ES2363669A1 - Metodo para determinar el riesgo de desarrollar metastasis cerebral y un kit para llevar a cabo dicho procedimiento. - Google Patents
Metodo para determinar el riesgo de desarrollar metastasis cerebral y un kit para llevar a cabo dicho procedimiento. Download PDFInfo
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Abstract
Método para determinar el riesgo de desarrollar metástasis cerebral y un kit para llevar a cabo dicho método.El método comprende: (a) aislar una muestra de un tumor de mama; (b) determinar el nivel de expresión de GRP94, FN14 o de ambos en la muestra; y (c) comparar dicho nivel con el nivel de expresión de dicho gen o genes en una muestra control, de manera que si se detecta una sobreexpresión de dicho gen o genes en relación con la muestra control, esto es indicativo del riesgo de desarrollar metástasis cerebral.El kit para llevar a cabo el método de la invención comprende medios apropiados para determinar el nivel de expresión de cada uno de los marcadores.Tanto el método como el kit proporcionan una información precisa sobre el riesgo de desarrollar metástasis cerebral en una fase temprana, lo cual puede conducir a una reducción de la incidencia de la metástasis cerebral derivada del cáncer de mama.
Description
Método para determinar el riesgo de desarrollar
metástasis cerebral y un kit para llevar a cabo dicho método.
La presente invención se refiere a marcadores
indicativos de metástasis cerebral. Estos marcadores encuentran
utilidad en la determinación del riesgo de desarrollar metástasis,
en particular metástasis cerebral.
El cáncer es un proceso que acontece en
múltiples etapas y aparece como resultado de la pérdida de control
de la división celular, conduciendo a la formación de un tumor
inicial que después puede diseminarse, y desarrollar un tumor en un
órgano distante o metástasis.
Una característica diferencial de las células
malignas es su capacidad para invadir tejido normal circundante,
metastatizar a través de los sistemas sanguíneo y linfático y
reestablecerse en localizaciones secundarias distantes. Para formar
metástasis, las células tumorales individuales deben desprenderse de
la masa tumoral primaria, degradar la matriz extracelular, invadir
el tejido normal circundante, entrar en la circulación sanguínea o
linfática, abandonar la circulación en un tejido distal y establecer
colonias satélite dentro de este nuevo entorno tisular. Este
comportamiento requiere la función cooperativa de numerosas
proteínas. Esta diseminación metastásica del tumor sólido es
responsable directa o indirectamente de la mayoría de las muertes
relacionadas con cáncer.
El tratamiento médico del cáncer puede ayudarse
de marcadores de pronóstico y de marcadores predictivos
terapéuticos. Los marcadores de pronóstico evalúan el riesgo de
avance de la enfermedad independiente de la terapia. Los marcadores
predictivos terapéuticos indican la sensibilidad o resistencia de un
cáncer a un tratamiento específico. Para la mayoría de los cánceres
y tratamientos del cáncer, existen subconjuntos de pacientes que
responderán a un tratamiento particular y subconjuntos de pacientes
que no responderán al tratamiento.
El uso de marcadores predictivos terapéuticos
para identificar subconjuntos de pacientes que probablemente
respondan al tratamiento facilitaría la selección de un tratamiento
apropiado y evitaría retrasos innecesarios asociados con un
tratamiento ineficaz. Además, debido a que la mayoría de los
tratamientos de cáncer se asocian con efectos secundarios adversos
intrínsecos al tratamiento, dichos marcadores predictivos eliminan
riesgos innecesarios de efectos secundarios adversos reduciendo la
administración de tratamientos de cáncer a individuos en los que es
probable que el tratamiento falle.
Actualmente, los únicos marcadores predictivos
terapéuticos recomendados en oncología son el estado de ER (receptor
de estrógenos) y PR (receptor de progesterona) para seleccionar
cánceres de mama sensibles a hormonas, y HERB-2 para
identificar pacientes con cáncer de mama que podrían beneficiarse
del tratamiento con trastuzumab.
La incidencia de metástasis cerebral en
pacientes con cáncer de mama que sobreexpresan
HERB-2 tratados con trastuzumab es el doble que en
otros pacientes con cáncer de mama. Por otro lado, un tercio de los
pacientes diagnosticados de cáncer de mama desarrollará metástasis
en el SNC y, con frecuencia, esto se produce cuando están
respondiendo a la terapia en otros órganos o tienen una enfermedad
estable. Por lo tanto, los fármacos con un alto impacto sobre la
evolución clínica de pacientes con cáncer de mama metastásico, tales
como taxanos o trastuzumab, desempeñan solamente un papel limitado
en el tratamiento de la metástasis cerebral (Tosoni A. et
al., "Chemotherapy in breast cancer patients with brain
metastases: Have new chemotherapic agents changed the clinical
outcome?", Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2008, vol. 68 (3),
págs. 212-221). La resistencia a agentes dirigidos
contra HERB-2 continúa siendo un problema médico
importante ya que muchos
\hbox{cánceres positivos para HERB-2 presentan una resistencia intrínseca.}
Las metástasis cerebrales ocurren en el
10-15% de los pacientes con cáncer de mama avanzado
y últimamente se han convertido en un problema médico significativo.
Puede suponerse que hasta un 30% de los pacientes con cáncer de mama
metastásico experimentarán metástasis cerebral durante el curso de
su enfermedad. El aumento en este índice podría estar relacionado
con una mayor supervivencia en pacientes que reciben quimioterapia y
con el hecho de que es difícil superar la barrera hematoencefálica
(BHE) con los tratamientos sistémicos actuales. Las dificultades en
el manejo de la terapia de metástasis cerebral dan como resultado
una supervivencia media de siete meses, siendo la metástasis
cerebral la causa de muerte o un factor contribuyente principal de
la misma en el 68% de los pacientes.
Es necesaria una estimación adecuada de factores
predictivos independientes en el diagnóstico del tumor inicial para
permitir al médico determinar si dicho tumor puede metastatizar.
Esta información sería útil para el médico para decidir entre
tratamientos agresivos, evitar un tratamiento innecesario y diseñar
terapias específicamente dirigidas contra aspectos diferenciales de
cada localización metastásica.
Por lo tanto, existe la necesidad de marcadores
predictivos que proporcionen información acerca del riesgo de que
metastatice a otros órganos un tumor primario para tratar
eficazmente la enfermedad.
Hasta ahora, poco se sabía sobre los factores
predictivos que permiten la identificación temprana del riesgo de
metástasis en el sistema nervioso central ("SNC") de pacientes
con cáncer primario. El análisis de tejidos metastásicos, el uso de
estrategias bioinformáticas y la caracterización de la expresión de
proteínas en tumores con metástasis específica a un determinado
órgano han permitido a los inventores de la presente solicitud
encontrar marcadores que proporcionan una información específica
acerca de si las células cancerosas tienen una predisposición a
metastatizar.
Así, en un primer aspecto, la presente invención
proporciona un método para determinar el riesgo de desarrollar
metástasis cerebral en un sujeto al que se le ha diagnosticado un
tumor de mama, comprendiendo el método: (a) aislar una muestra del
tumor de mama; (b) determinar el nivel de expresión de GRP94, FN14 o
ambos en la muestra; y (c) comparar dicho nivel con el nivel de
expresión de dicho gen o genes en una muestra control, de manera que
si se detecta una sobreexpresión de dicho gen o genes en relación
con la muestra control, esto es indicativo del riesgo de desarrollar
metástasis cerebral.
Como se muestra más abajo, los inventores de la
presente solicitud han analizado en profundidad las rutas
patogénicas que intervienen en la metástasis cerebral mediante el
análisis de la expresión de proteínas en tejidos de cerebro humano
metastásico y de tumores de mama primarios, y han llevado a cabo un
análisis funcional adicional de las células. De esta forma, se ha
identificado un fenotipo de resistencia al estrés del retículo
endoplásmico (en lo sucesivo también denominado "ERSRP") en
cánceres de mama, que predice la evolución a metástasis cerebral y
que, al mismo tiempo, es útil para tomar decisiones terapéuticas.
Sin estar ligado a teoría alguna, los inventores creen que dicho
ERSRP se basa principalmente en el nivel de expresión incrementado
de GRP94 y/o FN14.
Sorprendentemente, los inventores de la presente
solicitud han descubierto que GRP94 y FN14 se expresan de forma
diferencial (i.e. se sobre-expresan) en muestras de
tumor de mama primario procedentes de pacientes a los que ya se les
ha diagnosticado metástasis cerebral. De hecho, el perfil de
expresión de estos genes en las muestras de tumor de mama primario
procedentes de estos pacientes fue el mismo que el que se encontró
después de analizar muestras de metástasis cerebral. Esto respalda
el uso de estos genes como marcadores predictivos de metástasis
cerebral en tumores de mama primarios.
La expresión diferencial de GRP94 y/o FN14 puede
conferir al método una mayor sensibilidad, mejorando la capacidad de
discriminación (principalmente porque la no detección de GRP94 y/o
FN14 será indicativa de que no existe riesgo de metástasis cerebral)
y, de este modo, reduciendo los falsos negativos asociados a otros
métodos de diagnóstico basados en la detección de otros marcadores
tales como HERB-2 (véanse los datos que se muestran
en la Tabla 2).
Como se ha descrito anteriormente, la metástasis
es un proceso complejo. Esta complejidad hace impredecible si un
tumor primario puede o no metastatizar y qué órgano u órganos pueden
verse afectados por la metástasis. En este sentido, el médico tiene
el problema adicional de que la metástasis se detecta en una fase
avanzada ya que las primeras fases son "silenciosas", de modo
que cuando se detecta, mediante técnicas de imágenes, es muy difícil
tratar eficazmente al paciente.
De acuerdo con el método del primer aspecto de
la invención, si el médico, después de analizar la muestra de cáncer
de mama, determina la sobreexpresión de GRP94 y/o FN14, entonces
puede realizar un análisis adicional mediante técnicas de imagen,
por ejemplo RMN, del cerebro para confirmar si se ha producido o no
la metástasis cerebral. Para el médico esto es de importancia porque
le permitiría establecer el protocolo apropiado para el paciente
desde el momento del diagnóstico del tumor primario, determinando
qué tratamiento puede ser el más eficaz para tratar/prevenir la
enfermedad metastática. Si en la técnica de imagen se visualiza la
metástasis cerebral, el médico diseñará el tratamiento específico
para paliarla, con la ventaja de que se habrá diagnosticado esta
metástasis en un estadio temprano. Por lo tanto, la invención supone
un gran avance en el campo del cáncer ya que permite predecir en un
estado temprano la predisposición a metástasis cerebral, lo cual
puede conducir a una reducción de la incidencia de la metástasis
cerebral en el cáncer de mama.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un kit para llevar a cabo el método que se ha definido
en el primer aspecto de la invención, comprendiendo el kit medios
apropiados para determinar el nivel de expresión de cada uno de los
genes.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1 representa el análisis inmunohistoquímico
para identificar las proteínas indicadas en parejas de
tumor-metástasis cerebral embebidas en parafina (x
20) Se muestra la tinción con hematoxilina-eosina (H
y E) de cada tejido, observada mediante microscopía óptica (x 10).
A: Metástasis, B: Tumor primario.
Fig. 2 muestra la expresión de proteína en
tejidos de cáncer de mama para cada una de las proteínas indicadas
realizando una inmunohistoquímica. Las intensidades de tinción bajas
y medias se consideraron negativas con fines semicuantitativos (L(-)
y M(-), respectivamente), y sólo los tumores con una tinción de alta
intensidad (H) se tuvieron en cuenta como muestras positivas. Los
cuadrados pequeños son la muestra de tejido de control positivo
patrón usada en cada determinación.
Fig. 3 representa la curva de ROC (SE
(sensibilidad) frente a SP (especificidad)) para el marcador
HERB-2 (línea de puntos) y para la combinación de
GRP94 + FN14 + Inhibina (línea continua).
La presente invención proporciona un método para
determinar el riesgo de desarrollar metástasis cerebral en un sujeto
al que se le ha diagnosticado un tumor de mama primario,
comprendiendo el método: (a) aislar una muestra del tumor de mama;
(b) determinar el nivel de expresión de GRP94, FN14 o ambos en la
muestra; y (c) comparar dicho nivel con el nivel de expresión de
dicho gen o genes en una muestra control, de manera que si se
detecta una sobreexpresión de dicho gen o genes en relación con la
muestra control, esto es indicativo del riesgo de desarrollar
metástasis cerebral.
La muestra control se selecciona dependiendo de
la técnica, herramientas e instrucciones del fabricante usadas para
determinar el nivel de expresión de GRP94 y FN14. Por ejemplo, si se
desea determinar el nivel de las proteínas GRP94 y FN14, el experto
en la materia buscará entre los anticuerpos apropiados que se
encuentran disponibles en el mercado y seguirá las recomendaciones
del fabricante para obtener los mejores resultados. Se proporciona
un ejemplo ilustrativo no limitativo en la Tabla 1 de más abajo, en
la que para cada uno de los anticuerpos comerciales usados para la
detección de las proteínas diana, se usa un tejido control
específico. Como alternativa, el médico podría usar una muestra de
cáncer de mama primario de un paciente al que ya se le ha
diagnosticado metástasis cerebral como control con el fin de
determinar si existe sobreexpresión o no en la muestra en
análisis.
En una realización del primer aspecto de la
invención, se determina el nivel de expresión de GRP94.
La GRP94 (también conocida como HSP90B1, y que
tiene el número ID de Swiss Prot P14625) es una proteína del
retículo endoplásmico de la familia de proteínas HSP90. La GRP94
está implicada en la maduración conformacional de proteínas
destinadas a la presentación en la superficie celular o a la
exportación. El descubrimiento de los presentes inventores sugiere
que GRP94 puede participaren ERSRP, activando PERK, ATF6 e IRE1. Por
lo tanto, la sobreexpresión de GRP94 en la metástasis cerebral puede
jugar un papel central en el fenotipo ERSRP.
En otra realización preferida del primer aspecto
de la invención, se determina el nivel de expresión de FN14.
El FN14 (también denominado factor inducible de
crecimiento de fibroblastos 14, y que tiene el número ID de Swiss
prot. ID Q9NP84) es un miembro de la superfamilia de receptores del
factor de necrosis tumoral (TNF). El FN14 es un gen de respuesta
temprana inmediata cuya expresión se activa directamente después de
la exposición a factores de crecimiento en fibroblastos, está
sobre-regulado en células de glioma de migración
estimulada in vitro y se ha relacionado con tumores de alto
grado.
En una realización del primer aspecto de la
invención, se determina el nivel de expresión de GRP94 y FN14.
Como muestran los resultados de la Tabla 3,
GRP94 es el más sensible en los tumores positivos para
HERB-2, mientras que FN14 es el más específico en
tumores negativos para HERB-2. La detección
combinada de ambos marcadores confiere al método de la presente
invención una predicción fiable del riesgo de que un tumor de mama
primario pueda metastatizar en el cerebro.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, el método comprende además determinar el nivel de
expresión de TRAF-2. Se ha descubierto que
TRAF-2 está sobreexpresado en la metástasis cerebral
derivada del cáncer de mama y que muestra un valor de sensibilidad
superior al mostrado por HERB-2 (véase la Tabla 2).
Por lo tanto, la combinación de GRP94 y/o FN14 junto con TRAF2
mejora la sensibilidad del método de la presente invención. Como se
muestra más abajo, cuando se calcula la probabilidad positiva y
negativa para evaluar la exactitud predictiva de cada uno de los
tres genes (es decir, GRP94, TRAF2 y FN14) como marcadores de
metástasis cerebral, GRP94 fue el mejor marcador predictivo
negativo, seguido de TRAF2 y FN14. De hecho, se descubrió que la
exactitud predictiva de estos marcadores era mejor que la de
HERB-2. Por lo tanto, la ausencia de o la detección
insignificante de al menos uno de estos marcadores en tumores
predice con precisión la ausencia de riesgo a desarrollar metástasis
cerebral.
El TRAF2 (también denominado "factor asociado
a receptor de NF 2" y que tiene el número ID de Swiss protein
Q96NT2) es un miembro de la familia de proteínas de factores
asociados con receptores de TNF (TRAF). Las proteínas TRAF median la
transducción de señales de miembros de la superfamilia de receptores
de TNF. Esta proteína interacciona directamente con receptores de
TNF y forma un complejo heterodimérico con TRAF1.
En una realización del primer aspecto de la
invención, el método comprende además determinar el nivel de
expresión de HERB-2.
HERB-2 también se denomina
comúnmente Her-2/neu (número ID de Swiss protein
P04626). Este gen es un miembro de una familia de genes que
proporciona instrucciones para producir receptores de factores de
crecimiento.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, el método comprende además determinar el nivel de
expresión de Inhibina.
La Inhibina (número ID de Swiss prot P05111) es
un péptido que es un inhibidor de la síntesis y secreción de FSH y
participa en la regulación del ciclo menstrual.
Se ha descubierto que la Inhibina no está
significativamente expresada en muestras de cáncer de mama
procedentes de pacientes a los que ya se les ha diagnosticado una
metástasis cerebral. Por lo tanto, cuando este marcador no se
detecta o (no se detecta significativamente) en la muestra, será
indicativo de una predisposición a desarrollar metástasis cerebral.
Cuando se usa este marcador como marcador de metástasis cerebral,
confiere al método de la invención una especificidad superior al
80%. Por lo tanto, si el método de la invención comprende determinar
el nivel de expresión de GRP94 y/o FN14 e Inhibina, el método ganará
exactitud en la predicción de metástasis cerebral.
En otra realización del primer aspecto de la
invención, el método comprende determinar el nivel de expresión de
uno de los siguientes conjuntos de marcadores: (a) GRP94, FN14,
Inhibina; (b) GRP94, TRAF2, HERB-2 y FN14; (c)
GRP94, FN14, Inhibina y HERB-2; y (d) GRP94, FN14 y
TRAF2.
Cuando el método se basa en determinar la
sobreexpresión de GRP94, FN14 y TRAF2 (no se muestran los datos) se
consigue una buena correlación con metástasis cerebral en pacientes
con cáncer de mama. El poder predictivo usando la combinación de
estos marcadores es mejor que el conseguido solamente con
HERB-2 (que de momento es el marcador predictivo
comúnmente usado). El método basado en estos tres marcadores
representa una nueva herramienta para discriminar el riesgo de
metástasis cerebral en cánceres de mama positivos y negativos para
HERB-2.
Cualquiera de GRP94, FN14 y TRAF2 podría ser
útil para tomar decisiones terapéuticas ya que podrían indicar
respuesta a terapia.
Los inventores creen que el ERSRP puede predecir
qué pacientes podrían tratarse más eficazmente con compuestos
diferentes de trastuzumab o incluso tratarse para prevenir el
desarrollo de la enfermedad.
La realización de un análisis multivariante
basado en una regresión logística por etapas reveló que GRP94, FN 14
e Inhibina son la mejor combinación para predecir una metástasis
cerebral. El área bajo la curva ROC para esta combinación fue de
0,85, mientras que el área bajo la curva ROC para
HERB-2 en solitario fue 0,76 (Fig. 3). La
combinación de marcadores constituía una mejora significativa sobre
la eficacia de predicción de HERB-2.
También se realizó una análisis estratificado
para comprobar la relación entre la positividad de
HERB-2 y ERSRP en combinaciones binarias. Se
descubrió que realizando el análisis de la expresión de GRP94, TRAF2
y FN14 se aumentaba significativamente la predicción de la
enfermedad metastásica en cerebro en comparación con
HERB-2 en solitario.
El kit de acuerdo con el segundo aspecto de la
invención comprende medios apropiados para llevar a cabo el método
que se define en el primer aspecto de la invención. La presencia de
los marcadores que forman parte del método del primer aspecto de la
invención puede determinarse en base a los transcritos de ARNm o a
las proteínas. De esta forma, el kit de acuerdo con el segundo
aspecto de la presente invención incluirá medios apropiados para
determinar la presencia de transcritos de ARNm o de la proteína
correspondiente.
Son bien conocidos en el estado de la técnica
métodos y medios para determinar la cantidad de ARNm de un gen
particular en una muestra.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es
el método más ampliamente usado para la amplificación enzimática
in vitro de ácidos nucleicos, pero no es el único. La
reacción en cadena de la ligasa (LCR), por ejemplo, puede usarse
para la detección sensible de una secuencia de ADN con una
especificidad aumentada en comparación con la PCR (la LCR puede
usarse para la discriminación entre alelos). Durante la LCR, para
cada una de las dos cadenas de ADN se ligan dos sondas parciales
para formar la misma; por lo tanto, la LCR usa dos enzimas: una ADN
polimerasa y una ADN ligasa. Cada ciclo da como resultado una
duplicación de la molécula de ácido nucleico diana.
Un método cuantitativo para la determinación de
ácidos nucleicos es la PCR a tiempo real. La PCR a tiempo real,
también denominada PCR a tiempo real cuantitativa (qPCR), se usa
para amplificar y cuantificar simultáneamente una molécula de ADN
diana. El procedimiento sigue el principio general de la reacción en
cadena de la polimerasa; su característica clave es que el ADN
amplificado se cuantifica a medida que se acumula en la reacción a
tiempo real después de cada ciclo de amplificación. Dos métodos
comunes de cuantificación son el uso de colorantes fluorescentes que
se intercalan con el ADN bicatenario y sondas oligonucleotídicas de
ADN modificadas que presentan fluorescencia cuando hibridan con un
ADN complementario.
Se han desarrollado estrategias adicionales
basadas en la PCR original para la amplificación de ARN, tales como
la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa
(RT-PCR). En esta técnica, se realiza primero una
transcripción inversa de la cadena de ARN en su complementaria de
ADN o su ADN complementario, seguida de amplificación del ADN
resultante usando una reacción en cadena a la polimerasa. Otro
método en la biología molecular que se usa para amplificar
secuencias de ARN es la amplificación basada en secuencias de ácidos
nucleicos (NASBA). Explicada de forma resumida, la NASBA funciona de
la forma siguiente: (a) se proporciona un molde de ARN a la mezcla
de reacción y el primer cebador se une a su sitio complementario en
el extremo 3' del molde; (b) la transcriptasa inversa sintetiza la
cadena de ADN opuesta complementaria; (c) la ARNasa H destruye el
molde de ARN (la ARNasa H sólo destruye el ARN en híbridos de
ARN-ADN pero no el ARN monocatenario); (d) el
segundo cebador se une al extremo 5' de la cadena de ADN y la ARN
polimerasa 5-T7 produce una cadena de ARN
complementaria que puede usarse de nuevo en la etapa (a). La NASBA
se ha introducido en el diagnóstico médico, donde se ha demostrado
que proporciona resultados más rápidos que la PCR, y también puede
ser más sensible. Tanto la RT-PCR como la NASBA son
técnicas adecuadas para la determinación de la expresión.
Preferiblemente, el nivel de expresión de los genes se determina
mediante RT-PCR.
Otras técnicas adecuadas para la determinación
de la expresión génica son el screening de macroarrays, microarrays
y nanoarrays.
Son bien conocidos en el estado de la técnica
varios métodos para determinar la cantidad de una proteína en una
muestra. Generalmente, estos métodos utilizarán porciones de unión,
que son moléculas o segmentos de moléculas capaces de unirse
específicamente a la proteína diana (en el presente caso la proteína
diana es la proteína codificada por el gen del que se determina la
expresión). Pueden identificarse porciones de unión a polipéptidos
por medio de un examen. Un método o examen adecuado para identificar
péptidos u otras moléculas que se unen selectivamente a una proteína
diana puede comprender poner en contacto la proteína diana con un
péptido de prueba u otra molécula en condiciones en las que pueda
producirse la unión y después determinar si la molécula o péptido de
ensayo se ha unido a la proteína o péptido diana. Son bien conocidos
en el estado de la técnica métodos de detección de la unión entre
dos porciones. Preferiblemente, la porción de unión puede ser una
molécula polipeptídica (tal como un anticuerpo o un fragmento del
mismo) o un aptámero de ácido nucleico, entre otros. Las moléculas
de unión usadas más frecuentemente son anticuerpos.
Por "anticuerpo" se entiende un anticuerpo
completo, incluyendo sin limitación un anticuerpo quimérico,
recombinante, transgénico, humanizado, injertado y de cadena
sencilla y similares, o cualquier proteína de fusión, conjugados,
fragmentos o derivados del mismo que contengan uno o más dominios
que se unan selectivamente a la proteína o péptido diana. Por lo
tanto, el término anticuerpo incluye una molécula de inmunoglobulina
completa, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un
anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un fragmento
inmunológicamente eficaz de cualquiera de estos. Un fragmento de
anticuerpo significa un fragmento Fv, un Fv ligado a disulfuro,
scFv, Fab, Fab' o F(ab')2, que son bien conocidos en la
técnica, o cualquier parte del anticuerpo con un tamaño y una
conformación adecuadas para unirse a la proteína o péptido diana.
Existen diversas ventajas para el uso de fragmentos de anticuerpo en
lugar de anticuerpos completos.
Los anticuerpos monoclonales (MAb) son
anticuerpos monoespecíficos. Dada (casi) cualquier sustancia, es
posible generar anticuerpos monoclonales que se unan específicamente
a esa sustancia. Pueden producirse Mab por técnicas que son bien
conocidas en el estado de la técnica.
Se emplean frecuentemente anticuerpos para la
determinación de la expresión de una proteína particular en el
interior de una célula mediante técnicas inmunohistoquímicas o
inmunofluorescentes. Preferiblemente, la técnica a usar en la
presente invención es la inmunohistoquímica (IHC). La IHC es una
técnica bien conocida que se usa ampliamente para entender la
distribución y la localización de biomarcadores y proteínas
expresadas de forma diferencial en diferentes partes de un tejido
biológico.
Los cultivos celulares MDA-MB
435 (435-P) y las células 435-Br1
son modelos humanos bien caracterizados (proporcionados por Ángels
Fabra de IDIBELL), establecidos a partir de metástasis cerebral en
ratones desnudos con capacidad para metastatizar en el cerebro
(Schackert G. et al., "Unique patterns of brain metástasis
produced by different human carcinomas in athymic nude mice",
Int. J. Cancer, 1989, vol. 44, vol. 892-897;
Zhang R. D. et al., "Relative malignant potential of human
breast carcinoma cell lines established from pleural effusions and a
brain metastasis", Invasion Metastasis, 1991, vol. 11,
págs. 204-215). Estos cultivos celulares se
mantuvieron en una mezcla 1:1 (v/v) de medio de Eagle modificado por
Dulbecco y medio F12 de Ham complementado con suero fetal bovino al
10%, piruvato 1 mmol/l y L-glutamina 2 mmol/l en
CO_{2} al 5%-aire al 95%, a 37ºC en un incubador humidificado.
Para estudios funcionales también se usaron
otras variantes metastásicas procedentes de cultivos primarios de
metástasis de hígado (435-Liver) y pulmón
(435-Lung) (Martin B. et al., "Functional
Clustering of Metastasis Proteins Describes Plastic Adaptation
Resources of Breast-Cancer Cells to New
Microenvironments", J. Proteome Res., 2008, vol. 7, págs.
3242-3253). En algunos experimentos se usaron
células metastásicas de hueso de MDA-MB 231, células
BO2 proporcionadas por P. Clézardin (INSERM U.664, Faculté de
Médecine Laennec, Lyon, Francia).
Para confirmar la expresión de proteína se
usaron seis metástasis cerebrales, emparejadas con los
correspondientes carcinomas ductales de mama, de pacientes tratados
quirúrgicamente en el Hospital Universitario de Bellvitge,
HUB.
HUB.
También se usaron carcinomas ductales de mama
primarios en el diagnóstico inicial para evaluar el valor predictivo
de cada proteína. El Comité para el Cáncer de Mama del Instituto
Catalán de Oncología (I.C.O.) y el HUB suministraron muestras de
pacientes diagnosticados entre 1988 y 2006. La serie incluía 71
tumores consecutivos en el diagnóstico inicial de pacientes
metastásicos en tratamiento en el momento del estudio, con uno o
varios órganos afectados, y 51 pacientes con ganglios linfáticos
positivos en la cirugía sin evolución metastásica después de un
seguimiento mínimo de cinco años. Para optimizar cada análisis
inmunohistoquímico, también se usaron tejidos control de cáncer de
mama (GRP94, TRAF2), testículo (inhibina), riñón y corazón (FN14)
(Véase la Tabla 1 de más
abajo).
abajo).
El procedimiento para identificar nuevos
candidatos de cáncer ha sido descrito por Aragues y colaboradores
(Aragues R. et al., "Predicting cancer involvement of genes
from heterogeneous data", BMC Bioinformatics, 2008, vol. 9, pág.
172). En una primera etapa, se construyó una red de interacciones
proteína-proteína ("PPIN") a partir de un
conjunto de proteínas diana que se sabe que están implicadas en el
cáncer (es decir, proteínas semilla). Después, se mapearon los
niveles de expresión génica sobre las proteínas de la red. Se
considera que una proteína se expresa de forma diferencial si el gen
que la codifica se encontraba expresado de forma diferencial en el
experimento de micromatrices. Por último, se produjo una lista de
genes de cáncer candidatos.
Para clasificar las proteínas por su función se
usó el programa informático FatiGo; una herramienta web para
detectar asociaciones significativas entre términos de ontología de
genes y grupos de genes (Al-Shahrour F. et
al., "FatiGO: a web tool for finding significant associations
of Gene Ontology terms with groups of genes",
Bioinformatics, 2004, vol. 20, págs.
578-580).
Se usó antes del análisis proteómico que
comparaba la expresión diferencial de proteínas entre células
435-P y 435-Br1 para generar y
analizar una red de interacciones proteína-proteína
(Martin B. et al., "Biological pathways contributing to
organ-specific phenotype of brain metastatic
cells", J. Proteome Res., vol. 7, págs.
908-920). En resumen, se identificaron las proteínas
que se expresaban de forma diferencial mediante electroforesis
bidimensional en gel (Ettan TM DIGE, Amersham Biosciences AB) en
células 435-Br1 mediante espectros de masas de
huella peptídica registrados mediante un Voyager STR
MALDI-TOF (Applied Biosystems) en modo reflector
positivo con extracción retardada. Los espectros se analizaron
usando el programa m/z (Proteometrics, Nueva York, NY). Las
proteínas se identificaron frente una base de datos no redundante
(NCBI) usando el programa MASCOT (http://www.matrixscience.com).
La red de proteínas se basaba en 17 proteínas
conocidas. Se usó PIAÑA (Aragues R. et al., "PIAÑA: protein
interactions and network analysis", Bioinformatics, 2006,
vol. 22, págs. 1015-1017) para combinar los datos de
DIP 2006.01.16, (Salwinski L. et al., "The Database of
Interacting Proteins: 2004 update", Nucleic Acids Res,
2004, vol. 32, págs. D449-451), MIPS 2006.01 (Pagel
P. et al., "The MIPS mammalian
protein-protein interaction database",
Bioinformatics, 2005, vol. 21, págs.
832-834), HPRD 2005.09.13 (Peri S. et al.,
"Human protein reference database as a discovery resource for
proteomics", Nucleic Acids Res., 2004, vol. 32, págs.
D497-501), BIND 2006.01 (Alfarano C. et al.,
"The Biomolecular Interaction Network Database and related tools
2005 update", Nucleic Acids Res., 2005, vol. 33, págs.
D418-424) y las interacciones humanas de dos
experimentos de alto rendimiento (Rual J. F. et al.,
"Towards a proteome-scale map of the human
protein-protein interaction network",
Nature, 2005, vol. 437, págs. 1173-1178;
Stelzl U. et al., "A human protein-protein
interaction network: a resource for annotating the proteome",
Cell, 2005, vol. 122, págs. 957-968).
La integración de muchas fuentes de
interacciones diferentes en un único dispositivo de almacenamiento
permitió trabajar con un vasto conjunto de 363.571 interacciones
entre 42.040 secuencias de proteínas diferentes. El conjunto inicial
de proteínas se denominó "proteínas semilla". En esta red, una
proteína que estaba asociada con más de un semilla se denominó un
N-engarcer, siendo N el número de proteínas semilla
con las que estaba asociada.
Por último, las proteínas que sólo estaban
asociadas con una proteína semilla se denominaron "hojas"
(Dawelbait G. et al., "Structural templates predict novel
protein interactions and targets from pancreas tumour gene
expression data", Bioinformatics, 2007, vol. 23, págs.
1115-124; Cockell S. J. et al.,
"Structure-based evaluation of in silico
predictions of protein-protein interactions using
Comparative Docking", Bioinformatics, 2007, vol. 23, págs.
573-581).
Se usó la lista de genes expresados de forma
diferencial para 4 metástasis cerebrales de pacientes con cáncer de
mama obtenida del MetaBre Consortium. Se analizaron mediante
hibridación de microarray usando el GeneChip Human Genome U133 Plus
2.0 Array (Affymetrix, UK Ltd, Reino Unido), que incluye más de
47.000 transcritos y variantes, siguiendo protocolos convencionales
para la extracción de ARN y preparación de las sondas. Para procesar
y normalizar los chips de Affymetrix se usaron algoritmos de
promedio robusto de multichip (RMA) (Irizarry R. A. et al.,
"Exploration, normalization, and summaries of high density
oligonucleotide array probe level data", Biostatistics,
2003, vol. 4, págs. 249-264). Todos estos cálculos
se realizaron con el paquete Bioconductor (Gentleman R. C. et
al., "Bioconductor: open software development for
computational biology and bioinformatics", Genome Biol.,
2004, vol. 5, pág. R80). Los perfiles de expresión se analizaron con
BRB Array tools, versión 3.3beta3 (Biometric Research Branch,
Division of Cancer Treatment and Diagnosis Molecular Statistics and
Bioinformatics Section, National Cancer Institute, Bethesda,
Maryland, Estados Unidos). Se usaron dos procedimientos diferentes
para las comparaciones: (1) la variación en veces para cada gen en
metástasis cerebral en comparación con una combinación de carcinomas
de mama primarios (Lonnstedt I. et al., "Replicated
microarray data", Statistica Sinica, 2002, vol. 12, págs.
31-46); (2) y un test t univariante (Landemaine T.
et al., "A six-gene signature predicting
breast cancer lung metastasis", Cancer Res., vol. 68,
págs. 6092-6099) para identificar genes que se
expresaban de forma diferencial en metástasis cerebral y en
metástasis en órganos distintos del cerebro (5 muestras de
metástasis de pulmón, 6 de hígado, 2 de piel y 6 de hueso
osteolítico).
También se usó para las comparaciones la lista
obtenida en los mismos experimentos de genes expresados de forma
diferencial en metástasis diferentes de la metástasis cerebral
(genes en pulmón, hígado y hueso) con respecto a una combinación de
tumores de cáncer de mama.
Se prepararon TMA a partir de tres áreas
representativas del tumor que se seleccionaron cuidadosamente a
partir de secciones teñidas con hematoxilina-eosina
de bloques de 122 donantes. Se troquelaron cilindros de núcleo de un
diámetro de 0,6 mm de cada uno de ellos con un punzón de biopsia de
piel y se depositaron en bloques de parafina receptores usando un
dispositivo de generación de matrices específico (Beecher
Instruments, Sun Prairie, WI), tal y como se describe en Fernandez y
colaboradores (Fernandez P. L., et al., "Tissue macroarrays
("microchops") for gene expression analysis", Virchows
Arch., 2001, vol. 438, págs. 591-594). Además de
tumores, el bloque receptor también contenía 6 muestras normales de
mama. Se realizaron secciones de tres \mum del bloque de
microarray resultante y se usaron para análisis de IHC después de
transferirse a portaobjetos de vidrio.
Las condiciones experimentales y las
características y fuente de los anticuerpos usados se enumeran en la
Tabla 1.
Se usaron tejidos de control positivos para cada
proteína como una referencia para la intensidad de tinción de
TMA.
Los antígenos se desenmascararon por
calentamiento en una olla de presión durante 20 minutos en el tampón
apropiado (como se indicaba en la Tabla 1 anterior). Se diluyeron
anticuerpos primarios en tampón diluyente de anticuerpos Dako Real™
(Dakocytomation): tampón Tris, pH 7,2, NaN_{3} 15 mM. Se usó
LSAB+System-HRP (Dakocytomation) incluyendo las
inmunoglobulinas biotiniladas anti-conejo,
anti-ratón y anti-cabra en PBS;
estreptavidina conjugada con HRP en PBS; y
3,3'-diaminobencidina líquida en solución de
cromógeno. Se usó el anticuerpo policlonal
anti-HERB-2, A0485 (DAKO) con el kit
de detección Ultraview en un sistema de tinción automático
(Benchmark XT, Estados Unidos).
Las inmunorreactividades se clasificaron
estimando el porcentaje de células tumorales que mostraron una
tinción característica (desde "indetectable" o del 0%, hasta
tinción homogénea o del 100%) y estimando la intensidad de tinción
(1, tinción débil o negativa; 2, tinción moderada; ó 3, tinción
fuerte). Los valores límite eran los mismos para todos los
marcadores ensayados: se consideró la tinción fuerte como positiva
cuando más del 50% de las células expresaban (Fig. 2) (Ginestier C.
et al., "Distinct and complementary information provided by
use of tissue and DNA microarrays in the study of breast tumor
markers", Am. J. Pathol., vol. 161, págs.
1223-1233; Jacquemier J. et al., "Protein
expression profiling identifies subclasses of breast cancer and
predicts prognosis", Cancer Res., 2005, vol. 65, págs.
767-779). Se comprobó la reproducibilidad del método
usando múltiples intérpretes y la fiabilidad por comparación con
inmunhistoquímica convencional en secciones completas. Los
portaobjetos fueron evaluados al microscopio óptico por dos
investigadores.
Se lisaron células de cultivos en fase
exponencial en 200 \mul de tampón RIPA. Las proteínas separadas en
un gel de poliacrilamida al 7% ó 12% se transfirieron a membranas de
PVDF (Immobilon-p, Millipore Corporation, Bedford,
MA). Se usaron los siguientes anticuerpos: GRP94, clon
C-19 (Santa Cruz) a 1/1000; GRP78, clon
N-20 (Santa Cruz) a 1/500; HSP70, clon
C92F3A-5 a 1/1000 (Stressgen, Ann Arbor, MI); GRP58,
producto E1031 a 1/200 (Sigma), HSP60, clon LK1 (Abcam) a 1/200;
TRAF2, clon 33A1293 a 1/100 (Acris Antibodies, GmbH, Alemania);
ATF6, clon 70B14B.1 a 1/200 (Acris). También se usaron anticuerpo
monoclonal anti-actina humana 1/2000 (Sigma) y
anti-tubulina \alpha humana, clon
B-5-1-2 (Sigma) a
1/10.000 como patrones internos para el análisis densitométrico,
para los que se evaluó una banda usando el programa Quantity One; la
intensidad de una banda se calcula como la suma de las intensidades
de todos los píxeles dentro de los límites de la banda multiplicada
por el área de cada
píxel.
píxel.
\newpage
Se usó anticuerpo secundario de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasa 1/2000
(Amersham), o anticuerpo secundario anti-ratón
1/2000 (Pierce, Perbio Science Ltd., Cheshire, Reino Unido) o
anticuerpo secundario anti-cabra 1/3000 (Santa Cruz)
según fuera apropiado en cada caso.
Se visualizaron las bandas inmunorreactivas con
un sistema de formación de imágenes VersaDoc™
(Bio-Rad) usando el Super Signal
west-Pico (Pierce). Se establecieron los PM con
patrón preteñido con See Blue Plus2 (Invitrogen, San Diego, CA).
Para realizar el análisis estadístico se
siguieron las sugerencias de STARTD
(http://www.stard-statement.org/). Se usó un
análisis de varianza de dos vías para comparar los niveles medios de
expresión. Los marcadores de inmunohistoquímica se clasificaron en
una escala de tres categorías (negativo, positivo débil y positivo
fuerte). La predictibilidad de metástasis cerebral para cada
marcador se ensayó usando una prueba exacta de Fisher de dos lados y
se resumió por cálculo de la sensibilidad entre tumores que
desarrollaron metástasis y la especificidad entre tumores sin
metástasis para valores positivos fuertes. También se calcularon las
relaciones de probabilidad positiva y negativa como índices
predictivos integrados, así como el área bajo la curva de ROC. Se
evaluaron los marcadores usando un modelo de regresión logística
multivariante en un procedimiento por etapas hacia delante para
identificar la mejor combinación para predecir la metástasis
cerebral. Puesto que HERB-2 ya era un factor de
riesgo de metástasis conocido, también se realizó un análisis que
incluía HERB-2 como la medida basal, así como un
análisis estratificado de cada marcador candidato dentro de tumores
positivos y negativos para HERB-2. En todos los
análisis, las asociaciones se consideraron significativas cuando
p < 0,05.
Los inventores usaron un enfoque integrado para
construir, ensayar y perfeccionar un modelo de rutas celulares
implicadas en la evolución a metástasis cerebral usando una PPIN. Se
usó una PPIN de metástasis cerebral obtenida previamente (consúltese
Martin B. et al., "Biological pathways contributing to
organ-specific phenotype of brain metastatic
cells", J. Proteome Res., 2008, vol. 7, págs.
908-920) que incluía 628 proteínas de 13 semillas
conocidas identificadas mediante MALDI-TOF. 8
proteínas estaban subexpresadas en células metastásicas cerebrales
con respecto a las células parentales (glioxalasa 1, queratina 1,
proteína de choque térmico 27 (HSP27) y 70 (HSP70), galectina 1,
isoforma 3 de corte y empalme de RAD 50, proteína ribosomal 40s s12
y catepsina D) y 5 estaban sobreexpresadas (receptor de laminina de
34/67 kDa (34/67-LMR), queratina 10, vimentina,
cadena \beta de ATP sintasa y tubulina
\beta5).
\beta5).
La PPIN se comparó con 5.235 genes de metástasis
cerebral expresados de forma diferencial con respecto a una
combinación de carcinomas de mama primarios de transcriptómica
(variación en veces, \geq2, o \leq -2). Usando este método
(consúltese Lonnstedt I. et al., "Replicated microarray
data", Statistica Sinica, 2002, vol. 12, págs.
31-46), se encontraron en la red 556 parejas de
proteína-gen que se correspondían con 183 genes
diferentes, 48 subexpresados y 135 sobreexpresados (no se muestran
los datos) (29,14% proteínas por ordenador).
Para clasificar de forma funcional esta
identificación de proteínas cerebrales se usó el programa
informático FatiGO que a través de ID Ensembl busca términos GO para
llegar a una función preponderante de proteínas estadísticamente
significativas en grupos de coexpresión. Se clasificaron 112 códigos
de términos GO: 34 metabolismo de ácidos nucleicos (36,17%), 29
proteínas de traducción (30,85%), 18 proteínas involucradas en las
modificaciones y plegamientos de otras proteínas (19,15%), 9 de
muerte celular (9,58%) y una miscelánea de proteínas de señalización
y transporte metabólico (no se muestran los datos).
La identificación de genes específicos para la
metástasis cerebral (BMOS) se catalogó con un agrupamiento
jerárquico que distingue claramente entre las diferentes metástasis
(cfr. Landemaine T. et al., "A six-gene
signature predicting breast cancer lung metástasis", Cancer
Res., 2008, vol. 68, págs. 6092-6099). La BMOS
contenía 1.193 genes (MetaBre) después de que las comparaciones de
clase de uno contra todos (ONA) identificaran genes expresados de
forma diferencial en las 4 metástasis cerebrales a diferencia de en
las otras 19: 6 de hueso, 5 de pulmón, 2 de piel y 6 de hígado.
Integrando los análisis genómicos y proteómicos
que se han descrito anteriormente, los inventores relacionaron la
BMOS con la red de proteínas obtenida en la sección anterior y
obtuvieron 38 proteínas específicas de órgano cerebral: 7
subexpresadas y 31 sobreexpresadas. Estas incluían 13 proteínas del
metabolismo de ácidos nucleicos (48,15%), 10 proteínas de traducción
(37,04%), 7 proteínas de muerte celular (25,93%), 6 proteínas que
modifican y plegan otras proteínas (22,22%) así como miscelánea de
proteínas implicadas en metabolismo, de señalización y transporte,
algunas de ellas con varias funciones. Estas proteínas clasificadas
adicionalmente con el programa informático FatiGO se validaron como
una identidad funcional específica de órgano con un ligero aumento
en genes de muerte
celular.
celular.
Además, eran predominantes cinco funciones de la
PPIN: unión y reparación de ADN; plegamiento de proteínas y
chaperonas, que emplea una proteína más de unión a ADN (O14776);
estructural de citoesqueleto, que emplea cuatro nuevas proteínas de
unión a ADN (Q9POW2, P33991, Q53X93, Q9UJN0), dos nuevos factores de
transducción de señales (P50453, P16220), una proteína de
ubiquitinización (Q96BH1), una proteína del metabolismo de
aminoácidos (Q8N6T7) y una proteína implicada en la metilación
(Q96KQ7); biosíntesis de proteínas, que emplea cuatro nuevos
factores de transducción de señales (P29692, Q96I38, Q8IWK1,
P05111); y una proteína de transporte de vesículas (Q8N6T3).
Los inventores de la presente solicitud buscaron
referencias a identificaciones de metástasis cerebral en datos
genómicos publicados de cáncer de mama clínico y experimental y
análisis de metástasis, pero no encontraron ninguna. De la lista de
genes, sólo siete aparecían en listas anteriores de generación de
perfiles de expresión génica que predecían desenlaces médicos de
cáncer de mama: EEF1D, MCM4, RPL5, RPS12 y CLN3, a partir de la
generación de perfiles de expresión génica que predicen el desenlace
clínico (consúltese van 't Veer et al., "Gene expression
profiling predicts clinical outcome of breast cancer",
Nature, 2002, vol. 415, págs. 530-536) y
FAM3A y TBCD a partir de las identificaciones de expresión génica en
la predicción del desenlace del cáncer de mama (consúltese Nevins J.
R. et al., "Towards integrated
clinico-genomic models for personalized medicine:
combining gene expression signatures and clinical factors in breast
cancer outcomes prediction", Hum. Mol. Genet., 2003, vol. 12
Espec. Nº 2: R153-157). La GFAP, una proteína ubicua
en el SNC, también aparecía en una lista de genes que se expresaban
de forma diferencial entre metástasis del cáncer de mama en cerebro
y hueso (consúltese Klein A. et al., "Identification of
brain- and bone-specific breast cancer metastasis
genes", 2008, Cancer Lett.,
(Electronic)).
(Electronic)).
Se llevaron a cabo experimentos
inmunohistoquímicos adicionales en las seis muestras de metástasis
cerebral tumoral de cáncer de mama emparejadas de pacientes para
corroborar la expresión diferencial de algunas proteínas
representativas de las funciones implicadas. Se validó la expresión
de GRP94, el plegamiento de proteínas y chaperonas, en todas las
parejas (6/6) con una intensidad de tinción citoplasmática similar;
FN14, de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral
engranaba con el plegamiento de proteínas y nudo de chaperonas, que
tenía una tinción de membrana particular y citoplasmática aumentada
en la metástasis cerebral (6/6); y TRAF2, una proteína adaptadora y
transductora de señales que relaciona miembros de la familia de
receptores del factor de necrosis tumoral con diferentes rutas de
señalización que presentaban una clara tinción citoplasmática.
Para validar el carácter específico de órgano de
esta identificación, los inventores volvieron a los datos
transcriptómicos para comprobar la expresión en metástasis distintas
del cerebro (hígado, pulmón y hueso) de genes que se sabe que están
implicados en la respuesta al estrés del retículo endoplásmico
(ERS). Así, se buscaron grupos funcionales diferentes de genes:
chaperonas del retículo endoplásmico, sensores de estrés clásico,
respuesta de plegamiento/no plegamiento de proteínas, rutas de
señalización clásicas, resistencia a estrés oxidativo, proteosoma,
transportadores de glucosa, grupos del metabolismo de aminoácidos,
transportadores de proteínas y receptores y transductores de
señales. De estos, los sobreexpresados de una forma más diferencial
eran la proteína GRP94, 10 veces, en metástasis cerebral pero
también en pulmón, 6,5 veces y hueso, 3,3 veces; HSP90, 22 veces, en
cerebro seguido de hueso, 7,5 veces; calreticulina, 8 veces, que
muestra un ligero aumento en hueso y pulmón. Más específicamente, en
cerebro la subunidad del proteosoma 26S se sobreexpresaba 12 veces,
el receptor de proteína tirosina quinasa HERB-2 32
veces y el receptor del factor de crecimiento epidérmico 9,5 veces.
Por el contrario, otras funciones no tenían una expresión importante
en cerebro, por ejemplo, el metabolismo de glucosa se sobreexpresaba
solamente en hígado, o el metabolismo de aminoácidos. Por lo tanto,
de acuerdo con la expresión de estos genes en las cuatro metástasis
diferentes, los inventores formularon la hipótesis de que la
metástasis cerebral tenía un fenotipo funcional particular diferente
de otras metástasis que se desarrollan en pulmón, hígado o
hueso.
hueso.
De las proteínas validadas, las implicadas en el
plegamiento de proteínas y chaperonas pueden relacionar diferentes
funciones y presumiblemente actúan rescatando células de respuestas
de RES. De hecho, el mecanismo integrado implica las respuestas de
proteínas no plegadas (UPR) para establecer un eje de comunicación
entre el retículo endoplásmico (RE) y el núcleo, la maquinaria de
degradación asociada al RE, la maquinaria exportación del RE y una
interfaz con mitocondrias implicada en la activación de mecanismos
proapoptóticos. GRP94, la glicoproteína más abundante en el RE, está
implicada en la maduración conformacional de proteínas destinadas a
presentación en la superficie celular o exportación. GRP94, como
BiP, podría participar en la activación de PERK, ATF6 e IRE1 por
ERSRP. Por lo tanto, la sobreexpresión de GRP94 en metástasis
cerebral podría ser un eje que organiza el fenotipo ERSRP.
La apoptosis puede inducirse mediante IRE1 y
TRAF2 por liberación de calcio de los depósitos del RE. Además, la
sobreexpresión de FN14 a través de la señalización de TRAF2, como
receptores de TNF\alpha, podría ser un mediador potencial de la
supervivencia celular puesto que la activación induce la
translocación desde el citoplasma hasta el núcleo, regulando
positivamente proteínas antiapoptóticas. Por lo tanto, la capacidad
de células metastásicas cerebrales de manejar el estrés puede
condicionar su capacidad intrínseca para sobrevivir y contribuir a
la evolución a metástasis cerebral y a la resistencia a terapia.
Puesto que GRP94 también era una molécula de metástasis cerebral
específica de órgano en muestras de pacientes, los inventores de la
presente solicitud formularon la hipótesis de que GRP94 podía
organizar las respuestas al estrés del retículo endoplásmico (ERSR),
induciendo rutas compensatorias para inhibir la muerte celular.
Para estimar la probabilidad de desenlaces
específicos de metástasis cerebral se analizó el ERSRP generado en
una serie de tumores de cáncer de mama primarios para determinar su
valor como una supuesta herramienta para la predicción temprana en
el diagnóstico inicial.
Se seleccionó la tecnología de array de tejidos
(TMA) porque permite el análisis simultáneo de muchas muestras de
tumores archivadas organizadas en matrices sobre portaobjetos de
vidrio mediante análisis inmunohistoquímico tradicional sobre
tejidos embebidos en parafina con un seguimiento prolongado. La TMA
permitió comprobar la expresión de GRP94, TRAF2 y FN14 seleccionados
del análisis proteómico en tumores de mama primarios. También se
comprobó VAV2, TOP1 e Inhibina, que obtuvieron buenas puntuaciones
como específicos de órgano cerebral en los datos transcriptómicos
previos y se validaron adicionalmente mediante IHC a nivel de
expresión de proteínas. Los resultados se resumen en la Tabla 2:
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión se optimizó y puntuó previamente
para las seis parejas de tumores de cáncer de mama y metástasis
cerebral emparejadas (Fig. 1). Como se esperaba, la tinción para
todos los anticuerpos fue homogénea con diferentes intensidades
entre ellos. Se consideró que un marcador era positivo cuando se
detectaba una alta expresión para evitar falsos positivos
innecesarios, teniendo en cuenta la expresión conocida en un tejido
de control (Fig.
2).
2).
El análisis estadístico de los datos mostró
asociaciones significativas entre la evolución a metástasis cerebral
y la alta expresión de GRP94 (p < 0,0001), TRAF2 (p < 0,001),
FN14 (p < 0,0001), TOP1 (p=0.032), y VAV2 (p=0.005). La expresión
de Inhibina no se asoció con evolución a metástasis cerebral (p =
0,2). Como se esperaba, la expresión de HERB-2 se
asociaba con metástasis cerebral con una alta significación (p <
0,0001); así como con la ausencia de receptores de hormonas, ER:
54,6% frente a 29,6% (6/11 y 29/98, respectivamente, p = 0,016) y
PR: 72,7% frente al 39,0% (8/11 frente a 37/95, respectivamente, p =
0,009). También se observó una ligera asociación con el grado
histológico (HG), HG III 46,9% (7/12 frente a 45/96, p = 0,105).
Se calcularon las relaciones de probabilidad
positiva y negativa para evaluar la exactitud predictiva de cada
molécula como un marcador de metástasis cerebral considerando la
sensibilidad y la especificidad de cada una. El mayor valor
predictivo para la presencia de la enfermedad metastásica fue la
expresión de HERB-2 (LR positiva 6,7, p <
0,0001), seguido de FN14 (LR positiva 3,01, p < 0,001), GRP94 (LR
positiva 1,89 p < 0,003) y TRAF2 (LR positiva 1,67, p <
0,055). Por otro lado, GRP94 fue mejor marcador predictivo negativo
(LR negativa 0,16), seguido de TRAF2 (LR negativa 0,35), FN14 (LR
negativa 0,40) y HERB-2 (LR negativa 0,42). Por lo
tanto, la ausencia de ERSRP en tumores predecía la ausencia de
metástasis cerebral.
Un análisis multivariante basado en una
regresión logística por etapas determinó que GRP94, FN14 e Inhibina
como la mejor combinación para predecir la metástasis cerebral. El
área bajo la curva de ROC para esta combinación fue de 0,85 (95% CI
0,75-0,96) mientras que el área bajo la curva de ROC
para HERB-2 en solitario fue de 0,76 (95% CI
0,58-0,93). Esta combinación de marcadores supone
una mejora significativa sobre la eficacia de predicción de
HERB-2 (p < 0,001). (Tabla 3, Fig. 3).
\newpage
También se realizó un análisis estratificado
para comprobar la relación entre la positivad de
HERB-2 y ERSRP en combinaciones binarias, como se
muestra en la Tabla 3:
En tumores negativos para
HERB-2, FN14 tenía una relación de probabilidad
negativa alta para predecir la ausencia de evolución a metástasis
cerebral (LR = 0,26, sensibilidad = 0,8, p = 0,015). Además, si el
mejor predictor de metástasis cerebral en solitario era
HERB-2, la adición de la expresión de GRP94, TRAF2 y
FN14 aumentaba significativamente la predicción de enfermedad
metastásica en cerebro, Además, la combinación de GRP94, FN14,
Inhibina y HERB-2 mostró una predicción de
enfermedad metastásica en cerebro de aROC = 0,90.
Claims (11)
1. Método para determinar el riesgo de
desarrollar metástasis cerebral en un sujeto al que se le ha
diagnosticado un tumor de mama, comprendiendo el método: (a) aislar
una muestra del tumor de mama; (b) determinar el nivel de expresión
de GRP94, FN14 o ambos en la muestra; y (c) comparar dicho nivel con
el nivel de expresión de dicho gen o genes en una muestra control,
de manera que si se detecta una sobreexpresión de dicho gen o genes
en relación con la muestra control, es indicativo del riesgo de
desarrollar metástasis cerebral.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que se determina el nivel de expresión de GRP94 y FN14.
3. Método de acuerdo con cualquier de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además determinar el
nivel de expresión de TRAF-2.
4. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además determinar el
nivel de expresión de HERB-2.
5. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además determinar el
nivel de expresión de Inhibina.
6. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se determina el nivel de
expresión de uno de los siguientes conjuntos de marcadores:
- (a)
- GRP94, FN14, Inhibina;
- (b)
- GRP94, TRAF2, HERB-2, y FN14;
- (c)
- GRP94, FN14, Inhibina y HERB-2; y
- (d)
- GRP94, FN14 y TRAF2.
7. Método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que se determina la
cantidad de proteína.
8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que la cantidad de proteína se determina usando un anticuerpo que
se une específicamente a dicha proteína.
9. Kit para llevar a cabo el método que se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8,
comprendiendo el kit medios apropiados para determinar el nivel de
expresión de cada uno de los marcadores.
10. Kit de acuerdo con la reivindicación 9, en
el que los medios son anticuerpos que se unen específicamente a cada
una de las proteínas a detectar.
11. Uso de GRP94 como un marcador de pronóstico
o susceptibilidad a metástasis cerebral.
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