ES2355978T3 - Sal de fosfato de ácido 5-aminolevulinico, proceso para producir la misma y uso de la misma. - Google Patents
Sal de fosfato de ácido 5-aminolevulinico, proceso para producir la misma y uso de la misma. Download PDFInfo
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Abstract
Una sal de fosfato del ácido 5-aminolevulínico de fórmula (I): **(Ver fórmula)** en la que R1 individualmente es cada uno H, alquilo C1-18, alquenilo C2-18, aralquilo C7-26 o fenilo; y n es un número entero de 0-2.
Description
Sal de fosfato de ácido
5-aminolevulínico, proceso para producir la misma y
uso de la misma.
La presente invención se refiere a una sal de
fosfato del ácido 5-aminolevulínico que es útil en
los campos, por ejemplo, de los microorganismos, fermentación,
animales, medicamentos y plantas; a un proceso para producir la
misma; a una composición médica que comprende la misma; y a una
composición de activador de plantas que comprende la misma.
Se conoce que el ácido
5-aminolevulínico es útil, por ejemplo, para la
producción de V B_{12}, la producción de la enzima hemo, el
cultivo microbiano y la producción de porfirina en el campo de la
fermentación microbiana, por ejemplo, para el tratamiento de
enfermedades infecciosas (Referencia No de patente 1),
esterilización, diagnóstico de Haemophilus, materiales
derivados, depilación, terapia del reumatismo (Referencia No de
patente 2), terapia del cáncer (Referencia No de patente 3), terapia
del trombo (Referencia No de Patente 4), diagnóstico durante
operación de cáncer (Referencia No de patente 5), cultivo de células
animales, corte con UV, investigación del metabolismo del hemo,
cuidado del pelo, diagnóstico de intoxicación con metales pesados y
porfiria y prevención de anemia en el campo de la terapia animal y,
por ejemplo, para productos químicos agrícolas en el campo de
plantas.
Por otro lado, el método de producción del ácido
5-aminolevulínico se conoce solamente como su
clorhidrato y se han descrito métodos que usan ácido hipúrico
(Referencia de Patente 1), cloruro de monoéster del ácido succínico
(Referencia de Patente 2), furfurilamina (Referencia de Patente 3),
hidroximetilfufural (Referencia de Patente 4), éster metílico del
ácido oxovalérico (Referencia de Patente 5) o anhídrido succínico
(Referencia de Patente 6) como el material.
Sin embargo, ya que el clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico contiene ácido clorhídrico, es
necesario tener en cuenta la corrosión del aparato y la generación
de una estimulación causada por el cloruro de hidrógeno vaporizado
durante el proceso de producción y el proceso de formación de
compuestos y dispersión, de tal forma que es preferible adoptar una
contramedida para evitar las mismas.
Además, en el caso de la administración oral de
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico o su
aplicación a la piel en un ser humano, se añade una estimulación de
abrasamiento a la lengua o la piel. Por consiguiente, el interés se
ha dirigido a una sal de ácido 5-aminolevulínico que
tenga una menor estimulación que la del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico, como el ácido
5-aminolevulínico a usar en el campo de la
medicina.
Además, ya que el clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico tiene una propensión a degradarse
parcialmente de 130 a 156ºC y degradarse completamente a 156ºC,
tiene el problema de ser capaz de resistir con dificultad a un
tratamiento de esterilización por calor a alta temperatura.
Un método de esterilización mediante exposición
a radiación se conoce como un método para resolver este problema
(Referencia de Patente 7), pero este método requiere un aparato de
exposición a radiación.
Por consiguiente, para realizar la
esterilización mediante un método de esterilización por calor
general y cómodo, es necesario mejorar la resistencia térmica del
ácido 5-aminolevulínico.
Además, aunque el clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico se usa en el campo de plantas
(Referencia de Patente 8), cuando se usa mezclando con nitrato de
plata o un componente bactericida similar usado generalmente para
plantas, la precipitación del cloruro de plata se genera en algunos
casos a través de la reacción del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico con nitrato de plata, lo que
requiere una gran atención desde el punto de vista funcional debido
a la posibilidad de inutilizar la pulverización del agente debido al
atascamiento de la boquilla del pulverizador. Además, cuando una
solución acuosa de clorhidrato de ácido
5-aminolevulínico se aplica directamente a una
fruta, la coloración de la fruta en ocasiones es insuficiente cuando
está presente el ión de cloruro.
Además, aunque una solución acuosa que contiene
ión de ácido 5-aminolevulínico e ión de nitrato se
ha sugerido, el nitrato del ácido 5-aminolevulínico
todavía no se ha aislado (Referencia No de patente 6).
- Referencia de Patente 1:
- JP-A-48-92328
- Referencia de Patente 2:
- JP-A-62-111954
- Referencia de Patente 3:
- JP-A-2-76841
- Referencia de Patente 4:
- JP-A-6-172281
- Referencia de Patente 5:
- JP-A-7-188133
- Referencia de Patente 6:
- JP-A-9-316041
- Referencia de Patente 7:
- JP-T-2001-514243
- Referencia de Patente 8:
- JP-A-4-338305
- Referencia No de Patente 1:
- Peter W. et al., J. Am. Acad Dermatol., 31, 678-680 (\underline{1994})
- Referencia No de Patente 2:
- Kenneth T., Patente de Estados Unidos 5.368.841 (\underline{1994})
- Referencia No de Patente 3:
- Hillemanns P. et al., Int. J. Cancer, 85, 649-653 (\underline{2000})
- Referencia No de Patente 4:
- Ichiro Yamada et al., Abstracts of Papers, The Japanese Orthopedic Association (\underline{1988})
- Referencia No de Patente 5:
- Kamasaki N. et al., Journal of Japan Society for Laser Medicine, 22, 255-262 (\underline{2001})
- Referencia No de Patente 6:
- Baxter C. S. et al., Toxicology And Applied Pharmacology, 47, 477-482 (\underline{1979})
\vskip1.000000\baselineskip
El documento US 6.559.183 B1 describe una
composición que comprende una nanoemulsión que contiene una
sustancia activa seleccionada entre ácido
5-aminolevulínico, un compuesto de sal del mismo, un
compuesto de complejo del mismo y un compuesto de adición del mismo,
precursores del mismo y metabolitos del mismo y un vehículo, formado
por al menos un lípido y al menos un emulsionante, en una fase
acuosa. La composición se describe como útil en una terapia
fotodinámica de enfermedades asociadas con proliferación
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención es para proporcionar una
sal novedosa del ácido 5-aminolevulínico que tiene
una baja estimulación o que puede resistir un tratamiento de
esterilización por calor a alta temperatura, un método de producción
de la misma, una composición para uso de tratamiento médico que
comprende la misma y una composición de activador de planta que
comprende la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Teniendo en cuenta tales circunstancias reales,
los presentes inventores han realizado intensos estudios y han
hallado como resultado que un fosfato del ácido
5-aminolevulínico puede satisfacer los requisitos
que se han descrito anteriormente y se puede obtener eluyendo ácido
5-aminolevulínico absorbido sobre una resina de
intercambio catiónico y mezclando el eluato con ácido fosfórico.
Por tanto, la presente invención se refiere a
una sal de fosfato de ácido 5-aminolevulínico de
fórmula (I):
en la que R^{1} individualmente
es cada uno H, alquilo C_{1-18}, alquenilo
C_{2-18}, aralquilo C_{7-26} o
fenilo; y n es un número entero de
0-2.
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Además, la invención se refiere a un proceso
para producir esta sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico, que comprende
(i) eluir un ácido
5-aminolevulínico adsorbido sobre una resina de
intercambio catiónico y
\newpage
(ii) mezclar el eluato con un ácido fosfórico de
la fórmula
en la que R^{1} individualmente
es cada uno H, alquilo C_{1-18}, alquenilo
C_{2-18}, aralquilo C_{7-26} o
fenilo; y n es un número entero de
0-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Aún adicionalmente, la invención se refiere a
una composición que comprende la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico, así como al uso de la sal del
ácido 5-aminolevulínico (a) para la fabricación de
un agente médico para el tratamiento fofodinámico o diagnóstico
fotodinámico; y (b) como un activador de plantas.
Las realizaciones preferidas son como se definen
en las reivindicaciones dependientes adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención es una
sustancia que es sencilla de manejar, debido a que no desprende un
olor desagradable o un olor estimulante. Además, esto muestra una
baja naturaleza estimulante sobre la piel y la lengua y su
permeabilidad a través de la piel también es excelente, de tal forma
que una composición que comprenda esto es útil como un agente para
tratamiento o diagnóstico fotodinámico. Aún adicionalmente, esto
tiene un elevado punto de descomposición y una alta resistencia
térmica en comparación con su clorhidrato. De acuerdo con el método
de producción de la presente invención se puede producir una sal de
fosfato de ácido 5-aminolevulínico de forma cómoda y
eficaz. Además, ya que su concentración de ión de cloruro es baja
cuando se prepara en una solución acuosa, difícilmente tiene lugar
el daño por cloruro al administrar la misma a plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un gráfico que muestra una
relación entre la concentración y el pH de soluciones acuosas de sal
de ácido 5-aminolevulínico.
La Figura 2 es una ilustración esquemática de
una celda de diálisis.
La Figura 3 es un gráfico que muestra un
resultado de ensayo de permeabilidad cutánea de cerdo de fosfato y
clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico.
La Figura 4 es un gráfico que muestra un
resultado del ensayo de permeabilidad de epidermis de cebolla de
fosfato y clorhidrato de ácido
5-aminolevulínico.
\vskip1.000000\baselineskip
En la fórmula que se ha descrito anteriormente
(I), el alquilo que tiene de 1 a 18 átomos de carbono representado
por R^{1} puede ser lineal, ramificado o cíclico. El alquilo
lineal o ramificado incluye, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo,
terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo,
terc-pentilo, 2-metilbutilo,
n-hexilo, isohexilo, 3-metilpentilo,
etilbutilo, n-heptilo, 2-metilhexilo,
n-octilo, isooctilo, terc-octilo,
2-etilhexilo, 3-metilheptilo,
n-nonilo, isononilo, 1-metiloctilo,
etilheptilo, n-decilo,
1-metilnonilo, n-undecilo,
1,1-dimetilnonilo, n-dodecilo,
n-tridecilo, n-tetradecilo,
n-pentadecilo, n-hexadecilo,
n-heptadecilo y n-octadecilo. El alquilo cíclico o el
alquilo que contiene un grupo cíclico incluye, por ejemplo,
ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo,
ciclooctilo, 2-ciclopropiletilo,
2-ciclobutiletilo,
2-ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo,
2-ciclohexiletilo, cicloheptilmetilo,
2-ciclooctiletilo,
3-metilciclohexilo,
4-metilciclohexilo,
4-etilciclohexilo,
2-metilciclooctilo,
3-(3-metilciclohexil)propilo,
2-(4-metilciclohexil)etilo,
2-(4-etilciclohexil)etilo y
2-(2-metilciclooctil)etilo. Como el alquilo
que se ha descrito anteriormente que tiene de 1 a 18 átomos de
carbono, se prefiere un alquilo que tenga de 1 a 16 átomos de
carbono y se prefiere particularmente metilo, etilo,
n-butilo, n-hexadecilo o
2-etilohexilo.
El alquenilo que tiene de 2 a 18 átomos de
carbono incluye, por ejemplo, vinilo, alilo, isopropenilo,
2-butenilo, 2-metilalilo,
1,1-dimetilalilo,
3-metil-2-butenilo,
3-metil-3-butenilo,
4-pentenilo, hexenilo, octenilo, nonenilo, decenilo,
ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo,
cicloheptenilo, ciclooctenilo, 4-metilciclohexenilo,
4-etil-ciclohexenilo,
2-ciclopenteniletilo, ciclohexenilmetilo,
cicloheptenilmetilo, 2-ciclobuteniletilo,
2-cicloocteniletilo,
3-(4-metilciclohexenil)propilo,
5-(4-etilciclohexenil)pentilo, oleilo,
vacenilo, linoleilo y linolenilo, y se prefiere oleilo.
El aralquilo que tiene de 7 a 26 átomos de
carbono es preferiblemente uno que está constituido por alquilo que
tiene de 1 a 6 átomos de carbono y arilo que tiene de 6 a 20 átomos
de carbono. El alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono incluye,
por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo y ciclohexilo, y
el arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono incluye, por ejemplo,
pentilo y naftilo. Entre los aralquilos que tienen de 7 a 26 átomos
de carbono se prefieren bencilo o fenetilo y se prefiere
particularmente el bencilo. El arilo en el aralquilo puede estar
sustituido con 1 a 3 sustituyentes, tales como el alquilo que se ha
descrito anteriormente que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi
que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, tales como metoxi, etoxi,
n-propoxi, n-butoxi, isobutoxi y
terc-butoxi; hidroxilo; amino, nitro, ciano; halógeno, tal
como fluoro, cloro, bromo y yodo; y carboxilo.
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención puede ser
un sólido o una solución. El sólido indica un cristal, pero puede
ser un hidrato. La solución indica un estado en el que la sal está
disuelta o dispersada en un disolvente que incluye agua y su pH se
puede ajustar con un agente de ajuste del pH o similares. Además, el
disolvente que incluye agua se puede usar mezclando dos de los
mismos. El agente de ajuste del pH incluye, por ejemplo, tampones
que usan ácido fosfórico, ácido bórico, ácido ftálico, ácido
cítrico, ácido succínico, tris, ácido acético, ácido láctico, ácido
tartárico, ácido ftálico, ácido maleico y sales de los mismos o
tampones de Good.
Una solución acuosa es preferible como la sal de
fosfato del ácido 5-aminolevulínico en la forma de
solución. La concentración de la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en la solución acuosa es
preferiblemente del 0,01 ppm en peso al 10% en peso, más
preferiblemente de 0,1 ppm en peso al 5% en peso y aún más
preferiblemente de 1 ppm en peso al 1% en peso. Además, el pH de
esta solución acuosa es preferiblemente de 3 a 7, más
preferiblemente de 3,5 a 7 y aún más preferiblemente de 4 a 7.
Además, en esta solución acuosa puede estar contenida una sal
diferente de la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención y en ese
caso, la concentración del ión de cloruro es preferiblemente del 50%
en moles o menos, más preferiblemente del 10% en moles o menos y aún
más preferiblemente del 3% en moles o menos. En este contexto, la
expresión "no contiene ión de cloruro" significa que la
concentración de ión de cloruro es sustancialmente del 0% en moles,
concretamente es preferible que la misma sea igual o inferior al
límite de detección cuando se mide, por ejemplo, mediante
cromatografía iónica (0,1 ppm).
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención se puede
producir eluyendo ácido 5-aminolevulínico adsorbido
sobre una resina de intercambio catiónico con una solución acuosa
que contiene iones y mezclando el eluato con ácido fosfórico.
Además, la sal del fosfato del ácido
5-aminolevulínico se puede obtener como un sólido,
cristalizando el mismo mediante la adición de un mal disolvente al
líquido mixto. El ácido 5-aminolevulínico a adsorber
sobre una resina de intercambio catiónico no está limitado
particularmente y su pureza y similares tampoco están limitados. Es
decir, los que se producen de acuerdo con los métodos descritos en
los documentos
JP-A-48-92328,
JP-A-62-111954,
JP-A-2-76841,
JP-A-6-172281,
JP-A-7-188133 y
similares, y el documento
JP-A-11-42083, las
soluciones de reacción química y los líquidos de fermentación antes
de la purificación de los mismos, artículos comercializados también
se pueden usar. En este contexto se usa preferiblemente el
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico.
La resina de intercambio catiónico puede ser una
resina de intercambio catiónico fuertemente ácida o una resina de
intercambio catiónico débilmente ácida. Además también se puede usar
de forma adecuada una resina de quelato. Entre las mismas es
preferible una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida.
Como el tipo de la resina de intercambio catiónico fuertemente ácida
se prefieren aquellas en las que los grupos sulfonato están unidos a
resinas del sistema de poliestireno.
La adsorción del ácido
5-aminolevulínico por la resina de intercambio
catiónico se puede realizar pasando una solución de ácido
5-aminolevulínico preparada disolviendo en un
disolvente apropiado a través de la resina de intercambio catiónico.
Tal disolvente no está limitado particularmente, siempre que se
pueda disolver en el mismo ácido 5-aminolevulínico y
los ejemplos incluyen agua; dimetilsulfóxido; alcoholes tales como
metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol e isobutanol; amidas
tales como N,N-dimetilformamida y
N,N-dimetilacetamida; y piridinas; y agua,
dimetilsulfóxido, metanol o etanol es preferible y agua, metanol o
etanol es particularmente preferible. Además se pueden usar dos o
más disolventes mezclando los mismos. Además, cuando se usa una
solución de reacción química o un líquido de fermentación antes de
la purificación se puede realizar la retirada del disolvente de
reacción o dilución con un disolvente apropiado. En este contexto,
el pH del disolvente que se ha descrito anteriormente y la solución
de reacción química o líquido de fermentación antes de la
purificación se puede ajustar usando el agente de ajuste del pH que
se ha descrito anteriormente.
Aunque la solución acuosa que contiene iones a
usar en la elución no está particularmente limitada, se prefieren
aquellas en las que están disueltos en agua ácidos fosfóricos, ácido
nítrico, ácidos sulfónicos, hidróxidos o carbonatos de metales
alcalinos o metales alcalinotérreos, amonio, una amina, un compuesto
que contiene un grupo amino, aquellas en las que está disuelto en
agua hidróxido de litio, hidróxido sódico, hidróxido de magnesio,
hidróxido de potasio, hidróxido cálcico, hidróxido de cesio,
hidróxido de bario, carbonato de amonio, hidrogenocarbonato de
amonio, carbonato sódico, bicarbonato sódico, carbonato potásico,
carbonato sódico-potásico, bicarbonato potásico,
amonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina,
dietilamina o trietilamina son más preferibles y aquellas en las que
está disuelto amonio en agua son particularmente preferibles. Estas
soluciones acuosas se pueden usar en combinación de dos o más. La
concentración del amonio acuoso es preferiblemente de 0,01 a 10 N,
más preferiblemente de 0,1 a 3 N.
Como los ácidos fosfóricos a mezclar con el
eluato de ácido 5-aminolevulínico se puede usar un
compuesto representado por la fórmula (III)
en la que R^{1} y n son como se
han definido anteriormente. Los ácidos fosfóricos incluyen, por
ejemplo, ácido fosfórico; monoésteres de ácido fosfórico, tales como
metil fosfato, etil fosfato, n-butil fosfato,
2-etilhexil fosfato, hexadecil fosfato, bencil
fosfato, oleil fosfato y fenil fosfato; y diésteres de ácido
fosfórico tales como dimetil fosfato, dietil fosfato,
di-n-butil fosfato,
di(2-etilhexil) fosfato, dihexadecil fosfato,
dibencil fosfato, dioleil fosfato y difenil fosfato y metil fosfato,
etil fosfato, oleil fosfato, fenil fosfato, dimetil fosfato, dietil
fosfato, di-n-butil fosfato,
di(2-etilhexil) fosfato, dihexadecil fosfato,
dibencil fosfato, dioleil fosfato o difenil fosfato es
particularmente preferible. Además también se puede usar de forma
adecuada ácido hipofosfórico o ácido
fosfórico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos fosfóricos pueden ser hidratos o
sales y se pueden usar de forma adecuada los que están disueltos o
dispersos en un disolvente apropiado. La cantidad de mezcla de los
ácidos fosfóricos es preferiblemente de 1 a 5000 veces la cantidad
molar, más preferiblemente de 1 a 500 veces la cantidad molar y aún
más preferiblemente de 1 a 50 veces la cantidad molar, basándose en
la cantidad de elución de ácido 5-aminolevulínico
deducida de la cantidad del ácido 5-aminolevulínico
adsorbido. En este contexto, la cantidad de elución de ácido
5-aminolevulínico deducida de la cantidad del ácido
5-aminolevulínico adsorbido varía dependiendo de los
tipos de la resina de intercambio catiónico y eluyente y la cantidad
de paso del eluyente, pero generalmente es del 90 al 100% basándose
en la cantidad de ácido 5-aminolevulínico
adsorbido.
Los ejemplos del disolvente incluyen agua;
dimetilsulfóxido; alcoholes tales como metanol, etanol, propanol,
isopropanol, n-butanol e isobutanol; amidas tales
como N,N-dimetilformamida y
N,N-dimetilacetamida; y piridinas; y agua,
dimetilsulfóxido, metanol o etanol es preferible y agua, metanol o
etanol es particularmente preferible. Además se pueden usar dos o
más disolventes mezclando los mismos.
El mal disolvente no está particularmente
limitado, siempre que un sólido precipite en el mismo y los ejemplos
de tal disolvente incluyen alcoholes, tales como metanol, etanol,
propanol, isopropanol, n-butanol e isobutanol;
éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, dioxano,
tetrahidrofurano y dimetoxietano; ésteres tales como metil acetato,
etil acetato, propil acetato, isopropil acetato y
\gamma-butirolactona; cetonas tales como acetona y
metil etil cetona; y nitrilos tales como acetonitrilo y
benzonitrilo; y se prefiere metil acetato, etil acetato,
\gamma-butirolactona, acetona o acetonitrilo y se
prefiere particularmente metil acetato,
\gamma-butirolactona, acetona o acetonitrilo.
Además se pueden usar dos o más disolventes mezclando los
mismos.
La temperatura para la elución mediante una
solución acuosa que contiene iones y la mezcla del eluato con ácido
fosfórico, ácido nítrico o ácido sulfónico es preferiblemente de -20
a 60ºC, más preferiblemente de -10 a 30ºC, en condiciones tales que
el eluato y el ácido fosfórico, ácido nítrico o ácido sulfónico no
solidifiquen.
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención se puede
producir a partir de un ácido 5-aminolevulínico en
el que el grupo amino está protegido con un grupo protector
hidrolizable, tal como aquel en el que el grupo amino está protegido
con un grupo acilo o en el que un grupo protector capaz de formar un
esqueleto molecular de tipo
1,3-dioxo-1,3-dihidroisoindol-2-ilo
está unido al grupo amino. Además, la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención también
se puede preparar mediante un método de producción diferente del de
la presente invención, es decir, un método en el que se hidroliza
2-fenil-4-(\beta-alcoxicarbonilpropionil)oxazolin-5-ona
usando ácidos fosfóricos deseados o un método en el que se permite
que una sal diferente de las de ácidos fosfóricos, tal como
clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico, se ponga en
contacto con ácidos fosfóricos deseados en un disolvente. Se pueden
usar compuestos de la fórmula que se ha descrito anteriormente (III)
como los ácidos fosfóricos y se pueden usar los que se han descrito
anteriormente como los disolventes de reacción.
Como se muestra más adelante en los Ejemplos, la
sal de fosfato del ácido 5-aminolevulínico no genera
olores desagradables en comparación con el clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico y particularmente en el caso del
fosfato de ácido 5-aminolevulínico tiene una débil
estimulación para la piel y la lengua y no se encuentra
mutagenicidad en el mismo. Además, es excelente en su permeabilidad
a través de la piel animal y la epidermis vegetal. Por consiguiente,
de forma similar al caso del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico, el fosfato del ácido
5-aminolevulínico es útil como un agente para
tratamiento fotodinámico o diagnóstico fotodinámico en animales
incluyendo al ser humano. Como el agente para el tratamiento o
diagnóstico fotodinámico se pueden ilustrar agentes para el
tratamiento o diagnóstico fotodinámico de cáncer, enfermedad
infecciosa, reumatismo, trombo, espinillas y similares.
Al usar la sal del ácido
5-aminolevulínico como un agente para el tratamiento
o diagnóstico fotodinámico, se puede usar en condiciones conocidas
convencionalmente y más específicamente, se puede usar basándose en
las prescripciones y métodos descritos en los documentos
JP-T-2001-501970
(WO98/30242),
JP-T-4-500770
(WO91/01727),
JP-T-2005-501050
(WO2003/011265),
JP-T-2004-506005
(WO2002/013788),
JP-T-2001-518498
(WO99/17764) y
JP-T-8-507755
(WO94/17797).
Específicamente, una enfermedad se puede tratar
fotodinámicamente administrando una cantidad eficaz de la sal de
fosfato del ácido 5-aminolevulínico a un animal
(incluyendo el ser humano) y realizando la irradiación con luz.
Además, una enfermedad se puede diagnosticar fotodinámicamente
detectando fluorescencia de la parte afectada.
La composición para el tratamiento fotodinámico
o el diagnóstico fotodinámico, que contiene la sal de fosfato del
ácido 5-aminolevulínico, se puede preparar en formas
de dosificación tales como preparaciones externas para la piel,
inyecciones, preparaciones orales y supositorios. Al preparar las
mismas en estas formas de dosificación se pueden usar vehículos
farmacéuticamente aceptables. Como los vehículos se usan, por
ejemplo, agua, aglutinantes, disgregantes, agentes solubilizantes,
lubricantes, agentes voluminizantes y cargas.
La dosis varía dependiendo, por ejemplo, de la
edad, peso corporal, síntoma, efecto terapéutico, método de
administración y periodo de tiempo de tratamiento, pero en general,
se administra dentro del intervalo de 10 mg a 10 g, más
preferiblemente de 100 mg a 1 g, una vez por kg de peso corporal por
adulto, una vez o varias veces al día.
Además, cuando se usa la sal del fosfato del
ácido 5-aminolevulínico, por ejemplo, en
aplicaciones de plantas, puede contener, por ejemplo, un componente
de fertilizador usado generalmente. Como el componente de
fertilizador se pueden ilustrar las sustancias descritas en el
documento
JP-A-4-338305
(Patente de Estados Unidos 5.298.482, documento
EP-A-0514776).
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico también es útil como un activador
de plantas. Al usar ésta como un activador de plantas, se puede usar
en condiciones conocidas convencionalmente y, específicamente, se
puede usar para una planta mediante el método descrito en el
documento
JP-A-4-338305
(Patente de Estados Unidos 5.298.482, documento
EP-A-0514776).
Más específicamente, un agente de tratamiento de
follaje y un agente de tratamiento de suelo se puede ilustrar como
el activador de plantas. Además, este agente se puede absorber antes
de plantar una planta o un esqueje o añadir al agua en el momento
del cultivo hidropónico.
Cuando se usa la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico como un agente de tratamiento de
follaje, es preferible que contenga la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en el mismo a una concentración de
1 a 1.000 ppm, particularmente de 10 a 500 ppm y usar el mismo en
una cantidad de 10 a 100 litros, particularmente de 50 a 300 litros
por 10 áreas.
Cuando la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico se usa como un agente de
tratamiento de suelo, es preferible usar la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en una cantidad de 1 a 1.000 g,
particularmente de 10 a 50 g por 10 áreas.
Cuando se usa la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico como un agente de tratamiento de
follaje aplicando la misma antes de la plantación, es preferible que
contenga la sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico a una concentración de 1 a 1.000
ppm, particularmente de 10 a 500 ppm y usar esto en una cantidad de
10 a 100 litros, particularmente de 50 a 300 litros por 10 áreas. En
este contexto, también es preferible usar prácticamente la misma
cantidad en el momento de cultivo hidropónico.
Como la planta a tratar se pueden ilustrar
cereales, verduras, árboles frutales, flores y plantas ornamentales,
árboles, semillas, patatas, cebolletas, pastos.
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La presente invención se descrie a continuación
con más detalle basándose en los Ejemplos, aunque la presente
invención no se limita a los mismos.
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Una columna se cargó con 180 ml de una resina de
intercambio iónico fuertemente ácida (AMBERLITE IR120B Na, fabricada
por Japan Organo). La resina de intercambio iónico se usó después de
convertir la misma desde el tipo de ión de sodio al tipo de ión de
hidrógeno mediante el tratamiento con ácido clorhídrico. A
continuación se disolvieron 20,00 g (119 mmol) de clorhidrato del
ácido 5-aminolevulínico en 1000 ml de agua de
intercambio iónico y se pasaron a través de dicha columna y después
se pasaron 1000 ml de agua de intercambio iónico a través de la
misma. A continuación se pasó lentamente amonio acuoso 1 N a través
de la misma para recoger 346 ml de eluato amarillo. El eluato
recogido de este modo se añadió a 16 ml de ácido fosfórico al 85%
(H_{3}PO_{4} 238 mmol) y se concentró usando un evaporador. Al
líquido concentrado se añadieron 400 ml de acetona, seguido de
agitación vigorosamente con una agitadora y después se dejó reposar
a 4ºC durante 16 horas. El sólido precipitado de este modo se
recuperó mediante filtración por succión y se lavó con 500 ml de
acetona. El sólido obtenido de este modo se secó con presión
reducida durante 12 horas
para obtener 23,04 g (101 mmol) de la sustancia de interés. Sus datos de propiedad física se muestran a continuación.
para obtener 23,04 g (101 mmol) de la sustancia de interés. Sus datos de propiedad física se muestran a continuación.
Punto de fusión: 108-109ºC
RMN de ^{1}H (D_{2}O, 400 MHz) \delta ppm:
2,67 (t, 2H, CH_{2}), 2,86 (t, 2H, CH_{2}), 4,08 (s, 2H,
CH_{2})
RMN de ^{13}C (D_{2}O, 100 MHz) \delta
ppm: 30 (CH_{2}), 37 (CH_{2}), 50 (CH_{2}), 180 (CO), 207
(COO)
Condiciones de análisis de cromatografía iónica;
columna de separación: lonPac AS 12A fabricada por Nippon Dionex,
eluyente: solución acuosa que contiene Na_{2}CO_{3} y
NaHCO_{3} (Na_{2}CO_{3}: 3,0 mmol/l, NaHCO_{3}: 0,5 mmol/l),
caudal: 1,5 ml/min, cantidad de muestra introducida: 25 \mul,
temperatura de columna: 35ºC, detector: detector de conductividad
eléctrica.
\vskip1.000000\baselineskip
Una columna se cargó con 180 ml de una resina de
intercambio iónico fuertemente ácida (AMBERLITE IR120B Na, fabricado
por Japan Organo). La resina de intercambio iónico se usó después de
convertir la misma desde el tipo de ión de sodio al tipo de ión de
hidrógeno mediante el tratamiento con ácido clorhídrico. A
continuación se disolvieron 20,00 g (119 mmol) de clorhidrato del
ácido 5-aminolevulínico en 1000 ml de agua de
intercambio iónico y se pasaron a través de dicha columna y después
se pasaron 1000 ml de agua de intercambio iónico a través de la
misma. A continuación se pasó lentamente amonio acuoso 1 N a través
de la misma para recoger 321 ml de eluato amarillo. El eluato
recogido de este modo se añadió a 50,00 g (238 mmol) de
di-n-butil fosfato y se concentró
usando un evaporador. Al líquido concentrado se añadieron 400 ml de
acetona, seguido de agitación vigorosamente con una agitadora y
después la mezcla se dejó reposar a -25ºC durante 16 horas. El
sólido precipitado de este modo se recuperó mediante filtración por
succión. El sólido obtenido de este modo se secó con presión
reducida durante 12 horas para obtener 14,67 g (43 mmol) de la
sustancia de interés. Sus datos de propiedad física se muestran a
continuación.
RMN de ^{1}H (D_{2}O, 400 MHz) \delta ppm:
0,75 (6H, CH_{3}), 1,23 (4H, CH_{2}), 1,41 (4H, CH_{2}), 2,46
(2H, CH_{2}), 2,59 (2H, CH_{2}), 3,66 (4H, CH_{2}), 3,80 (2H,
CH_{2})
RMN de ^{13}C (D_{2}O, 100 MHz) \delta
ppm: 14 (CH_{3}), 20 (CH_{2}), 29 (CH_{2}), 34,2 (CH_{2}),
34,3 (CH_{2}), 36 (CH_{2}), 67 (CH_{2}0), 176 (COO), 204
(CO)
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Cinco sujetos olieron directamente una solución
acuosa del fosfato del ácido 5-aminolevulínico
producido en el Ejemplo 1 (un líquido mixto del eluato de la columna
y ácido fosfórico) y su sólido y evaluaron sus olores de acuerdo con
los siguientes criterios. Los resultados se muestran en la Tabla
1.
Criterios de evaluación:
- 0:
- no olido.
- 1:
- olido pero no desagradable.
- 2:
- olor desagradable.
\newpage
Ejemplo Comparativo
1
Los olores se evaluaron del mismo modo que en el
Ejemplo 3, excepto por que se usó una solución acuosa de clorhidrato
del ácido 5-aminolevulínico y su sólido. En este
contexto, la solución acuosa de clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico se preparó usando un sólido de
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico, ácido
clorhídrico y agua de intercambio iónico de tal modo que sus
concentraciones de ácido 5-aminolevulínico y de ión
de cloruro respectivamente adquirieron las mismas concentraciones
molares que las concentraciones del ácido
5-aminolevulínico e ión de fosfato de la solución
acuosa del fosfato del ácido 5-aminolevulínico del
Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los olores se evaluaron del mismo modo que en el
Ejemplo 3, excepto porque se usó una solución acuosa preparada
disolviendo 0,5 g de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en 1 ml de agua. Los resultados se
muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
2
Los olores se evaluaron del mismo modo que en el
Ejemplo 3, excepto por que se usó una solución acuosa preparada
disolviendo 0,5 g de clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico en 1 ml de agua. Los resultados se
muestran en la Tabla 2.
Basándose en las Tablas 1 y 2, los olores no se
encontraron en la solución acuosa de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en comparación con la solución
acuosa del clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico.
Ya que la medida antiolor y la medida de gas anticorrosivo
necesarias para producir una solución acuosa de clorhidrato del
ácido 5-aminolevulínico estaban simplificadas, el
manejo era más cómodo. Además, el sólido de fosfato del ácido
5-aminolevulínico tampoco generó olores en
comparación con el sólido de clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico, de tal forma que los manejos
tales como pesada y dispensación eran más cómodos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon respectivamente soluciones acuosas
de fosfato del ácido 5-aminolevulínico y soluciones
acuosas de clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico
que tenían una concentración de 1 a 1000 mM y se midió su acidez a
25ºC usando un pH metro. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Como es evidente a partir de la Figura 1, en el caso de la misma
concentración, la acidez de la solución acuosa de fosfato del ácido
5-aminolevulínico era menor que la de la solución
acuosa del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los cinco sujetos evaluó el sentido
del gusto del fosfato del ácido 5-aminolevulínico
obtenido en el Ejemplo 1, de acuerdo con los siguientes criterios
poniendo directamente 5 mg de su sólido sobre la lengua. Los
resultados se muestran en la Tabla 3. Criterios de evaluación:
- 0:
- no se siente ninguna estimulación.
- 1:
- existe una estimulación pero débil.
- 2:
- existe una fuerte estimulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
3
El sentido del gusto se evaluó del mismo modo
que en el Ejemplo 6, excepto porque se usaron 5 mg de sólido de
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico. Los
resultados se muestran en la Tabla 3.
Como se muestran en la Tabla 3, no se halló
estimulación fuerte en el fosfato del ácido
5-aminolevulínico en comparación con el clorhidrato
del ácido 5-aminolevulínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo de acuerdo con "Standard
of Mutagenicity Tests Using Microorganisms" (Ministerio de
Trabajo, Notificación Nº 77 1988) (revisión parcial por Ministerio
de Trabajo, Notificación Nº 67, 1997) y "Regarding the Tests
Concerning Novel Chemical Substances and the like" (con fecha de
21 de noviembre del 2003:
Yaku-Shoku-Hatsu Nº 1121002,
2003.11.13 Sei-Kyoku, Nº 2,
Kan-Ho-Ki-Hatsu Nº
031121002). A 0,1 ml de una solución preparada disolviendo 5% (p/v)
de fosfato del ácido 5-aminolevulínico en agua
destilada (Wako Pure Chemical Industries) se añadieron 0,5 ml de
tampón fosfato sódico 0,1 M (pH 7,4) (0,5 ml de mezcla S9 en el caso
del ensayo de activación de metabolismo) y adicionalmente a estos se
añadieron 0,1 ml de cada suspensión de cepa de ensayo (se usaron 5
cepas de Salmonella typhimurium sin histidina TA 100, TA 98,
TA 1535 y TA 1537 y Escherichia coli sin triptófano WP2uvrA
(Japan Bioassay Research Center)), seguido de
pre-incubación a 37ºC durante 20 minutos con
agitación. Después de la finalización del cultivo, 2,0 ml de agua de
agar blando mantenido a 45ºC con antelación se añadieron a esto y se
depositaron sobre un medio de placa de agar mínimo en glucosa. En
este caso se dispusieron dos placas para cada dosificación. Sin
embargo, se dispusieron 3 placas para un control de disolvente
(control negativo). Después de cultivar a 37ºC durante 48 horas se
observó la presencia o ausencia de inhibición de desarrollo de cada
cepa de ensayo bajo un microscopio estereoscópico y se contó el
número de colonias de retromutación aparecidas. En la medición se
midió un área interna de aproximadamente 80 mm de diámetro de una
placa de 86 mm de diámetro (84 mm de diámetro interno) usando un
analizador de colonias automático (CA-11: fabricado
por System Science), y se calculó realizando una corrección de área
y contando la corrección de pérdida usando un ordenador personal.
Sin embargo, ya que la fiabilidad del analizador de colonias
automático está reducida cuando el número de colonias es 1.500 o
más, se midieron manualmente 5 puntos en la placa bajo el
microscopio estereoscópico para realizar la corrección de área del
valor promedio. Se realizó un ensayo de ajuste de dosificación en 7
dosificaciones diluidas a una proporción común de 4, usando una
dosificación de 5.000 \mug/placa como el máximo, que es la máxima
dosificación definida por la directriz. Como resultado,
independientemente de la presencia o ausencia de mezcla S9 no se
observó un aumento del número de colonias de retromutación, en un
factor de dos veces o más en comparación con el control de
disolvente, en cada cepa. No se halló la inhibición del desarrollo
de las cepas por esta sustancia a ensayar. Tampoco se halló la
precipitación de la sustancia a ensayar. Por tanto, este ensayo se
realizó ajustando 5 dosificaciones diluidas a una proporción común
de 2, usando una dosificación de 5.000 \mug/placa como el máximo,
que es la dosificación máxima definida por la directriz. Como
resultado, independientemente de la presencia o ausencia de
actividad metabólica, no se observó aumento en el número de colonias
de retromutación en un factor de 2 veces o más en comparación con el
control de disolvente en cada cepa (Tabla 4), de tal forma que se
confirmó que el fosfato del ácido 5-aminolevulínico
no tiene la capacidad de inducción de mutación.
Este ensayo se realizó de acuerdo con la
Directriz de la OECD Nº 423 "Acute Oral
Toxicity-Acute Toxicity Grading Method" (adoptada
el 17 de diciembre de 2001). Se trataron ratas hembra en ayunas
(especie Sprague-Dawley CD) de 3 animales por grupo
con fosfato del ácido 5-aminolevulínico a una dosis
de 300 mg por kg de peso corporal. Además, otras ratas hembra en
ayunas de dos o más grupos se trataron con una dosis de 2000 mg por
kg de peso corporal. Se observaron después de la administración de
forma continua durante 2 semanas. Como resultado no se encontró
muerte en todas las ratas (Tabla 5), no había signos de toxicidad
sistémica, se observó ganancia de peso corporal general en todas las
ratas (Tabla 6) y se estimó que la dosis letal del 50% (DL50) oral
aguda era mayor de 2.500 mg por kg de peso corporal.
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\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo se realizó de acuerdo con la
Directriz de la OECD Nº 404 "Acute Skin Stimulation/Corrosive
Test" (adoptada el 17 de julio de 1992) y las Instrucciones del
Comité de la UE 92/69/EEC B4 Método de Toxicidad Aguda (Estimulación
Cutánea). Usando tres conejos blancos New Zealand (machos) se aplicó
una solución preparada disolviendo 0,5 g de fosfato del ácido
5-aminolevulínico en 0,5 ml de agua destilada (pH
3,1) durante 4 horas a 2,5 cm de área cuadrada de la piel no
lesionada afeitada de cada animal que después se observó durante 1,
24, 48 y 72 horas. Como resultado se observaron puntos muy
ligeramente rojos en el intervalo de 24 horas, pero se convirtieron
en normales cuando se observaron después de 24 horas (Tablas 7 y 8).
Además, cuando una solución preparada disolviendo 0,5 g de fosfato
del ácido 5-aminolevulínico en 0,5 ml de agua
destilada (pH 3,1) se aplicó durante 3 minutos o 1 hora a 2,5 cm de
área cuadrada de la piel no lesionada afeitada de un conejo blanco
New Zealand (macho) y el animal se observó durante 1, 24, 48 y 72
horas no se observó tampoco estimulación cutánea (Tablas 7 y 8).
Basándose en esto, ya que el valor de P.I.I (índice de irritación
cutánea primaria) fue 0,5, se confirmó que está sal está fuera de la
clasificación de la clasificación de estimulación de la
recombinación actual de las Naciones Unidas de GHS y no se incluye
en una sustancia estimulante. En este contexto, una solución
preparada como un control disolviendo 0,5 g de clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico en 0,5 ml de agua destilada se
consideró corrosiva por la Directriz de la OECD debido a que su pH
era menor de 2,0 o inferior, de tal forma que el ensayo no se
realizó.
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\vskip1.000000\baselineskip
Usando una celda de diálisis (área efectiva 1,13
m^{2}, Figura 2), se agitaron 17 ml de solución salina fisiológica
de pH 6,8 y se mantuvieron a 37ºC en su capa aceptora. Se puso una
capa total de piel de cerdo pretratada (epidermis + dermis) sobre un
filtro de membrana y se dispuso sobre la celda de diálisis. A esta
capa donadora se añadieron 0,5 ml de solución acuosa de fosfato del
ácido 5-aminolevulínico 1 mM. Después se recogieron
0,2 ml de la solución en la capa aceptora en un periodo de tiempo
predeterminado, la capa se complementó con una nueva solución salina
fisiológica. Después se mezclaron 0,05 ml de la muestra recogida o
líquido patrón con 3,5 ml de un líquido A (1 litro de una solución
mixta de acetilacetona/etanol/agua = 15/10/75 (v/v/v) que contenía 4
g de cloruro sódico) y 0,45 ml de un líquido B (una solución
preparada diluyendo 85 ml de formalina con 1 litro con agua) y la
mezcla se trató térmicamente durante 30 minutos y después, tras 30
minutos, se enfrió con agua. Después de esto se midió la
concentración del ácido 5-aminolevulínico mediante
HPLC (esto se realizó en condiciones de análisis de caudal de 1,0
ml/minuto y temperatura de 25ºC, usando un detector de fluorescencia
de 473 nm en longitud de onda de excitación y 363 nm en longitud de
onda de fluorescencia, usando una solución acuosa de metanol/ácido
acético al 2,5% = solución de 40/60 (v/v) como la solución de
elución y usando Wakosil-ll 5C18HG, 4,6 mm x 150 mm,
como la columna) y cada concentración se calculó a partir del área
máxima del líquido patrón.
A continuación se realizó el mismo ensayo usando
epidermis de cebolla en lugar de la piel de cerdo y cambiando la
concentración de la solución acuosa de fosfato del ácido
5-aminolevulínico a 0,1 mM. Los resultados se
muestran en las Figuras 3 y 4. Como se puede comprender a partir de
las Figuras 3 y 4, el clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico y el fosfato del ácido
5-aminolevulínico mostraron una permeabilidad
similar en la piel de cerdo y en la epidermis de cebolla.
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Ejemplos Comparativo
4
Se midió la permeabilidad del mismo modo que en
el Ejemplo 10, excepto porque se usó clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico en lugar del fosfato del ácido
5-aminolevulínico.
Se confirmó por esto que, aunque el clorhidrato
del ácido 5-aminolevulínico causa una estimulación
cuando se aplica directamente sobre la piel como se muestra en el
Ejemplo 9, el fosfato del ácido 5-aminolevulínico no
causa la estimulación cutánea y tienen la misma permeabilidad en la
piel, mostrando de este modo que el fosfato del ácido
5-aminolevulínico es una sal más útil que el
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico en ciertos
tratamientos médicos (tratamiento fotodinámico y diagnóstico
fotodinámico) y plantas.
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En 10 ml de agua de intercambio iónico se
disolvieron 0,5 g de fosfato del ácido
5-aminolevulínico y 0,5 g de nitrato de plata, se
dejó que la mezcla reposara durante 5 minutos y se observó el estado
del líquido. No se observó generación del precipitado. En este
contexto se disolvieron 0,5 g del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico y 0,5 g de nitrato de plata en 10
ml de agua de intercambio iónico y se dejaron reposar durante 5
minutos y se observó el estado del líquido. Se observó generación
del precipitado.
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El fosfato del ácido
5-aminolevulínico obtenido en el Ejemplo 1 se
disolvió en agua de intercambio iónico hasta la concentración
predeterminada mostrada en la siguiente tabla. Se añadió un
dispersante ("Approach Bl" fabricado por Maruwa Biochemical) al
líquido a una concentración de 0,1% en peso. El pH se ajustó usando
ácido fosfórico.
Se preparó una solución acuosa de clorhidrato
del ácido 5-aminolevulínico del mismo modo, excepto
porque el fosfato del ácido 5-aminolevulínico que se
ha descrito anteriormente se cambió a clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico y el ácido fosfórico para el
ajuste del pH se cambió a ácido clorhídrico.
El líquido preparado de este modo se pulverizó
con una proporción de 2 litros por rama sobre tres ramas principales
en las que había frutas jóvenes de una variedad de manzana
"Fuji" pero que todavía no habían cambiado el color a rojo (15
de septiembre). Aproximadamente 2 meses más tarde (6 de noviembre)
se recolectaron las manzanas y se examinó su grado de coloración. Se
usó un colorímetro CR-200 fabricado por MINOLTA
CAMERA para la medición del color. Los resultados se muestran en la
Tabla 9.
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En los valores L, a, b en la Tabla 9, L
representa brillo, a representa rojo y b representa amarillo. Por
consiguiente, un valor mayor de a significa un rojo más denso. La
coloración de rojo fue más densa en el caso de fosfato del ácido
5-aminolevulínico que en el caso de clorhidrato del
ácido 5-aminolevulínico.
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Un total de 12 macetas, en las que se cargaron
600 g de tierra de cenizas volcánicas en una maceta de porcelana de
12 cm de diámetro interno y una planta de una comelinácea
Commelina communis crecida hasta una altura de 15 cm se
plantó en la maceta, se prepararon y se pusieron bajo un entorno de
temperatura constante de 20ºC y se realizó el tratamiento de
aplicación foliar una vez por día usando los siguientes líquidos de
aplicación. Se observaron los estados de las hojas 21 días después
de esto. Los resultados se resumen en la Tabla 10.
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Basándose en los resultados de la Tabla 10 se
observó un efecto de activación de planta similar o mayor al del
clorhidrato del ácido 5-aminolevulínico en el
fosfato del ácido 5-aminolevulínico.
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Se sumergieron semillas de arroz
(Akinishiki) en solución acuosa de Benlate (fabricado por
Sumika Takeda Engei) (200 veces) en durante un día entero y la noche
y después se incubaron a 30ºC en condición de oscuridad para
realizar la aceleración de la germinación. Se seleccionaron semillas
de estadio uniforme de pecho carinado, 10 semillas se insertaron
usando un par de pinzas en un surco en una lámina de polietileno
expandido, que se realizó usando un cortador y esta lámina se dejó
flotando sobre una placa de Petri alta llena con 150 ml de fosfato
del ácido 5-aminolevulínico de las concentraciones
respectivas mostradas en la Tabla 11 y se incubaron a 25ºC durante
24 horas con 5.000 lux de irradiación con luz continua. El número de
repeticiones se ajustó en 3 repeticiones para cada concentración. El
examen se realizó tres días después de esto y se midieron las
longitudes de la primera vaina foliar y raíz seminal en cada lote
para calcular sus proporciones con respecto a las del lote no
tratado y para calcular los valores promedio de los mismos. Los
resultados se muestran en la Tabla 11.
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El fosfato del ácido
5-aminolevulínico mostró un efecto de aceleración de
crecimiento de planta similar o mayor al del clorhidrato del ácido
5-aminolevulínico.
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Una maceta de porcelana de 12 cm de diámetro
interno que no tenía orifico de drenaje se llenó con 600 g de tierra
de altura y se sembraron de 7 a 8 semillas de semillas de algodón
(variedad; M-5 Acala), se cubrieron con 1 cm de
espesor de la tierra y se dejaron crecer en un invernadero. Después
de esto se realizó el tratamiento general y en el momento del
desarrollo del foliolo se preparó un agente de mejora de la
salinidad que contenía cada uno de los compuestos a ensayar con las
respectivas concentraciones mostradas en la Tabla 12 y el 0,05%
(v/v) de un dispersante (Neoesterin: fabricado por Kumiai Chemical
Industry) y se aplicó al follaje a un volumen de aplicación de 100
litros por 10 áreas. Cada uno de los compuestos a ensayar se ajustó
a la concentración mostrada en la Tabla 12. Cuatro días después de
esto se disolvió cloruro sódico en una cantidad que se corresponde
del 0 al 1,5% en peso por peso de tierra como se muestra en la Tabla
12 en 30 ml de agua y se añadió gota a gota a la tierra. Continuando
el cultivo general se realizó el examen 23 días después de esto. El
examen se realizó mediante observación a simple vista y los
resultados del daño por sal se evaluaron basándose en las siguientes
6 etapas. Los resultados se muestran en la Tabla 12.
Etapas de evaluación:
- 0:
- no se observa absolutamente ningún daño por sal.
- 1:
- se observa un daño por sal muy débil.
- 2:
- se observa un daño por sal débil.
- 3:
- se observa un daño por sal obvio.
- 4:
- se observa un fuerte daño por sal.
- 5:
- el cuerpo vegetal se marchita debido al daño por sal.
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Como se muestra en la Tabla 12, el fosfato del
ácido 5-aminolevulínico mostró un efecto de mejora
de la tolerancia a la salinidad similar o mayor al del clorhidrato
del ácido 5-aminolevulínico.
Cuando la concentración de ión de cloruro en las
soluciones acuosas de fosfato del ácido
5-aminolevulínico usadas en los ejemplos que se han
descrito anteriormente se midió mediante cromatografía iónica en las
siguientes condiciones, era igual o inferior al límite de detección
(0,1 ppm) en cada muestra.
Las condiciones de medición son las siguientes;
A: columna de separación (lonPacAS12A fabricada por Japan Dionex),
B: precolumna (lonPac AG12A fabricada por Japan Dionex), C: solución
de elución (una solución acuosa que contenía Na_{2}CO_{3}: 3,0
mmol/l y NaHCO_{3}: 0,5 mmol/l), D: caudal (1,5 ml/min), E:
supresor (ASRS (modo de reciclaje, valor actual 50 mA)), F: cantidad
de muestra introducida (25 \mul), G: temperatura de horno de
temperatura constante (35ºC) y H: detector (detector de
conductividad eléctrica).
\vskip1.000000\baselineskip
La sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de la presente invención es una
sustancia que es sencilla de manejar debido a que no desprende un
olor desagradable o un olor estimulante. Además, esto muestra una
naturaleza estimulante baja sobre la piel y la lengua y su
permeabilidad a través de la piel y similares también es excelente,
de tal forma que una composición que comprenda esto es útil como un
agente para tratamiento o diagnóstico fotodinámico. Además, esto
tiene un alto punto de descomposición y una alta resistencia térmica
en comparación con su clorhidrato. De acuerdo con el método de
producción de la presente invención, una sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico se puede producir de forma cómoda
y eficaz. Además, ya que su concentración de ión de cloruro es baja
cuando se prepara en una solución acuosa, el daño por cloro
difícilmente tiene lugar al administrar la misma a plantas.
Claims (9)
1. Una sal de fosfato del ácido
5-aminolevulínico de fórmula (I):
en la que R^{1} individualmente
es cada uno H, alquilo C_{1-18}, alquenilo
C_{2-18}, aralquilo C_{7-26} o
fenilo; y n es un número entero de
0-2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La sal de la reivindicación 1, en la que
R^{1} es metilo, etilo, n-butilo, hexadecilo,
2-etilhexilo, oleilo, bencilo o fenilo.
3. La sal de la reivindicación 1 ó 2, que está
en forma de una solución acuosa.
4. La sal de cualquiera de las reivindicaciones
1-3, que está en forma de un sólido.
5. Un proceso para producir la sal de fosfato
del ácido 5-aminolevulínico de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, que comprende
(i) eluir ácido
5-aminolevulínico adsorbido sobre una resina de
intercambio catiónico y
(ii) mezclar el eluato con un ácido fosfórico de
la fórmula
en la que R^{1} individualmente
es cada uno H, alquilo C_{1-18}, alquenilo
C_{2-18}, aralquilo C_{7-26} o
fenilo; y n es un número entero de
0-2.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El proceso de la reivindicación 5, en el que
el ácido 5-aminolevulínico se eluye en la etapa (i)
con amonio acuoso.
7. Composición que comprende la sal del ácido
5-aminolevulínico de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4.
8. Uso de la sal del ácido
5-aminolevulínico de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4 para la fabricación de un
agente médico para tratamiento fotodinámico o diagnóstico
fotodinámico.
9. Uso de la sal del ácido
5-aminolevulínico de cualquiera de las
reivindicaciones 1-4 como un activador de
plantas.
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