ES2379107T3 - Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cÃclicos - Google Patents
Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cÃclicos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2379107T3 ES2379107T3 ES07114433T ES07114433T ES2379107T3 ES 2379107 T3 ES2379107 T3 ES 2379107T3 ES 07114433 T ES07114433 T ES 07114433T ES 07114433 T ES07114433 T ES 07114433T ES 2379107 T3 ES2379107 T3 ES 2379107T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- acylase
- hydrogen
- streptomyces
- hydroxy
- gly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Una acilasa de lipopéptidos cíclicos obtenida a partir de una cepa de microorganismo perteneciente al género Streptomyces, en la que la cepa de microorganismo productora de acilasa es Streptomyces sp. nº 6907, depositada en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809, y la acilasa presenta las características siguientes: 1) Actividad: Esta enzima cataliza la desacilación del resto acilo lipídico del compuesto lipopeptídico cíclico representado por la sustancia FR901379 y los análogos de FR901379, tales como equinocandina B y aculeacina A.
Description
Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cÃclicos Esta solicitud es una solicitud divisional de la patente EP-97905455.8. CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a la tecnologÃa enzimática. La presente invención se refiere a una nueva acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un compuesto lipopeptÃdico cÃclico y a un procedimiento de desacilación en el que se utilice la misma.
Más concretamente, la invención se refiere a una nueva acilasa adaptada para desacilar la cadena lateral acilo de la sustancia FR901379 (descrita en la patente japonesa Kokai Tokkyo Koho H3-184921), la cual es producida por el microorganismo Coleophoma sp. F-11899 (FERM BP-2635), o de un análogo de la sustancia FR901379 y a un procedimiento de desacilación en el que se use la misma.
Existe una necesidad constante de una acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un compuesto lipopeptÃdico cÃclico, especialmente de dicha sustancia FR901379 o análogo, con una buena eficacia.
Los autores de la presente invención han investigado extensamente en búsqueda de una nueva acilasa capaz de desacilar la cadena lateral acilo de un lipopéptido cÃclico representado por la sustancia FR901379 o sus análogos, tales como equinocandina B y aculeacina A. Como resultado, han descubierto una acilasa producida por Streptomyces anulatus con la cual se alcanza eficazmente la desacilación objetivo.
Esta nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos y el procedimiento de desacilación en el cual se utilice la misma se describen ahora en cuanto a sus aspectos principales.
En primer lugar, se describe el microorganismo productor de la acilasa de lipopéptidos cÃclicos.
El microorganismo productor de la nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos es Streptomyces sp. 6907 (FERM BP-5809 depositado en el NIBH tal como se menciona más adelante).
A continuación se describen las caracterÃsticas de esta cepa.
La cepa productora de la nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos denominada Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) (denominada en lo sucesivo de forma abreviada cepa nº 6907 (FERM BP-5809)) se aisló por primera vez de una muestra de tierra recogida en la prefectura de Fukushima. A continuación se describen las caracterÃsticas bacteriológicas de esta cepa nº 6907 (FERM BP-5809).
En la tabla 5 se resumen las caracterÃsticas de cultivo de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809) en agar extracto de levadura-extracto de malta, agar avena, agar almidón-sales inorgánicas, agar glicerina-asparagina, agar peptonaextracto de levadura-hierro y agar tirosina tras una incubación de 14 dÃas a 30 ºC y los resultados obtenidos por microscopÃa óptica y electrónica de barrido para los crecimientos respectivos. Las descripciones de color presentadas a continuación corresponden a la nomenclatura definida en el Methuen Handbook of Colour, Methuen, Londres, 1978.
- Medio
- CaracterÃsticas de cultivo
- Agar extracto de levadura-extracto de malta (ISP-2)
- C: bueno A: abundante, gris amarillento, blanco (4A2) R: naranja grisáceo (5B6) S: ninguno
- Agar avena (ISP-3)
- C: moderado A: abundante, gris azulado (22C2) R: marrón claro (4D4) S: ninguno
- Agar almidón-sales inorgánicas (ISP-4)
- C: bueno A: abundante, gris azulado (19C2) R: marrón (6F4) S: ninguno
- Agar glicerina-asparagina (ISP-S)
- C: bueno
- A: abundante, gris azulado (22B2) R: marrón rojizo (8E4) S: ninguno
- Agar peptona-extracto de levadura-hierro (ISP6)
- C: moderado A: ninguno R: marrón grisáceo (9F3) S: marrón oscuro
- Agar tirosina (ISP-7)
- C: bueno A: moderado, blanco amarillento (4A2) R: magenta oscuro (13F3) S: marrón oscuro
- Códigos: C: crecimiento, A: micelio aéreo, R: color del reverso, S: pigmento soluble
El color del micelio aéreo se encontraba entre gris amarillento y gris azulado, el color de crecimiento del reverso estaba entre marrón claro y marrón y los pigmentos intracelulares no eran sensibles a pH. En caldo de triptona-extracto de levadura, agar peptona-extracto de levadura-hierro y agar tirosina se produjeron pigmentos melanoides.
En la tabla 6 se resumen las caracterÃsticas fisiológicas de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809).
Tabla 6. CaracterÃsticas fisiológicas de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809)
- Parámetros
- Resultados
- Intervalo de temperatura para el crecimiento Licuefacción de gelatina Coagulación de leche Peptonización de leche Hidrólisis de almidón Producción de pigmentos melanoides
- 9,0 - 40,0 ºC + + -+ +
- Utilización de carbono:
- D-glucosa
- +
- L-arabinosa
- +
- D-xilosa
- +
- Inositol
- +
- Manitol
- +
- D-fructosa
- +
- L-ramnosa
- +
- Sacarosa
- +
- Rafinosa
- +
- +: positivo, ±: débilmente positivo, -: negativo
Esta cepa utilizó todas las fuentes de carbono ensayadas. No peptonizó la leche. El intervalo de temperatura para el 10 crecimiento se encontraba entre 9,0 y 40,0 ºC.
El micelio vegetativo de la cepa nº 6907 (FERM BP-5809) se desarrolló bien y se ramificó irregularmente pero sin fragmentarse. El micelio aéreo que se extendÃa desde el micelio vegetativo se ramificó monopódicamente para constituir cadenas de esporas alargadas. La morfologÃa de las cadenas de esporas del micelio aéreo era recta-flexuosa o de bucles incompletos, perteneciendo asà al tipo RF o RA de acuerdo con la clasificación de Pridham y col. (Pridham, T.G.
15 y col.: Appl. Microbiol., 6:54, 1958). Cada cadena de esporas se compone de 20 o más esporas. La espora presenta una superficie lisa y es cilÃndrica. El tamaño de las esporas es de 0,5-0,7 x 0,7-1,3 μm. No se observaron esclerocios, esporangios ni zoosporas.
En cuanto a la composición de aminoácidos de la pared celular, se analizó el lisado celular completo mediante el
20 método de Becker y col. (Becker, B., M. P. Lechevalier, R. E. Gordon y H. A. Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol., 12:421-423, 1964) y el método de Yamaguchi (Yamaguchi, T.: Comparison of the cell wall composition of morphologically distinct actinomycetes: J. Bacteriol., 89:444-453, 1965). El análisis indicó la existencia de ácido LL-diaminopimélico. Por lo tanto, la pared celular de esta cepa se consideró de tipo I.
25 En base a la observación morfológica y el análisis quÃmico anteriores, se consideró que la cepa nº (FERM BP-5809) pertenece al género Streptomyces de acuerdo con la clasificación taxonómica de Pridham y col. (Pridham, T. G. y col.: Appl. Microbiol., 6:54, 1958). Por consiguiente, se compararon las caracterÃsticas de esta cepa con las de Streptomyces species descritas en la bibliografÃa, a saber, en Shirling y col. (Shirling, E. B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 2. Species descriptions from first study, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189, 1968;
Shirling, E.B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 3. Additional species descriptions from first and second studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 18:279-392, 1968; Shirling, E. B. y D. Gottlieb: Cooperative Description of Type Culture of Streptomyces. 4. Species descriptions from second, third and forth studies, Intern. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512, 1969); Skerman y col. (Skerman, V. B., V. McGowan y P. H. A. Sneath: Approved List of 5 Bacterial Names, Amended Edition, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1989); y Moore y col. (Moore,
W. E., E. P. Cato y L. V. H. Moore: Index of Bacterial and Yeast Nomencultural Changes, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1992). La comparación no permitió indicar una especie con la cual se pudiera identificar y, por lo tanto, esta cepa se denominó Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809).
Esta Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) se depositó originalmente el 8 de marzo de 1996 en el Instituto
10 Nacional de Biociencia y TecnologÃa Humana (NIBH, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) (código ZIP 305) bajo el número de acceso FERM P-15506, y posteriormente se depositó de nuevo bajo el número de acceso FERM BP-5809 de acuerdo con el Tratado de Budapest del 3 de febrero de 1997.
La expresión "compuesto lipopeptÃdico cÃclico" tal como se utiliza en esta memoria descriptiva se refiere a un compuesto que presenta un anillo polipeptÃdico y, en tal anillo, un grupo "acilamino" como cadena lateral, opcionalmente con o sin
15 una o más cadenas laterales distintas.
La sustancia FR901379, la cual es un ejemplo representativo de dicho "compuesto lipopeptÃdico cÃclico", es una sustancia antifúngica conocida producida por el microorganismo Coleophoma sp. F-11899 (FERM BP-2635) (descrito en la patente japonesa Kokai Tokkyo Koho H3-184921) y que presenta la siguiente fórmula quÃmica [1a]:
[en la que
R1 es acilo,
R2 es hidroxi o aciloxi,
R3 es hidrógeno o hidroxi,
5 R4 es hidrógeno o hidroxi, R5 es hidrógeno o hidroxisulfoniloxi y R6 es hidrógeno o carbamoÃlo.] La nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos de la presente invención es una acilasa procedente de una cepa de
microorganismo del género Streptomyces, la cual es capaz de desacilar el grupo "acilamino" como cadena lateral de tal
10 compuesto lipopeptÃdico cÃclico para dar un grupo "amino". EspecÃficamente, es una acilasa la cual desacila la cadena lateral palmitoÃlo de la sustancia FR901379 o de una sal de la misma o la cadena lateral acilo de un análogo de tal sustancia FR901379 de fórmula general [I] o de una sal del mismo para producir especÃficamente un compuesto de la siguiente fórmula quÃmica [IIa] (sustancia FR179642) o una sal del mismo:
15 o un análogo de FR179642 de la siguiente fórmula general [II], incluida la sustancia FR179642, o una sal del mismo:
[en la que R2, R3, R4, R5 y R6 son los mismos grupos que los que se han definido respectivamente con anterioridad en la presente memoria.]
Las sales preferidas de los compuestos [I] y [II] son mono- o disales no tóxicas de las clases convencionales. AsÃ, son de mencionar sales metálicas, tales como sales de metales alcalinos (por ejemplo, sal sódica, sal potásica, etc.), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sal cálcica, sal de magnesio, etc.), sal de amonio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, sal de trimetilamina, sal de trietilamina, sal de piridina, sal de picolina, sal de diciclohexilamina, sal de N,N'dibenciletilendiamina, etc.), sales de adición de ácido orgánicas (por ejemplo, formiato, acetato, trifluoroacetato, maleato, tartrato, metanosulfonato, bencenosulfonato, toluenosulfonato, etc.), sales de adición de ácido inorgánicas (por ejemplo, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, sulfato, fosfato, etc.) y sales con aminoácidos (por ejemplo, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, etc.).
El "alquilo inferior" preferido es un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado de 1 a 6 átomo(s) de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc.-butilo, pentilo, isopentilo y hexilo. De ellos, se prefieren los grupos alquilo de 1 a 4 átomo(s) de carbono, y se prefiere especialmente metilo.
El "alquilo superior" preferido incluye grupos alquilo de cadena lineal o ramificados de 7 a 20 átomos de carbono, tales como heptilo, octilo, 3,5-dimetiloctilo, 3,7-dimetiloctilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo y eicosilo. El "alcoxi inferior" preferido incluye grupos de cadena lineal o ramificados, tales como metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, terc.-butoxi, pentiloxi, terc.pentiloxi, neopentiloxi, hexiloxi e isohexiloxi.
El "alcoxi superior" preferido incluye grupos de cadena lineal o ramificados, tales como heptiloxi, octiloxi, 3,5dimetiloctiloxi, 3,7-dimetiloctiloxi, noniloxi, deciloxi, undeciloxi, dodeciloxi, trideciloxi, tetradeciloxi, hexadeciloxi, heptadeciloxi, octadeciloxi, nonadeciloxi y eicosiloxi.
El "arilo" preferido incluye fenilo que presenta opcionalmente alquilo inferior (por ejemplo, fenilo, mesitilo, tolilo, etc.), naftilo y antrilo y similares.
El resto "acilo" preferido en la expresión grupo "acilamino" o "acilo" incluye acilo alifático, acilo aromático, acilo heterocÃclico, acilo alifático sustituido con arilo y acilo alifático sustituido con heterociclo derivado de ácidos carboxÃlicos, ácidos carbónicos, ácidos carbámicos y ácidos sulfónicos.
El "acilo" preferido incluye alcanoÃlo inferior (por ejemplo, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, valerilo, hexanoÃlo, pivaloÃlo, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como arilo (por ejemplo, fenilo, naftilo, antrilo, etc.), los cuales pueden presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como halógeno (por ejemplo, fluor, cloro, bromo, yodo, etc.), hidroxi, tal alcoxi superior, tal arilo, etc.; tal alcoxi inferior; amino; amino protegido [preferentemente acilamino, tal como alcoxi(inferior)carbonilamino (por ejemplo, metoxicarbonilamino, etoxicarbonilamino, propoxicarbonilamino, butoxicarbonilamino, terc.-butoxicarbonilamino, pentiloxicarbonilamino, hexiloxicarbonilamino, etc.), etc.]; dialquil(inferior)amino (por ejemplo, dimetilamino, N-metiletilamino, dietilamino, N-propilbutilamino, dipentilamino, dihexilamino, etc.); alcoxi(inferior)imino (por ejemplo, metoxiimino, etoxiimino, propoxiimino, butoxiimino, terc.butoxiimino, pentiloxiimino, hexiloxiimino, etc.); aralcoxi(inferior)imino (por ejemplo, benciloxiimino, fenetiloxiimino, benzhidriloxiimino, etc.), tal como fenilalcoxi(inferior)imino el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alcoxi superior; heterocicliltio (preferentemente piridiltio) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como alquilo superior (por ejemplo, heptilo, octilo, 2-etilhexilo, nonilo, decilo, 3,7-dimetiloctilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, 3-metil10-etildodecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosilo, etc.); y un grupo heterocÃclico (por ejemplo, tienilo, imidazolilo, pirazolilo, furilo, tetrazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como amino, tal amino protegido, tal alquilo superior y similares; alcanoÃlo superior (por ejemplo, heptanoÃlo, octanoÃlo, nonanoÃlo, decanoÃlo, undecanoÃlo, lauroÃlo, tridecanoÃlo, miristoÃlo, pentadecanoÃlo, palmitoÃlo, 10, 12-dimetiltetradecanoÃlo, heptadecanoÃlo, estearoÃlo, nonadecanoÃlo, eicosanoÃlo, etc.);
alquenoÃlo inferior (por ejemplo, acriloÃlo, metacriloÃlo, crotonoÃlo, 3-pentenoÃlo, 5-hexenoÃlo, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho arilo, que presentan opcionalmente uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alcoxi superior, etc.;
alquenoÃlo superior (por ejemplo, 4-heptenoÃlo, 3-octenoÃlo, 3,6-decadienoÃlo, 3,7,11-trimetil-2,6,10-dodecatrienoÃlo, 4,10-heptadecadienoÃlo, etc.);
alcoxi(inferior)carbonilo (por ejemplo, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxi-carbonilo, butoxicarbonilo, tbutoxicarbonilo, pentiloxicarbonilo, hexiloxicarbonilo, etc.);
alcoxi(superior)carbonilo (por ejemplo, heptiloxicarbonilo, octiloxicarbonilo, 2-etilhexiloxicarbonilo, noniloxicarbonilo, deciloxicarbonilo, 3,7-dimetiloctiloxicarbonilo, undeciloxicarbonilo, dodeciloxicarbonilo, trideciloxicarbonilo, tetradeciloxicarbonilo, pentadeciloxicarbonilo, 3-metil-10-etildodeciloxicarbonilo, hexadeciloxicarbonilo, heptadeciloxicarbonilo, octadeciloxicarbonilo, nonadeciloxicarbonilo, eicosiloxi-carbonilo, etc.);
ariloxicarbonilo (por ejemplo, fenoxicarbonilo, naftiloxicarbonilo, etc.);
arilglioxiloÃlo (por ejemplo, fenilglioxiloÃlo, naftilglioxiloÃlo, etc.);
aralcoxi(inferior)carbonilo el cual puede presentar uno o más sustituyente(s) adecuado(s), por ejemplo fenilalcoxi(inferior)carbonilo, el cual puede presentar nitro o alcoxi inferior (por ejemplo, benciloxicarbonilo, fenetiloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, etc.);
alquil(inferior)sulfonilo (por ejemplo, metilsulfonilo, etilsulfonilo, propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, pentilsulfonilo, butilsulfonilo, etc.);
arilsulfonilo (por ejemplo, fenilsulfonilo, naftilsulfonilo, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alquilo inferior, dicho alcoxi superior y similares;
aralquil(inferior)sulfonilo (por ejemplo, bencilsulfonilo, fenetilsulfonilo, benzhidrilsulfonilo, etc.), por ejemplo fenilalquil(inferior)sulfonilo; y
aroÃlo (por ejemplo, benzoÃlo, naftoÃlo, antrilcarbonilo, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 5) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho halógeno; alquilo inferior (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, terc.butilo, pentilo, hexilo, etc.); tal alquilo superior; alcoxi inferior (por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, terc.-butoxi, pentiloxi, hexiloxi, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 10) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alcoxi inferior, dicho halógeno, dicho arilo y similares; alcoxi superior (por ejemplo, heptiloxi, octiloxi, 2etilhexiloxi, noniloxi, deciloxi, 3,7-dimetiloctiloxi, undeciloxi, dodeciloxi, tricediloxi, tetradeciloxi, pentadeciloxi, 3-metil-10etildodeciloxi, hexadeciloxi, heptadeciloxi, octadeciloxi, nonadeciloxi, eicosiloxi, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 17) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho halógeno y similares; alqueniloxi superior (por ejemplo, 3-hepteniloxi, 7-octeniloxi, 2,6-octadieniloxi, 5-noneniloxi, 1-deceniloxi, 3,7-dimetil-6-octeniloxi, 3,7-dimetil-2,6octadieniloxi, 8-undeceniloxi, 3,6,8-dodecatrieniloxi, 5-trideceniloxi, 7-tetradeceniloxi, 1,8-pentadecadieniloxi, 15hexadeceniloxi, 11-heptadeceniloxi, 7-octadeceniloxi, 10-nonadeceniloxi, 18-eicoseniloxi, etc.); carboxi; dicho arilo el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alcoxi superior y similares; y ariloxi (por ejemplo, fenoxi, naftiloxi, antriloxi, etc.) el cual puede presentar uno o más (preferentemente 1 a 3) sustituyente(s) adecuado(s), tales como dicho alcoxi inferior y dicho alcoxi superior.
De los ejemplos anteriores de "acilo", se prefiere un grupo alcanoÃlo superior, y se prefiere especialmente palmitoÃlo.
Para el resto "acilo" preferido en la expresión "aciloxi" se puede hacer referencia al grupo "acilo" antes mencionado.
El grupo "aciloxi" preferido incluye alcanoiloxi inferior (por ejemplo, formiloxi, acetiloxi, propioniloxi, butiriloxi, isobutiriloxi, valeriloxi, hexanoiloxi, pivaloiloxi, etc.) o fosfonoxi.
La nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos de la invención se produce cultivando una cepa de microorganismo productora de acilasa que pertenece al género Streptomyces, a saber, Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809), en un medio de cultivo.
En general, esta nueva acilasa se puede producir cultivando dicha cepa de microorganismo productora de la nueva acilasa en un medio acuoso que contiene fuentes de carbono asimilable y de nitrógeno digerible, preferentemente en condiciones aerobias, por ejemplo mediante cultivo agitado y cultivo sumergido.
La fuente de carbono preferida para el medio incluye diversos carbohidratos, tales como glucosa, xilosa, galactosa, glicerina, almidón, dextrina y similares. Como otras fuentes de carbono son de mencionar maltosa, ramnosa, rafinosa, arabinosa, manosa, salicina, succinato sódico y similares.
La fuente de nitrógeno preferida incluye extracto de levadura, peptona, harina de gluten, harina de algodón, harina de soja, licor de maÃz fermentado, levadura seca, gérmenes de trigo, harina de plumas, harina de cacahuete y similares, asà como compuestos nitrogenados inorgánicos u orgánicos, tales como sales de amonio (por ejemplo, nitrato de amonio, sulfato de amonio, fosfato de amonio, etc.), urea y aminoácidos.
Aunque aquellas fuentes de carbono y de nitrógeno se utilizan preferentemente en combinaciones adecuadas, también se pueden utilizar materiales de baja pureza, siempre que contengan cantidades adecuadas de factores de crecimiento y cantidades razonables de nutrientes inorgánicos, y no siempre es necesario utilizarlos en forma pura. Opcionalmente, el medio se puede suplementar con carbonato sódico o carbonato potásico, fosfato sódico o fosfato potásico, cloruro sódico o cloruro potásico, yoduro sódico o yoduro potásico y sales inorgánicas, tales como sales de magnesio, sales de cobre y sales de cobalto. En particular, cuando el medio de cultivo produce una espuma copiosa, se puede añadir, según sea necesario, un agente antiespumante, tal como parafina lÃquida, aceite graso, aceite vegetal, aceite mineral y silicona.
Para la producción en masa de la nueva acilasa se prefiere el procedimiento del cultivo aerobio sumergido. Para la producción a menor escala se realiza un cultivo agitado o cultivo de superficie en un matraz o una botella. Para el cultivo en tanques de gran capacidad, el tanque de fermentación preferentemente se inocula con un cultivo de semillas para evitar un retraso en el crecimiento en la lÃnea de producción para la nueva acilasa. AsÃ, preferentemente se inocula primero una cantidad relativamente pequeña de medio de cultivo con las esporas o el micelio de la cepa y se incuba para preparar un cultivo de semillas el cual se transfiere después, en condiciones asépticas, a un tanque de fermentación de gran capacidad. El medio para este cultivo de semillas puede ser sustancialmente el mismo que el medio de producción para la nueva acilasa o diferente del medio de producción.
La agitación y aireación del sistema de fermentación se puede llevar a cabo de varias maneras. Por ejemplo, la agitación se puede efectuar utilizando una hélice u otro dispositivo de agitación similar, girando o sacudiendo el fermentador, por medio de una bomba apropiada o pasando aire estéril a través del medio. La aireación se puede lograr soplando aire estéril por el sistema de fermentación.
La fermentación se lleva a cabo generalmente en el intervalo de temperaturas de aproximadamente 20 a 32 ºC, preferentemente de 25 a 30 ºC, y en el intervalo de pH de 6 a 8 durante aproximadamente 50 a 150 horas. Esas condiciones se pueden modificar de acuerdo con otras condiciones de cultivo y escalas de fermentación.
La nueva acilasa asà producida se puede recuperar del caldo de fermentación mediante técnicas que se utilizan de forma rutinaria para la recuperación de otras sustancias bioactivas conocidas. La nueva acilasa elaborada se encuentra tanto en el micelio crecido como en el filtrado. Por lo tanto, la nueva acilasa se puede separar de la torta micelial y del filtrado disponible después de la filtración o centrifugación del caldo y purificar mediante los procedimientos convencionales, tales como concentración a presión reducida, liofilización, extracción con un disolvente común, ajuste de pH, tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, resina de intercambio aniónico, resina de intercambio catiónico, resina adsorbente no iónica, etc.), tratamiento con un adsorbente común, tal como carbón activo, ácido silÃcico, gel de sÃlice, celulosa, alúmina, cristalización y recristalización.
Los ejemplos siguientes ilustran con más detalle la acilasa producida por Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) y de ningún modo deben interpretarse como que definen el alcance de la invención.
Ejemplo 1
Producción de la acilasa originaria de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809)
Se cargó un matraz cónico de 100 ml de capacidad con 30 ml de un medio de semillas que contenÃa 6 % de almidón soluble, 4 % de harina de soja desgrasada y 0,5 % de carbonato y se esterilizó a 120 ºC durante 20 minutos. El matraz esterilizado se inoculó después con 1 a 2 asa(s) bacteriológica(s) de un cultivo de agar inclinado de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) y se incubó bajo agitación a 30 ºC durante 3 dÃas para proporcionar un cultivo de semillas.
Entretanto, se ajustó a pH 6,5 un medio de producción que contenÃa 4 % de sacarosa, 1 % de harina de cacahuete, 1 % de levadura seca y 0,5 % de carbonato cálcico y se cargó un matraz cónico de 500 ml de capacidad con 100 ml del medio de producción y se esterilizó a 120 ºC durante 20 minutos. El matraz esterilizado se inoculó con 2 ml del cultivo de semillas anterior y se incubó bajo agitación a 30 ºC durante 4 dÃas para proporcionar un caldo de fermentación.
Ahora se describe en detalle el procedimiento de desacilación de la cadena lateral acilo del compuesto lipopeptÃdico cÃclico antifúngico (por ejemplo, FR901379 o su análogo) con la nueva acilasa de lipopéptidos cÃclicos de la invención.
El procedimiento de desacilación de la invención se puede realizar de la siguiente manera.
Se inocula un medio de producción adecuado con una cepa de microorganismo perteneciente al género Streptomyces y capaz de producir la nueva acilasa y el medio inoculado se incuba durante unos dÃas entre aproximadamente 25 y 35 ºC para proporcionar un caldo de fermentación. Este caldo de fermentación se añade al compuesto lipopeptÃdico cÃclico sustrato, tal como la sustancia FR901379, y la mezcla se incuba entre 45 y 60 ºC y a un pH de aproximadamente 6,0 a
9. Después, el péptido cÃclico, tal como la sustancia FR179642, se detecta y se separa por cromatografÃa lÃquida de alta resolución (HPLC).
Los ejemplos siguientes pretenden ilustrar en detalle el procedimiento de desacilación de la invención y de ningún modo deben interpretarse como que definen el alcance de la invención.
Ejemplo 2-1
A 700 μl del caldo de fermentación de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) obtenido en el ejemplo 1 se añadieron 100 μl de una solución acuosa de la sustancia FR901379 (100 mg/ml) (10 mg como sustancia FR901379; 8,35 μmoles) junto con 100 μl de metanol y 100 μl de tampón (tampón de dihidrogenofosfato potásico/hidrogenofosfato disódico 0,5 M, pH 6,0) y la reacción transcurrió a 30 ºC durante 30 minutos. Después se detuvo la reacción con ácido acético al 4 % y, tras añadir 2 ml de metanol, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 μm) para eliminar las proteÃnas macromoleculares y otras fracciones y se sometió a HPLC, y la actividad acilasa de la sustancia esquelética FR179642 producida se monitorizó y ensayó a 210 nm.
La sustancia FR179642 se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un detector UV de longitud de onda variable (Shimadzu SPD-10A), una bomba (Shimadzu LC-10AD) y un integrador (Shimadzu C-R6A) como instrumentos, LiChrospher 100RP-18(e) (d.i. 250 mm x 4 mm, diámetro de partÃcula 5 μm (E. Merck)) como fase estacionaria y acetonitrilo al 3 %/dihidrogenofosfato de amonio al 0,5 % como fase móvil. El tiempo de retención de la sustancia FR179642 ascendió a aproximadamente 6,3 minutos. El rendimiento de la sustancia FR179642, calculado a partir de los datos de HPLC, ascendió a 560 μg (0,60 μmoles). El valor de Km, determinado mediante el método de Lineweaver-Burk, era de 257 μM y la Vmax ascendió a 14,3 U/mg de proteÃna.
Ejemplo 2-2
A 100 μl del caldo de fermentación de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) obtenido en el ejemplo 1 se añadieron 100 μl de una solución de aculeacina A en dimetilsulfóxido (100 mg/ml) (10 mg como aculeacina A; 9,65 μmoles) junto con 500 μl de tampón de dihidrogenofosfato potásico/hidrogenofosfato disódico 500 mM (pH 7,0) el cual contenÃa KCl 1,2 M y con 300 μl de agua, y la reacción transcurrió a 40 ºC durante 15 minutos. Después se detuvo la reacción con 1 ml de ácido acético al 4 % y, tras la adición de 2 ml de metanol, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 μm) para eliminar las proteÃnas macromoleculares y otras fracciones y se sometió a HPLC, y la actividad acilasa de la sustancia nuclear aculeacina A producida se monitorizó a 210 nm y se determinó. La sustancia nuclear aculeacina A se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un detector UV de longitud de onda variable (Shimadzu SPD-10A), una bomba (Shimadzu LC-10AD) y un integrador (Shimadzu C-R6A) como instrumentos, LiChrospher 100RP-18(e) (d.i. 250 mm x 4 mm, diámetro de partÃcula 5 μm (E. Merck)) como fase estacionaria y acetonitrilo al 4 %/dihidrogenofosfato de amonio al 1 % como fase móvil. El tiempo de retención de la sustancia nuclear aculeacina A ascendió a aproximadamente 8,7 minutos. El rendimiento de la sustancia nuclear aculeacina A, calculado a partir de los datos de HPLC, ascendió a 370 μg (0,47 μmoles). El valor de Km, determinado mediante el método de Lineweaver-Burk, era de 279 μM y la Vmax ascendió a 16,8 U/mg de proteÃna.
Ejemplo 2-3
A 100 μl del caldo de fermentación de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) obtenido en el ejemplo 1 se añadieron 100 μl de una solución de equinocandina B en dimetilsulfóxido (100 mg/ml) (10 mg como equinocandina B; 9,43 μmoles) junto con 500 μl de tampón de dihidrogenofosfato potásico/hidrogenofosfato disódico 500 mM (pH 7,0) el cual contenÃa KCl 1,2 M y con 300 μl de agua, y la reacción transcurrió a 40 ºC durante 15 minutos. Después se detuvo la reacción con 1 ml de ácido acético al 4 % y, tras la adición de 2 ml de metanol, la mezcla se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 μm) para eliminar las proteÃnas macromoleculares y otras fracciones y se sometió a HPLC, y la actividad acilasa de la sustancia nuclear equinocandina B producida se monitorizó y ensayó a 210 nm. La sustancia nuclear equinocandina B se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un detector UV de longitud de onda variable (Shimadzu SPD-10A), una bomba (Shimadzu LC-10AD) y un integrador (Shimadzu C-R6A) como instrumentos, LiChrospher 100RP-18(e) (d.i. 250 mm x 4 mm, diámetro de partÃcula 5 μm (E. Merck)) como fase estacionaria y acetonitrilo al 4 %/dihidrogenofosfato de amonio al 1 % como fase móvil. El tiempo de retención de la sustancia nuclear equinocandina B ascendió a aproximadamente 8,7 minutos. El rendimiento de la sustancia nuclear equinocandina B, calculado a partir de los datos de HPLC, ascendió a 90 μg (0,11 μmoles). El valor de Km, determinado mediante el método de Lineweaver-Burk, era de 146 μM y la Vmax ascendió a 7,85 U/mg de proteÃna.
A continuación se caracteriza el proceso de desacilación de la cadena lateral acilo de un compuesto lipopeptÃdico cÃclico antifúngico (por ejemplo, la sustancia FR901379) mediante la acilasa procedente de la cepa de microorganismo productora de la nueva acilasa perteneciente al género Streptomyces de acuerdo con la presente invención.
Los datos mostrados se generaron mediante el procedimiento experimental descrito en el ejemplo 2, pero variando el
5 tipo de tampón (se utilizaron tampón de citrato sódico 0,5 M, tampón de dihidrogenofosfato potásico/hidrogenofosfato disódico 0,5 M y tampón Tris-HCl en diferentes combinaciones), la temperatura de reacción y el nivel de adición de metanol. Cada actividad acilasa se muestra a la concentración (medida por HPLC) de la sustancia FR179642 alcanzada al completar la reacción.
pH de reacción óptimo
10 Ensayo 1
pH óptimo para la acilasa producida por Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809)
- pH
- Concentración de la sustancia FR179642 al completar la reacción (μg/ml)
- 3
- 0
- 4
- 190
- 5
- 280
- 6
- 300
- 7
- 470
- 8
- 800
- 9
- 1.000
Los resultados anteriores indican que la reacción transcurre en condiciones débilmente ácidas y por encima (aproximadamente pH 4) y que la velocidad de reacción aumenta a medida que sube el pH. 15 Temperatura de reacción óptima Ensayo 2 Temperatura óptima para la acilasa producida por Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809)
- Temperatura
- Concentración de la sustancia FR179642 al completar la reacción (μg/ml)
- 25
- 600
- 30
- 710
- 40
- 3.010
- 50
- 4.620
- 60
- 1.660
- 70
- 130
Los resultados anteriores indican que la temperatura de reacción óptima se encuentra entre 40 y 60 ºC. 20 Efecto del metanol añadido al sistema de reacción
Ensayo 3
5809)
- Concentración de metanol ( %)
- Concentración de la sustancia FR179642 al completar la reacción (μg/ml)
- 0
- 330
- 5
- 580
- 10
- 710
- 15
- 630
- 20
- 530
- 30
- 140
- 40
- 130
- 50
- 90
25 Los resultados anteriores indican que la actividad aumenta entre 1,6 veces y 2,2 veces en presencia de 5 a 20 % de metanol.
Ahora se describe en detalle la acilasa de lipopéptidos cÃclicos obtenida cultivando una cepa de microorganismo productora de acilasa del género Streptomyces.
1) Actividad:
Esta enzima cataliza la desacilación del resto acilo lipÃdico del compuesto lipopeptÃdico cÃclico representado por la sustancia FR901379 y los análogos de FR901379, tales como equinocandina B y aculeacina A. 2) pH óptimo: pH 8 a 9 3) Temperatura óptima para la actividad: aproximadamente 50 ºC 4) Inhibición, activación y estabilización: Metanol: La enzima es activada de forma dependiente de la concentración hasta un 10 % en la mezcla de reacción y es
inhibida a concentraciones mayores.
5) Peso molecular: La SDS-PAGE de la enzima purificada proporcionó dos bandas. Péptido grande: 61 kD Péptido pequeño: 19 kD
6) Estructura cristalina: HabÃa poca cantidad de la proteÃna purificada y no era cristalina.
7) Análisis de aminoácidos: Secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal Péptido grande:
Péptido pequeño:
8) Especificidad por el sustrato
La enzima actúa de catalizador para FR901379, equinocandina B y aculeacina A. Sin embargo, no actúa sobre FR901469.
Los ejemplos siguientes ilustran con más detalle la acilasa de la invención, pero de ningún modo deben interpretarse como que definen el alcance de la invención.
Purificación de la acilasa:
El caldo de fermentación de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) obtenido en el ejemplo 1 se extrajo con KCl 1,5 M bajo agitación a baja temperatura y el filtrado separado con papel de filtro nº 2 se desalinizó con una membrana UF (Asahi Chemical Industries; AIP-1010) [tampón Tris-HCl 20 mM (pH 9) sustituido] y se pasó a través de una columna HP-20. El efluente se aplicó en una columna DEAD-Toyopearl (forma Cl-) y la elución se llevó a cabo con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 9) suplementado con NaCl 0,3 M. En la fracción activa resultante se disolvió un equivalente 0,5 M de (NH4)2SO4 y la solución se aplicó en una columna fenil-Toyopearl, realizándose después la elución con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8) suplementado con NaCl 0,1 M. La fracción activa resultante se desalinizó y concentró con una membrana DF (Asahi Chemical Industries; SIP-0013) [tampón Tris-HCl 20 mM (pH 9) sustituido) y se sometió a una cromatografÃa de exclusión molecular en una columna YMC-Diol (fase móvil: tampón NaCl 0,2 M-dihidrogenofosfato potásico/hidrogenofosfato disódico 0,1 M, pH 7,0). La fracción activa se purificó adicionalmente mediante cromatografÃa preparativa en una columna de fase inversa Cosmosil 5C4-AR-300 [fase móvil: (solución A) ácido trifluoroacético al 0,5 %, (solución B) ácido trifluoroacético al 0,5 %/acetonitrilo al 80 %, A:B = 60:40 -> 40:60 (gradiente lineal)], obteniéndose dos bandas. La acilasa asà purificada se sometió a SDS-PAGE; de esta manera se obtuvieron dos péptidos diferentes con masas moleculares de 61 kD y 19kD, respectivamente.
Especificidad por el sustrato:
La sustancia FR901469 es una sustancia conocida (descrita en la patente WO 92/19648) que posee actividad antifúngica cuando es producida por la cepa de hongo nº 11243 (FERM BP-3373). Es un compuesto con la siguiente fórmula quÃmica [III]:
La acilasa procedente de Actinoplanes utahensis (descrita en la patente japonesa Kokai Tokkyo Koho H4-228072), la cual posee actividad de desacilación igual que la nueva acilasa de acuerdo con la presente invención, ejerce una acción catalÃtica sobre dicha sustancia FR901469 y su sal para producir la sustancia FR181131 (descrita en la patente WO 96/30399) con la siguiente fórmula quÃmica [IV]:
Por el contrario, la nueva acilasa de la presente invención no ejerce ninguna acción catalÃtica sobre dicha sustancia FR901469 y su sal.
A continuación se presentan ejemplos de la invención.
Ejemplo 4-1
A 20 ml de un caldo de fermentación de Actinoplanes utahensis IF013244 preparado mediante el procedimiento descrito en J. Antibiotics, vol. 41, pág. 1085-1092 ('88) se añadió 1 ml de una solución acuosa de la sustancia FR901469 (200 mg/ml) (0,2 g tal como sustancia FR901469; 130 μmoles) junto con 2,9 g de hidrogenofosfato disódico y 60 ml de agua, y la reacción transcurrió a 60 ºC durante 24 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 μm) para eliminar las proteÃnas de alto peso molecular y otras fracciones, se purificó mediante HPLC monitorizando la sustancia FR181131 a 210 nm y se determinó la actividad acilasa. La sustancia FR181131 se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un detector UV de longitud de onda variable (Shimadzu SPD-10A), una bomba (Shimadzu LC-10AD) y un integrador (Shimadzu C-R6A) tal como instrumentos, YMC AM303 (d.i. 250 mm x 4 mm, diámetro de partÃcula 5 μm) tal como fase estacionaria y acetonitrilo al 12,5 %/dihidrogenofosfato de amonio al 0,5 % tal como fase móvil. El tiempo de retención de la sustancia FR181131 ascendió a aproximadamente 7,3 minutos. El rendimiento de la sustancia FR181131, calculado a partir de los datos de HPLC, ascendió a 80 mg (68 μmoles).
Ejemplo 4-2
A 20 ml del caldo de fermentación de Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809) obtenido en el ejemplo 1 se añadió 1 ml de una solución acuosa de la sustancia FR901469 (200 mg/ml) (0,2 g tal como sustancia FR901469; 130 μmoles) junto con 2,9 g de hidrogenofosfato disódico y 60 ml de agua, y la reacción transcurrió a 60 ºC durante 24 horas. Una vez completada la reacción, la mezcla de reacción se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 μm) para eliminar las proteÃnas de alto peso molecular y otras fracciones, se purificó mediante HPLC monitorizando la sustancia FR181131 a 210 nm y se determinó la actividad acilasa. La sustancia FR181131 se eluyó a una velocidad de flujo de 1 ml/min utilizando un detector UV de longitud de onda variable (Shimadzu SPD-10A), una bomba (Shimadzu LC-10AD) y un integrador (Shimadzu C-R6A) tal como instrumentos, AM303 (d.i. 250 mm x 4 mm, diámetro de partÃcula 5 μm) tal como fase estacionaria y acetonitrilo al 12,5 %/dihidrogenofosfato de amonio al 0,5 % tal como fase móvil. El tiempo de retención de la sustancia FR181131 ascendió a aproximadamente 7,3 minutos. El rendimiento de la sustancia FR181131, calculado a partir de los datos de HPLC, no superó los 2 mg (1,7 μmoles) (por debajo del lÃmite de detección).
Coleophoma sp. F-11899, el cual produce la sustancia FR901379, y Streptomyces sp. nº 6907 (FERM BP-5809), el cual produce la acilasa de la invención, han sido depositados en el Instituto Nacional de Biociencia y TecnologÃa Humana
- (NIBH, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón).
- Microorganismo
- Nº de acceso
- Coleophoma sp. F-11899
- FERM BP-2635
- Streptomyces sp. nº 6907
- FERM BP-5809
- Cepa nº 11243
- FERM BP-3373
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Una acilasa de lipopéptidos cÃclicos obtenida a partir de una cepa de microorganismo perteneciente al género Streptomyces, en la que la cepa de microorganismo productora de acilasa es Streptomyces sp. nº 6907, depositada en el Instituto Nacional de Biociencia y TecnologÃa Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809, y la acilasa5 presenta las caracterÃsticas siguientes: 1) Actividad: Esta enzima cataliza la desacilación del resto acilo lipÃdico del compuesto lipopeptÃdico cÃclico representado por lasustancia FR901379 y los análogos de FR901379, tales como equinocandina B y aculeacina A. 2) pH óptimo: pH 8 a 9; 10 3) Temperatura óptima para la actividad: aproximadamente 50 ºC;4) Inhibición, activación y estabilización: Metanol: La enzima es activada de forma dependiente de la concentración hasta un 10 % en la mezcla de reacción y es inhibida a concentraciones mayores. 5) Peso molecular:Péptido grande: 61 kD 15 Péptido pequeño: 19 kD6) Análisis de aminoácidos: Secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal Péptido grande:Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly-...20 Péptido pequeño:Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala-...7) Especificidad por el sustrato La enzima actúa de catalizador para FR901379, equinocandina B y aculeacina A, pero no actúa sobre FR901469.
- 2. La acilasa de acuerdo con la reivindicación 1, la cual cataliza la desacilación del grupo acilo R1 de un compuesto 25 lipopeptÃdico cÃclico con la siguiente fórmula general [I] o una sal del mismo:en la queR1 es acilo; R2 es hidroxi o aciloxi; R3 es hidrógeno o hidroxi; R4 es hidrógeno o hidroxi; R5 es hidrógeno o hidroxisulfoniloxi y R6 es hidrógeno o carbamoÃlo; para producir un compuesto peptÃdico cÃclico con la siguiente fórmula general [II] o una sal del mismo:en la que R2, R3, R4, R5 y R6 son como se han definido anteriormente.
- 10 3. La acilasa de acuerdo con la reivindicación 2, en la que R1 es hidroxisulfoniloxi y R6 es carbamoÃlo.
- 4. Streptomyces sp. 6907 depositado en el Instituto Nacional de Biociencia y TecnologÃa Humana (NIBH) bajo el número de acceso FERM BP-5809.
- 15 5. Procedimiento para la producción de un compuesto peptÃdico cÃclico o una sal del mismo, el cual comprende poner un compuesto lipopeptÃdico cÃclico o su sal en contacto con una solución enzimática bruta o purificada de una acilasa producida por un microorganismo perteneciente al género Streptomyces para desacilar su resto acilo lipÃdico, en el que la acilasa es la acilasa de la reivindicación 1.
- 6. Procedimiento para la producción de un compuesto peptÃdico cÃclico con la siguiente fórmula general (II): en la que R2, R3, R4, R5 y R6 son los mismos grupos que los que se definen respectivamente más adelante, el cual comprende poner un compuesto lipopeptÃdico cÃclico con la siguiente fórmula general [I]:5 en la que R1 es acilo; R2 es hidroxi o aciloxi; R3 es hidrógeno o hidroxi; R4 es hidrógeno o hidroxi;10 R5 es hidrógeno o hidroxisulfoniloxi y R6 es hidrógeno o carbamoÃlo,o una sal del mismo en un disolvente acuoso en contacto con una solución enzimática bruta o purificada de una acilasa obtenida mediante el cultivo de una cepa de microorganismo productora de acilasa perteneciente al género Streptomyces, en el que la acilasa es la acilasa de la reivindicación 1.
- 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que R5 es hidroxisulfoniloxi y R6 es carbamoÃlo.DOCUMENTOS INDICADOS EN LA DESCRIPCIÓNEn la lista de documentos indicados por el solicitante se ha recogido exclusivamente para información del lector, y no es parte constituyente del documento de patente europeo. Ha sido recopilada con el mayor cuidado; sin embargo, la EPA no asume ninguna responsabilidad por posibles errores u omisiones.Documentos de patente indicados en la descripción
- •
- EP 97905455 A [0001] • WO 9219648 A [0065]
- •
- FR 901379 [0004] • JP H4228072 B [0066]
- •
- JP H3184921 B [0004] [0021] • WO 9630399 A [0066] Documentos de patente citados en la descripción
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5138696 | 1996-03-08 | ||
| JP5138696 | 1996-03-08 | ||
| JP19420796 | 1996-07-24 | ||
| JP19420796 | 1996-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2379107T3 true ES2379107T3 (es) | 2012-04-20 |
Family
ID=26391923
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97905455T Expired - Lifetime ES2327981T3 (es) | 1996-03-08 | 1997-03-06 | Procedimiento para la desacilacion de lipopeptidos ciclicos. |
| ES07114433T Expired - Lifetime ES2379107T3 (es) | 1996-03-08 | 1997-03-06 | Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cÃclicos |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97905455T Expired - Lifetime ES2327981T3 (es) | 1996-03-08 | 1997-03-06 | Procedimiento para la desacilacion de lipopeptidos ciclicos. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6207434B1 (es) |
| EP (3) | EP0885957B1 (es) |
| JP (1) | JP3123078B2 (es) |
| KR (1) | KR100545506B1 (es) |
| CN (1) | CN1161462C (es) |
| AT (2) | ATE544851T1 (es) |
| CA (1) | CA2248348C (es) |
| DE (1) | DE69739532D1 (es) |
| ES (2) | ES2327981T3 (es) |
| WO (1) | WO1997032975A1 (es) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE544851T1 (de) * | 1996-03-08 | 2012-02-15 | Astellas Pharma Inc | Verfahren zur deacylierung von zyklischen lipopeptiden |
| US6146872A (en) * | 1996-06-13 | 2000-11-14 | Fukisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Cyclic lipopeptide acylase |
| TWI233805B (en) * | 1999-07-01 | 2005-06-11 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Stabilized pharmaceutical composition in lyophilized form as antifungal agent |
| KR20020022758A (ko) * | 1999-07-02 | 2002-03-27 | 후지야마 아키라 | 환상 리포펩티드 아실라제를 암호화하는 유전자 및 그 발현 |
| JP2005095001A (ja) * | 1999-10-22 | 2005-04-14 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ヘテロマーペプチドの遺伝子工学的固定化 |
| CA2394313A1 (en) | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Novel lipopeptides as antibacterial agents |
| WO2001044272A2 (en) | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Cubist Pharmaceuticals, Inc. | Daptomycin analogs as antibacterial agents |
| BR0016467A (pt) | 1999-12-15 | 2002-08-27 | Cubist Pharm Inc | Lipopeptìdeos como agentes antibacterianos |
| DE60232158D1 (de) | 2001-08-06 | 2009-06-10 | Cubist Pharm Inc | Lipopeptid-stereoisomere, verfahren zu ihrer herstellung und nützliche zwischenprodukte |
| US7045547B2 (en) * | 2002-08-20 | 2006-05-16 | University Of Delaware | Acyl-CoA dehydrogenase allenic inhibitors |
| PL2379580T3 (pl) | 2008-12-22 | 2014-05-30 | Merck Sharp & Dohme | Nowe środki przeciwbakteryjne do leczenia zakażeń wywołanych bakteriami Gram-dodatnimi |
| US8877777B2 (en) | 2010-09-30 | 2014-11-04 | Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co., Ltd. | Process for purifying cyclolipopeptide compounds or the salts thereof |
| CN102533551B (zh) * | 2010-12-15 | 2013-10-09 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种肽类抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
| CN102618606B (zh) * | 2011-01-30 | 2014-09-10 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种棘白菌素生物转化方法 |
| CN103074403B (zh) * | 2011-10-26 | 2014-07-09 | 上海医药工业研究院 | 微生物酶转化棘白菌素b的方法 |
| CN102627689B (zh) | 2012-03-30 | 2014-08-06 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种环肽类化合物的水合物及其制备方法和用途 |
| CN102659930B (zh) * | 2012-03-30 | 2014-04-23 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度环肽类物质的晶体及其制备方法和用途 |
| CN103387975A (zh) * | 2012-05-11 | 2013-11-13 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途 |
| CN104768966B (zh) | 2012-09-24 | 2018-11-02 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 生产环肽的方法 |
| KR101425108B1 (ko) * | 2012-09-25 | 2014-07-31 | 동국제약 주식회사 | 탈아실화된 환상 리포펩티드의 제조방법 |
| CN106755221A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 无锡福祈制药有限公司 | 一种米卡芬净母核fr179642的制备方法 |
| CN111909244A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-10 | 卓和药业集团有限公司 | 一种高纯度米卡芬净前体fr901379的制备方法 |
| CN114874919B (zh) * | 2022-05-09 | 2023-06-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR901469A (fr) | 1942-11-27 | 1945-07-27 | Rohm & Haas Ges Mit Beschrankt | Procédé pour produire des pellicules, revêtements et analogues ne gonflant pas àpartir de polymérisats simples ou mixtes de composés éthyléniques sous forme de dispersions aqueuses |
| JPS585189A (ja) * | 1981-07-01 | 1983-01-12 | Sanraku Inc | 新規なアミドヒドロラ−ゼ |
| US4396543A (en) * | 1982-05-21 | 1983-08-02 | Eli Lilly And Company | Derivatives of A-21978C cyclic peptides |
| GB8925593D0 (en) | 1989-11-13 | 1990-01-04 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Fr901379 substance and preparation thereof |
| ES2089133T3 (es) * | 1990-06-07 | 1996-10-01 | Lilly Co Eli | Desacilasa de lipopeptidos. |
| TW199162B (es) | 1991-05-09 | 1993-02-01 | Fujisawa Pharmaceutical Co | |
| GB9506372D0 (en) | 1995-03-29 | 1995-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New peptide compounds |
| ATE544851T1 (de) * | 1996-03-08 | 2012-02-15 | Astellas Pharma Inc | Verfahren zur deacylierung von zyklischen lipopeptiden |
| US6146872A (en) | 1996-06-13 | 2000-11-14 | Fukisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Cyclic lipopeptide acylase |
| KR20020022758A (ko) * | 1999-07-02 | 2002-03-27 | 후지야마 아키라 | 환상 리포펩티드 아실라제를 암호화하는 유전자 및 그 발현 |
| JP2005095001A (ja) * | 1999-10-22 | 2005-04-14 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ヘテロマーペプチドの遺伝子工学的固定化 |
-
1997
- 1997-03-06 AT AT07114433T patent/ATE544851T1/de active
- 1997-03-06 AT AT97905455T patent/ATE439433T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-03-06 WO PCT/JP1997/000692 patent/WO1997032975A1/ja active IP Right Grant
- 1997-03-06 EP EP97905455A patent/EP0885957B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 CA CA002248348A patent/CA2248348C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-06 JP JP09511848A patent/JP3123078B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 CN CNB97194475XA patent/CN1161462C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-03-06 ES ES97905455T patent/ES2327981T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 KR KR1019980706947A patent/KR100545506B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-03-06 ES ES07114433T patent/ES2379107T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 DE DE69739532T patent/DE69739532D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 EP EP07114433A patent/EP1854877B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-03-06 EP EP09160239A patent/EP2172546A1/en not_active Withdrawn
- 1997-03-16 US US09/142,045 patent/US6207434B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-06 US US09/656,417 patent/US6573084B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-06 US US09/656,420 patent/US6537789B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2248348C (en) | 2008-06-10 |
| CA2248348A1 (en) | 1997-09-12 |
| JP3123078B2 (ja) | 2001-01-09 |
| US6537789B1 (en) | 2003-03-25 |
| EP1854877A2 (en) | 2007-11-14 |
| EP0885957A1 (en) | 1998-12-23 |
| ATE439433T1 (de) | 2009-08-15 |
| EP1854877A3 (en) | 2009-05-20 |
| CN1218507A (zh) | 1999-06-02 |
| KR19990087515A (ko) | 1999-12-27 |
| DE69739532D1 (de) | 2009-09-24 |
| WO1997032975A1 (fr) | 1997-09-12 |
| EP1854877B1 (en) | 2012-02-08 |
| EP0885957A4 (en) | 2004-06-09 |
| EP0885957B1 (en) | 2009-08-12 |
| ATE544851T1 (de) | 2012-02-15 |
| US6207434B1 (en) | 2001-03-27 |
| KR100545506B1 (ko) | 2006-10-04 |
| US6573084B1 (en) | 2003-06-03 |
| CN1161462C (zh) | 2004-08-11 |
| EP2172546A1 (en) | 2010-04-07 |
| ES2327981T3 (es) | 2009-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2379107T3 (es) | Procedimiento para la desacilación de lipopéptidos cÃclicos | |
| EP0462531B1 (en) | Cyclic polypeptide with antibiotic activity, process for its preparation and pure culture of a Coelomycetes strain | |
| EP0405421A2 (en) | Anthraquinone derivatives and preparation thereof | |
| US6372474B1 (en) | Cyclic lipopeptide acylase | |
| USRE32310E (en) | Derivatives of A-21978C cyclic peptides | |
| KR860002185B1 (ko) | A-21978c 사이클릭 펩티드 유도체의 제조방법 | |
| EP0095295A1 (en) | Cyclic peptide derivatives | |
| BRPI9803914B1 (pt) | compostos lantibióticos relacionados a actagardina, processo para preparação dos mesmos e produto farmacêutico contendo-os | |
| US5478809A (en) | TAN-1511, its derivatives, production and use thereof | |
| US5914348A (en) | Substance FA-70D, process for producing the same, and uses thereof | |
| US6331521B1 (en) | Echinocandine derivatives with antimicrobial activity | |
| USH1638H (en) | Use of the polypeptide compound | |
| EP0316907B1 (en) | Enzyme inhibitor and method of producing the same | |
| US4463092A (en) | Process for production antibiotic A53868 | |
| US4482488A (en) | Antibiotic A53868 and process for production thereof | |
| CA1200777A (en) | A-21978c cyclic peptide derivatives and their production |