BR102013010176A2 - Otimização de processo de obtenção de acil-homosserina lactonas e desenvolvimento de produto regulador de crescimento para cana-de-açúcar - Google Patents

Abstract

Otimização de processo de obtenção de acil-homosserina lactonas e desenvolvimento de produto regulador de crescimento para cana-de-açúcar. A presente invenção se enquadra na setor agroquímico, referindo-se ao desenvolvimento de: 1. Metodologia de caracterização de acil-homosserina lactonas em tecidos de cana-de-açúcar; 2. Aperfeiçoamento na metodologia de produção sintética de acil-homosserina lactonas de interesse; 3. Uso de um produto formulado contendo acil-homosserina lactonas como estimulador do enraizamento, brotação e crescimento da cana-de-açúcar, ou seja, um produto regulador de meristemas/gemas/toletes. O produto formulado foi capaz de acelerar expressivamente a formação do sistema radicular a partir de gemas (meristemas) de cana-de-açúcar, bem como promover um aumento na velocidade de formação de brotos. Estes resultados apresentam grande impacto na cultura da cana-de-açúcar com fatores de economicidade relevantes

Description

OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE-AÇÚCAR

Introdução A presente invenção se enquadra no setor agroquímico, referindo-se à otimização do processo de obtenção de substâncias químicas da classe das acii-homosserina lactonas e seu uso em um produto formulado capaz de promover o crescimento/enraizamento da cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L. Poaceae). O plantio da cana-de-açúcar para fins comerciais é realizado em campo a partir de “gemas” constituídas por meristemas presentes em secções de colmos adultos, conhecidos como toletes. No plantio tradicional, grandes secções de plantas adultas são lançadas ao solo em profundidade adequada, e cortadas por sua vez in situ, gerando pequenos toletes que darão origem às touceiras adultas. Modernamente, verifica-se uma tendência ao tratamento prévio dos toletes, que assumem proporções reduzidas se comparado aos tratamentos convencionais. Esses toletes recebem substâncias químicas que visam, por exemplo, manter sua sanidade vegetal pelo uso de produtos antifúngicos e antibacterianos, selantes de superfície, nutrientes, bem como substâncias químicas (reguladores vegetais) capazes de estimular e acelerar o crescimento dos meristemas. Além disso, existe jainda a possibilidade do seccionamento de meristemas para preparação de gemas de reduzido tamanho, facilitando o plantio. Este expediente também pode lançar uso de produtos agroquímicos capazes de melhorar o perfil de brotação dos meristemas bem como sua sanidade vegetal.

Haja vista a grande demanda mundial por produtos oriundos da cana-de-açúcar, tais como açúcar, etanol e biomassa, bem como os inúmeros empregos, renda e desenvolvimento oriundos de sua cadeia produtiva, verifica-se—que—©—desenvolvimento—de—novos—produtos—visandxx-a-^aceleração^dci enraizamento ou crescimento da cana-de-açúcar pode apresentar impacto relevante e positivo para seu cultivo.

Desta forma, o objetivo da presente invenção é proteger um produto baseado em uma nova classe de substâncias químicas capazes de acelerar o desenvolvimento radicular e aéreo da cana-de-açúcar, com base em formulações aplicadas ao material vegetal utilizado em plantio ou já plantado. Trata-se de um produto baseado em princípio ativo identificado nos próprios tecidos de cana-de-açúcar, como mostrado na presente invenção.

Estado da Técnica Com a elevação dos preços dos combustíveis fósseis e o aumento do consumo mundial de açúcar, houve um grande incremento e estímulo à produção de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) nos últimos anos. Igualmente, as pesquisas e desenvolvimentos tecnológicos afetos à área cresceram de forma exponencial, seja ao nível do cultivo quanto no processamento industrial dos produtos obtidos. Pelo fato da cana-de-açúcar ser considerada uma cultura semiperene, o plantio é uma atividade de extrema importância. Falhas cometidas por ocasião do plantio poderão representar anos consecutivos de produtividade comprometida. Com isso, os toletes plantados devem estar sadios e protegidos para reduzir os riscos da incidência de pragas e doenças. Igualmente, o uso de substâncias químicas capazes de estimular e acelerar a brotação dos toletes após o plantio pode ser essencial para garantir a formação de um canavial sadio e produtivo por vários anos (Ferreira et a/., 2008).

Neste sentido, existem esforços com o objetivo de acelerar o crescimento da planta e seu estado nutricional, tanto na fase de plantio/enraizamento/brotação quanto durante seu desenvolvimento normal. Assim, tem sido relatado na literatura o uso de produtos formulados a partir de substâncias químicas capazes de estimular o crescimento de meristemas de toletes de cana-de-açúcar. Este procedimento visa sobretudo (i) modular em termos temporais o enraizamento e a brotação, aumentando o grau de homogeneidade da lavoura; (ii) elevar a porcentagem e quantidade de raízes e brotos viáveis; (iii) reduzir a suscetibilidade dos toletes de plantio ao ataque de microrganismos patogênicos; e (iv) modular o período de brotação e enraizamento quanto à disponibilidade de recursos hídricos naturais. Neste sentido, dentro do estado da técnica, as auxinas e giberelinas são as substâncias químicas mais estudadas e empregadas comercialmente na formulação de produtos utilizados no tratamento de cana-de-açúcar visando o estímulo da brotação de meristemas, representando em termos moleculares o desenvolvimento mais importante do estado da técnica (Verri et ai, 1983; Martins; Castro, 1999; Siqueira, 2010; PI 0413818-0 A 2006; US 6521452B1 1999; ÜS 2010/0210467 A1).

Entretanto, as auxinas representam uma classe de substâncias químicas relativamente tóxicas, devido ao alto grau de aromaticidade de sua estrutura, o que implica inclusive em maiores dificuldades de degradação no ambiente. Por outro lado, as giberelinas possuem estrutura química complexa. Isto encarece o desenvolvimento de produtos estimulantes à brotação, enraizamento e crescimento da cana-de-açúcar. Como o plantio desta espécie em escala comercial não é realizado através de sementes, o tratamento de toletes (gemas/meristemas) assume características peculiares.

Neste aspecto, a presente invenção mostra o uso de uma formulação baseada em moléculas da classe das acil-homosserina lactonas como estimulantes ao enraizamento, brotação de toletes e crescimento de meristemas da; cana-de-açúcar, substâncias notadamente mais simples, economicamente mais baratas e de fácil biodegradação no ambiente se comparadas às moléculas atualmente disponíveis. Outrossim, não foram encontrados relatos na literatura científica ou de propriedade industrial sobre o uso destas substâncias em formulações reguladoras de brotação de meristemas em toletes de cana-de-açúcar.

Durante o desenvolvimento deste trabalho, Dahmen e colaboradores (2013) relataram a aplicação de acil-homosserina lactonas em cultivos de milho (Zea mays L.), trigo (Triticum aestivum L.) e soja (Glycine max L.), com incromentos-de rendimento de colheita, conteúdo de clorofila, germinação de sementes, absorção de nutrientes e interações simbióticas (WO 2013/034621 A1, 14/03/2013). Além da sobreposição temporal dos trabalhos, verificamos que a supramencionada patente não demonstrou a presença de metabólitos da classe de acil-homosserina lactonas nos tecidos dos referidos vegetais, além de serem aplicações em sementes e não em toletes de cana-de-açúcar, (secções de colmos), alvo de peculiaridades intrínsecas exploradas na presente invenção.

Como uma evolução da técnica, mostra-se na presente invenção a presença de /V-3-oxo-octanoil-homosserina lactona em tecidos de cana-de-açúcar, sua concentração aproximada, e a aplicação da substância sintética equivalente na estimulação de tecidos meristemáticos presentes em toletes e não em sementes de cana-de-açúcar. As técnicas específicas de tratamento dos toletes (secções de colmos) aqui descritas diferem em grande extensão dos procedimentos recentemente aplicados em grãos, justificando-se o requerimento de proteção industrial ao produto objeto da presente patente. Descrição das Figuras Para melhor compreensão do objeto da presente invenção foram elaboradas as seguintes figuras.

Figura 1. Cromatograma (CG) e espectro de massas (IE, 70 eV) da N-3-oxo-octanoil-homosserina lactona natural identificada nos tecidos de cana-de-açúcar. O princípio ativo é observado em eluição a 13,51 minutos.

Figura 2. Metodologia sintética otimizada na presente invenção para obtenção de A/-3-oxo-octanoil-homosserina lactonas.

Figura 3. Estrutura química numerada da (S)-N-3-oxo-octanoil-homosserina lactona.

Figura 4. Espectro de RMN de 1H (300,06 MHz) da (S)-N-3-oxo-octanoil-homosserina lactona sintética.

Figura 5. Espectro de RMN de 13C (75,45 MHz) da (S)-/V-3-oxo-octanoil-homosserina lactona sintética.

Figura 6. Avaliação da atividade promotora de crescimento de toletes de cana- presente invenção, em comparação a um controle (padrão 100 %) sem o produto formulado. Os ensaios representam a média de 6 (seis) aferições.

Figura 7. Representações fotográficas de toletes de cana-de-açúcar representativos para o controle (acima, à esquerda), tratamento com produto formulado mediante mergulho (acima, à direita) e tratamento com produto formulado mediante mergulho e irrigações (abaixo). Nota-se claramente um maior crescimento radicalar do tratamento realizado com mergulho e irrigações com o produto formulado se comparado ao controle onde não se utilizou o produto formulado objeto da presente invenção.

Figura 8. Análises por MEV de secções centrais de raízes de cana-de-açúcar ensaiada com produto em diferentes concentrações. Escala de 500 pm.

Figura 9. Análises por MEV de secções centrais de raízes de cana-de-açúcar ensaiada com produto em diferentes concentrações. Escala de 20 pm.

Figura 10. Análises por MEV de radículas de cana-de-açúcar ensaiada com produto em diferentes concentrações. Escala de 50 pm.

Figura 11. Análises por MEV de radículas de cana-de-açúcar ensaiada com produto em diferentes concentrações. Escala de 50 pm.

Descrição Detalhada do Invento As plantas são seres vivos complexos que utilizam de intrincados mecanismos de sobrevivência, utilizando a luz solar, a água e os recursos naturais do solo para crescerem e se desenvolverem. Entretanto, o avanço do conhecimento sobre biologia vegetal mostrou qge estes organismos lançam mão de mecanismos de sobrevivência ainda mais elaborados. Neste aspecto, sabe-se hoje que no interior dos tecidos das plantas desenvolvem-se diversas espécies de microrganismos como bactérias, vírus e fungos, estabelecendo com seu hospedeiro uma relação ecológica complexa.

Na maior parte das vezes, a presença de bactérias ou fungos nos tecidos vegetais é danosa, uma vez que estes levam ao surgimento de diversas fitopatologias capazes de comprometer o desenvolvimento da planta e, consequentemente, seu aproveitamento econômico. Por outro lado, existem microrganismos-capazes de promover o crescimento da planta e contribuir para sua nutrição de forma positiva, estimulando a produtividade. Estes microrganismos são conhecidos como endofíticos. Entre os microrganismos endofíticos mais conhecidos estão as bactérias fixadoras de nitrogênio (Rosenblueth et aí., 2006) e os microrganismos produtores de hormônios indutores de crescimento, como as auxinas e giberelinas (Barbosa et a!., 2009).

Neste aspecto, o conhecimento a respeito das interações planta-microrganismos pode fornecer informações importantes com respeito ao desenvolvimento vegetal, que podem por sua vez ser aproveitadas na geração de produtos capazes de incrementar/acelerar a brotação de meristemas e, consequentemente, a produtividade.

Assim, sabe-se que os tecidos da cana-de-açúcar são colonizados por uma grande quantidade de bactérias, de diversas espécies (Magnani, 2005). Estas bactérias podem, por exemplo, fornecer à planta nitrogênio na forma assimilável pelo vegetal, substâncias químicas capazes de proteger o vegetal contra o ataque de outros microrganismos nocivos ou ainda substâncias capazes de estimular o crescimento do vegetal, em uma associação mutualística benéfica a ambas as classes de organismos.

Nos últimos anos, descobriu-se que as bactérias Gram-negativas, quando cultivadas in vitro, são capazes de produzir substâncias químicas da classe das acil-homosserina lactonas. Estas substâncias são responsáveis pela modulação da expressão gênica em um mecanismo conhecido como “percepção do quórum”, e;stimulando, por exemplo,; a expressão de fatores fenotípicos como biofilmes, proteínas, antibióticos, alterações celulares como flagelos e pilos, transferência conjugal de plasmídeos, entre outros fatores importantes para as bactérias (Whitehead et a/., 2001).

Entretanto, havia uma lacuna na literatura no sentido de caracterizar o potencial destas moléculas e suas interações com as plantas, mais especificamente em sua capacidade de promover e acelerar o enraizamento e brotação da cana-de-açúcar (Pomini, 2006).

Neste sentido, na presente invenção objetivou-se (i) desenvolver uma metodologia para análise da presença de acil-homosserina lactonas no interior dos tecidos da cana-de-açúcar; (ii) aprimorar a metodologia para a síntese química artificial do produto acil-homosserina lactona e (iii) empregar este princípio ativo para a criação e uso de uma formulação utilizada para estimular/acelerar o enraizamento, brotação e o crescimento da cana-de-açúcar, seja a partir de toletes, gemas, meristemas, ou plantas já desenvolvidas.

Procedimento Experimental Materiais e métodos Os espectros de RMN de 1H e de RMN de 13C foram obtidos em espectrômetro VARIAM Mercury Plus, operando a 300,06 MHz para 1H e 75,45 MHz para 13C. Os deslocamentos químicos foram dados em ppm, tendo como referência interna o tetrametilisilano (δ 0,0). Os solventes utilizados foram: CDCI3, CD3OD e D2O, Aldrich ou Isotec. Para a purificação dos constituintes químicos foram utilizadas cromatografias em coluna usando gel de sílica 60 (0,063-0,2mm) da Merck ou Fluka, além de fracionamentos e filtrações em Sephadex LH 20. Os diâmetros das colunas utilizadas variaram de acordo com a massa do material a ser tratado. O acompanhamento das cromatografias e filtrações em coluna foi feito através de cromatografia em camada delgada (CCD), sendo que as placas cromatográficas foram preparadas com fase estacionária de gel de sílica 60 G e gel de sílica 60 GF, com 0,25 mm de espessura. As análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram realizadas com amostras; preparadas por desidratação em aparelho de ponto crítico Bal-Tec-CPD 030 à temperatura de 9o C, utilizando 55 bar de CO2. O metalizador de amostras era da marca Shimadzu IC-50 utilizando-se ouro de alta pureza. O microscópio eletrônico de varredura era da marca Schimadzu SS - 550 Super Scan.

Os solventes orgânicos (hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol) utilizados na fase móvel nas cromatografias e filtrações, apresentavam grau de pureza P.A ou foram destilados. O processo de evaporação de solventes foi realizado utilizando evaporador rotativo. As substâncias separadas nas placas eromatográficas foram visualizadas -através do revelador universal (solução alcoólica de anisaldeído). 1. Metodologia de identificação de acií-homosserína lactonas em tecidos de cana-de-açúcar.

As folhas e colmos jovens da espécie Saccharum officinarum L. foram coletados em cultivo comercial em latossolo roxo no município de Munhoz de Mello, região noroeste do Paraná, em 07 de setembro de 2011. Trata-se de um cultivo comercial voltado para a produção de etanol. A cana obtida era proveniente de rebrotação com corte estimado em 2 meses anteriores à coleta do material (brotações jovens). O material vegetal in natura (4,36 kg) foi moído em moinho de facas e submetido a extração exaustiva com acetato de etila à temperatura ambiente utilizando 40 litros de solvente. Após a evaporação do solvente em rotaevaporador (38 °C), foram obtidos 72,00 g de extrato bruto acetato de etila (AcOEt).

Parte do extrato bruto AcOEt (70,00 g) foi submetido a uma filtração em coluna cromatográfica de gel de sílica 60 (80 g, Θ = 5 cm) com os eluentes hexano, acetato de etila e metanol, resultando nas frações hexânica (7,64 g), acetato de etila (33,75 g) e metanólica (7,72 g). A fração acetato de etila foi purificada por cromatografia em coluna empacotada com gel de sílica 60 (158,00 g, θ= 4,5 cm) e eluída com os eluentes hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol em ordem crescente de polaridade, recolhendo-se 548 frações de 10 ml. As frações reunidas 271-299 foram submetidas à filtração em Sephadex LH 20 (10,00 g, Θ = 2,5 cm) com metanol visando a remoção de clorofila, Foram obtidas 42 frações, sendo que as frações reunidas 27-31, 32-37 e 38-42 foram analisadas por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas por impacto eletrônico (70 eV), tendo sido observada a ocorrência da molécula A/-3-oxo-octanoil-homosserina lactona na junção 32-37. O espectro de massas da substância natural é mostrado na Figura 1 e foi comparado posteriormente ao espectro de massa do padrão sintético, confirmando sua estrutura. A concentração estimada de substância nos tecidos de cana-de-açúcar em ocorrência natural foi de 2,29 x 10‘5 mg/g de 2. Aprimoramentos na metodologia de síntese química das acil-homosserina lactonas. A acil-homosserina lactona contendo uma carbonila na posição 3 da cadeia acila lateral foi sintetizada de forma otimizada conforme mostrado na Figura 2. Síntese do derivado de Meldrum (a). À um balão de 50 ml adicionou-se 20 mL de diclorometano seco. Em seguida, o balão foi vedado com rolha e agulha, tendo sido aspergido em sua atmosfera interior um fluxo de nitrogênio a partir de um reservatório de borracha. Em seguida adicionou-se 2,0 mmol de ácido hexanóico. Adicionou-se também 2,1 mmol de DMAP (4-dimetilaminopiridina, 256,2 mg), 2,2 mmol de diciclohexilcarbodiimida (453,2 mg) e 2,0 mmol de reagente de Meldrum (288,0 mg). A solução permaneceu sob agitação magnética à temperatura ambiente. Após 24 horas, havia no meio reacional um precipitado branco, e a solução era amarela. O meio foi filtrado em algodão e a fase orgânica evaporada sob pressão reduzida a 40°C. Em seguida, o óleo amarelo obtido foi dissolvido em 20 mL de acetato de etila e extraído com solução aquosa de HCI 2 M (3 x 10 mL) e água destilada (1x10 mL), e seco sob sulfato de magnésio anidro. A fase orgânica foi então filtrada em algodão e evaporada sob pressão reduzida. O derivado de Meldrum foi conservado em freezer a -20°C, e utilizado para a próxima etapa o mais rapidamente possível. Neste experimento, a principal melhoria da metodologia reacional consistiu na substituição do fluxo contínuo de nitrogênio por apenas uma aspersão inicial no balão. Este procedimento evitou a evaporação excessiva do solvente diclorometano, melhorando o perfil reacional. Síntese da (S)-N-3-oxo-octanoil-homosserina lactona (b). Λ uma solução do derivado de Meldrum (0,75 mmol de hexanoil-Meldrum) em 22,5 mL de acetonitrila grau HPLC de pureza adicionou-se 0,75 mmol de bromidrato ou cloridrato de (S) ou (±)-a-amino-y-butiroiactona e 1,2 mmol de trietilamina (126,44 pL). A mistura permaneceu sob agitação magnética e refluxo durante 5 horas. Em seguida, a fase orgânica foi evaporada sob pressão reduzida e o sólido branco dissolvido com 20 mL de acetato de etilá e 5 mL de metãnõT. A fase orgânica foi então extraída com soluções aquosas de NaHC03 saturada (3 χ 10 mL), KHSO4 1M (3 x 10 mL) e salmoura (3x10 mL). Em seguida, essa solução foi seca com sulfato de magnésio anidro, filtrada e evaporada, rendendo um sólido amarelado. Neste procedimento, a erradicação do uso de agitação inicial à temperatura ambiente e o uso de um maior tempo de refluxo aumentaram o rendimento do produto final em comparação com a literatura (Pomini, 2009), tendo sido observada, com esta otimização metodológica, um rendimento de 55,00 %, superior aos 28,00 % encontrados na literatura.

Os produtos das reações foram purificados por cromatografia em coluna (12 g de sílica; coluna com 2 cm de diâmetro), com os solventes hexano, diclorometano e acetato de etila em polaridades crescentes. Os produtos foram recolhidos como sólidos brancos, uniformes, nas frações de polaridade diclorometano/acetato de etila 7/3. (S)-N-(3-oxo-octanoH)-homosserína lactona (Figura 3). Rendimento global: 55,00 %. CG-ΕΜ (IE, 70 eV). Figura 4. m/z: 241 (M+, 1%), 224 (24%), 185 (7%), 143 (25%), 102 (7 %), 99 (31%), 56 (100%). RMN de 1H, Figura 5 (300,00 MHz, CD3OD): δ 0,89 (t, 3H, J 7,0 Hz, H-8’); 1,30 (m, 4H, H-6’, H-7’); 1,59 (quinteto, 2H, J7,Z Hz, H-5’); 2,28 (m, 1H, H- 4) ; 2,53 (t, 2H, J 7,3 Hz, H-4); 2,75 (m, 1H, H-4); 3,47 (s, 2H, H-2’); 4,28 (ddd, 1H, J 11,0; 9,1 e 6,2 Hz, H-5); 4,47 (t, 1H, J8,2 Hz, H-5); 4,60 (ddd, 1H, J11,3; 8,8 é 6,2 Hz, H-3); 7,70 (d, NH, J 5,1 Hz). RMN de 13C, Figura 6 (75,45 MHz, CD3OD): δ 13,8 (C-8’); 22,32 (C-7’); 23,0 (C-6’); 31,1 (G-5’); 29,8 (C-4); 43,8 (C-4’); 48,1 (C-2’); 49,0 (C-3); 65,8 (C- 5) ; 166,4 (C-1’); 174,8 (C-2); 206,5 (C-3’). 3. Desenvolvimento e uso de uma formulação reguladora da brotação/crescimento da cana-de-açúcar. O produto formulado regulador de crescimento para a estimulação de brotação de meristemas em toletes de cana-de-açúcar foi preparado pela dissolução de 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 e 10,0 mg de (S)-A/-3-oxo-octanoil-homosserina dissolvido em 1000 mL de água.

Nos ensaios de estimulação de crescimento, toletes de cana da variedade SP 80 foram cortados com aproximadamente 15,0 cm de comprimento. Estes toletes receberam os seguintes tratamentos iniciais: (a) seis toletes ioram mergulhados em solução branco contendo 100 pL de DMSO em 1000 ml_ de água. Os mesmos foram plantados em meio sólido (vermiculita) e irrigados com a solução branco. (b) seis toletes foram mergulhados inicialmente em solução do produto formulado em diferentes concentrações do princípio ativo. Os mesmos foram plantados em meio sólido (vermiculita) e irrigados com a solução branco. (c) seis toletes foram mergulhados inicialmente em solução do produto formulado. Em seguida, os mesmos foram plantados em meio sólido (vermiculita) e irrigados com o produto formulado. O produto formulado foi testado contendo as concentrações de 0,1 mg/L, 0,5 mg/L, 1,0 mg/L, 5,0 mg/L e 15,0 mg/L do princípio ativo acil-homosserina lactona. Todos os tratamentos descritos acima foram incubados em câmara de crescimento sob temperatura controlada (30° C) e ciclo de iluminação 14 horas claro/10 horas escuro durante 8 dias. Foram realizadas irrigações com solução controle ou produto formulado a cada dois dias. Após este período, observou-se a formação de brotos a partir dos toletes. Avaliou-se a massa total e o comprimento de raízps secas por tolete e a ipassa e comprimento de cada broto. Em seguida, os dados foram ponderados pelo diâmetro aferido de cada tolete antes do início da realização do experimento, de forma a uniformizar os dados obtidos. Finalmente, foram realizadas análises de microscòpia eletrônica de varredura com as raízes obtidas, de forma a avaliar o grau de sanidade e integridade dos tecidos vegetais.

Os toletes tratatos de acordo com a metodologia (b) acima descrita apresentaram um padrão de crescimento de raízes e brotos muito semelhante ao controle, permitindo inferir desde o início dos experimentos que a irrigação (além do tratamento inicial) com—o_prnrintn <=>ra impresr.inrih/gl____para a estimulação meristemática dos toletes.

Os resultados para os experimentos de acordo com os itens (a) e (c) estão apresentados na Figura 6, que representa a média das aferições realizadas com relação à ambas variáveis. A Figura 7 mostra de forma pictórica diferentes toletes oriundos dos três ensaios realizados, mostrando a diferença visual de quantidade de raízes mediante a aplicação do produto formulado.

Pelos resultados observados na Figura 6, verifica-se claramente que o mergulho inicial de toletes no produto formulado seguido de irrigações com este produto a 0,1 mg/L do princípio ativo estimulou o crescimento de raízes e brotos em comparação com o ensaio branco, uma vez que observaram-se aumentos significativos na massa média de raiz seca (47,20 %), comprimento médio das raízes (44,56 %), massa média de brotos secos (28,30 %), e nos comprimentos médios dos brotos (22,99 %). Trata-se, portanto, de uma concentração capaz de estimular tanto o enraizamento quanto a brotação das gemas de cana-de-açúcar em grande extensão, sendo visível a ação biológica mais significativa ao nível da aceleração do crescimento radicular.

Por outro lado, a administração do produto contendo a substância ativa na concentração de 0,5 mg/L promoveu um aumento menos significativo na massa média de raiz seca (34,48 %), redução na massa média de broto seco (-23,13%), pequeno aumento no comprimento médio das raízes (16,14 %) e redução do comprimento médio dos brotos (-32,39 %).

Finalmente, a administração do produto contendo a substância ativa na concentração de 1,0 mg/L causou um aumento significativo no comprimento médio dos brotos (54,54 %), na massa média de brotos (20,41 %), redução no comprimento médio das raízes (-26,63 %) e redução significativa na massa seca média de raízes (-37,30 %). A interpretação destes dados é relativamente simples. Em baixas concentrações do princípio ativo (0,1 mg/L), o produto é capaz de estimular principalmente o enraizamento das gemas em brotação, com ganhos adicionais menores fim termos Ha brotação. Pnr ni itrr> lado, em concentração mais alta do princípio ativo (dez vezes maior) verifica-se claramente uma mudança de atividade biológica, sendo a brotação estimulada e o enraizamento reprimido.

Este fenômeno é facilmente comprovado pelas análises de microscopia eletrônica de varredura (Figura 8), tendo sido observada uma menor quantidade de radículas para o tratamento com 1,0 mg/L de princípio ativo (Figura 8.d.) se comparado ao controle (Figura 8.a.) ou menores concentrações de princípio ativo (Figuras 8.b. e 8.c.). Notou-se também uma certa tendência à redução de diâmetro das raízes em maiores concentrações de princípio ativo no produto (Figura 8.d.)· Este fenômeno de mudança de atividade biológica (fenotípica) de acordo com a concentração é comum em outros produtos reguladores de crescimento de plantas contendo auxinas ou gibereiinas.

As análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV) também forneceram importantes informações a respeito do modo de ação do produto estimulador de crescimento de meristemas quanto à janela de concentrações úteis para aplicação do produto. A amostra controle branco revelou a presença de células com morfologia em aspecto quadrático (Figura 10.a.), ao passo que a administração do produto mesmo em pequenas concentrações do princípio ativo (0,1 mg/L) foi suficiente para causar um alongamento das mesmas (Figuras 10.b. e 10.c.). Os tecidos permaneceram íntegros nas menores concentrações testadas (0,1 ; 0,5 e 1,0 mg/L) (Figuras 9 e 10), porém, observou-se uma grande tendência à “descamação” das células em concentrações superiores de princípio ativo no produto (5,0 rrtg/L), como pode ser atestado pelas Figuras 10 e 11, especialmente Figura 11,d.. Desta forma, determinou-se que a concentração ótima de utilização do produto varia entre 0,1 e 1,0 mg/L de princípio ativo.

Assim, verifica-se que o uso do produto formulado no tratamento dos toletes, seguido de uso em irrigação nos primeiros dias de plantio, estimula de forma expressiva o crescimento das raízes e brotos em cana-de-açúcar. Este crescimento acelerado é benéfico para a planta e a cultura, uma vez que reduz o tempo de estabelecimento do material vegetal ao solo, acelera a formação rins w»rtir»iloa wagatnis importante» para a aftsimilaçãn rlfi nutrientes, além de ser capaz de reduzir a exposição do tolete sem brotação aos microrganismos patogênicos.

Este produto, portanto, pode ser utilizado no tratamento de toletes, gemas ou meristemas previamente ao plantio no solo, bem como em irrigações posteriores ao plantio visando a regulação do crescimento da planta. Outrossim, é possível incorporar este produto formulado em aspersões mecanizadas/automatizadas que tratam os toletes imediatamente antes ao lançamento ao solo no momento do plantio. O produto pode também ser utilizado em formulações como um princípio ativo principal ou adjuvante, em processos de aspersão de superfície ou aplicação sistêmica conjuntamente com outros produtos agroquímicos, tais como fungicidas, inseticidas, bactericidas, adubos, herbicidas, reguladores de crescimento vegetal e em processos de irrigação.

Entre as principais vantagens deste produto estão a simplicidade estrutural do princípio ativo, a baixa complexidade química e toxicidade da formulação, o baixo custo do princípio ativo se comparado a outros estimuladores de crescimento como auxinas e giberelinas. Em adição, trata-se de um produto químico com estrutura sem anéis aromáticos ou halogênios, como flúor, cloro, bromo ou iodo, certamente menos amigáveis sob o ponto de vista ambiental. Outrossim, a molécula não possui unidades de enxofre ou fósforo, sendo portanto muito mais facilmente degradável ao ambiente e atóxica.

Finalmente, o fato desta substância ser encontrada naturalmente nos tecidos de cana-de-açúcar, como atestado na presente invenção, minimiza a possibilidade de efeitos tóxicos ou danosos aos tecidos vegetais após a administração do produto formulado.

Neste relatório descritivo foram consultadas as seguintes referências: Abdelrahman, L. Z. Sugar cane production. Patente Estados Unidos da América, US 6,521,452 B1,2003.

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Claims (8)

1.OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada por se tratar de um processo de obtenção de acil-homosserina lactonas sintéticas e seu uso em produto como regulador de crescimento em cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L., Poaceae), estimulador de crescimento radicular e brotação em meristemas/gemas/toletes.

2. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pela aplicação específica deste produto em cana-de-açúcar que compreende espécies vegetais rústicas, híbridos comerciais e espécies comerciais ou experimentais modificadas geneticamente, seja pela inserção de genes de outras plantas, bactérias, vírus, conferindo resistência a patógenos, pragas, estresse hídrico e outros objetivos de modificação genética.

3. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada por compreender um processo de otimização de obtenção, relacic|nando-se ao conjunto de técnicas de síntese, extração, purificações cromatográficas, de partição, automatizados ou não, otimizadas, empregadas na obtenção da substância objeto do item 1, nas espécies vegetais compreendidas no item 2.

4. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pelo fato do produto formulado conte a substância princípio ativo acil-homosserina lactona.

5. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA tWOTONAS-E- DESFNVOIVIMFNTO nF PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pela substância (S)-/S/-3-oxo-octanoil-homosserina lactona que pode representar a (S)-N-3-oxo- octanoif-homosserina lactona, apresentando ainda um núcleo básico que pode conter substituintes acil, alquil, aril ou derivados tanto no núcleo lactônico quanto na cadeia acil lateral, possuir diferentes comprimentos na cadeia acil, insaturações, grupos hidroxila e amina, bem como substituintes na porção lactônica, ser apresentada como produto com configuração absoluta (R) ou (S) ou ainda como uma mistura racêmica, dimérica, polimérica e embebida supramolecularmente em moléculas carreadoras tais como ciclodextrinas, lipossomas, polímeros diversos, calixarenos, hidrogéis, entre outros.

6. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pela substância acil-homosserina lactona que se apresenta como um pró-agroquímico, dando origem a derivados oxigenados, hidratados, hidrolisados, salinizados e ativos biologicamente nos tecidos vegetais de cana-de-açúcar.

7. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pela substância DMSO que pode ser substituída na formulação por outras substâncias e vetores químicos de igual caráter solubilizante e baixa toxicidade aos tecidos vegetais e aplicação em agricultura.

8. OTIMIZAÇÃO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pela formulação que pode conter ainda silicone, óleos, gorduras, açúcares, talco, amido, celulose, solventes orgânicos e inorgânicos, polímeros sintéticos, água, substâncias antifúngicas, antibacterianas, auxinas, gibereiinas e demais reguladores de crescimento, nutrientes e outros excipientes capazes de realizar o carreamento do princípio ativo ou atuação em mistura. OTIMIZAÇÃO DF PROCFRRO nF O RTF NÇÃQ DE ACIL-HOMOSSERINA LACTONAS E DESENVOLVIMENTO DE PRODUTO REGULADOR DE CRESCIMENTO PARA CANA-DE AÇÚCAR, caracterizada pelo produto desenvolvido que pode ser utilizado na forma de tratamento de meristemas, gemas, toletes, aspersão no momento de plantio, adição à água de irrigação, adição à água de descarte industrial utilizada em irrigação, adição ao vinhoto industrial de irrigação proveniente de usinas, aplicações foliares, sistêmicas e outras metodologias de aplicação de produtos em agricultura.