ES2368298A1 - Método para la administración de oligonucleótidos. - Google Patents

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Abstract

Método para la administración de oligonucleótidos.La presente invención trata sobre un método para obtener formulaciones que mejoran la capacidad de unión de los pARNi a los componentes plasmáticos, que favorecen el transporte del pARNi en la sangre, que incrementan el paso del pARNi a través de la membrana celular, y así, aumentan la actividad inhibitoria de los pARNi. La invención describe un proceso para la obtención de una formulación que comprende pARNi asociado a los componentes plasmáticos, caracterizado porque el proceso comprende una etapa en la que se dispersan los componentes plasmáticos en medio acuoso.

Description

Método para la administración de oligonucleótidos.
La presente invención se refiere a un método para la manufacturación de composiciones que comprenden pARNi asociado a los componentes plasmáticos. Por lo tanto pertenece al campo de la técnica de la biotecnología.
Estado de la técnica anterior
El ARN de interferencia (ARNi) es un importante mecanismo de regulación génica que puede ser utilizado para el silenciamiento específico de genes. El proceso es iniciado por ARNs de doble cadena que se denominan pARNi, pequeños ARN de interferencia (small interfering RNAs, siRNAs). Los pARNi, complementarios a un ARN mensajero determinado, se unen a un complejo proteico conocido como RISC. El complejo formado por la unión de la cadena antisense o guía con RISC cataliza la degradación eficiente de un ARN mensajero específico, provocando un descenso de la proteína Diana. Durante los últimos años, se han realizado numerosos estudios con el fin de utilizar este fenómeno de regulación génica natural como base para una nueva terapia encaminada hacia la reducción específica de una proteína determinada previamente. Así, dicha terapia podría ser utilizada para el tratamiento de enfermedades en las que se conoce que son causadas por la sobreexpresión de genes tales como el cáncer o enfermedades inflamatorias [D. Brumcot y col. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nature Chemical Biology 2 (2006), páginas 711-719; A. de Fougerolles y col. RNA interference in vivo: toward synthetic small inhibitory RNA-based therapeutics Methods in Enzymology 392 (2005), páginas 278-296; C. Chakraborty Potentiality of small interfering RNAs (siRNA) as recent therapeutic targets for gene-silencing. Current Drug Targets 8 (2007) páginas.
469-482].
La administración celular in vivo de los pARNi, es quizás uno de los problemas más importante para el desarrollo de un fármaco terapéutico eficiente basado en ARN de interferencia. [D. Brumcot y col. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nature Chemical Biology 2 (2006), páginas 711-719; A. de Fougerolles y col. RNA interference in vivo: toward synthetic small inhibitory RNA-based therapeutics Methods in Enzymology 392 (2005), páginas 278-296; C. Chakraborty Potentiality of small interfering RNAs (siRNA) as recent therapeutic targets for gene-silencing. Current Drug Targets 8 (2007) páginas. 469-482]. Los pARNi, que son moléculas hidrofílicas cargadas negativamente, no tienen la capacidad, por sí solos, de distribuirse en la sangre e internalizarse, o penetrar al interior celular, a través de la membrana celular que es hidrofóbica. Para solucionar este problema se han descrito varias estrategias tales como la utilización de nanopartículas o la utilización de liposomas [J. Soutschek y col. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, (2004) páginas 173-178; D.H. Kim y col. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nature Reviews 8 (2007), páginas 173-184]. Estos vehículos pueden tener una doble función: ser agentes permeabilizadores celulares y, a su vez, ser agentes protectores de los pARNi, ya que los pARNi desnudos son rápidamente degradados por las ARNasas del suero. Por esta razón, se han diseñado y sintetizado un número elevado de pARNi modificados para aprovechar la ventaja de la unión los pARNi modificados a componentes específicos del suero (como albúmina, HDL y LDL) y, de esta manera, ayudar a la distribución de las moléculas de pARNi en el organismo.
Descripción de la invención
La presente invención trata sobre un método para obtener formulaciones que mejoran la capacidad de unión de los pARNi a los componentes plasmáticos, que favorecen el transporte del pARNi en la sangre, que incrementan el paso del pARNi a través de la membrana celular, y así, aumentan la actividad inhibitoria de los pARNi. Las formulaciones obtenidas por el proceso de la invención mejoran de forma clara la entrada de los pARNi en cultivos celulares y la biodistribución del pARNi en los tejidos. Esta acción se produce por unión de los pARNi a los componentes plasmáticos, tales como los sitios saturables de las proteínas plasmáticas como la albúmina, o los glicéridos tales como HDL o LDL, que le permiten al pARNi llegar a los diferentes tejidos, permanecer y ser detectados incluso después de 4 horas de la administración intravenosa del pARNi en ratones.
Por ello un primer aspecto de la invención es un proceso para la obtención de una formulación que comprende pARNi asociado a los componentes plasmáticos, caracterizado porque el proceso comprende una etapa en la que se dispersan los componentes plasmáticos en medio acuoso.
Un segundo aspecto de la presente invención son las composiciones farmacéuticas de pARNi asociado a los componentes plasmáticos obtenibles por cualquiera de los procesos definidos en el primer aspecto o en cualquiera de sus realizaciones particulares.
Un último aspecto de la presente invención es el uso de las composiciones farmacéuticas según cualquiera de las composiciones del segundo aspecto para la preparación de un medicamento.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, los componentes plasmáticos, en especial las proteínas plasmáticas y los lípidos plasmáticos son capaces de asociarse con pARNi, formando compuestos, o complejos, que protegen al pARNi de la degradación de las ARNasas. Para ello es vital que estos componentes plasmáticos estén dispersos, o disgregados. Hay diferentes técnicas conocidas en la técnica para hacer esta disociación, pero una de las usadas, por su versatilidad, economía y facilidad es mediante la utilización de ultrasonidos, ya sea aplicando la fuente de ultrasonidos directamente en la solución o utilizando un baño equipado con una fuente de ultrasonidos. [Japanese Journal of Applied Physics, 47, 2008 páginas 2000-2004].
La proporción entre pARNi y los componentes plasmáticos puede variar entre 1:100 y 1:50000 p/p, pero preferiblemente varía entre 1:500 y 1:10000. Las proporciones que varían entre 1:3000 y 1:5000 son preferidas, porque se obtienen elevadas concentraciones de pARNi, mostrando éste una buena estabilidad.
Preferiblemente cada una de las cadenas del dúplex de pARNi comprende entre 15 y 40 nucleótidos, referidos a los pares de nucleótidos ya que se trata de un ARN bicatenario para conseguir entrar en la célula y más preferiblemente entre 19 y 25 nucleótidos.
La dispersión se puede llevar a cabo a diferentes intervalos de temperatura, pero las temperaturas óptimas serían entre 0 y 85ºC, más preferiblemente entre 5 y 50ºC, y aun más preferiblemente entre 10 y 35ºC. Respecto a la duración de la etapa de dispersión depende de la eficacia del método utilizado, pero normalmente, y en especial cuando se dispersa mediante ultrasonidos, este dura al menos 1 segundo, más preferiblemente al menos 15 segundos, aun más preferiblemente entre 30 segundos y 2 horas, y todavía mas preferiblemente entre 60 segundos y 30 min.
La dispersión, o disgregación, se puede realizar con anterioridad a la mezcla de los componentes plasmáticos con pARNi. Otra alternativa, que a su vez es la preferida, es la realización de la dispersión de los componentes plasmáticos en presencia de pARNi, por lo que la asociación se realiza justo después de que estos se hayan dispersado, por lo que se evita o/y reduce que los componentes plasmáticos se vuelvan a agregar.
Como ya se ha comentado la asociación entre los componentes plasmáticos dispersados y el pARNi son los que mejoran la estabilidad del producto. Estos componentes plasmáticos se puede obtener de diferentes métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo la liofilización del plasma sanguíneo o por ultrafiltración de éste, aunque se puede utilizar como fuente de los componentes plasmáticos, plasma y/o suero, directamente sin ningún tratamiento previo. Esto es sorprendente porque el pARNi es inestable en el plasma per se, pero este pARNi muestra un comportamiento totalmente diferente si el plasma se ha dispersado. Esto es útil porque facilita el proceso de manufacturación, al no ser necesario el aislamiento de los componentes plasmáticos.
El proceso de la invención se puede utilizar para la manufacturación de diversos tipos de formulaciones, pero se han demostrado buenos resultados de absorción y biodistribución cuando éstas son inyectables.
Otra ventaja del presente proceso es que la mejora en la absorción y biodistribución no está limitada a algún tipo de pARNi en concreto. Por ejemplo, se ha conseguido formar los asociados con pARNi sin la necesidad de que esté derivatizado en algunas de sus posiciones terminales 3' ó 5', como por ejemplo en el pARNi sin modificar sintetizado por métodos químicos o sintetizado a partir de un ADN molde mediante la utilización de ARN polimerasa. Aunque se ha observado que también se puede mejorar la estabilidad de pARNi cuando está derivatizado en su posición 3' ó 5' con lípidos, péptidos o carbohidratos, u otra molécula orgánica que retarde la degradación del pARNi por nucleasas, en cualquiera de sus cadenas, ya sea la guía o la acompañante. Además la cadena antisentido o sentido pueden incorporar determinados compuestos para la mejora de la entrada de la molécula en la célula, como puede ser la introducción de compuestos lipófilos como colesterol, ácidos grasos o etc.
El dúplex de pARNi puede comprender derivatización como por ejemplo sustituciones seleccionadas entre 2'-O-metilo-ribonucleótido o 2'-desoxirribonucleótido o 2'-metoxietil-ribonucleótido o 2'-fluoro-desoxirribonucleótido, o 2'-fluoro-arabinonucleótido, nucleósidos de conformación restringida (como los conocidos en inglés con las siglas LNA o HNA), ARN con enlaces fosforotioato, o residuos abásicos o ribitoles o nucleósidos que contienen bases modificadas tales como 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 4-alquinilcitosina, 5-alquiniluracilo, 5-halogenocitosina, 5-halogenouracilo, u otras pirimidinas modificadas, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina, hipoxantina u otras purinas modificadas. La derivatización puede incorporar a cualquiera de las dos cadenas, aunque la cadena acompañante ya que es mas permisiva a los cambios.
El dúplex de pARNi (Y) puede inhibir y/o silenciar, siendo esta inhibición/silenciamiento total o parcialmente respecto de un control, diversos genes de interés farmacológico como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF), receptor de VEGF (VEGF R1/2), factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1), angiopoyetina (ANGPT), apolipoproteína (ApoB), neovascularización vascular (CNV), carboxiquinasa fosfoenol piruvato (PEPCK), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP2), receptor de N-metil-D aspartato (NMDA), citoquina derivadas de los keratocitos (KC), receptor opio de delta (DOR), receptor del dominio de Discoidina (DDR1), gen de la fosfoproteína PIV (PIV-P), oxigenasa hemo (HMOX1), caveloina, transportador de dopamina, proteína fluorescente verde y/o proteína del sarcoma de Swing (EWS-FL/1). Los genes preferidos para silenciar/inhibir son el factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF), receptor de VEGF (VEGF R1/2), factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1). TNF-\alpha es un mediador importante de la apoptosis tanto en inflamación como en la respuesta inmunitaria. Además, la sobreexpresión de TNF-\alpha está confirmada en el desencadenamiento de la patogénesis de muchas enfermedades humanas. Por todo ello la inhibición de esta citoquina es relevante desde el punto de vista biomédico. PEPCK es una proteína importante en el proceso de gluconeogénesis y se encuentra sobreexpresada en la diabetes. Es la responsable de un aumento en la producción de glucosa hepática en pacientes diabéticos y en modelos animales.
Como ejemplos de la presente invención la secuencia de pARNi es: 1) anti-TNF\alpha antisentido o guía 5'-GAG GCU GAG ACA UAG GCA C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 1) y 2) anti-TNF\alpha sentido o acompañante: 5'-GUG CCU AUG UCU CAG CCU C-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 2). En letras mayúsculas se indican los monómeros de ARN, dT representan residuos de timidina. Este dúplex de pARNi (anti TNF-\alpha) ya había sido descrito previamente por regular eficientemente el mARN de TNF-\alpha de ratón (D.R. Sorensen y col. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNA in adult mice. Journal of Molecular Biology 327 (2003) páginas 761-766.). Se han preparado 12 duplexes con diversos compuestos hidrofóbicos en los extremos ya sea en la cadena guía o en la cadena acompañante (Tabla 1). También 3) cadena antisentido o guía anti-PEPCK-C: 5'-UUACAUCUGGCUGAUUCUC-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 5) y 4) cadena sentido o acompañante anti-PEPCK-C: 5'-GAGAAUCAGCCAGAUGUAA-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 6). En letras mayúsculas se indican los monómeros de ARN, dT representan residuos de timidina.
Las composiciones farmacéuticas del segundo aspecto de la invención comprenden una realización preferida de al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los excipientes incluyen cualquier material inerte o no activo usado en la preparación de una forma de dosificación farmacéutica. Por ejemplo, los excipientes de comprimido incluyen, pero no se limitan a: fosfato de calcio, celulosa, almidón o lactosa. Las formas de dosificación líquidas también incluyen líquidos orales por ejemplo en forma de licores o suspensiones, así como disoluciones inyectables. Se puede formular la composición farmacéutica para la administración transdérmica en forma de parche. Todas las composiciones anteriormente descritas pueden contener opcionalmente uno o más de cada uno de los siguientes excipientes: vehículos, diluyentes, colorantes, agentes aromatizantes, lubricantes, agentes solubilizantes, desintegrantes, ligantes y conservantes.
Aunque una de las ventajas de la presente invención es que se puede formular pARNi sin la necesidad de un agente de transfección, éste se puede adicionar a la composición farmacéutica para mejorar aun si cabe las propiedades de ésta, o para vectorizarla. Los agente de transfección preferidos se seleccionan entre uno o mezclas de los siguientes compuestos lipofectina, liptofectamina, oligofectamina, effectene, cellfectina, DOTAP, DOPE, fugene, polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), Jet-polietilenimida, péptidos de penetración celular, péptidos troyanos, péptido TAT, penetratina, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono, lípidos catiónicos y liposomas.
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden tener varios usos, pero los preferidos son para el tratamiento del cáncer, inflamación, colitis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn y/o artritis reumatoides. En general, las composiciones de la presente invención son útiles para la preparación de medicamentos para el silenciamiento génico.
La composición farmacéutica preferidas son para la presente invención se presenta en una forma adaptada a la administración oral o parenteral, preferiblemente parenteral.
La administración de los compuestos de esta invención se puede realizar a través de cualquier procedimiento que libere el compuesto, preferentemente al tejido deseado. Estos procedimientos incluyen las vías oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o intramedular, intraduodenal, etc. Preferiblemente la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse localmente mediante inyección en una zona cercana a la región de interés (intramuscularmente, subcutáneamente, intradérmicamente), inyección en una zona cercana a la región de interés o inyección intravenosa.
Con el propósito de la administración parenteral, se pueden usar así como soluciones acuosas estériles. Si es necesario, tales soluciones acuosas pueden tamponarse de forma adecuada, y el diluyente líquido se convirtió primero en isotónico con el suficiente suero salino o glucosa. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para propósitos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, todos los medios acuosos estériles empleados se pueden obtener con facilidad mediante técnicas estándar bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica.
Definiciones
El plasma sanguíneo es el componente líquido amarillento de la sangre, en el cual las células sanguíneas deberían estar normalmente suspendidas. Representa el 55% del volumen total sanguíneo. La mayor proporción es agua (90% del volumen) y contiene proteínas disueltas, glucosa, factores de coagulación, iones minerales, hormonas y dióxido de carbono (siendo el plasma el principal medio para el transporte de productos excretados) y otros componentes.
El plasma sanguíneo es preparado centrifugando un tubo de sangre fresca, hasta que las células se precipiten en el fondo del tubo. El plasma sanguíneo tiene una densidad aproximada de 1025 kg/m^{3} o 1,025 kg/L. El suero sanguíneo es plasma sanguíneo sin fibrinógeno u otros factores de coagulación.
El plasma contiene una gran variedad de proteínas incluyendo albúmina, inmunoglobulinas y proteínas de coagulación como fibrinógeno. La albúmina constituye cerca del 60% del total de las proteínas del plasma y esta presente en unas concentraciones entre 35 y 55 mg/ml. El plasma es el principal contribuyente de la presión osmótica de la sangre y funciona como molécula transportadora de otras moléculas con baja solubilidad acuosa tales como hormonas solubles en lípidos, enzimas, ácidos grasos, iones metálicos, compuestos farmacéuticos. La albúmina es estructuralmente estable debido a sus 17 puentes disulfuro y es la única que tiene alta solubilidad en agua y tiene el más bajo potencial isoeléctrico (pi) de las proteínas plasmáticas. Debido a su integridad estructural permanece estable bajo condiciones en las cuales otras proteínas se desnaturalizarían.
El plasma está compuesto por un 82,5% de agua, además de numerosas sustancias inorgánicas y orgánicas (solutos del plasma), distribuidas de la siguiente forma: Proteínas plasmáticas (70%): fibrinógeno (7%), inmunoglobulinas (38%), albúminas (54%), otras proteínas (1%): VLDL, LDL, HDL, protrombina, transferrina. Metabolitos orgánicos (no electrolíticos) y compuestos de desecho (20%) fosfolípidos (280 mg/dL), colesterol (150 mg/dL), triacilgliceroles (125 mg/dL), glucosa (100 mg/dL), urea (15 mg/dL), ácido láctico (10 mg/dL), ácido úrico (3 mg/dL), creatinina (1,5 mg/dL), bilirrubina (0,5 mg/dL) y sales biliares (trazas).
Por pARNi se entiende en el contexto de la presente invención como pequeños fragmentos de ARN de interferencia de doble cadena de origen sintético o natural complementarios a la secuencia de los genes que se utilizan para la inhibición específica de los genes de los que son complementarios. Los pARNi están formados por dos cadenas de ARN que se denominan cadena guía (en inglés "guide strand" o "antisense strand") y cadena acompañante (en inglés "passenger strand" o "sense strand"). La cadena guía del pARNi se une a un complejo de proteínas denominado complejo silenciador del RNA de interferencia (en inglés "RNA-interference silencing complex", abreviado como "RISC") y el complejo resultante es el responsable de la degradación celular del RNA mensajero complementario a la cadena guía. Para la unión de la cadena guía al complejo RISC es necesario administrar el ARN de doble cadena o pARNi ya que la cadena guía por sí sola no puede unirse al complejo RISC.
Por pARNi asociado a los componentes plasmáticos se entiende en el contexto de la presente invención como los diferentes complejos formados entre los pARNi y las moléculas presentes de forma natural en el plasma formados después de un proceso de disgregación o dispersión de los componentes del plasma. En el proceso de asociación intervienen de forma mayoritaria interacciones electroestáticas e interacciones hidrofóbicas con los componentes del plasma que mayoritariamente son proteínas sanguíneas (albúminas, fibrinógeno, inmunoglobulinas, HDL, VLDL, LDL, protrombina, transferrina etc...) y en segundo lugar lípidos presentes en el plasma de forma natural (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos, ácidos biliares, etc...).
Por componentes plasmáticos se entiende las moléculas que están disueltas en el plasma de forma natural, y en especial la mezcla de proteínas y lípidos presentes en el plasma. Por la composición del plasma esta mezcla puede contener fibrinógeno, inmunoglobulinas, albúminas, y otras proteínas como son las VLDL, LDL, HDL, protrombina, transferína, etc..., junto con triglicéridos, colesterol, fosfolípidos, ácidos biliares y etc. Las proporciones entre los componentes plasmáticos para su uso en la presente invención, y en especial de las proteínas y de los lípidos puede variar y se puede ajustar según necesidad. Estos componentes pueden consistir básicamente en: o bien proteínas plasmáticas; o bien lípidos plasmáticos; aunque también se pueden encontrar en forma de mezcla de proporciones de proteína vs. lípidos de entre 1:1000 y 1000:1. En una realización preferida la proporción de proteínas a lípidos plasmáticos está alrededor de la relación en la que se encuentra en el plasma.
Por dispersar los componentes plasmáticos en medio acuoso se entiende en el contexto de la presente invención como la aplicación de una fuerza física tal, como la producida por acción de los ultrasonidos, a la solución que comprende los componentes plasmáticos, como por ejemplo el mismo plasma, que resulta en la separación de los agregados moleculares para dar moléculas mas o menos aisladas exponiendo los bolsillos hidrofóbicos y las partes cargadas que estaban ocluidas por el proceso de agregación a los componentes de la solución acuosa, lo que resulta en un aumento de la capacidad de formación de interacciones electroestáticas e interacciones hidrofóbicas con los pARNi. El grado de dispersión de los componentes plasmáticos se podría estimar por diversas técnicas que se basan en el fenómeno
de la dispersión de la luz por las biomoléculas y que permiten estimar el tamaño hidrodinámico de las biomoléculas.
Por el término "expresión génica" se entiende por la producción celular de una proteína determinada codificada por el gen correspondiente. De forma general el gen que se encuentra en los cromosomas presentes en el núcleo de las células se transcribe generando una molécula de ARN mensajero que se libera en el citoplasma. Allí la secuencia del ARN mensajero dirige la síntesis de la proteína. El resultado de este proceso, que se conoce como expresión génica, es la síntesis de una proteína cuya secuencia esta codificada por el gen correspondiente.
Descripción de las figuras
Figura 1 muestra la actividad inhibitoria in vivo de varios pARNi conjugados con lípidos C_{14} y C_{18} contra TNF-\alpha de ratón, usando los protocolos A y B en células HeLa. 1. pARNi sin modificar, 2. pARNi conjugado con colesterol en el extremo 3' de la cadena acompañante, 7. pARNi conjugado con un lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena acompañante, 8. pARNi conjugado con un lípido C_{18} en el extremo 3' de la cadena acompañante, 11. pARNi conjugado con un lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena acompañante y unidades 2'OMe, 12. pARNi conjugado con C_{14}N en el extremo 5' de la cadena acompañante, 14. pARNi de secuencia aleatoria usado como secuencia control negativa. La descripción de las secuencias 1, 2, 7, 8, 11, 12 y 14 de los pARNi se detalla en la Tabla 1 y la estructura química de las modificaciones se presenta los esquemas 1 y 2, Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con la secuencia aleatoria. ***p<0,001, *p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el método ANOVA con el tratamiento de Bonferroni.
Figura 2 muestra la actividad inhibitoria in vivo de pARNi anti-TNF-\alpha conjugados con acridina o quindolina, usando los protocolos A y B en las células HeLa. 1. pARNi sin modificar, 3. pARNi conjugado con acridina en el extremo 3' de la cadena sentido, 4. pARNi conjugado con quindolina en el extremo 3' de la cadena sentido, 14. pARNi de secuencia aleatoria usada como control negativo. La descripción de las secuencias 1, 3, 4 y 14 de los pARNi se detalla en la Tabla 1 y la estructura química de las modificaciones se presenta los esquemas 1 y 2, Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con una secuencia aleatoria. **p<0,01, *p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el método ANOVA con el tratamiento de Bonferroni.
Figura 3 muestra los efectos de la formulación objeto de la invención sobre la actividad inhibitoria in vivo de varios pARNi anti TNF-\alpha conjugados con lípidos C_{14} y C_{18} usando los protocolos A y B en células 4T1. 1. pARNi sin modificar, 2. pARNi conjugado con colesterol en el extremo 3' de la cadena acompañante, 7. pARNi conjugado con un lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena acompañante, 8. pARNi conjugado con un lípido C_{18} en el extremo 3' de la cadena acompañante, 9. pARNi conjugado con lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena guía, 10. pARNi conjugado con lípido C_{18} en el extremo 3' de la cadena guía, 11. pARNi conjugado con un lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena acompañante y unidades 2'-OMe, 12. pARNi conjugado con C_{14}N en el extremo 5' de la cadena acompañante, 14. pARNi de secuencia aleatoria usado como secuencia control. La descripción de las secuencias 1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 14 de los pARNi se detalla en la Tabla 1 y la estructura química de las modificaciones se presenta los esquemas 1 y 2, Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con una secuencia aleatoria. **p<0,001, **p<0,01. El análisis estadístico se realizó usando el método ANOVA con el tratamiento de con el tratamiento de Bonferroni.
Figura 4 muestra el efecto de la formulación objeto de la invención sobre la actividad inhibitoria in vivo de pARNi anti TNF-\alpha conjugados con acridina o quindolina, usando los protocolos A y B en las células HeLa. 1. pARNi sin modificar, 3. pARNi conjugado con acridina en el extremo 3' de la cadena acompañante, 6. pARNi conjugado con acridina en el extremo 3' de la cadena guía, 4. pARNi conjugado con quindolina en el extremo 3' de la cadena acompañante, 5. pARNi conjugado con quindolina en el extremo 3' de la cadena guía, 14. pARNi de secuencia aleatoria usada como control negativo. La descripción de las secuencias 1, 3, 6, 4, 5 y 14 de los pARNi se detalla en la Tabla 1 y la estructura química de las modificaciones se presenta los esquemas 1 y 2, Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con la secuencia aleatoria. **p<0,01, *p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el método ANOVA con el tratamiento de Bonferroni.
Figura 5A muestra los efectos del dúplex de pARNi en ausencia de suero y la figura 5B muestra los efectos de la formulación objeto de la invención sobre la actividad inhibitoria in vivo de pARNi contra PEPCK en células FAO. A. pARNi sin modificar, B. pARNi conjugado con colesterol en el extremo 3' de la cadena acompañante, 14. pARNi de secuencia aleatoria usada como control negativo. La descripción de las secuencias A, B y 14 de los pARNi se detalla en la Tabla 1 y la estructura química de las modificaciones se presenta los esquemas 1 y 2, Se determinaron las cantidades de ARNm producidas por las células después de 48 horas del tratamiento con los pARNi. Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con una secuencia aleatoria. **p<0,01, *p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el método ANOVA con el tratamiento de Bonferroni.
Figura 6 muestra la medida de la fluorescencia del pARNi siGLO en células 4T1 por Citometría de flujo. Células 4T1 fueron transfectadas con 100 nM de pARNi siGLO (Cy3) incubado con diferentes cantidades de suero fetal bovino (0 \muL a 25 \muL) usando ultrasonidos con el protocolo que hemos denominado la formulación objeto de la invención. Después de 24 horas de incubación, las células fueron analizadas en un citómetro de flujo. La entrada celular del pARNi marcado con Cy3 fue cuantificado por la medida de la señal de fluorescencia relativa en el canal Cy3. Las células sin pARNi fueron usadas como control de fluorescencia. Los datos representan las medias \pmES, n=3 y son comparados con células transfectadas con el pARNi sin FBS. ***p<0,001, **p<0,01. Test ANOVA, post-test Bonferroni.
Figura 7 muestra la biodistribución de un pARNi fluorescente.
Se usaron 5 ratones de la cepa ICR de 8 semanas de edad. 2 ratones fueron inyectados vía i.v. con 10 \mug de pARNi siGLO de acuerdo con la formulación objeto de la invención con 450 \muL de suero de ratón, otros 2 ratones recibieron por vía i.v. el pARNi siGLO disuelto directamente en 450 \muL de suero fisiológico y 1 ratón que no fue inyectado, fue usado como control de fluorescencia. Después de 4 horas, los animales fueron sacrificados y los órganos perfundidos en PFA al 4% para luego hacer cortes de los tejidos y observarlos bajo el microscopio confocal. Los datos representan las medias \pmES, n=3 stacks de fotos de cada tejido y se compara la formulación objeto de la invención con el pARNi siGLO disuelto directamente en el suero, entre cada uno de los tejidos. ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05 Test ANOVA, post-test Bonferroni.
Figura 8 muestra un diagrama del proceso para la formulación de la dispersión del pARNi y los componentes del suero mediante el uso de sonicación.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplos Síntesis de oligonucleótidos
Los oligoribonucleótidos se prepararon utilizando un sintetizador de la casa comercial Applied Biosystems modelo 3400 utilizando fosforamiditos de 2-cianoetilo y los protectores de tipo tert-butildimetilsilil (TBDMS) para la protección del grupo hidroxilo en la posición 2'. Se utilizaron las siguientes soluciones: 0,4 M 1H-tetrazol en ACN (catalizador); 3% ácido tricloroacético en DCM (destritilación), anhídrido acético/piridina/tetrahidrofurano (1:1:8) (capping A), 10% N-metilimidazol in tetrahidrofurano (capping B), 0,01 M iodo en tetrahidrofurano/piridina/agua (7:2:1) (oxidación). En las secuencias de ARN, se eliminó el último DMT ya que el grupo DMT no es totalmente estable al tratamiento de fluoruro. El rendimiento medio por etapa de adición de un nucleótidos fue alrededor del 97-98% para los monómeros de ARN. Los soportes poliméricos obtenidos se trataron con una solución concentrada de amoníaco-etanol (3:1) durante 1 h a 55ºC. Los soportes se lavaron con etanol y las soluciones resultantes se combinaron y se evaporaron a sequedad. Los productos resultantes se trataron con 0,15 ml de trietilaminatris(hidrofluoruro)/trietilamina/N-metilpirrolidona (4:3:6) durante 2,5 h a 65ºC con el fin de eliminar los grupos TBDMS. Las reacciones se detuvieron por adición de 0,3 ml de isopropoxitrimetilsilano y 0,75 ml de éter. Las mezclas resultantes se agitaron y se enfriaron a 4ºC. Se formó un precipitado que fue centrifugado a 7000 rpm durante 5 min a 4ºC. Los precipitados se lavaron con éter y se centrifugaron de nuevo. Los residuos se disolvieron en agua y los conjugados se purificaron por HPLC. Columna: Nucleosil 120-10 C18 (250x4 mm); se utilizó un gradiente lineal de 20 min desde 0% a 50% B; con un flujo de 3 ml/min. Las composición de las soluciones utilizadas en el HPLC fueron: solución A: 5% acetonitrilo (ACN) en 100 mM acetato de trietilamonio (pH 6,5) y solución B: 70% ACN en 100 mM acetato de trietilamonio pH 6,5. Los productos purificados se analizaron por espectrometría de masas
MALDI-TOF.
Los espectros de MALDI-TOF se realizaron en un espectrómetro de masas Perseptive Voyager DETMRP, equipado con un láser de nitrógeno de 337 nm utilizando un pulso de 3ns. La matriz utilizada contenía 2,4,6-trihidroxiacetophenone (THAP, 10 mg/ml en ACN/agua 1:1) y citrato amónico (50 mg/ml en agua).
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Oligoribonucleótidos
Las siguientes secuencias de ARN se obtuvieron de fuentes comerciales (Sigma-Proligo, Dharmacon): cadena acompañante control negativo 5'-CAG UCG CGU UUG CGA CUG G-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 3), cadena guía control negativo 5'-CCA GUC GCA AAC GCG ACU G-dT-dT-3' (SEQ ID NO: 4), cadena guía anti-TNF\alpha: SEQ ID NO: 1 y cadena acompañante anti-TNF\alpha: SEQ ID NO: 2. Los monómeros de tipo ARN se detallan en letras mayúsculas, la abreviación dT corresponde timidina. La cadena sentido anti TNF-\alpha con colesterol en el extremo 3': SEQ ID NO: 1-colesterol fue preparada usando el soporte comercial colesterol-tetraetilenglicol (TEG)-3'-CPG (Glen Research). El pARNi fluorescente marcado con Cy3 fue obtenido de fuentes comerciales (siGLO Thermo scientific, Dharmacon USA). Las secuencias de pARNi anti TNF-\alpha habían sido descritas pARNi en la bibliografía para inhibir el mARN de TNF-\alpha de ratón [D.R. Sorensen y col. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNA in adult mice. Journal of Molecular Biology 327 (2003) páginas 761-766.].
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Cultivos celulares, transfección y ensayos celulares
Células HeLa se cultivaron en condiciones habituales: 37ºC, 5% CO_{2}, medio de Dulbecco Eagle modificado, 10% suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, suplementado con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 mg/mL). Todos los experimentos se hicieron a una confluencia del 40-60%. Las células HeLa se transfectaron con 250 ng del plásmido que expresa el gen de TNF-\alpha de ratón utilizando lipofectina (Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Células 4T1 de ratón se cultivaron en condiciones habituales. 100 nM de cada uno de los dúplex de pARNi se incubaron con 10% suero fetal bovino (FBS) antes de su adición a las células 4T1. Al cabo de 24 h la cantidad de TNF-\alpha producida por las células se analizó por el ensayo de ELISA.
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Ejemplo práctico del método objeto de la invención
i) Los pARNi con formula general (N19TT/N19TT) se añadieron al suero fetal bovino en una proporción 0,33 \mug pARNi/25 \mul de suero.
ii) El complejo pARNi/suero fue colocado en un baño de ultrasonidos durante 5-10 minutos.
iii) El complejo pARNi/suero tratado con ultrasonidos fue añadido al cultivo celular en presencia de medio de cultivo celular fresco.
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1) Síntesis de oligoribonucleótidos que contienen moléculas hidrofóbicas para su utilización en ensayo de ARN de interferencia.
Se escogieron como genes diana, los siguientes genes que codifican el factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha): 1) anti-TNF\alpha cadena guía SEQ ID NO: 1 y 2) anti-TNF\alpha cadena acompañante SEQ ID NO: 2. Este dúplex de pARNi (anti TNF-\alpha) ya había sido descrito previamente por regular eficientemente el mARN de TNF-\alpha de ratón (S D.R. Sorensen y col. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNA in adult mice. Journal of Molecular Biology 327 (2003) páginas 761-766.). Se han preparado 12 duplexes con diversos compuestos hidrofóbicos en los extremos ya sea en la cadena guía o en la cadena acompañante (Tabla 1).
Se seleccionaron las siguientes secuencias como genes que codifican el PEPCK-C. 1) cadena antisentido o guía anti-PEPCK-C: SEQ ID NO: 5 y 2) cadena sentido o acompañante anti-PEPCK-C: SEQ ID NO: 6. Estas secuencias no se han descrito previamente.
Se han preparado siete secuencias de oligonucleótidos conjugadas con derivados de C_{14} y C^{18}: Dos cadenas de tipo guía y cinco de tipo acompañante, conjugadas con C_{14} y C_{18} en el extremo 3' (ver esquema 1 y Tabla 1).
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Esquema 1
Estructura química de los lípidos (C_{14}, C_{18} y C_{14}N) unidos a los pARNi 
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1 
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Los oligonucleótidos correspondientes a la cadena acompañante 7 y 8 tienen derivados C_{14} y C_{18} en el extremo 3' respectivamente. El oligonucleótido 12 tiene un derivado de C_{14}N en el extremo 5' (tabla 1). El oligonucleótido 11 tiene un derivado C_{14} en el extremo 3' y varias unidades 2'-O-metil a lo largo de la cadena acompañante menos en las dos últimas timidinas. Se ha descrito que las unidades 2'-O-metil estabilizan las cadenas de ARN de la degradación por nucleasas. La posición de las unidades 2'-OMe (mC = 2'-O-metil-C y mU = 2'-O-metil-U) en el oligonucleótido 11 es 5'-GUG C (mC) U AUG (mU) (mC) U (mC) AG (mC) C (mU) CTT-3' (SEQ ID NO: 7)-C_{14}.
Finalmente, se prepararon cuatro oligonucleótidos conjugados con acridina o quindolina en el extremo 3' (tabla 1): Dos cadenas acompañantes conjugadas con acridina 3 o quindolina 4 respectivamente y dos cadenas guía conjugadas con acridina 6 o quindolina 5. La cadena guía conjugada con colesterol en el extremo 3' fue preparada usando reactivos comerciales. La síntesis de las secuencias de ARN ha sido desarrollada por los inventores de la patente.
TABLA 1 Secuencia de los pARNi que contienen moléculas hidrofóbicas
2
3
G: Cadena guía/A: cadena acompañante. Las secuencias nucleotídicas de dichas cadenas se presentan de 5' a 3'. mC y mU representan la posición de derivados 2'-O-metil-C y 2'-O-metil-U respectivamente.
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Esquema 2
Estructura química de las modificaciones acridina y quindolina incluidas en una de las posiciones 3'-terminales de los pARNi
4
2) Inhibición de TNF-\alpha. Las cadenas guía y acompañante fueron hibridadas y el resultado fue un dúplex o pARNi que se utilizó para inhibir la expresión del gen de TNF-\alpha. Primero se evaluó las propiedades inhibitorias del pARNi en células HeLa con y sin la formulación objeto de la invención. Estas células no expresan el gen TNF-\alpha de ratón por lo tanto, se realizó una cotransfección con el plásmido pCAm que contiene el gen de TNF-\alpha de ratón. Se estudiaron dos protocolos diferentes.
Protocolo A) Las células HeLa fueron transfectadas con 250 ng de plásmido de ratón pCAm TNF-\alpha usando lipofectina. Una hora más tarde las células fueron tratadas con los pARNi (100 nM) sin usar ningún reactivo de transfección, pero fueron incubadas con suero fetal bovino y tratadas con ultrasonidos antes del proceso de transfección. Después de 48 horas la cantidad de TNF-\alpha producida por las células se analizó por ELISA.
Protocolo B) Las células HeLa fueron transfectadas con 250 ng del plásmido de ratón pCAm TNF-\alpha usando lipofectina como se describió en el apartado A. Una hora más tarde las células fueron tratadas con el dúplex de pARNi (100 nM) en ausencia de suero. Después de 48 horas la cantidad de TNF-\alpha producida por las células se analizó por ELISA.
Los resultados de este experimento muestran que la cantidad de TNF-\alpha producido después de 48 horas de la adición de los dúplex de pARNi modificados incubados con un 10% de suero y ultrasonidos (A) o después de la adición sin la incubación (B), son claramente diferentes. Se observó una inhibición entre un 40 y 50% en la producción de la proteína TNF-\alpha comparada con el pARNi de secuencia aleatoria, solamente cuando el pARNi fue transfectado usando la formulación objeto de la invención. La presencia de las unidades de lípidos en los extremos 3' y 5' de la cadena sentido incrementaron la inhibición de la expresión de TNF-\alpha.
La figura 2 indica que los pARNi conjugados con acridina o quindolina pretratados con suero y ultrasonidos produjeron una inhibición entre el 30 y 50% en la producción de TNF-\alpha comparando con el pARNi aleatorio usado como control negativo. No se observó inhibición en ausencia de la formulación objeto de la invención. Solamente la quindolina en el extremo 3' de la cadena sentido incrementó la inhibición de la expresión de TNF-\alpha.
A continuación se estudiaron las propiedades inhibitorias de los pARNi en células de ratón 4T1. Estas células producen TNF-\alpha de ratón de forma endógena. En estos experimentos las células se trataron con el dúplex de pARNi (100 nM) sin la utilización de ningún reactivo de transfección. Los pARNi fueron incubados con suero y ultrasonidos o simplemente añadidos a las células sin tratamiento previo. A las 24 horas la cantidad de TNF-\alpha producida por las células se analizó por ELISA.
Los resultados de la inhibición de TNF-\alpha por los pARNi conjugados con lípidos se muestran en la figura 3. Como se describió para las células HeLa, se puede observar una fuerte inhibición en la producción de TNF-\alpha sólo cuando se utilizó la formulación objeto de la invención. La inhibición más elevada (80%) se observó cuando se utilizó el dúplex de pARNi conjugado con el lípido C_{14} en el extremo 3' de la cadena acompañante (7).
Los resultados de la inhibición de TNF-\alpha por los pARNi conjugados con acridina o quindolina se muestran en la figura 4. Las cadenas guía y acompañante se modificaron en el extremo 3' (3 y 6). Tal como se puede observar, se encontró una fuerte inhibición en la producción de TNF-\alpha usando la formulación objeto de la invención. La inhibición más elevada (60%) se observó con el pARNi conjugado con quindolina en el extremo 3' de la cadena acompañante (4).
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3) Inhibición de PEPCK-C.
Las secuencias guía y acompañante complementarias a PEPCK fueron hibridadas y el dúplex resultante se usó para inhibir la expresión del gen PEPCK-C. Se estudiaron las propiedades del pARNi en células FAO (hepatoma de rata) con y sin la formulación objeto de la invención. Estas células expresan el gen PEPCK-C endógenamente (pckl) por lo tanto no fue necesario realizar cotransfección con el plásmido correspondiente. Se utilizaron los siguientes protocolos:
A) Las células FAO fueron tratadas con el dúplex de pARNi (100 nM) en ausencia de suero. Después de 48 horas la cantidad de ARNm de pepCK-C producido por las células se analizó por qRT-PCR.
B) Las células FAO fueron tratadas con el dúplex de pARNi (100 nM) incubado con suero fetal bovino y ultrasonidos. Después de 48 horas la cantidad de ARNm de PEPCK-C producido por las células se analizó por qRT-PCR.
Los resultados de este experimento demuestran que el pARNi incubado con suero y ultrasonidos mejora significativamente el silenciamiento génico del gen diana Pck1 en las células FAO. Es interesante destacar que la mejoría de la entrada del pARNi por acción de la formulación objeto de la invención, no requiere de modificaciones en el pARNi para ayudar a incrementar la eficiencia. Usando esta metodología el pARNi sin modificar es un buen inhibidor del ARNm de PEPCK-C.
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4) Entrada celular de un pARNi marcado con una molécula fluorescente (Cy3) usando la formulación objeto de la invención''.
Se optimizó el método, suponiendo que la eficiencia del método dependía de la interacción del pARNi con los componentes plasmáticos, determinando la mejor proporción de pARNi/suero. Para ello, se transfectaron células de ratón 4T1 con un pARNi fluorescente marcado con Cy3 incubado previamente con diferentes volúmenes de suero fetal bovino y ultrasonidos (de 0 \muL a 25 \muL), y medimos la entrada del pARNi en las células por citometría de flujo (DakoCytomation, modelo MoFlo) a una velocidad de 1000 células por segundo.
Las imágenes obtenidas usando el citómetro de flujo, muestran que cuando el pARNi siGLO fue transfectado directamente sobre las células con medio suplementado con suero, es decir sin la formulación objeto de la invención, solo el 20% de las células del campo, estaban transfectadas, mientras que en el caso de la formulación objeto de la invención del pARNi siGLO con 15 \mul de FBS, el 50% de las células, presentaban una gran fluorescencia (Figura 6). Según estos datos, la proporción más eficiente para asegurar una mejor entrada del pARNi en las células es 0,33 \mug pARNi/15 \muL suero que será la concentración utilizada en los ensayos in vivo.
Se observó también que al aumentar el volumen de suero, la eficiencia de entrada del pARNi en las células disminuye, esto puede ser debido a una posible saturación de los sitios de unión que tienen las proteínas presentes en el suero.
Pruebas in vivo
5) Administración in vivo del pARNi siGLO en ratones.
Se usaron 5 ratones de la cepa ICR de 8 semanas de edad (Harían, Interfauna Ibérica España). Los animales estuvieron estabulados en condiciones ambientales estándar, temperatura 22ºC, humedad relativa del 70-80% y con un ciclo de iluminación de 12 horas diarias, hasta el momento de realizar los ensayos.
Todos los protocolos usados fueron aprobados previamente por el comité ético de la Universidad de Barcelona y la manipulación de los animales se rigió por la normativa de la Comunidad Europea.
El ensayo consistió en administrar por inyección en la vena de la cola de ratones, 450 \muL de una solución del pARNi fluorescente Cy3, incubado con ultrasonidos o no con suero de ratón conservando una proporción de 0.33 \mug de pARNi: 15 \muL de suero. Después de 4 horas, los animales fueron sacrificados con éter y los tejidos fueron perfundidos con PFA al 4%. Luego los tejidos se cortaron en un Criostat (Leica) con un tamaño de 30 \mum para ser montados en portaobjetos y observados bajo el microscopio confocal (Leica modelo. TCS NT). Se tomaron 3 fotos de cortes longitudinales de cada uno de los órganos, conservando los mismos parámetros de adquisición entre los órganos. La fluorescencia observada en las fotos, fue cuantificada usando un programa de ordenador, el MacBiophotonics ImageJ que permite obtener valores cuantitativos de la fluorescencia de los tejidos.
Como se muestra en la figura 7, después de 4 horas de la administración por vía i.v., los niveles de fluorescencia del siGLO sin la formulación objeto de la invención fueron más bajos en todos los órganos, mientras que se detectaron niveles significativos entre un 20 y un 50% más de pARNi en pulmón, corazón, hígado, bazo y tejido adiposo cuando fue preincubado con suero de ratón. Indicando ésto que la formulación objeto de la invención mejora las propiedades de biodistribución de los pARNi.
<110> Consejo Superior de investigaciones Científicas (CSIC)
\hskip1cm
Universidad de Barcelona 
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<120> Método para la administración de oligonucleótidos
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<130> ES1641.514
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<160> 7
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<170> PatentIn version 3.5
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<210> 1
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<211> 21
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de la secuencia guía o antisentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggcugaga cauaggcact t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de la secuencia acompañante o sentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 2
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gugccuaugu cucagccuct t 
\hfill
21 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de una secuencia guía o antisentido de ARN de Euglena gracilis a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
cagucgcguu ugcgacuggt t 
\hfill
21 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de una secuencia acompañante o sentido de ARN de Euglena gracilis a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 4
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ccagucgcaa acgcgacugt t 
\hfill
21 
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<210> 5
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de la secuencia guía o antisentido del ARN de PEPCK-L de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 5
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uuacaucugg cugauucuct t 
\hfill
21 
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<210> 6
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de la secuencia acompañante o sentido del ARN de PEPCK-L de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3'.
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<400> 6
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gagaaucagc cagauguaat t 
\hfill
21 
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<210> 7
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Fragmento de la secuencia acompañante o sentido del ARN de TNF alfa de Mus musculus a la que se han adicionado dos timinas en el extremo 3' y se han metilado algunos nucleótidos.
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (5)..(5)
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<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "cm" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
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<223> n es a, c, g, t o u
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (10)..(10)
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<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "um" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (10)..(11)
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<223> n es a, c, g, t o u
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "cm" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "cm" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (13)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, t o u
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (16)..(16)
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<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "cm" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (16)..(16)
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<223> n es a, c, g, t o u
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (18)..(18)
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<223> El nucleótido definido como "n" corresponde a un nucleótido "um" de acuerdo con la lista de nucleótidos modificados del cuadro 2 del apéndice 2 de la Norma ST.25
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (18)..(18)
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<223> n es a, c, g, t o u
\newpage
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gugcnuaugn nunagncnct t 
\hfill
21

Claims (31)

1. Un proceso para la obtención de una formulación que comprende pARNi asociado a los componentes plasmáticos, caracterizado porque el proceso comprende una etapa en la que se dispersan los componentes plasmáticos en medio acuoso.
2. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la dispersión de los componentes plasmáticos se realiza mediante ultrasonidos.
3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proporción entre pARNi y los componentes plasmáticos varía entre 1:100 y 1:50000.
4. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la proporción entre pARNi y los componentes plasmáticos varía entre 1:500 y 1:10000.
5. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la proporción entre pARNi y los componentes plasmáticos varía entre 1:3000 y 1:5000.
6. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque como fuente de los componentes plasmáticos se utiliza plasma y/o suero sanguíneo.
7. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la formulación es inyectable.
8. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el pARNi no está derivatizado en su extremo 3' ó 5' en cualquiera de sus cadenas.
9. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el pARNi es de fuente natural (aislado de células), o obtenido por proceso de copia enzimática de un molde de ADN mediante la utilización de ARN polimerasa o sintetizado a partir de un ADN molde mediante la utilización de ARN polimerasa.
10. El proceso según cualquiera de las reivindicación 1 a 7, caracterizado porque el pARNi está derivatizado en su posición 3' ó 5' con al menos un lípido, al menos un péptido, al menos un carbohidrato o cualquiera de sus combinaciones.
11. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el pARNi comprende entre 15 y 40 nucleótidos.
12. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el pARNi comprende entre 19 y 25 nucleótidos.
13. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo a una temperatura entre 0 y 85ºC.
14. El proceso según la reivindicación anterior caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo a una temperatura entre 5 y 50ºC.
15. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo a una temperatura entre 10 y 35ºC.
16. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo al menos durante 1 segundo.
17. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo al menos durante 15 segundos.
18. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo al menos entre 30 segundos y 2 horas.
19. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque la dispersión se lleva a cabo al menos entre 60 segundos y 30 min.
20. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dúplex de pARNi comprende al menos una sustitución seleccionada entre 2'-O-metilo-ribonucleótido; 2'-desoxirribonucleótido; 2'-metoxietil-ribonucleótido; 2'-fluoro-desoxirribonucleótido; 2'-fluoro-arabinonucleótido; nucleósidos de conformación restringida; ARN con enlaces fosforotioato; residuos abásicos o ribitoles; o nucleósidos que contienen bases modificadas tales como 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 4-alquinilcitosina, 5-alquiniluracilo, 5-halogenocitosina, 5-halogenouracilo, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina o hipoxantina.
21. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex de pARNi inhibe/silencia parcial o totalmente la expresión de al menos uno de los siguientes genes: factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF), receptor de VEGF (VEGF R1/2), factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1), angiopoietina (ANGPT), apolipoproteína (ApoB), neovascularización vascular (CNV), carboxiquinasa fosfoenol piruvato (PEPCK), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), proteína inflamatoria de macrófagos (MIP2), receptor de N-metil-D aspartato (NMDA), citoquina derivadas de los keratocitos (KC), receptor opio de delta (DOR), receptor del dominio de Discoidina (DDR1), gen de la fosfoproteína PIV (PIV-P), oxigenasa hemo (HMOX1), caveloina, transportador de dopamina, proteína fluorescente verde y proteína del sarcoma de Swing (EWS-FL/1).
22. El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el dúplex de pARNi (Y) inhibe/silencia, total o parcialmente, la expresión de al menos uno de los siguientes genes: factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha), factor de crecimiento endotelial y vascular (VEGF), receptor de VEGF (VEGF R1/2), factor supresor de colonias de granulocitos (GM-CSF-1) y de macrófagos (M-CSF-1).
23. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de pARNi se seleccionan entre: anti-TNF\alpha antisentido o guía 5'SEQ ID NO: 1; anti-TNF\alpha sentido o acompañante: SEQ ID NO: 2; cadena antisentido o guía anti-PEPCK-C: SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6.
24. Una composición farmacéutica de pARNi asociado a los componentes plasmáticos obtenible por cualquiera de los procesos definidos en las reivindicaciones anteriores.
25. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende al menos un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
26. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende al menos un agente de transfección.
27. La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque el agente de transfección se selecciona de la lista que comprende los siguientes compuestos: lipofectina, liptofectamina, oligofectamina, effectene, cellfectina, DOTAP, DOPE, fugene, polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), Jet-polietilenimida, péptidos de penetración celular, péptidos troyanos, péptido TAT, penetratina, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono, lípidos catiónicos y liposomas.
28. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde se presenta en una forma adaptada a la administración oral o parenteral, preferiblemente parenteral.
29. El uso de las composiciones farmacéuticas según cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento.
30. El uso según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para el silenciamiento génico.
31. El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, inflamación, colitis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn o artritis reumatoides.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102887948B (zh) * 2012-08-24 2014-06-11 复旦大学附属儿科医院 一种抗菌及免疫调节多肽类药物
US10801024B2 (en) 2015-05-20 2020-10-13 Indiana University Research And Technology Corporation Inhibition of lncRNA HOTAIR and related materials and methods
WO2016187578A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Indiana University Research And Technology Corporation Inhibition of lncrna hotair and related materials and methods
WO2018185253A1 (en) * 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
CN110384806B (zh) * 2019-08-26 2021-09-24 西南大学 载药聚多巴胺/树状大分子-金纳米颗粒的制备及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090286851A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-19 Akin Akinc Compositions and Methods for Delivering RNAI Using Lipoproteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090286851A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-19 Akin Akinc Compositions and Methods for Delivering RNAI Using Lipoproteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2005, KINOSHITA M., HYNYNEN K. "A novel method for the intracellular delivery of siRNA using microbubble-enhanced focused ultrasound." Biochemical and Biophysical Research Communications (2005) Vol. 335, pages 393-399. *
2009, AVIÑÓ A., OCAMPO S. M., CAMINAL, C., PERALES J. C., ERITJA R. "Stepwise synthesis of RNA conjugates carrying peptide sequences for RNA interference studies." Mol Divers (2009) Vol. 13, pages 287-293. *

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