ES2363873T3 - Factor viii resistente a la inactivación. - Google Patents

Abstract

Una proteína FVIII activa procoagulante que comprende un polipéptido FVIII humano que es modificado, en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del sitio de unión del factor de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de secuencia de aminoácido entre los dominios A2 y A3.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por lo tanto, se refiere a una proteína FVIII procoagulante activa que comprende un polipéptido FVIII humano que está modificado, en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del factor de unión del sitio de unión de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de la secuencia de aminoácidos entre los dominios A2 y A3.

Antecedentes de la invención

El factor humano VIll:C (el FVIII) es un factor de coagulación deficiente en el trastorno de sangrado relacionado con el cromosoma X, hemofilia A, causa principal de la morbosidad hemorrágica y de la mortalidad en los varones afectados. Tradicionalmente, a los hemofílicos se les ha tratado con transfusiones de sangre entera. Más recientemente, el tratamiento se viene realizando con preparaciones de concentrados de FVIII derivados de plasma humano. Sin embargo, el uso de productos derivados de plasma expone a los pacientes hemofílicos a un posible riesgo de enfermedades transmisibles por virus, tales como la hepatitis y el SIDA. Los costosos programas de purificación que reducen este riesgo aumentan los gastos de tratamiento. Con los aumentos de los gastos y la limitada disponibilidad del FVIII derivado del plasma, a los pacientes se les trata episódicamente según la demanda, en vez de profilácticamente. El FVIII recombinantemente producido tiene ventajas importantes respecto al FVIII derivado del plasma en términos de pureza y seguridad, así como una mayor disponibilidad y en consecuencia, se ha dirigido mucho esfuerzo en la investigación para el desarrollo del FVIII producido recombinantemente. Debido a la naturaleza lábil del FVIII, sobre todo después de su activación, se deben administrar grandes dosis y repetidas de la proteína o del plasma o del derivado recombinante, para conseguir una ventaja terapéutica. Sin embargo, la cantidad de proteína FVIII a la cual el paciente se expone se ha correlacionado con el desarrollo de anticuerpos que inhiben su actividad, a la luz de la conocida inmunogenicidad, uno de los objetivos en el desarrollo de nuevas formas recombinantes de FVIII para su uso como agente terapéutico es el desarrollo de productos que reduzcan o eliminen dicha respuesta inmune.

El FVIII funciona en la ruta intrínseca de la coagulación de la sangre como un cofactor que acelera la activación del factor X por el factor IXa, una reacción que ocurre en la superficie fosfolipídica cargada negativamente en presencia de iones de calcio. El FVIII se sintetiza como un polipéptido de cadena sencilla de 2351 aminoácidos que tiene la estructura del dominio A1-A2-B-A3-C1-C2. Wehar. G.A. et al..; Nature 312:337-342 (1984) y Toole, J.J. et al.; Nature 312:342-347 (1984). La estructura del dominio de FVIII es idéntica a la del factor de coagulación homólogo, el factor V (FV). Kane, W.H. et al.; PNAS (USA) 83:6800-6804 (1986) y Jenny, R.J. et al.; PNAS (USA) 84:4846-4850 (1987). Los dominios A de FVIII tienen 330 aminoácidos y una identidad de aminoácidos del 40 % entre sí y el dominio A de FV y la proteína del plasma que se une al cobre de la ceruloplasmina. Takahashi. N. et al.; PNAS (USA) 81:390-394 (1984). Cada dominio C tiene 150 aminoácidos y muestra una identidad del 40 % respecto a los dominios C de FV, y respecto a las proteínas que se unen a glicoconjugados y fosfolípidos negativamente cargados. Stubbs, J.D. et al., PNAS (USA) 87:8417-8421 (1990). El dominio B de FVIII está codificado por un solo exón y muestra poca homología con cualquier proteína conocida incluyendo el dominio B de FV. Gitschier. J. et al.; Nature 312:326-330 (1984) y Cripe, L.D. et al.; Biochemistry 31:3777-3785 (1992).

El FVIII se secreta en el plasma como un heterodímero de una cadena pesada (dominios A1-A2-B) y una cadena ligera (dominios A3-C1-C2) asociada a través de un enlace de ión metálico divalente no covalente entre los dominios A1 y A3, en el plasma, El FVIII se estabiliza uniéndose al factor de von Willebrand. Más específicamente, la cadena ligera de FVIII se une por interacciones no covalentes a un sitio de unión primario en el extremo amino del factor de von Willebrand. Con la activación proteolítica por la trombina, el FVIII se activa en un heterotrímero de 2 fragmentos de la cadena pesada (A1, un fragmento de 50 kDa, y A2, un fragmento de 43 kDa) y la cadena ligera (A3-C1-C2, una cadena de 73 kDa). La forma activa del FVIII (FVIIla) consiste así en una subunidad A1 asociada a través de la unión del ión metálico divalente a una cadena ligera de A3-C1-C2 dividida de trombina y una subunidad A2 libre asociada con el dominio A1 a través de una asociación iónica (véase la Figura 1A). Eaton. D. et al.; Biochemistry 25: 505 (1986); Lollar, P. et al.; J. Biol. Chem. 266: 12481 (1991); y Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266: 8957 (1991). Este heterotrímero de FVIIla es inestable y está sometido a la rápida inactivación a través de la disociación de la subunidad A2 en condiciones fisiológicas.

Estudios de transfección anteriores han demostrado que el FVIII es secretado 10 veces menos eficazmente que el FV. La secreción ineficaz de FVIII se correlaciona con la unión a la proteína chaperonina identificada como la proteína de unión de la inmunoglobulina (BiP), también conocida como la proteína regulada por la glucosa de 78 kDa (GRP78) (Munro, S. et al., Cell 46:291-300 (1986)) dentro del lumen del RE (Domer. A. J. et al.; EMBO J. 4:15631571 (1992)). La BiP es un elemento de la familia de la proteína de choque térmico que muestra una actividad de ATPasa dependiente de péptido. Flynn, G.C. et al., Science 245:385-390 (1989). La expresión de BiP es inducida por la presencia de proteínas desplegadas o subunidades de proteína no ensambladas dentro del RE. Lee, A.S., Curr Opin. Cell Biol. 4:267-273 (1992) y Kozutsumi, Y. et al.; Nature 332:462-464 (1988). Se ha demostrado que el alto nivel de expresión de FVIII induce la transcripción de BiP. Domer, A.J. et al., J. Biol. Chem. 264:20502-20607 (1989). Además, la liberación de FVIII desde BiP y el transporte desde el RE requiere niveles altos de ATP intracelular. Domer, A.J. et al., PNAS (USA) 87:7429-7432 (1990), en contraste, se ha encontrado que FV no se asocia con BiP y no requiere niveles altos de ATP para la secreción. Pittman, D.D. et al., J. Biol. Chem. 269: 1732917337 (1994). La deleción del dominio B de FVIII proporcionó una proteína que se unía a BIP en un grado menor y se secretaba más eficazmente. Domer, A.J. et al.; J. Cell Biol. 105:2655-2674 (1987). Para evaluar si el dominio B de FVIII era responsable de la interacción de BiP, fueron construidas moléculas de cDNA quiméricas de FV y FVIII en las que fueron cambiadas las secuencias del dominio B. Pittman. D.D. et al.; Blood 84:4214-4225 (1994). Un híbrido de FVIII que alberga al dominio B de FV fue expresado y secretado como una molécula funcional, aunque la eficacia de secreción del híbrido era pobre, similar al FVIII tipo silvestre. Pittman, D.D. et al. Blood 84:4214-4225 (1994). Esto indicaba que la diferencia en la eficacia de secreción entre FV y FVIII no era directamente atribuible a secuencias específicas dentro del dominio B de FVIII, la región más divergente entre estos factores de coagulación homólogos.

Para determinar si las secuencias de aminoácidos específicas dentro de la secreción de inhibición del dominio A de FVIII, fueron estudiadas proteínas quiméricas que contenían los dominios A1 y A2 de FVIII o FV. La proteína quimérica que contiene los dominios A1 y A2 del FV fue secretada con una eficacia similar como el FV tipo silvestre. La quimera complementaria que tiene los dominios A1 y A2 del FVIII fue secretada con una eficacia baja similar a la del FVIII tipo silvestre. Estos resultados sugirieron que las secuencias dentro de los dominios A1 y A2 fueron responsables de una eficacia de secreción baja de FVIII. Una molécula de FVIll con el dominio A1 delecionado fue construida y la secreción fue aumentada aproximadamente 10 veces comparado con el FVIII delecionado del dominio A2 del FVIII tipo silvestre. La expresión del dominio A1 de FVIII solo no proporcionó la proteína secretada, mientras que la expresión del dominio A2 de FVIII solo o el dominio A1 de FV o el dominio A2 solo dirigía la síntesis de la proteína secretada. La secreción de un híbrido en el cual los 110 aminoácidos del extremo carboxilo-terminal del dominio A1 fueron sustituidos por secuencias homólogas del dominio A1 de FV (226-336 híbrido FVIII) también fue aumentada 10 veces comparado con el FVIII tipo silvestre, sin embargo, la proteína secretada no era funcional, es decir no mostró actividad procoagulante, y las cadenas pesadas y ligeras no se asociaron. Marquette. K.A. et al.,

J. Biol. Chem. 270:10297-10303 (1995). Sería deseable por tanto proporcionar una proteína FVIII recombinante funcional con una mayor secreción comparada con la del FVIII tipo silvestre. También sería deseable proporcionar una proteína FVIII recombinante funcional con mayor secreción así como con mayor actividad específica.

Los FVa y FVIIla se inactivan por la proteína C Activada (APC) en presencia de fosfolípidos y CaCl2 y se ha considerado que la resistencia de la APC es una de las causas principales de la trombofilia hereditaria. Dahlbäck, B. et al., PNAS (USA) 90: 1004 (1993). La base molecular de la resistencia a la APC fue atribuida a la resistencia a la división y a la inactivación de la APC. Dahlbäck, B. et al., PNAS (USA) 91: 1396 (1994). Los estudios anteriores de la inactivación de APC de FVIII mostraron la generación de un fragmento de 45 kDa (Fulcher, C.A. et al., Blood 63: 486 (1984)) derivado del extremo amino-terminal de la cadena pesada y fue propuesto que resultaba de la división en Arg336. Eaton, D. et al., Biochemistry 25: 505 (1985). Aunque la cadena ligera de FVIII no se divide por APC, se han observado polipéptidos múltiples, que representan fragmentos de la digestión intermedios y terminales derivados de la cadena pesada. Walker, F.J et al.; Arch. Bioch. Biophys. 252; 322 (1987). Estos fragmentos resultan de posiciones del sitio de división en Arg336, la unión del dominio A1 y A2, en Arg562, biseccionando el dominio A2, y un sitio en la unión de A2-B, probablemente en Arg740. Fay, P.J. et al.; J. Biol Chem. 266: 20139 (1991). La división de APC de FVIII en el residuo 336 genera un fragmento de 45 kDa del extremo amino-terminal del dominio A1 y la división en los residuos 562 y 740 genera un fragmento de 25 kDa del extremo carboxi-terminal del dominio A2 (véase la Figura 1A).

Estudios anteriores han demostrado que el dominio B de FVIII es prescindible para la actividad del cofactor FVllI. Las moléculas FVIII genéticamente modificadas que tienen grados variables de la deleción del dominio B (BDD) producen especies de FVIII de cadena sencilla secretadas en las cuales no se observa ninguna proteólisis intracelular del producto de traducción primario. Estos mutantes de FVlIl de BDD son ventajosos porque se producen más eficazmente en células mamíferas. La caracterización funcional de estas moléculas de FVIII de BDD demostró que la actividad del cofactor FVIIl es retenida si ocurre la división de trombina después de Arg372, Arg740 y Arg1689. Por lo tanto, cualquier construcción funcional de FVIII genéticamente modificado hasta ahora genera un heterotrímero FVIIla después de la activación de trombina. Las ventajas funcionales de las construcciones de FVIII de BDD anteriores están limitadas, por lo tanto, por la rápida disolución de la subunidad A2 no covalentemente unida de FVIIla. Pittman et al. PNAS 85 (1988), 2429-33 describe la expresión de una proteína FVIII que comprende una deleción de los residuos 1001-1581, lo que constituye una parte del dominio B incluyendo el sitio de unión del factor vW y una mutación en el residuo Arg740. Esta proteína no muestra, p. ej., mayores niveles de secreción.

Es, por lo tanto, deseable proporcionar una mejor proteína FVIII recombinante. También es deseable proporcionar una proteína FVIIla que sea resistente a la activación, además es deseable proporcionar una proteína FVIIla que sea resistente a APC. También es deseable proporcionar una proteína FVIII que tenga una mayor secreción comparado con la FVIII tipo silvestre. Es deseable además proporcionar la proteína FVlII que tiene una mejor secreción y resistencia frente a APC. También es deseable proporcionar la proteína FVIII con una mayor resistencia de la inactivación y secreción. También es deseable proporcionar un método para tratar a pacientes hemofílico con un FVIIl recombinante mejor. Es deseable además proporcionar un método para tratar a pacientes hemofílicos vía una terapia de reemplazo, en la que la cantidad de la proteína FVIII requerida para tratar al paciente es menor.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una proteína FVllI activa procoagulante y moléculas de ácidos nucleicos que codifican dicha proteína como se caracteriza en las reivindicaciones.

Se ha encontrado sorprendentemente que bajo la activación por trombina, esta proteína es un heterodímero, en el que el dominio A2 permanece covalentemente asociado con la cadena ligera (véase la Figura 1B). Esta configuración heterodimérica es más estable que la configuración heterotrímera tipo silvestre y tiene un aumento doble aproximado de la actividad específica comparado con el FVIII tipo silvestre purificado. Así, en una realización preferida, el FVIII de la presente invención es secretado como un polipéptido de cadena sencilla que, bajo la activación por trombina, consigue una heterodímero FVIII resistente a la inactivación. Por conveniencia, este nuevo FVIII de la presente invención se denomina de forma general en este documento "FVIII resistente a la inactivación".

Será apreciado por los expertos en la técnica que debido a la resistencia a la inactivación de las proteínas de la presente invención y la consecuente mayor actividad específica, puede ser administrada una dosis inferior de la proteína a pacientes hemofílicos en la terapia de reemplazo del FVIIl. Así, utilizando las proteínas de la presente invención, se reduce la exposición total de la proteína al paciente, reduciéndose así la probabilidad de formación de inhibidor. Se apreciará además que el nuevo FVIII de la presente invención también será útil en las aplicaciones de la terapia génica.

Otros objetos, ventajas y características de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones añadidas, tomadas junto con los dibujos que acompañan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Serán evidentes diversas ventajas de la presente invención para cualquier experto en la técnica leyendo la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones añadidas y que se refirieren a los dibujos siguientes en los que:

La figura 1A es un diagrama de FVIII tipo silvestre y las estructuras del dominio de FV;

La figura 1B es un diagrama del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención;

La figura 2 es una tabla que muestra que la actividad de secreción proteínas FVIII mutadas de A-1 de la presente invención comparado con el FVIII tipo silvestre;

La figura 3 es un gráfico que muestra la activación de trombina del FVIII resistente a APC de la presente invención y el FVIII tipo silvestre;

Las figuras 4A y 4B son fotografías de geles que muestran la expresión y la división de trombina del FVIII resistente a APC de la presente invención;

Las figuras 5A y 5B son fotografías de geles que muestran la división de APC del FVIII resistente a APC de la presente invención;

La figura 6 es una fotografía de un gel que muestra el FVIII tipo silvestre purificado y resistente a APC de la presente invención;

Las figuras 7A y 7B son gráficas que muestran la inactivación funcional mediada por APC del FVIII tipo silvestre y resistente a APC de la presente invención;

La figura 8 es un diagrama de la estructura del dominio del FVIII resistente a la inactivación de la cadena sencilla de la presente invención;

La figura 9 es un diagrama de la estructura de dominio de la proteína FVIII heterodímera resistente a la inactivación de la presente invención;

La figura 10 es una fotografía de un gel que muestra la síntesis relativa y los niveles de secreción del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención;

La figura 11 es una fotografía de un gel que muestra los modelos de división del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención;

La figura 12 es una gráfica que muestra la activación funcional y la inactivación del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención comparado con el FVIII tipo silvestre;

La figura 13 es una gráfica que muestra la activación y la tasa reducida de inactivación del FVIII resistente a la inactivación purificado por inmunoafinidad de la presente invención comparado con el FVIII tipo silvestre;

La figura 14 es una gráfica que ilustra los resultados de un ensayo ELISA que demuestra la unión de vWF inducible por anticuerpo del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención;

La figura 15 es una gráfica que ilustra los resultados de un ensayo ELISA que demuestra la unión de vWF inducible por anticuerpo del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención después de la activación por trombina; y

La figura 16 es una gráfica que ilustra los resultados de un ensayo ELISA que demuestra la unión de vWF inducible por anticuerpo del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención después de la activación por trombina y la actividad de FVIII retenida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican el FVIII activo procoagulante y la proteína codificada por dichas secuencias de ácidos nucleicos que son caracterizadas además en las reivindicaciones.

En una realización preferida, los sitios de división de APC Arg333 y Arg562 mutan a isoleucina y lisina, respectivamente (R335I y R562K). La proteína FVIIl resultante es resistente a APC.

El espaciador de la secuencia de aminoácidos tiene una longitud suficiente para permitir que la proteína sea activada por trombina para conseguir un heterodímero, en el que el dominio A2 queda covalentemente asociado con la cadena ligera. En una realización preferida, el espaciador tiene aproximadamente 54 residuos de longitud. En otra realización preferida, el espaciador comprende los 54 residuos de la parte amino del dominio B tipo silvestre de FVIII, es decir los residuos de 741 a 794, en el que el residuo 794 es treonina o leucina. El polipéptido de cadena sencilla (el nuevo FVIII, también denominado en este documento el IR8) bajo la activación con trombina, se vuelve un heterodímero (el nuevo FVIIla, también denominado en este documento el IR8a), que tiene un quíntuplo incremento aproximadamente de la actividad específica comparado con el FVIII tipo silvestre purificado.

En una realización más, el FVIll resistente a la inactivación de la presente invención puede ser empleado en combinación con un anticuerpo que aumente la afinidad de unión de la proteína a vWF. Por ejemplo, cuando el FVIII resistente a la inactivación delecionada del sitio de unión de vWF de la presente invención está en presencia de ESH8, un anticuerpo monoclónico de ratón comercialmente disponible (American Diagnostics, Inc. Greenwich, Connecticut), que reconoce un epítopo en los aminoácidos de 2248 a 2285 dentro del dominio C2, el FVIII resistente a la inactivación se une a vWF. Como se expone con mayor detalle en el Ejemplo 4, el FVIII resistente a la inactivación de la presente invención tiene al menos una menor afinidad de 10 veces para vWF comparado con el FVIII tipo silvestre, sin embargo, en presencia de ESH8, tiene sólo una menor afinidad de 2 veces para vWF. Se ha descrito recientemente que ESH8 puede funcionar como un inhibidor de la activación del FVIII tipo silvestre aumentando la afinidad de FVIII dividido por trombina (FVIIla) para vWF. Saenko, E.L. et. al., Blood 86, Nº. de resumen 749 (1995). Retrasando la liberación de FVIIla de vWF, la disociación de A2 y otras divisiones proteolíticas probablemente inactivan el FVIIla antes de que pueda soltarse totalmente de vWF y ejercer su función de cofactor. También se ha descrito un anticuerpo inhibidor humano que reconoce un epítopo en los aminoácidos de 2218 a 2307 dentro del dominio C2 que parece inhibir la activación de FVIII tipo silvestre por un mecanismo similar y puede usarse de manera similar para inducir la unión de vWF. Shima, M. et al., Blood 86, Nº. resumen 748 (1995) y Shima,

M. et al., British J. Hematol 91: 714-721 (1995).

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención codifican las proteínas FVIII que muestran resistencia de inactivación y/o mayor secreción.

Se apreciará que debido a la mayor actividad específica de las proteínas de la presente invención, se puede administrar una dosis inferior de la proteína a pacientes hemofílicos manteniendo niveles de actividad de FVIII terapéuticamente eficaces. Además de la economía de costes, utilizando las proteínas de la presente invención en terapia de reemplazo del FVIII, la exposición total de la proteína al paciente se reduce, bajando así la probabilidad de la formación del inhibidor. Se apreciará además que las proteínas de la presente invención también son útiles en tratamientos relacionados con terapia génica.

Las secuencias de ADN para el FVIII humano son conocidas, por ejemplo como métodos de expresión (véase, p.ej. Toole et al., Nature 312:312-317 (1984); Wood et al.; Nature 312:330-337, Vehar et al., Nature 312:337-342, la patente de EE.UU. Nº. 4.757.006 y los documentos WO 87/04187, WO 88/08035 y WO 88/03558). Las nuevas secuencias de ácidos nucleicos purificadas y aisladas que codifican la proteína FVIII de la presente invención, es decir una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido sustancialmente la misma que la FVIII humana o sus variantes modificadas como son conocidas en la técnica y descritas en este documento, se pueden hacer por técnicas convencionales. Por ejemplo, las mutaciones en Phe309 y los sitios de división de APC y trombina se pueden hacer así por mutagénesis dirigida del cDNA. Cualquier experto en la técnica reconocerá que "mutación" se refiere a cualquier modificación incluyendo, pero sin limitación, sustituciones, inserciones y deleciones. Se apreciará además que el resto de la secuencia de ácido nucleico de FVIII puede variar del FVIIl tipo silvestre por contener otras modificaciones, como las descritas en la patente de EE.UU. Nº. 5 004 803 y los documentos WO 86/06101 y WO 87/07144. Se han desarrollado análogos de FVIII para entender mejor los requerimientos estructurales específicos para la capacidad de actividad de FVIII, la capacidad de inactividad y la eficacia in vivo y también están dentro del ámbito de la presente invención. Están incluidas entre las características que se optimizan la preparación simplificada; la facilidad de administración, la estabilidad, las mejores características de aclaración/distribución, la menor inmunogenicidad y un período de semivida prolongado. Además, se apreciará que las variantes de las secuencias de ácidos nucleicos de FVIII de acuerdo con la presente invención también incluyen variaciones alélicas, es decir, variaciones en la secuencia debido a la variabilidad natural de individuo a individuo, o con otras sustituciones del codón o deleciones que todavía retienen la actividad procoagulante del FVIIl-tipo.

Las formas de ácidos nucleicos alternos, tales como el ADN genómico, cDNA y el ADN preparado por síntesis química parcial o total de nucleótidos, así como el ADN con mutaciones, también está dentro de lo que se contempla en la invención.

La asociación de secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas por la invención con la expresión de especies homólogas o heterólogas, secuencias de control, tales como promotores, operadores, reguladores y otros por el estilo, permiten la transcripción in vivo e in vitro para formar el mRNA que, por su parte, es susceptible a la traducción para proporcionar las nuevas proteínas de FVIII y poli- y oligo-péptidos relacionados en grandes cantidades. La presente invención comprende así los productos de expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, así como las formas activadas de estos productos de expresión. En un sistema de expresión actualmente preferido de la invención, las secuencias que codifican el FVIll operativamente asociados con una secuencia promotora reguladora que permite la transcripción y la traducción en una célula mamífera para proporcionar, por ejemplo, el FVIIl con actividad de coagulación.

Como se usa en este documento, la expresión FVIII "activo procoagulante" y "activo" se puede usar de modo intercambiable se refiere a uno o varios polipéptido(s) o proteínas que muestran actividad procoagulante en un ensayo de coagulación. El término FVIll se puede usar en este documento para abarcar a FVIIla y cualquier experto en la técnica apreciará a partir del contexto en el cual los términos se usan qué término es re querido (FVIII activado con pre-trombina o FVIII activado con trombina (FVIIla)). Como se usa en este documento, el término "polipéptidos" incluye no sólo moléculas proteicas de longitud completa sino también sus fragmentos que, por ellos mismos o con otros fragmentos, generan la actividad procoagulante de FVIII en un ensayo de coagulación. Se apreciará que los polipéptidos sintéticos de los nuevos productos proteicos de la presente invención también están dentro del ámbito de la invención y pueden ser fabricados según los métodos sintéticos estándares. También se apreciará que en el sistema de enumeración de aminoácidos usado en este documento, el residuo del aminoácido 1 es el primer residuo de la proteína FVIII natural y madura. Se apreciará además que el término "dominio" se refiere a las regiones aproximadas de FVIIl, conocidas por los expertos en la técnica.

La incorporación de las secuencias de la presente invención en células huésped procarióticas y eucarióticas por procesos de transformación y de transfección estándar, que implican potencialmente vectores de plásmido de ADN viral y circular adecuados, también está dentro de lo que se contempla en la invención. Los vectores de expresión de células procarióticas y eucarióticas que contienen y son capaces de expresar las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser sintetizados por técnicas conocidas por los expertos en esta técnica. Los componentes de los vectores, tales como replicones bacterianos, genes de selección, potenciadores, promotores y similares, pueden ser obtenidos a partir de fuentes naturales o pueden ser sintetizados por procedimientos conocidos (véase, p.ej. Kaufman et al., J. Mol Biol. 159:501-621 (1982) y Kaufman, PNAS 82:589-593 (1995)). Los vectores de expresión útiles en la producción de proteínas de esta invención también pueden contener a promotores inducibles o pueden comprender sistemas de expresión inducibles como son conocidos en la técnica.

Las líneas celulares establecidas, incluyendo las líneas celulares transformadas, son adecuadas como huéspedes. Las células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, así como explantas primarias (incluyendo células relativamente no diferenciadas, tales como células madre hematopoyéticas) también son adecuadas. Las células candidato no tienen que ser genotípicamente deficientes en el gen de selección siempre que el gen de selección sea dominantemente actuante.

El uso de células huésped mamíferas proporciona tales modificaciones pos-translacionales, p.ej procesamiento proteolítico, glucosilación, tirosina, fosforilación de serina o treonina, como puede hacerse para conferir la actividad biológica óptima sobre los productos de expresión de la invención. Las líneas de células de mamíferos establecidas son así preferidas, p.ej células CHO (Ovario de Hámster Chino). O bien, el vector puede incluir todo o parte del genoma del virus papiloma bovino (Lusky et al.; Cell 35:391-401 (1984)) y puede llevarse a cabo en líneas celulares, tales como células de ratón de C127 como un elemento episomal estable. Otras líneas celulares mamíferas utilizables incluyen células HeLa, COS-1 de mono, líneas celulares de melanoma, tales como células de Bowes, células de ratón L-929, líneas 3T3 derivadas de Swiss, de ratón Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK, y otros por el estilo.

Sea el que sea el tipo de vector de expresión que se use, puede ser preferible co-expresar los ácidos nucleicos de FVIII de la presente invención con una secuencia de ácido nucleico que codifica el factor de von Willebrand (vWF) o sus análogos, p.ej como se describe en los documentos WO 87/06101, WO 88/08035 y la patente de EE.UU. Nº.

5.250.421. También puede preferirse expresar la proteína en medios que contienen un inhibidor de proteasa, tal como aprotinina, p.ej en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 %, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 %, (vol/vol) (Aprot., 15-30 unidades de inhibidor de Tripsina (TIU)/ml, Sigma) o las cantidades correspondientes de unidades de actividad de otros inhibidores de proteasa.

Se seleccionan los transformantes estables para la expresión del producto procoagulante, por ensayos inmunológicos estándar o de actividad. La presencia del ADN que codifica las proteínas procoagulantes puede detectarse mediante procedimientos estándares, tales como la transferencia Southern. La expresión transitoria de los genes procoagulantes durante varios días después de la introducción del vector de expresión en células huésped adecuadas, tales como células de mono COS-1, se mide sin selección por ensayos de actividad o inmunológicos de las proteínas en el medio de cultivo. Siguiendo la expresión del ADN por medios convencionales, la proteína así producida puede ser recuperada, purificada y/o caracterizada con respecto a parámetros fisicoquímicos, bioquímicos y/o clínicos, todos por métodos conocidos.

En una realización más, las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden usar en aplicaciones de terapia génica, p.ej para tratar la hemofilia causada por la deficiencia del FVIII. Debido a la mayor actividad específica de las proteínas FVIII de la presente invención, puede conseguirse una actividad de FVIII terapéuticamente eficaz con niveles de expresión de proteína inferiores comparado con otras formas de FVIII incluyendo el FVIII tipo silvestre. Los métodos de esta invención comprenden así la etapa de introducir las secuencias de nucleótidos de la presente invención en una célula diana. A fin de efectuar la transferencia, las secuencias de nucleótidos que se transfieren deben estar asociadas con un vehículo capaz de transformar la célula diana. Los expertos en la técnica apreciarán que tales vehículos incluyan sistemas de administración de terapia génica conocidos incluyendo, pero sin limitación, vectores adenovirales, retrovirales y virales adeno-asociados, así como complejos de ADN-proteína y liposomas.

La invención será explicada a continuación con los siguientes ejemplos ilustrativos y procedimientos, que son puramente ejemplares, y no deberían ser tomados como una limitación del alcance verdadero de la presente invención. El ejemplo 1 describe la preparación y el análisis del FVIII mutado del dominio A1 de la presente invención. El ejemplo 2 describe la preparación y el análisis del FVIII resistente a APC de la presente invención. El ejemplo 3 describe la preparación y el análisis del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención. El ejemplo 4 describe la unión del vWF inducible del FVIIl resistente a la inactivación de la presente invención.

El ejemplo 5 describe composiciones farmacéuticas y métodos de uso de las proteínas FVIII y secuencias de nucleótidos de la presente invención.

EJEMPLO 1

PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DEL FACTOR VIII MUTADO DEL DOMINIO A1

Se aplicó un algoritmo estadístico (Blond-Elguindi. S. et al., Cell 75:717-728 (1993)) para predecir el potencial de unión de BiP de péptidos de 7-mero a la región 226-336 de FVIII (el residuo 1 es el primer residuo de aminoácido de la proteína FVIII natural y madura). Se encontró que los residuos de Leu303 a Phe309 tenían un valor de unión de BiP de +14 donde cualquier resultado mayor de +10 tiene una probabilidad muy alta de unirse a BiP. Fay, P.J. et al.,

J. Biol. Chem. 266:8957-8962 (1991). Esta región contiene un racimo hidrófobo donde 7 de 11 residuos de aminoácidos son Leu o Phe.

Inicialmente los 7 residuos de Leu y Phe en la bolsa de unión de BiP potencial fueron mutados a Ala. Se utilizó mutagénesis dirigida por la mutagénesis (PCR) de la reacción en cadena de polimerasa de extensión del sobrelapamiento. Fue producido un FVIII/FV quimérico en el que los residuos 226-336 de FVIII fueron sustituidos por los residuos homólogos de FV (residuos 198-313). Marquette, K.A. et al., J. Biol. Chem. 270:10297-10303 (1995). Los cebadores parcialmente complementarios que contenían la mutación fueron utilizados con dos cebadores dirigidos a los sitios Mlul en 226 y 336 en el cDNA quimérico de FVIII/FV para amplificar dos productos sobrelapantes que contienen la mutación dirigida. Estos dos fragmentos se aislaron y se fusionaron juntos por PCR utilizando los dos cebadores que contienen el sitio MIul. El fragmento de Mlul resultante fue entonces subclonado en la quimera de 226-336 de FVIII/FV digerido con Mlul dentro del vector de expresión pMT2. Todas las mutaciones fueron confirmadas por la secuenciación del ADN respecto a la región amplificada de la PCR. Los vectores de expresión que codifican a estos mutantes fueron transfectados en células COS-1 y el medio fue acondicionado tomado a 60 horas para el análisis de la actividad de FVIII por el ensayo de actividad Coatest. Cuando se mutaron todos los 7 residuos Leu y Phe en la bolsa de unión de BIP potencial a Ala, la molécula no fue secretada. Posteriormente, los residuos Phe fueron mutados individualmente a los residuos de aminoácidos respectivos en FV. La secreción de los mutantes F309S (solos o en combinación con otros "mutantes) aumentó de forma reproducible 2 veces en varios experimentos de transfección. Como se muestra en la Figura 2, las mutaciones en otros residuos adyacentes (F293S, F306W) no mejoraron la secreción. La mayor secreción de los mutantes F309S guardó correlación con un aumento de 2 veces del antígeno de FVIII, indicando una actividad específica similar al FVIII tipo silvestre. El marcaje metabólico por [35S]-metionina durante 20 minutos con un seguimiento de 4 horas en medio que contiene metionina no marcada en exceso indicó que el aumento de la secreción de los mutantes F309 y Q,F305/309K,S se correlacionaba con el aumento de la secreción comparado con el FVlIl tipo silvestre.

Se modificaron genéticamente líneas celulares CHO establemente transfectadas que expresaban al mutante F309S. De los 35 clones celulares de CHO transfectados originales seleccionados para la expresión de dihidrofolato reductasa, fueron obtenidos 5 clones que expresaban niveles significativos de FVIIl (aproximadamente 1 U/mI/106 células/día). Dos de estos clones expresaban el mismo nivel de FVIII que la línea celular 10A1 original que fue obtenida rastreando más de 1000 clones celulares transfectadas originales. Kaufman. R.J. et al., J. Biol Chem, 263:6352-6362 (1988). Así, a bajas concentraciones de metotrexato, se permite que se obtenga más fácilmente una mutación con un alto nivel de expresión de FVIll.

Se realiza otra selección en metotrexato para determinar si se mejora la productividad máxima de FVIIl/célula. Los experimentos se realizan para medir la interacción de BiP y la dependencia del ATP respecto a la secreción para el mutante de FVIII funcional de F309W/S en las células CHO establemente transfectadas.

EJEMPLO 2

PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DEL FACTOR VIII RESISTENTE A APC

Procedimientos Experimentales

Materiales. Se obtuvieron plasma deficiente en FVIll y plasma humano reunido normal del George King Biomedical, Inc., (Overland Park, Kansas). Se usó el anticuerpo monoclónico a la cadena pesada de FVIII (F8) conectado a CL4B-sepharose y puede prepararse por métodos conocidos. La tromboplastina parcial activada (reactivo APTT Automatizado) fue comprada en General Diagnostics Organon Teknika Corporation (Durham, Carolina del Norte). El inhibidor de tripsina de soja, fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) y la aprotinina fueron comprados en Boehringer, Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania). La -trombina humana fue obtenida de Sigma Chemical Co. (San Louis, Misuri). El APC humano fue comprado en los Laboratorios Enzyme Research, Inc., (South Bend, Indiana). El medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), la -modificación del Medio Eagle (-MEM) y el DMEM libre de metionina fueron obtenidos de Gibco BRL (Gaithersburg, Maryland). El suero bovino fetal fue comprado en los Laboratorios PAA Inc., (Playa de Newport, California).

Construcción del plásmido. Se realizó la mutagénesis mediada por oligonucleótido por el procedimiento de doble hélice hetero con huecos para introducir las mutaciones Arg336Ile (R3361) y/o Arg562Lys (R562K) en el cDNA de FVIII clonado en el vector de expresión pED6, como se describe anteriormente. Pittman, D.D. et al.; Methods in Enzymology, volumen 222 (San Diego, California; Academic Press. Inc.,) p. 236 (1993) y Toote. J.J. et al.; PNAS (USA) 83:5939 (1986). Las mutaciones fueron confirmadas por la digestión de endonucleasa de restricción extensa y el análisis de secuencia de ADN. Las moléculas resultantes fueron denominadas R336I o R562K y el mutante doble, denominado en este documento como FVIII resistente a APC, fueron denominados R336I/R562K. Además, también se construyó un mutante doble R3361/K33B1.

Análisis de síntesis y secreción. El ADN del plásmido se transfirió en células COS-1 por el procedimiento de dietilaminoetilo (DEAE) - dextrano como se ha descrito. Pittman, D.D. et al., Methods in Enzymology, volumen 222 (San Diego, California; Academic Press. Inc.,) p. 236 (1993). El medio acondicionado fue recogido 60 horas después de la transfección en presencia de suero bovino fetal al 10 % inactivado con calor (FBS) para el ensayo de FVIII. Posteriormente, las células se marcaron metabólicamente con [35S]-metionina como se describe antes. Pittman. D.D. et al., Methods in Enzymology, Vol 222 (San Diego, California; Academic Press, Inc,) p. 236 (1993). El medio acondicionado marcado fue recogido y se inmunoprecipitó con el anticuerpo F8 unido a CL-4B sepharose. Las proteínas inmunoprecipitadas del medio acondicionado fueron lavadas con PBS que contiene Tritón X-100, fueron suspendidas de nuevo en Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, CaCl2 2,5 mM y glicerol al 5 % (tampón A), y fueron tratados con o sin 8,5 U/ml de trombina a 37ºC durante 1 hora. Las muestras fueron analizadas por electroforesis de gel de dodecil-sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones reductoras y fueron visualizadas por autoradiografía después fluorografía por tratamiento con En3hance (Dupont; Boston, Massachusetts).

Análisis de división de APC de FVIII. Fueron suspendidos de nuevo FVIII radiomarcado e inmunoprecipitado con el tampón A y se trataron con 30 g/ml de APC bovino en presencia de 100 g/ml de inositina y CaCl2 10 mM a 37ºC durante 1,5 horas. Los polipéptidos resultantes fueron separados por SDS-PAGE y se visualizaron por autoradiografía como se ha descrito anteriormente.

Generación de líneas celulares de CHO y purificación de FVIII. A fin de obtener grandes cantidades de FVIII, se modificaron genéticamente líneas de células CHO establemente transfectadas que contenían el ADN que codifica el FVIII tipo silvestre y el resistente a APC. Los plásmidos de expresión se digirieron con Cla1 y se transfectaron en células CHO usando el método de lipofección. Pittman, D.D. et al.; Methods in Enzymology, Vol 222 (San Diego, California; Academic Press, Inc.) p. 236 (1993). Se aplicaron los medios acondicionados a una columna de CL-4B sepharose acoplada al anticuerpo de F8. El FVIII unido se eluyó en tampón que contenía etilenglicol al 60 % y se concentró por diálisis contra un tampón que contenía polietilenglicol al 10 % (PM 15K-20K). Fay. P.J. et al., J. Biol. Chem. (en prensa) (1996). Las muestras concentradas se dializaron contra tampón A modificado que contenía CaCI2 5 mM; (tampón B). La actividad de coagulación del FVIII de las preparaciones purificadas fue aproximadamente 20 U/ml. La estructura de las proteínas purificadas fue evaluada por SDS-PAGE y tinción de plata (Laboratorios Bio-Rad; Hercules, California).

Ensayo de FVIII. Las actividades de FVIII fueron medidas en un ensayo de coagulación de una etapa usando plasma deficiente en FVIII como sustrato. Una unidad de actividad de FVIII es la cantidad medida en 1 ml de plasma reunido de humano normal. Para la activación de trombina, el medio acondicionado fue diluido en tampón A y se incubó a temperatura ambiente con 1 U/ml trombina. Después de la incubación para aumentar los períodos de tiempo, las partes alícuotas fueron diluidas y analizadas según la actividad de FVIII.

Inactivación de APC de FVIII. Las muestras de FVIII purificadas diluidas a 3 U/ml en tampón B fueron mezcladas 5 con 100 g/ml de inositina y APC humano 100 ng/ml o tampón solo como control. Después de períodos de tiempo crecientes a 37°C, las alícuotas fueron diluidas y fue determinado el FVIII residual.

Efecto del FVIII resistente a APC en el ensayo de resistencia a APC. Veinte U/ml del FVIII purificado fueron diluidos con plasma deficiente en FVIII a 1 U/ml. Estas muestras fueron analizadas mediante un kit de ensayo de resistencia a APC comercializado (Coatest APC Resistance; Chromogenix, Molndal, Suecia) según el fabricante.

10 Resultados

Las moléculas de FVIII mutantes R336I, R562K y R336I/R562K se secretan eficazmente con una actividad de FVIII similar a la del FVIIl tipo silvestre. La actividad y la secreción de FVIII mutantes fueron medidas por la transfección de ADN transitorio de células COS-1 de mono. La actividad de coagulación de FVIII en el medio acondicionado demostró que todos los mutantes tenían una actividad de FVIll similar a la del FVIII tipo silvestre, 15 aproximadamente 300 mU/ml (véase la Tabla 1). La activación de trombina de las muestras medias acondicionadas indicó que no había ninguna diferencia en la tasa de activación de trombina y la caída de la actividad procoagulante. Como se demuestra en la Figura 3, todas las muestras fueron inmediatamente activadas (3-5 veces) en 10 segundos después de la adición de trombina y fueron inmediatamente inactivadas. En la Figura 3, los símbolos representan el FVIII tipo silvestre (X). R33D1 (•). R562K (◊) y R336I/R562K (♦). Para medir la secreción de FVIII, las 20 células transfectadas se marcaron metabólicamente con [35S]-metionina durante 2 horas y luego se siguió durante 4 horas en medio que contenía metionina no marcada en exceso. Las proteínas secretadas se analizaron por inmunoprecipitación del medio acondicionado marcado. Como se muestra en la Figura 4A, el FVIII tipo silvestre y todos los mutantes fueron secretados a niveles similares como una cadena sencilla de 300 kDa y una cadena pesada de 200 kDa y una cadena ligera de 80 kDa. Como se muestra en la Figura 4B, la división de trombina para 25 todas las moléculas generó la cadena ligera que migraba a 73 kDa y la cadena pesada derivó fragmentos correspondientes al dominio A1 de 50 kDa y al dominio A2 de 43 kDa como se esperaba (Figura 4B). Además, para el FVIII tipo silvestre y R562K (Figura 4B, bandas 7 y 9) hubo alguna división en el residuo 336 que proporcionó una especie de 45 kDa. En contraste, los mutantes R336I y R336I/R562K (Figura 4B, bandas 8 y 10) no generaron la especie de 45 kDa, indicando que la mutación de isoleucina en el residuo 335 es resistente a la división por la

30 trombina en exceso. Para las Figuras 4A y 4B, los marcadores del tamaño molecular son mostrados a la izquierda, "Mock" representa células que no recibieron ADN, y sc, hc y lc representan la cadena sencilla, la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente.

TABLA 1

Actividad de coagulación de FVIll en medio acondicionado de células COS35 1 transfectadas

Actividad de coagulación de FVIll (mU/ml) (n=5)

Tipo silvestre

318,8 + 36,3

R336I

306,4 + 51,2

R562K

340,0 + 44,8

R336I/R562K

308,4 + 76,9

los datos representan la media + SD

R562K es completamente resistente y R336/es en su mayor parte resistente a la división de APC en el sitio mutado. La división de APC de FVIIla fue evaluada tratando el FVIII inmunoprecipitado marcado con [35S]-metionina por APC. El análisis de los productos de división de APC del FVIII tipo silvestre analizado por SDS-PAGE en un gel 40 con gradiente del 5-15 % detectó los fragmentos de la cadena pesada de 50 kDa y 45 kDa que representan el dominio A1, y de 43 kDa que representan el dominio A2, que no estaban presentes en el medio acondicionado de células que no recibieron el ADN. Como se muestra en la Figura 5A, banda 2, fue detectable un producto de peso molecular inferior a 25 kDa, que representaba el extremo carboxi-terminal del dominio A2. Como se muestra en la Figura 5A, la banda 3, el FVIII R3361 fue parcialmente resistente a la división en el residuo 336, como se indica por 45 un aumento de 50 kDa y una reducción de los productos de división de 45 kDa comparado con el tipo silvestre. El R336I no mostró ningún cambio en la cantidad de las especies de 25 kDa lo que indica una división eficiente en el residuo 552. Como se muestra en la Figura 5A, banda 4, el mutante de FVIII R562K fue resistente a la división en el residuo 562 como se indica por el aumento del fragmento de 43 kDa y la pérdida del fragmento de 25 kDa. Sin embargo, el mutante R562K fue dividido eficazmente en 336, como es indicado por un intenso fragmento de 45 kDa.

El tratamiento de APC del mutante doble R336I/R552K proporcionó un aumento de las especies de 50 kDa y 43 kDa, y una reducción de 45 kDa y la pérdida de la especie de 25 kDa comparado con el FVIII tipo silvestre (véase la Figura 5A, banda 5). La migración del fragmento de 45 kDa derivado de la división de APC del mutante R336I fue ligeramente reducida en el análisis por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 8 % (véase la Figura 5B, comparar

5 las bandas 7 y 8). A fin de determinar si este mutante puede ser dividido en la lisina adyacente en el residuo 338, se hizo por mutagénesis dirigida un mutante doble R336I y K338I. El mutante R336I/K338I no generó el fragmento de 45 kDa con la digestión de APC (véase la Figura 5B, banda 9). En las Figuras 5A y 5B, los marcadores por tamaño molecular se muestran a la izquierda y "Mock" representa las células que no recibieron el ADN.

Las mutagénesis en ambos Arg336 y Arg562 en FVIIl son requeridas para la resistencia a la inactivación de

10 APC. El Factor de von Willebrand (vWF) inhibe la inactivación de APC de FVIII. Koedam, J, A. et al.; J. Clin. Invest. 82:1236 (1988) y Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:2172 (1991). Por lo tanto, para estudiar la inactivación de APC, se modificaron genéticamente células CHO establemente transfectadas que expresaban moléculas de FVIII tipo silvestre y de mutantes de sitio de división de APC. El medio acondicionado fue recuperado con la purificación por FVIII. Como se muestra en la Figura 6, el análisis de las proteínas purificadas por SDS-PAGE en condiciones

15 reductoras y tinción de plata demostró que todas las moléculas tenían composiciones polipeptídicas similares de la cadena pesada (hc) y la cadena ligera (lc) con degradación mínima y ausencia de vWF. Estas proteínas purificadas fueron analizadas entonces según la inactivación funcional por APC. Como se muestra en la Figura 7A, la actividad de todas las muestras, excepto la del mutante doble R336I/R552K (♦), fueron reducidas al 80 % después de 10 minutos de incubación a 37ºC en ausencia de APC y fueron estables posteriormente durante 60 minutos a partir de

20 entonces. En presencia de APC, el FVIII tipo silvestre (X) tenía una actividad residual del 38 % a los 10 minutos y del 8 % a los 60 minutos. En presencia de APC, la inactivación de los mutantes simples R335I (•) y R552K (◊) fue similar y ambas fueron más lentas que el FVIII tipo silvestre. Después de 60 minutos el 41 % y el 30 % de la actividad inicial permanecieron para los mutantes R336I y R562K, respectivamente. En contraste, el mutante doble R336I/R562K (i) era resistente a la inactivación y retuvo una actividad del 76 % después de 60 minutos. Los resultados demuestran

25 así que el mutante doble R3361/R562K era en su mayor parte resistente y ambos mutantes simples fueron sólo parcialmente resistentes a la inactivación de APC.

La capacidad del kit de ensayo de la resistencia de APC para detectar el FVlIl resistente a APC. Actualmente, el kit de ensayo de la resistencia de APC comercialmente disponible (Resistencia de APC de Coatest; Chromogenix, Molndal, Suecia) se usa para rastrear el plasma de pacientes con enfermedad trombótica asociada con la mutación 30 de FV R505Q. La capacidad de este kit de detectar el FVIII resistente al APC fue probada por la reconstitución de plasma deficiente en FVIII con el FVIII tipo silvestre purificado o con el mutante purificado. La proporción de la resistencia de APC fue calculada por la medida del tiempo de coagulación en presencia de APC dividido por el tiempo de coagulación en ausencia de APC (véase la Tabla 2). Sólo el mutante doble R336I/R562K demostró una proporción de resistencia de APC inferior que 2, un valor indicativo de un fenotipo con resistencia de APC.

35 Svensson, P.J. et al., N. Engl. J. Med. 336:517 (1994).

TABLA 2

Proporción de resistencia de APC del FVIII tipo silvestre y mutantes en el kit de ensayo comercializado

Proporción de resistencia de APC (n=3)

Tipo silvestre

2,13 ± 0,06

R33BI

2,10 ± 0,00

R562K

2,13 ± 0,05

R336I/R562K

1,73 ± 0,06

los datos representan la media ± SD

40 Discusión

Todos los mutantes fueron secretados eficazmente a partir de células COS-1 con una actividad de FVIII similar a la del FVIII tipo silvestre. El análisis de la división de APC fue realizado por el marcaje de [35S]-metionina de la proteína y el análisis de FVIIl en el medio acondicionado después de la inmunoprecipitación. El mutante R336I era resistente parcialmente a la división en el residuo 336, pero fue sensible a la división en Arg552. Por otra parte, el mutante 45 R562K fue completamente resistente a la división en el residuo 562, pero sensible a la división en Arg33B. Estos resultados indican que la mutación sencilla en Arg336 o Arg562 afecta a la división en el sitio mutado y que no hay un orden requerido por la división de APC en estos dos sitios en FVIIl. El mutante doble R3361/R562K fue parcialmente resistente a la división en el residuo 336 y completamente resistente en el residuo 562. La división de R335I probablemente ocurrió en un residuo adyacente, Lys 338, ya que un doble mutante R336I/K338I fue

completamente resistente a la división en este sitio. Estos resultados muestran que la división de APC de FVIII puede ser desigual, es decir no tiene un requerimiento de espaciado riguroso para la división.

El análisis de la cinética de la división de APC en FVIII indicó que Arg562 fue preferiblemente dividido comparado con Arg336 y esta división inicial estaba más estrechamente correlacionada con la pérdida de la actividad del cofactor. Fay, P.J. et al., J. Biol. Chem. 266:20139 (1991). La inactivación más lenta del mutante sencillo R562K como una consecuencia de la resistencia de división en el residuo 562 es consecuente con la hipótesis, y que la inactivación consiguiente era debida a la división en Arg336. Sin embargo, el mutante sencillo R336I fue sólo parcialmente inactivado por la división en Arg562. Se ha demostrado que ambos mutantes de división sencillos fueron inactivados en proporciones similares en las condiciones descritas en este documento. Suponiendo que la división en Arg336 y Arg562 ocurra al mismo tiempo, el efecto de división en Arg336 o en Arg562 para la inactivación de FVIII parece ser similar. La inactivación rápida del FVIII tipo silvestre puede ser debida a roles sinérgicos de la división en Arg336 y Arg562 para la inactivación de FVIII.

Actualmente, no hay ninguna publicación que describa a pacientes con mutaciones con los sitios de división de APC de FVIII. Para evaluar si estas mutaciones tendrían un fenotipo con resistencia a APC, las moléculas FVIII resistentes a APC fueron probadas en el kit de ensayo de resistencia a APC comercialmente disponible (Resistencia a la APC de Coatest; Chromogenix, Molndal, Suecia). Sólo los mutantes dobles R336I/R562K mostraron una proporción de resistencia a APC inferior. Este kit de ensayo no puede, por lo tanto, detectar a cada mutante de sitio de división de APC sencillo de FVIIl. En contraste con FVIII, ambos mutantes de sitio de división sencillos de APC del FV, tanto Arg306Gln como Arg506GIn, mostraron proporciones de resistencia de APC reducidas en este ensayo. Los resultados muestran así que el kit de resistencia de APC comercialmente disponible no detectará a los mutantes resistentes a APC de FVIII a menos que ambas divisiones de APC sean inhibidas.

EJEMPLO 3

PREPARACIÓN Y ANÁLISIS DEL FACTOR VIII RESISTENTE A LA INACTIVACIÓN

Procedimientos experimentales

Materiales. El anticuerpo monoclónico del factor VIII de anti-cadena pesada (F-8), F-8 conjugado a CL-4B Sepharose y la proteína del factor VIII recombinante purificado fueron obtenidos del Genetics Institute Inc (Cambridge, Massachusetts). Se obtuvo el anticuerpo de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) vWF antihumano fue obtenido de Dako Corp. (Carpinteria, California). Los anticuerpos monoclónicos del factor VIII de cadena antiligera, ESH-4 y ESH-8, fueron obtenidos de American Diagnostica, Inc, (Greenwich, Connecticut). Se obtuvieron plasmas reunidos deficientes del factor VIII y humano normal del George King Biomedical, Inc (Overland Park, KS). Se obtuvieron la tromboplastina parcial activada (reactivo APTT Automatizado) y CaCl2 del General Diagnostics Organon Teknika Corporation (Durham, NC). La trombina humana, el inhibidor de tripsina de soja, el fenilmetilsulfonilfluoruro y la aprotinina fueron obtenidos de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania). El dihidrocloruro de O-fenilendiamina (OPD) fue obtenido de Sigma Chemical Co. (San Louis, Misuri). La [35S]metionina (> 1000Ci/mmol) fue obtenida del Amersham Corp. (Arlington Heights, Illinois). En3hance fue obtenido de Dupont (Boston, Massachusetts). El suero bovino fetal fue obtenido de PAA Laboratories Inc (Playa de Newport, California). El medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), DMEM sin metionina, OptiMEM, éster de N-hidroxisuccinimida de Biotina, y el conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante fueron obtenidos de Gibco BRL (Gaithersburg, Maryland),

Mutagénesis de plásmido. La mutagénesis fue realizada dentro del vector de expresión de mamífero pMT2 (37) que contiene el cDNA(pMT2VIII) de FVIII. Los plásmidos mutantes fueron generados por mutagénesis dirigido del oligonucleótido utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para una descripción detallada de la mutagénesis dirigida de oligonucleótidos, véase Smith, M., Annu. Rev. Genet 19:423 (1985).

Construcción 1 - 90/73 R740K. El vector pMT290/73 se usó como plantilla de ADN. El constructo de 90/73 es descrito en Nesheim. M. et al., J. Biol. Chem., 266: 17815-17820 (1991) y Pittman, D. et al., Blood 10, No. de resumen 392 (1987). Generalmente, el constructo 90/73 es la secuencia de cDNA del FVIIl tipo silvestre en el cual el dominio B y el sitio de unión de vWF (la región ácida de la cadena ligera) han sido delecionados (del 741-1689). Se usó la mutagenesis dirigida del oligonucleótido para crear un fragmento de PCR, Kpnl/R740K/Apal, y se unió a pMT290/73 digerido con Kpnl/Apal.

Construcción 2 - 90/b/73 R740K. El vector pMT2VllI se usó como plantilla de ADN. Se usó la mutagenesis dirigida del oligonucleótido para crear un fragmento PCR, Kpnl/b/1689 Mlul (donde b representa una secuencia de ADN que codifica los residuos de aminoácidos de 741 a 793 de la secuencia tipo silvestre seguido de unos aminoácidos de predicción de sitio de Mlul treonina y arginina en los residuos 794 y 795/1689), que se unieron en el vector digerido con Kpnl/Mlul pMT2 VllI/1689\Mlul. La secuencia de aminoácido siguiente (y la secuencia de nucleótido que codifica la misma) es el espaciador de secuencia de aminoácido preferido, en el que el residuo 794 puede ser treonina o leucina y es preferiblemente treonina:

imagen1

Construcción 3 - 90/b/73 R740A. El vector 90/b/73 se usó como plantilla de ADN (en el que b es como se describe antes y codifica treonina en el residuo 794). Se usó la mutagénesis dirigida del oligonucleótido para crear un fragmento PCR, el Kpnl/R740A/b/Apal, que se unieron en pMT290/73 digerido con KpnI/Apal.

Construcción 4 - 90/b/73 R740A/R1689A (DM1). Se usó el vector 90/b/73 R740A como plantilla de ADN (en el que b es como se describe antes y codifica leucina en el residuo 794). Se usó la mutagénesis dirigida del oligonucleótido para crear el fragmento PCR, el Kpnl/R740A/b/R1689A/ApaI, que se unió dentro del PMT290/73 digerido con Kpnl/Apal.

Construcción 5 - 90/b/73 R336I/R740A (DM2). El vector PMT2VlIl/R336I fue digerido con Spel y KpnI. El fragmento se unió en 90/b/73 R74OA digerido con Spel/Kpni (en el que b es como se describe antes y codifica treonina en el residuo 794).

Construcción 6 - 90/b/73 R336I/R562K/R740A (IR8). El vector PMT2VIlI/R562K fue digerido con Bglll y Kpnl. El fragmento BgIII/R562K/Kpnl se ligó en 90/b/73 R3361/R740A digerido con Bglll/Kpnl (en el que b es como se describe antes y codifica treonina en el residuo 794).

El plásmido que contiene la secuencia de cDNA del FVIII tipo silvestre se denominó FVIII WT. Todos los plásmidos fueron purificados por centrifugación a través del cloruro de cesio y fueron caracterizados por la digestión de endonucleasa de restricción y el análisis de la secuencia de ADN.

Transfección de ADN y análisis. El ADN del plásmido se transfectó en células COS-1 por el método de DEAEdextrano. El medio acondicionado se recogió a las 64 horas después de la transfección en presencia de suero bovino fetal al 10 %. La actividad de FVIII fue medida por el ensayo de APTT de coagulación de una etapa en un MLA Electra 750. La síntesis y la secreción de proteínas fueron analizadas por un marcaje de células metabólicamente a las 64 horas después de la transfección durante 30 minutos con [35S]-metionina (300 mCi/ml en medio sin metionina), seguido de un seguimiento durante 4 horas en medio que contiene metionina no marcada en exceso de 100 veces y aprotinina al 0,02 %. Los extractos de células y el medio acondicionado que contiene la proteína marcada fueron recogidos. Las proteínas WT y FVIII mutante se inmunoprecipitaron a partir de proporciones iguales del extracto celular y medio acondicionado con F-8 acoplado a CL-4B Sepharose. Los inmunoprecipitados se lavaron y fueron suspendidos de nuevo en tampón de muestra Laemmli. Las muestras se analizaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8 % SDS-bajo bis. Los geles fueron tratados con En3Hance y las proteínas se visualizaron por autoradiografía.

Purificación de la proteína. La proteína IR8 parcialmente purificada fue obtenida a partir de 200 ml del medio acondicionado de células COS-1 transitoriamente transfectadas por cromatografía de inmunoafinidad. La proteína FVIII WT parcialmente purificada fue obtenida a partir de 200 ml de medio acondicionado de células CHO establemente transfectadas y fue purificada por inmunoafinidad de la misma manera. Las proteínas eluídas en tampón que contenía etilenglicol se dializaron y se concentraron frente a un tampón que contenía polietilenglicol (PM-15-20.000) y se almacenó a -70ºC.

Ensayo de actividad de FVIII. La actividad de FVIII fue medida en un ensayo de coagulación de APTT de una etapa por la reconstitución de plasma deficiente en FVIIl humano. Para la activación de la trombina, las muestras de proteína fueron diluidas en Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM y glicerol al 5 % y se incubaron a temperatura ambiente con 1 U/ml de trombina. Después de la incubación para aumentar los períodos de tiempo, fueron diluidas alícuotas y se analizaron según la actividad de FVIII. Una unidad de la actividad de FVIII es la cantidad medida en 1 ml del plasma reunido humano normal.

Determinación del antígeno de FVIII. El antígeno de FVIII fue cuantificado usando un método ELISA sándwich que utilizaba anticuerpos de anti-cadena ligera ESH-4 y ESH-8. La proteína FVIII recombinante purificada se usó como estándar.

Resultados

Generación de la resistencia a la inactivación de FVIII. Todos los constructos anteriores están basadas en 90/73, en el que se han delecionado el dominio B (residuos de 795 a 1647) y el sitio de unión de vWF (residuos de 1648 a 1888, también denominado la región ácida del extremo amino terminal de la cadena ligera). Nesheim, M. et al., J. Biol. Chem. 266: 17815-17820 (1991) y Pittman. D. et al.; Blood 70, nº. de resumen 392 (1987). La figura 8 muestra las estructuras de dominio del FVIII tipo silvestre y los anteriores constructos así como las mutaciones en el APC y los sitios de división de trombina. Como se describe en este documento y en la Figura 8, "b" representa el espaciador de la secuencia de aminoácido que tiene una longitud suficiente para permitir que la proteína sea activada por trombina para conseguir un heterodímero, en el que el dominio A2 permanece covalentemente asociado con la cadena ligera. En una realización preferida, el espaciador de la secuencia de aminoácidos es preferiblemente la parte amino del dominio B tipo silvestre, es decir los residuos de aminoácido de 741 a 793 seguido de un sitio Mlul (con fines de clonación) que predicen los aminoácidos treonina o leucina, preferiblemente treonina, en el residuo 794 y arginina en 795/1689.

La figura 8 muestra un modelo de activación de los constructos de la presente invención. El FVIII tipo silvestre y el mutante 90/73 ambos consiguen un heterotrímero bajo la activación de trombina. Cuando un espaciador de secuencia de aminoácido es introducido entre los dominios A2 y A3 de 90/73 que contienen una mutación en el sitio de división de trombina (del795-1688/Arg335lso/Arg562Lys/Arg740Ala), bajo la activación con trombina, la división sólo ocurre después de Arg372, generando un heterodímero de FVIIla. Esta nueva proteína de FVIII denominada IR8, mantiene la actividad estable después de la activación de trombina.

Síntesis y secreción de IR8. El FVIII WT y varios mutantes con resistencia a la inactivación fueron comparados mediante la transfección del ADN transitorio de los vectores de expresión de cDNA en células COS-1 de mono. 60 horas después de la transfección, las tasas de la síntesis fueron analizadas por inmunoprecipitación de los extractos celulares de células marcadas por pulso de [35S]-metionina. El FVIII WT intracelular fue detectado en su forma de cadena sencilla y migró a aproximadamente 250 kDa (Figura 10, banda 1). El mutante 90/80 es un mutante de FVIII BDD (del741-1648) previamente caracterizado, que migra a ~170 kDa y muestra una intensidad mayor de extractos de células marcados por pulso consecuentes con la mayor eficacia de la síntesis (Figura 10, banda 3). El 90/73 migra ligeramente más rápido debido a la deleción adicional de los residuos de la región ácida (Figura 10, banda 5). Todos los constructos basados en 90/b/73 incluyendo IR8 mostraron una intensidad de banda similar a los constructos 90/80 y 90/73 lo que sugiere que las mutaciones sin sentido múltiples no interfirieren con una síntesis de proteínas eficiente. No se observaron bandas adicionales dentro del extracto de células en el extracto de células imitadas inmunoprecipitadas con un anticuerpo específico anti-FVIII y representan tanto proteínas específicas de FVIII como proteínas intracelulares co-inmunoprecipitantes. Después de un período de seguimiento de 4 horas, la mayoría de FVIII WT es perdida del extracto celular (Figura 10, banda 2) y puede ser recuperada del medio acondicionado de seguimiento en su cadena sencilla de 280 kDa, cadena pesada de 200 kDa y formas de cadena ligera de 80 kDa (Figura 10, banda 3). Aunque todos los BDD y mutantes de resistencia a la inactivación mostraron cantidades significativas de sus productos de traducción primarios que permanecen dentro del extracto celular después de un seguimiento de 4 horas (Figura 10, bandas 4, 5, 8, 10, 12), fueron todos recuperados del medio acondicionado de seguimiento como especies de cadena sencilla (Figura 11, bandas 5, 7, 9, 11, 13). Por lo tanto, las diversas modificaciones del constructo de FVIII no tuvieron un impacto significativo en la secreción.

Estabilidad estructural de lRB después de la división de trombina. Las proteínas de FVIII marcadas inmunoprecipitadas a partir del medio acondicionado de seguimiento fueron incubadas con trombina (1 U/ml) durante 30 minutos antes del análisis de SDS-PAGE. El FVIII WT fue dividido eficazmente en un heterotrímero de fragmentos que consistían en una subunidad A1 de 50 kDa, subunidad A2 de 43 kDa y cadena ligera dividida por trombina de 73 kDa, A3-C1-C2 (Figura 11, banda 4). El 90/73 WT también fue dividido en un heterotrímero de subunidades similares al FVIII WT (Figura 11, banda 6) consecuente con las observaciones anteriores y se representa en la Figura 1A. El 90/73 Arg740Lys generó un heterodímero de subunidades divididas de trombina consecuente con la subunidad A1 de 50 kDa y una cadena ligera fusionada de A2-A3-C1-C2 (Figura 11, banda 8). El 90/b/73 Arg740Lys mostró fragmentos de división de trombina consecuentes con 2 especies heteroméricas, un heterodímero A1 de 50 kDa / A2-b-A3-C1-C2 de 120 kDa, así como la subunidad A2 de 43 kDa y un fragmento de ~85 kDa consecuente con una cadena ligera b-A3-C1-C2 fusionada (Figura 11, banda 10). El aspecto de la subunidad A2 después de incubación con trombina sugirió que Lys740 no revocaba completamente la división de trombina en presencia del espaciador b. Con la mutación sin sentido más radical a Ala740, fue mostrada una especie heterodímera estable (Figura 11, banda 12). Esta estructura heterodímera estable después de la división de trombina fue mantenida para IR8 con adiciones de las mutaciones sin sentido Arg336lso y Arg562Lys (Figura 11, banda 14).

Estabilidad funcional de IR8 después de la activación de trombina. Habiendo demostrado la integridad estructural del heterodímero IR8 sobre la división de trombina, la consecuencia funcional de esta modificación en la activación e inactivación fue examinada en un ensayo funcional in vitro. El FVIII WT purificado por inmunoafinidad y IR8 fueron incubados con trombina y analizados para la actividad de FVIII por un ensayo de coagulación de APTT de una etapa. Un ejemplo de la activación e inactivación funcional es representado en la Figura 12 y es típico de experimentos de repetición múltiples. En estas condiciones, el FVIII WT fue activado máximamente a los 10 primeros segundos de la incubación con trombina, entonces se inactivó rápidamente a los 5 minutos siguientes. IR8 no alcanzó una actividad máxima hasta 30 segundos de la incubación con trombina, sugiriendo una sensibilidad modestamente reducida frente a la activación de trombina comparado con el FVIII WT. Además, la actividad máxima para el 1R8 activado con trombina fue más baja (74,7 + 6,7 % de la actividad de FVIII WT activada de trombina máxima, n=3), sugiriendo un poco de eficacia reducida como cofactor. Sin embargo, el IR8 mostró una retención significativa de la actividad máxima en los 10 primeros minutos de incubación con trombina (66,9 + 5,3 % de la actividad de IRS máxima, n=3), un período en el cual el FVIII WT fue casi completamente inactivado. Aunque haya una pérdida gradual de la actividad de IRS máxima con la incubación prolongada con trombina, el IR8 todavía retenía ~38 % de la actividad máxima después de una incubación de 4 horas con trombina.

IR8 muestra una mayor actividad específica de FVIII in vitro. El FVIll WT purificado por inmunoafinidad e IR8 fueron analizados según la actividad de FVIII utilizando un ensayo de coagulación estándar de APTT de una etapa, en el que el primer punto de tiempo fue 10 segundos. Las determinaciones de antígeno se hicieron utilizando un ELISA basado en la cadena ligera de FVIII. La figura 13 muestra la activación y la menor proporción de la inactivación expresada como actividad específica. Los valores de actividad específica para IR8 fueron calculados basados en una corrección para su peso molecular. Se observó que IR8 tenía una actividad específica 5 veces mayor comparado con el FVIII WT (102 ± 43 vs. 18,6 ± 7,4 U/mg de la proteína).

EJEMPLO 4

UNIÓN DE VWF INDUCIBLE DEL FACTOR VIII RESISTENTE A LA INACTIVACIÓN

Procedimientos Experimentales

Fueron revestidos 2 pocillos de microtítulo de Immulon (Laboratorios Dynatech, Inc., Chantilly, VA) con el anticuerpo FVIII a una concentración de 2 g/ml durante la noche a 4ºC en un tampón de carbonato/bicarbonato sódico 0,05 M, pH 9,6. Los pocillos fueron lavados con TBST (Tris HCl 50 mM /pH 7.,6, NaCI 150 mM, Tween 20 al 0,05 %) después se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3 % (BSA) en TBST. Las muestras de proteína fueron diluidas en TBST, BSA al 3 %, plasma humano deficiente del factor VIII al 1 % +/-ESH8 (proporción molar de proteína ESH8:FVIII = 2:1). Las muestras fueron incubadas durante 2 horas a 37ºC en tubos de microfuga de 1,7 ml. Las muestras fueron incubadas entonces durante unas 2 horas adicionales en los pocillos de microtítulo bloqueados y lavados. Los pocillos fueron lavados entonces en TBST que contiene CaCl2 10 mM. El anticuerpo anti-vWF-HRP fue diluido en TBST, BSA al 3 %, CaCl2 10 mM y se incubó en los pocillos durante 2 horas a 37°C. Después del lavado adicional con TBST que contiene CaCl2 10 mM, el sustrato OPD fue añadido a los pocillos y se incubó durante 3 minutos. La reacción del color fue parada con H2SO4 2 M y la densidad óptica (O.D) se leyó a 490 nm utilizando un lector de microplacas automatizado EL-340 (Biotek Instruments Inc., Winooski, Vermón).

Resultados

La figura 14 muestra los resultados del ELISA de unión de FVIII-vWF. Se usó una trampa de dominio anti-A2. Después de una incubación de 4 horas con el plasma deficiente de FVIII (dilución 1:100), la unión fue detectada por anti-vWFab conjugado con peroxidasa. Como se muestra en la Figura 14, una afinidad de unión 10 veces más baja de IR8 a vWF se observa en ausencia de ESH8 comparado con el FVIII tipo silvestre, y se observa una afinidad de unión 2 veces más baja en presencia de ESH8.

La figura 15 muestra los resultados del ELISA de unión de FVIII-vWF con trombina (IIa) y/o ESH8. El mismo método ELISA usó sin embargo un exceso 2 veces molar de ESH8 fue empleado así como una incubación de 4 horas con Ila (1 U/ml) en presencia de plasma deficiente en FVIII. Como se muestra en la Figura 15, IR8 retiene la actividad para vWF después de la activación de trombina lo que sugiere que el heterodímero sea intacto después de la división de trombina y ESH8 estabiliza la confirmación de la cadena ligera tal que esto retenga algo de la afinidad para vWF.

Ya que los ensayos de unión descritos antes utilizan un anticuerpo "trampa" que sólo reconoce el dominio A2 de FVIII, esto sólo detectará complejos FVIII-vWF que reconocen el dominio A2 conjuntamente con el resto de la proteína. Por lo tanto, después de la incubación de 4 horas de la proteína en presencia de trombina en exceso, el FVIII tipo silvestre sólo no se habrá activado totalmente pero también habrá sido completamente inactivado por la disociación de A2 y/o otras divisiones proteolíticas, y ya no se asociará con vWF en un complejo que será reconocido por este ensayo. El FVIII resistente a la inactivación de la presente invención retiene así la unión inducible incluso después de la activación completa por trombina.

También se mostró que la forma de unión inducible por vWF del FVIII resistente a la inactivación de la presente invención retenía la actividad. En este ensayo, un anticuerpo anti-vWF se usó como "trampa" para el ELISA. La 5 misma incubación fue realizada en presencia y ausencia de trombina y ESH8. Después de la inmovilización del complejo FVIII-vWF en la placa, la actividad de FVIII fue medida usando un kit de ensayo de FVIII cromogénico (Coamatic, Pharmacia Hepar, Franklin, Ohio) dentro de los pocillos del ELISA. Como se muestra en la Figura 16, después de la activación por trombina, no fue observado ningún complejo FVlII-vWF manifiestamente activo para el FVIIl tipo silvestre. Sin embargo, el FVIIl resistente a la inactivación todavía tenía una actividad detectable en las

10 mismas condiciones. Esto sugiere que después de la activación de la trombina, el FVIIl resistente a la inactivación se dividió en un heterodímero de A1 conjuntamente con una cadena ligera modificada de A2-b-A3-C1-C2 que tiene una unión inducible de ESH8 a vWF, y retiene la actividad de FVIIl.

El impacto funcional de este complejo IR8-vWF inducido por ESH8 también fue evaluado analizando la actividad de FVIII vía el APTT (Tabla 3). En ausencia de ESH8, el FVIII WT purificado por inmunoafinidad y el IR8 mostró la

15 pérdida mínima de la actividad en una incubación de 4 horas a 37°C con el plasma deficiente de FVlII. En presencia de ESH8, la actividad de FVIII WT fue inhibida en aproximadamente el 70 %, mientras que IR8 retuvo el 100 % de su actividad inicial. Estos resultados sugieren que la inactivación del FVIll WT en presencia de ESH8 puede ser debida a que la disociación de la subunidad A2 e IRB sea resistente a la inactivación por ESH8 porque no es susceptible a la disociación de la subunidad A2.

20 TABLA 3

ESH8 no inhibe la actividad de IR8 en presencia de vWF

Proteína

% de actividad inicial

-ESH8

+ ESH8

FVIII WT

92 ± 3 29 ± 13

1R8

101 ± 2 120 ± 27

EJEMPLO 5

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y USO

25 Composición farmacéutica

Las proteínas FVIIl de la presente invención pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticamente aceptables con vehículos y excipientes parenteralmente aceptables de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de esta invención, adecuadas para la administración parenteral, pueden comprender adecuadamente una preparación liofilizada estéril de la proteína que puede ser reconstituida por la

30 adición de una disolución estéril para producir soluciones preferiblemente isotónicas con la sangre del receptor. La preparación se puede presentar en recipientes de una unidad o multidosis, p.ej en ampollas selladas o viales.

Tales composiciones farmacéuticas también pueden contener a vehículos farmacéuticamente aceptables, diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizadores, y/u otros materiales conocidos en la técnica. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad

35 biológica del(de los) ingrediente(s) activo(s). Las características del vehículo u otro material dependerán de la ruta de administración.

La cantidad de la proteína FVIIl en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y la severidad de la condición tratada, y de la naturaleza de los tratamientos previos a los que el paciente se ha sometido. Por último, el médico decidirá la cantidad de proteína que se trata a cada paciente individual. La duración

40 de la terapia Intravenosa de manera similar variará, según la severidad de la enfermedad tratada y la condición y la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual.

Además, las secuencias de nucleótido que codifican las proteínas FVIII de la presente invención pueden estar asociadas con el sistema de administración de terapia génica de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Dichos sistemas de administración incluyen, sin limitación, vectores adenovirales, retrovirales y virales

45 adeno-asociados, así como complejos de ADN-proteína y liposomas. Las secuencias de la presente invención están contenidas o están operativamente unidas a tales sistemas de administración de una manera que permita la transcripción, p.ej, por el uso de elementos reguladores suficientes. Se apreciará que es conocida una variedad de estrategias y metodología para crear dichos sistemas de administración de terapia génica por los expertos en la técnica.

Métodos de uso

Las composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas de la presente invención se pueden usar para tratar a pacientes que padecen una hemofilia causada por la deficiencia del FVIIl.

En la práctica del método de tratamiento de esta invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína FVIII a un mamífero con una condición hemofílica causada por la deficiencia de FVIII. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo del método o de la composición que sea suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, es decir, el cese del sangrado.

La administración de las proteínas de la presente invención puede ser realizada en una variedad de formas convencionales. Es preferida la administración intravenosa al paciente. Cuando se administra por inyección intravenosa, las proteínas de la invención estarán en forma de libre de pirógenos, soluciones acuosas parenteralmente aceptables. Una composición farmacéutica preferida para la inyección intravenosa debería contener, además de las proteínas, un vehículo isotónico, tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer lactada u otros vehículos como los conocidos en la técnica. La composición farmacéutica según la presente invención también puede contener estabilizadores, conservantes, tampón, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica.

Para la inyección cutánea o subcutánea, las proteínas de la presente invención estarán en una forma de libre de pirógenos, soluciones acuosas parenteralmente aceptables. La preparación de dichas disoluciones de proteína parenteralmente aceptables, teniendo el adecuado pH, isotonicidad, estabilidad y otros similares, está dentro de la pericia de la técnica.

Como con las composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas de la presente invención, los sistemas de administración de terapia génica o los vehículos que contienen las secuencias de nucleótido de la presente invención también pueden usarse para tratar a pacientes que padecen hemofilia causada por la deficiencia de FVIII. Una cantidad terapéuticamente eficaz de dichos vehículos de administración de terapia génica se administra a un mamífero que padece una condición hemofílica causada por la deficiencia de FVIII. Se apreciará que la administración de los vehículos de la presente invención será mediante los procedimientos establecidos en las técnicas farmacéuticas, p.ej por la administración directa al tejido diana o al sitio, intranasalmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intradermalmente y por la administración oral, sola o en combinación. También se apreciará que las formulaciones adecuadas para la administración de los vehículos de la administración de terapia génica son conocidas en la técnica e incluyen soluciones acuosas y de inyección estériles isotónicas no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una proteína FVIII activa procoagulante que comprende un polipéptido FVIII humano que es modificado, en el que la modificación comprende una deleción del dominio B, una deleción del sitio de unión del factor de von Willebrand, una mutación en Phe309, una mutación en Arg740 y una adición de un espaciador de secuencia de aminoácido entre los dominios A2 y A3.

2. 2.

   La proteína de la reivindicación 1, en la que la modificación comprende además una sustitución del residuo Arg en la posición 336 con Ile y una sustitución del residuo Arg en la posición 562 con Lys.

3. 3.

   La proteína de la reivindicación 1 o 2, en el que la mutación comprende una sustitución de Arg en la posición 740 con Ala.

4. 4.

   La proteína de cualquiera de reivindicaciones 1 a 3, en la que el espaciador de la secuencia de aminoácidos tiene 54 residuos de longitud.

5. 5.

   La proteína de la reivindicación 4, en la que el espaciador de la secuencia de aminoácidos comprende los residuos de 741 a 794 del FVIII tipo silvestre, en el que el residuo en la posición 794 es treonina o leucina.

6. 6.

   Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la reivindicación 1.

7. 7.

   Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. 8.

   Una célula huésped transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el vector de expresión de la reivindicación 7.

9. 9.

   Un método para la producción de una proteína activa procoagulante que comprende las etapas de:

   a) hacer crecer en un cultivo una célula huésped transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6; y

   b) aislar a partir de la célula huésped y del cultivo, el producto polipeptídico de la expresión de la molécula de ácido nucleico.

10. 10.

    Una composición farmacéutica que comprende la proteína de la reivindicación 1 junto con un vehículo o excipiente parenteralmente aceptable.

11. 11.

    El uso de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6 de la preparación de una composición farmacéutica para uso en terapia génica.

12. 12.

    Un método para aumentar la unión de la proteína de la reivindicación 1 al factor de von Willebrand que comprende la etapa de combinar un anticuerpo contra la cadena ligera del heterodímero FVIII con la proteína de la reivindicación 1 que aumenta la afinidad de unión de la proteína respecto al factor de von Willebrand.

13. 13.

    El método de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo reconoce un epítopo en los aminoácidos 2248 a 2285 de la proteína.

14. 14.

    El método de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo es ESH8.