ES2380803T3 - Dominio no histona MACROH2A como inhibidor de la actividad PARP-1 y uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la enzima nucleica poli(adenosina 5'-difosfo-ribosa) polimerasa ["poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1)"] para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel, en donde dicho inhibidor tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A seleccionada del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1 humano (aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO: 1), macroH2A1.2 (aminoácidos 120 a 371 de la SEQ ID NO: 2), y macroH2A2 (aminoácidos 121 a 372 de la SEQ ID NO: 3) histona.

Description

Dominio no histona MacroH2A como inhibidor de la actividad PARP-1 y uso del mismo

Campo de la Invención

La presente invención se relaciona con un inhibidor de la enzima nucleica de poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa)

5 polimerasa 1 [“poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1)”] para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias

10 relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel, en donde dicho inhibidor tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos del dominio no histona de terminal C de una histona

15 macroH2A seleccionada del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1 humano (aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO:1), macroH2A1.2 (aminoácidos 120 a 371 de la SEQ ID NO: 2), y macroH2A2 (aminoácidos 121 a 372 de la SEQ ID NO:3) histona.

Antecedentes

La polimerasa poli(ADP-ribosa) ("PARP") es una enzima ubicada en los núcleos de las células de diversos órganos,

20 que incluyen células de músculo, corazón y cerebro. El PARP cumple una función fisiológica en la reparación de rupturas de hebra en ADN. Una vez activado por el daño de los fragmentos de ADN, por ejemplo, después de exposición a quimioterapia, radiación ionizante, radicales libres de oxígeno, u óxido nítrico (NO), el PARP cataliza la transferencia de las unidades de ADP-ribosa del dinucleótido de adenina nicotinamida (NAD+) a las proteínas receptoras nucleares, y es responsable de la formación de los polímeros homo-ADP-ribosa ramificados o lineales

25 unidos a la proteína. La activación de PARP resulta en la adhesión de hasta 100 unidades de ADP-ribosa en una variedad de proteínas nucleares, que incluyen histonas, topoisomerasas, polimerasas de ADN y ARN, ligasas de ADN, endonucleasas dependientes de Ca2+ - y Mg2+- y PARP en sí mismo. Aunque el rango exacto de funciones de PARP no se ha establecido completamente, esta enzima se considera que cumple una función en mejorar la reparación de ADN y mantener la integridad del ADN.

30 Durante estreses celulares principales, sin embargo, la activación extensa de PARP puede conducir rápidamente a daño o muerte celular a través del agotamiento de almacenamientos de energía. Se consumen cuatro moléculas de ATP para cada molécula de NAD (la fuente de ADP-ribosa) regenerado. Así, NAD, el sustrato de PARP, se agota mediante activación PARP masiva y, también se puede agotar en los esfuerzos por resintetizar NAD, ATP.

Se ha reportado que la activación PARP cumple una función clave en la neurotoxicidad inducida por NMDA- y NO,

35 como se muestra por el uso de inhibidores PARP para evitar tal toxicidad en cultivos corticales en proporción a sus potencias como inhibidores de esta enzima (ZHANG et al., Science, vol.263, p: 687-89, 1994); y en cortes del hipocampo (WALLIS et al., NeuroReport, vol.5 (3), p:245-48, 1993). Así se ha conocido la función potencial de los inhibidores PARP en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y trauma de cabeza. Sin embargo, la investigación continúa determinando los mecanismos exactos de su efecto beneficioso en la isquemia cerebral,

40 (ENDRES et al., J. Cereb. Blood Flow Metabol., vol.17, p:1143-51, 1997) y lesión de cerebro infitraumática (WALLIS et al., Brain Res., vol.710, p: 169-77, 1996).

Los inhibidores PARP son adicionalmente útiles para tratar enfermedades cardiovasculares. La isquemia, una deficiencia de oxígeno y glucosa en una parte del cuerpo, puede ser provocada por una obstrucción en el vaso sanguíneo que irriga esa área o una hemorragia masiva. Dos formas severas, ataque cardiaco y apoplejía, son los 45 principales asesinos en el mundo desarrollado. La muerte celular resulta directamente y también ocurre cuando se reperfunde el área privada. Se ha demostrado que las inyecciones únicas de inhibidores PARP han reducido el tamaño del infarto provocado por isquemia y reperfusión del corazón o del músculo estriado en conejos. En estos estudios, una inyección única del inhibidor PARP, 3-amino-benzamida (10 mg/kg), un minuto antes de oclusión o un minuto antes de reperfusión, provoca reducciones similares en el tamaño del infarto en el corazón (32-42 %). Otro

50 inhibidor PARP, 1,5-dihidroxiisoquinolina (1 mg/kg), reduce el tamaño del infarto mediante un grado comparable (3848 %; THIEMERMANN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.94, p: 679-83, 1997). Este hallazgo ha sugerido que los inhibidores PARP pueden ser capaces de salvar previamente el tejido de músculo estriado o cardiaco isquémico. Actualmente, los inhibidores PARP se desarrollan para tratar lesiones de isquemia/reperfusión (ZHANG, The Prospect for Improved Medicines, Ashley Publications Ltd, 1999).

También se ha mostrado que la activación PARP proporciona un índice de daño siguiendo traumatismos neurotóxicos mediante glutamato (por medio de estimulación del receptor NMDA), intermedios de oxígeno reactivo, proteína beta amiloide, n-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y su metabolito activo N-metil-4-fenilpiridina (MPP+), que participa en condiciones patológicas tales como apoplejía, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson (ZHANG et al., J. Neurochem., vol.65(3), p: 1411-14, 1995). Otros estudios han continuado explorando la función de la activación PARP en células de gránulo cerebelar in vitro y en neurotoxicidad MPTP (COSI et al., Ann.

N. Y. Acad. Sci., vol. 825, p: 366-79, 1998 COSI et al., Brain Res., vol. 729, p: 264-69, 1996).

Se considera que el daño neuronal luego de apoplejía y otros procesos neurodegenerativos resulta de una liberación masiva del glutamato neurotransmisor excitatorio, que actúa luego de los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) y receptores del subtipo éter. El glutamato sirve como en neutrotransmisor excitatorio predominante en el sistema nervioso central (SNC). Las neuronas liberan glutamato en grandes cantidades cuando se privan de oxígeno, como puede ocurrir durante una lesión cerebral isquémica tal como un ataque cardiaco o apoplejía. Este exceso libera glutamato que a su vez provoca sobrestimulación (excitotoxicidad) de N-metil-D-aspartato (NMDA), AMPA, receptores Kainate y MGR. Cuando el glutamato se une a estos receptores, los canales de iones en los receptores abiertos, permiten el flujo de iones a través de sus membranas celulares, por ejemplo, Ca2+ y Na+ dentro de las células y K+ fuera de las células. Estos flujos de iones, especialmente el influjo de Ca2+, provocan sobrestimulación de las neuronas. Las neuronas sobreestimuladas secretan más glutamato, creando un bucle de retroalimentación o efecto dominó que finalmente resulta en daño o muerte celular por medio de la producción de proteasas, lipasas y radicales libres. La activación excesiva de los receptores de glutamato ha estado implicada en diversas enfermedades neurológicas y afecciones que incluyen epilepsia, apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS), enfermedad de Huntington, esquizofrenia, dolor crónico, isquemia y pérdida neuronal luego de hipoxia, hipoglicemia, isquemia, trauma, y traumatismo nervioso. Estudios recientes también han avanzado una base glutamatérgica para trastornos compulsivos, particularmente dependencia de fármaco. La evidencia incluye los hallazgos en muchas especies animales, así como también, en cultivos corticales cerebrales tratados con glutamato o NMDA, que los antagonistas del receptor de glutamato bloquean el daño neuronal seguido por apoplejía vascular (DAWSON et al., H. Hunt Batjer ed., p: 319-25, 1997). Se han probado que son difíciles los intentos para evitar la excitotoxicidad al bloquear los receptores NMDA, AMPA, Kainato y MGR debido a cada receptor tiene múltiples sitios a los que se puede unir el glutamato. Muchas de las composiciones que son efectivas en bloquear los receptores también son tóxicas para los animales. Como tal, no existe tratamiento efectivo conocido para las anormalidades de glutamato.

La estimulación de los receptores NMDA, a su vez, activa la sintasa de óxido nítrico neuronal de enzima (NNOS), que provoca la formación de óxido nítrico (NO), que media más directamente la neurotoxicidad. La protección contra la neurotoxicidad NMDA ha ocurrido luego de tratamiento con inhibidores NOS (DAWSON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, p: 6368-71, 1991; DAWSON et al., J. Neurosci., vol. 13 (6), p: 2651-61, 1993). La protección contra la neurotoxicidad NMDA también puede ocurrir en cultivos corticales de ratones con interrupción dirigida de NNOS (DAWSON et al., J. Neurosci., vol. 16 (8), p: 2479-87, 1996).

También se sabe que el daño neuronal luego de apoplejía vascular se disminuye marcadamente en animales tratados con inhibidores NOS o en ratones con interrupción de gen NNOS (IADECOLA, Trends Neurosci., vol. 20 (3),

p:

132-39, 1997; HUANG et al., Science, vol. 265, p: 1883-85, 1994; BECKMAN et al., Biochem. Soc. Trans., vol. 21,

p:

330-34, 1993). El NO o peroxinitrito puede provocar daño del ADN, que activa PARP. El soporte adicional para esto se proporciona en SZABO et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, p: 1753-58, 1996).

También se sabe que los inhibidores PARP afectan de manera general la reparación del ADN. CRISTOVAO et al. (Terato., Carcino., and Muta., vol. 16, p: 219-27, 1996) discute el efecto del peróxido de hidrógeno y la radiación gamma en rupturas de hebra de ADN en la presencia de y en la ausencia de 3-aminobenzamida, un inhibidor potente de PARP. CRISTOVAO et al. observado de una recuperación dependiente de PARP de las rupturas de hebra de ADN en leucocitos tratados con peróxido de hidrógeno.

También existe evidencia de que los inhibidores PARP son útiles para tratar afecciones tales como trastornos inflamatorios del intestino (SOUTHAN et al., Br. J. Pharm., vol. 117, p: 619-32, 1996; SZABO et al., J. Biol. Chem., vol. 272, p: 9030-36, 1997) o artritis (SZABO et al., Portland Press Proc., vol. 15, p: 280-281, 1998; SZABO, Eur. J. Biochem., vol. 350 (1), p: 1-19, 1998; SZABO et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, vol. 95 (7), p: 3667-72, 1998; SZABO et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, p: 1753-58, 1996; BAUER et al., Intl. J. Oncol., vol. 8, p: 239-52, 1996; HUGHES et al., J. Immuno., vol. 153, p: 3319-25, 1994). Así, SALZMAN et al. (Japanese J. Pharm., vol. 75 (Supp. I),

p: 15, 1997) muestra que la 3- aminobenzamida, un inhibidor específico de la actividad PARP, reduce la respuesta inflamatoria y restaura la morfología y el estado energético del colon distal en ratas que sufren de colitis inducida por administración intraluminal del ácido sulfónico de trinitrobenceno hapteno en 50 % de etanol. Como otro ejemplo, SZABO et al. (Japanese J. Pharm., vol. 75 (Supp. I), p: 102, 1997) discute la capacidad de los inhibidores PARP para evitar o tratar artritis inducida por colágeno.

Adicionalmente, los inhibidores PARP parecen ser útiles en tratar la diabetes y se han estudio a nivel clínico para prevenir el desarrollo de diabetes mellitus dependiente de insulina en individuos susceptibles (SALDEEN et al., Mol.

Cellular Endocrinol., vol. 139, p: 99-107, 1998). En modelos de diabetes tipo I inducida por toxinas tales como estreptozocina y aloxano que destruyen las células islote pancreáticas, se ha mostrado que los ratones transgénicos que carecen de PARP son resistentes a la destrucción celular y el desarrollo de diabetes (PIEPER et al., Trends Pharmacolog. Sci., vol. 20, p: 171-181, 1999; BURKART et al., Nature Medicine, vol. 5, p: 314-319, 1999). La administración de nicotinamida, un inhibidor PARP débil y un secuestrante de radical libre, evita el desarrollo de diabetes en un modelo de diabetes inmune espontáneo, de ratón diabético, no obeso (PIEPER et al., 1999, mencionado anteriormente). Por lo tanto, los inhibidores PARP específicos y potentes pueden ser útiles como terapéuticos para la prevención de diabetes.

Aún más, se ha mostrado que los inhibidores PARP son útiles para tratar choque endotóxico o choque septicémico (ZINGARELLI et al., Shock, vol. 5, p: 258-64, 1996; CUZZOCREA, Brit. J. Pharm., vol. 122, p: 493-503, 1997). ZINGARELLI et al. sugiere que la inhibición del ciclo de reparación de ADN activado por sintetasa poli(ADP ribosa) tiene efectos protectores contra falla en choque endotóxico. ZINGARELLI et al. encuentra que la nicotinamida protege contra falla vascular mediada por NO, retrasada en choque endotóxico. ZINGARELLI et al. también encuentra que las acciones de la nicotinamida se pueden relacionar con la inhibición de la activación mediada por NO del ciclo de reparación de ADN que consume energía, activado por sintetasa poli(ADP ribosa).

Aún otro uso conocido para los inhibidores PARP es tratar el cáncer. De hecho, la actividad de PARP puede contribuir a la resistencia que frecuentemente desarrolla diversos tipos de terapias de cáncer, debido a que este proceso celular de transferencia de ADP-ribosa se asocia con la reparación de ruptura de hebra de ADN en respuesta al daño de ADN provocado por radioterapia o quimioterapia. Consecuentemente, la inhibición de PARP puede retardar la reparación intracelular del ADN y mejora los efectos antineoplásicos de terapia de cáncer. De hecho, los datos in vitro e in vivo muestran que muchos inhibidores PARP potencian los efectos de radiación ionizante (Patente Estadounidense Nos. 5,032,617; 5,215,738; 5,041,653; 5,177,075) o fármacos citotóxicos tales como agentes alquilatantes (WELTIN et al., Oncol. Res., vol. 6 (9), p: 399-403, 1994). Así, los inhibidores de la enzima PARP que son útiles como quimioterapéuticos de cáncer adjuntos.

Todavía otro uso para los inhibidores es el tratamiento de lesiones del nervio periférico, y el síndrome de dolor patológico resultante conocido como dolor neuropático, tal como aquel inducido por lesión de constricción crónica

(CCI) del nervio ciático común y en el que la alteración trans-sináptica de asta dorsal de la médula espinal caracterizado porque ocurre hipercromatosis de citoplasma y nucleoplasma (así llamado neuronas "oscuras") (MAO et al., Pain, vol. 72, p: 355-366, 1997).

Los inhibidores PARP también han sido útiles para extender la vida útil y la capacidad proliferativa de las células que incluye el tratamiento de enfermedades tales como envejecimiento de la piel (Patente Estadounidense No. 5,589,483), enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, osteoartritis, osteoporosis, distrofia muscular, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, SIDA, y otras enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad; y para alterar la expresión de gen de células senescentes.

Se han descrito números grandes de inhibidores PARP. Por ejemplo, BANASIK et al. (J. Biol. Chem., vol. 267 (3), p: 1569-75, 1992) examina la actividad que inhibe PARP de cerca de cien compuestos, lo más potente de los cuales es 4-amino-1,8-naftalimida, 6(5H)-fenantridona, 2-nitro-6(5H)-fenantridona, y 1,5-dihidroxiisoquinolina. GRIFFIN et al. reporta la actividad que inhibe PARPpara ciertos compuestos benzamida (Anti-Cancer Drug Design, vol. 10, p: 507514, 1995; Patente Estadounidense No. 5,756,510), compuestos bencimidazol (WO 97/04771), y compuestos quinalozinona (WO 98/33802). SUTO et al. reporta la inhibición PARP mediante ciertos compuestos dihidroisoquinolina (Anti-Cancer Drug Design, vol. 7, p: 107-117, 1991). GRIFFIN et al. ha reportado otros inhibidores PARP de la clase quinazolina (J. Med. Chem., vol. 41, p: 5247-5256, 1998). Finalmente, la WO 99/11622, WO 99/11623, WO 99/11624, WO 99/11628, WO 99/11644, WO 99/11645, y WO 99/11649 también describen diversos compuestos que inhiben PARP.

Sin embargo, el método para utilizar estos inhibidores PARP en las formas discutidas anteriormente ha tenido efecto limitado. Por ejemplo, se han observado efectos colaterales con algunos de los inhibidores PARP mejores conocidos (MILAM et al., Science, vol. 223, p: 589-91, 1984). Específicamente, los inhibidores PARP 3-aminobenzamida y benzamida no solo inhiben la acción de PARP pero también se muestra que afecta la viabilidad celular, el metabolismo de la glucosa, y la síntesis de ADN. Así, se concluye que la utilidad de estos inhibidores PARP se puede restringir severamente por la dificultad de encontrar una dosis que inhibirá la enzima sin producir efectos metabólicos adicionales.

De acuerdo con lo anterior, subsiste una necesidad de compuestos que inhiben más específicamente la actividad PARP, las composiciones que contienen estos compuestos, y métodos que utilizan aquellos compuestos, en donde los compuestos producen efectos más potentes y confiables sin pocos efectos colaterales, con respecto a inhibir la actividad PARP y tratar las enfermedades y afecciones discutidas aquí.

Las histonas Macro-H2A1 y macroH2A2 son variantes de histonas particularmente enigmáticas que tienen una región de terminal N con homología de secuencia alta a H2A, y que también contiene una cola de terminal C de histona no excesiva que comprende casi dos tercios de la proteína (25 kDa). El genoma humano contiene dos genes que codifican las histonas macroH2A. Los genes MACROH2A1 que codifican dos subtipos MACROH2A1.1 y MACROH2A1.2 producidos por división alternativa. Un segundo gen codifica MACROH2A2 (CHADWICK and WILLARD, Human. Mol. Genet., vol. 10, p: 1101-1113, 2001). Estas proteínas parecen estar enriquecidas en heterocromatina tal como el cromosoma X inactivo (Xi) en mamíferos femeninos (COSTANZI and PEHRSON, Nature, vol. 393, p. 599-601, 1998), y los locus heterocromáticos discretos en células senescentes y quiescentes (ZHANG et al., Dev. Cell, vol. 8, p: 19-30, 2005; GRIGORYEV et al., J. Cell Sci, vol. 117, p: 6153-6162, 2004). El MacroH2A está altamente localizado en células femeninas como un cuerpo nuclear, denominado como un cuerpo de cromatina macro (MCB), que es coincidente con el Xi y el cuerpo Barr (COSTANZI and PEHRSON, mencionado anteriormente, 1998). La región de terminal C de macroH2A contiene un dominio denominado "dominio macro", que se encuentra solo o en múltiples copias en un número de proteínas no relacionadas en otra forma (PEHRSON and FUJI, Nuc. Acids Res., vol. 26, p: 2837-2849, 1998), y que es crítica para la formación de macroH2A MCB (CHADWICK et al., Nuc. Acids Res., vol. 29 (13), p: 2699-2705, 2001). Se ha sugerido que este dominio macro define una superfamilia de fosfoesterasas que actúan en los derivados de ribosa ADP (ALLEN et al., J. Mol. Biol., vol. 330, p: 503-511, 2003). Recientemente, KUSTATSCHER et al. (Nat. Struct. Mol. Biol, vol. 12 (7), p: 624-5, 2005) muestra que el macroH2A1.1 se une a ADP-ribosa monomérico y a O-acetil-ADP-ribosa (un metabolito NAD). Los autores identifican Phe348, Asp203, Gly224 y Gly314 como residuos críticos para la unión de O-acetil-ADP-ribosa. No obstante, la función específica macroH2A es aún desconocida.

Resumen de la Invención

El inhibidor de la enzima nucleica de polimerasa poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) ["poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos, que se deriva del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A, opcionalmente se fusiona y/o se acopla a por lo menos una secuencia heteróloga.

La presente invención se relaciona con un inhibidor de la enzima nucleica de poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) polimerasa 1 [“poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1)”] para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel, en donde dicho inhibidor tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A seleccionada del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1 humano (aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO: 1), macroH2A1.2 (aminoácidos 120 a 371 de la SEQ ID NO: 2), y macroH2A2 (aminoácidos 121 a 372 de la SEQ ID NO: 3) histona.

Como se utiliza aquí, una "actividad fosfoesterasa" significa la catálisis de la hidrólisis de uno de los dos enlaces éster en un compuesto fosfodiéster.

En otra realización, la composición de la Invención para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel que comprende (i) un inhibidor de la Invención, un ácido nucleico que codifica el mismo, o un vector que comprende dicho ácido nucleico, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un método de tratamiento profiláctico o terapéutico de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con la activación de PARP que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende (i) un inhibidor de la enzima nucleica de polimerasa poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) ["poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP) que tiene una actividad fosfoesterasa, y que comprende una secuencia de aminoácidos, que se deriva del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A, opcionalmente se fusiona y/o se acopla a por lo menos un secuencia heteróloga, un ácido nucleico que codifica el mismo, o un vector que comprende dicho ácido nucleico, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable a dicho sujeto, también se describe.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1 muestra el teñido inmunoflorescente obtenido con el anticuerpo anti-HA (anti-HA) en células Hela que expresan establemente las histonas macro-H2A1.1 (e-MH1.1) y H2A (eH2A) etiquetadas, o no se compara (control) con la localización de cromatina (DAPI).

La Figura 2 muestra la señal obtenida con el anticuerpo anti-Flag para inmunotransferencia de complejos nucleares purificados de células HeLa que expresan las histonas H2A (e-H2A) y macroH2A1.1 (e-MH1.1) etiquetadas.

La Figura 3 muestra el teñido plata del gel de poliacrilamida separado de la inmunoprecipitación de anti-FLAG/HA de extractos nucleares de células Hela que expresan las histonas H2A (H2A com), y MacroH2A1.1 (MH1.1 com) etiquetadas respectivamente. Los polipéptidos identificados se indican mediante análisis espectrométrico de masa. M corresponde al marcador de peso molecular de proteína M12 (INVITROGEN).

La Figura 4 muestra la proteína humana recombinante PARP-1 en la fracción unida (B) y no unida (U) para las proteínas recombinantes GST (GST), GST-H2A (H2A), GST-macroH2A1.1 (MH1.1) o GST-NHR (Región No Histona).

La Figura 5 describe las diferentes etapas del método Tap-Chip. La cromatina purificada se digiere con la Nucleasa Microcócica (Mnasa). Luego, las nucleosomas que contienen la histona macro-H2A1.1 etiquetada se purifican mediante inmunoprecipitación con anticuerpos anti-HA y anti-FLAG. El ADN luego se purifica y se fosforila con la quinasa de ADN T4. Se agrega un nucleótido de adenosina a la posición 3’ del fragmento con polimerasa Taq, y el fragmento obtenido finalmente se clona en un plásmido para secuenciamiento adicional.

La Figura 6A muestra los productos de amplificación PCR obtenidos con el promotor hsp70-1 (P) y los cebadores de región codificante (C) de un extracto de la cromatina inmunoprecipitada de células Hela que expresan establemente la histona macro-H2A1.1 etiquetada. Se ha hecho amplificación de control con los mismos cebadores en cromatina de células Hela antes de inmunoprecipitación (entrada). La línea M corresponde a una escalera molecular (1,000 pb escalera, INVITROGEN).

La Figura 6B muestra el enriquecimiento relativo de la histona macroH2A1.1 en la región promotora (gris) versus la región codificante (sombreado) del gen hsp70-1 en células Hela.

La Figura 6C muestra los productos de amplificación PCR obtenidos con el promotor hsp70-1 (P) y los cebadores de la región codificante (C) de un extracto de histona macroH2A1.1 que inmunoprecipita cromatina de células Hela no transfectadas. La línea M corresponde a una escalera molecular (1,000 pb escalera, INVITROGEN).

La Figura 7A muestra la cantidad de histonas H2A o macroH2A1.1., o del promotor PARP-1 en hsp70-1 versus el promotor GAPDH en células Hela después de un choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-). Cada resultado corresponde a la media de tres experimentos independientes.

La Figura 7B muestra la cantidad de las histonas H3 o H3.3, y de PARP-1 en el promotor hsp70-1 versus el promotor GAPDH en células Hela después de choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-). Cada resultado corresponde a la media de tres experimentos independientes.

La Figura 8A muestra la cantidad de ADP-ribosa en el promotor hsp70-1 versus el promotor GAPDH en células Hela después de un choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-). Cada resultado corresponde a la media de tres experimentos independientes.

La Figura 8B muestra la cantidad de histona H4 acetilada en el promotor hsp70-1 versus el promotor GAPDH en células Hela después de un choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-). Cada resultado corresponde a la media de tres experimentos independientes.

La Figura 9 muestra la expresión relativa de PARP-1 30 en células Hela minutos después de un choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-), y en células Hela transfectadas o no con un siARN específico PARP-1 o un siARN no relacionado (Scr); y la expresión relativa de macroH2A1 en células transfectadas o no con un siARN específico macroH2A1 o un siARN no relacionado (Scr).

La Figura 10A muestra la expresión relativa de mARN hsp70-1 versus mARN GAPDH 30 minutos en células Hela después de un choque térmico (HS, +) o sin ningún choque térmico (-) mediante PCR en tiempo real. Dichas células se han transfectado o no con siARN no relacionado (mezclado), siARN específico PARP-1 (PARP-1), y siARN específico macroH2A1 (MacroH2A1).

La Figura 10B muestra un análisis cinético mediante PCR en tiempo real de expresión hsp70-1 versus expresión GAPDH en células Hela transfectadas con siARN específico macroH2A1 (+siARN macro-H2A1) o sin ningún siARN (-siARN macro- H2A1). Dichos ensayos se realizan en células transfectadas 10, 20 o 30 minutos después de un choque térmico (HS, +) o en la ausencia de ningún choque térmico (-). Los resultados son la media de tres experimentos independientes.

La Figura 11 muestra la alineación de secuencia de los dominios macro de macroH2A1.1 (NP_613075) macroH2A1.2 (NP_004884) y macroH2A2 (NP_061119) con algunos dominios macro seleccionados de las proteínas no histona. Los residuos conservados en el dominio macro se marcan en rojo. Los residuos alterados por la división alternativa del gen MacroH2A1 se subrayan. Esta región alterada se predice que une los grupos de fosfato e hidrolizan la ADP-ribosa (el motivo consensus GDIT). El AF1521 es una proteína Archaeoglobus fulgidus con homología al dominio macro de MacroH2A. AF1521 que se cristaliza. El NP_598908.1 es un ortólogo AF1521 de ratón. El YBR022WP es una proteína S. con un dominio exclusivamente macro. El YBR022WP se reporta para procesos del grupo 1"-fosfato de 1"-fosfo-ADP-ribosa.

La Figura 12 muestra el análisis cinético de PARP-1 de actividad de auto-ADP-ribosilación del PARP-1 recombinante, el complejo purificado macroH2A1.1 (MH1.1), o el complejo mutante macroH2A1.1 purificado (MH1.1mut.com) en la presencia de 32PNAD+.

La Figura 13 muestra la cantidad de ADN inmuno-precipitado con la sonda del promotor Hsp70.1, Hsp70.2 o Hsp70.8 como una función del porcentaje de ADN de entrada.

La Figura 14 muestra la asociación estable de PARP-1 con el complejo e-mH2A1.1 después de aislamiento de dicho complejo de 15-35 % de gradiente de glicerol, fraccionamiento de dicho gradiente y carga de fracciones (1 a 9) en 412 % d eSDS PAGE. Las posiciones de las histonas núcleo, e-mH2A1.1 y PARP-1 se indican en la parte izquierda de la figura. M, marcador de masa molecular.

La Figura 15 muestra el complejo aislado de e-mH2A1.1 (com) después de separación de 12 % de PAGE, y teñido plata (panel izquierdo), y western-blot del complejo revelado mediante el anticuerpo anti-ADP ribosa (panel derecho). Los marcadores M, moleculares con las masas moleculares se indican en la izquierda.

La Figura 16 muestra la alineación de secuencia de macroH2A con fosfoesterasas conocidas. Los dos distintivos de tetrapéptido conservado en S. cerivisiae (P53314, primera fila), A. thaliana (Y11650, segunda fila) y las fosfoesterasas humanas (BC006392.1, tercera fila) se muestran y se alinean con mH2A1.1 humano (cuarta fila), mH2A1.2 humano (quinta fila) y mH2A2 humano (sexta fila). Estas alineaciones destacan la importancia del motivo consensus HXTX (octava fila) ubicada en el sitio activo. Este motivo se muta a alanina (AAAA) en mH2A1.1 (mH2A1.1-mut, séptima fila).

La Figura 17 muestra la unió alterada de mono-ADP-ribosa para el mH2A1.1 mutado. El mH2A1.1 tipo natural recombinante (WT) o mutado (Mut) se purifican para homogeneidad. Las cantidades aumentadas de ambas proteínas se cargan (en duplicado) en los filtros. Un filtro luego se incuba con 32P-ADP-ribosa (panel superior), mientras que el otro se tiñe con azul Coommassie como un control para carga igual (panel inferior).

La Figura 18 muestra que aumentar la resistencia iónica libera la proteína mutada, pero no la proteína WT emH2A1.1, del complejo de nucleosoma. Los complejos de nucleosoma tipo natural (WT) y mH2A1.1 mutado se aíslan de las estirpes celulares que expresan establemente la histona WT o e-mH2A1.1 mutada 150 mM NaCl (panel izquierdo) o a 300 mM NaCl (panel derecho). Los complejos se hacen correr en 4-12% de gradiente PAGE que contiene SDS, luego se tiñen con plata. Se indican las posiciones de emH2A1.1 y PARP-1. El marcador de masa molecular de proteína M. El panel derecho presenta la cuantificación de PARP-1 (relativo a la histona H1) dentro de los complejos WT y emH2A1.1 mutado, se aísla en 150 mM y 300 mM NaCl, respectivamente. Note la reducción drástica de la cantidad de PARP-1 dentro del complejo mH2A1.1 mutado aislado a 300 mM NaCl.

La Figura 19 muestra la cantidad de PARP-1 asociada in vivo con el promotor Hsp70.1 en las estirpes celulares estables sin choque térmico (HS: -) o de choque térmico (durante 30 min a 42°C ; HS : +) que expresan el emH2A1.1 tipo natural (WT) o mutado (mH2A1.1-Mut). Las estirpes celulares se tratan con formaldehido para entrecruzar las proteínas al ADN, y se lleva a cabo ChIP utilizando el anticuerpo anti-PARP-1. Las cantidades de los fragmentos de ADN de promotor Hsp70.1 amplificado con PCR en tiempo real se presentan como un porcentaje del ADN de entrada.

La Figura 20 muestra el teñido plata de las nucleosomas macroH2A1.1 tipo natural purificadas (e-mH2A1.1) y mutantes (emH2A1.1- mut) utilizadas para la medición de la actividad enzimática PARP-1. Los complejos se aíslan utilizando 100 mM NaCl. Se indican las bandas que corresponden a PARP-1, e-mH2A1.1 y las histonas de núcleo convencionales. El marcador de masa molecular de proteína M.

La Figura 21 muestra la cuantificación de los datos mostrados en la Figura 12.

La Figura 22 muestra 12 % de SDS-PAGE de los octámeros purificados e-mH2A1.1 y asociados PARP-1. Se cargan los complejos de nucleosoma e-mH2A1.1 en una columna de apatita hidroxilo y después de lavado con 0.65M NaCl las proteínas restantes se eluyen con solución regulada 2M de NaCl. Para purificar el PARP-1 de los octámeros de histona, el eluido NaCl 2M se complementa con 1 M urea y se pasa a través de una columna de Agarosa-níquel. Línea 3, la composición de proteína del eluido NaCl 2M. Línea 4, el PARP-1 purificado. Líneas 1 y 2, el marcador de masa molecular y octámero de histona convencional como un control.

La Figura 23 muestra el análisis cinético de la actividad PARP-1 asociada con nucleosomas reconstituidas in vitro que contienen las histonas núcleo e-mH2A1.1 purificadas (líneas, 6-9) o histonas de núcleo convencionales (líneas, 2-5). Las muestras se incuban con 32P-NAD+ y se hacen correr en 12 % de PAGE que contiene SDS. Línea 1, contiene solo 32P-NAD+.

La Figura 24 muestra que la supresión de la expresión de mH2A1 con siARN regula por disminución la cantidad de PARP-1 asociado con el promotor Hsp70.1. Las células HeLa no tratadas con control (-siARN-mH2A1) y tratadas con siARN (+siARNmH2A1) se entrecruzan con formaldehido y se utilizan con ChIP con el anticuerpo anti-PARP-1. El ADN se aísla de las muestras ChIP y se imite en amplificación de PCR en tiempo real con cebadores específicos para el promotor Hsp70.1.

Descripción Detallada

Los inventores ahora han descubierto que la histona macroH2A se puede unir específicamente PARP-1 a través de su dominio no histona de terminal C, y posteriormente reprime la actividad PARP-1 I a través de la actividad fosfoesterasa de su dominio macro.

Esta invención proporciona una nueva herramienta para inhibir la enzima nucleica de polimerasa poli(adenosina 9difosfo-ribosa) ["poli(ADP-ribosa) polimerasa" (PARP)] y métodos para tratar y/o evitar enfermedades asociadas con la activación de PARP.

Posteriormente, en un aspecto la presente invención se relaciona con un inhibidor de la enzima nucleica de polimerasa poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) ["poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de lesión por isquemia y reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel, en donde dicho inhibidor tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A seleccionada del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1 humano (aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO: 1), macroH2A1.2 (aminoácidos 120 a 371 de la SEQ ID NO: 2), y macroH2A2 (aminoácidos 121 a 372 de la SEQ ID NO: 3) histona.

Ventajosamente, dicho inhibidor es un polipéptido o un polipéptido recombinante.

Como se utiliza aquí el término " histona macroH2A " se relaciona con una variante inusual de histona H2A que tiene un dominio no histona de terminal C grande (para revisión, ver PERCHE et al., Med. Sci., vol. 19 (11). p: 1137-45, 2003). Actualmente, se han identificado tres histonas macroH2A humanas, tiene el dominio no histona de terminal C: macroH2A1.1 y macroH2A1.2 producido por la división alternativa de un gen único, y macroH2A2.

Como se utiliza aquí el término "dominio no histona de terminal C" se relaciona con la región de terminal C grande de histona macroH2A que no comparte homología con la histona H2A. Dicho dominio no histona se puede identificar de uno de los expertos en la técnica con análisis de secuencia simple. Dicho dominio no histona corresponde a los residuos 121 a 369 de macroH2A1.1 humano (SEQ ID NO: 1), residuos 121 a 371 de macroH2A1.2 humano (SEQ ID NO: 2), y los residuos 121 a 372 de macroH2A2 humano (SEQ ID NO: 3).

El dominio no histona de terminal C de histona maoroH2A se selecciona del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de histonas macroH2A1.1, macroH2A1.2, y macroH2A2,

Como se utiliza aquí una "secuencia heteróloga" se relaciona con cualquier secuencia de aminoácidos que no se deriva de las variantes de histona macroH2A, como macroH2A1.1, macroH2A1.2, y macroH2A2. Esta secuencia heteróloga por ejemplo puede consistir de una secuencia de aminoácidos, que facilita la penetración del inhibidor de

la Invención del medio externo en el medio intracelular, y muy específicamente en el núcleo de la célula. Tal secuencia de aminoácidos es bien conocida por un experto en la técnica, y ejemplos de tales secuencias de aminoácidos se describen en la EP 1512696, WO 42/10201, EP 15226183, y WO 2004/069279. Esta secuencia heteróloga también puede facilitar por ejemplo la purificación de inhibidor de bacteria. Tal secuencia de aminoácidos es bien conocida por el experto en la técnica, y ejemplos de tales secuencias de aminoácidos incluyen la etiqueta His, la proteína GST, la etiqueta FLAG, y la etiqueta HA.

Las diferencias de identidad entre el dominio no histona de terminal C descrito anteriormente y la secuencia de aminoácidos del inhibidor de la Invención resulta de la sustitución de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicho inhibidor.

Preferiblemente, los aminoácidos sustituidos en estos dominios no histona de terminal C conservan o aumentan la actividad fosfoesterasa de dichos dominios. Se pueden identificar tales sustituciones por un experto en la técnica en vista de su conocimiento general y/o con experimentos simples. Preferiblemente, dichas sustituciones corresponden a los residuos de aminoácido que tienen la misma carga, hidropatía, restricciones esteáricas, y/o función química como se relaciona con los residuos correspondientes en el dominio no histona de terminal C de las histonas macroH2A.

De acuerdo con una realización específica, dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de 100% con dicho dominio no histona de terminal C macroH2A o fragmentos de los mismos.

En la presente secuencia de aminoácidos que se derivan del dominio no histona de una histona macroH2A es menos de 350 aminoácidos de longitud, preferiblemente menos de 300 aminoácidos, como un ejemplo también se describen menos de 250 aminoácidos o menos de 200 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente menos de 150 aminoácidos.

En la presente secuencia de aminoácidos que se deriva del dominio no histona de una histona macroH2A no comprende el dominio de plegamiento de histona macroH2A que tiene homología con histona H2A (LUGER et al., Nature vol. 389 (6648), p: 251-260, 1997), y preferiblemente dichas secuencias de aminoácidos no comprende ninguna secuencia que tiene homología con histona H2A,

Ventajosamente, dicha secuencia de aminoácidos no comprende ningún dominio de plegamiento de histona.

En el presente, la secuencia de aminoácidos que se deriva del dominio de no histona de una histona macroH2A es más de 20 aminoácidos de longitud, preferiblemente más de 25 aminoácidos, como un ejemplo también se describen más de 35 aminoácidos o más de 50 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente más de 60 aminoácidos.

En el presente, también se describe dicha secuencia de aminoácidos, que se deriva del dominio de no histona de una histona macroH2A que comprende el dominio macro de una histona macroH2A.

Como se utiliza aquí el término "dominio macro" se relaciona con una región presente en el dominio no histona de terminal C de histonas macroH2A, y que también se encuentra solo o en múltiples copias en un número de proteínas de otra forma no relacionadas (PEHRSON and FUJI, 1998, mencionado anteriormente; ALLEN et al., 2003, mencionado anteriormente). Tal dominio macro también se puede identificar simplemente de un experto en la técnica con análisis de secuencia simple. Como un ejemplo, dicho dominio macro corresponde a los residuos 184 a 369, preferiblemente 202 a 369 de macroH2A1.1 humano (SEQ ID NO: 1), residuos 183 a 371, preferiblemente 201 a 371 de macroH2A1.2 humano (SEQ ID NO: 2), y los residuos 184 a 372, preferiblemente 202 a 372 del macroH2A2 humano (SEQ ID NO: 3). Dicho dominio macro incluye los residuos críticos para actividad fosfoesterasa, algunos de los cuales se identifican en los ejemplos adelante, y en KUSTATSCHER et al. (2005, mencionado anteriormente). Algunos residuos potencialmente críticos para actividad fosfoesterasa se puede identificar como los residuos conservados en los dominios macro de los miembros de la familia AF1521 descritos en ALLEN et al. (2003, mencionado anteriormente. Finalmente, dicho dominio macro de la histona macroH2A es potencialmente un dominio de unión ADP como se describe en KARRAS et al. (EMBO journal, vol. 24 (11), p: 911-1920, 2005: Ver las Figuras 6A y B). En otro aspecto la invención se relaciona con el Uso de un ácido nucleico que codifica un inhibidor como se describió anteriormente en un proceso para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con la activación PARP.

Dicho ácido nucleico corresponde a ARN o ADN, preferiblemente a ADN.

De acuerdo con una realización particular, el ácido nucleico que codifica el inhibidor se liga operativamente a una secuencia de expresión de gen, que dirige la expresión del ácido nucleico dentro de una células procariótica o eucariótica, preferiblemente una célula eucariótica. La "secuencia de expresión de gen" es cualquier secuencia de nucleótido reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación de mejorador de promotor, que facilita la

transcripción eficiente y traducción del inhibidor al que se liga operativamente. La secuencia de expresión de gen, por ejemplo, puede ser un promotor vírico o de mamífero, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores de mamífero constitutivos incluyen, pero no se limitan a, los promotores de los siguientes genes: fosforibosil transferasa hipoxantina (HPTR), desaminasa adenosina, quinasa piruvato, promotor de actina beta, promotor de quinasa creatina de músculo, promotor del factor de elongación humano y otros promotores constitutivos. Los promotores víricos de ejemplo que funcionan constitutivamente en células eucarióticas incluyen, por ejemplo, promotores del virus del simio (por ejemplo, SV40), virus de papiloma, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus (CMV), virus de sarcoma Rous (RSV), virus de hepatitis B (HBV), las repeticiones de terminal largo (LTR) del virus de leucemia Moloney y otros retrovirus, y el promotor de quinasa timidina del virus de herpes simplex. Otros promotores constitutivos se conocen por aquellos medianamente versados en la técnica. Los promotores útiles como secuencias de expresión de gen de la Invención también incluyen promotores inducibles, tañes como promotores inducibles bajo condiciones de estrés. Los promotores inducibles se expresan en la presencia de un agente de inducción. Por ejemplo, el promotor hsp70-1 se induce para promover la transcripción y traducción después de un choque térmico. Otros promotores inducibles se conocen por aquellos medianamente versados en la técnica.

En general, la secuencia de expresión de gen debe incluir, cuando sea necesario, las secuencias 5’ de no transcripción y 5’ de no traducción implican con el inicio de transcripción y traducción, respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de tapón. La secuencia CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias 5’ de no transcripción incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico de antígeno ligado en forma operativa. Las secuencias de expresión de gen incluyen opcionalmente las secuencias mejoradoras o las secuencias de activador en la dirección 5’ según se desee. Preferiblemente, la secuencia de expresión de gen incluye una señal de localización nuclear (NLS) fusionado a la secuencia de ácido nucleico que codifica el inhibidor de la Invención con el fin de facilitar la transubicación de dicho inhibidor dentro del núcleo de la célula. Las secuencias NLS son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Como se utiliza aquí, la secuencia de ácido nucleico inhibidor y la secuencia de expresión de gen se dice que son "ligadas en forma operativa" cuando se ligan covalentemente en tal forma para poner la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia que codifica el inhibidor bajo la influencia o control de la secuencia de expresión de gen. Se dice que dos secuencias de ADN se ligan en forma operativa si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión de gen 5’ resulta en la transcripción de la secuencia inhibidora y si la naturaleza del ligado entre las dos secuencias de ADN no (1) resulta en la introducción de la mutación de cambio de estructura, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia inhibidora, o (3) interfiere con la capacidad del transcripto de ARN correspondiente que se traduce en la proteína. Así, una secuencia de expresión de gen se ligaría en forma operativa a una secuencia de ácido nucleico inhibidor si la secuencia de expresión de gen son capaces de efectuar la transcripción de aquella secuencia de ácido nucleico de tal manera que el transcripto resultante se traduce en la proteína o polipéptido deseado.

El ácido nucleico inhibidor se puede suministrar in vivo solo o en combinación con un vector. En otro aspecto la invención se relaciona con el uso de un vector que comprende un ácido nucleico como se describió previamente en un proceso para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con la activación de PARP.

En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico inhibidor a las células y preferiblemente las células que expresan la enzima nucleica de polimerasa poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) ["poli(ADPribosa) polimerasa" (PARP)]. Preferiblemente, el vector transporta el ácido nucleico a las células con degradación reducida con relación al grado de degradación que resultaría en la ausencia del vector. El vector incluye opcionalmente la secuencia de expresión de gen descrita anteriormente para mejorar la expresión del ácido nucleico de inhibidor en células que expresan PARP. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes víricas o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción o incorporación de las secuencias de ácido nucleico inhibidor. Los vectores víricos son un tipo preferido de vector e incluyen, pero no se limitan a las secuencias de ácido nucleico de los siguientes virus: retrovirus, tales como virus de leucemia de murino moloney, virus de sarcoma de murino harvey, virus de tumor mamario de murino, y virus de sarcoma de rouse; adenovirus, virus adeno asociado; virus del tipo SV40; virus del polioma; virus Epstein-Barr; virus de papiloma; virus de herpes; virus vaccinia; virus del polio; y virus de ARN tal como retrovirus. Uno puede emplear fácilmente otros vectores no mencionados pero conocidos en la técnica.

Los vectores víricos preferidos se basan en virus eucarióticos no citopáticos en los que se han reemplazado los genes no esenciales con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen retrovirus, el ciclo de vida de los que implica transcripción inversa del ARN vírico genómico en ADN con integración provírica posterior en los retrovirus de ADN celulares de anfitrión se han aprobado para ensayos de terapia génica humano. Son más útiles aquellos retrovirus que son deficientes de replicación (es decir, capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retrovíricos genéticamente alterados tienen utilidad general para la traducción de alta eficiencia de genes in vivo. Los protocolos estándar para producir

retrovirus deficientes de replicación (que incluyen las etapas de incorporación del material genético exógeno en un plásmido, transfección de la estirpe celular empacada con el plásmido, la producción de retrovirus recombinantes mediante la estirpe celular empacada, recolección de partículas víricas del medio de cultivo de tejido, e infección de las células objetivo con partículas víricas) se proporcionan en KRIEGLER (A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990) y en MURRY ("Methods in Molecular Biology," vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991).

Los virus preferidos para ciertas aplicaciones son los adeno-virus y virus adeno asociados, que son virus de ADN de doble hebra que ya se han aprobado para uso humano en terapia génica. Los virus adeno asociados se pueden construir mediante ingeniería por ser de replicación deficiente y son capaces de infectar un amplio rango de tipos y especies celulares. Esto tiene ventajas adicionales tales como, estabilidad de solvente de lípido y calor; frecuencias de alta transducción en células de diversos linajes, que incluyen células hematopoyéticas; y la carencia de inhibición de superinfección permitiendo así múltiples series de transducciones. Según se dice, los virus adeno asociados se pueden integrar en ADN celular humano en una forma específica de sitio, minimizando por lo tanto la posibilidad de mutagenia insercional y variabilidad de la característica de expresión de gen insertado de infección retrovírica. Adicionalmente, las infecciones de virus adeno asociadas del tipo natural han seguido en el cultivo de tejido para más de 100 pasaje en la ausencia de la presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adeno asociado es un evento relativamente estable. El virus adeno asociado también puede funcionar en una forma extracromosómica.

Otros vectores incluyen vectores de plásmido. Se han descrito extensamente en la técnica los vectores de plasma y se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Ver por ejemplo, SANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos pocos años, se han utilizado vectores de plásmido como vacunas de ADN para suministrar genes que codifican antígeno a las células in vivo. Estos son particularmente ventajosos debido a que no tienen la misma seguridad que se relaciona con muchos de los vectores víricos. Sin embargo estos plásmidos tienen un promotor compatible con la célula anfitriona, que puede expresar un péptido de un gen codificado en forma operativa dentro del plásmido. Algunos plásmidos comúnmente utilizados incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, y pBlueScript. Otros plásmidos se conocen bien por aquellos medianamente versados en la técnica. Adicionalmente, los plásmidos se pueden diseñar habitualmente utilizando enzimas de restricción y reacciones de ligación para retirar y agregar fragmentos específicos de ADN. Se pueden suministrar plásmidos de una variedad de rutas parenteral, mucosal y tópica. Por ejemplo, el plásmido de ADN se puede inyectar mediante las rutas intramuscular, intradérmica, subcutánea, u oras rutas. También se puede administrar mediante gotas o rociados intranasales, supositorio rectal y oralmente. También se puede administrar en la epidermis o una superficie mucosal utilizando una pistola de genes. Los plásmidos se pueden dar en una solución acuosa, se secan en partículas doradas o en asociación con otro sistema de suministro de ADN que incluye pero no se limita a liposomas, dendrímeros, cocleato y microencapsulación.

El vector de ácido nucleico puede incluir marcadores delectable que son activos en las bacterias y en células de mamífero.

De acuerdo con una realización preferida, el vector de ácido nucleico de la presente invención corresponde a "ADN desnudo" como plásmidos, cósmidos o fagémidos. Tal ADN desnudo se puede asociar con polímeros catiónicos de no lípido (WU and WU, J. Bill Chem., vol. 263, p: 14621-4, 1988) o liposomas (BRIGHMAN et al., Am. J. Med. Sci., vol. 298, p: 278-81, 1989) para formar complejos que mejoran la retoma celular.

De acuerdo con otra realización preferida, el vector de ácido nucleico es un vector vírico adaptado para protocolos de terapia génica in vivo. Ejemplos de los vectores víricos apropiados incluyen vectores retrovíricos como se describe en la EP 0871459, EP 0386882 y EP 1222300 y vectores de adenovirus como se describe en la US 2004/ 265273 y US 6,638,502. En este caso, la internalización del virus ocurre a través de la interacción específica de la envoltura vírica con un receptor de superficie celular, seguido por endocitosis mediada por el receptor del complejo de virus/receptor.

De acuerdo con un cuarto aspecto la presente invención se relaciona con una composición, para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel que comprende (i) un inhibidor de la Invención, un ácido nucleico que codifica el mismo, o un vector que comprende dicho ácido nucleico, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición de la Invención inhibe la actividad de PARP, y se puede utilizar para evitar y/o tratar enfermedades asociadas con la activación de PARP. Por ejemplo, la composición de la Invención se puede utilizar para tratar o evitar daño de tejido neural que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, como daño de tejido cardiovascular que resulta de isquemia cardiaca o lesión por reperfusión o enfermedades neurodegenerativas. La composición de la Invención se puede utilizar para extender o aumentar la vida útil o la proliferación de células y así para tratar o evitar enfermedades asociadas con este e inducidas o exacerbadas por senescencia celular que incluyen envejecimiento de la piel, aterosclerosis, osteoartritis, osteoporosis, distrofia muscular, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, SIDA y otras enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, y otras enfermedades asociadas con senescencia celular y envejecimiento, así como también para alterar la expresión de gen de células senescentes. La composición de la Invención se puede utilizar adicionalmente para tratar cáncer y para radiosensibilizar las células de tumor hipóxico para hacer las células neoplásicas más susceptibles a terapia de radiación y para evitar las células neoplásicas de recuperar el daño potencialmente letal de ADN después de terapia de radiación, presumiblemente mediante su capacidad para evitar la reparación de ADN.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Como ejemplo del vehículo farmacéuticamente aceptable, la composición puede comprender emulsiones, microemulsiones, emulsiones aceite en agua, lípidos anhidros y emulsiones agua en aceite, otros tipos de emulsiones. La composición también puede comprender uno o más aditivos (por ejemplo, diluyentes, excipientes, estabilizantes, conservantes). Ver, de manera general, Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed. (diversos editores, 1989-1998, Marcel Dekker); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).

El inhibidor de la Invención, los ácidos nucleicos que codifican los mismos o los vectores de ácido nucleico que comprenden tal ácido nucleico se pueden solubilizar en un regulador o agua o incorporar en emulsiones y microemulsiones. Los reguladores adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución salina regulada por fosfato Ca++/Mg++ libre (PBS), solución salina regulada con fosfato (PBS), solución salina normal (150 mM NaCl en agua), el regulador Tris y los tensoactivos.

Existen numerosas causas de la inestabilidad o degradación de péptido, que incluyen hidrólisis y desnaturalización. La interacción hidrófoba puede provocar aglutinación de moléculas (es decir agregación). Este resultado puede disminuir la represión PARP. Se pueden agregar estabilizadores para disminuir o evitar tales problemas.

Los estabilizantes incluyen ciclodextrina y derivados del mismo (ver Patente Estadounidense No. 5,730,969). Los conservantes adecuados tales como sacarosa, mannitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina también se pueden agregar para estabilizar la formulación final. Un estabilizante seleccionado de tensoactivos iónicos y no iónicos, Dglucosa, D-galactosa, D-xilosa, ácido D-galacturónico, trehalosa, dextranos, almidones hidroxietilo, y mezclas de los mismos se pueden agregar a la formulación. La adición de sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar un péptido. El péptido también se puede estabilizar al ponerlo en contacto con un sacárido seleccionado del grupo que consiste de dextrano, ácido sulfúrico de condroitina, almidón, glicógeno, dextrina, y sal de ácido algínico. Otros azúcares que se pueden agregar incluyen monosacáridos, disacáridos, alcoholes de azúcar, y mezclas de los mismos (por ejemplo, glucosa, mannosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, mannitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un péptido, y son miscibles en agua o solubles en agua. Los polioles adecuados pueden ser alcoholes polihidroxi, monosacáridos y disacáridos que incluyen mannitol, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, trimetilglicol, vinil pirrolidona, glucosa, fructosa, arabinosa, mannosa, maltosa, sacarosa, y polímeros de los mismos. Diversos excipientes también pueden estabilizar los péptidos, que incluyen albúmina de suero, aminoácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensoactivos, metales, polioles, agentes de reducción, agentes quelantes de metal, povidona, gelatina hidrolizada, y sulfato de amonio.

Ventajosamente, dicha composición comprende el inhibidor de la Invención, un ácido nucleico que codifica el mismo,

o un vector de ácido nucleico en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de PARP.

Como un ejemplo, dicha composición puede comprender una concentración de dicho inhibidor de más de 10-12 M, preferiblemente más de 10-9 M, como un ejemplo más de 10-8 M o más de 10-6 M, y más preferiblemente más de 10-3

M.

En un quinto aspecto la presente invención se relaciona con el uso de la composición como se describió anteriormente para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con la activación de PARP que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición como se describió anteriormente a dicho sujeto.

Como se utiliza aquí, el término "sujeto" denota un Mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. El sujeto es un animal tal como vaca, cerdo, caballo, pollo, gato, perro y puede ser preferiblemente un humano.

Los inhibidores de la Invención inhiben la actividad PARP y son útiles tratar el daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas; para evitar o tratar apoplejía vascular; para tratar o evitar trastornos cardiovasculares; para tratar otras afecciones y/o trastornos tales como degeneración macular relacionada con la edad, SIDA y otras enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios como trastornos inflamatorios del intestino tales como colitis y enfermedad de Crohn, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico (tal como dolor neuropático), falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico (tal como choque endotóxico), y envejecimiento de la piel; para extender la vida útil y la capacidad proliferativa de las células; para alterar la expresión de gen de células senescentes; o para radiosensibilizar las células neoplásicas.

Ejemplos de enfermedades neurodegenerativas que se pueden tratar mediante el método de la presente invención incluyen, sin limitación, neuralgia trigeminal; neuralgia glosofaríngea; Parálisis de Bell; miastenia gravis; distrofia muscular; esclerosis lateral amiotrófica; atrofia muscular progresiva; atrofia muscular bulbar progresiva heredada; hernia, síndromes de disco invertebrado roto o desplazado; espondilosis cervical; trastornos del plexo; síndromes de destrucción de la salida torácica; neuropatías periféricas tales como aquellas provocadas por plomo, dapsona, garrapatas, porfiria, o síndrome de Guillain-Barre; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.

Ejemplos de trastornos cardiovasculares que pueden provocar isquemia o son provocados por reperfusión del corazón incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de arteria coronaria, angina pectoris, infarto del miocardio, daño de tejido cardiovascular provocado por disminución cardiaca, daño de tejido cardiovascular provocado por derivación coronaria, choque cardiogénico, y afecciones relacionadas que conocidas por aquellos medianamente versados en la técnica o que implican disfunción de o daño de tejido en el corazón o vasculatura, especialmente, daño de tejido relacionado con activación PARP.

Por ejemplo, los inhibidores PARP de acuerdo con las reivindicaciones son útiles para tratar cánceres y radiosensibilizar las células neoplásicas en los cánceres tales como tumores que producen ACTH, leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, cáncer de la corteza adrenal, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, cáncer colorrectal, linfoma de célula T cutáneo, cáncer endometrial, cáncer esofágeo, sarcoma de Ewing, cáncer de vejiga, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (microcítico y/o no microcítico), efusión pleural maligna, efusión peritoneal maligna, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de ovario (célula germinal), cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pene, retinoblastoma, cáncer de piel, sarcoma de tejido blando, carcinomas de célula escamosa, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, neoplasmas trofoblásticos, cáncer uterino, cáncer vaginal, cáncer de la vulva y tumor de Wilm. Ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que se pueden utilizar en conjunto con el inhibidor de la Invención incluyen, pero no se limitan a: 5-fluorouracilo, leucovorina, 5’-amino-5’deoxitimidina, oxígeno, carbógeno, transfusiones de glóbulos rojos, perfluorocarbonos (por ejemplo, Fluosol-DA), 2,3-DPG, BW12C, bloqueadores del canal de calcio, pentoxifilina, compuestos de antiangiogenia, hidralazina, L-BSO, adriamicina, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, interferón (alfa, beta, gamma), interleuquina 2, irinotecan, paclitaxel, topotecan, y análogos terapéuticamente efectivos y derivados de los mismos.

Para uso médico, la cantidad requerida del inhibidor de la Invención para lograr un efecto terapéutico variará de acuerdo con el inhibidor particular administrado, la ruta de administración, el mamífero bajo tratamiento, y el trastorno o enfermedad particular relacionado. Una dosis sistémica adecuada del inhibidor de la Invención para un mamífero que sufre de, o probablemente sufre de, cualquier afección como se describe aquí está típicamente en el rango de aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Típicamente, los niveles de dosificación en el orden de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 10,000 mg del inhibidor son útiles en el tratamiento de las afecciones anteriores, con niveles preferidos que son aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 1,000 mg. El nivel de dosis específico para cualquier paciente particular variará dependiendo de una variedad de factores, que incluyen la actividad del compuesto específico empleado; la edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del paciente; el momento de administración; el índice de excreción; cualquier combinación del compuesto con otro de los fármacos; la severidad de la enfermedad particular que se va a tratar; y la forma y ruta de administración. Típicamente, los resultados de efecto de dosificación in vitro proporcionan la guía útil en las dosis apropiadas para la administración del paciente. También pueden ser útiles estudios en modelos de animal. Las consideraciones para determinar los niveles de dosis apropiada se conocen bien en la técnica.

La composición se puede administrar, por ejemplo, oralmente, parenteralmente, mediante rociado por inhalación, tópicamente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, sublingualmente, vaginalmente, intraventricularmente, o por medio de un reservorio implantado en formulaciones de dosificación que contienen portadores, adyuvantes, y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos.

Las composiciones se pueden administrar mediante una dosis única, múltiples dosis discretas o infusión continua. Cualquier régimen de administración que regula el tiempo y secuencia de suministro del compuesto se puede utilizar y se repite cuando sea necesario para efectuar el tratamiento. Tal régimen puede incluir pretratamiento y/o la coadministración con agentes terapéuticos adicionales.

Para maximizar la protección de daño de tejido, la composición se debe administrar a las células afectadas tan pronto como sea posible.

La presente invención se relaciona con el uso de un inhibidor como se describió anteriormente, un ácido nucleico que codifica el mismo, o un vector de ácido nucleico que comprende dicho ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad asociada con la activación de PARP.

Los inhibidores de la Invención inhiben la actividad de PARP y, así, son útiles para tratar daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas; para evitar o tratar apoplejía vascular; para tratar o prevenir trastornos cardiovasculares; para tratar otras afecciones y/o trastornos tales como degeneración macular relacionada con la edad, SIDA y otras enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios como trastornos inflamatorios del intestino tales como colitis y enfermedad de Crohn, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico (tal como dolor neuropático), falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico (tal como choque endotóxico), y envejecimiento de la piel; para extender la vida útil y la capacidad proliferativa de las células; para alterar la expresión de gen de las células senescentes; o para radiosensibilizar las células neoplásicas.

La presente invención se entenderá más claramente en la lectura de la descripción de los estudios experimentales desarrollados en el contexto de la investigación llevada a cabo por el solicitante, que no se debe interpretar como de naturaleza limitante.

EJEMPLOS

1) Construcción de plásmido

Los clones de cADN que corresponden a la secuencia de codificación completa de las histonas H2A (NM_138609; ácido nucleico 186 a 1295 de la SEQ ID NO: 4), macroH2A1.1 (NM_004893; ácido nucleico 174 a 1289 de la SEQ ID NO: 5) y macroH2A1.2 (NM_018649; ácido nucleico 214 ta1332 de la SEQ ID NO: 6) se amplifican por PCR de clones de imagen comparados de INVITROGEN con cebadores que incorporan los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción. Los fragmentos PCR amplificados luego se subclonan en los sitios Xho I-Not I del vector retrovírico pREV-HTF o el vector pGEX-5X.1 (AMERSHAM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las construcciones se secuencian para asegurar la integridad de la secuencia.

2) Expresión y localización de macroH2A1.1

Las histonas macroH2A1.1 y H2A cada una se expresan establemente como las proteínas de fusión de las etiquetas de epítopo Flag doble y HA doble de terminal N (e-MH1.1, y e-H2A) en células HeLa mediante transducción retrovírica de acuerdo con los protocolos estándar. Se realizan experimentos de inmunofluorescencia en células establemente transfectadas utilizando el anticuerpo de Rata anti-HA (ROCHE, dilución 1: 300), y un IgG anti-rata de cabra se acopla a Alexa Fluor 488 (MOLECULAR PROBES, dilución 1: 400) como un anticuerpo secundario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La localización de cromatina se evalúa en las mismas células con coloración DAPI.

Los resultados revelan que las histonas etiquetadas se colocalizan con cromatina (ver Figura 1), que indica que la presencia de los epítopos tag no interfieren con su depósito. En contraste a la histona etiquetada H2A (e-H2A), que muestra un amplio teñido en el núcleo, histona etiquetada macroH2A1.1 (e-MH1.1) muestra un teñido localizado restringido principalmente para condensar la cromatina. Concluimos a partir de estos datos que la histona etiquetada macroH2A1.1 (e-MH1.1) e histona etiquetada H2A (e-H2A) se depositan funcionalmente en las nucleosomas in vivo.

3) Purificación de nucleosomas asociadas con macroH2A1.1

Los glóbulos nucleares preparados a partir de las células HeLa descritas anteriormente que expresan las proteínas H2A y macroH2A1.1 fusionadas con las etiquetas de epítopo FLAG doble y HA doble de terminal N (e-H2A/e-MH1.1) se digieren con nucleasa microcóccica para dar las mononucleosomas predominantes como se describe en SOLLNER-WEBB y FELSENFELD (Biochemistry, vo1.14(3), p: 2915-20, 1975). Las mononucleosomas que contienen e-H2A o e-MH1.1 se purifican a partir del material resultante mediante inmunoprecipitación en la agarosa conjugada con el anticuerpo anti-Flag (SIGMA). Las nucleosomas vinculadas se eluyen con el péptido FLAG (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 7), y se purifican con afinidad adicional mediante agarosa conjugada con el anticuerpo anti-HA (SIGMA) y se eluye con el péptido HA (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 8). Una fracción pequeña de los

5 complejos purificados se ha analizado con un anticuerpo anti-Flag (ROCHE) en gel SDS-PAGE para evaluar su enriquecimiento en las histonas etiquetadas macroH2A1.1 y H2A.

La inmunotransferencia con el anticuerpo anti-Flag releva una banda específica en el tamaño esperado para las histonas etiquetadas macroH2A1.1 o H2A (ver Figura 2). El fraccionamiento bioquímico ha revelado que solo una fracción pequeña de la histona macroH2A1.1 se encuentra que está presente como una proteína soluble en el

10 extracto nuclear, y se encuentra que la mayor parte de la proteína está presente en el glóbulo nuclear estrechamente asociado con cromatina. Encontramos que la histona etiquetada macroH2A1.1 se puede solubilizar suficientemente junto con mononucleosomas al digerir la cromatina con la cantidad controlada de nucleasa microcóccica.

Luego, los complejos purificados que contienen las histonas etiquetadas macroH2A1.1 o H2A se hacen correr en 12

15 % de gel poliacrilamida desnaturalizante, que se tiñe con plata utilizando el equipo SilverQuest® (INVITROGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, se identifican los diferentes polipéptidos separados de gel mediante espectrometría de masa. Como control, realizamos la purificación en células HeLa no traducidas.

Se encuentran numerosos polipéptidos asociados con las nucleosomas e-mH2A1.1 y e-H2A (Figura 3).

Los análisis espectrométricos de masas identifican las histonas H3, H4, H2A, H2B, mH2A1.1 Ku 80, KU 70, Hsp70,

20 HDAC1, los dos subtipos de polimerasa I H1 (H1.1 y H1.2), Hpla, Hp1� y poli(ADP-ribosa) (PARP-1) como componentes comunes en los complejos e-mH2Al.1 y e-H2A (Figura 3). Una lista exhaustiva de las proteínas identificadas, con sus números de acceso, se presenta en la siguiente tabla.

Lista de proteínas asociadas con los complejos de nucleosoma H2A y mH2A1.1.

H2A

mH2A1.1 Números de acceso

PHF-14

O94880

WARP-1

PARP-1 P09874

Topo I

P11387

DDX 21

Q9NR30

KU 80

KU 80

P13010

KU70

KU 70 P12956

PRMT5

AAH25979

Hsp 70

Hsp 70

P17066

HDAC1

HDAC1 Q13547

Hpl-bp74

CAI12528

MEP 50

Q9BQA1

RCC 1

P18754

DEK

P35659

mH2A1

mH2A1 O75367

(continuación)

H2A

mH2A1.1 Números de acceso

H1.2

H1.2 P16403

H1.1

H1.1 Q02539

Ran

P62826

Hp1a

Hpla P45973

Hp1

Hp1 P83916

H3

H3 AAI08702

H2B

H2B

CAB02542

H2A

H2A

CAG33360

H4

H4 CAG46986

Sin embargo, se encuentra que ambos complejos contienen PARP-1, solo el complejo e-mH2A1.1 tiene una cantidad significativa de PARP-1.

Una parte del complejo purificado se hace correr en 15-35 % de gradiente de glicerol, el gradiente se fracciona y las diferentes fracciones se cargan en 4-12 % de SDS-PAGE. Las posiciones de las histonas núcleo, e-mH2A1.1 y PARP-1 se indican en la parte izquierda de la Figura 14.

Finalmente, la cantidad de PARP-1 presente en el complejo se encuentra que es proporcional a la cantidad de emH2A1.1 y histona H4 (Figura 3 y 14) que sugiere una interacción directa entre mH2A1.1 y PARP-1. En contraste, el complejo H2A contiene ~10 veces menos de PARP-1 (la relación entre PARP-1 y histona H4 se encuentra que está cerca de 0.1, Figura 3, panel derecho). No se detectan polipéptidos mediante teñido de plata de la purificación mock de células HeLa no traducidas (datos mostrados), que indica que todos los polipéptidos detectables en estos complejos son específicos para las histonas macroH2A1.1 o H2A.

4) El macroH2A1.1 interactúa con PARP- a través de su región no histona de terminal C

Para confirmar la interacción entre la histona macro-H2A1.1 y PARP-1, realizamos un experimento GST-Pull down utilizando un macroH2A1.1 recombinante como cebo. Se utilizan la histona H2A y GST como controles. Las histonas de fusión GST se expresan en la cepa E. Coli BL21 (pLysS) que crecen a 25° C. Las proteínas solubles se purifican en glóbulos de glutationa Sefarosa 4B (AMERSHAM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El PARP-1 recombinante humano (ALEXIS) se incuba durante 1 h con el GST recombinante fusionado o sin la histona H2A (GST-H2A), la histona macroH2A1.1 (GSTmacroH2A1.1), o a la región no histona (NHR; aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO: 1) de macroH2A1.1 (GSTNHR), a 30° C con m ezcla gentil a PBS con 100 mM KC1 y 0.02 % de NP40 (SIGMA). Después de una etapa de lavado, las proteínas vinculadas se eluyen en regulador de LAEMMLI, se fracciona en un gel de proteína de 12 % de SDS-PAGE, se transfiere y luego se revela mediante un anticuerpo humano anti-PARP-1 (ALEXIS).

Los resultados muestran que la histona recombinante macroH2A1.1 interactúa específicamente con PARP-1 a través de su región no histona (NHR), y que esta interacción no depende de la presencia de ADN (ver Figura 4). La región macroH2A1.1 no histona de terminal C comprende una región de terminal C sin ninguna homología con otras proteínas (residuo 121 a 201) y el dominio macro. Así, estos resultados sugieren que esta región de terminal C, que si el macroH2A1.1 específico es un buen candidato como el sitio de unión PARP-1.

5) Identificación de los genes objetivo macroH2A1.1

Un número de estudios sugieren un involucramiento general de la histona macroH2A en la heterocromatina establecida o de mantenimiento. Estos datos soportan fuertemente un involucramiento de la histona macroH2A en la represión de transcripción, pero se desconoce el mecanismo mediante el cual se logra esta represión. Estos

estudios utilizan principalmente el método de inmunofluorescencia y falla en identificar los genes objetivo de histona macroH2A específicos. Para superar esta cuestión, desarrollamos un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina altamente específica que utiliza el método de purificación de afinidad en tándem para identificar las secuencias de ADN objetivo específicas asociadas con las nucleosomas macroH2A1.1. Llamamos este método "Tap-Chip" (ver Figura 5), para el "Ensayo de Inmunoprecipitación de Cromatina y Purificación por Afinidad en Tandem". Nuestro método no utiliza entrecruzamiento de formaldehido o amplificación de PCR, que tiene el riesgo inherente de los artefactos.

Purificamos los núcleos de la estirpe celular HeLa que expresa establemente la histona etiquetada macroH2A1.1 de acuerdo con métodos estándar. Los núcleos purificados se digieren con la cantidad controlada de nucleasa microcóccica para dar mono y dinucleosomas predominantemente (datos no mostrados). Se encuentra que la cromatina digerida contiene una cantidad significativa de la histona etiquetada macroH2A1.1 (datos nos mostrados). Las mono- y dinucleosomas macroH2A1.1 se inmunopurifican con (i) un anticuerpo anti- Flag, y luego con (ii) un anticuerpo anti-HA como se describió anteriormente. Una fracción péquela del las mono- y dinucleosomas purificadas se ha analizado en gel SDS-PAGE para evaluar su enriquecimiento en la histona etiquetada macroH2A1.1 (datos no mostrados). Como control, realizamos la purificación mock de una estirpe celular HeLa no etiquetada, y no se pueden detectar los polipéptidos mediante teñido plata (datos nos mostrados).

Las mono- y dinucleosomas macroH2Al.1 inmunopurificadas se digieren con la proteinasa K, y fenol extraído de acuerdo con métodos estándar. El ADN purificado se trata con la quinasa de ADN T4 (BIOLABS) y una saliente A 3’ se agregan utilizando la polimerasa de ADN Taq (AMERSHAM). Los fragmentos de ADN que corresponden a monoy dinucleosomas macroH2A1.1 se clonan en el vector pcDNA3.1-Topo utilizando tecnología de clonación TA (INVITROGEN). Los clones transformados se revisan para insertos y se secuencian al utilizar cebadores específicos de vector. Las secuencias obtenidas luego se identifican mediante búsqueda Blast de la base de datos del genoma humano (http: //www.ncbi.nhn.nih.gov/).

Los resultados en la literatura muestran que el MacroH2A se asocia con la represión de gen y se localizan esencialmente en el cromosoma X inactivo cuando contribuye a la inactivación de X. De forma interesante, nuestros resultados muestra que el macroH2A no se restringe al cromosoma X pero se extiende a lo largo del genoma. 45 % de los 60 genes identificados son enzimas, y los otros se implican en diferentes rutas biológicas. Más aún, el análisis de estas secuencias genómicas identificadas revelan que la histona macroH2A1.1 se asocia principalmente con las regiones promotoras de diversos genes altamente regulados, y luego se puede involucrar en la regulación general de los genes inducibles o tempranos responsables.

Una de las secuencias genómicas identificadas corresponde al gen promotor hsp70-1. El Hsp70-1 (o hsp70i) es uno de los miembros más promisorios y mejor caracterizados de la familia hsp70, que abarca por lo menos 11 genes, y codifica un grupo de las proteínas altamente relacionadas (TAVARIA et al., 1996). El Hsp70-1 es inducible en respuesta al choque térmico y el estrés químico y la sonda utilizada aquí recoge específicamente este gen.

6) El MacroH2A1.1 dirige específicamente el promotor hsp70

Con el fin de confirmar la asociación de la histona macroH2A1.1 con los promotores de gen, analizamos su distribución en el locus hsp70-1 utilizando PCR semi-cuantitativo y en tiempo real. La cromatina de células Hela que expresan la histona etiquetada macroH2A1.1 (e-MH1.1) se precipita como se describe adelante, con los anticuerpos anti-Flag y anti-HA. La cromatina se entrecruza con solución de formaldehido durante 10 min a 37° C, y luego se somete a sonicación para obtener una longitud promedio de 300 a 800 bp fragmentos de ADN. Los extractos se estandarizan mediante electroforesis en gel no desnaturalizante y cada muestra se analiza independientemente mediante PCR semicuantitativo con los siguientes cebadores:

-

promotor hsp70-1 (delantero): 5’-GGCGAAACCCCTDGAATATTGCCGA-3’ (SEQ ID NO: 9);

-

promotor hsp70-1 (inverso): 5’-AGCCTTGGGACAACGGGAG-3’ (SEQ ID NO: 10);

-

región codificante hsp70-1 (delantero): 5’-CAGGTGATCAACGACGGAGACA-3’ (SEQ ID NO: 11);

-

región codificante hsp70-1 (inverso): 5’-GTCGATCGTCAGGATGGACACG-3’ (SEQ ID NO: 12).

Se realizan PCR semi-cuantitativo con la polimerasa de ADN Taq (PROMEGA) en el promotor hsp70.1 y la región codificante utilizando los pares de oligonucleótido descritos adelante. Las muestras se amplifican durante 25 ciclos (93° C durante 30 seg, 58° C durante 30 seg, y 72° C durante 1 min), y se hace correr en 2 % de geles de agarosa, visualizado con bromuro de etidio y se cuantifica mediante densitometría.

Los resultados muestran que se enriquece el fragmento de ADN que abarca el promotor hsp70-1 (P, 191 bp), mientras que no lo hace el fragmento ubicado en la región codificante (C, 363 bp) (ver Figura 6A). Estos resultados demuestran que el macroH2A1.1 está presente en el promotor hsp70-1.

Luego utilizamos un PCR en tiempo real para cuantificar el enriquecimiento relativo de la histona macro-H2A1.1 en la región promotora utilizando un LightCycler (ROCHE DIAGNOSTICS). Se analizan dos diluciones diferentes de cada muestra independientemente de Q-PCR con los cebadores mencionados anteriormente y cebadores GAPDH para normalización (GAPDH (delantero): 5’-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AGA A-3’ (SEQ ID NO: 13); GAPDH (inverso): 5’-GGTG TCG CTG TTG AAG TCA GAG-3’ (SEQ ID NO: 14). Se calculan los números de copia como se describe en FERREIRA et al. (2001), y se presentan los resultados de Q-PCR como la relación entre el mARN Hsp70 versus el mARN GAPDH. Finalmente, los valores PCR se normalizan contra los valores obtenidos con cromatina de células no transfectadas.

Los resultados muestran que se encuentra que el MacroH2A1.1 enriquece 450 veces en la región promotora del gen hsp70-1 comparado con la región codificante (ver Figura 6B).

Luego nos preguntamos si la histona macroH2A1.1 expresada ectotópicamente refleja adecuadamente la distribución de la proteína natural a través del genoma y por lo tanto los genes objetivo identificados mediante nuestro método TAP-ChIP son de hecho los objetivos reales in vivo de histona macroH2A1.1. Para determinar si el promotor hsp70-1 es un objetivo de buena fe de macroH2A1.1, examinamos la distribución in vivo de la histona macroH2A1.1 endógena en el promotor hsp70-1 utilizando una estirpe celular HeLa no transfectada. Se realizan ensayos de inmunoprecipitación de cromatina in vivo (ChIP) como se describió previamente utilizando un anticuerpo policlonal dirigido contra la región no histona de la histona macroH2A1.1. Los extractos se estandarizan mediante electroforesis en gel no desnaturalizante y cada muestra se analiza independientemente mediante PCR semicuantitativo como se describió previamente.

Los resultados muestran que el fragmento de ADN que abarca el promotor hsp70-1 (P) se enriquece después de coinmunosupresión de cromatina con un anticuerpo específico macroH2A1.1 en tres ensayos ChIP independientes, mientras que un fragmento ubicado en la región codificante (C) no es (ver Figura 6C). Estos resultados demuestran que el macroH2A1.1 está presente en forma natural in vivo en el promotor hsp70-1.

Luego nos preguntamos si el mH2A1.1 se asocia con los promotores de otros genes inducibles de la familia Hsp70 así como también con los genes constitutivamente expresados Hsp70. Utilizamos un método candidato, focalizando los genes Hasp70.2 inducibles mediante choque térmico y los genes Hsp70.8 (Hsc70) constitutivamente expresados (Dworniczak and Mirault 1987).

Se lleva a cabo un ensayo ChIP utilizando los anticuerpos anti-Flag y anti-HA con cromatina entrecruzada con formaldehido aislado de las estirpes celulares HeLa que expresan establemente e-mH2A1.1 como se describió previamente.

Finalmente, se realiza cuantificación de PCR en tiempo real como se describió previamente utilizando cebadores específicos para los promotores respectivos, que son como sigue:

-

promotor Hsp70.2 (delantero): 5’-GGCCGAGAGTCAGGGAGGAACC-3’ (SEQ ID NO : 24);

-

promotor Hsp70.2 (inverso): 5’-ACTCTTCCAGCTCCACCACAG-3’ (SEQ ID NO : 25);

-

promotor Hsp70.8 (delantero): 5’-TGTGGCTTCCTTCGTTATTGGA-3’ (SEQ ID NO : 26);

-

promotor Hsp70.8 (inverso): 5’-AAATACCGCTGCCATCCCACCG-3’ (SEQ ID NO : 27).

Los resultados muestran claramente que la región promotora del gen Hsp70.2 se enriquece en e-mH2A1.1 a un grado similar a aquel del gen Hasp70.1, mientras que la presencia es e-mH2A1.1 es apenas detectable en el promotor del gen Hsp70.8 (Fig 13). Estos datos sugieren que el mH2A1.1 en general se puede asociar preferencialmente con genes de choque térmico inducibles.

7) Desplazamiento de macroH2A1.1 y PARP-1 inducido por choque térmico del promotor hsp70-1

Se pretende describir exhaustivamente la función de macroH2A1.1 en la regulación del gen y su relación con PARP1, examinamos el orden de eventos que ocurren en el promotor hsp70-1 durante la activación transcripcional dependiente del choque térmico. Se establecen diferentes estirpes celulares HeLa que expresan las versiones etiquetadas Flag-HA de las histonas macro-H2A1.1, H2A, H3 o H3.3. Se utiliza una estirpe celular HeLa noetiquetada como un control negativo. La expresión del gen hsp70-1 se induce por células HeLa de choque térmico a 42° C durante 30 min y se observa rutinariamente una inducción de diez veces (datos no mostrados). Las células se

dejan recuperar durante 30 min y se tratan inmediatamente con formaldehido para entrecruzar la proteína-proteína y los complejos de proteína-ADA. A continuación se precipita la cromatina cortada como se describió previamente utilizando el anticuerpo anti-Flag para las histonas macroH2A1.1, H2A, H3 y H3.3. En paralelo, también examinamos con anticuerpos específicos la presencia de la enzima que modifica la histona PARP-1 (ALEXIS), los polímeros de ADP-ribosa (ALEXIS) y histona H4 pan acetilada (ALEXIS). Como control, la cromatina se inmunoprecipita en la ausencia de anticuerpos específicos. La estandarización de las entradas de cromatina para la inmunoprecipitación se evalúa en cada experimento utilizando PCR en tiempo real. Los niveles de GAPDH, que se expresan constitutivamente, también se evalúan como control negativo, y como se espera se encuentra que la secuencia es a penas detectable en los inmunoprecipitados. El fragmento de promotor hsp70-1 en los inmunoprecipitados se cuantifica utilizando PCR en tiempo real como se describió anteriormente.

Los resultados muestran que el macroH2A1.1 y PARP-1 están presentes en el promotor hsp70-1 antes de activación y que el desplazamiento inducida por choque térmico del promotor (ver Figura 7A). La asociación de macro-H2A1.1 con el promotor hsp70-1 disminuido en un 90 %, mientras que la histona H2A canónica solo afecta ligeramente (disminución de menos del 30 %). De forma interesante, el PARP-1 es caso no detectable en el promotor hsp70-1 después de choque térmico (ver Figura 7A) debido a un alto nivel de los polímeros poli(ADP-ribosa) que aparecen en el momento de activación (ver Figura 8A)). Consistente con hallazgos recientes, se encuentra que la histona H3.3 reemplaza la histona H3 en el promotor hsp70-1 transcripcionalmente activo (ver Figura 7B). En contraste, no encontramos cambios en la acetilación global de histona H4 (ver Figura 8B). Estas observaciones sugieren que se inhibe la ADPribosilación PARP-1, mientras que se secuestra por macro-H2A1.1 en el promotor. El PARP-1 se vuelve activo cuando se libera del promotor, y modifica las proteínas locales, lo que conduce a una acumulación de las unidades estructurales ADP-ribosa.

Debido a que la ADP-ribosilación es esencial para la liberación de las proteínas vinculadas a cromatina (para una revisión reciente ver (Kim et al. 2005), hipotetizamos que el macroH2A1 y PARP-1 se pueden ADP-ribosilar.

Para visualizar la asociación del polímero con las proteínas del complejo de nucleosoma e-mH2A1.1 en la ausencia de choque térmico, aislamos el complejo e-mH2A1.1 de estirpes celulares HeLa estables, separados en un SDS que contiene 12 % de PAGE, y teñido plata (Figura 15, panel izquierdo). Luego, el gel se transfiere y se revela mediante un anticuerpo de ribosa anti-ADP (Figura 15, panel derecho).

El Western blot muestra que el PARP-1 y e-mH2A1.1 así como también las histonas núcleo H3 y H2B se ADPribosilan (Figura 15, panel derecho), un resultado de acuerdo con la literatura (Abbott et al., 2005). Estos resultados sugieren que luego de activación por choque térmico no solo mH2A1.1 y PARP-1, pero también las histonas núcleo se ribosilan pesadamente y posteriormente se liberan del promotor Hsp70.1 en una forma dependiente de ADPribosilación.

8) Regulación por disminución del macroH2A1.1 o PARP-1 que retrasa la respuesta de choque térmico

Con el fin de tratar más precisamente la función de macroH2A1.1 y PARP-1 en la regulación de gen hsp70-1, diseñamos dos siARN que corresponden a sus secuencias de mARN específicas. El siARN dirigido contra macroH2A1 se ubica en el dominio macro y se comparte por las dos isoformas de macro-H2A1, es decir macro-H2A1.1 y macro-H2A1.2. El siARN dirigió contra PARP-1 se ubica en el dominio catalítico de PARP-1 (KAMEOKA et al., 2004). Se utiliza una secuencia codificada como un control negativo (control siARN). Una búsqueda en las colecciones de secuencia indica que nuestro siARN macro-H2A1 y PARP-1 se restringen a macro-H2A1 y PARP-1 respectivamente, y que la secuencia de control siARN está totalmente ausente. La secuencia de estos siARN son como sigue:

-

siARN MacroH2A1 (siARN MH1, SEQ ID NO: 15; 5’ AAGCAGGGUGAAGUCAGUAA 3’),

-

siARN PARP1 (siARN PARP-1, SEQ ID NO: 16; AAGCCUCCGCUCCUGAACAAU);

-

El siARN codificado de control (siARN codificado, SEQ ID NO: 17; 5’-CAUGUCAUGUUCACAUCUCTT-3’).

Para la transfección de siARN, las células HeLa en crecimiento exponencial se siembran en placas de 6 pozos y se cultivan durante la noche a 37° C en DMEM/10 % de F BS (INVITROGEN). Las células HeLa se transfectan con Lipofectamine® (INVITROGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y con 1 µg de cada siARN mencionado anteriormente, o no siARN. 48 horas post-transfección, las células experimentaron choque térmico a 42° C durante 60 minutos y se dejan recuperar a 37° C durante 10, 20 o 30 min. Luego Las células se cosechan y se evalúan para expresión de hsp70.1 mediante RT-PCR. Como control, las células también se evalúan para inactivación macro-H2A1 y PAR-1 mediante inmunotransferencia.

Los resultados revelan que la expresión del macroH2A1 y PARP-1 endógeno casi se inhibe completamente (cuando se revela mediante western blot utilizando anticuerpos específicos contra macroH2A1 y PARP-1, ver Figura 9). Los

resultados también revelan que la regulación por disminución de macro-H2A1.1 o PARP-1 con siARN específicos que retrasan la respuesta de choque térmico respectivamente por 3 y 10 veces (ver Figura 10A). Al mismo tiempo, las células HeLa transfectadas con un siARN codificado se comportan como el control y no muestran ningún retraso en la activación de hsp70-1.

Con el fin de confirmar este resultado, realizamos un análisis cinético de la activación hsp70-1 en la presencia de los siARN macroH2A1. Las células HeLa transfectadas o no con siARN macroH2A1se someten a choque térmico a 42°C durante 30 min y se supervisa la expresión de hsp70-1 mediante RT-PCR en tiempo real después de 10, 20 y 30 min de recuperación como anteriormente.

Los resultados muestran claramente que la regulación por disminución de macroH2A1.1 con un siARN específico resulta en una respuesta de choque térmico retrasada mediante un factor de tres veces (ver Figura 10B). Debido a que el mH2A1 parece estar implicado en la asociación de PARP-1 con el promotor Hsp70.1, uno esperaría que el agotamiento de mH2A 1 mediante tratamiento de siARN reduciría severamente la cantidad de promotor Hsp70.1 asociado con PARP-1, que, a su vez, interferiría con la respuesta de choque térmico. Los datos ChIP (Figura 24) demuestran que el agotamiento de mH2A1 resulta, como espera, en una reducción fuerte de la cantidad de PARP-1 que interactúa con el promotor Hsp70.1.

De acuerdo con nuestros resultados, se encuentra que se requiere el PARP-1 para inflamación inducida por choque térmico y expresión de hsp70 en larvas drosofila (TULIN AND SPRADLING Science, vol. 299 (5606), p: 560-2, 2003). Posteriormente, muestran que el macroH2A en asociación con el promotor hsp70-1 se liga claramente a su estado inactivo. La asociación con PARP-1 suporta este punto de vista y sugiere una función de macroH2A en la regulación de genes inducibles que necesitan responder rápidamente a hormonas, citoquinas, o choque térmico. La identificación de un gran número de genes que se regulan potencialmente por macroH2A1.1 suporta la noción que el macroH2A1.1 es un regulador que reprime los diversos procesos celulares.

9) MacroH2A1.1 regula la actividad enzimática PARP-1

La asociación física de macro-H2A1.1 conPARP-1 y su liberación coordinada del promotor hsp70-1 después de una activación por choque térmico nos llevaron a examinar la regulación posible de la actividad enzimática PARP-1 mediante macro-H2A1.1. Se sabe que el PARP-1 auto-ADP-ribosila por sí mismo y no se conocen los mecanismos que controlan esta auto-modificación.

Nuestros resultados sugieren que el macroH2A está implicado en la regulación de la actividad PARP-1. Con el fin de elucidar este proceso de regulación, comparamos las secuencias macroH2A con proteínas que tienen un dominio macro, y más específicamente con fosfoesterasas: De hecho, ALLEN et al., (2003, mencionado anteriormente) sugiere que el dominio macro define una superfamilia de fosfoesterasas que actúan en derivados de ribosa ADP.

Nuestro análisis muestra que el macroH2A1.1, macroH2A1.2, y macroH2A2 comparten una homología importante con el dominio catalítico de las fosfoesterasas conocidas (ver Figura 11). Más aún, la macroH2A1.1 y macroH2A2 comparten un motivo HXTX filogenéticamente invariante (en negrilla de la Figura 11 y la Figura 16) asociado con la actividad de fosfoesterasa (NASR and FILIPOWICZ, Nucleic acids Res., vol. 28 (8), p: 1676-83, 2000; HOFMAN et al., EMBO J., vol. 19 (22), p: 6207-17, 2000), en donde el residuo histidina es crítico para la actividad. El residuo correspondiente en macroH2Al.2 es asparagina (N).

Para probar su una perturbación en el plegado de mH2A1.1 puede afectar la actividad PARP-1 y facilitar la liberación de otra forma de la nucleosoma asociada con mH2A1.1 PARP-1, generamos una mutuación puntual en el gen mH2A1.1 que convierte el motivo conservado HXTX en las posiciones 213-216 a Alaninas (AAAA), y se denomina aquí adelante como MH1.1mut (Figura 16). De hecho, este motivo HXTX está presente en otros dominios macro que poseen la actividad catalítica hacia los sustratos ADPribosilados (Figura 16 y Allen et al. 2003). Se ha mostrado previamente que la mutación de un motivo análogo en la fosfoesterasa de levadura abole su actividad enzimática (NASR and FILIPOWICZ, 2000, mencionado anteriormente; HOFMAN et al., 2000, mencionado anteriormente). Este motivo también está en proximidad cercana con el bolsillo mH2A1.1 (Allen et al. 2003; Chakravarthy et al. 2005), que une la ribosa ADP (y posiblemente el PARP-1 mono-ADP ribosilado) y su derivado Oacetil- ADPribosa (Karras et al. 2005; Kustatscher et al. 2005), de tal manera que se espera que las mutaciones en el motivo afectan la unión.

Para probar si las mutaciones anteriores afectan la unión de mono-ADP-ribosa, aumenta las cantidades de los dominios macro mH2A1.1 recombinantes tipo natural (WT) y mutado (Mut) se purifican hasta homogeneidad, se incuban con 32P-ADP-ribosa, y se transfieren (en duplicado) en las membranas PVDF para detectar las proteínas marcadas (Figura 17, panel superior). La membrana en duplicado se tiñe Coomassie como un control para carga igual (Figura 17, panel inferior). Los resultados obtenidos confirman la unión más débil de mono-ADP-ribosa al emH2A1.1 mutado comparado con su unión en el WT e-mH2Al.1 (Figura 17, panel superior). Esto proporciona evidencia que la estructura del bolsillo e-mH2A1.1 que une ADP-ribosa (Karras et al. 2005; Kustatscher et al. 2005) se perturba en la proteína mutada.

Si el plegado de mH2A1.1 es importante para la afinidad de unión de PARP-1 dentro del complejo de nucleosoma emH2A1.1, las alteraciones en el plegado de e-mH2A1.1 debe afectar la unión de PARP-1. Para abordar esto, purificamos los complejos emH2A1.1 tipo natural (WT) y mutados (Mut) bajo condiciones diferentes de exigencia, es decir a 150 mM (Figura 18, panel izquierdo) y 300 mM NaCl (Figura 18, panel medio).

Los resultados muestran que remarcablemente, la cantidad de PARP-1 asociado con los complejos WT y Mut aislados a 150 mM NaCl que difieren solo ligeramente (ver cuantificación en la Figura 18, panel derecho). Sin embargo, la fotografía es completamente diferente para los complejos aislados a 300 mM NaCl (Figura 18, panel medio y cuantificación). En este caso la cantidad de PARP-1 que permanece asociada con el complejo de nucleosoma e-mH2A1.1 mutado no excede 8-10 % de aquel asociado con el complejo de nucleosoma WT emH2A1.1 (Figura 18, cuantificación). Por lo tanto, 300 mM NaCl es capaz de perturbar fuertemente la unión de PARP-1 al e-mH2A1.1 mutado dentro del complejo de nucleosoma, defendiendo una interacción más débil entre PARP-1 y el emH2A1.1 mutado. Esto sugiere que, in vivo el promotor Hsp70.1, la cantidad de PARP-1 asociada con el e-mH2A1.1 mutado será más pequeño comparado con aquel asociado con el WT e-mH2A1.1. De hecho encontramos que este es el caso (Figura 19). En resumen, realizamos experimentos ChIP con anti-PARP-1 al utilizar cromatina aislada de las estirpes celulares HeLa que expresan establemente el e-mH2A1.1 tipo natural o mutado, y Q-PCR para cuantificar la cantidad del promotor Hsp70.1 asociado con PARP-1. La cuantificación muestra que no más de 15 % del promotor Hsp70.1 se asocia con PARP-1 en las células que expresan el e-mH2A1.1 mutado cuando se compara con aquel encontrado en las células que expresan la proteína WT. Tomados juntos, todos los datos anteriores demuestran, in vitro e in vivo, que el plegado de mH2A1.1 es crucial para la unión de PARP-1 a cromatina.

Luego medimos la actividad de ribosilación auto-ADP del PARP-1 asociado con los complejos de nucleosoma emH2A1.1 tipo natural y mutante. Se aíslan los dos complejos bajo las mismas condiciones mediante purificación de inmunoafinidad doble en una solución regulada que contiene 100 mM NaCl (Figura 20). Bajo estas condiciones, la cantidad relativa de PARP-1 asociada con el complejo mH2A1.1-mut es igual como aquella asociada con el complejo mH2A1.1 tipo natural (Figura 20).

Para medir la actividad de ribosilación auto-ADP de PARP-1, los complejos mutante y tipo natural que contiene la misma cantidad de PARP-1 asociado se incuban en la presencia de mononucleosomas y 32P-a-NAD+. Se realiza la poli(ADP-ribosil) ación in vitro en 20 µl de una mezcla de reacción que contiene 20 mM Tris-HCl, pH 7.8, 50 mM Nacl, 3mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 10 µM {32P}NAD (10µCi/nmol) (AMERSHAM), 100 ng de mononucleosomas preparadas como se describe en DUBAND- GOULET et al. (Methods, vol. 33 (1), p: 12-7, 2004) y 100 ng de PARP-1 recombinante (ALEXIS), macroH2A1.1 natural asociado con PARP-1 o el mutante macro-H2A1.1 natural asociado con PARP-1. Las reacciones de ribosilación ADP se incuban a 37° C durante 1 a 30 min y se detienen con 1 % de SDS y se cargan directamente en 12 % de gen SDS-PAGE.

Los resultados muestran que la incubación del complejo macro-H2A1.1 tipo natural con mononucleosomas en el presencia de 32P-NAD+ resulta en una marca muy pobre de PARP-1 (ver Figura 12), y podemos detectar fuertemente el marcado después de 30 min de incubación. El control que contiene la misma cantidad de PARP-1 recombinante (50 ng) y mononucleosomas muestran un marcado fuerte de PARP-1 después de solo 1 min de incubación, lo que sugiere que el macro-H2A1.1 interfiere con la actividad de auto-ADP-ribosilación PARP-1. El mismo experimento desarrollado con el complejo mutante macroH2A1.1 resulta en una marca detectable PARP-1 justo después de 1 min de incubación con 32P-NAD+ (ver Figura 12), y esta marca aumenta linealmente hasta que todo el 32P-NAD+ se convierte en el polímero ADP-ribosa.

Adicionalmente, el grado de marca PARP-1 durante el primer minuto es por lo menos 37 veces mucho mayor que el de aquel PARP-1 asociado con las nucleosomas e-mH2A1.1 tipo natural (Figura 21, cuantificación).

Estos resultados sugieren fuertemente que la interacción de mH2A1.1 con PARP-1 interfiere con la actividad de auto- ADP-ribosilación PARP-1. De hecho, el plegado del mH2A1.1 mutado se perturba (Figura 17 y 18), esto resultaría en una perturbación de la interacción específica entre el mH2A1.1 y PARP-1 mutado (Figura 18), que a su vez permitiría al PARP-1 adoptar una conformación cercana a aquella de la enzima libre en la solución, con actividad enzimática mayor. Nuestros datos en la auto ADP-ribosilación del PARP-1 recombinante están de acuerdo con esto, debido a que ambas cinéticas y el grado de auto-ADP ribosilación del PARP-1 recombinante son similares a estos PARP-1 asociados con el emH2A1.1 mutante (Figura 12, compara el panel derecho y medio). Finalmente, la concentración NAD utilizada aquí es cercana a las concentraciones fisiológicas y no permite la formación de PARP-1 altamente ramificado (datos no mostrados).

Debido a que el complejo de mononucleosoma e-mH2A1.1 contiene, además de PARP-1, un número de otras proteínas es difícil excluir completamente la posibilidad que algunas de estas proteínas, como e-mH2A1.1, pueden interactuar con PARP- 1 e interfiere también con su actividad enzimática. Con el fin de descartar purificar los octámeros emH2A1.1 y el PARP-1 asociado, para reconstituir el complejo de nucleosoma-PARP-1 e-mH2A1.1 de los componentes altamente purificados y para medir la actividad enzimática del asociado con la PARP-1 de nucleosoma e-mH2A1.1. Para este fin, generamos una nueva estirpe celular HeLa que expresa establemente una

versión etiquetada triple de mH2A1.1 (FLAG-HA-HIS). Esto ha permitido la purificación del octámero de histona emH2A1.1 y PARP-1 del complejo de nucleosoma emH2A1.1. En resumen, las mononucleosomas FLAGHA purificadas se adsorben en una columna de hidroxil apatita y se lavan con 0.65 M NaCl. El lavado de la columna con

0.65 M NaCl libera todas las proteínas asociadas, con la excepción de PARP-1. (Figura 22, línea 3, y datos no mostrados), evidenciando una unión muy fuerte de las nucleosomas PARP-1 a e-mH2A1.1 (para notar que es el resto de la columna e-mH2A1.1 y PARP-1 está en una cantidad estequiométrica similar, lo que sugiere que una molécula de emH2A1.1 nucleosómico se puede complejar con una molécula de PARP-1).

Se liberan el octámero e-mH2A1.1 y PARP-1 de la columna con una solución regulada que contiene NaCl 2M (Figura 22, línea 3) y se utilizan para reconstitución del complejo de nucleosoma emH2A1.1-PARP-1. La actividad de auto-ADP ribosilación del PARP-1 asociada con las nucleosomas e-mH2A1.1 reconstituidas luego se prueba (Figura 23). Una solución que contiene nucleosomas convencionales y PARP-1 natural (purificado NaCl 2M eluato de la columna hidroxil apatita inmovilizado en el complejo de nucleosoma e-mH2A1.1 (Figura 22, línea 4), se utiliza como un control positivo (Figura 23). La reacción se disminuye en los momentos indicados y las muestras se cargan en 12 % de gel SDS-PAGE. Después de terminación de la electrofóresis, se visualiza el PARP-1 auto-ADP-ribosilado mediante autoradiografía (Figura 23). La incubación de los nucleosomas emH2A1.1 reconstituidas in vitro con PARP-1 en la presencia de 32P-a-NAD+ resulta en una inactivación completa de su actividad enzimática (Figura 23, líneas 2-5), mientras que el mismo PARP-1, cuando se incuba con las mononucleosomas convencionales, muestran una actividad de ADP-ribosilación fuerte, que se aumenta con el tiempo y alcanza la terminación dentro de 10-20 minutos (Figura 23, líneas 6-9). Adicionalmente, la incubación de las nucleosomas mH2A1.1 reconstituidas in vitro que contienen PARP-1 en la presencia de un exceso de 100 veces de las nucleosomas convencionales fallan en reactivar PARP-1 (datos no mostrados), confirmando adicionalmente que la interacción específica entre PARP-1 y mH2A1.1 determina la "inactivación" de la enzima.

10) Identificación del sitio de unión PARP-1 en la región no histona de terminal C de macroH2A1.1

Para identificar el dominio de macroH2A1.1 interactúa específicamente con PARP-1, realizamos experimentos GSTPull-down utilizando la región no histona recombinante macroH2A1.1 con diferentes eliminaciones como cebo. Los experimentos se realizan como se describió previamente. Como experimentos de control, utilizamos la región no histona recombinante macroH2A1.1 con G224E, que abole la unión de la ADP ribosa (KUSTATSCHER et al., 2005, mencionado anteriormente), y el dominio macro recombinante de YBR022w (de S. Cerivisiae; NP_009578) como cebos.

Con el fin de identificar la región de unión correspondiente en macroH2A1.2 y en macroH2A2, también realizamos experimentos GST-Pull down utilizando región no histona recombinante macroH2A1.2 o macroH2A2 con diferentes eliminaciones como cebo.

11) Inhibidores recombinantes de la actividad PARP-1

Con el fin de identificar el nuevo inhibidor de la actividad PARP-1, elaboramos diferentes construcciones que codifican las proteínas de fusión GST que contienen el sitio de unión macroH2A1.1 a PAP-1 fusionado al dominio macro de macroH2A1.2, macroH2A2, o YBR022w (de S. Cerivisiae; NP_009578).

Se producen proteínas recombinantes como se describió previamente, y se purifican de acuerdo con protocolos estándar.

Realizamos el ensayo de poli(ADP-ribosil)ación en la presencia de PARP-1 recombinante (ALEXIS) con o sin las diferentes proteínas de fusión GST que contienen el sitio de unión macroH2A1.1 a PARP-1.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) HAMICHE, Ali

<120> NUEVOS INHIBIDORES DE ACTIVIDAD PARP Y USO DEL MISMO

<130> 46201/PCT

<150> 60/736,588

<151> 2005-11-14

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 371

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 372

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1890

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 1923

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 1932

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido FLAG

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido HA

<400> 8

<210> 9

<211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador hsp70-1

<400> 9 ggcgaaaccc ctggaatatt cccga 25

<210> 10

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador HSP

<400>

10

<400>

14 ggtgtcgctg ttgaagtcag ag 22

agccttggga caacgggag

19

<210> 11

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador HSP

<400> 11

caggtgatca acgacggaga ca

22

<210> 12

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador HSP

<400> 12

gtcgatcgtc aggatggaca cg

22

<210> 13

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador GAPDH

<400> 13

ggacctgacc tgccgtctag aa

22

<210> 14

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador GAPDH

<210> 15

<211> 20

<212> ARN

<213> Artificial

<220>

<223> macroH2A1 siARN

<400> 15 aagcagggug aagucaguaa 20

<210> 16

<211> 21

<212> ARN

<213> Artificial

<220>

<223> PARP1 siARN

<400> 16 aagccuccgc uccugaacaa u 21

<210> 17

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> siARN de control codificado

<400> 17 caugucaugu ucacaucuct t 21

<210> 18

<211> 249

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio macro de macroH2A1.1

<400> 18

<210> 19

<211> 251

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio macro de macroH2A1.2

<400> 19 <210> 20

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio macro de macroH2A2

<400> 20

<210> 21

<211> 57

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio macro de AF1521

<400> 21

10 <210> 22

<211> 57

<212> PRT

<213> Artificial.

<220>

<223> Dominio macro de NP_598908

<400> 22

<210> 23

<211> 59 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dominio macro de YBR022WP

<400> 23

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial 20 <220>

<223> Cebador hsp70-2

<400> 24

ggccgagagt cagggaggaa cc

22

<210> 25

5

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador hsp70-2

10

<400> 25

actcttccag ctccaccaca g

21

<210> 26

<211> 22

<212> ADN

15

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador hsp70-8

<400> 26

tgtggcttcc ttcgttattg ga

22

20

<210> 27

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

25

<223> Cebador hsp70-8

<400> 27

aaataccgct gccatcccac cg

22

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un inhibidor de la enzima nucleica poli(adenosina 5’-difosfo-ribosa) polimerasa ["poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1)”] para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel, en donde dicho inhibidor tiene una actividad fosfoesterasa, y comprende una secuencia de aminoácidos del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A seleccionada del grupo que consiste del dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1 humano (aminoácidos 121 a 369 de la SEQ ID NO: 1), macroH2A1.2 (aminoácidos 120 a 371 de la SEQ ID NO: 2), y macroH2A2 (aminoácidos 121 a 372 de la SEQ ID NO: 3) histona.

2. 2.

   Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos se fusiona y/o se acopla a por lo menos una secuencia heteróloga.

3. 3.

   Un inhibidor para uso en la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio no histona de terminal C de histona macroH2A es el dominio no histona de terminal C de macroH2A1.1.

4. 4.

   Un inhibidor para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha secuencia de aminoácidos, que es del dominio no histona de terminal C de una histona macroH2A no comprende el dominio de plegamiento de histona macroH2A que tiene homología con histona H2A.

5. 5.

   Un inhibidor para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la secuencia de aminoácidos, que es del dominio no histona de una histona macroH2A comprende el dominio macro de una histona macroH2A.

6. 6.

   Un ácido nucleico que codifica un inhibidor para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. 7.

   Un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

8. 8.

   Una composición para uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de una enfermedad asociada con activación PARP-1 seleccionada del grupo que comprende daño de tejido que resulta de daño o muerte celular debido a necrosis o apoptosis, daño de tejido neural que resulta de isquemia y lesión por reperfusión, trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas, apoplejía vascular, trastornos cardiovasculares, degeneración macular relacionada con la edad, SIDA, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, artritis, aterosclerosis, caquexia, cáncer, enfermedades degenerativas del músculo estriado que implican senescencia replicativa, diabetes, trauma de cabeza, enfermedades inmunitarias relacionadas con la edad, trastornos inflamatorios, distrofia muscular, osteoartritis, osteoporosis, dolor agudo y/o crónico, falla renal, isquemia retiniana, choque septicémico, envejecimiento de la piel que comprende un (i) inhibidor de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o un vector de acuerdo con la reivindicación 7, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

   Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 23 Figura 24