JP2005052101A - 新規タンパク質およびそれをコードするdna - Google Patents
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Abstract
【課題】 完全長cDNAライブラリーに含まれるcDNAクローンの塩基配列を解析し、このうち全長として配列が新規なcDNAについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするDNAの利用方法を提案すること。
【解決手段】 以下の(a)または(b)のタンパク質;(a)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、(b)特定のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
【解決手段】 以下の(a)または(b)のタンパク質;(a)特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、(b)特定のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
Description
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするDNA、該タンパク質をコードする完全長cDNA、該DNAを有する組換えベクター、該DNAの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該DNAを導入した遺伝子導入細胞、および該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
現在、世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められている。既に約百数十の原核微生物、下等真核生物の出芽酵母、多細胞性真核生物である線虫で、その全ゲノム配列が決定された。30億塩基対といわれるヒトのゲノムについては2001年2月にその塩基配列のドラフトが発表されていたが、2003年4月に完全配列が解読され公表された。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、全ての遺伝子の機能を明らかにできるわけではない。例えば酵母では、ゲノム配列から推定された約6,000の遺伝子の約半数しか、その機能を推定できなかった。一方、ヒトには約10万種類のタンパク質が存在するといわれる。そこで、ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量の新しい遺伝子の機能を、迅速かつ効率的に解明していくための「ハイスループット遺伝子機能解析システム」の確立が、強く望まれている。
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエクソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたmRNAから作製されるcDNAでは、タンパク質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのcDNAの研究では、これまでに500万以上のEST (Expressed Sequence Tag) データが公共データベースに公開されている。
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエクソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトEST情報の多くはcDNAの3’末端側近傍に集中しているため、特にmRNAの5’末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。また、世界の研究機関 (ヘリックス研究所、かずさDNA研究所、東大医科学研究所、ドイツ癌研究センター、MGCプロジェクトなど) で行われている解析の結果明らかにされているcDNAは4万数千に上り、数的には3万数千と言われる遺伝子座の大半をカバーしていると思われるが、全長クローンとして取得されているcDNAの割合は80%程度であることや、重複やスプライスバリアントが含まれていることを考慮すると、まだ取得されていないcDNAは多数存在していると考えられる。
完全長cDNAを取得できれば、その5’末端配列からゲノム配列上でのmRNA転写開始点が推定できる上、その配列の中に含まれるmRNAの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。また、翻訳開始点であるatgを5’側に含むことから、正しいフレームでタンパク質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝子発現系を適用することで、そのcDNAがコードするタンパク質を大量に生産したり、タンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。このように、完全長cDNAの解析からはゲノム配列解析を相補する重要な情報が得られる。また、発現可能な全長cDNAクローンは、その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、その重要性はきわめて高い。
また、同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、それをコードするmRNAが転写される際、ゲノム中一部のエクソンが挿入・欠失して結合する異性体(以下、これを「スプライシングバリアントmRNA」と称することがある)がある。実際、これらのmRNAが翻訳されて生成される、複数種の類似のタンパク質(以下、これらを「スプライシングバリアント」と称することがある)が生体内において確認されている。スプライシングバリアントは、組織特異的、発生段階特異的、あるいは疾患特異的に発現し、それぞれ異なる機能を有していると考えられている。
例えば、エストロゲン受容体βは、10種類のエクソン欠失スプライシングバリアントmRNAが様々なヒト組織より同定されている。このうち9種類が正常乳房組織で発現しているが、その中で、5番と6番のエクソンを欠いたmRNAの発現が、大部分の癌組織で有意に減少することが明らかにされている。また、5番のエクソンを欠いたmRNAは、癌の進行度に応じて、有意にその発現量が変動することが明らかにされている(例えば、非特許文献1を参照。)。このようにスプライシングバリアントの発現量が病態と有意な相関を示すことがある。
このようなスプライシングバリアントのmRNAあるいはcDNAも、従来のcDNAライブラリーやESTからは取得されにくく、転写開始点を含む完全長cDNAライブラリーにより取得される可能性の高いクローンである。
特に、転写因子は、転写反応または遺伝子発現と呼ばれるDNAからmRNAを合成する段階に関与する、DNAに親和性を有するタンパク質であり、極めて多くの因子が知られている。転写反応は、遺伝子産物であるタンパク質の合成量を調節する重要な反応であり、細胞の機能、構造にかかわるタンパク質量を制御していることになる。この転写反応は一群の転写因子によって引き起こされ、例えばRNAポリメラーゼは、TATAボックスや転写開始部位から構成されるプロモーターと呼ばれる転写制御領域の特定の塩基配列を有するDNAに結合し、RNAポリメラーゼを組込んで種々の転写因子が集合した転写複合体を形成してmRNAの合成を開始する。プロモーターに依存する転写反応は遺伝子特異性がなく基本転写と呼ばれ、RNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼと転写複合体を形成してRNAポリメラーゼに近い部分で働く転写因子は、基本転写因子と呼ばれている。この基本転写とは別に、細胞は生理的環境の変化や外界からの刺激に対し、基本転写のレベルを上下させたり、時期もしくは組織特異的な発現を調節する機構を有している。このような基本転写の調節をつかさどる転写調節領域の特定の塩基配列を有するDNAはエンハンサーもしくはサイレンサーとも呼ばれ、通常はプロモーターの上流に存在し、この領域に結合する転写調節因子(遺伝子特異的転写調節因子、遺伝子発現調節因子もしくは遺伝子発現調節タンパク質とも呼ばれる)が直接もしくは別の転写調節補因子(メディエーター、コファクターもしくは介在因子とも呼ばれる)を介して基本転写因子と相互作用することにより基本転写の調節を行っている(以下、このような基本転写の調節活性を「転写調節活性」と称し、また転写調節因子と転写調節補因子を併せて「転写調節因子」と称することがある)。すなわち、転写因子は、基本転写因子と転写調節因子の2つのカテゴリーに分類される。基本転写因子は遺伝子特異性がなく数も少ないが、転写調節因子は非常に多くのものが知られており、その数は類似因子やファミリーを含めると1000のオーダーに達すると考えられているし、その結合部位も多様である。
細胞内または細胞間刺激に対する応答において転写反応を調節することは、例えば、そのような調節が生物の発達に必要な場合に、または生物環境の変化に対する生物の生存に必要な場合にしばしば所望される。しかし、転写反応が不適切に作動または停止することにより、疾患が引き起こされることがある。例えば、エストロゲン介在性遺伝子発現がいくつかの種類の乳癌または卵巣癌に関与することを示唆する証拠が報告されている。また、白血病に伴う染色体転座部位からさまざまな転写調節因子遺伝子が発見されており、この中に転写調節因子同士の融合キメラ分子をコードするものが多数存在することから、転写調節因子の活性の異常が白血病に深く関与する可能性が示唆されている(例えば、非特許文献2を参照。)。このように、転写調節因子の中には、疾患に関与する種々の遺伝子の転写を調節する転写調節因子(以下、これを「疾患関連転写調節因子」と称することがある)が存在する。例えば、疾患関連転写調節因子として、PPAR、p53、NFκB、AP−1、HIF−1、CREB等が知られている。
また、プロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系(リン酸化カスケード)を調節することにより、種々の生命現象の制御に関わっていることが知られており、疾患との関係が解明されている遺伝子が多い(例えば、非特許文献3を参照。)が、このリン酸化カスケードにおいてリン酸化されて活性化される一群の転写調節因子が関与することも知られており、これらの転写調節因子もプロテインキナーゼと同様に疾患に関与する可能性が示唆されている(例えば、非特許文献4を参照。)。
しかし、上記のとおり、ヒトの体内には約千種もの異なる転写調節因子が存在すると推定されており、まだ多くの転写調節因子遺伝子がクローニングされないままに残されている。したがって、ヒトにおいて分離が進んでいないスプライシングバリアントを含む新規な転写調節因子の全長cDNAを提供する意義は大きい。また、転写調節因子は、治療のための標的分子として、またタンパク質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、これらのタンパク質をコードするcDNAの全長を明らかにすることには大きな意義がある。
Poola I et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 82: 169-179 (2002). Look, A. T., Science, 278: 1059-1064 (1997) Hunter, T., Cell, 50: 823-829 (1987) Ninomiya-Tsuji, J. et al., Nature 398: 252-256 (1999)
Poola I et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 82: 169-179 (2002). Look, A. T., Science, 278: 1059-1064 (1997) Hunter, T., Cell, 50: 823-829 (1987) Ninomiya-Tsuji, J. et al., Nature 398: 252-256 (1999)
本発明は、完全長cDNAライブラリーに含まれるcDNAクローンの塩基配列を解析し、このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規なcDNAについては、これがコードするタンパク質の生理活性を特定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするDNAの利用方法を提案することを目的とする。
本発明者らは、オリゴキャップ法(Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174(1994); Suzuki, Y. et al., Gene, 200: 149-156 (1997))を用いて取得されたスプライシングバリアントを含む配列が新規なcDNAについて、該cDNAクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列に転写調節活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのcDNAがコードするタンパク質が転写調節因子であると同定した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、以下の1〜15に記載の発明が提供される。1.以下の(a)または(b)のタンパク質;
(a)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質。
2.前項1に記載のタンパク質をコードするDNA。
3.前項1に記載のタンパク質をコードする完全長cDNA。
4.以下の(a)または(b)のいずれかのDNA;
(a)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列を有するDNA、
(b)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列を有し、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードするDNA。
5.前項2〜4のいずれかに記載のDNAを含む組換えベクター。
6.前項2〜4のいずれかに記載のDNAまたは前項5に記載の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
7.前項6に記載の細胞により産生される、前項1に記載のタンパク質。
8.前項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
9.前項1または7に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
10.抗体がモノクローナル抗体である前項9に記載の抗体。
11.モノクローナル抗体が前項1または7に記載のタンパク質の転写調節活性を中和する作用を有することを特徴とする前項10に記載の抗体。
12.前項1または7に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
13.前項6に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているDNAの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該DNAの発現調節物質のスクリーニング方法。
14.前項1に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも1以上のアミノ配列情報および/または前項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列から選択される少なくとも1以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
15.前項1に記載のタンパク質および/または前項2〜4のいずれかに記載のDNAを結合させた担体。
(a)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質。
2.前項1に記載のタンパク質をコードするDNA。
3.前項1に記載のタンパク質をコードする完全長cDNA。
4.以下の(a)または(b)のいずれかのDNA;
(a)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列を有するDNA、
(b)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列を有し、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードするDNA。
5.前項2〜4のいずれかに記載のDNAを含む組換えベクター。
6.前項2〜4のいずれかに記載のDNAまたは前項5に記載の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
7.前項6に記載の細胞により産生される、前項1に記載のタンパク質。
8.前項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
9.前項1または7に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
10.抗体がモノクローナル抗体である前項9に記載の抗体。
11.モノクローナル抗体が前項1または7に記載のタンパク質の転写調節活性を中和する作用を有することを特徴とする前項10に記載の抗体。
12.前項1または7に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
13.前項6に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているDNAの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該DNAの発現調節物質のスクリーニング方法。
14.前項1に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも1以上のアミノ配列情報および/または前項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列から選択される少なくとも1以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
15.前項1に記載のタンパク質および/または前項2〜4のいずれかに記載のDNAを結合させた担体。
本発明のタンパク質およびそれをコードするDNAは転写調節活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするDNAを用いて該活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発に有用である。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
(1)完全長cDNAの取得および塩基配列の解析
本発明のDNAは、配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個(ここで、数個とは、例えば5個以下、好ましくは3個以下、より好ましくは2個以下を意味する)のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードし得るものであればいかなるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのcDNAの全長を含むものでもよい。
(1)完全長cDNAの取得および塩基配列の解析
本発明のDNAは、配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個(ここで、数個とは、例えば5個以下、好ましくは3個以下、より好ましくは2個以下を意味する)のアミノ酸残基の置換、欠失および/または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードし得るものであればいかなるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのcDNAの全長を含むものでもよい。
具体的には、cDNAの全長を含むDNAとしては、例えば配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列からなるDNA等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号1の塩基番号32〜1060、配列番号2の塩基番号211〜1329、配列番号3の塩基番号33〜1385、配列番号4の塩基番号75〜1379、配列番号5の塩基番号542〜1768に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のcDNAの全長でなくても、上記翻訳領域とその3’および/または5’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のDNAに含まれる。
本発明のDNAは、これを取得できる方法であればいかなる方法により取得したものでもよいが、具体的には例えば下述の方法により取得することができる。まず、ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりmRNAを調製する。次に、このmRNAを鋳型としてオリゴキャップ法(Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174 (1994))によりcDNAを取得する。具体的には、取得したmRNAについて酸性ピロフォスファターゼにより5’キャップをはずし、その後露出した5’末端のリン酸基を標的に、合成オリゴヌクレオチドをRNAライゲースを用いて連結する。ここで、キャップ構造を5’末端に有していないRNA分子について、上記オリゴヌクレオチドが結合しないように、予め5’末端に存在するリン酸基を、5’キャップは外さないが5’端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファターゼ等を用いて外しておくことは有効である。このRNA分子を鋳型として、3’側のプライマーとしてオリゴdTプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、RNA鎖を分解除去する。
さらに取得された1本鎖DNAを鋳型として、上記合成オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを5’プライマーとし、3’末端に特異的なプライマー(オリゴdT等)を用いてポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行うことにより完全長cDNAライブラリーを作製することができる。ここで、5’プライマーおよび3’プライマーは、上記合成オリゴヌクレオチドおよび逆転写プライマーの全長に対して相補的なものではなく、3’側に3〜10bずらした配列を用いることが好ましい。プライマーの鎖長としては、通常15〜100塩基、好ましくは15〜30塩基が挙げられるが、増幅するcDNAの鎖長が長い場合には25〜35塩基の長さとすることが好ましく、また、Long and Accurate PCR(LA PCR:林健志、実験医学別冊・PCRの最新技術、羊土社;Cheng, S. et al., Nature 369: 684-685 (1994))を用いることが好ましい。
このようにして取得されたcDNAは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、取得されたcDNAクローンを細胞に導入して該cDNAがコードするタンパク質を発現できるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。具体的には例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはpME18SFL3(Genbank AB009864)等が好ましく、また大腸菌の場合では、pET3、pET11(ストラタジーン社製)、pGEX(アマシャムファルマシアバイオテク社製)等が挙げられ、酵母の場合ではpESP−Iエクスプレッションベクター(ストラタジーン社製)等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではBacPAK6(クロンテック社製)等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ZAP Express(ストラタジーン社製)、pSVK3(アマシャムファルマシアバイオテク社製)等が挙げられる。
かくして取得されるcDNAライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のDNAは、取得されたcDNAの5’末端あるいは3’末端の塩基配列を解析し、これをNCBI(National Center of Biotechnology Information;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で運用しているGenbank、EMBL、DDBJ、dbEST等のデータベースをBLAST(Basic local alignment search tool; Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410(1990))を用いて検索し、その全長について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供することとした。
このような完全長cDNAの塩基配列を有するDNAとしては、例えば、配列番号1〜5に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号1の塩基番号32〜1060、配列番号2の塩基番号211〜1329、配列番号3の塩基番号33〜1385、配列番号4の塩基番号75〜1379、配列番号5の塩基番号542〜1768に示される配列を有するものが挙げられる。
かくして取得されたcDNAの全長として新規な塩基配列を、BLASTによる相同性検索(homology search)や、HMMER(隠れMarkovモデルによる配列解析手法;Eddy, S. R., Bioinformatics 14: 755-763(1998))の機能群のひとつであるHMMPFAMによるタンパク質特徴検索(profile search:http://pfam.wustl.edu)等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
BLASTによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されている配列の機能ドメイン部分と本発明のDNAのこれに対応する部分との一致度(identity)がe−value(問い合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値)として10-4以下のものか、あるいは30%以上のものを示す。
例えば、上位にヒットした機能ドメイン配列の多くが転写調節因子としての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、すなわち、転写調節活性を持つであろうという予測が成り立つ。
HMMPFAMでは、Pfamというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、解析対象である塩基配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析が行われる。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない機能でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し機能予測ができる。このように、それがコードするタンパク質が転写調節活性を有すると予測されるcDNAは、後述する生化学的実験によりその転写調節活性を確認することができる。
上記でcDNAの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、配列番号1〜5のいずれかに示す塩基配列を有するものが挙げられる。また、これらの塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号6〜10のいずれかに示すものが挙げられる。
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のDNAは上記の配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、1もしくは数個(ここで、言う数個とは、例えば15個以下、好ましく9個以下、より好ましくは6個以下を意味する)の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列を有し、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードするDNA等も含まれる。これらDNAには前記したとおり、配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
さらに、本発明のDNAは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。DNAの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット(宝酒造社製)や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット(ストラタジーン社製)等の市販キットで容易に行うことができる。
(2)新規cDNAがコードするタンパク質
本発明のDNAがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該DNAが有する塩基配列について3種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明のタンパク質の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を推定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号6〜10のいずれかに記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するものも含まれる。
本発明のDNAがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該DNAが有する塩基配列について3種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明のタンパク質の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を推定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号6〜10のいずれかに記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するものも含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法としては、(1)に記載の本発明のDNAを適当な方法により転写/翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクターもしくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
また、そのN末端またはC末端に適当なタグが融合するように設計されたベクターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。タグとして具体的には、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、Flagなどが挙げられる。
上記形質転換体が産生するタンパク質には、タンパク質合成時に重原子などで置換・修飾したアミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。また、タンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。例えば、N末端アセチル化、C末端アミド化などの末端修飾、糖鎖付加、脂質付加、アシル化、メチル化、スルホン化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、ADP−リボシル化などであるが、必ずしもこれらに限定されない。これらの修飾タンパク質も上記した転写調節活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も上記した転写調節活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のDNAを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該DNAが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該DNAが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域DNAが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、pET3、pET11(ストラタジーン社製)、pGEX(アマシャムファルマシアバイオテク社製)等が挙げられ、酵母の場合ではpESP−Iエクスプレッションベクター(ストラタジーン社製)等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではBacPAK6(クロンテック社製)等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ZAP Express(ストラタジーン社製)、pSVK3(アマシャムファルマシアバイオテク社製)が挙げられ、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはpME18SFL3(Genbank AB009864)等が好ましい。
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはT3、T7、tac、lacプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはnmt1プロモーター、Gal1プロモーター等を用いることができる。昆虫細胞の場合には、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはSV40プロモーター、CMVプロモーター等が好ましく用いられる。
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のDNAの挿入は、該DNAまたはこれを含むDNA断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、DNA導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック(J. Mol. Biol., 53: 154 (1970))、リン酸カルシウム法(Science, 221: 551 (1983))、DEAEデキストラン法(Science, 215: 166 (1982))、インビトロパッケージング法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 581 (1975))、ウィルスベクター法(Cell, 37: 1053 (1984))、および電気パルス法(Chu. et al., Nuc. Acids Res., 15: 1331 (1987))等が挙げられる。
DNA導入体を作製するための宿主としては、本発明のDNAが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス(節足動物多角体ウイルス)−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではBL21、XL−2Blue(ストラタジーン社製)等、酵母ではSP−Q01(ストラタジーン社製)等、バキュロウィルスではAcNPV(J. Biol. Chem., 263: 7406 (1988))とその宿主であるSf−9細胞(J. Biol. Chem., 263: 7406 (1988))等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞C127(J. Viol., 26: 291 (1978))やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO細胞(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980))等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来COS−7細胞(ATCC CRL1651:アメリカンタイプカルチャーコレクション保存細胞)、ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞(ATCC CRL1573)またはヒト子宮頸部癌HeLa細胞(ATCC CCL−2)が用いられる。
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のDNA断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術(Vertes, A. A. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 57: 2036 (1993))、あるいはトランスポゾンや挿入配列(Vertes, A. A. et al., Molecular Microbiol., 11: 739 (1994))等を用いてDNA導入体を作製することもできる。
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および/または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。
かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記(1)で取得された本発明のDNAを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、DNAからmRNAへの転写、およびmRNAからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにDNAを加えることによってそのDNAがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B.D.& Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞タンパク質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、E. coli S30 extract system(Promega社製)とRTS500 Rapid Translation System(Roche社製)等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System(Promega社製)等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM(TOYOBO社製)等が挙げられる。
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、例えばエピトープペプチド、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトース結合タンパク質等をコードするDNA領域を、前記した転写翻訳されるべきDNAに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
目的とするタンパク質の発現は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー(シグマ社製)等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること(プロセッシング)が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、転写調節活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
(3)本発明のタンパク質が有する活性の確認
本発明のタンパク質は、これを上記(2)に記載のとおり組換えタンパク質として作製し、これを解析することにより(1)で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記(4)に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
本発明のタンパク質は、これを上記(2)に記載のとおり組換えタンパク質として作製し、これを解析することにより(1)で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記(4)に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
本発明のタンパク質が有する転写調節活性としては、例えば、DNA構造に変化を与えて遺伝子発現を調節する機能が挙げられる。本発明のタンパク質が、転写調節活性を有することは、それ自体既知の常法を用いて確認することができる。例えば、転写調節活性の解析方法の一つとして、他のタンパク質やDNAとの相互作用を解析する方法が知られている。相互作用の解析には、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。
より具体的には、本発明のタンパク質の有するDNAとの相互作用活性の一つであるDNA結合活性の場合、例えば、適当な二本鎖DNAを該タンパク質に接触させ、該タンパク質の該DNA鎖への結合性を測定することにより確認することができる。具体的な方法としては、以下に説明する方法等が挙げられる。
反応液としては、60mM塩化カリウム、1mMジチオトレイトール、10%グリセロール、1μg poly(dI−dC)を含む中性から弱塩基性緩衝液、例えば20mMトリス−塩酸或いはHEPES緩衝液(pH7〜8)を用い、適当な長さの二本鎖DNAと本発明のタンパク質を加えることにより反応を開始する。一定条件下で反応後、該タンパク質とDNAの結合物を検出することによりタンパク質の二本鎖DNA結合活性を判断する。
タンパク質とDNAの結合は、分子の大きさとして検出する方法、電荷の差異として検出する方法、両者の親和性を測定する方法等を用いて検出することが可能である。
分子の大きさを検出する方法としては、分子ふるいクロマトグラフィーによる測定が挙げられる。上記反応液を、生理食塩水或いは0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)、0.1M HEPES(pH7.5)で平衡化した分子ふるいクロマトグラフィー用カラムに添加し、同溶液にて展開する。タンパク質、DNAそれぞれの溶出位置と比較して、より高分子量側に両者の結合物が溶出される。
電荷の差として検出する方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法が挙げられる。ゲル電気泳動法は、電荷の差と分子の大きさの差が移動度の差として現れる。上記反応液を、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、泳動後のゲルを銀染色、クマーシーブリリアントブルー染色、或いは蛍光染色し、タンパク質単独の場合と比較して、結合物は移動度の異なるバンドとして確認される。この2法の場合、DNAの一方の末端を蛍光ラベルしておくことによって、DNAの溶出位置、移動度の差として、より高感度で検出することも可能である。
両者の親和性を測定する方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。これらの方法では、DNAを担体に固定しておき、そこにタンパク質を接触させ、その結合量を測定し活性の強さとする。アフィニティークロマトグラフィーでは、結合したタンパク質を高濃度の塩溶液、変性剤、遊離のDNA等で溶出し、溶出したタンパク質量を測定する。表面プラズモン共鳴法では、固定化DNAに結合したタンパク質量を、表面プラズモン共鳴で測定し、結合したタンパク質濃度で親和性の強さを測定することができる。
また、転写調節因子の場合、既知の転写調節因子が認識し標的とするプロモーターやエンハンサー等の遺伝子転写調節領域(以下、これを「標的転写調節領域」と称することがある)のDNAまたはその部分断片に対する結合能を測定することにより生物学的活性を解析する方法が知られている(特開2001−314190号公報)。解析に使用する標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片として、既知の標的転写調節領域の塩基配列(以下、これを「標的配列」と称することがある)を有するものだけでなく、既知の標的転写調節領域の塩基配列をデーターベース解析し分類してそれぞれ設計した、転写調節因子が共通して認識する標的転写調節領域の共通塩基配列(以下、これを「コンセンサス標的配列」と称することがある)を有するものを使用してもよい。
既知の転写調節因子としては、例えば、v−jun、c−jun、junB、junD、dJRA、c−fos、fosB1、fosB2、Fra−1、LRF−1、v−maf、mafG、NF−E2 p45、aNF−E2、fNF−E2、Nrf short form、GCN4、yAP−1、CREB−2、ATF−3、CRE−BP1、CRE−BP3、ATF−a、CREB−341、CREB−327、CREM、dCREB2、dCREB2−b、dCREB2−c、dCREB2−d、dCREB2−q、dCREB2−r、dCREB2−s、C/EBPα、C/EBPβ、p34C/EBPβ、CHOP−10、VBP、Hlf、CPRF−2、EmBP−1b、EmBP−1b、GBF1、GBF2、GBF3、CPRF−1、TAF−1、HBP−1a、GBF9、GBF1、GBF12、CPRF−3、TGA1a、TGA1b、O2、STE4、OPI1、E2A、E47、ITF−2/SEF2−1B、SEF−1A、MyoD、p42Tal−1、HEN−1、AhR、Arnt、USF、NF−1A1、NF−1A1.1、NF−1A6、NF−1B1、NF−1B1、NF−1B2、NF−1C2/CTF−2、CTF−4、CTF−6、RF−X1、AP2αA/AP−2α1、AP2α2、AP2α3、AP2α4、AP2αB、AP2β、AP2γ、GR、AR、ER、RXR−α、PPARα、PPARγ、COUP−TF1、HNF−4α1、HNF−4α2、CF1、GATA−1、GATA−2、GATA−3、GATA−4、AREA/NIT−2、Sp1、YY1、Egr−1、Egr−2、Egr−3、Snail、CF2−II、Evi−1、Ikaros、MZF−1、Tramtrack69K、HOX9、CDP、HNF−1A、Nkx−2.2、Nkx−2.5、TTF−1、Oct−1A、Oct−1B、Oct−1C、Oct−2、Oct−2.1/Oct−2B、Pax−3、Pax−6、Pax−1、HSF1(short)、HSF2、dHSF、fungalHSF、c−Myb、A−Myb、v−Myb、P(long)、P(short)、C1(long)、C1(short)、c−Ets−1_p54、Ets−1_δiV/VII、Ets−2、Elk−1、SAP−1、SAP−1b、Erg−1、p55erg、Fli−1b、E4TF1−60/GABP−α、E74A、IRF−1、IRF−2、p50、NF−ATc、NF−Atp、p91、p84、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、p53、MEF−2A、SRF、E2、TBP、SRY、Sox−5、Sox−9、mat−Mc、CP1A、CP1B、CBF−C、AML1a、等が知られており、これらの転写調節因子の標的転写調節領域の塩基配列もそれぞれ報告されている(田村隆明、外2名編、「Bio Science 実験医学別冊 新用語ライブラリー 転写因子」、第2版、株式会社羊土社、1999年12月)。
転写調節因子と標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片の結合は、自体公知の測定系を使用して検出することができる。例えば、標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片を固定化したプレートに転写調節因子を含む被検試料を添加し、両者の直接的な結合をSPR(Surface Plasmon Resonance, 表面プラズモン共鳴)法を用いて検出することができる。その場合には、前記したような転写調節因子が認識する標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片をセンサーチップに固定化する。DNAまたはその部分断片は、アニーリングさせたものを固定化する。また、転写調節因子または標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片を蛍光標識したものを用いて、両者の結合を検出することもできる。
本発明のDNAがコードするタンパク質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のDNAを適当な方法により転写/翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のDNAを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。
本発明のDNAがコードするタンパク質(配列番号6〜10)は、既知の標的転写調節領域の塩基配列をデーターベース解析して設計した標的配列またはコンセンサス標的配列(配列番号15〜配列番号67)を有する少なくとも一つのDNAまたはその部分断片に対して結合活性を有していた。
さらに転写調節因子の場合、前述のように、PPAR、p53、NFκB、AP−1、HIF−1、CREB等の疾患関連転写調節因子への作用を解析することにより、その転写調節因子が特定の疾患に直接的または間接的に関与しているかを解析することが可能である。
PPARとは、ステロイドホルモン受容体ファミリーであるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(peroxisome proliferator-activated receptor)であり、生活習慣病発症、例えば糖尿病や肥満等と関連する内分泌・糖・脂質代謝、さらには血管機能や炎症などの循環器系や発がん機構に関与する種々の標的遺伝子の発現を調節している疾患関連転写調節因子として知られており、これらの疾患の治療薬のターゲット分子として注目されている。このPPARは複数のサブタイプ遺伝子が見いだされ、哺乳動物においてはα、γ、およびδ(ヒトではNUC I、マウスではFAAR(fatty acid-activated receptor)、カエルではPPARβとも呼ばれる)の主に3種類のサブタイプ が明らかとなっている。α型は主として肝臓、腎臓、褐色脂肪細胞などの脂肪消費臓器、その他心筋や消化管に発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパクの生成などに関与する。β型は脳に、δ型は組織特異性がみられず普遍的に発現しているが大腸ガン細胞での発現が顕著であり、発ガンとの関係が注目されている。またγ型はγ1型とγ2型などの数種のアイソホームが知られており、γ1型は脂肪組織や免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、γ2型は脂肪細胞で特異的な発現がみられ、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている。これらのPPARは別の転写調節因子であるRXR(レチノイドX受容体)などとヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子上流にある応答配列PPRE(PPAR response element)に結合し、転写を制御することが知られている。
p53はRB遺伝子に引き続いて、1989年に2番目に同定された癌抑制遺伝子である。p53遺伝子は染色体の17p13.1に存在し、その遺伝子産物は分子量53kDの核内タンパク質である。最初、p53遺伝子はmycに似た癌遺伝子であると考えられていたが、その後、p53蛋白には野性型と変異型があり、野性型は細胞の増殖機能を制御する機能をもち、RB遺伝子と良く似た働きをもつ癌抑制遺伝子であることが明らかになった。p53蛋白は、転写調節因子としていくつかの遺伝子を制御している。そのうちでもっとも重要なものはサイクリン/Cdk複合体の機能を阻害するp21遺伝子の発現制御であると考えられている。p53の機能自体はリン酸化によって制御されている。癌化の抑制という観点からは、p53の機能として以下の2つが重要である。第1はプログラムされた細胞死であるアポトーシスを起こすシグナル伝達経路上にあることである。第2は細胞がDNA修復を行う間、細胞周期を停止させる働きである。このような機能を通じてp53は放射線や薬剤などによって障害を受けた細胞の細胞周期を停めたり、アポトーシスを引き起こして除去し、遺伝子変化を生じた細胞が癌細胞として増殖していくことを防止していることから、例えば、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
NFκBは、サイトカイン(例えば、IL−1、IL−2、IL−6、IL−8、GM−CSF、TNFなど)やケモカイン、インターフェロン、MHC分子、増殖因子、細胞接着分子などの遺伝子発現を制御し、特に免疫系に重要な働きを持つ疾患関連転写調節因子として知られており、例えば、関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患や炎症性疾患および癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
AP−1は、転写調節因子のFosとJunファミリーからなる複合体で、細胞増殖,分化,特に細胞ガン化や炎症性疾患に関与していることが知られており、例えば、炎症性疾患や癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
HIF−1は、低酸素状況において活性化される遺伝子転写調節因子であり、血管内皮増殖因子などの遺伝子発現制御を通じて血管新生の制御に密接に関わることが示されており、例えば、血管新生異常や細胞内酸化異常等に起因する、虚血性疾患、貧血、低酸素症、糖尿病性網膜症、循環器系疾患、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
CREB(Cyclic AMP Respones Element Binding protein)は、細胞増殖,分化,学習や記憶プロセス,薬物常用に対する神経系順応、インスリンとグルカゴンなどによるグルコネオジェネシスなどの代謝経路制御などに重要な働きを持つ疾患関連転写調節因子として知られており、例えば、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
具体的には、各疾患関連転写調節因子が認識する遺伝子部位の塩基配列を固相に固定化する。特に疾患関連転写調節因子が認識する標的転写調節領域のDNAまたはその部分断片が、好適に用いられる。固定化するDNAまたはその部分断片の配列の例示として、PPARγ解析用として配列番号68及び配列番号69、p53解析用として配列番号70及び配列番号71、NFκB解析用として配列番号72及び配列番号73、AP−1解析用として配列番号74及び配列番号75、HIF−1解析用として配列番号76及び配列番号77、CREB解析用として配列番号78及び配列番号79をあげたが、これらに限定されるものではない。DNAまたはその部分断片は、アニーリングさせたものを固定化する。固相は、例えばウェルプレートが使われ、直接或は例えばストレプトアビジン処理プレート、ニュートラアビジン処理プレート等に固定化される。DNAまたはその部分断片は、またビオチン標識したものを用いることはより好適な結果をもたらす。DNAまたはその部分断片の添加量は、好ましくは、1〜100nM/100μl/ウェルである。反応は、10〜30℃(室温)で、約30分〜2時間処理で行うことが好ましい。反応完了後、未反応物を除去し、より好ましくはタンパク質によるブロッキング操作を行う。
このようにして調製されたウェルプレートに、転写調節因子を含む被検試料を各疾患関連転写調節因子と共に適宜添加し、被検試料に含まれる転写調節因子の作用を解析する。被検試料に含まれる転写調節因子が、疾患関連転写調節因子と結合し、固定化DNAとの親和性を高めるものであれば、反応洗浄後も疾患関連転写調節因子と転写調節因子の結合体が固定化DNAと結合した状態でウェル中に残り、例えば吸光度で測定すればコントロールに比較してOD値が上がり、転写調節因子が疾患関連転写調節因子と固定化DNAとの親和性に正に作用すると推定できる。一方、被検試料に含まれる転写調節因子が、疾患関連転写調節因子と結合し或は結合せずに、疾患関連転写調節因子と固定化DNAとの親和性を低めるものであれば、反応洗浄後は疾患関連転写調節因子と転写調節因子の結合体はウェル中から除去され、例えば吸光度で測定すればコントロールに比較してOD値が下がり、転写調節因子が疾患関連転写調節因子と固定化DNAとの親和性に負に作用すると推定できる。
本発明のcDNAがコードするタンパク質を含む解析用の被検試料は、前述のように本発明のDNAを適当な方法により転写/翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、本発明のDNAを無細胞転写翻訳系に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。
疾患関連転写調節因子は、該疾患関連転写調節因子が含まれている細胞抽出液または細胞核抽出液から取得することができる。また、前述のように、疾患関連転写調節因子をコードするDNAを適当な方法により転写/翻訳する方法により調製することができる。具体的には、例えば、疾患関連転写調節因子をコードするcDNAを使用し、その全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または動物に導入し、疾患関連転写調節因子が発現したこれらの遺伝子導入細胞の培養上清または細胞内、組織、体液より、組換えタンパク質である疾患関連転写調節因子を取得することができる。
本発明のDNAがコードするタンパク質(配列番号6〜10)は、PPAR、p53、NFκB、AP−1、HIF−1、CREBのうち少なくとも一つの疾患関連転写調節因子が有する作用を増強または抑制する活性を有していた。
PPARの作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、内分泌・糖・脂質代謝異常等による糖尿病や肥満等の生活習慣病、血管機能異常等による循環器系疾患、炎症、癌等に関連することが推測された。
p53の作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、癌等に関連することが推測された。
NFκBの作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、関節リウマチや変形性関節炎などの免疫性疾患、炎症性疾患、癌等に関連することが推測された。
AP−1の作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、炎症性疾患や癌等に関連することが推測された。
HIF−1の作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、血管新生異常や細胞内酸化異常等に起因する、虚血性疾患、貧血、低酸素症、糖尿病性網膜症、循環器系疾患、癌等に関連することが推測された。
CREBの作用を増強または抑制する活性を有する、本発明のDNAがコードするタンパク質は、記憶障害などの中枢系疾患、循環器系疾患、糖尿病等に関連することが推測された。
このような転写調節活性の解析系は、本発明の転写調節活性を有するタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。
(4)本発明のタンパク質の機能解析
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規タンパク質であって、かつ転写調節活性を有する本発明のタンパク質は、上記(3)で確認された転写調節活性以外の機能を解析することによりその新規の利用法が提供される(この転写調節活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある)。特に、本発明のタンパク質には、公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規タンパク質であって、かつ転写調節活性を有する本発明のタンパク質は、上記(3)で確認された転写調節活性以外の機能を解析することによりその新規の利用法が提供される(この転写調節活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある)。特に、本発明のタンパク質には、公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
具体的な機能の解析方法としては、例えば、(i)各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、(ii)他のタンパク質、DNAとの相互作用を解析する方法、(iii)適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、(iv)適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
(i)の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、mRNAレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。mRNAレベルで発現量を解析する場合は、例えば、in situハイブリダイゼーション法(In situ hybridization: Application to Developmental Biology & Medicine., Ed. by Harris, N. and Wilkinson, D. G., Cambridge University Press (1990))、DNAチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量PCR法等が用いられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法、ELISA、ウェスタンブロット法などが挙げられる。ここで、解析の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、解析対象タンパク質をコードするcDNAにのみ存在し、公知のバリアントをコードするcDNAとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量PCR法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法(Wong, Y., Neuroscience Let., 320: 141-145 (2002))等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合にも、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
(ii)の方法においては、本発明のタンパク質と既知のタンパク質との相互作用の有無を調べて、本発明のタンパク質の機能を解析することができる。相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
(iii)の方法では、本発明のcDNAを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。DNAの細胞への導入法としては、上記(2)に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、本DNAまたは公知のバリアントをコードするDNAを同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質は転写調節活性を有するものであることがわかっているので、キナーゼが関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
(iv)の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、RNAインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
(5)オリゴヌクレオチドの調製および該オリゴヌクレオチドを用いる機能解析
上記(1)に記載の方法で取得した本発明のDNAまたはその断片を用いて、DNA合成機などを用いる常法により、本発明のDNAの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記DNAの有する塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。具体例としては、配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントDNAが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度(Tm)および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には5〜100塩基であり、好ましくは10〜60塩基であり、より好ましくは15〜50塩基である。
上記(1)に記載の方法で取得した本発明のDNAまたはその断片を用いて、DNA合成機などを用いる常法により、本発明のDNAの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。該オリゴヌクレオチドとしては、上記DNAの有する塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。具体例としては、配列番号1〜5のいずれかで表される塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するDNAまたは該DNAと相補的な配列を有するDNAを挙げることができる。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントDNAが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度(Tm)および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には5〜100塩基であり、好ましくは10〜60塩基であり、より好ましくは15〜50塩基である。
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine-modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを2本鎖RNAとして調製することにより、RNAインターフェアレンス法に適用することができる。2本鎖RNAの作製方法、及びRNAインターフェアレンス法については、例えば、Elbashir, S., et al., Nature, 411: 494-498 (2001)に記載の方法等を用いることができる。上記2本鎖RNAは、そのすべてがRNAである必要はない。具体的には、その一部がDNAであるものとして、WO02/10374号公報に記載のものを用いることができる。
このRNAインターフェアランス法において標的となる遺伝子(以下これを「標的遺伝子」と称することがある)は、本発明のDNAであれば、いかなるものであってもよい。これらのDNAの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するRNAからなる2本鎖ポリヌクレオチド(以下、これを「2本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある)とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい15bp以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と80%以上の相同性を有することを意味する。
また、解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、2本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を2本鎖ポリヌクレオチド配列とすることにより、該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードするDNAの塩基配列と比較して、解析対象タンパク質をコードするDNAに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害することができる。
ヌクレオチドの鎖長は15bpから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の全長までのいかなる長さでもよいが、15〜500bp程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、30bp以上の長い2本鎖RNAに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており(Mareus, P. I., et al., Interferon, 5: 115-180 (1983))、該2本鎖RNAが細胞内に侵入すると、PKR(dsRNA-responsive protein kinase: Bass, B. L., Nature, 411: 428-429 (2001))を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に2’-5’oligoadenylate synthetase(Bass, B. L., Nature, 411: 428-429(2001))を介してRNase Lの活性化が起こり、細胞内のRNAの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には15〜30bp、好ましくは19〜24bp、さらに好ましくは21bpの2本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。2本鎖ポリヌクレオチドはその全体が2本鎖である必要はなく、5’または3’末端が一部突出したものも含むが、3’末端が2塩基突出したものを用いることが好ましい。2本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する2本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する1本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する1本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
2本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する1本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより2本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、2本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した2本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する1本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
このようにして調製した2本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でRNAに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであればいかなるものであってもよいが、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。好ましい微生物は、農業または工業において使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ(Drosophila)、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能、または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等からであってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞からのような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
被導入体への2本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、2本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口(皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む)、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、2本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、2本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
RNAインターフェアレンスによる本発明のDNAの導入体内での発現抑制により、本発明のDNAがコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
(6)本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ(抗原決定基)として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばEpitope Adviser(富士通九州システムエンジニアリング社製)等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列(ジャンクション部分)等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのN末またはC末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ(抗原決定基)として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばEpitope Adviser(富士通九州システムエンジニアリング社製)等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列(ジャンクション部分)等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのN末またはC末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばBALB/cマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合0.3〜0.5mg/1回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
免疫後、適宜試験的に採血を行ってオクタロニー法、固相酵素免疫検定法(以下、これを「ELISA法」と称することがある)やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる(Milstein, et al., Nature, 256: 495 (1975))ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来等)ミエローマ細胞株であるP3X63−Ag8.653(ATCC:CRL−1580)、P3−NS1/1Ag4.1(理研セルバンク:RCB0095)等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばRPMI1640やイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、あるいはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等に、50%ポリエチレングリコール(PEG)を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法(Zimmermann, U. et al., Naturwissenschaften, 68: 577 (1981))によっても行うことができる。
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が8−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン(HAT)液を含む正常培地(HAT培地)中で5%CO2、37℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したSevere combined immune deficiency(SCID)マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる(Mosier, D. E., et al., Nature, 335: 256-259 (1988); Duchosal, M. A., et al., Nature, 355: 258-262 (1992))。
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからRNAを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一過性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてFab部分とFc部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてFab部分を回収することによって作製することができる。
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有する転写調節活性等を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記(2)で作製したDNA導入体に抗体を接触させ、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
(7)本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能(活性)を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質(以下、これを「調節物質」と称することがある)を得ることができる。
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能(活性)を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質(以下、これを「調節物質」と称することがある)を得ることができる。
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であればいかなるものであってもよい。例えば、まずはじめに本発明のタンパク質とスクリーニングに供する物質(以下、これを「被検物質」と称することがある)とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であればいかなるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記(6)に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ結合し、公知のまたは他のバリアントには結合しない物質についてその影響を解析するか、または公知のあるいは他のバリアントにおいても同様に結合するか否かを同定し、結合した場合にはその影響の相違を解析することによって、対象タンパク質に対する該物質の影響を解析することができる。また、該物質の個体内での分布を検討することにより、対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することができる。
具体的な解析方法としては、例えば、転写調節活性を調節する物質を解析する場合には、(2)に記載したDNA導入体に基質となるタンパク質も同様の方法で導入する。この導入体について選択された物質の存在下/または非存在下で基質となるタンパク質のリン酸化をそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。具体的には、上記(3)に記載の方法等を用いて行うことができる。転写調節活性が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質は転写調節因子の活性化物質として機能する可能性があり、また低下、または阻害された場合には物質は転写調節因子の阻害物質として機能する可能性があると同定できる。
ここで、医薬活性成分の取得を目的として調節物質をスクリーニングするために用いる本発明のDNA、あるいはタンパク質を用いる場合は、上記したヒトのホモログタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってスクリーニングされた物質は、さらに生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。なお、本発明のタンパク質の機能調節物質の評価は、上記した方法に限定されるものではない。
転写調節因子は、癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の分化・運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール三リン酸を生成する機能、神経細胞の発生・分化・増殖・生存維持を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能他、各種細胞の発生、分化、成長、増殖、生存、再生、および、細胞機能等を制御するパスウェイのシグナル伝達機能等、各種シグナル伝達において最終的にDNAに結合して遺伝子の発現制御に関わる。従って、これらシグナル伝達に関わる各種疾患治療剤のスクリーニングの標的とすることができる。本スクリーニング方法により同定できる化合物は、抗ガン剤、糖尿病治療剤、抗炎症剤、神経変性疾患治療剤、心疾患治療剤、不妊治療剤、再生組織誘導剤、アルツハイマー病治療剤、肥満治療剤、糖尿病治療剤、心臓血管疾患治療剤、代謝異常治療剤、食欲不振、過食症などの治療剤等として用いられ得るものである。
また、本発明のタンパク質をコードするDNAは、脳(扁桃核、海馬、黒質、胎児脳)、精巣、気管、成人乳房、軟骨細胞、未分化の神経前駆細胞を含む神経系細胞等の組織、器官または細胞由来のRNAから構築されたcDNAライブラリーよりクローニングされており、取得された本発明のタンパク質は、上記組織または器官等において特有の機能を有している可能性があるので、本発明のタンパク質の機能調節物質は該組織または器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得るものである。
かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
(8)本発明のDNAの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするmRNAの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、(2)に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をELISA等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするmRNA量を、定量的逆転写PCR法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするmRNAの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、(2)に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をELISA等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするmRNA量を、定量的逆転写PCR法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
被検物質としては、(7)に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはmRNA量と比べてその量が増加すれば、この被検物質は本発明のDNAの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、この被検物質は本発明のDNAの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、1〜90重量%の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
(9)本発明のDNA導入動物
上記(1)に記載の、本発明のDNAを含む導入DNAを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のDNAが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後1日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入DNAをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体(仮親)の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のDNAが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したDNAのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
上記(1)に記載の、本発明のDNAを含む導入DNAを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のDNAが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後1日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入DNAをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体(仮親)の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のDNAが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したDNAのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
かくして得られた本発明のDNA導入動物は、この個体を交配し、導入されたDNAが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のDNAが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
(10)本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むDNAの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAまたはその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「DNAチップ」または「DNAアレイ」(DNAマイクロアレイ及びDNAマクロアレイ)と称することがある。これらのプロテインチップ、又はDNAチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やDNA以外に、他のタンパク質やDNAが含まれていてもよい。ここで、対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、DNAアレイには、対象タンパク質をコードするDNA配列のうち、他のバリアントDNAと異なる配列を選択することが好ましい。
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列を有するDNAまたはその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「DNAチップ」または「DNAアレイ」(DNAマイクロアレイ及びDNAマクロアレイ)と称することがある。これらのプロテインチップ、又はDNAチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やDNA以外に、他のタンパク質やDNAが含まれていてもよい。ここで、対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、DNAアレイには、対象タンパク質をコードするDNA配列のうち、他のバリアントDNAと異なる配列を選択することが好ましい。
また、タンパク質やDNAを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非RI的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはDNAの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、DNAチップ、あるいはDNAアレイも、本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びDNAの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。このDNAの塩基配列には、対応するRNAの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするDNAの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、CD−ROM、MO、CD−R、CD−RW、DVD―R、DVD−RAM等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
ヒト皮膚癌組織より、文献(J.Sambrook,et al.,Molecular Cloning Second edition,Cold Spring harbor Laboratory Press(1989))記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+RNAを精製した。
ヒト皮膚癌組織より、文献(J.Sambrook,et al.,Molecular Cloning Second edition,Cold Spring harbor Laboratory Press(1989))記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+RNAを精製した。
上記で取得したpoly(A)+RNAと、ヒト各組織より全RNAとして抽出された市販の各mRNA(クロンテック社製:精巣(#6535−1)、前立腺(#6546−1)、バイオチェイン社製:直腸(#062001))から、オリゴキャップ法(Maruyama, K., et al., Gene, 138: 171-174 (1994))によりcDNAライブラリーをそれぞれ作製した。以下に、ライブラリー名とその由来の関係を示す。
dmc:皮膚癌
prs:前立腺
rct:直腸
tst:精巣
dmc:皮膚癌
prs:前立腺
rct:直腸
tst:精巣
まず、上記RNAをBAP(Bacterial Alkaline Phosphatase)およびTAP(Tobacco Acid Pyrophosphatase)で処理した後に、オリゴキャップリンカー(配列番号11)をRNAライゲースを用いて連結した。このRNA鎖を鋳型としてオリゴdTプライマー(配列番号12)を用いた逆転写反応により第1鎖cDNAを合成し、続いてRNA鎖を分解除去した(鈴木ら、タンパク質 核酸 酵素、41: 603-607 (1996);Suzuki, Y. et al., Gene, 200: 149-156 (1997))。次いで、5’のPCRプライマー(配列番号13)と3’のPCRプライマー(配列番号14)を用いPCR(polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAを増幅し、増幅されたDNA鎖をSfiIにより切断した。
次いで、発現用ベクターであるpME18SFL3(GenBank AB009864)のDraIIIサイトに上記で取得したSfiI切断断片をクローニングし、cDNAライブラリーを作成した。上記で用いたpME18SFL3ベクターは、クローニング部位の上流にSRαプロモーターとSV40 small tイントロンが組み込まれており、またその下流にはSV40ポリ(A)付加シグナル配列が挿入されている。pME18SFL3のクローン化部位は非対称性のDraIIIサイトとなっており、cDNA断片の末端にはこれと相補的なSfiI部位を付加しているので、クローン化したcDNA断片はSRαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長cDNAを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままCOS細胞に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物であるタンパク質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
これらより得たクローンのプラスミドDNAについて、cDNAの5’端または3’端の塩基配列をDNAシーケンシング試薬(Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction KitまたはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit:PE Biosystems社製)を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー(ABI PRISM 3700:PE Biosystems社製)でDNA塩基配列を解析した。
オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのクローンの5’末端の全長性の評価
実施例1で作製したヒトcDNAライブラリーの5’末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知mRNAの配列と比較し、5’末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知mRNA配列より長く5’末端が伸びている場合、または5’末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
実施例1で作製したヒトcDNAライブラリーの5’末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知mRNAの配列と比較し、5’末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知mRNA配列より長く5’末端が伸びている場合、または5’末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
次に、ESTiMateFLによるクローンの評価を行った。ESTiMateFLは、公共データベース中のESTの5’末端配列や3’末端配列との比較によって全長cDNAの可能性の高いクローンを選択するために、ヘリックス研究所の西川・太田らにより開発された方法である。実施例1で解析したcDNAクローンの5’末端や3’末端配列をESTデータベースに登録されている塩基配列と比較し、取得されたcDNAクローンの配列よりも、5’側または3’側へ伸長しているESTが存在する場合には、そのクローンは「全長ではない可能性が高い」と判断した。公共データベース中のEST配列より5’末端が伸長している場合、あるいは5’末端が短いクローンでも、その差が50塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全長とした。
cDNAクローンの塩基配列、アミノ酸配列の解析
実施例2で解析したcDNAクローンの全塩基配列について、BLAST(Basic local alignment search tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990))による相同性検索(homology search)や、HMMER(隠れMarkovモデルによる配列解析手法;Eddy, S. R., Bioinformatics, 14: 755-763 (1998))の機能群のひとつであるHMMPFAMによるタンパク質特徴検索(profile search:http://pfam.wustl.edu)を行い、各cDNAクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが挿入・欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
実施例2で解析したcDNAクローンの全塩基配列について、BLAST(Basic local alignment search tool; Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990))による相同性検索(homology search)や、HMMER(隠れMarkovモデルによる配列解析手法;Eddy, S. R., Bioinformatics, 14: 755-763 (1998))の機能群のひとつであるHMMPFAMによるタンパク質特徴検索(profile search:http://pfam.wustl.edu)を行い、各cDNAクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが挿入・欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
転写調節活性の測定(標的転写調節領域に対する結合活性の解析)
(1)無細胞タンパク質合成系を用いた本発明のタンパク質の調製
実施例3で転写調節活性を有すると推定されたcDNAクローンについて、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質が転写調節活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
(1)無細胞タンパク質合成系を用いた本発明のタンパク質の調製
実施例3で転写調節活性を有すると推定されたcDNAクローンについて、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質が転写調節活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
実施例3で転写調節活性を有すると推定されたcDNAを含むプラスミドに対して、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14652-14657 (2002)に記載されている方法に準じてPCR反応を行い、転写用のDNA断片を調製した。このDNAを鋳型として、SP6 RNAポリメラーゼ(Promega社製)を用いて転写を行い、得られたmRNAをフェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column(Amersham Pharmacia Biotech社製)によって精製した。
上記で精製されたmRNAを用いたタンパク合成は、特開2002−204689号公報、およびProc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002)に準じた重層法による無細胞タンパク質合成系を用いて行った。重層法無細胞タンパク質合成系にて使用する翻訳溶液(25μl)には、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:559-564(2000)に従って調製された6μlの小麦胚芽抽出液および上述したmRNA(0.02nmol)を添加して用い、その組成は24mM Hepes/KOH(pH7.8)、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM creatine phosphate、10μg creatine kinase、ribonuclease inhibitor(20units)、2mM DTT、0.4mM spermidine、0.3mM L型アミノ酸(20種)、2.7mM magnesium acetate、100mM potassium acetate、5μg小麦胚芽由来tRNA、0.05% Nonidet P−40および0.005% NaN3から成る。また翻訳用緩衝液は31.3mM HEPES/KOH(pH7.8)、2.67mM Mg(OAc)2、93mM KOAc、1.2mM ATP、0.257mM GTP、16mM creatine phosphate、2.1mM DTT、0.41mM spermidine、0.3mML型アミノ酸(20種)、1μM E−64、0.005% NaN3、0.05% NP−40から成る。重層法による無細胞タンパク質合成は、まず96穴プレートに翻訳用緩衝液を125μlずつ加えて、この翻訳用緩衝液が入ったそれぞれの穴に底からゆっくりと翻訳溶液を重層し、このプレートを26℃インキュベーターで保温して16時間反応させることにより行った。
(2)標的配列またはコンセンサス標的配列を有するDNAを固定化したセンサーチップを用いたSPR測定方法
BIAapplications handbook, chapter4.4の記載に従い、センサーチップ表面にビオチン化した以下の53種類の二重鎖DNAを別々に固定化した。センサーチップはSAタイプ(ビアコア社製)を用い、SPR測定および解析は、BIACORE3000(ビアコア社製)を用いた。
BIAapplications handbook, chapter4.4の記載に従い、センサーチップ表面にビオチン化した以下の53種類の二重鎖DNAを別々に固定化した。センサーチップはSAタイプ(ビアコア社製)を用い、SPR測定および解析は、BIACORE3000(ビアコア社製)を用いた。
既知の転写調節因子と設計した標的配列またはコンセンサス標的配列の関係、およびこれらの転写調節因子の機能は、次の通りである。
[1]v−jun、c−jun、junB、junD、dJRA、c−fos、fosB1、fosB2、Fra−1、LRF−1、v−maf、mafG、NF−E2 p45、aNF−E2、fNF−E2、Nrf short form、GCN4、yAP−1、CREB−2、ATF−3、CRE−BP1、CRE−BP3、ATF−a、CREB−341、CREB−327、CREM、dCREB2、dCREB2−b、dCREB2−c、dCREB2−d、dCREB2−q、dCREB2−r、dCREB2−sのコンセンサス標的配列:TGATGACGT(配列番号15)
[2]C/EBPα、C/EBPβ、p34C/EBPβ、CHOP−10のコンセンサス標的配列:AAGTGGCGAAAGAGACA(配列番号16)
上記の転写調節因子は、例えば、インシュリン抵抗性糖尿病、断続的ケトン尿症、多剤耐性の誘導に関与していることが知られている。
[3]VBP、Hlf、CPRF−2、EmBP−1b、EmBP−1b、GBF1、GBF2、GBF3、CPRF−1、TAF−1、HBP−1a、GBF9、GBF1、GBF12、CPRF−3、TGA1a、TGA1b、O2、STE4のコンセンサス標的配列:AGAAGCACGTGG(配列番号17)
[4]OPI1、E2A、E47、ITF−2/SEF2−1B、SEF−1A、MyoD、p42Tal−1のコンセンサス標的配列:AACAGATGGT(配列番号18)
[5]HEN−1の標的配列:GGGGCGCAGCTGCGGCCC(配列番号19)
[6]AhR、Arntのコンセンサス標的配列:GGGGATTGCGTG(配列番号20)
上記の転写調節因子は、成体ではほとんどの細胞や組織において普遍的に発現が認められ、例えば、ダイオキシンによる薬物代謝酵素の誘導に関与していることが知られている。[7]USFの標的配列:GTCACGTGGT(配列番号21)
[8]NF−1A1、NF−1A1.1、NF−1A6、NF−1B1、NF−1B1、NF−1B2、NF−1C2/CTF−2、CTF−4、CTF−6のコンセンサス標的配列:CTGTGGGGTTTGGCACGGGGCCA(配列番号22)
上記の転写調節因子は、ハウスキーピング遺伝子の転写に関与するだけではなく、例えば、TGF−βによる転写の活性化、インスリンによるグルコーストランスポーター遺伝子の発現抑制など、多くの細胞特異的な遺伝子の転写の促進や抑制に関与していることが示されている。また、癌遺伝子の機能と相互作用している可能性も示唆されている。
[9]RF−X1の標的配列:GGTAACATAGCAAC(配列番号23)
[10]AP2αA/AP−2α1、AP2α2、AP2α3、AP2α4、AP2αB、AP2β、AP2γのコンセンサス標的配列:CGCCCCCCGGCG(配列番号24)
[11]GRの標的配列:GGTACAAAATGTTCT(配列番号25)
上記の転写調節因子は、例えば、Glucocorticoidの放出の促進、ストレス応答、 胎児におけるGlucocorticoid 要求性、肺形成不全、血管新生に関連する癌、妊娠初期の子宮の不適応症、成長ホルモン欠損症、胎児の子宮内成長遅滞、子宮低酸素症、骨形成関連疾患、vitamin Dの誘導等に関与していることが知られている。
[12]ARの標的配列:AACATTATGTTCT(配列番号26)
[13]ERの標的配列:AAGGGAAAATGACCCCC(配列番号27)
[14]RXR−αの標的配列:GGTCATAGGGGT(配列番号28)
上記の転写調節因子は、若年発症糖尿病、肥満、肝臓における薬物代謝、癌、低HDL・低アポ蛋白、アテローム硬化症、下痢、消化不良、栄養失調、多発性硬化症、RA、SLE、インシュリン依存性糖尿病、クローン病、喘息、高HDL、低βリポ蛋白症、高αリポ蛋白症、アミロイド症、動脈硬化等循環器疾患の誘導等に関与していることが知られている。
[15]PPARαの標的配列:CTAGGGCAAAGGTCA(配列番号29)
前述のように、上記の転写調節因子は、主として肝臓、腎臓、褐色脂肪細胞などの脂肪消費臓、その他心筋や消化管に発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパクの生成などに関与し、生活習慣病発症、例えば糖尿病や肥満等と関連する内分泌・糖・脂質代謝、さらには血管機能や炎症などの循環器系や発がん機構に関与する種々の標的遺伝子の発現を調節している疾患関連転写調節因子として知られている
[16]PPARγの標的配列:GGTCAAAGGTCA(配列番号30)
前述のように、上記の転写調節因子は、脂肪細胞、脂肪組織、免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている。
[17]COUP−TF1、HNF−4α1、HNF−4α2の標的配列:TGAACTTTGA(配列番号31)
[18]CF1の標的配列:GGGGTCACC(配列番号32)
[19]GATA−1、GATA−2、GATA−3、GATA−4のコンセンサス標的配列:CCAGATAAGG(配列番号33)
上記の転写調節因子は、血球系細胞、神経系、心臓および腸管などの内臓に発現しており、血球系細胞の分化、形成、維持、増殖およびアポトーシス、白血病、精子形成、神経系細胞の分化および形成、臓器形成、等に関与していることが示されている。
[20]AREA/NIT−2の標的配列:TATCTC(配列番号34)
[21]Sp1の標的配列:GGGGGGGGGG(配列番号35)
上記の転写調節因子は、ハウスキーピング遺伝子の転写だけでなく、癌遺伝子やウイルス遺伝子の転写にも関与していることが示されている
[22]YY1の標的配列:CGGCCATCTTGGCT(配列番号36)
[23]Egr−1、Egr−2、Egr−3のコンセンサス標的配列:TGCGTGGGCG(配列番号37)
[24]Snailの標的配列:CACCTGTTTTCA(配列番号38)
[25]CF2−IIの標的配列:GTATATATA(配列番号39)
[26]Evi−1の標的配列:AGATAAGATAA(配列番号40)
[27]Ikaros、MZF−1のコンセンサス標的配列:TTGGGAGG(配列番号41)[28]Tramtrack69Kの標的配列:GGACCTGC(配列番号42)
[29]HOX9の標的配列:TGACAGTTTAACGA(配列番号43)
[30]CDPの標的配列:CCAATAATCGAT(配列番号44)
[31]HNF−1Aの標的配列:GGTTAATGATTAACCAC(配列番号45)
[32]Nkx−2.2、Nkx−2.5、TTF−1のコンセンサス標的配列:TTAAGTGGTT(配列番号46)
[33]Oct−1A、Oct−1B、Oct−1Cのコンセンサス標的配列:ATGCAAAT(配列番号47)
[34]Oct−2、Oct−2.1/Oct−2Bのコンセンサス標的配列:TATTTGCAT(配列番号48)
[35]Pax−3、Pax−6のコンセンサス標的配列:CGTCACGCTTGA(配列番号49)
[36]Pax−1の標的配列:CCGTTCCGCTCTAGATAT(配列番号50)
[37]HSF1(short)、HSF2、dHSF、fungal HSFのコンセンサス標的配列:AGAAAAGAAAAGAAA(配列番号51)
上記の転写調節因子は、ほとんどの細胞や組織において普遍的に発現が認められ、例えば、熱ショック応答に関与していることが知られている。
[38]c−Myb、A−Myb、v−Myb、P(long)、P(short)、C1(long)、C1(short)のコンセンサス標的配列:AACGGGCCC(配列番号52)
[39]c−Ets−1_p54、Ets−1_δiV/VII、Ets−2、Elk−1、SAP−1、SAP−1b、Erg−1、p55erg、Fli−1b、E4TF1−60/GABP−α、E74Aのコンセンサス標的配列:GACAGGAAGTG(配列番号53)
上記の転写調節因子は、癌、サーカディアンリズム関連疾患の誘導等に関与していることが知られている。
[40]IRF−1、IRF−2のコンセンサス標的配列:GAAAAGCGAAACC(配列番号54)
[41]p50の標的配列:GGGGACTTTCC(配列番号55)
[42]NF−ATc、NF−Atpのコンセンサス標的配列:AGGAAAA(配列番号56)
[43]p91(STAT1)、p84のコンセンサス標的配列:GAATTCCGGGAAATGG(配列番号57)
上記の転写調節因子は、各種インターフェロンにより刺激、活性化され、ウイルスや細菌感染の防御に関与していることが知られている。
[44]STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6のコンセンサス標的配列:TTTCCCGGGAAATG(配列番号58)
上記の転写調節因子は、各種インターフェロンや各種インターロイキンなどのサイトカインにより刺激、活性化され、癌、自己免疫疾患、炎症に関与していることが知られている。
[45]p53の標的配列:GGACATGCCCGGGCATGTC(配列番号59)
前述のように、上記の転写調節因子は、癌抑制遺伝子であることが知られており、アポトーシスを起こすシグナル伝達に関与していることと、細胞がDNA修復を行う間、細胞周期を停止させる機能を有することから、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
[46]MEF−2Aの標的配列:CTCTAAAAATA(配列番号60)
[47]SRFの標的配列:CCATATATGGACAT(配列番号61)
[48]E2の標的配列:AACCAAAAACGGTAA(配列番号62)
[49]TBPの標的配列:TATAAAA(配列番号63)
[50]SRY、Sox−5、Sox−9のコンセンサス標的配列:AAAAAACAATAGGG(配列番号64)
上記の転写調節因子は、神経系の発生・分化、軟骨形成、性分化などの発生・分化に関与していることが知られている。
[51]mat−Mcの標的配列:TCATTGTT(配列番号65)
[52]CP1A、CP1B、CBF−Cのコンセンサス標的配列:CTGATTGGCTACC(配列番号66)
[53]AML1aの標的配列:TGTGGT(配列番号67)
[1]v−jun、c−jun、junB、junD、dJRA、c−fos、fosB1、fosB2、Fra−1、LRF−1、v−maf、mafG、NF−E2 p45、aNF−E2、fNF−E2、Nrf short form、GCN4、yAP−1、CREB−2、ATF−3、CRE−BP1、CRE−BP3、ATF−a、CREB−341、CREB−327、CREM、dCREB2、dCREB2−b、dCREB2−c、dCREB2−d、dCREB2−q、dCREB2−r、dCREB2−sのコンセンサス標的配列:TGATGACGT(配列番号15)
[2]C/EBPα、C/EBPβ、p34C/EBPβ、CHOP−10のコンセンサス標的配列:AAGTGGCGAAAGAGACA(配列番号16)
上記の転写調節因子は、例えば、インシュリン抵抗性糖尿病、断続的ケトン尿症、多剤耐性の誘導に関与していることが知られている。
[3]VBP、Hlf、CPRF−2、EmBP−1b、EmBP−1b、GBF1、GBF2、GBF3、CPRF−1、TAF−1、HBP−1a、GBF9、GBF1、GBF12、CPRF−3、TGA1a、TGA1b、O2、STE4のコンセンサス標的配列:AGAAGCACGTGG(配列番号17)
[4]OPI1、E2A、E47、ITF−2/SEF2−1B、SEF−1A、MyoD、p42Tal−1のコンセンサス標的配列:AACAGATGGT(配列番号18)
[5]HEN−1の標的配列:GGGGCGCAGCTGCGGCCC(配列番号19)
[6]AhR、Arntのコンセンサス標的配列:GGGGATTGCGTG(配列番号20)
上記の転写調節因子は、成体ではほとんどの細胞や組織において普遍的に発現が認められ、例えば、ダイオキシンによる薬物代謝酵素の誘導に関与していることが知られている。[7]USFの標的配列:GTCACGTGGT(配列番号21)
[8]NF−1A1、NF−1A1.1、NF−1A6、NF−1B1、NF−1B1、NF−1B2、NF−1C2/CTF−2、CTF−4、CTF−6のコンセンサス標的配列:CTGTGGGGTTTGGCACGGGGCCA(配列番号22)
上記の転写調節因子は、ハウスキーピング遺伝子の転写に関与するだけではなく、例えば、TGF−βによる転写の活性化、インスリンによるグルコーストランスポーター遺伝子の発現抑制など、多くの細胞特異的な遺伝子の転写の促進や抑制に関与していることが示されている。また、癌遺伝子の機能と相互作用している可能性も示唆されている。
[9]RF−X1の標的配列:GGTAACATAGCAAC(配列番号23)
[10]AP2αA/AP−2α1、AP2α2、AP2α3、AP2α4、AP2αB、AP2β、AP2γのコンセンサス標的配列:CGCCCCCCGGCG(配列番号24)
[11]GRの標的配列:GGTACAAAATGTTCT(配列番号25)
上記の転写調節因子は、例えば、Glucocorticoidの放出の促進、ストレス応答、 胎児におけるGlucocorticoid 要求性、肺形成不全、血管新生に関連する癌、妊娠初期の子宮の不適応症、成長ホルモン欠損症、胎児の子宮内成長遅滞、子宮低酸素症、骨形成関連疾患、vitamin Dの誘導等に関与していることが知られている。
[12]ARの標的配列:AACATTATGTTCT(配列番号26)
[13]ERの標的配列:AAGGGAAAATGACCCCC(配列番号27)
[14]RXR−αの標的配列:GGTCATAGGGGT(配列番号28)
上記の転写調節因子は、若年発症糖尿病、肥満、肝臓における薬物代謝、癌、低HDL・低アポ蛋白、アテローム硬化症、下痢、消化不良、栄養失調、多発性硬化症、RA、SLE、インシュリン依存性糖尿病、クローン病、喘息、高HDL、低βリポ蛋白症、高αリポ蛋白症、アミロイド症、動脈硬化等循環器疾患の誘導等に関与していることが知られている。
[15]PPARαの標的配列:CTAGGGCAAAGGTCA(配列番号29)
前述のように、上記の転写調節因子は、主として肝臓、腎臓、褐色脂肪細胞などの脂肪消費臓、その他心筋や消化管に発現が認められ、脂肪酸酸化、ケトン体生成、アポリポタンパクの生成などに関与し、生活習慣病発症、例えば糖尿病や肥満等と関連する内分泌・糖・脂質代謝、さらには血管機能や炎症などの循環器系や発がん機構に関与する種々の標的遺伝子の発現を調節している疾患関連転写調節因子として知られている
[16]PPARγの標的配列:GGTCAAAGGTCA(配列番号30)
前述のように、上記の転写調節因子は、脂肪細胞、脂肪組織、免疫系臓器、副腎、小腸で発現し、脂肪細胞の分化誘導や脂肪合成に重要な役割を担っていると考えられている。
[17]COUP−TF1、HNF−4α1、HNF−4α2の標的配列:TGAACTTTGA(配列番号31)
[18]CF1の標的配列:GGGGTCACC(配列番号32)
[19]GATA−1、GATA−2、GATA−3、GATA−4のコンセンサス標的配列:CCAGATAAGG(配列番号33)
上記の転写調節因子は、血球系細胞、神経系、心臓および腸管などの内臓に発現しており、血球系細胞の分化、形成、維持、増殖およびアポトーシス、白血病、精子形成、神経系細胞の分化および形成、臓器形成、等に関与していることが示されている。
[20]AREA/NIT−2の標的配列:TATCTC(配列番号34)
[21]Sp1の標的配列:GGGGGGGGGG(配列番号35)
上記の転写調節因子は、ハウスキーピング遺伝子の転写だけでなく、癌遺伝子やウイルス遺伝子の転写にも関与していることが示されている
[22]YY1の標的配列:CGGCCATCTTGGCT(配列番号36)
[23]Egr−1、Egr−2、Egr−3のコンセンサス標的配列:TGCGTGGGCG(配列番号37)
[24]Snailの標的配列:CACCTGTTTTCA(配列番号38)
[25]CF2−IIの標的配列:GTATATATA(配列番号39)
[26]Evi−1の標的配列:AGATAAGATAA(配列番号40)
[27]Ikaros、MZF−1のコンセンサス標的配列:TTGGGAGG(配列番号41)[28]Tramtrack69Kの標的配列:GGACCTGC(配列番号42)
[29]HOX9の標的配列:TGACAGTTTAACGA(配列番号43)
[30]CDPの標的配列:CCAATAATCGAT(配列番号44)
[31]HNF−1Aの標的配列:GGTTAATGATTAACCAC(配列番号45)
[32]Nkx−2.2、Nkx−2.5、TTF−1のコンセンサス標的配列:TTAAGTGGTT(配列番号46)
[33]Oct−1A、Oct−1B、Oct−1Cのコンセンサス標的配列:ATGCAAAT(配列番号47)
[34]Oct−2、Oct−2.1/Oct−2Bのコンセンサス標的配列:TATTTGCAT(配列番号48)
[35]Pax−3、Pax−6のコンセンサス標的配列:CGTCACGCTTGA(配列番号49)
[36]Pax−1の標的配列:CCGTTCCGCTCTAGATAT(配列番号50)
[37]HSF1(short)、HSF2、dHSF、fungal HSFのコンセンサス標的配列:AGAAAAGAAAAGAAA(配列番号51)
上記の転写調節因子は、ほとんどの細胞や組織において普遍的に発現が認められ、例えば、熱ショック応答に関与していることが知られている。
[38]c−Myb、A−Myb、v−Myb、P(long)、P(short)、C1(long)、C1(short)のコンセンサス標的配列:AACGGGCCC(配列番号52)
[39]c−Ets−1_p54、Ets−1_δiV/VII、Ets−2、Elk−1、SAP−1、SAP−1b、Erg−1、p55erg、Fli−1b、E4TF1−60/GABP−α、E74Aのコンセンサス標的配列:GACAGGAAGTG(配列番号53)
上記の転写調節因子は、癌、サーカディアンリズム関連疾患の誘導等に関与していることが知られている。
[40]IRF−1、IRF−2のコンセンサス標的配列:GAAAAGCGAAACC(配列番号54)
[41]p50の標的配列:GGGGACTTTCC(配列番号55)
[42]NF−ATc、NF−Atpのコンセンサス標的配列:AGGAAAA(配列番号56)
[43]p91(STAT1)、p84のコンセンサス標的配列:GAATTCCGGGAAATGG(配列番号57)
上記の転写調節因子は、各種インターフェロンにより刺激、活性化され、ウイルスや細菌感染の防御に関与していることが知られている。
[44]STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6のコンセンサス標的配列:TTTCCCGGGAAATG(配列番号58)
上記の転写調節因子は、各種インターフェロンや各種インターロイキンなどのサイトカインにより刺激、活性化され、癌、自己免疫疾患、炎症に関与していることが知られている。
[45]p53の標的配列:GGACATGCCCGGGCATGTC(配列番号59)
前述のように、上記の転写調節因子は、癌抑制遺伝子であることが知られており、アポトーシスを起こすシグナル伝達に関与していることと、細胞がDNA修復を行う間、細胞周期を停止させる機能を有することから、癌等の治療薬のターゲット分子として注目されている。
[46]MEF−2Aの標的配列:CTCTAAAAATA(配列番号60)
[47]SRFの標的配列:CCATATATGGACAT(配列番号61)
[48]E2の標的配列:AACCAAAAACGGTAA(配列番号62)
[49]TBPの標的配列:TATAAAA(配列番号63)
[50]SRY、Sox−5、Sox−9のコンセンサス標的配列:AAAAAACAATAGGG(配列番号64)
上記の転写調節因子は、神経系の発生・分化、軟骨形成、性分化などの発生・分化に関与していることが知られている。
[51]mat−Mcの標的配列:TCATTGTT(配列番号65)
[52]CP1A、CP1B、CBF−Cのコンセンサス標的配列:CTGATTGGCTACC(配列番号66)
[53]AML1aの標的配列:TGTGGT(配列番号67)
まず、上記53種類の標的配列またはコンセンサス標的配列(配列番号15〜配列番号67)を有するDNAに関し、それぞれの5’側にビオチンが付加したDNAとその相補な塩基配列を有するDNAを定法により個別にアニーリングさせ、合計53種類の二本鎖化したDNAを調製した。一方、解析に用いるセンサーチップは、1枚に付きフローセルが4分割されている。フローセル1は何も固定化せずコントロール区として用い、フローセル2、3および4はそれぞれ上記で調製した二本鎖DNAを3種類づつ固定化した。センサーチップのDNAの固定化密度を一定にするため、DNA固定化によるSPR応答値の上昇(ΔRU−DNA)をDNA分子量(MW)で割った値(D)が各フローセルで一定になるようにΔRU−DNAを調節した。同様の要領で、残りのDNAについても固定化を行った。
以上のようにセンサーチップの作製ができた後、クローンのcDNAがコードする本発明のタンパク質との結合活性解析を行った。SPR法によるDNAとタンパク質間の結合活性解析は既に多数報告がある。本実施例では、Molecular Microbiology, 36(3), 557-569(2000)の測定条件を参考にして行った。まず、フローセル1−2−3−4が直列につながった流路に設定しておく。そこにランニングバッファーを一定流量(5μL/min)で流しておき、SPR測定値を安定させた後、各フローセルのベースライン値(SPR−baseline)を測定する。次に、タンパク質溶液を同流量で流し、タンパク質分子とDNA鎖との間で特異的結合を形成させる。一定時間注入後、各フローセルのSPR応答値(SPR−bound)を測定した。
(4)SPR法により得られた測定結果の解析方法
SPR応答値からベースライン値を差し引き([SPR−bound]−[SPR−baseline])することにより、真の結合量(B)を求め、さらに、標準化した値(nB)を求めた。
SPR応答値からベースライン値を差し引き([SPR−bound]−[SPR−baseline])することにより、真の結合量(B)を求め、さらに、標準化した値(nB)を求めた。
測定結果より、本発明のcDNAによりコードされるタンパク質(配列番号6〜10)は、前記[1]〜[53]の計53種類の標的配列またはコンセンサス標的配列(配列番号15〜配列番号67)を有するDNAの少なくとも一つに対して結合活性を有していることがわかった
転写調節活性の測定(疾患関連転写調節因子に対する調節作用活性の解析)
(1)無細胞タンパク質合成系を用いた本発明のタンパク質の調製
本発明のcDNAがコードするタンパク質につき、さらに疾患関連転写調節因子に対する調節作用活性を解析した。各クローンのcDNAがコードするタンパク質は、実施例4(1)の方法に準じて調製した。
(1)無細胞タンパク質合成系を用いた本発明のタンパク質の調製
本発明のcDNAがコードするタンパク質につき、さらに疾患関連転写調節因子に対する調節作用活性を解析した。各クローンのcDNAがコードするタンパク質は、実施例4(1)の方法に準じて調製した。
(2)解析用プレートの調製
転写調節因子の疾患関連転写調節因子に対する調節作用活性の測定系に用いるDNAは、疾患関連転写調節因子が結合する塩基配列を有することを特徴とし、5’側にビオチン(Bioと表記する)が付加した一本鎖DNA(oligo-Aと記載する)とその相補的配列を有する一本鎖DNA(oligo-B)と記載するをアニーリングさせることにより、二本鎖化したDNAを用いた。以下に用いたDNA配列を記載する。
転写調節因子の疾患関連転写調節因子に対する調節作用活性の測定系に用いるDNAは、疾患関連転写調節因子が結合する塩基配列を有することを特徴とし、5’側にビオチン(Bioと表記する)が付加した一本鎖DNA(oligo-Aと記載する)とその相補的配列を有する一本鎖DNA(oligo-B)と記載するをアニーリングさせることにより、二本鎖化したDNAを用いた。以下に用いたDNA配列を記載する。
疾患関連転写調節因子PPARγが認識する配列として、配列番号68と配列番号69を含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5´- Bio-GGAACTAGGTCAAAGGTCATCCCCT-3´(配列番号68)
oligo-B;3´-CCTTGATCCAGTTTCCAGTAGGGGA-5´(配列番号69)
oligo-A;5´- Bio-GGAACTAGGTCAAAGGTCATCCCCT-3´(配列番号68)
oligo-B;3´-CCTTGATCCAGTTTCCAGTAGGGGA-5´(配列番号69)
疾患関連転写調節因子p53が認識する配列として、配列番号70と配列番号71を含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5´-Bio-CTTGGACATGCCCGGGCATGTCCCTC-3´(配列番号70)
oligo-B;3´-GAACCTGTACGGGCCCGTACAGGGAG-5´(配列番号71)
oligo-A;5´-Bio-CTTGGACATGCCCGGGCATGTCCCTC-3´(配列番号70)
oligo-B;3´-GAACCTGTACGGGCCCGTACAGGGAG-5´(配列番号71)
疾患関連転写調節因子NFκBが認識する配列として、配列番号72と配列番号73を含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5´-Bio-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3´(配列番号72)
oligo-B;3´-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5´(配列番号73)
oligo-A;5´-Bio-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3´(配列番号72)
oligo-B;3´-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5´(配列番号73)
疾患関連転写調節因子AP−1が認識する配列として、配列番号74と配列番号75含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5´-Bio-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3´(配列番号74)
oligo-B;3´-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5´(配列番号75)
oligo-A;5´-Bio-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3´(配列番号74)
oligo-B;3´-GCGAACTACTCAGTCGGCCTT-5´(配列番号75)
疾患関連転写調節因子HIF−1が認識する配列として、配列番号76と配列番号77を含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5'-Bio-GATCGCCCTACGTGCTGTCTCAGATC-3'(配列番号76)
oligo-B;3'-CTAGCGGGATGCACGACAGAGTCTAG-5'(配列番号77)
oligo-A;5'-Bio-GATCGCCCTACGTGCTGTCTCAGATC-3'(配列番号76)
oligo-B;3'-CTAGCGGGATGCACGACAGAGTCTAG-5'(配列番号77)
疾患関連転写調節因子CREBが認識する配列として、配列番号78と配列番号79を含むビオチン化DNAをアニーリングさせた二本鎖DNA
oligo-A;5´-Bio-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3´(配列番号78)
oligo-B;3´-TCTCTAACGGACTGCAGTCTCTCGATC-5´(配列番号79)
oligo-A;5´-Bio-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3´(配列番号78)
oligo-B;3´-TCTCTAACGGACTGCAGTCTCTCGATC-5´(配列番号79)
上記によって作成した二本鎖DNAを固定する固相担体として、BioTechniques ,32:1168-1177(2002)の方法に準じてストレプトアビジンをコートした96ウェルプレート{ビオチン結合能20ng/ウェル(80 pmol/ウェル)、ストレプトアビジンコートエリア300μl}またはTransAMキット(ACTIVE MOTIF社)もしくはBD Mercury TransFactorキットに添付のプレートを適宜使用した。
(3)PPARγに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはPPARγを含むPMA処理THP−1細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl,20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、4% glycerol、50mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、10μg/ml Herring sperm}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはPMA処理THP−1細胞核抽出溶液1μl,9μl希釈溶液,35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、PPARγが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。
解析試料としてはPPARγを含むPMA処理THP−1細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl,20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、4% glycerol、50mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、10μg/ml Herring sperm}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはPMA処理THP−1細胞核抽出溶液1μl,9μl希釈溶液,35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、PPARγが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。
この後洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、10mg/ml BSA}に溶解した抗PPARヤギ抗体(0.2μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液によって充分な洗浄を行ない、抗体希釈液によって1000倍に希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗ヤギIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液によって充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm,リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
(4)p53に対する調節作用活性の解析
解析試料としては活性化p53を含むH2O2処理MCF−7細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{20mM Hepes(pH7.5)、10% glycerol、5mM KCl、0.5mM EDTA、5mM MgCl2、1mM DTT、0.17μg/ml poly[d(I−C)]}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはH2O2処理MCF−7細胞核抽出溶液1μl、9μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、p53が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、10mg/ml BSA}に溶解した抗p53ウサギ抗体(0.2μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
解析試料としては活性化p53を含むH2O2処理MCF−7細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{20mM Hepes(pH7.5)、10% glycerol、5mM KCl、0.5mM EDTA、5mM MgCl2、1mM DTT、0.17μg/ml poly[d(I−C)]}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはH2O2処理MCF−7細胞核抽出溶液1μl、9μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、p53が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、10mg/ml BSA}に溶解した抗p53ウサギ抗体(0.2μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
この後洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗ウサギIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm、リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
(5)NFκBに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはNFκBを含むTNF−α処理HeLa細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、350mM NaCl、20% glycerol、1% Igepal−CA630、1mM MgCl2, 0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、5mM DTT}と混合後、25μlの反応溶液{4mM Hepes(pH7.5)、8% glycerol、120mM KCl、1% BSA、2mM DTT、10μg/ml Herring sperm}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはTNF−α処理HeLa細胞核抽出溶液1μl,19μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、NFκBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。
解析試料としてはNFκBを含むTNF−α処理HeLa細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、350mM NaCl、20% glycerol、1% Igepal−CA630、1mM MgCl2, 0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、5mM DTT}と混合後、25μlの反応溶液{4mM Hepes(pH7.5)、8% glycerol、120mM KCl、1% BSA、2mM DTT、10μg/ml Herring sperm}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはTNF−α処理HeLa細胞核抽出溶液1μl,19μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、NFκBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。
この後洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1%Tween 20}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween20}に溶解した抗NFκB抗体(0.2μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液1000倍で希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1%DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm,リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
(6)AP−1に対する調節作用活性の解析
解析試料としては活性化AP−1を含むPMAおよびInomycin処理WI−38細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate,1mM DTT}と混合後、25μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、 12% glycerol、8mM NaCl、0.2mM EDTA, 0.1% BSA、1mM DTT、0.17μg/ml poly[d(I−C)]および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としては活性化AP−1を含むPMAおよびInomycin処理WI−38細胞核抽出溶液1μl、19μl希釈溶液、25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液、25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、AP−1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、1% BSA}に溶解した抗リン酸化−c−Jun抗体(0.4μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
解析試料としては活性化AP−1を含むPMAおよびInomycin処理WI−38細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate,1mM DTT}と混合後、25μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、 12% glycerol、8mM NaCl、0.2mM EDTA, 0.1% BSA、1mM DTT、0.17μg/ml poly[d(I−C)]および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としては活性化AP−1を含むPMAおよびInomycin処理WI−38細胞核抽出溶液1μl、19μl希釈溶液、25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液、25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、AP−1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、1% BSA}に溶解した抗リン酸化−c−Jun抗体(0.4μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1% DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm,リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
(7)HIF−1に対する調節作用活性の解析
解析試料としてはHIF−1を含むCoCl2処理Cos−7細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、5% glycerol、50mM NaCl、1mM EDTA、10mg/ml BSA, 1mM DTT}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはHIF−1を含むCoCl2処理Cos−7細胞核抽出溶液1μl、9μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液,35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの,測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、HIF−1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、10mg/ml BSA}に溶解した抗HIF−1マウス抗体(0.25μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
解析試料としてはHIF−1を含むCoCl2処理Cos−7細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを9μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT}と混合後、35μlの反応溶液{10mM Hepes(pH7.5)、5% glycerol、50mM NaCl、1mM EDTA、10mg/ml BSA, 1mM DTT}および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはHIF−1を含むCoCl2処理Cos−7細胞核抽出溶液1μl、9μl希釈溶液、35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては10μl希釈溶液,35μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの,測定ブランク用試料としては10μl希釈溶液および40μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、HIF−1が認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、50mM NaCl、2.7mM KCl、10mg/ml BSA}に溶解した抗HIF−1マウス抗体(0.25μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。
この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗マウスIgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1% DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させ発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm、リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
(8)CREBに対する調節作用活性の解析
解析試料としてはCREBを含むForskolin処理WI−38細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT)と混合後、25μlの反応溶液(10mM Hepes(pH7.5)、4% glycerol、50mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、1% BSA、1mM DTT、10μg/ml Herring sperm)および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはForskolin処理WI−38細胞核抽出溶液1μl,19μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、CREBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で3時間反応させた。
解析試料としてはCREBを含むForskolin処理WI−38細胞核抽出溶液(2.5mg/ml ACTIVE MOTIF社)1μlを19μlの希釈溶液{20mM Hepes(pH7.5)、400mM NaCl、20% glycerol、0.1mM EDTA、10mM NaF、10μM Na2MoO4、1mM NaVO3、10mM pNPP、10mM b−glycerophosphate、1mM DTT)と混合後、25μlの反応溶液(10mM Hepes(pH7.5)、4% glycerol、50mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、1% BSA、1mM DTT、10μg/ml Herring sperm)および実施例5(1)の方法によって調製した本発明のタンパク質を含むコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。陽性試料としてはForskolin処理WI−38細胞核抽出溶液1μl,19μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したものを用いた。また陰性試料としては20μl希釈溶液,25μl反応溶液および本発明のタンパク質を含まないコファクター溶液5μlを混合したもの、測定ブランク用試料としては20μl希釈溶液および30μl反応溶液を混合したものを用いた。各試料は混合後室温で30分反応させた。次に実施例5(2)によって作成した、CREBが認識する二本鎖DNAを結合させた96ウェルプレートに対し、1ウェルあたり上記試料50μlずつを添加し室温で3時間反応させた。
この後、洗浄用緩衝液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、151mM NaCl、0.1% Tween 20、2.7mM KCl}を用いてウェルを充分な洗浄を行い、抗体希釈液{10mM phosphate buffer(pH7.5)、151mM NaCl、 2.7mM KCl、1% BSA}に溶解した抗CREB抗体(0.2μg/ml)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。この後、洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行ない、抗体希釈液で1000倍に希釈したHRP(西洋わさびペルオキシターゼ)標識抗IgG抗体を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で1時間反応させた。洗浄用緩衝液で充分な洗浄を行なった後、発色用基質(TMB)を含む1% DMSO溶液を100μlずつウェルに添加し室温で反応させて発色を行なった。この後0.5M硫酸溶液を100μlずつウェルに添加して反応を止め、測定波長450nm、リファレンス波長655nmで測定を行なった。解析結果は、陽性試料と陰性試料測定値の差に対する解析試料測定値と陽性試料測定値の差の割合を百分率(%)で表示できる。すなわち{(解析試料値―陽性試料値)/(陽性試料値―陰性試料値)}×100で表記できる。
各cDNAクローンの解析結果
(1)dmc02806(配列番号1、6)
dmc02806(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号1に示すように、1944塩基から成り、そのうち塩基番号32から1060までがオープンリーディングフレーム(終止コドンを含む)である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、342アミノ酸残基から成る(配列番号6)。
(1)dmc02806(配列番号1、6)
dmc02806(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号1に示すように、1944塩基から成り、そのうち塩基番号32から1060までがオープンリーディングフレーム(終止コドンを含む)である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、342アミノ酸残基から成る(配列番号6)。
配列番号6に示すアミノ酸配列についてBLASTを用いて相同性検索を行ったところ、NRDBタンパク質データベース(SWISS−PROT、PIR、TREMBLE、GENPEPT、PDBから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース)中の、(i)データベース登録記号AX716699、Sequence 3 from Patent EP1293570 (human) がヒットした。その内容として、AX716699は342アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号1〜342が、配列番号6に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜342と、e−value:0.0、かつ342アミノ酸残基に亘り100%の一致度でヒットした。また、(ii)データベース登録記号AY040779、forkhead-associated domain histidine-triad like protein (pig) がヒットした。その内容として、AY040779は356アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号15〜354が、配列番号6に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜340と、e−value:0.0、かつ340アミノ酸残基に亘り91%の一致度でヒットした。さらに(iii)データベース登録記号AF398235、FHA-HIT (rat) がヒットしていた。その内容として、AF398235は329アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号1〜327が、配列番号6に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号2〜340とe−value:5×10-158、かつ339アミノ酸残基に亘り81%の一致度でヒットした。
上記(i)の文献等から、AX716699はアプラタキシンであることが分かる。アプラタキシン遺伝子は、その異常が神経細胞の機能障害をもたらすため、単一遺伝子疾患、常染色体劣勢遺伝性脊髄小脳変性症の病因遺伝子として同定されている。
また、配列番号6に示すアミノ酸配列について、HMMPFAMによるタンパク質特徴検索を行ったところ、配列番号6のアミノ酸番号170〜269に示されるアミノ酸配列にhistidine triad motifの特徴を示す配列(PfamにHITとしてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。
Histone triad (HIT) motif、His-phi-His-phi-His-phi-phi (phi は非疎水性アミノ酸) は、多くの種で、HIT superfamily の一群のヌクレオチド結合タンパク質に見られる特徴である。HIT superfamily には、Hint homolog、Fhit homolog、GalT homolog などがある。Hint homolog は、Cdk7/Kin28 の positive regulator として働く。また、Fhit homolog は、腫瘍の抑制因子として働くことが知られている。
上記のように本タンパク質とAX716699は、タンパク質としては同一である。但し、このことは、本DNAと上記AX716699をコードするcDNA(1187塩基から成る)が同一であることを意味するものではない。実際、両者のエクソン構造を明らかにするために、DNA塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアsim4 (Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、本DNAとAX716699をコードするcDNAをそれぞれヒトゲノム塩基配列上にマッピングした結果、以下のようなエクソン構造の違いが明らかとなった。本DNAは、第9染色体に8個のエクソンとして写像された。一方、AX716699をコードするcDNAは、同染色体に7個のエクソンとして写像された。本DNAの第1エクソンに相当するエクソンをAX716699をコードするcDNAは持たない。本DNAの第2〜7エクソンは、AX716699をコードするcDNAの第1〜第6エクソンに完全に一致する。本DNAの第8エクソンは、AX716699をコードするcDNAの第7エクソンに対応し、それらはゲノム塩基配列上同一位置を開始点とするが、前者の長さは1039塩基と,後者の275塩基に比べて,非常に長い.以上のように、両cDNAは異なるエクソン構造を持つことが明らかとなった。
さらに、タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるPSORTII(Trends Biochem.Mol.Biol. 58 (4): 417-424 (1996)) による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は、核に87%、ミトコンドリアに9%、細胞質に4%であることがわかった。よって本タンパク質は、核に局在することが予測された。
本DNAは、ヒト皮膚癌由来のcDNAライブラリーからクローニングされたものであり、上記のことから、アプラタキシンの3’非翻訳領域を完全に有する完全長cDNAであることがわかった。また、本タンパク質はヒトの器官・組織などの発生・分化・形成、細胞周期や細胞増殖などに関わる機能を有する転写調節因子であることが推測された。さらに、上述のように、本タンパク質は常染色体劣勢遺伝性脊髄小脳変性症の病因アプラタキシンであることから、その転写調節機能は、該疾患等神経変性疾患の分子機構に関わる可能性がある。
(2)prs00543(配列番号2、7)
prs00543(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号2に示すように、1956塩基から成り、そのうち塩基番号211から1329までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、372アミノ酸残基から成る (配列番号7)。
prs00543(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号2に示すように、1956塩基から成り、そのうち塩基番号211から1329までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、372アミノ酸残基から成る (配列番号7)。
配列番号7に示すアミノ酸配列についてBLASTを用いて相同性検索を行ったところ、NRDBタンパク質データベース (SWISS−PROT、PIR、TREMBLE、GENPEPT、PDBから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、(i)データベース登録記号AF151534、core histone MACROH2A2 (human) がヒットした。その内容として、AF151534は372アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号1〜372が、配列番号7に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜372と、e−value:0.0かつ372アミノ酸残基に亘り100%の一致度でヒットした。また(ii)データベース登録記号AK032636、MACROH2A2 (mouse) がヒットした。その内容として、AK032636は372アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号1〜372が、配列番号7に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜372と、e−value:0.0かつ372アミノ酸残基に亘り98%の一致度でヒットした。
上記(i)の文献情報(J. Biol. Chem. 276, 21776-21784 (2001))によれば、コアヒストンであるMACROH2AのメンバーのひとつであるMACROH2A1のsubtypeとしてMACROH2A1.1とMACROH2A1.2が知られている。これらは、5番染色体上に存在する。新たに見出されたメンバーであるMACROH2A2は、10番染色体に存在し、MACROH2A1.2と同様、X染色体上に凝集し、その転写を不活性化するX-inactivationに寄与していると考えられる。
また、配列番号7に示すアミノ酸配列について、HMMPFAMによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号7のアミノ酸番号216〜331に示されるアミノ酸配列にAppr-1"-p processing enzyme familyの特徴を示す配列(PfamにA1ppとしてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。このA1pp ドメインは、macro-H2A histone タンパク質の C 末端に見出されている。また、バクテリア、古細菌、真核生物からの一群のタンパク質中にも見出されており、遍在する重要な細胞内過程に関わると考えられている。
さらに配列番号7のアミノ酸番号2〜117に示されるアミノ酸配列にCore histone H2A/H2B/H3/H4の特徴を示す配列(Pfamにhistoneとしてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。この特徴 "histone" は、core histone と他の DNA 結合タンパク質の持つ特徴である。
本DNAと上記AF151534をコードするcDNA(1932塩基から成る)のエクソン構造を明らかにするために、DNA塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアsim4 (Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、本DNAとAF151534をコードするcDNAをそれぞれヒトゲノム塩基配列上にマッピングした結果、以下のようなエクソン構造の違いが明らかとなった。本DNAは、第10染色体に9個のエクソンとして写像された。一方、AF151534をコードするcDNAも、同染色体に9個のエクソンとして写像された。これらのうち、第2〜第8エクソンは、両者で完全に一致する。第1エクソンについては、両者の終止点は一致するが、本DNAの1〜151番目の塩基が100%写像できたのに対し、AF151534をコードするcDNAは、対応する1〜154番目の塩基うち1〜14番目の塩基が写像できていなかった。また、第9エクソンについては、両者の開始点は一致するが、本DNAは1164〜1926番目の塩基(763塩基の長さ)が2塩基分の異なりをもって写像されたのに対し、AF151534をコードするcDNAは、その1167〜1909番目の塩基(743塩基の長さ)が4塩基分の異なりをもって写像された。これらの塩基の異なりは、ORF外にあった。本DNAの1927番目以降の塩基配列の30塩基、および、AF151534をコードするcDNAの1910番目以降の塩基配列の23塩基は、poly(A)と思われ、ゲノム塩基配列へ写像はされなかった。上記より、本DNAはcDNAとして正確に取得されていることが分かった。
更にタンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるPSORTII(Trends Biochem.Mol.Biol. 58,(4) 417-424 (1996))による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は、ミトコンドリアに56%、核に30%、細胞質に13%であり、本タンパク質は核にも相当程度存在することが予測された。
本DNAは、ヒト前立腺由来のcDNAライブラリーからクローニングされたものであり、上記のことから、ヒトのコアヒストンMACROH2A2を正確にコードする完全長cDNAであることがわかった。また、本タンパク質はヒトの器官・組織などの発生・分化・形成、細胞周期や細胞増殖などに関わる機能を有する転写調節因子であることが推測された。さらに、本タンパク質はX染色体の転写不活性化に寄与すると考えられることから、X染色体にリンクした疾患等に関与することが推測された。
(3)rct05786(配列番号3、8)
rct05786(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号3に示すように、1554塩基から成り、そのうち塩基番号33から1385までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、450アミノ酸残基から成る (配列番号8)。
rct05786(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号3に示すように、1554塩基から成り、そのうち塩基番号33から1385までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、450アミノ酸残基から成る (配列番号8)。
配列番号8に示すアミノ酸配列についてBLASTを用いて相同性検索を行ったところ、NRDBタンパク質データベース (SWISS−PROT、PIR、TREMBLE、GENPEPT、PDBから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、(i)データベース登録記号Q13263、transcription intermediary factor 1-β(tif1-β) (human) がヒットした。その内容としてQ13263は835アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の378〜835が、配列番号8に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜450と、e−value:0.0、かつ458アミノ酸残基に亙り98%の一致度でヒットした。また、(ii)データベース登録記号U67303、KRAB-A interacting protein (mouse) がヒットした。その内容として、U67303は834アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列中の379〜834が、配列番号8に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜450と,e−value:0.0、かつ457アミノ酸残基に亘り92%の一致度でヒットした。
上記(i)のタンパク質は、文献Genes Dev. 10, 2067-2078 (1996) によると、KAP−1とも呼ばれ、KRAB領域に結合することで、その転写抑制活性を強める。KRAB(Kruppel−associated box)は、C2H2タイプのZnフィンガータンパク質の約1/3に見られ、N末端部分に存在し、転写の抑制に働き、Znフィンガードメインとともに細胞分化・発生に関与することが知られている。
また配列番号8に示すアミノ酸配列について、HMMPFAMによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号242〜287に示されるアミノ酸配列にPHD-fingerの特徴を示す配列(PfamにPHDとしてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。PHDフォールドは、2 個の Zn イオンを含む zinc finger 構造である。その機能は,まだ十分明らかにされていないが、タンパク質−タンパク質相互作用に関わると予想され、転写の活性化・不活性化における多成分タンパク質複合体の形成に重要と考えられている。
本DNAと上記Q13263をコードするcDNA、U78773(2770塩基から成る)のエクソン構造を明らかにするために、DNA塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアsim4 (Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、本DNAとU78773をそれぞれヒトゲノム塩基配列上にマッピングした結果、以下のようなエクソン構造の違いが明らかとなった。本DNAは、第19染色体に10個のエクソンとして写像された。一方、U78773は、同染色体に17個のエクソンとして写像され、本DNAの第1〜第10エクソンは、U78773の第8〜第17エクソンに対応する。これら10個のエクソンのうち、本DNAの第4エクソンはヒトゲノム塩基配列上、U78773の第11エクソンよりも24塩基下流から始まることが分かった。この24塩基の差は、ORF中にあり、終止コドンもフレームシフトも生じない。この差が、上述の本タンパク質とQ13263の差(前者は後者に対し、8アミノ酸残基を欠失している)を生じていることが分かった。
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるPSORT II (Trends Biochem. Sci. 24, (1) 34-6 (1999)) による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は核57%、細胞質22%、ミトコンドリア13%,peroxisome9%であり、核への局在の確率が高いことが分かった。
本DNAは、ヒト直腸由来のcDNAライブラリーからクローニングされたものであり、上記のことから、ヒトのtif1-βのスプライシングバリアントをコードする完全長cDNAであることがわかった。また、本タンパク質は細胞核内でDNAと結合し、細胞の分化・増殖、細胞周期などに関与する遺伝子の転写を調節する転写調節因子であることが推測された。さらに、前述のように、転写抑制活性を強めることが考えられるので、これを阻害し、目的遺伝子の発現を上げること等により、薬物開発に応用できる可能性がある。
(4)tst04007(配列番号4、9)
tst04007(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号4に示すように、1755塩基から成り、そのうち塩基番号75から1379までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、434アミノ酸残基から成る (配列番号9)。
tst04007(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号4に示すように、1755塩基から成り、そのうち塩基番号75から1379までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、434アミノ酸残基から成る (配列番号9)。
配列番号9に示すアミノ酸配列についてBLASTを用いて相同性検索を行ったところ、NRDBタンパク質データベース (SWISS−PROT、PIR、TREMBLE、GENPEPT、PDBから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、(i)データベース登録記号AK027810、NEDO human cDNA sequencing project FLJ14904 (PLACE1005603) (human) がヒットした。その内容として、AK027810は434アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の1〜434が、配列番号9に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜434と、e−value:0.0かつ434アミノ酸残基に亙り99%の一致度でヒットした。また(ii)データベース登録記号BC050800、Hypothetical protein (mouse) がヒットした。その内容として、BC050800は434アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の1〜434が、配列番号9に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜434と、e−value:0.0かつ434アミノ酸残基に亙り90%の一致度でヒットした。
また配列番号9に示すアミノ酸配列について、HMMPFAMによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号8〜80に示されるアミノ酸配列にhigh mobility group boxの特徴を示す配列(PfamにHMG#boxとしてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。High mobility group (HMG) タンパク質は、クロマチン中の、比較的分子量の低い non-histone components である。そのうち、HMG1 と HMG2 は、single-strand DNA に結合しやすく、double-strand DNA を解く機能がある。HMG ドメインは、HMG1 や HMG2
以外に、SOX ファミリー転写因子等のタンパク質に見られる。また、文献Biochim. Biophys. Acta 1049, 231- 243 (1990) によれば、HMGタンパク質は、特定の転写調節因子がDNAに結合するのを補助することによって転写を活性化することが知られている。
以外に、SOX ファミリー転写因子等のタンパク質に見られる。また、文献Biochim. Biophys. Acta 1049, 231- 243 (1990) によれば、HMGタンパク質は、特定の転写調節因子がDNAに結合するのを補助することによって転写を活性化することが知られている。
本DNAと上記AK027810をコードするcDNA(1731塩基から成る)のエクソン構造を明らかにするために、DNA塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアsim4 (Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、本DNAとAK027810をコードするcDNAをそれぞれヒトゲノム塩基配列上にマッピングした結果、両者はいずれも、第1染色体に12個のエクソンとして写像された。本DNAとAK027810をコードするcDNAの塩基配列上の差としては、poly(A)の有無の他、本DNAの5’末端が3塩基長い。また、本DNAの86番目と195番目の塩基、C,Gが、AK027810をコードするcDNAにおいて、それぞれT、Tとなっている。この2塩基の変異は、いずれも第1エクソンに存在し、それぞれ、CGC→CGT、GCA→TCAのコドン変化に対応し、前者はアミノ酸Argをコードすることに変わりはないが、後者はAlaからSerへの変化を生じる。これが、上述の本タンパク質とAK027810のアミノ酸配列上の1%の差異(434アミノ酸残基に亙り99%の一致度)に相当する。
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるPSORT II (Trends Biochem. Sci. 24, (1) 34-6 (1999)) による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は核74%、ミトコンドリア13%等であり、核への局在の確率が高いことが分かった。
本DNAは、ヒト精巣由来のcDNAライブラリーからクローニングされたものであり、AK027810のバリアントをコードする完全長cDNAであることがわかった。また、本タンパク質は細胞核内でDNAと結合し、細胞の分化・増殖、細胞周期などに関与する遺伝子の転写を調節する転写調節因子であることが推測された。さらに、本タンパク質は、他の転写調節因子のDNA結合を補助することによって転写を活性化する可能性があり、これを阻害する薬剤を開発すること等によって、生体に不都合なタンパク質の産生を抑制するなどの応用が考えられる。
(5)dmc08777(配列番号5、10)
dmc08777(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号5に示すように、2067塩基から成り、そのうち塩基番号542から1768までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、408アミノ酸残基から成る (配列番号10)。
dmc08777(以下、これを「本DNA」と称し、該DNAによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する)は、配列番号5に示すように、2067塩基から成り、そのうち塩基番号542から1768までがオープンリーディングフレーム (終止コドンを含む) である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、408アミノ酸残基から成る (配列番号10)。
配列番号10に示すアミノ酸配列についてBLASTを用いて相同性検索を行ったところ、NRDBタンパク質データベース (SWISS−PROT、PIR、TREMBLE、GENPEPT、PDBから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース) 中の、(i)データベース登録記号BC051847、zinc finger protein 99 (human) がヒットした。その内容として、BC051847は561アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の154〜561が、配列番号10に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜408と、e−value:0.0かつ408アミノ酸残基に亙り100%の一致度でヒットした。(ii)データベース登録記号AK022360、weakly similar to ZINC FINGER PROTEIN 29 (human) がヒットした。その内容として、AK022360は561アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の154〜561が、配列番号10に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜408と、e−value:0.0、かつ408アミノ酸に亘り100%の一致度でヒットした。また、(iii)データベース登録記号Q9Z2K3、zinc finger protein 94 (rat) がヒットした。その内容として、Q9Z2K3は536アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中の136〜521が、配列番号10に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号3〜398と、e−value:5×10-137、かつ396アミノ酸に亘り62%の一致度でヒットした。
また配列番号10に示すアミノ酸配列について、HMMPFAMによるタンパク質特徴検索を行ったところ、アミノ酸番号205〜227、233〜255、261〜283、289〜310、316〜338、344〜366、372〜394に示されるアミノ酸配列にZinc Finger,C2H2 type domainの特徴を示す配列(Pfamにzf−C2H2としてエントリーされるアミノ酸配列)を見出した。このドメインは、保存された2つのCysと2つのHisが亜鉛イオンに配位する構造モチーフをもっており、転写因子等多くの DNA結合タンパク質に見られる。
また配列番号10のアミノ酸番号2〜44にKRAB box regionが存在する。このドメインはDNAとの結合の際には転写の抑制にはたらき、Znフィンガードメインとともに細胞分化・発生に関与することが知られている。
本DNAと上記BC051847をコードするcDNAのエクソン構造を明らかにするために、DNA塩基配列をゲノム塩基配列へ写像するソフトウェアsim4 (Genome Res. 8, 967-974 (1998)) を用いて、本DNAとBC051847をコードするcDNAをそれぞれヒトゲノム塩基配列上にマッピングした結果、以下のようなエクソン構造の違いが明らかとなった。本DNAとBC051847をコードするcDNAを並置すると、本DNAの1740番目の塩基とBC051847をコードするcDNAの1819番目の塩基は対応することが分かった。本DNAの1〜1740番目の塩基配列は、第7染色体に4個のエクソンとして写像された。一方、BC051847をコードするcDNAの1〜1819番目の塩基配列は、同染色体に3個のエクソンとして写像された。本DNAの第3、第4エクソンはBC051847をコードするcDNAの第2、第3エクソンにそれぞれ完全に一致するが、本DNAの第1、第2エクソンは、BC051847をコードするcDNAの第1エクソンの中央部がスプライスされ、ふたつに分断されたものに相当する。本DNAのORFは、その第2エクソンから始まっているので、このスプライスの影響を受けていない。本DNAの第1エクソンの5’末端は、ゲノム塩基配列上97632467番目の塩基に位置する。一方、BC051847をコードするcDNAの第1エクソンの5’末端は、ゲノム塩基配列上97632454番目の塩基に位置する。写像はreverse方向になされたので、本DNAはより完全な5’末端を持つcDNAとして取得されたことが分かった。なお、本DNAの1741番目以降の塩基配列、およびBC051847をコードするcDNAの1820番目以降の塩基配列は、第7染色体に写像されなかった。両塩基配列部分は、それらのpoly(A)を除く3’末端近くまで300塩基以上に亘って一致していることから、cDNAの塩基配列の問題ではなく、ゲノム塩基配列(Build 31)に不備があるためと考えられる。実際、該塩基配列部分は、BACクローンAC073063と、poly(A)部分を除いて正確に一致している。
タンパク質の細胞内局在の予測プログラムであるPSORT II (Trends Biochem. Sci. 24, (1) 34-6 (1999)) による解析を行ったところ、本タンパク質の細胞内での局在の確率は核に96%、ミトコンドリアに4%であり、核内の存在確率が非常に高いことがわかった。
本DNAは、ヒト皮膚癌由来のcDNAライブラリーからクローニングされたものであり、上記のことから、BC051847のスプライシングバリアントをコードする完全長cDNAであることがわかった。また、本タンパク質は細胞核内でDNAと結合し、細胞の分化・増殖、細胞周期などに関与する遺伝子の転写を調節する転写調節因子であることが推測された。さら、本タンパク質は、前述のように、転写を抑制する活性を持つことが考えられるので、これを阻害し、目的遺伝子の発現を上げること等により、薬物開発に応用できる可能性がある。
Claims (15)
- 以下の(a)または(b)のタンパク質;
(a)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号6〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ転写調節活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項1に記載のタンパク質をコードする完全長cDNA。
- 以下の(a)または(b)のいずれかのDNA;
(a)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列を有するDNA、
(b)配列番号1〜5のいずれかに記載の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換および/または付加された塩基配列を有し、かつ転写調節活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項2〜4のいずれかに記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項2〜4のいずれかに記載のDNAまたは請求項5に記載の組換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
- 請求項6に記載の細胞により産生される、請求項1に記載のタンパク質。
- 請求項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列中の連続した5〜100塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、および、当該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
- 請求項1または7に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項9に記載の抗体。
- モノクローナル抗体が請求項1または7に記載のタンパク質の転写調節活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項10に記載の抗体。
- 請求項1または7に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
- 請求項6に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているDNAの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該DNAの発現調節物質のスクリーニング方法。
- 請求項1に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも1以上のアミノ酸配列情報および/または請求項2〜4のいずれかに記載のDNAの塩基配列から選択される少なくとも1以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
- 請求項1に記載のタンパク質および/または請求項2〜4のいずれかに記載のDNAを結合させた担体。
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-
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