JP5603505B2

JP5603505B2 - マヌカ蜂蜜に含まれる新規化合物及びその利用

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Inventors: 陽二加藤
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Description

本明細書は、マヌカ蜂蜜に含まれる新規化合物及びその利用に関する。

マヌカ蜂蜜はニュージーランドにのみ生息するマヌカ（Leptospermum scoparium）の花の蜜に由来するニュージーランド特有の蜂蜜であり、高い抗菌活性やその他の生理機能を有することが知られている。ただし、オーストラリアにマヌカの亜種（Leptospermum polygalifolium）が存在し、そこからもマヌカ蜂蜜（ジェリーブッシュ蜂蜜）が採取されている。

マヌカ蜂蜜は、例えば胃がんの元となるピロリ菌を高い抗菌活性で除菌できる可能性があるとされている。こうした抗菌活性などの生理活性は、マヌカ蜂蜜でも変動が大きいとされている。

そこで、マヌカ蜂蜜の抗菌活性などの生理活性の一つの指標として、フェノール活性に換算された抗菌活性に基づく「ユニークマヌカファクター」（Unique Manuka Factor, UMF）が用いられている。また、マヌカ蜂蜜の抗菌活性成分がメチルグリオキサール（Methyglyoxal、MGO）というアルデヒドであるという報告（非特許文献１、２）がある（図９参照）。この報告に基づいて、マヌカ蜂蜜の生理活性の指標としてＭＧＯ量が用いられる場合もある。

さらに、マヌカ蜂蜜には以下に示すメチルシリンゲート（ＭＳＹＲ）が含まれており、活性酸素の消去能を有していることも報告されている（非特許文献３）（図９参照）。このメチルシリンゲートは、マヌカ蜂蜜以外にも、イタリアサルディニア島で得られたアスフォデル蜂蜜にも大量に含まれていることが知られている（文献４）。加えて、メチルシリンゲートに１つの糖が結合した配糖体がアニスシードから単離同定されている（文献５）。

Isolation by HPLC and characterisation of the bioactive fraction of New Zealand manuka (Leptospermum scoparium) honey. Adams CJ, Boult CH, Deadman BJ, Farr JM, Grainger MN, Manley-Harris M, Snow MJ. Carbohydrate Res. 2008; 343(4): 651-659. Identification and quantification of methylglyoxal as the dominant antibacterial constituent of Manuka (Leptospermum scoparium) honeys from New Zealand. Mavric E, Wittmann S, Barth G, Henle T, Mol Nutr Food Res. 2008; 52(4): 483-489. Identification of phenolic compound in manuka honey as specific superoxide anion radical scavenger using electron spin resonance (ESR) and liquid chromatography with coulometric array detection. Koichi Inoue, Shinho Murayama, Fumie Seshimo, Kazue Takeba, Yoshihiro Yoshimura, and Hiroyuki Nakazawa. J. Sci. Food Agric. 85, 872-878, 2005. Methyl syringate: a chemical marker of asphodel (Asphodelus microcarpus Salzm. Et Viv.) monofloral honey. Tuberoso CI, Bifulco E, Jerkovi? I, Caboni P, Cabras P, Floris I. J Agric Food Chem. 2009, 57(9): 3895-3900. Aromatic compound glucosides, alkyl glucoside and glucide from the fruit of anise. Fujimatu E, Ishikawa T, Kitajima J. Phytochemistry. 2003, 63(5): 609-616.

しかしながら、ＵＭＦの評価には、抗菌活性を測定することが必要であり簡易性や迅速性に問題があった。また、ＭＧＯ量の測定も、一旦、キノキサリン誘導体とした後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定するなど、迅速な評価が困難であるという問題があった。

また、マヌカ蜂蜜には、抗菌活性のほか各種の効能があるとされている。その有効成分の一つとして上記したＭＧＯやＭＳＹＲが知られているものの、さらに他の有効成分が存在する可能性もある。そして、その化合物がより有効なマヌカ蜂蜜の抗菌活性等の生理活性の有効な指標となる可能性もある。

そこで、本明細書は、マヌカ蜂蜜の生理活性有効成分を見出すことを一つの目的とする。

本発明者は、マヌカ蜂蜜について新規な有効成分を、抗炎症作用活性に基づきミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）阻害活性評価系を用いてスクリーニングすることに着目した。そして、スクリーニングの結果、高いＭＰＯ阻害活性を示す化合物を見出し、当該化合物をＭＳＹＲに二糖（ゲンチオビオース）が配糖した新規化合物である Methyl 4-O- [β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl] -3,5-dimethoxybenzoate（メチル-４-Ｏ［β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-β-Ｄ-グルコピラノシル］-３，５-ジメトキシベンゼン酸（ＭＧＧＤ）と同定し、新規化合物であることを見出した。また、同時に３糖体及び４糖体も見出した。さらに、本発明者は、ＭＧＧＤがマヌカ蜂蜜の指標であるＵＭＦと相関していることを見出し、抗菌活性等の指標にもなりうるという知見を得た。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。

（１）以下の式で表される、化合物。
（上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基を表し、ｍは、１〜３の整数を表し、Ｒ_4-m、Ｒ_5-m及びＲ_6-mは、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基を表し、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉及びＲ₁₀は、それぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４の置換されていてもよいアルキル基を表す。）
（２）前記式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、いずれも水素原子である、（１）に記載の化合物。
（３）前記式中、Ｒ_4-m、Ｒ_5-m及びＲ_6-mは、いずれも水素原子である、（１）又は（２）に記載の化合物。
（４）前記式中、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉及びＲ₁₀は、いずれも水素原子である、（１）〜（３）のいずれかに記載の化合物。
（５）以下の式で表される、（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物を有効成分とする、ミエロペルオキシダーゼ活性阻害剤。
（７）さらに、メチルシリンゲートを含む、（６）に記載のミエロペルオキシダーゼ活性阻害剤。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物を含む、蜂蜜の評価用マーカー。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物と、
メチルシリンゲートと、
を含む、蜂蜜評価用マーカーキット。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物の製造方法であって、
マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液を水・低級アルコール混液で溶出される画分を回収する第１のクロマトグラフィー工程を、備える、製造方法。
（１１）前記第１のクロマトグラフィー工程は、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂材料からなる固相を用いる工程である、（１０）に記載の製造方法。
（１２）前記第１のクロマトグラフィー工程は、水〜低級アルコールの傾斜組成又は段階組成を有する移動相を用いたクロマトグラフィー工程である、（１０）又は（１１）に記載の製造方法。
（１３）さらに、前記画分を酸性移動相で溶出される画分を回収する第２のクロマトグラフィー工程を備える、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法。
（１４）前記第２のクロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィー工程である、（３に記載の製造方法。
（１５）さらに、前記第１のクロマトグラフィー工程に先立って、
マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液から、より親水性の第１の画分と、前記化合物を含みより疎水性の第２の画分と、を分離する工程と、
前記第２の画分から、メチルシリンゲートを含みより疎水性の第３の画分と前記化合物を含みより親水性の第４の画分とを分離する工程と、
を備える、（１０）〜（１４）のいずれかに記載の製造方法。
（１６）マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜から（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物を取得するための処理方法であって、
マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液から、より親水性の第１の画分と、前記化合物を含みより疎水性の第２の画分と、を分離する工程と、
前記第２の画分から、メチルシリンゲートを含みより疎水性の第３の画分と前記化合物を含みより親水性の第４の画分とを分離する工程と、
を備える、方法。
（１７）蜂蜜中の（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物の測定方法であって、
蜂蜜の水性溶液を酸性移動相で溶出される画分を回収するクロマトグラフィー工程、
を備える、製造方法。
（１８）蜂蜜中の（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物の量を測定する工程を、備える、蜂蜜の評価方法。
（１９）さらに、蜂蜜中のメチルシリンゲート量を測定する工程を、備える、（１８）に記載の評価方法。
（２０）蜂蜜中の抗菌活性及び抗炎症活性から選択される作用を評価する、（１８）又は（１９）に記載の評価方法。

配糖体MGGD のＮＭＲ相関（HMBC）Key HMBC correlations 配糖体MGGD の赤外スペクトＦＴ−ＩＲチャートＱ１マススキャンによる配糖体MGGD の質量分析スペクトルＭＳチャートプロダクトスキャンによる配糖体MGGD の質量分析スペクトルＭＳチャートマヌカ蜂蜜の高速液体クロマトグラフィー分析図 UMF 値とメチルシリンゲートＭＳＹＲ及び配糖体MGGD 量の相関（縦軸は蜂蜜グラムあたりのモル数）アスフォデル蜂蜜の高速液体クロマトグラフィー分析図（メチルシリンゲートＭＳＹＲ）マヌカ蜂蜜とアニスシードにおける配糖体ＭＧＧＤの検出（LC/MS/MS 質量分析器）ＭＧＧＤのＭＰＯ阻害活性を評価した結果を示す図である。メチルグリオキサールとメチルシリンゲートの構造を示す図である。

本明細書の開示は、マヌカ蜂蜜中の抗炎症活性等に関連する新規配糖体化合物及びその利用に関する。本発明の新規配糖体（以下、単に本新規配糖体という。）は、ＭＰＯ阻害活性を有する。マヌカ蜂蜜中に含まれるＭＳＹＲは、本新規配糖体と同様にＭＰＯ阻害活性を有しており、本新規配糖体、若しくはこれに加えてＭＳＹＲは、ＭＰＯ活性阻害剤として用いることができる。

また、マヌカ蜂蜜中の本新規配糖体量は、マヌカ蜂蜜の抗菌活性の指標とされるＵＭＦと相関しており、マヌカ蜂蜜等の蜂蜜の評価用マーカーとしても有用である。さらに、本新規配糖体は、液体クロマトグラフィーなどにより簡便かつ短時間での定量が可能である。これにより、従来のように、煩雑かつ時間のかかる抗菌活性を測定することなく、ＵＭＦと同等の評価が可能となる。

さらに、マヌカ蜂蜜中のＭＰＯ阻害活性を有するＭＳＹＲ量が、ＵＭＦと逆相関することも新たに見出した。ＭＳＹＲも本新規配糖体と同様に、簡易に抽出測定ができる。したがって、ＭＳＹＲによっても、マヌカ蜂蜜を評価できることがわかった。

本新規配糖体は、優れたＭＰＯ活性を有するのみならず、マヌカ蜂蜜における生理活性の指標となる。さらには、蜂蜜中の本新規配糖体を簡易にかつ迅速に測定できる。したがって、本新規配糖体は、マヌカ蜂蜜等の蜂蜜の生理活性を簡易にかつ迅速に評価できる有利なマーカーとして利用できる。本新規配糖体は、マヌカ蜂蜜に含まれる他の指標性化合物であるＭＧＯよりも優位である。ＭＧＯは、誘導体化後にＨＰＬＣで測定するなど、煩雑な操作を要するからである。

以下、本明細書の開示に関する実施形態について詳細に説明する。

（本新規配糖体）
本新規配糖体は、以下の式で表される。

本新規配糖体は、上記式で表されるように、ＭＳＹＲ誘導体に２〜４個のグルコースが配糖した配糖体である。この化合物は、本発明者が、マヌカ蜂蜜の抗炎症活性に着目し、ＭＰＯ活性を有する化合物をスクリーニングをする過程で見出した新規化合物である。

本新規配糖体は、上記式中、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基で表される化合物を含む。炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖状であってもよいし、分枝状であってもよい。より具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられる。これらのアルキル基における１又は２以上の水素原子は置換されていてもよい。例えば、水酸基、ハロゲン原子、ヒドロキシアルキル基等が挙げられる。本新規配糖体は、好ましくは、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃は、いずれもメチル基である。

本新規配糖体は、上記式中、ｍは、１〜３の整数を表す化合物を含む。ｍが１のとき、２つのグルコース誘導体が配糖した配糖体（ＭＧＧＤ）となり、ｍが２のとき、グルコース誘導体が３個配糖した配糖体となり、ｍが４のとき、グルコース誘導体が４個配糖した配糖となる。本発明者は、ＭＳＹＲにグルコースが３個及び４個配糖した配糖体も同時にマヌカ蜂蜜からスクリーニングしている。

本新規配糖体は、上記式中、Ｒ_4-m、Ｒ_5-m及びＲ_6-mが、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す化合物を包含する。炭素数１〜４のアルキル基については、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃におけるアルキル基と同義である。また、置換基もＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃におけるアルキル基の置換基と同義である。

なお、上記式において、ｍが１のとき、Ｒ_4-1、Ｒ_5-1及びＲ_6-1は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、ｍが２のとき、Ｒ_4-1、Ｒ_5-1及びＲ_6-1並びにＲ_4-2、Ｒ_5-2及びＲ_6-2は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。さらに、ｍが３のとき、Ｒ_4-1、Ｒ_5-1及びＲ_6-1、Ｒ_4-2、Ｒ_5-2及びＲ_6-2、並びにＲ_4-3、Ｒ_5-3及びＲ_6-3は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。

本新規配糖体は、Ｒ_4-m、Ｒ_5-m及びＲ_6-mが、水素原子がこれらにおいて優性であることが好ましい。より好ましくは、Ｒ_4-m、Ｒ_5-m及びＲ_6-mのいずれもが水素原子である。

本新規配糖体は、上記式中、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉及びＲ₁₀が、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す化合物を包含する。炭素数１〜４のアルキル基については、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃におけるアルキル基と同義である。また、置換基もＲ₁、Ｒ₂及びＲ₃におけるアルキル基の置換基と同義である。本新規配糖体は、Ｒ₇、Ｒ₈、Ｒ₉及びＲ₁₀が、いずれも水素原子であることが好ましい。

本新規配糖体の一例として、以下の式で表される化合物（ｍは１〜３の整数）が挙げられる。典型的には、以下の式においてｍが１である、Methyl 4-O- [β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl] -3,5-dimethoxybenzoate（メチル４-Ｏ-［β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-β-Ｄ-グルコピラノシル］−３，５-ジメトキシベンゼン酸）（ＭＧＧＤ）が挙げられる。

（式中、ｍは１〜３の整数を表す。）

（ＭＰＯ活性阻害剤）
本発明のＭＰＯ活性阻害剤は、本新規配糖体を有効成分とすることができる。本新規配糖体は、ＭＰＯ阻害活性を有する。本発明者らは、ＭＧＧＤにつきＭＰＯ阻害活性を見出しているが、ＭＳＹＲについてＭＰＯ阻害活性があること及び１−６βグリコシド結合を切断する酵素の普遍的な存在を考慮すると、ＭＧＧＤを含む本新規配糖体は、ＭＰＯ阻害活性を有するかあるはその前駆体であるといえ、新規配糖体はいずれも、ＭＰＯ阻害活性剤として機能するといえる。

本新規配糖体についてＭＰＯ阻害活性は、例えば、文献（Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003, 67(5), p1136-1139）に記載の方法で測定することができる。すなわち、Ｌ−チロシンを基質とし、リン酸緩衝液（pH 7.4）に溶解し、これに酵素ミエロペルオキシダーゼ、阻害物質候補化合物を加えておき、これに、過酸化水素を添加して酵素反応を開始させ、１５分間、３７℃で保温した後、カタラーゼを添加し、残存した過酸化水素を除去することで反応を停止させる。遠心式限外濾過膜により低分子のみ取り出し、逆相HPLC（ODS系のカラムの使用）によりジチロシンに由来する蛍光を励起波長300nm、蛍光波長400nmで検出する。ジチロシンに由来するピークの増減を測定することで、MPO阻害活性の評価が可能となる。

ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、主として好中球に存在する酵素であって、バクテリア感染における生体防御に深く関わるとされている。ＭＰＯは、過酸化水素とハロゲンの共存下で、次亜塩素酸や次亜臭素酸といった強力な活性種を生成することで、生体内に侵入した微生物を排除することが報告されている。また、ＭＰＯはアテローム性動脈硬化病変、肺がん、アルツハイマー、多発性硬化症と関連することも報告されている。さらに、ＭＰＯは、アテローム性動脈硬化病変部位に存在し、炎症と心血管疾患の発症メカニズムに関わっていることが報告されている。したがって、ＭＰＯ阻害活性は、抗炎症作用や例示した疾患を含む各種疾患に関連（予防、治療等）するといえる。ＭＰＯ阻害活性を有する化合物に抗炎症作用を期待できる。

マヌカ蜂蜜に由来してＭＳＹＲ（メチルシリンゲート）もＭＰＯ阻害活性があることが既に報告されている。ＭＳＹＲは、ＭＧＧＤと同時にマヌカ蜂蜜から分取できる。これらの双方を含むＭＰＯ活性阻害剤は、有用である。

（蜂蜜の評価用マーカー、キット及び蜂蜜の評価方法）
（蜂蜜の評価用マーカー）
本明細書に開示される蜂蜜の評価用マーカー（以下、単に本マーカーともいう。）は、本新規配糖体を含んでいる。本新規配糖体は、マヌカ蜂蜜の生理活性等の既知の評価指標であるＵＭＦと相関している。すなわち、ＵＭＦが高値であるマヌカ蜂蜜は、本新規配糖体も高値である。したがって、本新規配糖体を指標とすることで、ＵＭＦの評価が可能となる。なお、本発明者らによれば、本新規配糖体は、いわゆるマヌカ蜂蜜の他にはほとんど見出されていない。マヌカ蜂蜜は、ニュージーランドにのみ生息するマヌカ（Leptospermum scoparium）やこの亜種（Leptospermum polygalifolium）以外に由来する蜂蜜においては、ニュージーランド産の蜂蜜に微量に存在する場合があるのみである。したがって、本新規配糖体の含有の有無及びその量を測定することにより、蜂蜜の生理活性、品質等を評価することができる。また、マヌカ蜂蜜か否かの判定のほか、新たに本新規配糖体を含む蜂蜜をスクリーニングするのにも用いることができる。

本マーカーは、本新規配糖体が特に抗菌活性の指標であるＵＭＦと相関することから、抗菌活性評価用として用いることができる。また、本マーカーは、本新規配糖体がＭＰＯ阻害活性を有することから、蜂蜜のＭＰＯ阻害活性に代表される抗炎症活性評価用として用いることもできる。

本新規配糖体をマーカーとして用いるには、蜂蜜から本新規配糖体を分離し、本新規配糖体を同定又は定量する。蜂蜜からの本新規配糖体の分離ないし同定、定量については、後段にて説明する。本新規配糖体を同定するには、実施例等に開示する公知の分析装置を用いた方法を適用できるほか、標準物質として本新規配糖体を準備して、クロマトグラフィー等を用いて対比してもよい。本新規配糖体の定量にも各種方法が適用できる。なお、ＭＳＹＲもマーカーとして用いる場合においても、ＭＳＹＲは、本新規配糖体と同様の態様で分離、同定、定量が可能である。

（評価用キット）
本明細書に開示される蜂蜜の評価用キットは、本新規配糖体と、メチルシリンゲートと、を含むことができる。本発明者は、メチルシリンゲート（ＭＳＹＲ）量が、マヌカ蜂蜜のＵＭＦと逆相関していることも見出した。したがって、ＵＭＦと相関する本新規配糖体とＵＭＦと逆相関するＭＳＹＲとを組み合わせることで、より特異性の高い評価が可能となる。

（蜂蜜の評価方法）
本明細書に開示される蜂蜜の評価方法は、蜂蜜中の本新規配糖体を同定又は本新規配糖体の量を測定する工程を、備えることができる。上記したように、本新規配糖体は、蜂蜜の生理活性の評価用として有用であるからである。また、ＭＳＹＲを同定又はその量を測定する工程を備えていてもよい。より特異性の高い評価が可能になるからである。本評価方法は蜂蜜の抗菌活性や抗炎症活性などの生理活性を評価できる。

（本新規配糖体の製造方法）
本新規配糖体の製造方法は、マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液を水・低級アルコール混液で溶出される画分を回収する第１のクロマトグラフィー工程を備えることができる。本製造方法によれば、容易に、本化合物を得ることができる。

（第１のクロマトグラフィー工程）
水・低級アルコール混液において、水は、酸性液であってもよい。酸は、酢酸やギ酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸及び無機酸であってもよい。また、水は、酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの塩を含んでいてもよい。低級アルコールは、水と相溶するアルコールであることが好ましく、具体的には、炭素数１〜４の直鎖及び分枝アルコールを用いることができる。メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールが挙げられる。

第１のクロマトグラフィー工程におけるクロマトグラフィーの形態は特に限定しない。カラム状のクロマトグラフィーに限定しないで各種形態を採りうる。また分離用材としては、一般的に低分子化合物を分画できる担体を用いることができる。典型的には、芳香族系及び／又は鎖状炭化水素系の構造を有する疎水性（逆相）の担体を用いることができる。例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂材料からなる担体を用いることができる。なお、担体は、適当な細孔を有していてもよい。また、その外形形状も特に限定しない。

本新規配糖体は、水・低級アルコール混液によって溶出ないし抽出される画分に含まれている。その比率は、担体の種類によっても異なるが、本新規配糖体を水・低級アルコール混液の比率を適宜変更しつつ回収することで、本新規配糖体を溶出等するのに適当な比率を決定できる。また、必要に応じて、分離精製が可能であるし、粗分画であっても有利である場合もあるので、粗精製であってもよい。

例えば、典型的な疎水性担体（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂材料）を用いた場合であって、水とメタノールなどの低級アルコールの経時的な傾斜組成を有する移動相（グラジェント）ないし組成比を段階的に異ならせた移動相による溶出（ステップワイズ）を用いてクロマトグラフィーを行うとき、水・低級アルコール混液の体積比が７：３〜４：６の画分に本新規配糖体が分画されやすい。より具体的には、同体積比が７：３〜５：５であり、さらに具体的には同体積比が７：３〜６：４であり、一層具体的には同体積比が６：４の画分である。

（第２のクロマトグラフィー工程）
さらに、前記画分を酸性移動相で溶出される画分を回収する第２のクロマトグラフィー工程と、を備えることができる。こうすることで、より純度の高い本新規配糖体を得ることができる。また、本化合物の同定や検出も同時に可能である。

こうした第２のクロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィーを用いることが好ましい。担体としては、炭素数が８以上２０以下程度のアルキル基を備える逆相担体を用いることが好ましい。また、移動相も担体に応じて適宜設定できるが、配糖体であることから、水を含有する移動相が好ましく、本新規配糖体の構造を考慮すると、酸性の移動相により溶出されやすくなることが推測される。したがって、移動相としては、酸性の水相と有機相との混液あるいはグラジェントが好ましく用いられる。移動相のための水相としては、トリフルオロ酢酸、酢酸、ギ酸などの酢酸酸性の水等が挙げられ、有機相としては、アセトニトリル、メタノール、ブタノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等が挙げられる。

また、第２のクロマトグラフィー工程は、親水性基を固相に保持しており親水性化合物を保持するように構成された親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いることができる。

本新規配糖体を分取するには、溶出される画分につき、本新規配糖体の含有を適当な検出手段を用いて検出し、本新規配糖体含有画分を同定し、必要に応じて、当該画分から本新規配糖体を分離し、必要に応じてさらに精製する。本新規配糖体のような配糖体を、クロマトグラフィーを用いて分画した際の、さらなる精製方法等は当業者において周知である。

本新規配糖体の検出手段は特に限定しない。一般的な紫外吸収検出器を用いることができるほか、本新規配糖体の構造に応じた検出手段（例えば、ＭＳ等など）を用いることができる。検出波長は特に限定しないが、本新規配糖体に特徴的な波長２６２nm及びその近傍（±２０〜５０ｎｍ程度）を好ましく用いることができる。

第２のクロマトグラフィー工程は、高精度で本新規配糖体を検出し、同定し、さらには定量することも可能である。高速液体クロマトグラフィーを用いることにより、溶出画分を、経時的に適当な検出手段で本新規配糖体やＭＳＹＲを検出し分取し、標準物質等を用いて同定し、定量することができる。

以上の本新規配糖体の製造方法においては、ＭＳＹＲも蜂蜜から分取できる。第１のクロマトグラフィー工程において、本新規配糖体と同時に、あるいは水・低級アルコール混液の比率を本新規配糖体よりも低級アルコールより多くする、例えば、水・低級アルコール混液の体積比率を６：４から４：６又はそれに近づけていくことにより、本新規配糖体と同時にあるいはよりＭＳＹＲを高濃度に分離できる。そして、さらに、本新規配糖体と同様に第２のクロマトグラフィーを適用することで、本新規配糖体が共存していても、ＭＳＹＲを分離して検出し、同定し、定量することができる。典型的な第２のクロマトグラフィーでは、ＭＳＹＲは、本新規配糖体と良く分離される。

なお、第１のクロマトグラフィー工程に蜂蜜の水溶解液を適用するのに先だって、以下の工程を採用することもできる。すなわち、マヌカ又はその亜種に属する植物体を蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液から、より親水性の第１の画分と、新規配配糖体を含みより疎水性の第２の画分とを分離する第１の分離工程と、第２の画分から、メチルシリンゲートを含みより疎水性の第３の画分と新規配糖体を含みより親水性の第４の画分とを第２の分離する工程と、を備える、ようにすることもできる。こうした前処理を行うことで、スケールアップが可能となり、また、後段の第１のクロマトグラフィー工程や第２のクロマトグラフィー工程での分離性等を向上させることができる。さらに、第２のクロマトグラフィー工程を省略あるいはスピード化合物させることができる。

第１の分離工程は、第１の画分に蜂蜜水性溶液中の水溶性化合物及び糖分を分離し、第２の画分に本新規配糖体を分離できる。第１の分離工程における手法は特に限定しないで、本新規配糖体と蜂蜜中の糖分やその他の水溶性化合物の極性等を考慮して適宜実施できる。例えば、以下の方法を採用できる。

第１の分離工程は、例えば、第１のクロマトグラフィー工程で用いる担体に当該溶解液を適用して実施できる。適用の形態は特に問わないで、カラムクロマトグラフィー形態であってもよいし、適当な容器内で担体と溶解液とを接触混合させてもよい。こうすることで、本新規配糖体やメチルシリンゲートは、疎水性の担体（第２の画分）に分配されるが、より親水性の水溶性化合物や糖分は水相（第１の画分）に分配される。水相を洗浄・除去することで、担体に本新規配糖体やメチルシリンゲートを保持させて水溶性化合物及び糖分を効率的に除去できる。なお、水相による水溶性化合物及び糖分の除去は、必要に応じて適数回繰り返される。担体からの本新規配糖体及びメチルシリンゲートは、担体をメタノールで洗浄溶出することで回収し、これを第２の画分とすることができる。

第２の分離工程では、第２の画分から、メチルシリンゲートを含むより疎水性の第３の画分と本新規配糖体を含むより親水性の第４の画分とを分離する。第２の分離工程における手法は特に限定しないで、本新規配糖体と蜂蜜中の糖分やその他の水溶性化合物の極性等を考慮して適宜実施できる。例えば、以下の方法を採用できる。

第２の分離工程は、例えば、第２の画分からメタノール等の溶媒を蒸発等により除去し、濃縮したものに、酢酸エチルなどのＭＳＹＲを溶解するＭＳＹＲ親和性溶媒及び水などの当該ＭＳＹＲ親和性溶媒と相溶しないで相分離するとともに本新規配糖体を溶解する本新規配糖体親和性溶媒とを加えて分液ロート等を用いて液液分配を行う。本新規配糖体は水層（第４の画分）に分配されＭＳＹＲは酢酸エチル層（第３の画分）に移動するため、これによりＭＳＹＲと本新規配糖体の分離を行うことができる。

なお、ＭＳＹＲ親和性溶媒や本新規配糖体親和性溶媒は、一般的に液液分配に用いられる公知の溶媒から、ＭＳＹＲと本新規配糖体の溶解性、溶媒の相溶性等を考慮して適宜決定できる。

これらの分離工程は、第１のクロマトグラフィーに準じたクロマトグラフィーの形態で行ってもよいが、バッチ式に、適当な容器内で行うこともできる。

なお、第２の分離工程後、第３の画分からＭＳＹＲは、適宜疎水性担体を用いた第２のクロマトグラフィー工程に準じたクロマトグラフィー等でさらに分離精製できる。こうすることで、ＭＳＹＲを回収、検出、定量等することができる。また、第２の分離工程後、本新規配糖体は、第１のクロマトグラフィー工程、必要に応じて第２のクロマトグラフィー工程を実施してさらに分離精製を行うことができる。なお、第４の画分を第１のクロマトグラフィー工程に適用するときには、適宜濃縮してもよい。

以上説明した第１の分離工程及び第２の分離工程は、本新規配糖体及び／又はメチルシリンゲートを取得するための前処理方法としても独立して実施できる。

（蜂蜜中の本新規配糖体の測定方法）
本明細書に開示される蜂蜜中の本新規配糖体の測定方法は、蜂蜜の水性溶液をクロマトグラフィーを用いて、酸性移動相で溶出される画分を回収する工程、を備えることができる。本測定方法によれば、本新規配糖体を蜂蜜から簡易に分離して検出同定することができる。本新規配糖体の回収、検出及び定量に関しては、本新規配糖体の第２のクロマトグラフィーに関する内容をそのまま適用することができる。すなわち、酸性移動相を溶出される画分を適用な検出手段を用いることにより検出し定量できる。

本新規配糖体は、上記したように、マヌカ及びその亜種を蜜採取植物体とする蜂蜜以外からは見出されていない。このため、本新規配糖体の検出・定量がマヌカ蜂蜜のマーカー、すなわち産地証明や混合比の確認として有用と考えられる。

以下に実施例を挙げて、本明細書の開示について更に詳細に説明を加えるが、本開示が、かかる実施例のみに限定されないことは言うまでもない。

市販マヌカ蜂蜜を用いて配糖体を精製した。市販マヌカ蜂蜜（UMF 値が高い製品ほど望ましい）40g を200 ml の水に加え、温めて溶解した。ガラス製オープンカラムに三菱化学のイオン交換樹脂 Diaion Sepabeads HP20 を詰め（膨潤した状態で300 ml 程度を使用）、次いで溶解したマヌカ蜂蜜をカラムに通し、さらに水500 ml を流した。さらに、水／メタノール＝8／2、6／4、4／6、2／8、メタノールのみの溶液をそれぞれ500 ml ずつ流し、水／メタノール＝6／4、4／6 のみを回収して合わせてロータリーエバポレーターにより濃縮し、再度、少量の水メタノール混合液に溶解して以下のHPLC 条件に従い、分取精製を行った。

HPLC 分取条件
カラム Combi-RP（20×100 mm）
流速 5 ml/min
溶出溶媒 0.1%酢酸／アセトニトリル＝85／15
検出波長 262 nm

得られた精製物質を濃縮し、各種機器分析に用いることでＭＧＧＤを確認した。マヌカ蜂蜜63.5 g（湿重量）より30 mg 得られ、収率0.047％であった。

ＮＭＲの結果を図１に示し、ＦＴＩＲの結果を図２に示す、質量分析の結果を図３及び図４に示す。その他、得られた物質の物性値は以下の通りであった。
[α]D ＝‐３０．１（c=0.69, MeOH）
ESI-MS m/z ５３５ [M-H]-, 分子量５３６
λmax
262 nm

図１〜図４に示す結果から、得られた化合物を、Methyl 4-O- [β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl] -3,5-dimethoxybenzoate（メチル４-Ｏ-［β-Ｄ-グルコピラノシル（１-６）-β-Ｄ-グルコピラノシル］−３，５-ジメトキシベンゼン酸）（ＭＧＧＤ）と特定することができた。

実施例１で得た新規配糖体ＭＧＧＤ及び市販ＭＳＹＲを標品として用い、マヌカ蜂蜜に含まれる２種の化合物を定量した。また、ＭＧＧＤが大量に含まれているとの報告（非特許文献４）があるアスフォデル蜂蜜（イタリアサルディニア島）についても、同様に定量した。さらに、ＵＭＦが異なる複数のマヌカ蜂蜜についても、ＭＧＧＤ及びＭＳＹＲの各量を定量した。具体的には、以下の通りとした。

蜂蜜を量って水に溶解し（約100 mg/ml）、一部（約５μl）を紫外吸収検出器（UV 検出器）を備えるＨＰＬＣに注入する。分析条件を以下に示す。結果を図５及び図６に示す。

（HPLC 分析条件）
カラム Develosil ODS-HG-5（4.6×150 mm）
流速 0.8 ml/min
溶出溶媒 A: 0.1％酢酸、B: アセトニトリル
検出波長 262 nm

（グラジェント条件）

図５上段のクロマトグラムには、マヌカ蜂蜜の結果を示す。この図に示すように、ＭＧＧＤとＭＳＹＲとは、クロマトグラム上明確に分離することができた。また、図５下段のクロマトグラムには、アスフォデル蜂蜜の結果を示す。配糖体ＭＧＧＤは基本骨格にＭＳＹＲを有していることから、ＭＳＹＲが大量に含まれているアスフォデル蜂蜜には、ＭＧＧＤが全く含まれていないことがわかった。したがって、ＭＧＧＤはマヌカ蜂蜜に特異性が高く、その生理活性と強く結びついていることがわかった。また、ＭＳＹＲが大量に含まれているからといってＭＧＧＤも同様に含まれていることは必ずしもいえないことがわかった。

さらに、ＵＭＦの異なるマヌカ蜂蜜についてのＭＧＧＤとＭＳＹＲについて測定した結果を図６に示す。図６に示すように、ＭＧＧＤの含量とＵＭＦ値との間に高い相関性が認められた。その一方、ＭＳＹＲの量とＵＭＦ値とは、逆相関であった。

ＭＧＧＤは、ＭＳＹＲにゲンチオビオースという二糖が結合したものであるが、単糖が結合したＭＳＹＲの存在が、アニスシードにおいて報告されている（非特許文献５）。このため、アニスシードにもＭＧＧＤが含まれている可能性が有る。そこで、マヌカ蜂蜜とアニスシードについて、LC/MS/MS 質量分析器を用いてＭＧＧＤについて測定を行った。分析条件は以下の通りとした。結果を図７に示す。

（LC/MS/MS 分析条件）
質量分析器
API3000
カラム Develosil ODS-HG-5（2×150 nm）
流速 0.2 ml/min
溶出溶媒 A: 0.1％酢酸、B: アセトニトリル
インジェクション5 μl
モード：Negative electrospray ionization, Multiple Reaction Monitoring 535.1/211.1

（グラジェント条件）

図７に示すように、LC/MS/MS 質量分析器を用いた高感度解析において、マヌカ蜂蜜には、ＭＧＧＤを検出できたが、アニスシードには、全く見つけることが出来なかった。以上のことから、ＭＧＧＤはマヌカ蜂蜜に特異性が高く、その生理活性と強く結びついていることがわかった。また、ＭＳＹＲが大量に含まれているからといってＭＧＧＤも同様に含まれていることは必ずしもいえないことがわかった。

なお、マヌカ蜂蜜については、LC/MSにおいては、ＭＳＹＲの３配糖体及び４配糖体にそれぞれ対応する分子量６９７．２及び８５９．２のピークを確認した。したがって、マヌカ蜂蜜には、ＭＳＹＲの２配糖体であるＭＧＧＤほか、同３配糖体及び４配糖体が含まれることがわかった。なお、他のマヌカ蜂蜜についても調べたところ、３配糖体及び４配糖体は、２配糖体に比べて少なくマヌカ蜂蜜によっては検出できないかあるいは含まれていない場合もあることもわかった。

単離したＭＧＧＤ及びそのアグリコンであるＭＳＹＲについて、ＭＰＯ阻害活性を測定した。測定法はビオチン標識したタンパク質（ウシ血清アルブミン）のチロシン残基のハロゲン化の阻害を評価するものであり、ＭＰＯ酵素そのものの阻害活性、あるいは酵素から生じる次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）などの活性種の消去・捕捉能を測定することができる。

反応に必要な溶液等は、以下のように調製した。
（１）ヒト由来ＭＰＯは、０．５μＭとした。
（２）キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）（Sigma X4500-25UN）は水で１００倍希釈して使用した。
（３）アセトアルデヒド（ＡＬＤ）(Merck A4907704 746）は５．６１μｌを１ｍｌの水に溶かして１００ｍＭとした。
（４）Ｂｉｏｔｉｎ−ＢＳＡ（Sigma A6043-10MG）は、２００μＭＮａＢｒ及び２００ｍＭＮａＣｌを予め加えた０．１Ｍリン酸緩衝液に対し１ｍｇ／ｍｌとなるように溶かし、それを冷凍保存したものを、使用前に０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。
（５）試料は、５ｍＭとなるように調製した。
（６）陽性コントロールとして、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（Sigma G-6529）を使用した。（７）Ｌ−メチオニンは、水に溶かし、１０ｍＭに調製した。

反応は、エッペン管に、Biotin-BSA ５０μｌ及び試料、ＭＰＯ及びＸＯＤをそれぞれ１０μｌづつ加えて、水を加えて全量を１００μｌとし、ＡＬＤを１０μｌ加えることで開始した。コントロールとして試料を加えないものを準備し、同様に反応を開始した。３７℃で３０分間反応させた後、マイクロスピンカラム（BioRad）に反応液７５μｌを加えて、１０００ｇで４分間遠心することにより、Ｂｉｏｔｉｎ−ＢＳＡを回収し、上清には、Ｌ-メチオニン７５μｌを加えて反応を停止させた。

マイクロプレートに一次抗体として、ジハロゲン化チロシンを認識する3A5抗体（日研ザイル社）１０μｇ／ｍｌを５０μｌづつコーティングし、４℃で一晩静置した。０．０５％Tween２０含有ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で３回洗浄し、水に溶かした２００μｌの１％スキムミルク水溶液（ブロックエース粉末、雪印株式会社）でブロッキングした。３７℃で３０分間放置した後洗浄し、試料（回収したBiotin-BSA）をＴＰＢＳで５倍希釈後、その１００μｌ加えて、３７℃で４５分間静置した。その後、洗浄し、二次抗体として、Streptavidin-Ultrasensitive、Polymer（ＨＲＰ）(Sigma）をＴＰＢＳで７５００倍希釈して１００μｌを加えた。その後、再度３７℃で４５分間静置し、洗浄後ＴＭＢ（3,3’-5,5’-tetramethylbentidine）発色試薬（Ａ液／Ｂ液＝１／１）１００μｌ加え、約１０分マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ／５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図９に示す。

図９に示すように、抗酸化物質を加えなかった対照（no Anti）の発色（ハロゲン化チロシンの生成量）に比べてＭＧＧＤにＭＰＯ酵素阻害能があることがわかった。

本実施例では、市販のマヌカ蜂蜜からＭＳＹＲ及びＭＧＧＤの精製を行った。まず市販マヌカ蜂蜜５００ｇに水５００ｍｌを加えて、よく撹拌した蜂蜜液を、実施例１で用いたＨＰ２０樹脂４００ｍｌ（水で膨潤）とよく混合後、ブフナー漏斗に入れて水で良く洗浄した。その後、メタノールをブフナー漏斗内のＨＰ２０樹脂に供給して、メタノール溶出液を採取した。メタノール溶出液を乾固させた。乾固物を、水５０ｍｌに溶解して分液漏斗に移して、分液漏斗内に酢酸エチル・水混液（１：１）（体積比）１００ｍｌとなるように、分液漏斗に酢酸エチルと水と加えてよく混合し、酢酸エチル層を捨て、さらに、酢酸エチル５０ｍｌを加えて、同様によく混合して酢酸エチル層を捨てるこぶとを２回繰り返した。酢酸エチル層には、ＭＳＹＲがよく分配されていることをクロマトグラフィーで確認した。また、水層には、ＭＧＧＤが分配されていることも確認した。なお、ＨＰＬＣ条件は、以下の通りとした。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈＨＲ（４．６×１００ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出溶媒：Ａ：０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル
検出波長：２６２ｎｍ
プログラム：０ｍｉｎ，Ａ９０％，１０ｍｉｎ，Ａ７０％，１１ｍｉｎ，Ａ９０％，２０ｍｉｎ，Ａ９０％

次いで、分液漏斗内の水層を遠心エバポレーターにより濃縮後、ＨＰ２０樹脂を充填したオープンカラムに適用し、水及び水・メタノール混液（８：２）で洗浄後、水・メタノール混液（１：１）でＭＧＧＤを溶出させて回収した回収液に、ＭＧＧＤがよく分配されていることをクロマトグラフィーで確認した。なお、ＨＰＬＣ条件は、以下の通りとした。
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈＨＲ（４．６×１００ｍｍ）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出溶媒：０．１％ギ酸・アセトニトリル（７：３）
検出波長：２６２ｎｍ

Claims

以下の式で表される、化合物。
（上記式中、ｍは、１を表す。）
請求項１に記載の化合物を有効成分とする、ミエロペルオキシダーゼ活性阻害剤。
さらに、メチルシリンゲートを含む、請求項２に記載のミエロペルオキシダーゼ活性阻害剤。
請求項１に記載の化合物を含む、蜂蜜の評価用マーカー。
請求項１に記載の化合物と、
メチルシリンゲートと、
を含む、蜂蜜評価用マーカーキット。
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
Leptospermum scoparium又はLeptospermum polygalifoliumを蜜採取植物とする蜂蜜の水性溶液を、水・低級アルコール混液で溶出される画分を回収する第１のクロマトグラフィー工程を、備える、製造方法。
前記第１のクロマトグラフィー工程は、スチレン−ジビニルベンゼン系樹脂材料からなる固相を用いる、請求項６に記載の製造方法。
前記第１のクロマトグラフィー工程は、水〜低級アルコールの傾斜組成及び段階組成を有する移動相を用いたクロマトグラフィー工程である、請求項６又は７に記載の製造方法。
さらに、前記画分を酸性移動相で溶出される画分を回収する第２のクロマトグラフィー工程を、備える、請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法。
前記第２のクロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィー工程である、請求項６〜９のいずれかに記載の製造方法。
さらに、前記第１のクロマトグラフィー工程に先立って、
前記蜂蜜の水性溶液から、より親水性の第１の画分と、前記化合物を含みより疎水性の第２の画分と、を分離する工程と、
前記第２の画分から、メチルシリンゲートを含みより疎水性の第３の画分と前記化合物を含みより親水性の第４の画分とを分離する工程と、
を備える、請求項６〜１０のいずれかに記載の製造方法。
Leptospermum scoparium又はLeptospermum polygalifoliumを蜜採取植物とする蜂蜜から請求項１に記載の化合物を取得するための処理方法であって、
前記蜂蜜の水性溶液から、より親水性の第１の画分と、前記化合物を含みより疎水性の第２の画分と、を分離する工程と、
前記第２の画分から、メチルシリンゲートを含みより疎水性の第３の画分と前記化合物を含みより親水性の第４の画分とを分離する工程と、
を備える、方法。
蜂蜜中の請求項１に記載の化合物の測定方法であって、
蜂蜜の水性溶液を酸性移動相で溶出される画分を回収するクロマトグラフィー工程、
を備える、測定方法。
蜂蜜中の請求項１に記載の化合物の量を測定する工程、
を、備える、蜂蜜の抗菌活性及び抗炎症活性から選択される生理活性の評価方法。
さらに、蜂蜜中のメチルシリンゲート量を測定する工程を、備える、請求項１４に記載の評価方法。