: A3IS – Esterilización del terminal

Se han llenado botellas de vidrio y tubos de plástico con A3IS. A continuación, se han esterilizado con radiación gamma. Después de la esterilización, se ha comparado la actividad antibacteriana de las muestras con los resultados antes de la esterilización. Se ha encontrado que la radiación gamma no reduce la actividad. Se ha producido una ligera decoloración del recipiente principal. Sin embargo, el proceso de radiación no ha afectado la actividad ni el color del material de ensayo. La Fig.- 14 muestra la eficacia del A3IS antes y después de la radiación gamma con S. aureus, el E. coli y el pseudomonas aeruginosa.

Ejemplo 15: A3IS – Incorporación en una matriz de colágeno-GAG /glicosaminogliano) – como revestimiento antibacteriano.

Fotografía del A3IS en GAG con S. aureus y fotografías de la infiltración de GAG (Fig.- 15a a Fig. 15c).

La matriz de colágeno-GAG (glicosaminoglicano) se ha descrito anteriormente (Wilkins, L., M., y otros, 1993. Development of a bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Organogenesis Inc.) se ha formulado y se ha añadido A3IS a la matriz con una proporción de 1:1.

La mezcla se ha vertido en una superficie estéril hasta formar una fina capa de aproximadamente 1 mm y se ha secado en una incubadora durante 24 horas hasta formar un apósito epidérmico. Una vez secas, se han cortado secciones de 1 cm y se han situado en placas de agar inoculado con S.aureus, E.coli y P.acnes. Se ha observado la actividad antibacteriana contra S.aureus, E.coli y P.acnes. Existen zonas definidas libres de inhibición y sin crecimiento bacteriano observadas bajo el revestimiento.

También se han situado las secciones de ensayo en una monocapa confluyente de NHFs (fibroblastos humanos normales) en 6 placas de pozo en el tiempo T0. Se ha encontrado que faltaba poco para la no toxicidad.

Las secciones de ensayo también se han co-incubado con células de NHF en pozos de cultivo celular. Se ha encontrado que además de adherirse al fondo de los pozos de cultivo celular, tal y como se esperaba, las células de NHF también se han infiltrado, uniéndose y creciendo en las secciones de ensayo. Esto demuestra que las matrices de colágeno-GAG que incorporan A3IS son matrices apropiadas para la unión y el crecimiento celular (ver Fig. 15b y Fig. 15c).

Ejemplo 16: A3IS – Incorporación en un gel alcohólico

El A3IS se ha mezclado con un gel alcohólico compuesto por alcohol absoluto, por un agente gelificante ultrez 10, por diisopropanolamina y propilenglicol, que se ha mezclado antes de la adición del A3IS creando un material limpio y no adhesivo. Esta formulación en gel se ha probado utilizando un bioensayo de difusión de superficie y de pozo para determinar las zonas de inhibición contra S. aureus, E. coli y P. acnes. En la Fig. 16a, se muestran los resultados para S. aureus. Se debe indicar que las zonas de inhibición son artificialmente bajas en esta situación a causa de la propiedad de absorción de la matriz de gel. Por lo tanto, no se permite la difusión libre a través de la matriz de agar sino que existe una zona libre alrededor de la matriz de gel.

La formulación de gel se somete a un estudio de estabilidad a corto plazo de 6 semanas, que incluye un ensayo de congelación/ descongelación. Los resultados han indicado que la formulación de gel ha mantenido su estabilidad a lo largo del periodo de ensayo Fig. 16b. Se muestran los resultados para S. aureus.

Ejemplo 17: A3IS – Incorporación en apósitos comercialmente disponibles

Fotografía del A3IS en apósitos Fig. 17

Se ha echado el A3IS en la superficie de una gama de apósitos comercialmente disponibles Kaltosta® (Comvita), Kendal® (Telfa) y una matriz de colágeno-GAG (clicosaminoglican), tal y como se ha descrito anteriormente y se ha difundido en un revestimiento durante varias horas hasta formar una fina capa. Se han cortado unas secciones de 1cm2 y se han situado en placas de agar, previamente inoculadas con S. aureus, E. coli y P. aeruginosa. La eficacia antibacteriana de los apósitos impregnados con se han comparado, a continuación, con apósitos de Aquacel ® (Convatec) y Betadine® (Seton) comercialmente disponibles que contenían plata y iodina elemental – Fig. 17. Se ha encontrado que los apósitos del A3IS son tan eficaces desde el punto de vista antimicrobiano como Aquacel ® (Convatec) y Betadine® (Seton) y los apósitos comercialmente disponibles que utilizan plata y iodina elemental.

Ejemplo 18: A3IS – Potente actividad antimicrobiana contra la onicomicosis

Un estudio de caso sobre la eficacia del A3IS en el tratamiento de las infecciones por hongos de las uñas se ha llevado a cabo en un voluntario humano. La uña infectada era la uña del dedo gordo del pie derecho y la infección estaba localizada en la parte izquierda de la uña. La infección había estado presente durante un periodo considerable de aproximadamente 2 años. Antes del tratamiento, se ha obtenido una fotografía de la uña infectada. Fig. 18a. El tratamiento se ha llevado a cabo una vez al día por la mañana, después de que el sujeto se diera una ducha y se secara con una toalla. Se ha aplicado el A3IS en la superficie de la uña sobre la zona infectada en lugar de en la totalidad de la superficie de la uña. A continuación, se ha cubierto el A3IS con una venda con un relleno humedecido con agua y, después, la uña se ha cubierto con un apósito oclusivo durante el resto del día. Fig. 18b. Este tratamiento se ha llevado a cabo diariamente durante un periodo de tres semanas. Después de un periodo de dos días, se ha tomado otra fotografía. Fig. 18c. Es evidente que la zona infectada de la uña ha cambiado y tiene ahora un color más oscuro. Durante el periodo de tratamiento, ha habido pocas pruebas de otra alteración física, salvo por un desarrollo de una zona cada vez mayor no infectada de la uña en crecimiento. Se ha tomado otra fotografía 8 semanas después del inicio del tratamiento. Fig. 18d. La franja de uña no infectada es claramente visible, lo que indica que los dermatofitos han sido eliminados.

Referencias mencionadas en la descripción

Esta lista de referencias mencionadas por el solicitante son solo para el lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al compilar las referencias no se descarta que pueda haber errores u omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente mencionados en la descripción

WO 03090800 A [0003]

Literatura no relativa a patentes mencionada en la descripción

Journal of Apiculture Research., vol. 35 (3), 110-117 PATTON T. et al. Journal of Microbiological [0129] Methods, 2006, 84-95 [0131]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Sistema inmunoestimulante y antimicrobiano estable en su almacenamiento que incluye glucosa oxidasa, D-glucosa, azúcares añadidos elegidos entre uno o varios entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente en una actividad de, al menos, 10 U para 100g del sistema;

la D-glucosa se encuentra presente de un 20 a un 85% en peso, respecto al peso del sistema total;

los azúcares adicionales elegidos entre uno o varios entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa se encuentran presentes de un 5 a un 70% en peso, respecto al peso del sistema total;

el agua se encuentra presente de un 10 a un 20% en peso, respecto al peso del sistema total;

el sistema tiene un pH aproximadamente de 4 a 8; y en el que el sistema facilita una liberación de hidrógeno en dos etapas en la que

(a)

el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena y estable en su almacenamiento es biodisponible en el sistema con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata; y

(b)

la liberación prolongada de peróxido de hidrógeno adicional durante, al menos, un periodo de veinticuatro horas, se produce en el momento de la rehidratación del sistema.
2.

Sistema según la reivindicación 1, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente con una actividad de, al menos, 100 U para 100 g del sistema.
3.

Sistema según la reivindicación 1, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente con una actividad de, al menos, 1750 U para 100 g del sistema.
4.

Sistema según la reivindicación 1, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente con una actividad de, al menos, 1400 U para 100 g del sistema.
5.

Sistema según la reivindicación 1, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente con una actividad de, al menos, 560 U para 1g del sistema.
6.

Sistema según la reivindicación 1, en el que la glucosa oxidasa se encuentra presente con una actividad de, al menos, 5600 U para 1g del sistema.
7.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los azúcares añadidos se encuentran presentes desde un 10 a un 70% en peso, a partir del peso del sistema total.
8.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fructosa se encuentra presente de un 8 a un 50% en peso, la maltosa se encuentra presente de un 4 a un 15% en peso, la sacarosa de un 0,5 a un 3% en peso respecto al peso del sistema total.
9.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los azúcares añadidos y la D-glucosa están presentes de acuerdo con una relación de aproximadamente 0,05:1 a un 3,5:1 en peso, respecto al peso del sistema total.
10.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el peróxido de hidrógeno producido de forma endógena y estable para su almacenamiento se encuentra biodisponible en el sistema con un nivel de, al menos, 75 mg por litro para una liberación inmediata.
11.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el índice de peróxido de hidrógeno con una liberación prolongada producido en el momento de la rehidratación del sistema es de, al menos, 10 mg por litro, preferiblemente de 20 mg por litro.
12.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye también un agente amortiguador, preferiblemente, ácido carbónico/ bicarbonato y/ o ácido fosfórico/ hidrogenofosfato disódico.
13.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye, además, al menos un ingrediente que modifica la viscosidad.
14.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores con un pH que va aproximadamente de 5 a 7, preferiblemente alrededor de 5,5.
15.

Sistema inmunoestimulante y antimicrobiano estable para su almacenamiento, de acuerdo con la reivindicación 5.

en el que la D-glucosa se encuentra presente de alrededor de un 26% a alrededor de un 37% o de alrededor de un 33 a un 43% en peso, respecto al peso del sistema total;

la sacarosa se encuentra presente de un 0,5% a un 2,5% en peso, respecto al peso del sistema total;

la fructosa se encuentra presente de un 30% a un 40% en peso, respecto al peso del sistema total;

la maltosa se encuentra presente de un 5% a un 15%, preferiblemente, de un 5 a un 9% en peso, respecto al peso del sistema total;
16.

Sistema inmunoestimulante y antimicrobiano estable en su almacenamiento, de acuerdo con la reivindicación 14 en el que la D-glucosa se encuentra presente de alrededor de un 33% a alrededor de un 43% en peso, respecto al peso del sistema total.
17.

Sistema inmunoestimulante y antimicrobiano, estable en su almacenamiento, de acuerdo con la reivindicación 6 que incluye glucosa oxidasa, D-glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa y un agente amortiguador opcional, en el que la D-glucosa está presente de alrededor de un 33% a alrededor de un 43% en peso, respecto al peso del sistema total;

la sacarosa se encuentra presente de un 0,5% a un 2,5% en peso, respecto al peso del sistema total;

la fructosa se encuentra presente de un 30% a un 40% en peso, respecto al peso del sistema total;

la maltosa se encuentra presente de un 5% a un 15% en peso, respecto al peso del sistema total;

el agua se encuentra presente de un 10 a un 20% en peso, preferiblemente un 13,5% respecto al peso del sistema total;

un agente amortiguador opcional en función de una cantidad eficaz para obtener un sistema con un pH aproximado de 4 a 8, preferiblemente de 4 a 7, y más preferiblemente 5.5.
18.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una forma adaptada para una administración tópica, enteral o parenteral.
19.

Sistema según la reivindicación 17, en forma de ungüento, crema, loción, aceite, linimento, líquido y/o gel tópico, preferiblemente adaptado para una administración intramamaria, o adaptado para una administración que forma parte de un sellado, tejido, vendaje y/ o apósito.
20.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método de blanqueamiento dental en el que la composición se encuentra en una forma adaptada para una administración mediante una o varios bandas de película soluble, hilo dental, dentífrico, enjuague bucal y/ o aparato dental.
21.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para su uso en un método de terapia, preferiblemente, en un método de tratamiento de una infección microbiana y/o en un método de reparación y/o de regeneración de tejidos y/o de células dañada(s).
22.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la infección microbiana está causada por bacterias Gram positivo, bacterias Gram negativo, bacterias ácido-resistentes, virus, levaduras, microorganismos parásitos o patógenos y/o hongos.
23.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la infección microbiana es una infección bucal, ocular y/o de oído, incluidas infecciones bucales como una enfermedad de las encías, una ulceración bucal y/o un trastorno de higiene bucal como la halitosis y/o la gingivitis.
24.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la infección microbiana es una infección de la piel y/o de las uñas, preferiblemente, una infección por hongos en la piel y/o en las uñas, como el pie de atleta y/o la dermatofitosis.
25.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en el tratamiento de la mastitis, incluida la mastitis exudativa y/o seca.
26.

Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en un método de tratamiento de una herida y/o una sepsis de herida, preferiblemente, cuando la herida es una herida aguda, una herida crónica, una herida quirúrgica, una quemadura crónica y/o una quemadura aguda.
27.

Uso del sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una infección microbiana y a la reparación y/o a la regeneración de células dañadas, preferiblemente, aumentando una respuesta inmunitaria para la estimulación de la liberación de interleukina 1.
28.

Procedimiento de fabricación de un sistema inmunoestimulador y antimicrobiano estable en su almacenamiento, que incluye glucosa, oxidasa, D-glucosa, uno o varios azúcares añadidos elegidos entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa y peróxido de hidrógeno en una solución acuosa, según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 19, incluidas las etapas que consisten en

a.

calentar el agua hasta una temperatura de, al menos, 60º C, preferiblemente, de alrededor de 75ºC a 95ºC;

b.

añadir la D-glucosa y uno o varios azúcares añadidos elegidos entre la sacarosa, la fructosa y/o la maltosa al agua calentada, para formar una solución de azúcar en el agua;

c.

enfriar la solución de azúcar en el agua hasta que alcance una temperatura inferior a alrededor de 40ºC para permitir la conservación de la actividad enzimática;

d.

añadir la glucosa oxidasa a la solución de azúcar en el agua de la etapa (c) agitándola durante el tiempo suficiente para formar peróxido de hidrógeno en un índice controlado predeterminado; y

e.

enfriar la mezcla resultante derivada de la etapa (d) hasta que alcance una temperatura ambiente para generar un sistema con peróxido de hidrógeno producido de forma endógena, estable en su almacenamiento y biodisponible, con un índice de, al menos, 10 mg por litro para una liberación inmediata.

Fig. 12e

Fig. 12f Fig. 12g

Fig. 12h

Fig. 15b

Fig.15c

Fig. 16a

Fig. 18a

Fig. 18b

Fig.18c

Fig. 18d