WO2010117055A1 - プロテインキナーゼCα又はη選択的阻害活性を有するポリペプチド - Google Patents

プロテインキナーゼCα又はη選択的阻害活性を有するポリペプチド Download PDF

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WO2010117055A1
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polypeptide
lys
arg
protein kinase
phe
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PCT/JP2010/056438
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佳樹 片山
貞勲 姜
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国立大学法人九州大学
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    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having protein kinase C ⁇ selective inhibitory activity, a protein kinase C ⁇ inhibitor containing the same, an agent for treating a symptom or disease that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ , And an anticancer agent.
  • the present invention further provides a polypeptide having protein kinase C ⁇ selective inhibitory activity, a protein kinase C ⁇ inhibitor containing the same as an active ingredient, and the treatment of symptoms or diseases that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ . It relates to the agent.
  • Protein kinase C has 11 subtypes, of which ⁇ is an enzyme that is specifically upregulated in cancer. Therefore, a substance that inhibits protein kinase C ⁇ is expected to be very useful as an anticancer agent or a reagent for cancer research, and its development has been desired.
  • Protein kinase C ⁇ is a very important factor in the development of cerebral infarction and glioma (glioma), and a substance that inhibits protein kinase C ⁇ is used as a therapeutic agent for cerebral infarction and glioma, or as a reagent for research. Its usefulness is expected to be extremely high (see Non-Patent Documents 3 and 4).
  • An object of the present invention is to provide an inhibitor capable of selectively inhibiting protein kinase C ⁇ .
  • the present invention further aims to provide an inhibitor capable of selectively inhibiting protein kinase C ⁇ .
  • the present inventors have found that a polypeptide having a specific amino acid sequence specifically inhibits protein kinase C ⁇ or protein kinase C ⁇ , and has completed the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
  • polypeptide (a) or (b) or a derivative thereof having protein kinase C ⁇ inhibitory activity (a) X1-X2-X3-Gln-Gly-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (Wherein X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 and X9 each represent an amino acid residue, X1 is located at the N-terminus, X9 is located at the C-terminus, X1 is Phe, Leu Or Arg, X2 is Lys or Arg, X3 is Lys or Arg, X4 is Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu , Lys, Arg or His, X5 is Phe, Leu, Met or Val, X6 is Ala, Lys or Arg, X7 is Lys, Phe or Arg
  • X1 is Phe
  • X2 is Lys
  • X3 is Lys
  • X5 is Phe
  • X6 is Ala
  • X7 is Lys
  • X8 is Lys
  • X9 is Lys
  • a protein kinase C ⁇ inhibitor comprising the polypeptide or derivative thereof according to any one of (1) to (3) or the nucleic acid according to (4) as an active ingredient.
  • An anticancer agent comprising the polypeptide or derivative thereof according to any one of (1) to (3) or the nucleic acid according to (4) as an active ingredient.
  • Y1 is Arg
  • Y2 is Asp
  • Y3 is Met
  • Y4 is Arg
  • Y5 is Asn
  • Y7 is Phe
  • Y8 is Asn
  • Y9 is Leu
  • a protein kinase C ⁇ inhibitor comprising the polypeptide or derivative thereof according to any one of (8) to (10) or the nucleic acid according to (11) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for cerebral infarction comprising the polypeptide or derivative thereof according to any one of (8) to (10) or the nucleic acid according to (11) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for glioma comprising the polypeptide or derivative thereof according to any one of (8) to (10) or the nucleic acid according to (11) as an active ingredient.
  • the present invention further includes the following aspects.
  • polypeptide or derivative thereof according to any one of (1) to (3) or the nucleic acid according to (4) for use in inhibiting protein kinase C ⁇ in vitro or in vivo.
  • polypeptide according to any one of (1) to (3) or a derivative thereof or the description (4) for use in treating a symptom or disease that can be improved by inhibiting the activity of sputum protein kinase C ⁇ Nucleic acids.
  • polypeptide or derivative thereof according to any one of (1) to (3) or (4) in the manufacture of a medicament for the treatment of a symptom or disease that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ ) Use of the nucleic acids described.
  • a cancer comprising a step of administering an effective amount of the polypeptide according to any one of (1) to (3) or a derivative thereof or the nucleic acid according to (4) to a subject in need of treatment for vaginal cancer. Treatment methods.
  • polypeptide or derivative thereof according to any one of (8) to (10) or (11) in the manufacture of a medicament for the treatment of a symptom or disease that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ ) Use of the nucleic acids described.
  • (35) comprising administering an effective amount of the polypeptide according to any one of (8) to (10) or a derivative thereof or the nucleic acid according to (11) to a subject in need of treatment for camphor infarction, How to treat cerebral infarction.
  • (38) including a step of administering an effective amount of the polypeptide according to any one of (8) to (10) or a derivative thereof or the nucleic acid according to (11) to a subject in need of treatment for sputum glioma How to treat glioma.
  • polypeptide of the present invention is useful as an inhibitor that selectively inhibits protein kinase C ⁇ or protein kinase C ⁇ .
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of FKKQGAFAKKK on the phosphorylation of the substrate polypeptide FKKQGSFAKKK by PKC ⁇ .
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of FKKQGAFAKKK on the phosphorylation of the substrate polypeptide LRVQNSLRRR by PKC ⁇ .
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of RDMRNAFNLGV on the phosphorylation of the substrate polypeptide RDMRNSFNLGV by PKC ⁇ .
  • Embodiment 1 Protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide and use thereof
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is an amino acid sequence represented by X1-X2-X3-Gln-Gly-X4-X5-X6-X7-X8-X9 Consists of.
  • X1 is Phe, Leu or Arg
  • X2 is Lys or Arg
  • X3 is Lys or Arg
  • X4 is Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met , Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg or His
  • X5 is Phe, Leu, Met or Val
  • X6 is Ala, Lys or Arg
  • X7 is Lys
  • X8 Is Lys or Arg
  • X9 is Lys, Arg or Ala
  • X1 is preferably Phe.
  • X2 is preferably Lys.
  • X3 is preferably Lys.
  • X4 is preferably Ala.
  • X5 is preferably Phe.
  • X6 is preferably Ala.
  • X7 is preferably Lys.
  • X8 is preferably Lys.
  • X9 is preferably Ly
  • a particularly preferred protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence represented by Phe-Lys-Lys-Gln-Gly-X4-Phe-Ala-Lys-Lys-Lys, and among them, X4 is Ala.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is preferred.
  • Example 1 Phe (X1) -Lys (X2) -Lys (X3) -Gln-Gly-Ala (X4) -Phe (X5) -Ala (X6) -Lys (X7) -Lys represented by SEQ ID NO: 1 (X8) -Lys (X9) has been confirmed to be a selective inhibitor for protein kinase C ⁇ .
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 1 has a structure in which the amino acid Ser at the phosphorylation site in the protein kinase C ⁇ substrate polypeptide described in Patent Document 1 (shown in SEQ ID NO: 2) is substituted with Ala.
  • this peptide is useful as an inhibitor specific for protein kinase C ⁇ .
  • One of the reasons why the polypeptide has a protein kinase C ⁇ -specific inhibitory activity is considered to be because Ala has a structure that is not phosphorylated unlike Ser.
  • Ala which is the amino acid at the site of X4 is Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, other amino acid residues that are not phosphorylated.
  • Lys, Arg or His it is presumed that the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is exhibited. It is presumed that the same effect as that of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is exhibited even when the hydrophobic amino acid Phe is substituted with another hydrophobic amino acid Leu or strong binding Arg at the X1 site. .
  • the sites X2, X3, and X8 are presumed to have the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 1 even when Lys, which is a cationic amino acid, is substituted with Arg, which is another cationic amino acid.
  • the site of X5 is considered to be a position that greatly affects enzyme binding and inhibitory effect.
  • the site of X5 is presumed to have the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 1 even when Phe, which is a hydrophobic amino acid, is substituted with Leu, Met or Val, which is another hydrophobic amino acid.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence described above (preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1), and is a protein.
  • Polypeptides having kinase C ⁇ inhibitory activity are also suitable.
  • “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention may be in the form of a salt, if necessary, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include salts of inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention may be in a form that is chemically modified as necessary. Such derivatives are also included in the scope of the present invention.
  • chemical modification modification with a neutral polymer or a membrane-permeable substance can be considered. Since the neutral polymer has no charge, the polypeptide inhibitor of the present invention can be stabilized.
  • the method for modifying a membrane permeable substance include myristoylation and a method for modifying a membrane permeable peptide.
  • the membrane-permeable peptide can be a natural membrane-permeable peptide, an artificially synthesized membrane-permeable peptide, or a phage permeable cell-permeable peptide (reference: Joliot A, and Prochiantz) A. 2004. “Transduction peptides:“ from ”technology“ to ”physiology.“ Nature ”Cell“ Biol ”6: 189-196).
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention can be produced by a known polypeptide synthesis method, for example, a method using a fully automatic peptide synthesizer.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is useful as an active ingredient of a selective inhibitor for protein kinase C ⁇ .
  • Protein kinase C ⁇ has a function of phosphorylating a substrate.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is characterized in that it acts selectively on protein kinase C ⁇ , binds directly to protein kinase C ⁇ and inhibits enzyme activity over a long period of time, and has no toxicity. Have.
  • the origin of the protein kinase C ⁇ to be inhibited is not particularly limited, but is preferably human.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitor of the present invention is useful for uses such as reagents for studying diseases such as cancer.
  • the polypeptide of the present invention may be formulated together with various additives such as excipients and carriers that are acceptable in the use of reagents.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is useful as an active ingredient of a symptom or disease therapeutic agent that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ .
  • a symptom or disease therapeutic agent that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ .
  • Specific examples of symptoms or diseases that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ include cancer, inflammation, immune system diseases, and the like. Cancer is particularly preferred, but is not limited thereto. Examples of cancer include, but are not limited to, skin cancer, breast cancer, liver cancer, and colon cancer.
  • the therapeutic agent or anticancer agent of the present invention can be used for the purpose of treating symptoms or diseases (particularly cancer) in mammals such as humans.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention has the feature that it has few side effects as an anticancer agent, the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is combined with other anticancer agents that may cause side effects. If used, side effects can be minimized while maintaining the therapeutic effect of cancer.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention Since the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention has a positive charge, it can be combined with a negatively charged gene (nucleic acid such as DNA or RNA). Therefore, a gene effective for cancer treatment and the polypeptide of the present invention can be combined and introduced into cells. Examples of genes effective for treatment include IL-2, IL-12, HSV-tk (HepesHesimplex virus thymidine kinase), Bcl-2, and granzymes.
  • genes effective for treatment include IL-2, IL-12, HSV-tk (HepesHesimplex virus thymidine kinase), Bcl-2, and granzymes.
  • the above-mentioned symptom or disease therapeutic agent or anticancer agent containing the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention can be prepared into a dosage form suitable for the administration form.
  • the mode of administration is not particularly limited, and may be any of oral administration and parenteral administration (vascular administration, intradermal administration, application, infusion, intramedication, etc.).
  • Preparation into a pharmaceutical form can be carried out according to a conventional method, and carriers and excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrating agents, lubricants, corrigents, diluents that can be used at that time, It can be suitably selected from various commonly used ones.
  • the form is not particularly limited and is appropriately selected as necessary.
  • tablets, capsules, granules, fine granules, powders, pills, solutions, syrups, suspensions, emulsions, elixirs are used.
  • Oral preparations such as injections, infusions, suppositories, inhalants, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, nasal preparations, enteral preparations, patches, ointments, etc.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the above-mentioned protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide.
  • the nucleic acid include DNA or RNA, and DNA is preferable.
  • nucleic acid of the present invention When the nucleic acid of the present invention is administered in vivo, a polypeptide is expressed from the nucleic acid in vivo, and the expressed polypeptide exerts a selective inhibitory action on protein kinase C ⁇ . Therefore, the nucleic acid of the present invention itself is also useful as a protein kinase C ⁇ inhibitor, a symptom or disease therapeutic agent that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ , or an active ingredient of an anticancer agent.
  • a method of administering a vector incorporating the nucleic acid can be mentioned.
  • the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, and the like, and can be efficiently administered by using these virus vectors.
  • a method of introducing the nucleic acid of the present invention into a phospholipid vesicle such as a liposome and administering the liposome may be employed.
  • nucleic acid of the present invention As a route of administration of the nucleic acid of the present invention, local administration can be performed to immune system tissues (bone marrow, lymph nodes, etc.) in addition to systemic administration such as normal intravenous and intraarterial administration. Furthermore, administration routes combined with catheter techniques, surgical operations, and the like can also be employed.
  • Protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide and use thereof The protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is an amino acid sequence represented by Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11 Consists of.
  • Y1 is Arg or Lys
  • Y2 is Asp, Arg, Lys or Ala
  • Y3 is Met
  • Y4 is Arg or Lys
  • Y5 is Gly, Ala, Val, Leu , Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg or His
  • Y6 is Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met , Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg or His
  • Y7 is Phe, Leu, Met or Val
  • Y8 is Asn, Lys or Arg
  • Y1 is preferably Arg. Asp is preferably Y2. Y3 is preferably Met. Y4 is preferably Arg. Asn is preferable as Y5. Y6 is preferably Ala. Y7 is preferably Phe. Asn is preferable as Y8. Y9 is preferably Leu. Y10 is preferably Gly. Y11 is preferably Val.
  • a particularly preferred protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide includes a polypeptide having an amino acid sequence represented by Arg-Asp-Met-Arg-Asn-Y6-Phe-Asn-Leu-Gly-Val, and among them, Y6 is Ala.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is
  • Example 2 Arg (Y1) -Asp (Y2) -Met (Y3) -Arg (Y4) -Asn (Y5) -Ala (Y6) -Phe (Y7) -Asn (Y8)- It has been confirmed that Leu (Y9) -Gly (Y10) -Val (Y11) is a selective inhibitor for protein kinase C ⁇ .
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 4 has a structure in which the amino acid Ser at the phosphorylation site in the protein kinase C ⁇ substrate polypeptide described in Patent Document 1 (shown in SEQ ID NO: 5) is substituted with Ala.
  • the inventors have surprisingly found that this peptide is useful as an inhibitor specific for protein kinase C ⁇ .
  • One of the causes that the polypeptide has a protein kinase C ⁇ specific inhibitory activity is considered to be because Ala has a structure that is not phosphorylated unlike Ser.
  • Ala which is the amino acid at the site of Y6
  • Ala is Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, other amino acid residues that are not phosphorylated.
  • Lys, Arg, or His it is presumed that the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is exhibited.
  • the site Y1 is presumed to have the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 4 even when Arg, which is a cationic amino acid, is substituted with Lys, which is another cationic amino acid.
  • the Y2 site is presumed to have a very high binding ability when Asp is substituted with Arg, Lys, or Ala.
  • the binding of Y3 is also expected to increase when Met is substituted with Arg or Lys. It is presumed that the same effect is exhibited at the Y4 site even when Arg, which is a cationic amino acid, is substituted with Lys, which is another cationic amino acid.
  • the same binding force can be obtained by replacing Asn with Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, or His at Y5. It is predicted that the same effect as the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is produced.
  • the same binding force can be obtained by replacing Gly with Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Cys, Met, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, or His at the Y10 site. is expected.
  • the site of Y11 is presumed to have very high binding properties when Val is substituted with Ala, Arg or Lys.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added, inserted or substituted in the amino acid sequence described above (preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4).
  • Polypeptides having kinase C ⁇ inhibitory activity are also suitable.
  • “1 or more” is usually “1 to 5”, more typically “1 to 3”, and most preferably “1 to 2”.
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention may be in the form of a salt, if necessary, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include salts of inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, be
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention may be in a form that is chemically modified as necessary. Such derivatives are also included in the scope of the present invention.
  • chemical modification modification with a neutral polymer or a membrane-permeable substance can be considered. Since the neutral polymer has no charge, the polypeptide inhibitor of the present invention can be stabilized.
  • the method for modifying a membrane permeable substance include myristoylation and a method for modifying a membrane permeable peptide.
  • the membrane-permeable peptide can be a natural membrane-permeable peptide, an artificially synthesized membrane-permeable peptide, or a phage permeable cell-permeable peptide (reference: Joliot A, and Prochiantz) A. 2004. “Transduction peptides:“ from ”technology“ to ”physiology.“ Nature ”Cell“ Biol ”6: 189-196).
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention can be produced by a known polypeptide synthesis method, for example, a method using a fully automatic peptide synthesizer.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is useful as an active ingredient of a selective inhibitor for protein kinase C ⁇ .
  • Protein kinase C ⁇ has a function of phosphorylating a substrate.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is characterized in that it acts selectively on protein kinase C ⁇ , binds directly to protein kinase C ⁇ and inhibits enzyme activity over a long period of time, and has no toxicity. Have.
  • the origin of the protein kinase C ⁇ to be inhibited is not particularly limited, but is preferably human.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitor of the present invention is useful for use as a reagent for studying diseases such as cerebral infarction and glioma (glioma).
  • glioma glioma
  • the polypeptide of the present invention may be formulated together with various additives such as excipients and carriers that are acceptable in the use of reagents.
  • the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention is useful as an active ingredient of a symptom or disease therapeutic agent that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ .
  • a symptom or disease therapeutic agent that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ .
  • Specific examples of symptoms or diseases that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ include, but are not limited to, cerebral infarction and glioma (glioma).
  • the therapeutic agent of the present invention can be used for the purpose of treating symptoms or diseases in mammals such as humans.
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention has the feature that it has few side effects when used as a pharmaceutical, the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention has a risk of side effects on the target symptom or disease. When used in combination with other drugs, side effects can be minimized while retaining the therapeutic effect.
  • the protein kinase C ⁇ -inhibiting polypeptide of the present invention has a positive charge, it can bind to a gene (nucleic acid such as DNA or RNA) having a negative charge. Therefore, a gene effective for treatment of a target symptom or disease and the polypeptide of the present invention can be combined and introduced into cells.
  • the therapeutic agent for the above symptoms or diseases containing the protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide of the present invention can be prepared into a dosage form suitable for the administration form.
  • the mode of administration is not particularly limited, and may be any of oral administration and parenteral administration (vascular administration, intradermal administration, application, infusion, intramedication, etc.).
  • Preparation into a pharmaceutical form can be carried out according to a conventional method, and carriers and excipients, binders, preservatives, oxidation stabilizers, disintegrating agents, lubricants, corrigents, diluents that can be used at that time, It can be suitably selected from various commonly used ones.
  • the form is not particularly limited and is appropriately selected as necessary.
  • tablets, capsules, granules, fine granules, powders, pills, solutions, syrups, suspensions, emulsions, elixirs are used.
  • Oral preparations such as injections, infusions, suppositories, inhalants, transdermal absorbents, transmucosal absorbents, nasal preparations, enteral preparations, patches, ointments, etc.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the above protein kinase C ⁇ inhibitory polypeptide.
  • the nucleic acid include DNA or RNA, and DNA is preferable.
  • nucleic acid of the present invention When the nucleic acid of the present invention is administered in vivo, a polypeptide is expressed from the nucleic acid in vivo, and the expressed polypeptide exerts a selective inhibitory action on protein kinase C ⁇ . Therefore, the nucleic acid of the present invention itself is also useful as an active ingredient of a protein kinase C ⁇ inhibitor or a therapeutic agent for a symptom or disease that can be improved by inhibiting the activity of protein kinase C ⁇ .
  • a method of administering a vector incorporating the nucleic acid can be mentioned.
  • the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, and the like, and can be efficiently administered by using these virus vectors.
  • a method of introducing the nucleic acid of the present invention into a phospholipid vesicle such as a liposome and administering the liposome may be employed.
  • nucleic acid of the present invention As a route of administration of the nucleic acid of the present invention, local administration can be performed to immune system tissues (bone marrow, lymph nodes, etc.) in addition to systemic administration such as normal intravenous and intraarterial administration. Furthermore, administration routes combined with catheter techniques, surgical operations, and the like can also be employed.
  • the protein kinase C ⁇ (PKC kinase) inhibitory polypeptide FKKQGAFAKKK (SEQ ID NO: 1) was synthesized using an automatic peptide synthesizer by the standard Fmoc method.
  • the synthesized polypeptide was purified using a high performance liquid chromatography system. At this time, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution was used as eluent A, and 0.1% TFA acetonitrile solution was used as eluent B, and elution was performed with an AB linear gradient at a flow rate of 8 ml / min. The gradient is 10/90 to 30/70 acetonitrile / water over 30 minutes.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the target polypeptide was confirmed by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF / MS).
  • ⁇ -Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix (10 mg / ml) was prepared in 50% brine / acetonitrile and 0.1% TFA. The matrix and sample were mixed in a 1: 1 ratio. A total volume of 1 ⁇ l of each mixture was applied to the sample plate and allowed to dry before measurements were taken.
  • CHCA matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • Phosphorylation inhibition experiment with inhibitory polypeptide FKKQGAFAKKK
  • the phosphorylation reaction was performed using 25 ⁇ M polypeptide, 0.1-1.0 ⁇ g / ml PKC enzyme ( ⁇ , ⁇ , and ⁇ ), and PKC ⁇ inhibitory polypeptide (0, 50 ⁇ l buffer containing 25, 50, 75, and 100 ⁇ M) [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 0.5 mM CaCl 2 , 100 ⁇ M ATP, 2.0 ⁇ g / ml diacylglycerol ( DAG) and 2.5 ⁇ g / ml phosphatidylserine (PS)].
  • DAG diacylglycerol
  • PS 2.5 ⁇ g / ml phosphatidylserine
  • the relative intensity (%) of phosphorylated polypeptide was calculated by the following formula: (Intensity of phosphorylated polypeptide) / ⁇ (Intensity of phosphorylated polypeptide) + (Polyphosphorylated polypeptide) Peptide strength) ⁇ x 100.
  • Phosphorylation inhibition rate by inhibitory polypeptide is 100% of control sample (sample without added PKC ⁇ inhibitory polypeptide), and each PKC ⁇ inhibitory polypeptide concentration (25, 50, 75, and 100 ⁇ M) After the addition, the percentage decreased was shown as the phosphorylation inhibition rate.
  • LRVQNSLRRR (SEQ ID NO: 3) polypeptide is a polypeptide that is phosphorylated by most PKC isozymes (Patent Document 1).
  • the results of the phosphorylation inhibition rate of the LRVQNSLRRR (SEQ ID NO: 3) polypeptide by the inhibitory polypeptide FKKQGAFAKKK (SEQ ID NO: 1) are shown in FIG. Addition of 50 and 75 ⁇ M inhibitory polypeptide inhibited PKC ⁇ phosphorylation by approximately 30%. In addition, an inhibitory effect of 60% or more was obtained at a concentration of 100 ⁇ M. On the other hand, it showed only an inhibitory effect of 20% or less against PKC isozymes other than PKC ⁇ .
  • Peptide Protein kinase C ⁇ (PKC ⁇ ) inhibitory peptide RDMRNAFNLGV SEQ ID NO: 4
  • PLC ⁇ Peptide Protein kinase C ⁇
  • RDMRNAFNLGV RDMRNAFNLGV
  • the target peptide was confirmed by matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF / MS).
  • MALDI-TOF / MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • ⁇ -Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix (10 mg / ml) was prepared in 50% brine / acetonitrile and 0.1% TFA. The matrix and sample were mixed in a 1: 1 ratio. A total volume of 1 ⁇ l of each mixture was applied to the sample plate and allowed to dry before measurements were taken.
  • CHCA matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • Phosphorylation inhibition experiment with inhibitory peptide contains 25 ⁇ M polypeptide, 10 ⁇ g / ml PKC ⁇ enzyme, and PKC ⁇ inhibitory peptide (0, 25, 50, 75, and 100 ⁇ M)
  • 50 ⁇ l buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 100 ⁇ M ATP, 2.0 ⁇ g / ml diacylglycerol (DAG) and 2.5 ⁇ g / ml phosphatidylserine (PS)] went.
  • the peptide sequence used for the phosphorylation reaction is RDMRNSFNLGV (SEQ ID NO: 5) (Patent Document 1).
  • the sample was incubated at 37 ° C. for 60 minutes and then analyzed by MALDI-TOF / MS.
  • the relative intensity (%) of the phosphorylated peptide was calculated by the following formula: (Intensity of phosphorylated peptide) / ⁇ (Intensity of phosphorylated peptide) + (Intensity of non-phosphorylated peptide) ⁇ x 100.
  • Phosphorylation inhibition rate by inhibitory peptide is 100% of control sample (sample without added PKC ⁇ inhibitory peptide), and each PKC ⁇ inhibitory peptide concentration (0, 25, 50, 75, and 100 ⁇ M) is added After that, the decreased percentage was shown as the phosphorylation inhibition rate.
  • RDMRNAFNLGV (SEQ ID NO: 5) is a peptide that is specifically phosphorylated by PKC ⁇ .
  • the results of the phosphorylation inhibition rate of the RDMRNSFNLGV (SEQ ID NO: 5) peptide by the inhibitory peptide (RDMRNAFNLGV (SEQ ID NO: 4)) are shown in FIG. Addition of 75 ⁇ M inhibitory peptide inhibited PKC ⁇ phosphorylation by more than 50%.
  • the peptide of the present invention (RDMRNAFNLGV (SEQ ID NO: 4) was confirmed to have an inhibitory ability against PKC ⁇ .

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Abstract

　本発明はプロテインキナーゼCα又はηを選択的に阻害し得る阻害剤を提供することを目的とする。　Phe-Lys-Lys-Gln-Gly-X4-Phe-Ala-Lys-Lys-Lysで表されるポリペプチドはプロテインキナーゼCα選択的阻害活性を有し、Arg-Asp-Met-Arg-Asn-Y6-Phe-Asn-Leu-Gly-Valで表されるポリペプチドはプロテインキナーゼCη選択的阻害活性を有する。ここで、X4及びY6はそれぞれGly、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Trp、 Cys、 Met、 Asn、 Gln、 Asp、 Glu、 Lys、 Arg又はHisである。

Description

プロテインキナーゼCα又はη選択的阻害活性を有するポリペプチド
　本発明は、プロテインキナーゼCα選択的阻害活性を有するポリペプチド、並びにそれを有効成分として含有するプロテインキナーゼCα阻害剤、プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤、並びに抗ガン剤に関する。
　本発明は更に、プロテインキナーゼCη選択的阻害活性を有するポリペプチド、並びにそれを有効成分として含有するプロテインキナーゼCη阻害剤、並びにプロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤に関する。
　プロテインキナーゼCには11種のサブタイプが存在し、そのうちαはガンで特異的に異常亢進している酵素である。従って、プロテインキナーゼCαを阻害する物質は抗ガン剤として、或いはガン研究用の試薬として非常に有用であると期待され、その開発が望まれてきた。
　プロテインキナーゼCηは脳梗塞および神経膠腫(グリオマ)の発症に非常に重要な因子であり、プロテインキナーゼCηを阻害する物質は脳梗塞および神経膠腫の治療剤として、或いは研究用の試薬として、その有用性は極めて高いと期待される（非特許文献３及び４参照）。
　本発明に関連する先行技術文献としては以下の文献が挙げられる。
特開2007-236388号公報
O’Brian CA, Bornmann, WG, and Maxwell, DS. 2006. Protein kinase Cα and ε small-molecule targeted therapeutics: a new roadmap to two holy grails in drug discovery? Expert Rev Anticancer Ther 6:175-186. Hofmann, J. 2004. Protein kinase C isozymes as potential targets for anticancer therapy. Curr Cancer Drug Targets 4:125-146. Kubo et al., A nonsynonymous SNP in PRKCH (protein kinase C η) increases the risk of cerebral infarction. Nat. Genetics, 39:212-217 (2007). Martin and Hussaini, PKCηas a therapeutic target in glioblastoma multiforme, Expert. Opin. Ther. Targets 9:299-313 (2005).
　しかしながらプロテインキナーゼCαに対する阻害ポリペプチドは従来存在しない。プロテインキナーゼCαはプロテインキナーゼCβと非常に基質特異性が似ていることから、これまでプロテインキナーゼCα特異的なポリペプチド性リガンドは設計不可能であると考えられてきた。
　本発明はプロテインキナーゼCαを選択的に阻害し得る阻害剤を提供することを目的とする。
　また、プロテインキナーゼCηに対する阻害ポリペプチドとして満足できる活性を有するものも提供されていない。
　そこで本発明は更に、プロテインキナーゼCηを選択的に阻害し得る阻害剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドがプロテインキナーゼCα又はプロテインキナーゼCηを特異的に阻害することを見出し、本願発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の(a)若しくは(b)のポリペプチド又はプロテインキナーゼCα阻害活性を有するその誘導体：
(a) X1-X2-X3-Gln-Gly-X4-X5-X6-X7-X8-X9
（式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及びX9はそれぞれアミノ酸残基を示し、X1はN末端に位置し、X9はC末端に位置し、X1はPhe、Leu又はArgであり、X2はLys又はArgであり、X3はLys又はArgであり、X4はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、X5はPhe、Leu、Met又はValであり、X6はAla、Lys又はArgであり、X7はLys、Phe又はArgであり、X8はLys又はArgであり、X9はLys、Arg又はAlaである）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCα阻害活性を有するポリペプチド。
(2) X1がPheであり、X2がLysであり、X3がLysであり、X5がPheであり、X6がAlaであり、X7がLysであり、X8がLysであり、X9がLysであることを特徴とする(1)記載のポリペプチド又はその誘導体。
(3) X4がAlaである(1)又は(2)記載のポリペプチド又はその誘導体。
(4) (1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
(5) (1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸を有効成分として含有するプロテインキナーゼCα阻害剤。
(6) (1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸を有効成分として含有する、プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤。
(7) (1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸を有効成分として含有する抗ガン剤。
(8) 以下の(c)又は(d)のポリペプチド又はプロテインキナーゼCη阻害活性を有するその誘導体：
(c) Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11
（式中、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10及びY11はそれぞれアミノ酸残基を示し、Y1はN末端に位置し、Y11はC末端に位置し、Y1はArg又はLysであり、Y2はAsp、Arg、Lys又はAlaであり、Y3はMet、Arg又はLysであり、Y4はArg又はLysであり、Y5はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y6はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y7はPhe、Leu、Met又はValであり、Y8はAsn、Lys又はArgであり、Y9はLeu、Phe、Arg又はLysであり、Y10はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y11はVal、Lys、Arg又はAlaである）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(d) 上記(c)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCη阻害活性を有するポリペプチド。
(9) Y1がArgであり、Y2がAspであり、Y3がMetであり、Y4がArgであり、Y5がAsnであり、Y7がPheであり、Y8がAsnであり、Y9がLeuであり、Y10がGlyであり、Y11がValであることを特徴とする(8)記載のポリペプチド又はその誘導体。
(10) Y6がAlaである(8)又は(9)記載のポリペプチド又はその誘導体。
(11) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
(12) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を有効成分として含有するプロテインキナーゼCη阻害剤。
(13) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を有効成分として含有する、プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤。
(14) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を有効成分として含有する、脳梗塞の治療剤。
(15) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を有効成分として含有する、神経膠腫の治療剤。
　本発明は更に以下の態様を包含する。
(16) (1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体をプロテインキナーゼCαに in vitro または in vivoにおいて接触させる工程を含む、プロテインキナーゼCαをin vitro または in vivoにおいて阻害する方法。
(17) (4)記載の核酸から(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチドを発現させる工程と、該ポリペプチドをプロテインキナーゼCαに in vitro または in vivoにおいて接触させる工程とを含む、プロテインキナーゼCαをin vitro または in vivoにおいて阻害する方法。
(18) プロテインキナーゼCαをin vitro または in vivoにおいて阻害する用途のための、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸。
(19) プロテインキナーゼCα阻害剤の製造における、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸の使用。
(20) 医薬としての用途のための、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸。
(21) プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療を必要とする対象に、有効量の、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸を投与する工程を含む、前記症状又は疾患の治療方法。
(22) プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患を治療する用途のための、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸。
(23) プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療のための医薬の製造における、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸の使用。
(24) ガンの治療を必要とする対象に、有効量の、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸を投与する工程を含む、ガンの治療方法。
(25) ガンを治療する用途のための、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸。
(26) ガンの治療のための医薬の製造における、(1)～(3)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(4)記載の核酸の使用。
(27) (8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体をプロテインキナーゼCηに in vitro または in vivoにおいて接触させる工程を含む、プロテインキナーゼCηをin vitro または in vivoにおいて阻害する方法。
(28) (11)記載の核酸から(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチドを発現させる工程と、該ポリペプチドをプロテインキナーゼCηに in vitro または in vivoにおいて接触させる工程とを含む、プロテインキナーゼCηをin vitro または in vivoにおいて阻害する方法。
(29) プロテインキナーゼCηをin vitro または in vivoにおいて阻害する用途のための、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸。
(30) プロテインキナーゼCη阻害剤の製造における、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸の使用。
(31) 医薬としての用途のための、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸。
(32) プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療を必要とする対象に、有効量の、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を投与する工程を含む、前記症状又は疾患の治療方法。
(33) プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患を治療する用途のための、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸。
(34) プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療のための医薬の製造における、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸の使用。
(35) 脳梗塞の治療を必要とする対象に、有効量の、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を投与する工程を含む、脳梗塞の治療方法。
(36) 脳梗塞を治療する用途のための、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸。
(37) 脳梗塞の治療のための医薬の製造における、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸の使用。
(38) 神経膠腫の治療を必要とする対象に、有効量の、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸を投与する工程を含む、神経膠腫の治療方法。
(39) 神経膠腫を治療する用途のための、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸。
(40) 神経膠腫の治療のための医薬の製造における、(8)～(10)のいずれかに記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は(11)記載の核酸の使用。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-096125号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明のポリペプチドはプロテインキナーゼCα又はプロテインキナーゼCηを選択的に阻害する阻害剤として有用である。
図１はPKCαによる基質ポリペプチドFKKQGSFAKKKのリン酸化に対する、FKKQGAFAKKKによる阻害効果を示す図である。 図２はPKCαによる基質ポリペプチドLRVQNSLRRRのリン酸化に対する、FKKQGAFAKKKによる阻害効果を示す図である。 図３はPKCηによる基質ポリペプチドRDMRNSFNLGVのリン酸化に対する、RDMRNAFNLGVによる阻害効果を示す図である。
実施形態1. プロテインキナーゼCα阻害ポリペプチド及びその用途
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドはX1-X2-X3-Gln-Gly-X4-X5-X6-X7-X8-X9で表されるアミノ酸配列から成る。式中、X1はPhe、Leu又はArgであり、X2はLys又はArgであり、X3はLys又はArgであり、X4はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、X5はPhe、Leu、Met又はValであり、X6はAla、Lys又はArgであり、X7はLys、Phe又はArgであり、X8はLys又はArgであり、X9はLys、Arg又はAlaである。X1としてはPheが好ましい。X2としてはLysが好ましい。X3としてはLysが好ましい。X4としてはAlaが好ましい。X5としてはPheが好ましい。X6としてはAlaが好ましい。X7としてはLysが好ましい。X8としてはLysが好ましい。X9としてはLysが好ましい。
　特に好ましいプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドとしては、Phe-Lys-Lys-Gln-Gly-X4-Phe-Ala-Lys-Lys-Lysで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、中でもX4がAlaである配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
　実施例１において、配列番号１で示すPhe(X1)-Lys(X2)-Lys(X3)-Gln-Gly-Ala(X4)-Phe(X5)-Ala(X6)-Lys(X7)-Lys(X8)-Lys(X9)がプロテインキナーゼCαに対する選択的阻害剤であることが確認されている。配列番号１のポリペプチドは、特許文献１記載のプロテインキナーゼCα基質ポリペプチド（配列番号２に示す）におけるリン酸化部位のアミノ酸SerがAlaに置換された構造を有する。本発明者らは驚くべきことに、このペプチドがプロテインキナーゼCαに特異的な阻害剤として有用であることを見出した。当該ポリペプチドがプロテインキナーゼCα特異的阻害活性を有する原因の一つは、AlaがSerと異なりリン酸化を受けない構造を有するためであると考えられる。
　そこで、X4の部位のアミノ酸であるAlaは、リン酸化を受けない他のアミノ酸残基であるGly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisに置換された場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X1の部位は疎水性アミノ酸であるPheを、他の疎水性アミノ酸であるLeu、または結合性が強いArgに置換した場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X2、X3、およびX8の部位は、カチオン性アミノ酸であるLysを他のカチオン性アミノ酸であるArgに置換した場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X5の部位は、酵素結合と阻害効果に大きな影響を及ぼす位置と考えられる。X5の部位は、疎水性アミノ酸であるPheを他の疎水性アミノ酸であるLeu、MetまたはValに置換した場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X6の部位は、Alaを、結合性が強いカチオン性アミノ酸残基であるArgまたはLysに置換しても、配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X7の部位は、カチオン性アミノ酸であるLysを他のカチオン性アミノ酸であるArgに置換した場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定され、更に、Pheに置換した場合には結合性が高くなり配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。X9の部位には、カチオン性アミノ酸であるLysを、他のカチオン性アミノ酸であるArgに置換した場合でも配列番号１のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定され、更に、Alaに置換した場合には結合性が非常に高くなると推定される。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドとしては、上記で説明したアミノ酸配列（好ましくは配列番号１のアミノ酸配列）において1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCα阻害活性を有するポリペプチドも好適である。ここで「1以上」とは通常は「1～5個」であり、より典型的には「1～3個」であり、最も好ましくは「1～2個」である。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは必要に応じて化学修飾された形態であってもよい。本発明の範囲にはこのような誘導体も含まれる。化学修飾としては中性のポリマーまたは膜透過性物質による修飾が考えられる。中性のポリマーはチャージを有していないことから、本発明のポリペプチド阻害剤を安定化することができる。膜透過性物質の修飾法としては、ミリストイル化（N-myristoylation）と膜透過性ペプチドの修飾法が挙げられる。膜透過性ペプチドは天然の膜透過性ペプチド、人工合成の膜透過性ペプチド、およびファージティスプレイ由来の膜透過性ペプチド（phage display cell-permeable peptide）が使用できる（参考文献：Joliot A, and Prochiantz A.　2004. Transduction peptides: from technology to physiology. Nature Cell Biol 6:189-196）。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは公知のポリペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置を用いた方法により製造することができる。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCαに対する選択的阻害剤の有効成分として有用である。プロテインキナーゼCαは基質をリン酸化する機能を有する。本発明のポリペプチドがプロテインキナーゼCαと結合するとプロテインキナーゼCαはリン酸化基質をリン酸化することができず、活性が阻害される。本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCα選択的に作用するという点、プロテインキナーゼCαと直接結合して長期間にわたり酵素活性を阻害するという点、並びに毒性がないという点において特長を有する。阻害されるプロテインキナーゼCαの起源は特に限定されないがヒトであることが好ましい。本発明のプロテインキナーゼCα阻害剤は、ガン等の疾患研究用の試薬などの用途に有用である。本発明のポリペプチドをプロテインキナーゼCα阻害剤として使用する場合、試薬の用途において許容される賦形剤、担体等の各種添加剤とともに製剤化されてもよい。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤の有効成分として有用である。プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患としては、具体的にはガン、炎症、免疫系疾患などが挙げられ、特にガンが好ましいがこれらには限定されない。ガンとしては、皮膚ガン、乳ガン、肝ガン、大腸ガンなどが挙げられるがこれらには限定されない。本発明の治療剤又は抗ガン剤は、ヒト等の哺乳動物における症状又は疾患（特にガン）の治療の目的で使用され得る。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドは抗ガン剤として副作用が少ないという特長を有していることから、本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドを、副作用の恐れのある他の抗ガン剤と組み合わせて使用すると、ガンの治療効果を保持しながら副作用を最小化することができる。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドはプラスチャージを有しているので、マイナスチャージを有する遺伝子（DNA、RNA等の核酸）と結合することができる。そのため、ガン治療に有効な遺伝子と本発明のポリペプチドとを組み合わせて細胞に導入することもできる。治療に有効な遺伝子としてはIL-2、IL-12、HSV-tk（Hepes simplex virus thymidine kinase）、Bcl-2、granzymes等が挙げられる。
　本発明のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドを含有する上記症状又は疾患の治療剤、或いは抗ガン剤は、投与形態に適した製剤形態へ調製され得る。投与形態は特に限定されず経口投与、非経口投与（血管投与、皮内投与、塗布、点滴、服内投与など）のいずれであってもよい。製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
　本発明はまた、上記のプロテインキナーゼCα阻害ポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸としてはDNA又はRNAが挙げられ、DNAが好ましい。
　本発明の核酸を生体内に投与すると、生体内において核酸からポリペプチドが発現され、発現されたポリペプチドがプロテインキナーゼCαに対する選択的阻害作用を発揮する。従って、本発明の核酸それ自体もまた、プロテインキナーゼCα阻害剤、プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤、或いは抗ガン剤の有効成分として有用である。
　本発明の核酸を生体に投与する場合は、該核酸を注射により直接投与する方法のほか、該核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の核酸をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。本発明の核酸の投与経路としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与経路を採用することもできる。
実施形態2. プロテインキナーゼCη阻害ポリペプチド及びその用途
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドはY1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11で表されるアミノ酸配列から成る。式中、Y1はArg又はLysであり、Y2はAsp、Arg、Lys又はAlaであり、Y3はMet、Arg又はLysであり、Y4はArg又はLysであり、Y5はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y6はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y7はPhe、Leu、Met又はValであり、Y8はAsn、Lys又はArgであり、Y9はLeu、Phe、Arg又はLysであり、Y10はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y11はVal、Lys、Arg又はAlaである。Y1としてはArgが好ましい。Y2としてはAspが好ましい。Y3としてはMetが好ましい。Y4としてはArgが好ましい。Y5としてはAsnが好ましい。Y6としてはAlaが好ましい。Y7としてはPheが好ましい。Y8としてはAsnが好ましい。Y9としてはLeuが好ましい。Y10としてはGlyが好ましい。Y11としてはValが好ましい。
　特に好ましいプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドとしては、Arg-Asp-Met-Arg-Asn-Y6-Phe-Asn-Leu-Gly-Valで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、中でもY6がAlaである配列表の配列番号4に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
　実施例2において、配列番号4で示すArg(Y1)-Asp(Y2)-Met(Y3)-Arg(Y4)-Asn(Y5)-Ala(Y6)-Phe(Y7)-Asn(Y8)-Leu(Y9)-Gly(Y10)-Val(Y11)がプロテインキナーゼCηに対する選択的阻害剤であることが確認されている。配列番号4のポリペプチドは、特許文献１記載のプロテインキナーゼCη基質ポリペプチド（配列番号5に示す）におけるリン酸化部位のアミノ酸SerがAlaに置換された構造を有する。本発明者らは驚くべきことに、このペプチドがプロテインキナーゼCηに特異的な阻害剤として有用であることを見出した。当該ポリペプチドがプロテインキナーゼCη特異的阻害活性を有する原因の一つは、AlaがSerと異なりリン酸化を受けない構造を有するためであると考えられる。
　そこで、Y6の部位のアミノ酸であるAlaは、リン酸化を受けない他のアミノ酸残基であるGly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisに置換された場合でも配列番号４のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。Y1の部位は、カチオン性アミノ酸であるArgを他のカチオン性アミノ酸であるLysに置換した場合でも配列番号4のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。Y2の部位はAspをArg、Lys又はAlaに置換した場合には結合性が非常に高くなると推定される。Y3の部位もMetをArg又はLysに置換した場合には結合性の増加が予測される。Y4の部位はカチオン性アミノ酸であるArgを他のカチオン性アミノ酸であるLysに置換した場合でも同様の効果が奏されると推定される。Y5の部位はAsnをGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisに置換しても同様の結合力が得られると予測され、配列番号4のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。Y7の部位は疎水性アミノ酸であるPheを他の疎水性アミノ酸であるLeu、MetまたはValに置換した場合でも配列番号4のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。Y8の部位はAsnをArg又はLysに置換した場合には結合性が増加すると推定される。Y9の部位は疎水性アミノ酸であるLeuを、他の疎水性アミノ酸であるPhe、または結合性が強いカチオン性アミノ酸であるArg又はLysに置換した場合でも配列番号4のポリペプチドと同様の効果が奏されると推定される。Y10の部位はGlyをAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisに置換しても同様の結合力が得られると予測される。Y11の部位はValをAla、Arg又はLysに置換した場合には結合性が非常に高くなると推定される。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドとしては、上記で説明したアミノ酸配列（好ましくは配列番号４のアミノ酸配列）において1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCη阻害活性を有するポリペプチドも好適である。ここで「1以上」とは通常は「1～5個」であり、より典型的には「1～3個」であり、最も好ましくは「1～2個」である。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態であってもよい。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは必要に応じて化学修飾された形態であってもよい。本発明の範囲にはこのような誘導体も含まれる。化学修飾としては中性のポリマーまたは膜透過性物質による修飾が考えられる。中性のポリマーはチャージを有していないことから、本発明のポリペプチド阻害剤を安定化することができる。膜透過性物質の修飾法としては、ミリストイル化（N-myristoylation）と膜透過性ペプチドの修飾法が挙げられる。膜透過性ペプチドは天然の膜透過性ペプチド、人工合成の膜透過性ペプチド、およびファージティスプレイ由来の膜透過性ペプチド（phage display cell-permeable peptide）が使用できる（参考文献：Joliot A, and Prochiantz A.　2004. Transduction peptides: from technology to physiology. Nature Cell Biol 6:189-196）。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは公知のポリペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置を用いた方法により製造することができる。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCηに対する選択的阻害剤の有効成分として有用である。プロテインキナーゼCηは基質をリン酸化する機能を有する。本発明のポリペプチドがプロテインキナーゼCηと結合するとプロテインキナーゼCηはリン酸化基質をリン酸化することができず、活性が阻害される。本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCη選択的に作用するという点、プロテインキナーゼCηと直接結合して長期間にわたり酵素活性を阻害するという点、並びに毒性がないという点において特長を有する。阻害されるプロテインキナーゼCηの起源は特に限定されないがヒトであることが好ましい。本発明のプロテインキナーゼCη阻害剤は脳梗塞および神経膠腫(グリオマ)等の疾患研究用の試薬の用途に有用である。本発明のポリペプチドをプロテインキナーゼCη阻害剤として使用する場合、試薬の用途において許容される賦形剤、担体等の各種添加剤とともに製剤化されてもよい。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは、プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤の有効成分として有用である。プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患としては、具体的には脳梗塞および神経膠腫(グリオマ)などが挙げられるがこれらには限定されない。本発明の治療剤は、ヒト等の哺乳動物における症状又は疾患の治療の目的で使用され得る。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドは医薬として用いた場合に副作用が少ないという特長を有していることから、本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドを、対象症状又は疾患に対する副作用の恐れのある他の薬物と組み合わせて使用すると、治療効果を保持しながら副作用を最小化することができる。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドはプラスチャージを有しているので、マイナスチャージを有する遺伝子（DNA、RNA等の核酸）と結合することができる。そのため、対象症状又は疾患の治療に有効な遺伝子と本発明のポリペプチドとを組み合わせて細胞に導入することもできる。
　本発明のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドを含有する上記症状又は疾患の治療剤は、投与形態に適した製剤形態へ調製され得る。投与形態は特に限定されず経口投与、非経口投与（血管投与、皮内投与、塗布、点滴、服内投与など）のいずれであってもよい。製剤形態への調製は、常法に従って行うことができ、その際に利用できる担体や賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、希釈剤も、慣用されている各種のものから適宜選択することができる。形態には、特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、貼付剤、軟膏剤等の非経口剤として製剤化される。
　本発明はまた、上記のプロテインキナーゼCη阻害ポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸としてはDNA又はRNAが挙げられ、DNAが好ましい。
　本発明の核酸を生体内に投与すると、生体内において核酸からポリペプチドが発現され、発現されたポリペプチドがプロテインキナーゼCηに対する選択的阻害作用を発揮する。従って、本発明の核酸それ自体もまた、プロテインキナーゼCη阻害剤、或いはプロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤の有効成分として有用である。
　本発明の核酸を生体に投与する場合は、該核酸を注射により直接投与する方法のほか、該核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の核酸をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。本発明の核酸の投与経路としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与経路を採用することもできる。
1. ポリペプチドの合成
　プロテインキナーゼCα（Protein kinase Cα, PKCα）阻害ポリペプチドFKKQGAFAKKK (配列番号1)は、標準的なFmoc法により自動ペプチド合成機を用いて合成した。合成したポリペプチドは高速液体クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。この時、溶出液Aとして0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)水溶液を用い、溶出液Bとして0.1% TFA アセトニトリル溶液を用いて、流速8ml/分のA-Bリニアグラジエントにより溶出を行った。このグラジエントは、30分間かけてアセトニトリル/水を10/90から30/70へするというものである。
　目的ポリペプチドの確認はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MS）によって行われた。α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸 (CHCA) マトリクス (10 mg/ml) を50% 水/アセトニトリルおよび0.1% TFA中で調製した。マトリクスと試料とを1:1の比で混合した。各混合物1μlの全量をサンプルプレートに適用し、乾燥させた後、測定を行った。
2. 阻害ポリペプチド（FKKQGAFAKKK）によるリン酸化阻害実験
　リン酸化反応は、25 μMのポリペプチド、0.1-1.0 μg/mlのPKC酵素（α、β、およびγ）、およびPKCα阻害ポリペプチド（0，25、50、75、および100 μM）を含有する50 μlの緩衝液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 100 μM ATP, 2.0 μg/mlジアシルグリセロール (DAG) および2.5 μg/ml フォスファチジルセリン (PS)] 中で行った。ただし PKCδ、ε、η、およびθによりリン酸化反応を行う場合は CaCl2を含まない緩衝液を用い、PKCζ、およびι/λによりリン酸化反応を行う場合は CaCl2およびDAGを含まない緩衝液を用いた。また、リン酸化反応に使用されたポリペプチド配列は二種類（FKKQGSFAKKK（配列番号2）とLRVQNSLRRR（配列番号3））である。サンプルは37℃で60分間インキュベーションを行った後、MALDI-TOF/MSにより分析を行った。リン酸化されたポリペプチドの相対強度 (%) は次の算式で算出した：(リン酸化されたポリペプチドの強度)/{(リン酸化されたポリペプチドの強度)＋(リン酸化されていないポリペプチドの強度)} x 100。
　阻害ポリペプチドによるリン酸化阻害率は、コントロールサンプル（PKCα阻害ポリペプチドの無添加のサンプル）のリン酸化率を100％とし、各PKCα阻害ポリペプチド濃度（25、50、75、および100 μM）を添加した後、減少したパーセントをリン酸化阻害率として示した。
3. 結果
3.1. FKKQGSFAKKKポリペプチドに対する阻害効果
　FKKQGSFAKKK (配列番号2) ポリペプチドは他のPKCアイソザイムに比べてPKCαに対するリン酸化感度が非常に高い配列である（特許文献１）。阻害ポリペプチドFKKQGAFAKKK (配列番号1) によるFKKQGSFAKKK (配列番号2)ポリペプチドのリン酸化阻害率の結果を図1に示した。50 μMの阻害ポリペプチドの添加によってPKCαのリン酸化は50％程度阻害された。さらに、75 μMの濃度では60％以上の阻害効果が得られた。
3.2. LRVQNSLRRRポリペプチドに対する阻害効果
　0.1-1μg/ml 酵素濃度で、LRVQNSLRRR (配列番号3) ポリペプチドはほとんどのPKCアイソザイムによってリン酸化されるポリペプチドである（特許文献１）。阻害ポリペプチドFKKQGAFAKKK (配列番号1)によるLRVQNSLRRR (配列番号3)ポリペプチドのリン酸化阻害率の結果を図2に示した。50と75 μMの阻害ポリペプチドの添加によってPKCαのリン酸化は30％程度阻害された。また、100 μMの濃度では60％以上の阻害効果が得られた。一方、PKCα以外のPKCアイソザイムに対しては20％以下の阻害効果を示すのみであった。
4. 結論
　これらの結果から、本発明のポリペプチド（FKKQGAFAKKK (配列番号1)）はPKCαに対して高い阻害能力を有していることが分かった。
1. ペプチドの合成
　プロテインキナーゼCη（Protein kinase Cη, PKCη）阻害ペプチドRDMRNAFNLGV (配列番号4) は、標準的なFmoc法により自動ペプチド合成機を用いて合成した。合成したペプチドは高速液体クロマトグラフィーシステムを用いて精製した。この時、溶出液Aとして0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)水溶液を用い、溶出液Bとして0.1% TFA アセトニトリル溶液を用いて、流速8ml/分のA-Bリニアグラジエントにより溶出を行った。このグラジエントは、30分間かけてアセトニトリル/水を10/90から30/70へするというものである。
　目的ペプチドの確認はマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI－TOF/MS）によって行われた。α－シアノ－4－ヒドロキシ桂皮酸 (CHCA) マトリクス (10 mg/ml) を50% 水/アセトニトリルおよび0.1% TFA中で調製した。マトリクスと試料とを1:1の比で混合した。各混合物1μlの全量をサンプルプレートに適用し、乾燥させた後、測定を行った。
2. 阻害ペプチド（RDMRNAFNLGV）によるリン酸化阻害実験
　リン酸化反応は、25 μMのポリペプチド、10 μg/mlのPKCη酵素、およびPKCη阻害ペプチド（0，25、50、75、および100 μM）を含有する50 μlの緩衝液 [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 100 μM ATP, 2.0 μg/mlジアシルグリセロール (DAG) および2.5 μg/ml フォスファチジルセリン (PS)] 中で行った。リン酸化反応に使用されたペプチド配列はRDMRNSFNLGV（配列番号5）（特許文献１）である。サンプルは37℃で60分間インキュベーションを行った後、MALDI－TOF/MSにより分析を行った。リン酸化されたペプチドの相対強度 (%) は次の算式で算出した：(リン酸化されたペプチドの強度)/{(リン酸化されたペプチドの強度)＋(リン酸化されていないペプチドの強度)} x 100。
　阻害ペプチドによるリン酸化阻害率は、コントロールサンプル（PKCη阻害ペプチドの無添加のサンプル）のリン酸化率を100％とし、各PKCη阻害ペプチド濃度（0、25、50、75、および100 μM）を添加した後、減少したパーセントをリン酸化阻害率として示した。
3. 結果
3.1. RDMRNAFNLGVペプチドに対する阻害効果
　RDMRNSFNLGV(配列番号5)はPKCηに特異的にリン酸化するペプチドである。阻害ペプチド（RDMRNAFNLGV(配列番号4)）によるRDMRNSFNLGV(配列番号5)ペプチドのリン酸化阻害率の結果を図3に示した。阻害ペプチドの75 μMの添加によってPKCηのリン酸化は50％以上阻害された。本発明のペプチド（RDMRNAFNLGV (配列番号4)）はPKCηに対して阻害能力を有していることが確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (15)

  1. 　以下の(a)若しくは(b)のポリペプチド又はプロテインキナーゼCα阻害活性を有するその誘導体：
    (a) X1-X2-X3-Gln-Gly-X4-X5-X6-X7-X8-X9
    （式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及びX9はそれぞれアミノ酸残基を示し、X1はN末端に位置し、X9はC末端に位置し、X1はPhe、Leu又はArgであり、X2はLys又はArgであり、X3はLys又はArgであり、X4はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、X5はPhe、Leu、Met又はValであり、X6はAla、Lys又はArgであり、X7はLys、Phe又はArgであり、X8はLys又はArgであり、X9はLys、Arg又はAlaである）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    (b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCα阻害活性を有するポリペプチド。
  2. 　X1がPheであり、X2がLysであり、X3がLysであり、X5がPheであり、X6がAlaであり、X7がLysであり、X8がLysであり、X9がLysであることを特徴とする請求項１記載のポリペプチド又はその誘導体。
  3. 　X4がAlaである請求項1又は2記載のポリペプチド又はその誘導体。
  4. 　請求項1～3のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする核酸。
  5. 　請求項1～3のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項4記載の核酸を有効成分として含有するプロテインキナーゼCα阻害剤。
  6. 　請求項1～3のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項4記載の核酸を有効成分として含有する、プロテインキナーゼCαの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤。
  7. 　請求項1～3のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項4記載の核酸を有効成分として含有する抗ガン剤。
  8. 　以下の(c)又は(d)のポリペプチド又はプロテインキナーゼCη阻害活性を有するその誘導体：
    (c) Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11
    （式中、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10及びY11はそれぞれアミノ酸残基を示し、Y1はN末端に位置し、Y11はC末端に位置し、Y1はArg又はLysであり、Y2はAsp、Arg、Lys又はAlaであり、Y3はMet、Arg又はLysであり、Y4はArg又はLysであり、Y5はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y6はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y7はPhe、Leu、Met又はValであり、Y8はAsn、Lys又はArgであり、Y9はLeu、Phe、Arg又はLysであり、Y10はGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Cys、Met、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg又はHisであり、Y11はVal、Lys、Arg又はAlaである）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    (d) 上記(c)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入又は置換されたアミノ酸配列からなり、プロテインキナーゼCη阻害活性を有するポリペプチド。
  9. 　Y1がArgであり、Y2がAspであり、Y3がMetであり、Y4がArgであり、Y5がAsnであり、Y7がPheであり、Y8がAsnであり、Y9がLeuであり、Y10がGlyであり、Y11がValであることを特徴とする請求項8記載のポリペプチド又はその誘導体。
  10. 　Y6がAlaである請求項8又は9記載のポリペプチド又はその誘導体。
  11. 　請求項8～10のいずれか1項記載のポリペプチドをコードする核酸。
  12. 　請求項8～10のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項11記載の核酸を有効成分として含有するプロテインキナーゼCη阻害剤。
  13. 　請求項8～10のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項11記載の核酸を有効成分として含有する、プロテインキナーゼCηの活性を阻害することにより改善され得る症状又は疾患の治療剤。
  14. 　請求項8～10のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項11記載の核酸を有効成分として含有する、脳梗塞の治療剤。
  15. 　請求項8～10のいずれか1項記載のポリペプチド若しくはその誘導体又は請求項11記載の核酸を有効成分として含有する、神経膠腫の治療剤。
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