ES2354937T3 - Método para tipar y detectar hbv. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION Y/O ANALISIS GENETICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B (VHB) EN UNA MUESTRA BIOLOGICA, QUE COMPRENDE HIBRIDIZAR LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DE LA MUESTRA CON UNA COMBINACION DE AL MENOS DOS SONDAS DE NUCLEOTIDOS, HIBRIDIZANDO CONCRETAMENTE DICHA COMBINACION A UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION GENETICA DE LA MEZCLA RT DEL VHB Y/O UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION PRE - NUCLEO DEL VHB Y/O A UNA SECUENCIA BLANCO MUTANTE ELEGIDA DE LA REGION HBSAG DEL VHB Y/O A UNA SECUENCIA BLANCO ESPECIFICA DEL GENOTIPO DEL VHB, ELIGIENDOSE DICHAS SECUENCIAS - BLANCO EN LA FIGURA 1, Y APLICANDOSE DICHAS SONDAS A LUGARES CONOCIDOS, SOBRE SOPORTE SOLIDO, Y SIENDO DICHAS SONDAS CAPACES DE HIBRIDIZARSE A LOS ACIDOS POLINUCLEICOS DE LA MUESTRA EN LAS MISMAS CONDICIONES DE HIBRIDIZACION Y LAVADO, O HIBRIZANDOSE DICHAS SONDAS ESPECIFICAMENTE, CON UNA SECUENCIA COMPLEMENTARIA, A CUALQUIERA DE DICHAS SECUENCIAS BLANCO, O UNASECUENCIA EN LA QUE LA T DE DICHA SECUENCIA BLANCO ES SUSTITUIDA POR U; Y DETECTAR LOS HIBRIDOS FORMADOS; Y DEDUCIR EL GENOTIPO Y/O MUTANTE DEL VHB PRESENTE EN DICHA MUESTRA A PARTIR DE LA SEÑAL O SEÑALES DIFERENCIALES DE HIBRIDIZACION OBTENIDAS. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A CONJUNTOS DE SONDAS DE NUCLEOTIDOS Y POSIBLEMENTE CEBADORES UTILES EN DICHOS PROCEDIMIENTOS, ASI COMO A SU USO EN UN PROCEDIMIENTO PARA TIPIFICAR Y/O DETECTAR EL VHB Y PARA ENSAYAR KITS QUE UTILIZAN EL MISMO.

Description

La presente invención se refiere al campo del diagnóstico del virus de la hepatitis B (HBV). Más particular-mente, la presente invención se refiere al campo del genotipado de HBV y la determinación de la presencia de mutantes de HBV en muestras de ensayo. 5

La presente invención se refiere particularmente a un método para la detección rápida y fiable de mutantes y genotipos de HBV que aparecen en una muestra de ensayo usando conjuntos específicos de sondas optimizadas para funcionar juntas en un ensayo de hibridación inversa.

El virus de la hepatitis B es un virus de ADN encapsulado pequeño, de una longitud de aproximadamente 3200 pb. Históricamente, se ha caracterizado en base a la reacción inmunológica del HBsAg con conjuntos de anticuer-10 pos monoclonales. Los aislados se describieron como a, que indica el determinante común para todos los subtipos diferentes, seguido de las combinaciones específicas de los subtipos: dw, dr, yw, o yr. Estos últimos son pares de de-terminantes mutuamente excluyentes, que cubren los aminoácidos 122 (d = lys, y = arg) y 160 (w = lys, r = arg) de HBsAg. Existen varios subdeterminantes para w, y se pueden adscribir a la aparición de ciertas variantes de aminoáci-dos en el codón 127. Más recientemente, se ha propuesto una clasificación genética, basada en el análisis molecular 15 del virus. Este tipo de análisis mostró que en total existen seis genotipos diferentes, indicados desde A a F, con una divergencia genética máxima de 8% cuando se comparan genomas completos (repasado por Magnius y Norder, 1995).

La variabilidad genética de HBV puede ser clínicamente importante. De hecho, la variabilidad genómica pue-de incluir algunos mecanismos mediante los cuales el HBV evita el aclaramiento inmunitario, y por tanto induce infección crónica. Un marcador proteico importante a la hora de inducir tolerancia inmunitaria, eliminación del virus e infección 20 crónica, es HBeAg. La expresión de esta proteína está estrictamente controlada tanto a nivel transcripcional como tra-duccional (Li et al., 1993; Okamoto et al., 1990; Yuan et al., 1995; Sato et al., 1995). Por lo tanto, en el transcurso natu-ral de la infección por HBV, una etapa bien caracterizada de la enfermedad se indica como hepatitis B crónica negativa a HBe (repasado por Hadziyannis S.J., 1995). Esta fase es debida principalmente a la aparición de mutaciones de co-dones de parada traduccionales preCore. La variabilidad genética global determina la frecuencia y localización física en 25 el genoma vírico en el que aparecen estas mutaciones de codones de parada traduccionales. Se propuso que la regula-ción transcripcional es el mecanismo para el genotipo A (y posiblemente también F), mientras que el control traduccional era encontrado más probablemente en otros genotipos (Li et al.; 1993; Sato et al., 1995). Contradictorio con la regula-ción traduccional, se encontró que la regulación transcripcional fue incapaz de bloquear completamente la expresión de HBeAg, y por lo tanto se propuso categorizar el fenotipo de este mutante como HBe suprimido, en lugar de negativo a 30 HBe (Takahashi et al., 1995). En cualquier caso, estos mutantes preCore conducirían a una destrucción del balance preexistente entre HBeAg en circulación y los péptidos derivados de HBc presentados por moléculas HLA de clase I sobre la superficie de hepatocitos infectados, disminuyendo de ese modo el efecto supresor de HBeAg en células T, dando finalmente como resultado la liberación parcial de CTL específicos del núcleo y conduciendo a apoptosis de los hepatocitos infectados. En general, tras la aparición de las variantes HBe-, el transcurso de la infección vírica se carac-35 teriza por la progresión de hepatitis crónica, lo que puede conducir al desarrollo de cirrosis y carcinoma hepatocelular (Hadziyannis, 1995).

Otro aspecto para el cual la variabilidad genética o genotipado del virus puede ser de importancia es en el desarrollo de vacunas en las que la respuesta puede estar mediada por el tipo de virus. La protección frente a la infec-ción por HBV de todos los subtipos es conferida por anticuerpos frente al determinante “a” común del antígeno de super-40 ficie de la HB (HBsAg). Se ha demostrado que este determinante “a” presenta un número de epítopos, y que esta es-tructura terciaria es tremendamente importante para su antigenicidad. La región más importante está entre los aminoá-cidos 124 y 147, pero se puede extender desde el aminoácido 114 a 150. Una respuesta anti-HBs adecuada, formada tras la vacunación, es en principio completamente protectora. La infección con una cepa de HBV que posee mutaciones en la región del determinante “a” puede dar como resultado el fracaso de la vacuna, debido a que la respuesta inmunita-45 ria humoral inducida por la vacuna no reconoce al mutante HBsAg. Los mutantes de escape asociados con la vacuna más comunes son las sustituciones de una glicina en la posición 145 por una arginina (G145R), K141E, y T126N. Pero también se ha encontrado una inserción de 2 aa entre las posiciones de los aa 122 y 123, una inserción de 8 aa entre los aa 123 y 124 (Carman et al., 1990, 1995; Crawford, 1990; Waters et al., 1992).

La lamivudina es un (-)-enantiómero de 3’-tiacitidina, un análogo 2’,3’-didesoxinucleosídico, y se sabe que es 50 un potente inhibidor de la replicación de HBV a través de la inhibición de la actividad de transcriptasa inversa (RT) de la HBV polimerasa. El tratamiento con lamivudina puede dar como resultado mejoras histológicas en pacientes con hepati-tis crónica, y, cuando se administra antes y después de un transplante de hígado, puede evitar la reinfección del injerto (Honkoop et al., 1995; Naoumov et al., 1995). Sin embargo, después del tratamiento, se puede observar un rebrote de la hepatitis en la mayoría de los pacientes, con elevaciones de ALT y ADN de HBV que vuelve a ser detectable. Este rebo-55 te del ADN de HBV está asociado con un nuevo cuasi equilibrio de las especies. En unos pocos casos, se observó el avance repentino del virus durante la terapia, debido a la selección de cepas de HBV resistentes a lamivudina. La natu-

raleza exacta de este avance repentino se ha adscrito a la acumulación de mutaciones en la parte de RT de la polime-rasa. Se ha encontrado un mecanismo similar en la RT polimerasa del HIV, en el que, al tratar con lamivudina, las muta-ciones se acumulan en el motivo YMDD (Gao et al., 1993). Este motivo YMDD también está presente en la parte de RT de la HBV polimerasa, y se han encontrado en esta región mutaciones seleccionadas por lamivudina en HBV (Tipples et al., 1996), así como en otras regiones de la parte de RT de la polimerasa (Ling et al., 1996). Otro fármaco que ha de-5 mostrado que inhibe la actividad de transcriptasa inversa de la HBV polimerasa es el penciclovir (Shaw et al., 1996), y también se pueden detectar mutaciones en la HBV polimerasa con el tratamiento con este fármaco.

En la Solicitud de Patente Internacional WO 93/13120, se ha descrito un método para la detección de HBV en una muestra en un ensayo de hibridación en sándwich en fase de disolución. En la Solicitud de Patente Internacional WO 95/02690, se proporciona una composición de sondas de HBV y la determinación del mismo presente en la muestra 10 de ensayo. En la patente EP 229701, se ha descrito un procedimiento de PCR general para detectar la presencia o ausencia de un ácido nucleico en un virus.

A partir de todo esto, se puede concluir que la información en los siguientes aspectos es esencial para un diagnóstico in vitro apropiado, monitorización y seguimiento de infecciones por HBV:

- genotipo; 15

- mutaciones preCore;

- mutaciones de escape de vacuna;

- mutaciones del gen de RT seleccionadas mediante tratamiento con fármacos tales como lamivudina y penciclo-vir.

La obtención de toda esta información usando las tecnologías existentes es complicada, consume tiempo, y 20 requiere un personal altamente cualificado y experimentado.

De este modo, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación de la presencia o ausencia de uno o más genotipos de HBV presentes posiblemente en una muestra biológica.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable 25 para la determinación de la presencia o ausencia de una o más variaciones en la región de HBsAg que representan uno o más genotipos de HBV presentes posiblemente en una muestra biológica, en un único experimento.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación de la presencia o ausencia de uno o más mutantes de HBV presentes posiblemente en una mues-tra biológica, en un único experimento. 30

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación de una o más mutaciones en la región de HBsAg de HBV presente posiblemente en una muestra biológica, en un único experimento.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación de una o más mutaciones en la región del gen de la polimerasa (pol) de HBV posiblemente pre-35 sente en una muestra biológica, en un único experimento.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención desarrollar un método de detección rápido y fiable para la determinación simultánea de uno o varios genotipos de HBV en combinación con uno o varios mutantes de HBV posiblemente presentes en una muestra biológica, en un único experimento.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar un ensayo o método de genotipado, que permite 40 inferir la secuencia nucleotídica en codones de interés y los mutantes de HBV de interés, e inferir el genotipo de HBV presente posiblemente en una muestra biológica.

Es el objeto de la presente invención proporcionar un ensayo de genotipado que permita la detección de los diferentes mutantes y genotipos de HBV en un único montaje experimental.

Es otro objeto de la presente invención seleccionar sondas particulares capaces de discriminar una o más 45 mutaciones de HBV en una de las regiones mencionadas anteriormente del genoma de HBV, y discriminar uno o más genotipos de HBV.

Más particularmente, es un objeto de la presente invención seleccionar sondas particulares capaces de dis-criminar secuencias de HBV de tipo salvaje de las secuencias de HBV mutantes.

Es también un objeto de la presente invención seleccionar sondas particulares capaces de discriminar varian-50 tes de tipo salvaje y polimórficas de HBV de las secuencias de HBV mutantes.

Es también un objeto de la presente invención seleccionar sondas particulares capaces de discriminar se-cuencias de genotipos de HBV.

Además, es un objeto de la presente invención combinar un conjunto de sondas seleccionadas capaces de genotipar HBV y discriminar diferentes mutantes de HBV posiblemente presentes en una muestra biológica, con lo que todas las sondas se pueden usar bajo las mismas condiciones de hibridación y de lavado. 5

Es también un objeto de la presente invención seleccionar cebadores que permitan la amplificación del frag-mento o fragmentos génicos que determinan las mutaciones o variaciones genómicas de HBV de interés como se expli-ca anteriormente.

La presente invención también se refiere a kits de diagnóstico que comprenden dichas sondas útiles para desarrollar tal ensayo de genotipado, y ensayos para detectar, monitorizar o hacer el seguimiento de la infección por 10 HBV, y ensayos para detectar mutaciones de HBV.

Todos los objetos de la presente invención se han satisfecho mediante las siguientes realizaciones específi-cas.

Como una solución al problema mencionado anteriormente de que es esencial, para un diagnóstico apropia-do, monitorización y seguimiento de la infección por HBV, tener información sobre el genotipo de HBV presente, la pre-15 sente invención proporciona una forma elegante de abordar tal complejidad, que implica descansar en un enfoque de hibridación inversa (particularmente en tiras de Ensayo de Sondas en Líneas, como se describe por Stuyver et al., 1993). Usando esta tecnología, es posible obtener convenientemente todos los datos esenciales en un experimento de ensayo. Para lograr esta meta, es necesario diseñar y ensamblar un conjunto de sondas, que pueden detectar todos los polimorfismos relevantes en las regiones génicas de HBV de interés. 20

La presente invención se refiere así particularmente a un método para la detección de tanto genotipos de ce-pas de HBV como de mutantes de HBV resistentes a fármacos, en una muestra biológica, que comprende:

(i) si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

(ii) si es necesario, amplificar la parte relevante de un gen de HBV adecuado presente en dicha muestra con al menos un par de cebadores adecuados; 25

(iii) hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con una combinación de al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos:

- SEC ID 77, 81, 139-141, 190-194

- SEC ID 78, 142-147, 149

- SEC ID 79, 150-161, 204 30

- SEC ID 82, 162-169, 208

- SEC ID 170-176, 213

- SEC ID 178-189, 214-219,

- opcionalmente una o más de SEC ID 80, 148 y 177, y al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos: 35

- SEC ID 114, 115, 127-129, 227-234, 243, 249, 250, 261

- SEC ID 116, 117, 130-133, 244-248, 251-260, 262-266, y/o al menos una sonda procedente de:

- SEC ID 267 y 269, cada una junto con SEC ID 268,

(iv) detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v) inferir los genotipos de HBV y los mutantes de HBV resistentes a fármacos presentes en dicha muestra a par-40 tir de la señal o señales de hibridación diferenciales obtenidas en la etapa (iv).

Las secuencias dianas específicas de los genotipos pueden ser cualquier variación nucleotídica que aparezca al alinear los diferentes genomas de HBV que permite la clasificación de un cierto aislado de HBV como un cierto geno-tipo (véase la Figura 1).

La expresión “parte relevante de un gen de HBV adecuado” se refiere a la parte del gen de HBV que engloba 45 la secuencia diana específica del genotipo de HBV escogida a partir de la Figura 1 a detectar.

Según una realización preferida de la presente invención, la etapa (iii) se lleva a cabo usando sondas diseña-das todas ellas meticulosamente de manera que muestran los resultados de hibridación deseados, cuando se usan en un formato de ensayo de hibridación inversa, más particularmente en las mismas condiciones de hibridación y de lavado

que implican que cada una de dichas sondas es capaz de formar un complejo al hibridarse con su secuencia diana presente en los ácidos polinucleicos de la muestra según se obtiene después de la etapa (i) o (ii).

La numeración de los aminoácidos y nucleótidos codificados por el gen de HBV es según se acepta general-mente en la bibliografía.

Se describe aquí un conjunto de sondas que permiten la detección de una variación específica del genotipo, 5 incluyendo sondas que permiten la detección de una secuencia de tipo salvaje, una secuencia polimórfica o una se-cuencia mutada en una cualquiera de las posiciones nucleotídicas que muestran una diversidad de secuencia al alinear-la con todas las secuencias de HBV conocidas o aún por descubrir según se representa en la Figura 1 para todos los genomas de HBV completos encontrados en EMBL/NCBI/DDBJ/Genbank.

Los conjuntos de sondas según la presente invención tienen como característica común que todas las sondas 10 en dicho conjunto se diseñan de manera que se pueden usar juntas en un ensayo de hibridación inversa, más particu-larmente en condiciones de hibridación y de lavado similares o idénticas como se indica anteriormente y más abajo.

Los conjuntos seleccionados de sondas incluyen sondas que permiten diferenciar cualquiera de los cambios nucleotídicos específicos del genotipo de HBV según se representan en la Figura 1, preferiblemente en la región de HBsAg de HBV. Dichas sondas se caracterizan porque pueden funcionar en un método como se expone anteriormente. 15

A fin de resolver el problema mencionado anteriormente de obtener información sobre la posible presencia de mutantes de HBV en una muestra dada, la presente invención proporciona una manera elegante de abordar este pro-blema, que implica basarse en un enfoque de hibridación inversa (particularmente en tiras de Ensayo de Sondas en Líneas, como se describe por Stuyver et al., 1993). Usando esta tecnología, es posible obtener de forma conveniente todos los datos esenciales en un experimento de ensayo. Para lograr esta meta, es necesario diseñar y ensamblar un 20 conjunto de sondas que pueden detectar todas las mutaciones relevantes y posiblemente también secuencias de tipo salvaje o polimorfismos en las regiones de interés del gen de HBV.

También se describe aquí un método para determinar la presencia o ausencia de uno o más mutantes de HBV en una muestra biológica, que comprende:

(i) si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en la muestra; 25

(ii) si es necesario, amplificar la parte relevante de un gen de HBV adecuado presente en dicha muestra con al menos un par de cebadores adecuados;

(iii) hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con al menos dos sondas nucleotídicas que se hibridan específicamente a una secuencia diana mutante de HBV, escogida del gen pol de RT de HBV a partir de la Figu-ra 1, aplicándose dichas sondas a localizaciones conocidas sobre un soporte sólido, y siendo capaces dichas 30 sondas de hibridarse a los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) en las mismas condiciones de hibridación y de lavado, o hibridándose dichas sondas específicamente con una secuencia complementaria a cualquiera de di-chas secuencias diana, o una secuencia en la que T de dicha secuencia diana se sustituye por U, y compren-diendo posiblemente también dicho conjunto de sondas una o más sondas de HBV de tipo salvaje que se co-rresponden con la secuencia diana de HBV mutado respectiva; 35

(iv) detectar los híbridos formados en la etapa (iii);

(v) inferir el mutante o mutantes de HBV presentes en dicha muestra a partir de la señal o señales de hibridación diferenciales obtenidas en la etapa (iv).

Se entenderá que la expresión “secuencia diana mutante” no sólo cubre la secuencia que contiene una muta-ción, sino también la secuencia de tipo salvaje correspondiente. La secuencia diana mutante de HBV descrita aquí pue-40 de ser cualquier secuencia que incluye un codón mutado de HBV conocido en la técnica, o aún por descubrir. Más abajo se exponen regiones diana mutantes de HBV particularmente preferidas.

A fin de resolver el problema citado anteriormente de la obtención de información sobre los aspectos esencia-les para el diagnóstico apropiado de HBV (a saber, genotipo y diferentes mutaciones, mutaciones de escape de vacuna y mutaciones del gen de RT seleccionadas mediante tratamiento con fármacos tales como lamivudina y penciclovir), la 45 presente invención proporciona una forma particularmente elegante de obtener tal información compleja.

Además, el análisis cuidadoso de los datos obtenidos mediante los presentes inventores reveló claramente que la combinación de la información referente a los mutantes de escape con los datos sobre el genotipo es esencial para permitir la interpretación adecuada de los resultados. Por tanto, es altamente ventajoso ser capaces de producir simultáneamente todos los datos relevantes. 50

En este método para diagnosticar mutantes de HBV en combinación con el genotipado de HBV, se puede usar un conjunto de sondas seleccionadas como se define anteriormente, en el que dicho conjunto de sondas se carac-teriza por elegirlas de forma que, para una mutación de HBV dada, se incluyen las siguientes sondas en dicho conjunto:

- al menos una sonda para detectar la presencia del nucleótido o nucleótidos mutados en dicha posición;

- al menos una sonda para detectar la presencia del nucleótido o nucleótidos de tipo salvaje en dicha posición;

- posiblemente también una sonda o sondas adicionales para detectar polimorfismos de tipo salvaje en posiciones que rodean a la posición de la mutación.

La inclusión de estos dos últimos tipos de sondas contribuye enormemente a incrementar la sensibilidad de dichos en-5 sayos, según se demuestra en la sección de ejemplos.

Adicionalmente, se describe aquí al menos una sonda, preferiblemente al menos dos sondas, que caracteri-zan la presencia de una mutación en la región del gen pol de RT de HBV, que da lugar a resistencia a fármacos tales como lamivudina y penciclovir, por ejemplo la mutación de M a V o a I en la posición 552 (en el motivo YMDD), la muta-ción de V a I en la posición 555, la mutación de F a L en la posición 514, la mutación de V a L en la posición 521, la 10 mutación de P a L en la posición 525, y la mutación de L a M en la posición 528 (véase la Figura 1).

Se describe además una combinación de al menos dos sondas oligonucleotídicas, y dicha combinación de sondas se hibrida específicamente a al menos dos de los siguientes grupos de secuencias diana:

una secuencia diana mutante escogida de la región del gen pol de RT de HBV,

una secuencia diana mutante escogida de la región de HBsAg de HBV, 15

una secuencia diana específica de un genotipo de HBV a partir de la secuencia del gen pol de RT de HBV.

Por ejemplo, se describe aquí la hibridación con al menos una sonda nucleotídica que se hibrida específica-mente a una secuencia diana específica de un genotipo escogida de la Figura 1, y al menos una sonda nucleotídica que se hibrida específicamente a una secuencia diana mutante de HBV escogida de la Figura 1.

Se describe aquí además la hibridación con al menos una sonda nucleotídica que se hibrida específicamente 20 a una secuencia diana específica de un genotipo escogida de la Figura 1, y al menos una sonda nucleotídica que se hibrida específicamente a una secuencia diana mutante de HBV escogida de la región del gen pol de RT como se re-presenta en la Figura 1.

Se describe aquí además la hibridación con al menos una sonda nucleotídica que se hibrida específicamente a una secuencia diana específica de un genotipo escogida de la Figura 1, y al menos una sonda nucleotídica que se 25 hibrida específicamente a una secuencia diana mutante de escape de vacuna de HBV en la región de HBsAg según se representa en la Figura 1.

Por ejemplo, se describe además la hibridación con al menos una sonda que se hibrida específicamente a una secuencia diana mutante procedente de la región del gen pol de RT de HBV, y al menos una sonda que se hibrida específicamente a una secuencia diana mutante procedente de la región de HBsAg de HBV, y al menos una sonda que 30 se hibrida específicamente a una secuencia diana específica de un genotipo a partir de la región de HBsAg de HBV. Según esta realización, la parte relevante del genoma de HBV se puede amplificar mediante uso de un par de cebado-res, por ejemplo HBPr 75 y HBPr 94.

Se describe aquí además un conjunto de sondas como se expone anteriormente, que comprende al menos una, preferiblemente al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más sondas para seleccionar como dianas uno, 35 preferiblemente dos, tres o más cambios nucleotídicos que aparecen en el alineamiento de los genomas de HBV según se escogen a partir del gen pol de RT de HBV y se representan en la Figura 1.

Los conjuntos seleccionados de sondas incluyen sondas derivadas de dos de las mismas regiones o diferen-tes regiones de HBV que contienen nucleótidos mutados de HBV, o además también una tercera (un tercer conjunto de) sonda(s) que caracteriza la presencia de una tercera mutación de HBV en cualquiera de las posiciones mostradas en la 40 Figura 1, o sus combinaciones particulares.

Se describe además un conjunto de sondas que permiten la detección simultánea de mutaciones de HBV en los codones 15, 28 y 29 en la región de preCore, en combinación con mutaciones en las regiones promotoras de preCo-re, en combinación con mutaciones en los codones 122, 126, 141, 143, 144, 145 en la región de HBsAg, posiblemente también en combinación con mutaciones en el gen pol de HBV en los codones 514, 521, 525, 528, 552 ó 555. 45

En los casos en los que se cita aquí el alineamiento de genomas de HBV de la Figura 1, se debería de inter-pretar referido a un alineamiento de todos los genomas de HBV existentes y futuros. Las secuencias genómicas de HBV existentes se pueden deducir a partir de cualquier base de datos, tales como la base de datos EMBL/NCBI/DDBJ/GENBANK.

Un conjunto de sondas de preCore, preS1, HBsAg y del gen pol de RT son las sondas con SEC ID NO 1 a 50 278 de la Tabla 1 (véase también la Figura 1).

En la Figura 2 y en la Figura 4 se muestran conjuntos específicos de sondas a este respecto. Las sondas en la Figura 2 y en la Figura 4 se conservaron después de una primera selección en busca de sondas preCore, preS1, HBsAg y RT pol.

Las sondas de la invención se diseñan para obtener un comportamiento óptimo bajo las mismas condiciones de hibridación, de forma que se pueden usar en conjuntos de al menos dos sondas para la hibridación simultánea. Esto 5 incrementa enormemente la utilidad de estas sondas, y da como resultado una ganancia significativa de tiempo y traba-jo. Evidentemente, cuando se prefirieran otras condiciones de hibridación, todas las sondas se deberían de adaptar en consecuencia añadiendo o suprimiendo un número de nucleótidos en sus extremidades. Se entendería que estas adap-taciones concomitantes deberían de dar lugar a esencialmente el mismo resultado, a saber, que las sondas respectivas todavía se hibridan específicamente a la diana definida. Tales adaptaciones también pueden ser necesarias si el mate-10 rial amplificado debiera ser de naturaleza de ARN y no ADN, como en el caso para el sistema NASBA.

La selección de las sondas preferidas de la presente invención se basa en un formato de ensayo de hibrida-ción inversa que usa sondas oligonucleotídicas inmovilizadas presentes en distintas localizaciones sobre un soporte sólido. Más particularmente, la selección de sondas preferidas de la presente invención se basa en el uso del principio del Ensayo de Sondas en Líneas (LiPA), que es un ensayo de hibridación inversa que usa sondas oligonucleotídicas 15 inmovilizadas como líneas paralelas sobre una tira de soporte sólido (Stuyver et al. 1993; Solicitud Internacional WO 94/12670). Este enfoque es particularmente ventajoso puesto que es rápido y simple de hacer. El formato de hibridación inversa, y más particularmente el enfoque de LiPA, tiene muchas ventajas prácticas en comparación con otras técnicas de ADN o formatos de hibridación, especialmente cuando el uso de una combinación de sondas es preferible o inevita-ble para obtener la información relevante buscada. 20

Se entenderá, sin embargo, que cualquier otro tipo de ensayo o formato de hibridación que use cualquiera de las sondas seleccionadas como se describe posteriormente en la invención también está cubierto por la presente inven-ción.

El enfoque de hibridación inversa implica que las sondas se inmovilizan a ciertas localizaciones sobre un so-porte sólido, y que el ADN diana se marca a fin de permitir la detección de los híbridos formados. 25

Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los términos y expresiones usados en la presente invención.

La expresión “análisis genético” se refiere al estudio de la secuencia nucleotídica del genoma de HBV me-diante cualquier técnica apropiada.

La expresión “mutante de HBV” se refiere a cualquier cepa de HBV que posee variaciones genómicas con consecuencias serológicas, genéticas o clínicas. 30

La expresión “mutante de escape de vacuna” se repasa en la sección de introducción y en el Ejemplo 7. La región más importante cae entre los aminoácidos 124 y 147 de la región de HBsAg, pero se puede extender desde el aminoácido 114 hasta el 150.

La expresión “mutante resistente a fármacos tales como lamivudina y penciclovir” se repasa en la sección de introducción y en el Ejemplo 8. 35

La expresión “genotipo de HBV” se refiere a cepas de HBV con una variación intergenotípica de 8% o más, basado en la comparación de genomas completos.

El material diana en las muestras a analizar puede ser ADN o ARN, por ejemplo ADN genómico, ARN mensa-jero, ARN vírico o sus versiones amplificadas. Estas moléculas también se denominan ácidos polinucleicos.

Es posible usar moléculas de ADN genómico o de ARN a partir de muestras susceptibles de contener HBV 40 en los métodos según la presente invención.

Existen procedimientos de extracción y purificación bien conocidos para el aislamiento de ARN o ADN proce-dente de una muestra (véase en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Har-bour Laboratory Press (1989)).

El término “sonda” se refiere a oligonucleótidos específicos de una secuencia monocatenarios que tienen una 45 secuencia que es complementaria a la secuencia diana a detectar.

La expresión “secuencia diana”, como se cita en la presente invención, describe la secuencia nucleotídica de una parte de una secuencia génica de HBV de tipo salvaje, polimórfica o mutante a detectar específicamente mediante una sonda según la presente invención. La secuencia polimórfica puede englobar uno o más nucleótidos polimórficos; la secuencia mutante puede englobar uno o más nucleótidos que son diferentes de la secuencia de tipo salvaje. Se enten-50 derá que la expresión “secuencia diana mutante” no sólo cubre la secuencia que contiene una mutación, sino también la secuencia de tipo salvaje correspondiente. Las secuencias diana se pueden referir generalmente a posiciones nucleotí-dicas individuales, posiciones de codón, nucleótidos que codifican aminoácidos, o a secuencias que se expanden a

cualquiera de las posiciones anteriores. En la presente invención, dicha secuencia diana incluye a menudo una, dos o más posiciones nucleotídicas variables. En la presente invención, los ácidos polinucleicos detectados por las sondas de la invención comprenderán la secuencia diana frente a la cual se detecta la sonda.

Se entenderá que el complemento de dicha secuencia diana es también una secuencia diana adecuada en algunos casos. Las secuencias diana como se definen en la presente invención proporcionan secuencias que deberían 5 ser al menos complementarias a la parte central de la sonda que se diseña para hibridarse específicamente a dicha región diana. En la mayoría de los casos, la secuencia diana es completamente complementaria a la secuencia de la sonda.

El término “complementaria”, como se usa aquí, significa que la secuencia de la sonda monocatenaria es exactamente el complemento (inverso) de la secuencia de la diana monocatenaria, definiéndose además la diana como 10 la secuencia en la que está localizada la mutación a detectar.

Puesto que la aplicación actual requiere la detección de desemparejamientos de pares de bases individuales, se requieren condiciones restrictivas para la hibridación, permitiendo sólo en principio la hibridación de secuencias exac-tamente complementarias. Sin embargo, son posibles variaciones en la longitud de las sondas (véase más abajo). Tam-bién se debería observar que, puesto que la parte central de la sonda es esencial para sus características de hibrida-15 ción, se pueden permitir desviaciones posibles de la secuencia de la sonda frente a la secuencia diana hacia la cabeza y la cola de la sonda cuando se usan secuencias de sondas más largas. Estas variaciones, que se pueden concebir a partir del conocimiento normal en la técnica, sin embargo siempre se deberían de evaluar experimentalmente, a fin de comprobar si dan como resultado características de hibridación equivalentes como las sondas exactamente complemen-tarias. 20

Preferiblemente, las sondas de la invención tienen una longitud de alrededor de 5 a 50 nucleótidos, más pre-feriblemente de alrededor de 10 a 25 nucleótidos. Las longitudes particularmente preferidas de las sondas incluyen 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 nucleótidos. Los nucleótidos como se usan en la presente invención pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados tales como inosina o nucleótidos que contienen grupos modificados que no alteran esencialmente sus características de hibridación. 25

Las secuencias de sondas se representan a lo largo de la memoria descriptiva como oligonucleótidos de ADN monocatenarios a partir del extremo 5’ hacia el extremo 3’. Es obvio para la persona experta en la técnica que cualquie-ra de las sondas especificadas anteriormente se puede usar como tal, o en su forma complementaria, o en su forma de ARN (en la que T se sustituye por U).

Las sondas según la invención se pueden preparar clonando plásmidos recombinantes que contienen inser-30 tos, que incluyen las secuencias nucleotídicas correspondientes, si es necesario escindiendo estas últimas de los plásmidos clonados al usar nucleasas adecuadas y recuperándolos, por ejemplo mediante fraccionamiento según el peso molecular. Las sondas según la presente invención también se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo me-diante el método de fosfotriéster convencional.

La expresión “soporte sólido” se puede referir a cualquier sustrato al que se puede acoplar una sonda oligo-35 nucleotídica, con la condición de que retenga sus características de hibridación, y con la condición de que el nivel de fondo de la hibridación siga siendo bajo. Habitualmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una mem-brana (por ejemplo nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla) o un chip. Antes de la aplicación a la membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico a fin de facilitar la fijación o mejorar la eficacia de la hibridación. Tales modificaciones pueden englobar la terminación mediante homopolímeros, el acoplamiento con dife-40 rentes grupos reactivos tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxílicos, o el acoplamiento con biotina, haptenos o proteínas.

El término “marcado” se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. El marcaje se puede llevar a cabo me-diante el uso de nucleótidos marcados incorporados durante la etapa de polimerasa de la amplificación tal como se ilustra por Saiki et al. (1988) o Bej et al. (1990), o cebadores marcados, o mediante cualquier otro método conocido por 45 la persona experta en la técnica. La naturaleza del marcador puede ser isotópica (32P, 35S, etc.) o no isotópica (biotina, digoxigenina, etc.).

El término “cebador” se refiere a una secuencia nucleotídica monocatenaria capaz de actuar como punto de iniciación para la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a la hebra de ácido nucleico a copiar. La longitud y la secuencia de tal cebador debe ser tal que permitan al cebador sintetizar productos de extensión. 50 Preferiblemente, el cebador tiene una longitud de alrededor de 5-50 nucleótidos. La longitud y secuencia específicas dependerán de la complejidad de las dianas de ADN o ARN requeridas, así como de las condiciones de uso del ceba-dor, tales como temperatura y fuerza iónica.

La expresión “par de cebadores adecuado” se refiere en esta invención a un par de cebadores que permiten la amplificación de parte o todo el gen de HBV para el que se inmovilizan las sondas. 55

El hecho de que los cebadores de la amplificación no tienen que emparejarse exactamente con la secuencia molde correspondiente para garantizar la amplificación apropiada se documenta ampliamente en la bibliografía (Kwok et al., 1990).

El método de amplificación usado puede ser la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Saiki et al., 1988), la reacción en cadena de ligasa (LCR; Landgren et al., 1988; Wu y Wallace, 1989; Barany, 1991), la amplificación a 5 base de secuencias de ácidos nucleicos (NASBA; Guatelli et al., 1990; Compton, 1991), el sistema amplificación a base transcripción (TAS; Kwoh et al., 1989), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA; Duck, 1990; Walker et al., 1992), o la amplificación por medio de QB replicasa (Lizardi et al., 1988: Lomeli et al., 1989), o cualquier otro método adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico conocido en la técnica.

Los oligonucleótidos usados como cebadores o sondas también pueden comprender análogos nucleotídicos 10 tales como fosforotiatos (Matsukura et al., 1987), alquilfosforotiatos (Miller et al., 1979) o ácidos nucleicos peptídicos (Nielsen et al., 1991; Nielsen et al., 1993), o pueden contener agentes intercalantes (Asseline et al., 1984).

Como la mayoría de otras variaciones o modificaciones introducidas en las secuencias de ADN originales de la invención, estas variaciones necesitarán adaptaciones con respecto a las condiciones bajo las cuales se debería usar el oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados eventuales de la 15 hibridación serán esencialmente los mismos que los obtenidos con los oligonucleótidos sin modificar.

La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa a fin de influir positivamente en las característi-cas tales como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la formación de híbridos, la estabilidad biológica de las moléculas oligonucleotídicas, etc.

La “muestra” puede ser cualquier material biológico tomado directamente del ser humano (o animal) infecta-20 do, o después de cultivarlo (enriquecimiento). El material biológico puede ser, por ejemplo, expectoraciones de cualquier tipo, broncolavados, sangre, tejido de piel, biopsias, esperma, material de cultivo de sangre linfocítica, colonias, cultivos líquidos, muestras fecales, orina, etc.

Los conjuntos de sondas incluirán al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más sondas. Dichas sondas se pueden aplicar en dos o más (posiblemente tantas 25 como sondas haya) posiciones distintas y conocidas sobre un sustrato sólido. A menudo, es preferible aplicar dos o más sondas juntas en una y la misma posición de dicho soporte sólido.

Para diseñar sondas con las características deseadas, se pueden aplicar las siguientes guías útiles conoci-das por la persona experta en la técnica.

Debido a que la extensión y especificidad de las reacciones de hibridación tales como las descritas aquí se 30 ven afectadas por un número de factores, la manipulación de uno o más de esos factores determinará la sensibilidad y especificidad exactas de una sonda particular, ya sea perfectamente complementaria a su diana o no. La importancia y efecto de diversas condiciones de ensayo, explicadas posteriormente aquí, son conocidos por los expertos en la técnica.

La estabilidad del híbrido de ácido nucleico [sonda:diana] se debería de elegir para que sea compatible con las condiciones del ensayo. Esto se puede lograr evitando largas secuencias ricas en AT, terminando los híbridos con 35 pares de bases G:C, y diseñando la sonda con una Tm apropiada. Los puntos de comienzo y final de la sonda se deber-ían de elegir de forma que la longitud y % de GC den como resultado una Tm de alrededor de 2-10ºC mayor que la temperatura a la que se llevará a cabo el ensayo final. La composición de bases de la sonda es significativa, debido a que los pares de bases G-C muestran una mayor estabilidad térmica en comparación con los pares de bases A-T, debi-do a enlace de hidrógeno adicional. De este modo, la hibridación que implica ácidos nucleicos complementarios de 40 mayor contenido de G-C será estable a mayores temperaturas.

Cuando se diseña una sonda, también se deberían tener en cuenta las condiciones tales como la fuerza ióni-ca y la temperatura de incubación en las que se usará una sonda. Se sabe que la hibridación aumentará a medida que aumenta la fuerza iónica de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de los híbridos aumentará al aumentar la fuerza iónica. Por otro lado, los reactivos químicos tales como formamida, urea, DMSO y alcoholes, que destruyen los 45 enlaces de hidrógeno, aumentarán la restricción de la hibridación. La desestabilización de los enlaces de hidrógeno por tales reactivos puede reducir enormemente la Tm. En general, la hibridación óptima para sondas oligonucleotídicas sintéticas de alrededor de 10-50 bases de longitud se produce aproximadamente 5ºC por debajo de la temperatura de fusión para un dúplex dado. La incubación a temperaturas por debajo de la óptima puede permitir que secuencias de bases desemparejadas se hibriden, y por lo tanto puede dar como resultado una especificidad reducida. 50

Es deseable tener sondas que se hibridan solo en condiciones de elevada restricción. En condiciones de ele-vada restricción, sólo se formarán híbridos de ácidos nucleicos altamente complementarios; los híbridos sin un grado suficiente de complementariedad no se formarán. En consecuencia, la restricción de las condiciones de ensayo deter-mina la cantidad de complementariedad necesaria entre dos hebras de ácido nucleico que forman un híbrido. El grado de restricción se elige para maximizar la diferencia de estabilidad entre el híbrido formado con el ácido nucleico diana y 55

el ácido nucleico que no es la diana. En el presente caso, es necesario detectar cambios de pares de bases individua-les, lo que requiere condiciones de restricción muy elevada.

También puede ser importante la longitud de la secuencia de ácido nucleico diana, y, en consecuencia, la longitud de la secuencia de la sonda. En algunos casos, puede haber varias secuencias procedentes de una región particular, que varían en localización y longitud, que producirán sondas con las características de hibridación deseadas. 5 En otros casos, una secuencia puede ser significativamente mejor que otra que difiere simplemente en una única base. Aunque es posible que los ácidos nucleicos que no son perfectamente complementarios se hibriden, el tramo más largo de la secuencia de bases perfectamente complementaria normalmente determinará principalmente la estabilidad del híbrido. Aunque se pueden usar sondas oligonucleotídicas de diferentes longitudes y composición de bases, las sondas oligonucleotídicas preferidas de esta invención tienen una longitud de alrededor de 5 a 50 (más particularmente 10-25) 10 bases, y tienen un tramo suficiente en la secuencia que es perfectamente complementaria a la secuencia de ácido nu-cleico diana.

Se prefieren menos las regiones en el ADN o ARN diana que se sabe que forman estructuras internas fuertes inhibidoras de la hibridación. Igualmente, se deberían evitar las sondas con una autocomplementariedad amplia. Como se explica anteriormente, la hibridación es la asociación de dos hebras sencillas de ácidos nucleicos complementarios 15 para formar una hebra doble enlazada por hidrógeno. Es implícito que si una de las dos hebras está completa o par-cialmente implicada en un híbrido que será menos capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Pueden existir híbridos intramoleculares e intermoleculares formados en la molécula de un tipo de sonda si hay suficiente auto-complementariedad. Tales estructuras se pueden evitar a través de un diseño cuidadoso de las sondas. Diseñando una sonda para que una porción sustancial de la secuencia de interés sea monocatenaria, se puede incrementar enorme-20 mente la velocidad y grado de hibridación. Hay disponibles programas de ordenador para buscar este tipo de interac-ción. Sin embargo, en ciertos casos, puede no ser posible evitar este tipo de interacción.

Las condiciones de hibridación y de lavado estándar se describen en la sección de Materiales y Métodos de los Ejemplos. Otras condiciones son, por ejemplo, 3X SSC (citrato salino sódico), 20% de FA (formamida) desionizada a 50ºC. 25

También se pueden usar otras disoluciones (SSPE (EDTA con fosfato salino sódico), TMACl (cloruro de te-trametilamonio), etc.) y temperaturas, con la condición de que se mantengan la especificidad y sensibilidad de las son-das. Si es necesario, se han de llevar a cabo ligeras modificaciones de las sondas en longitud o en secuencia para mantener la especificidad y sensibilidad requeridas en las circunstancias dadas.

En una realización más preferente, los ácidos polinucleicos mencionados anteriormente procedentes de la 30 etapa (i) o (ii) se hibridan con al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, o más de las sondas específicas de la región diana mencio-nadas anteriormente, preferiblemente con 5 ó 6 sondas, que, tomadas en conjunto, cubren la “región de mutación” del gen de HBV relevante.

La expresión “región de mutación” significa la región en la secuencia génica de HBV relevante en la que está 35 localizada al menos una mutación que codifica un mutante de HBV en una parte preferida de esta región de mutación, representada en la figura 1.

Además de las regiones de mutación como se definen anteriormente, los genomas de tipo salvaje o mutantes de HBV también pueden mostrar variaciones nucleotídicas polimórficas en posiciones distintas de las citadas como posiciones variadas específicas de genotipo o específicas de mutante como se muestra en la Figura 1. 40

Puesto que algunas mutaciones pueden aparecer de forma más frecuente que otras, por ejemplo en ciertas áreas geográficas o en circunstancias específicas (por ejemplo, comunidades más bien cerradas), puede ser apropiado seleccionar sólo mutaciones específicas, usando un conjunto seleccionado de sondas como se indica anteriormente. Esto daría como resultado un ensayo más simple, que cubriría las necesidades en ciertas circunstancias.

A fin de detectar genotipos de HBV y mutantes de HBV con el conjunto seleccionado de sondas oligonucle-45 otídicas, se puede usar cualquier método de hibridación conocido en la técnica (transferencia de punto convencional, transferencia Southern, sándwich, etc.).

Sin embargo, a fin de obtener resultados rápidos y fáciles si está implicada una multitud de sondas, puede ser más conveniente un formato de hibridación inversa.

En una realización preferida, el conjunto seleccionado de sondas se inmoviliza a un soporte sólido en locali-50 zaciones distintas conocidas (puntos, líneas, u otras figuras). En otra realización preferida, el conjunto seleccionado de sondas se inmoviliza a una tira de membrana en forma de línea. Dichas sondas se pueden inmovilizar individualmente o como mezclas para delinear localizaciones sobre el soporte sólido.

Una realización específica y muy fácil de usar del método preferente mencionado anteriormente es el método de LiPA, en el que el conjunto de sondas mencionado anteriormente se inmoviliza en líneas paralelas sobre una mem-brana, como se describe posteriormente en los ejemplos.

La invención también proporciona un conjunto de cebadores que permiten la amplificación de la región del gen de HBV respectivo a detectar por medio de sondas. En la Tabla 1 y en la Figura 1 se dan ejemplos de tales cebado-5 res de la invención.

Los cebadores se pueden marcar con un marcador de elección (por ejemplo biotina). Se pueden usar diferen-tes sistemas de amplificación diana a base de cebadores, y preferiblemente amplificación mediante PCR, como se ex-pone en los ejemplos. Se puede usar PCR de una sola ronda o anidada.

La invención también proporciona un kit de ensayo según la reivindicación 3. 10

La expresión “tampón de hibridación” significa un tampón que permite que se produzca una reacción de hibri-dación entre las sondas y los ácidos polinucleicos presentes en la muestra, o los productos amplificados, en las condi-ciones de restricción apropiadas.

La expresión “disolución de lavado” significa una disolución que permite lavar los híbridos formados en las condiciones de restricción apropiadas. 15

Como se ilustra en la sección de Ejemplos, se diseñó un ensayo de sondas en líneas (LiPA) para identificar genotipos de HBV y/o mutantes de HBV. El principio del ensayo se basa en una hibridación inversa de un fragmento de ácido polinucleico amplificado, tal como un fragmento de PCR biotinilado del gen de HBV sobre oligonucleótidos cortos. Este último híbrido se puede detectar entonces, vía un acoplamiento de biotina-estreptavidina, con un sistema de desa-rrollo del color no radioactivo. 20

Los siguientes ejemplos sólo sirven para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS Y DE LAS TABLAS

Figura 1: Alineamiento de 35 genomas de HBV completos. Los aislados que pertenecen al genotipo A son: HBVXCPS, HBVADW, HVHEPB, S50225, HPBADWZCG; genotipo B: HPBADW3, HPBADWZ, HPBADW1, 25 HPBADW2; genotipo C: HPBCGADR, HBVADRM, HPBADRA, HPBCG, HEHBVAYR, HBVADR, HBVADR4, HPBADR1C, HPBADRC, HBVPREX, HPBETNC, HHVBC, HHVCCHA; genotipo D: HBVAYWMCG, HBVAYWC, HBVAYWCI, HBVAYWE, HBVDNA, HPBHBVAA, XXHEPAV, HBVORFS; genotipo E: HHVBE4, HHVBBAS; y genotipo F: HHBF, HHVBFFOU, HBVADW4A. Para conservar el alineamiento, se crearon varios saltos en el ali-neamiento, y se indican con /. Se indican las posiciones del comienzo y final de los diferentes genes codificados 30 de HBV: HBsAg: antígeno de superficie de la hepatitis B (antígeno de superficie pequeño); HBx: proteína X de la hepatitis B; HB Pol: proteína polimerasa de la hepatitis B, que codifica una proteína terminal, un espaciador, una región de RT/ADN polimerasa, y una actividad de ARNasa H; HBcAg: antígeno del núcleo de la hepatitis B; HBpreS1Ag: antígeno preS1 de la hepatitis B (antígeno de superficie grande); HBpreS2Ag: antígeno preS2 de la hepatitis B (antígeno de superficie medio). La posición de los cebadores de la PCR se indica con una gran caja a 35 lo largo de las 35 secuencias. La polaridad del cebador de la PCR se puede deducir a partir de la posición del nombre encima de estas cajas: izquierda = cebador antisentido; derecha = cebador sentido. Las sondas de LiPA se indican con cajas pequeñas; los números de las sondas se indican próximos a las sondas o a la derecha del alineamiento, y corresponden a los números de sondas en la Tabla 1.

Figura 2: Diseño de LiPA para HBV. Se detalla el contenido de una tira de LiPA para HBV. Para cada número de 40 línea, se indica la región en el genoma vírico, junto con el genotipo que se detecta, el número de sonda que co-rresponde con las cajas del alineamiento en la Figura 1, y la secuencia de la sonda.

Figura 3: Resultado combinado de la determinación genotípica en el barrido de la región de preS1 y de preCore en 24 muestras. La interpretación de cada muestra se da bajo cada tira. Las reactividades de las sondas en las líneas 3 a 14 se obtienen a partir del fragmento de PCR de preS1; la reactividad de las sondas en las líneas 15 a 45 27 son debidas al fragmento de PCR de preCore. Los genotipos se indican de A a F. La interpretación para la re-gión de preCore es la siguiente: W = tipo salvaje; M = mutante; I = indeterminada, queriendo decir que no se ob-serva reactividad, lo que es debido a mutaciones que todavía no se pudieron detectar con las sondas seleccio-nadas; mix = mezcla de tipo salvaje y mutante; la interpretación del codón 15 es sólo relevante para el genotipo A, la ausencia de reactividad en HBPr 45 para los genotipos B a F no es útil según se indica con – (no aplicable). 50 Puesto que la presencia o ausencia de mutaciones de preCore tiene efecto sobre el estado serológico de HBe-Ag, esto también se indica.

Figura 4: Sondas usadas en LiPA para HBV. Las sondas se diseñaron para genotipar en la región de HBsAg, y para la detección de mutaciones resistentes a fármacos en el motivo YMDD (véase también la Figura 5), así co-mo para la detección de mutaciones en la región de preCore (véase también la Figura 6). 55

Figura 5: Ejemplo de un ensayo de LiPA que combina el genotipado de HBV en la región de HBsAg y la detec-ción de mutaciones resistentes a fármacos en el motivo YMDD. Los genotipos se indican de A a F. El diseño de la tira se muestra a la derecha, correspondiendo los números de las sondas a los números en la Tabla 1 y en la Figura 4. Los genotipos y los motivos mutantes a los que se hibrida cada sonda se escriben en la parte derecha más externa. La combinación de sondas reactivas permite la determinación de un genotipo único. 5

Figura 6: Ejemplo de la determinación de mutaciones de preCore mediante la técnica de LiPA. El diseño de la tira se muestra a la derecha, correspondiendo los números de las sondas a los números en la Tabla 1. Las secuen-cias diana mutantes a las que se hibridan las sondas se indican en la parte derecha más externa. El motivo M2 corresponde a una mutación en el codón 28, M4 corresponde a una mutación en el codón 29. M2/M4 tiene muta-ciones tanto en 28 como en 29. 10

Figura 7: Detección de una mutación en el motivo YMDD de pol de HBV al tratar con lamivudina. La gráfica muestra el paso del tiempo de la carga viral durante el tratamiento con lamivudina. A la derecha se muestran ti-ras de LiPA, que corresponden a ensayos al comienzo del tratamiento (5/95), 10 meses de tratamiento (2/96) y 14 meses de tratamiento (6/96). El ensayo muestra que durante el tratamiento el motivo YMDD muta a YVDD.

Tabla 1: Repaso de todos los cebadores y sondas citados en las Figuras con una indicación de sus SEC ID 15 NO respectivas y la región del genoma de HBV para la que se diseñan. Los cebadores de la región de PreS1 incluyen 1, 106, 2 (cebadores sentido) y 4, 107 y 3 (cebadores antisentido). Los cebadores procedentes de la región de HBsAg incluyen 75 y 104 (cebadores sentido) y 76, 94 y 105 (cebadores antisentido). Los cebadores procedentes de la región de preCore incluyen 5, 6, 69, 70, 84, 86, 87 y 108 (cebadores sentido) y 7, 8, 85 y 109 (cebadores antisentido). Los oligonucleótidos que quedan son sondas procedentes de las regiones de PreCore, PreS1, HBsAg y del gen pol RT de 20 HBV, como se indica. El motivo YMDDV y sus mutantes consisten en aminoácidos 551 a 555 de la proteína RT pol; la secuencia MGVGL y su mutante consiste en aminoácidos 519 a 523 de la proteína RT pol; la secuencia SPFLL y sus mutantes y variantes genotípicas consisten en aminoácidos 524 a 528 de la proteína RT pol.

Tabla 1: Diseño de sondas y cebadores de HBV

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr1

GGGTCACCATATTCTTGGG 1 Cebador de preS1 sentido

HBPr2

GAACAAGAGCTACAGCATGGG 2 Cebador de preS1 sentido

HBPr3

CCACTGCATGGCCTGAGGATG 3 Cebador de preS1 anti-sentido

HBPr4

GTTCCT/GGAACAGGGCGCCACCAG 4 Cebador de preS1 anti-sentido

HBPr5

TCTTTGTATTAGGAGGCTGTAG 5 Cebador de pre-Core sentido

HBPr6

GCTGTAGGCATAAATTGGTCTG 6 Cebador de pre-Core sentido

HBPr7

CTCCACAGT/AAGCTCCAAATTC 7 Cebador de preCo-re anti-sentido

HBPr8

GAAGGAAAGAAGTCAGAAGGC 8 Cebador de preCo-re anti-sentido

HBPr9

TGGCTTTGGGGCATGG 9 preCore

HBPr10

TGGCTTTAGGGCATGG 10 preCore

HBPr11

TGGCTTTAGGACATGG 11 preCore

HBPr12

AAGTTGCATGGTGCTG 12 preCore

HBPr13

CACCTCTGCCTAATCAT 13 preCore

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr14

TGGGGTGGAGCCCTCAG 14 preS1

HBPr15

CCCACCAGCCAACCAG 15 preS1

HBPr16

CCCATGGGGGACTGT 16 preS1

HBPr17

AACCCCAACAAGGATG 17 preS1

HBPr18

TCCACCAGCAATCCT 18 preS1

HBPr19

TGGGGGAAGAATATTT 19 preS1

HBPr20

AAATTCCAGCAGTCCC 20 preS1

HBPr21

GTTCCCMCCCTCTGG 21 preS1

HBPr22

MCCTCGCMAGGCAT 22 preS1

HBPr23

TGCATTCAAAGCCAAC 23 preS1

HBPr24

TACTCACAACTGTGCC 24 preS1

HBPr25

ACCCTCCGTTCGGAGC 25 preS1

HBPr26

CACGAAGACAGCCTAC 26 preS1

HBPr27

GATCCAGCCTTCAGAG 27 preS1

HBPr28

ATGCTCCAGCTCCTAC 28 preS1

HBPr29

GCTTTCTTGGACGGTC 29 preS1

HBPr30

CTACCCCAATCACTCC 30 preS1

HBPr31

AGCACCTCTCTCAACG 31 preS1

HBPr32

CCAATGGCAAACAAGG 32 preS1

HBPr33

CTGACGGCTCCACCCCA 33 preS1

HBPr34

ATGCMCTTTTTCACC 34 preCore

HBPr35

ATCTCTTGTACATGTC 35 preCore

HBPr36

ATCTCATGTTCATGTC 36 preCore

HBPr37

CAGTGGGACATGTACA 37 preCore

HBPr38

CAGTAGGACATGAACA 38 preCore

HBPr39

CTGTTCAAGCCTCCAA 39 preCore

HBPr40

AGCCTCCAAGCTGTGC 40 preCore

HBPr41

AAAGCCACCCAAGGCA 41 preCore

HBPr42

TGGCTTTAGGACATGGA 42 preCore

HBPr43

GACATGTACAAGAGATGA 43 preCore

HBPr44

GACATGAACATGAGATCA 44 preCore

HBPr45

TGTACATGTCCCACTGTT 45 preCore

HBPr46

TGTTCATGTCCTACTGTT 46 preCore

HBPr47

ACTGTTCAAGCCTCCAAG 47 preCore

HBPr48

GGCACAGGCTTGGAGGCIT 48 preCore

HBPr49

AAAGCCACCCAAGGCACA 49 Precore

HBPr50

CCCACACGGTTGGGAAC 50 preS1

HBPr51

CAGCATGGGGCAGAATCT 51 preS1

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr52

TCCACCAGCAATCCTCTG 52 preS1

HBPr53

GGATCCAGCCTTCACAGC 53 preS1

HBPr54

TCAGGAAGACAGCCTAC 54 preS1

MBPr55

TTCAACCCCAACAAGGATC 55 preS1

HBPr56

AATGCTCCAGCTCCTAC 56 preS1

HBPr57

CTGCATTCAAAGCCAACT 57 preS1

HBPr58

CCCCATGGGGGACTGTTG 58 preS1

HBPr59

CATACTCACAACTGTGCCA 59 preS1

HBPr60

GGGCTTTCTTGGACGGTCC 60 preS1

HBPr61

CTCTCGAATGGGGGAAGA 61 preS1

HBPr62

CCTACCCCAATCACTCCA 62 preS1

HBPr63

ACCACCTCTCTCAACGACA 63 preS1

HBPr64

GCAAATTCCAGCAGTCCCG 64 preS1

HBPr65

GCCAATCGCAAACAAGGTA 65 preS1

HBPr66

GACATGAACATGACATG 66 preCore

HBPr67

GGACATCAACAAGAGAT 67 preCore

HBPr68

GACATGTACAAGAGATG 68 preCore

HBPr69

ACATAAGAGGACTCTTGGAC 69 Cebador de pre-Core sentido

HBPr70

TACTTCAAAGACTGTGTGTTTA 70 Cebador de preCo-re sentido

HBPr71

ACAAAGACCTTTAAC/TCT 71 Promotor de pre-Core

HBPr72

ACAAAGATCATTAAC/TCT 72 Promotor de pre-Core

HBPr73

TTCCACCAGCAATCCTC 73 preS1

HBPr74

GATCCAGCCTTCAGAGC 74 preS1

HBPr75

CAAGGTAGTTGCCCGTTTGTCC 75 Cebador de HBsAg sentido

HBPr76

CCAAACAGTGGGGGAAGCCC 76 Cebador de HBsAg anti-sentido

HBPr77

CTACGGATGGAATTTGC 77 codón 115 de HBsAg de tipo salvaje

HBPr78

TACGGACGGAAACTGC 78 codón 145 de HBsAg de tipo salvaje

HBPr79

TTCGGACGGAAACTGC 79 codón 145 de

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBsAg de tipo salvaje

HBPr80

CTTCGGACGGAAATTGC 80 codón 145 de HBsAg de tipo salvaje

HBPr81

CTACGGATAGAAATTGC 81 codón 145 de HBsAg mutante

HBPr82

CTTCGGACAGAAATTGC 82 codón 145 de HBsAg mutante

HBPr83

CTATGGGAGTGGGCCTCAGT/CC 83 Pol de HB

HBPr84

GCTGTAGGCATAAATTGGTCTG 84 Cebador de pre-Core sentido

HBPr85

CTCCACAGT/AAGCTCCAAATTC 85 Cebador de preCo-re anti-sentido

HBPr86

ACATAAGAGGACTCTTGGAC 86 Cebador de pre-Core sentido

HBPr87

TACTTCAAGGACTGTGTGTTTA 87 Cebador de pre-Core sentido

HBPr88

TAGGTTAAAGGTCTTTGT 88 Promotor de pre-Core

HBPr89

TAGGTTAATCATCTTTGT 89 Promotor de pre-Core

HBPr90

CATGTCCCACTGTTCAA 90 preCore

HBPr91

CATGTCCTACTGTTCAA 91 preCore

HBPr92

TTCTGCCCCATGCTGTA 92 preS1

HBPr93

TTCTCCCCCATGCTGTAC 93 preS1

HBPr94

GGTAA/TAAAGGGACTCAC/AGATG 94 Cebador de HBsAg anti-sentido

HBPr95

TCACCTATATGGATGAT 95 Pol de HB

HBPr96

CAGCTATATGGATGAT 96 Pol de HB

HBPr97

TTCAGCTATATGGATG 97 Pol de HB

HBPr98

TCAGTTATATGGATGAT 98 Pol de HB

HBPr99

TTTCAGTTATATGGATG 99 Pol de HB

HBPr100

TTTAGTTATATGGATGA 100 Pol de HB

HBPr101

TCAGCTATGTGGATGAT 101 Pol de HB

HBPr102

TCAGTTATGTGGATCAT 102 Pol de HB

HBPr103

TTTCAGCTATGTGGATG 103 Pol de HB

HBPr104

CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 104 Cebador de HBsAg

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

sentido

HBPr105

GGT/CAA/TAAACGGACTCAC/AGATG 105 Cebador de HBsAg anti-sentido

HBPr106

GGGTCACCATATTCTTGGG 106 Cebador de preS1 sentido

HBPr107

GTTCCT/GGAACTGGAGCCACCAG 107 Cebador de preS1 anti-sentido

HBPr108

CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATC 108 Cebador de pre-Core sentido

HBPr109

CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAATGTTGCATGGTGCTGG 109 Cebador de preCo-re anti-sentido

HBPr110

CCTCTGCCGATCCATACTGCGGAAC 110 Cebador de prex sentido

HBPr111

CTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTTC 111 Cebador de Core de HB anti-sentido

HBPr112

TGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGC 112 Cebador de HBPsAg sentido

HBPr113

CCGGCAGATGAGAAGGCACAGACGG 113 Cebador de HBX antisentido

HBPr114

TTCAGCTATATGGATGAT 114 Motivo YMDD

HBPr115

TCAGCTATATGCATGATG 115 Motivo YMDD

HBPr116

TTCAGCTATGTGGATGAT 116 Motivo YMDD

HBPr117

TCAGCTATGTGGATGATG 117 Motivo YMDD

HBPr118

GGCTTTGGGGCATGG 118 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje

HBPr119

TGGCTTTGGGGCATG 119 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje

HBPr120

GTGGCTTTGGGGCATG 120 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje

HBPr121

GGCTTTGGGCCATGGA 121 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje

HBPr122

TGGCTTTGGGACATGG 122 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje, codón 29 mutante

HBPr123

GGCTTTGGGACATGG 123 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje, codón 29 mutante

HBPr124

TGGCTTTGGGACATG 124 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje,

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

codón 29 mutante

HBPr125

GTGGCTTTGGGACATG 125 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje, codón 29 mutante

HBPr126

GGCTTTGGGACATGGA 126 codón 28 de preCo-re de tipo salvaje, codón 29 mutante

HBPr127

TCAGTTATATGGATGATG 127 genotipo D de YMDD, tipo salvaje

HBPr128

TTCAGTTATATGGATGAT 128 genotipo D de YMDD, tipo salvaje

HBPr129

TTTCAGTTATATGGATGAT 129 genotipo D de YMDD, tipo salvaje

HBPr130

TCAGTTATGTGGATGATG 130 genotipo D de YMDD, mutante

HBPr131

TTCAGTTATGTGGATGAT 131 genotipo D de YMDD, mutante

HBPr132

TTTCAGTTATGTGGATGAT 132 genotipo D de YMDD, mutante

HBPr133

TTTCAGTTATGTGGATGA 133 genotipo D de YMDD, mutante

HBPr134

TGCTGCTATGCCTCATCTTC 134 Cebador de HBsAg externo sentido

HBPr135

CA(G/A)AGACAAAAGAAAATTGG 135 Cebador de HBsAg externo anti-sentido

HBPr136

CTATGGATGGAAATTGC 136 codón 143 mutante de HBsAg

HBPR137

CCTATGGATGGAAATTG 137 codón 143 mutante de HBsAg

HBPR138

ACCTATGGATGGAAATT 138 codón 143H mutan-te de HBsAg

HBPr139

CT CAA GGC AAC TCT ATG TGG 139 HBsAg, genotipo A

HBPr140

CT CAA GGC AAC TCT ATG GG 140 HBsAg, genotipo A

HBPr141

T CAA GGC AAC TCT ATG TTG 141 HBsAg, genotipo A

HBPr142

ATC CCA TCA TCT TGG G 142 HBsAg, genotipo B

HBPr143

ATC CCA TCA TCT TGG GCG G 143 HBsAg, genotipo B

HBPr144

TC CCA TCA TCT TGG GCG G 144 HBsAg, genotipo B

HBPr145

C CCA TCA TCT TGG GCT GG 145 HBsAg, genotipo B

HBPr146

TTC GCA AAA TAC CTA TGG 146 HBsAg, genotipo B

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr147

T TTC GCA AAA TAC CTA TG 147 HBsAg, genotipo B

HBPr148

CT TTC GCA AAA TAC CTA TG 148 HBsAg, genotipo B

HBPr149

TC GCA AAA TAC CTA TGG G 149 HBsAg, genotipo B

HBPr150

T CTA CTT CCA GGA ACA T 150 HBsAg, genotipo C

HBPr151

T CTA CTT CCA GGA ACA TC 151 HBsAg, genotipo C

HBPr152

CT CTA CTT CCA GGA ACA T 152 HBsAg, genotipo C

HBPr153

CT CTA CTT CCA GGA ACA G 153 HBsAg, genotipo C

HBPr154

C TGC ACG ATT CCT GCT 154 HBsAg, genotipo C

HBPr155

TGC ACG ATT CCT GCT CA 155 HBsAg, genotipo C

HBPr156

C TGC ACG ATT CCT GCT C 156 HBsAg, genotipo C

HBPr157

TGC ACG ATT CCT GCT CAA 157 HBsAg, genotipo C

HBPr158

TTC GCA AGA TTC CTA TG 158 HBsAg, genotipo C

HBPr159

CT TTC GCA AGA TTC CTA T 159 HBsAg, genotipo C

HBPr160

CT TTC GCA AGA TTC CTA 160 HBsAg, genotipo C

HBPr161

CT TTC GCA AGA TTC CTA TG 161 HBsAg, genotipo C

HBPr162

C TCT ATG TAT CCC TCC T 162 HBsAg, genotipo D

HBPr163

TCT ATG TAT CCC TCC TG 163 HBsAg, genotipo D

HBPr164

C TCT ATG TAT CCC TCC TGG 164 HBsAg, genotipo D

HBPr165

CC TCT ATG TAT CCC TCC T 165 HBsAg, genotipo D

HBPr166

C TGT ACC AAA CCT TCG G 166 HBsAg, genotipo D

HBPr167

C TGT ACC AAA CCT TCG 167 HBsAg, genotipo D

HBPr168

GC TGT ACC AAA CCT TCG G 168 HBsAg, genotipo D

HBPr169

TGT ACC AAA CCT TCG GAG 169 HBsAg, genotipo D

HBPr170

GGA CCC TGC CGA ACC T 170 HBsAg, genotipo E

HBPr171

GGA CCC TGC CGA ACC G 171 HBsAg, genotipo E

HBPr172

G GGA CCC TGC CGA AC 172 HBsAg, genotipo E

HBPr173

GGA CCC TGC CGA AC 173 HBsAg, genotipo E

HBPr174

GT TGC TGT TCA AAA CCT T 174 HBsAg, genotipo E

HBPr175

GT TGC TGT TCA AAA CCT G 175 HBsAg, genotipo E

HBPr176

TGT TGC TGT TCA AAA CCT G 176 HBsAg, genotipo E

HBPr177

A TGT TGC TGT TCA AAA CCT G 177 HBsAg, genotipo E

HBPr178

GA TCC ACG ACC ACC A 178 HBsAg, genotipo F

HBPr179

GGA TCC ACG ACC ACC A 179 HBsAg, genotipo F

HBPr180

GGA TCC ACG ACC ACC 180 HBsAg, genotipo F

HBPr181

GA TCC ACG ACC ACC AGG 181 HBsAg, genotipo F

HBPr182

TGT TCC AAA CCC TCG G 182 HBsAg, genotipo F

HBPr183

C TGT TCC AAA CCC TCG 183 HBsAg, genotipo F

HBPr184

C TGT TCC AAA CCC TCG G 184 HBsAg, genotipo F

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr185

GT TCC AAA CCC TCG GAT 185 HBsAg, genotipo F

HBPr186

G CCA AAT CTG TGC AGC 186 HBsAg, genotipo F

HBPr187

CCA AAT CTG TGC AGC AT 187 HBsAg, genotipo F

HBPr188

G CCA AAT CTG TGC AGC AG 188 HBsAg, genotipo F

HBPr189

GG CCA AAT CTG TGC AGC 189 HBsAg, genotipo F

HBPr190

A TCA ACA ACA ACC AGT A 190 HBsAg, genotipo A

HBPr191

GA TCA ACA ACA ACC AGT 191 HBsAg, genotipo A

HBPr192

GA TCA ACA ACA ACC AGT A 192 HBsAg, genotipo A

HBPr193

GGA TCA ACA ACA ACC AGT 193 HBsAg, genotipo A

HBPr194

T CAA GGC AAC TCT ATG TGG 194 HBsAg, genotipo A

HBPr195

AGG TTA AAG GTC TTT GT 195 promotor genotipo A tipo salvaje

HBPr196

T AGG TTA AAG GTC TTT GG 196 promotor genotipo A tipo salvaje

HBPr197

TT AGG TTA AAG GTC TTT 197 promotor genotipo A tipo salvaje

HBPr198

GG TTA AAG GTC TTT GTA GG 198 promotor genotipo A tipo salvaje

HBPr199

AGG TTA ATG ATC TTT GT 199 promotor genotipo A mutante

HBPr200

T AGG TTA ATG ATC TTT GG 200 promotor genotipo A mutante

HBPr201

CT TTC GCA AGA TTC CTA TGG 201 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr202

GCT TTC GCA AGA TTC CTA TG 202 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr202

GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG 203 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr204

CT TTC GCA AGA TTC CTA TGG G 204 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr205

GC TGT ACC AAA CCT TCG GAG 205 codón 140 de geno-tipo D de HBsAg

HBPr206

TGC TGT ACC AAA CCT TCG G 206 codón 140 de geno-tipo D de HBsAg

HBPr207

TGC TGT ACC AAA CCT TCG GAG 207 codón 140 de geno-tipo D de HBsAg

HBPr208

GC TGT ACC AAA CCT TCG GAT 200 codón 140 de geno-tipo D de HBsAg

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr209

TGG TTC GCC GGG CTT T 209 Codón 184 de ge-notipo E de HBsAg

HBPr210

G TGG TTC GCC GGG CTT G 210 Codón 184 de ge-notipo E de HBsAg

HBPr211

GG TTC GCC GGG CTT TC 211 Codón 184 de ge-notipo E de HBsAg

HBPr212

TGG TTC GCC GGG CTT TC 212 Codón 184 de ge-notipo E de HBsAg

HBPr213

AG TGG TTC GCC GGG CTG G 213 Codón 184 de ge-notipo E de HBsAg

HBPr214

A GGA TCC ACC ACC ACC AGG 214 Genotipo F de HBsAg

HBPr215

A GGA TCC ACG ACC ACC AGT 215 Genotipo F de HBsAg

HBPr216

CA GGA TCC ACG ACC ACC AGG 216 Genotipo F de HBsAg

HBPr217

C TGT TCC AAA CCC TCG GAG 217 Genotipo F de HBsAg

HBPr218

C TGT TCC AAA CCC TCG GAT 218 Genotipo F de HBsAg

HBPr219

GC TGT TCC AAA CCC TCG GAG 219 Genotipo F de HBsAg

HBPr220

CTGAACCTTTACCCCGTTGC 220 Cebador potencia-dor

HBPr221

CTCGCCAACTTACAAGGCCTTTC 221 Cebador potencia-dor

HBPr222

AGAATGGCTTGCCTGAGTGC 222 Cebador de Core anti-sentido

HBPr223

GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG G 223 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr224

G GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG 224 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr225

G GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG G 225 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr226

G GCT TTC GCA AGA TTC CTA TGG GA 226 codón 160 de geno-tipo C de HBsAg

HBPr227

C AGC TAT ATG GAT GAT GTG 227 Motivo YMDDV

HBPr228

AGC TAT ATG GAT GAT GTG GG 228 Motivo YMDDV

HBPr229

GC TAT ATG GAT GAT GTG GT 229 Motivo YMDDV

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr230

AGC TAT ATG GAT GAT GTG GT 230 Motivo YMDDV

HBPr231

C AGC TAT ATG GAT GAT ATA 231 MOTIVO YMDDI

HBPr232

AGC TAT ATG GAT GAT ATA GG 232 MOTIVO YMDDI

HBPr233

GC TAT ATG GAT GAT ATA GT 233 MOTIVO YMDDI

HBPr234

AGC TAT ATG GAT GAT ATA GT 234 MOTIVO YMDDI

HBPr235

CCA TCA TCT TGG GCT TG 235 codón 155 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr236

CA TCA TCT TGG GCT TT 236 codón 155 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr237

CCA TCA TCT TGG GCT TT 237 codón 155 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr238

CCA TCA TCT TGG GCT TTC 238 codón 155 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr239

CCC ACT GTC TGG CTT TC 239 codón 190 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr240

CC ACT GTC TGG CTT TC 240 codón 190 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr241

CC ACT GTC TGG CTT T 241 codón 190 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr242

CCC ACT GTC TGG CTT G 242 codón 190 de geno-tipo B de HBsAg

HBPr243

TAT ATG GAT GAT GTG GTA 243 MOTIVO YMDDV

HBPr244

TAT GTG GAT GAT GTG GTA 244 MOTIVO YVDDV

HBPr245

TAT ATA GAT GAT GTG GTA 245 MOTIVO YIDDV

HBPr246

TAT ATT GAT GAT GTG GTA 246 MOTIVO YIDDV

HBPr247

TAT GTA GAT GAT GTG GTA 247 MOTIVO YVDDV

HBPr248

TAT GTT GAT GAT GTG GTA 248 MOTIVO YVDDV

HBPr249

TAT ATG GAT GAT ATA GTA 249 MOTIVO YMDDI

HBPr250

TAT ATG GAT GAT ATC GTA 250 MOTIVO YMDDI

HBPr251

TAT GTG GAT GAT ATA GTA 251 MOTIVO YVDDI

HBPr252

TAT GTG GAT GAT ATC GTA 252 MOTIVO YVDDI

HBPr253

TAT ATA GAT GAT ATA GTA 253 MOTIVO YIDDI

HBPr254

TAT ATA GAT GAT ATC GTA 254 MOTIVO YIDDI

HBPr255

TAT ATT GAT GAT ATA GTA 255 MOTIVO YIDDI

HBPr256

TAT ATT GAT GAT ATC GTA 256 MOTIVO YIDDI

HBPr257

TAT GTA GAT GAT ATA GTA 257 MOTIVO YVDDI

HBPr258

TAT GTA GAT GAT ATC GTA 258 MOTIVO YVDDI

HBPr259

TAT GTT GAT GAT ATA GTA 259 MOTIVO YVDDI

Nombre

Secuencia SEC ID nº Región

HBPr260

TAT GTT GAT GAT ATC GTA 260 MOTIVO YVDDI

HBPr261

TAT ATG GAT GAT CTG GTA 261 MOTIVO YMDDL

HBPr262

TAT GTG GAT GAT CTG GTA 262 MOTIVO YVDDL

HBPr263

TAT ATA GAT GAT CTG GTA 263 MOTIVO YIDDL

HBPr264

TAT ATT GAT GAT CTG GTA 264 MOTIVO YIDDL

HBPr265

TAT GTA GAT GAT CTG GTA 265 MOTIVO YVDDL

HBPr266

TAT GTT GAT GAT CTG GTA 266 MOTIVO YVDDL

HBPr267

T ATG GGA GTG GGC CTC AG 267 MGVGL

HBPr268

T ATG GGA TTG GGC CTC AG 268 MGLGL

HBPr269

C AGT CCG TTT CTC TTG GC 269 SPFLL

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Preparación de ADN de HBV y amplificación mediante PCR

Se recogieron muestras de suero procedentes de individuos positivos a HBsAg, y se almacenaron a menos 20ºC hasta uso en alícuotas de 0,5 ml. Para preparar el genoma vírico, se mezclaron 18 l de suero con 2 l de NaOH 1 5 N, y se incubó a 37ºC durante 60 minutos. La desnaturalización se detuvo y se neutralizó añadiendo 20 l de HCl 0,1 N. Después de la etapa de centrifugación de 15 minutos, el sobrenadante se recogió, y el pelete se desechó. Se llevó a cabo una PCR sobre este lisado según lo siguiente: se mezclaron 32 l de H2O con 5 l de tampón de PCR 10x, 1 l de dXTP 10 mM, 1 l de cada cebador biotinilado (10 pmoles/l), 10 l de lisado sérico, y 2 U de enzima Taq. El esquema de amplificación contenía 40 ciclos de 95ºC durante 1 minuto, hibridación a 45ºC durante 1 minuto, y alargamiento a 10 72ºC durante 1 minuto. Los productos de la amplificación se visualizaron en gel de agarosa al 3%.

El conjunto de cebadores exteriores para preS1 tuvo la siguiente secuencia:

sentido exterior: HBPr 1: 5’-bio-GGGTCACCATATTCTTGGG- 3’

antisentido exterior: HBPr 4: 5’-bio-GTTCC(T/G)GAACTGGAGCCACCAG-3’

El conjunto de cebadores exteriores para preCore tuvo la siguiente secuencia: 15

sentido exterior: HBPr 69: 5’-bio-ACATAAGAGGACTCTTGGAC-3’

antisentido exterior: HBPr 8: 5’-bio-GAAGGAAAGAAGTCAGAAGGC-3’

El conjunto de cebadores exteriores para HBsAg tuvo la siguiente secuencia:

sentido exterior: HBPr 134: 5’-bio-TGCTGCTATGCCTCATCTTC-3’

antisentido exterior: HBPr 135: 5’-bio-CA(G/A)AGACAAAAGAAAATTGG-3’ 20

Las muestras que fueron negativas en la PCR de primera ronda se volvieron a ensayar en una reacción ani-dada compuesta de lo siguiente: l de H2O, 5 l de tampón Taq 10x, 1 l de dXTP 10 mM, 1 l de cada cebador anidado (10 pmoles/l), 1 l del producto de la PCR de primera ronda, y 2 U de Taq polimerasa. El esquema de amplificación fue idéntico al de la PCR de primera ronda. La secuencia de los cebadores anidados fueron las siguientes, para la región de preS1: 25

sentido anidado: HBPr 2: 5’-bio-GAACAAGAGCTACAGCATGGG-3’

antisentido anidado: HBPr 3: 5’-bio-CCACTGCATGGCCTGAGGATG-3’;

y para la región de preCore:

sentido anidado: HBPr 70: 5’-bio-TACTTCAAAGACTGTGTGTTTA-3’

antisentido anidado: HBPr 7: 5’-bio-CTCCACAG(T/A)AGCTCCAAATTC-3’ 30

En una segunda reacción, la región de HBsAg se puede amplificar en un protocolo similar usando los siguien-tes cebadores: HBPr 75: 5’-bio-CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-3’ en combinación con HBPr 76: 5’-bio-CCAAACAGTGGGGGAAAGCCC-3’; o con HBPr 94: 5’-bio-GGTA(A/T)AAAGGGACTCA(C/A)GATG-3’.

Ejemplo 2. Preparación de los Ensayos de Sondas en Líneas

Se diseñaron sondas para cubrir los motivos universales, genotípicos y mutantes. En principio, sólo se retu-vieron sondas que discriminan entre una variación de un solo nucleótido. Sin embargo, para ciertos polimorfismos en los finales extremos de la sonda, se toleró una reactividad cruzada. La especificidad se alcanzó experimentalmente para cada sonda de forma individual después de considerar el % (G + C), la longitud de la sonda, la concentración final, y la temperatura de hibridación. Se proporcionaron sondas optimizadas enzimáticamente con una cola poly-T usando TdT 5 (Pharmacia) en una condición de reacción estándar. De forma breve, se incubaron 400 pmoles de sonda a 37ºC en 30 l de mezcla de reacción que contiene 5,3 mM de dTTP, 25 mM de Tris.HCl pH 7,5, 0,1 M de cacodilato sódico, 1 mM de CoCl2, 0,1 M de DTT y 170 U de desoxinucleotidil transferasa terminal (Pharmacia). Después de una hora de incuba-ción, la reacción se detuvo y las sondas terminadas se hicieron precipitar y se lavaron con etanol enfriado con hielo. Las sondas se disolvieron en 6 x SSC a sus concentraciones específicas respectivamente, y se aplicaron como líneas hori-10 zontales sobre tiras de membrana en concentraciones entre 0,2 y 2,5 pM/ml. Como control positivo, se aplicó en el lado ADN biotinilado (línea 1 de LiPA). Los oligonucleótidos se fijaron a la membrana cociendo a 80ºC durante 12 horas. La membrana se rebanó entonces en tiras de 4 mm. El diseño de esta tira se indica en la Figura 2.

Ejemplo 3. Comportamiento del ensayo de LiPA

Se mezclaron volúmenes iguales (10 l cada uno) del fragmento de PCR biotinilado y de la disolución de 15 desnaturalización (DS; 400 mM de NaOH/10 mm de EDTA) en recipientes de ensayo, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, se añadieron 2 ml de la disolución de hibridación precalentada a 37ºC (HS, 3 x SSC/0,1% de SDS), seguido de la adición de una tira por recipiente de ensayo. La hibridación se produjo durante 1 hora a 50 ± 0,5ºC en un baño de agua agitado cerrado. Las tiras se lavaron dos veces con 2 ml de disolución de lavado res-trictivo (3 x SSC/0,1% de SDS) a temperatura ambiente durante 20 segundos, y una vez a 50ºC durante 30 minutos. 20 Después del lavado restrictivo, las tiras se aclararon dos veces con 2 ml de la disolución de aclarado (RS) estándar de Innogenetics. Las tiras se incubaron en una plataforma giratoria con el conjugado de estreptavidina marcado con fosfa-tasa alcalina, se diluyeron en disolución de conjugado estándar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 a 25ºC). Las tiras se lavaron entonces dos veces con 2 ml de RS y una vez con tampón de sustrato estándar (SB), y se inició la reacción de color añadiendo BCIP y NBT al SB. Después de un máximo de 30 minutos a temperatura ambiente, la reac-25 ción de color se detuvo sustituyendo los compuestos de color por agua destilada. Inmediatamente después de secar, las tiras se interpretaron. Las reactividades se consideraron positivas siempre que la reactividad fue más fuerte que la reac-ción en el control negativo. Las tiras se pueden almacenar en un lugar oscuro seco. El procedimiento completo descrito anteriormente también se puede sustituir por el dispositivo automático estándar Inno-LiPA (auto-LiPA).

Ejemplo 4. Selección de material de referencia. 30

Se prepararon fragmentos de PCR, derivados de miembros de los diferentes genotipos, las diferentes se-cuencias de tipo salvaje y mutante de preCore, motivos resistentes a fármacos y mutantes de escape de vacuna. Los fragmentos de PCR se amplificaron con cebadores que carecen del grupo biotina en su extremo 5’, y se clonaron en el sitio EcoRV pretratado del vector pGEMT (Promega). Los clones recombinantes se seleccionaron después de la com-plementación  y análisis de la longitud de los fragmentos de restricción, y se secuenciaron con cebadores plasmídicos. 35 Otros fragmentos biotinilados se secuenciaron directamente con un protocolo terminador de colorante (Applied Biosys-tems), usando los cebadores de amplificación. Como alternativa, se llevó a cabo una PCR anidada con análogos de los cebadores, en los que el grupo biotina se sustituyó por la secuencia del cebador T7 y SP6, respectivamente. Estos amplicones se secuenciaron entonces con un procedimiento de cebador de colorante de SP6 y T7. Al hacer esto, se preparó un panel de referencia de clones recombinantes, lo que es necesario para optimizar sondas de LiPA. 40

Ejemplo 5: Genotipado de muestras séricas infectadas con HBV

Sólo tras crear un alineamiento de secuencias como se muestra en la Figura 1, se vio claramente qué regio-nes podrían ser útiles para el genotipado de HBV. La región de preS1 parece ser adecuada debido al elevado grado de variabilidad. Por lo tanto, se diseñaron sondas para cubrir la mayoría de estas regiones variables, como se muestra en la Tabla 1. Sólo se retuvo una selección limitada de sondas, debido a su reacción específica con el panel de referencia. 45 Las más importantes se indican como regiones encajonadas en la Figura 1. Estas sondas seleccionadas se aplicaron entonces en un formato de LiPA indicado en la Figura 2, como número de línea 2 a 14. Algunas de las sondas se pudie-ron aplicar juntas en una línea, debido a su carácter universal, mientras que fue necesario aplicar separadamente otras. Con la selección de sondas así obtenida, se ensayaron las muestras séricas recogidas en diferentes partes del mundo (Europa, Sudamérica, África, Oriente Medio). La parte superior de la Figura 3 muestra la reactividad de una selección de 50 muestras en estas sondas. El genotipado de estas muestras es directo, perteneciendo las muestras 2 a 8 al genotipo A, perteneciendo las muestras 9 y 10 al genotipo B, perteneciendo las muestras 11 y 12 al genotipo C, perteneciendo las muestras 13 a 19 al genotipo D, perteneciendo las muestras 20 a 23 al genotipo E, y perteneciendo la muestra 24 al genotipo F.

El genotipado también se puede llevar a cabo en la región de HBsAg. Nuevamente, se diseñaron sondas pa-55 ra cubrir la mayoría de las regiones variables mostradas en la Fig. 1. Sólo se retuvo una selección limitada de sondas.

Estas sondas están encajonadas en la Fig. 1 y se enumeran en la Figura 4. Se preparó una tira de LiPA que posee estas sondas, y se caracterizaron las muestras que pertenecen a los diferentes genotipos, como se muestra en la Fig. 5.

Ejemplo 6. Barrido de la región de preCore en busca de mutaciones.

La expresión de HBeAg se puede regular a nivel transcripcional y traduccional. Se postula que existe una re-gulación transcripcional debido a la presencia de una variación dinucleotídica en la región promotora del ARNm de pre-5 Core. Se seleccionaron sondas que cubren el motivo de tipo salvaje (por ejemplo sonda HBPr 88) y el motivo mutante (por ejemplo HBPr 89), y sus posiciones se indican en el alineamiento mostrado en la Figura 1, y se aplicaron en la tira de LiPA como línea 15 y 16 (Figura 2).

A nivel translacional, pueden surgir muchas más mutaciones, todas dando como resultado posiblemente la anulación de la expresión de HBeAg: cualesquiera mutaciones en el codón 1 (ATG) que destruye el inicio de la traduc-10 ción, codón 2 (CAA a TAA), codón 7 (TGC a TGA), codón 12 (TGT a TGA), codón 13 en el genotipo B, C, D, E, F (TCA a TGA o TAA), codón 14 (TGT a TGA), codón 18 (CAA a TAA), codón 21 (AAG a TAG), codón 23 (TGC a TGA), codón 26 (TGG a TAG o TGA), codón 28 (TGG a TAG o TGA). Sin embargo, debido al constreñimiento secundario de la señal de encapsidamiento, la mayoría de las mutaciones se producen en el codón 28 (TGG a TAG). Junto con la mutación en el codón 28, a menudo se observa una segunda mutación en el codón 29 (GGC a GAC). En el caso del genotipo A, y 15 nuevamente como consecuencia del constreñimiento secundario, las mutaciones del codón de parada en el codón 28 sólo es probable que ocurran después de la selección de una mutación del codón 15 (CCC a CCT). Por tanto, la inter-pretación correcta de las mutaciones de preCore depende del genotipo. Además de los codones de parada menciona-dos anteriormente, una gran cantidad de diferentes mutaciones de supresión o inserción en el marco de lectura abierto del preCore puede dar esencialmente el mismo resultado. 20

A fin de desarrollar un ensayo sensible para detectar las mutaciones relevantes y las mutaciones hipotéticas, se desarrolló un procedimiento de barrido de sondas. Se diseñaron sondas que solapan parcialmente, y se aplicaron en un formato de LiPA (Figura 2, línea 17 a 27). En este formato de ensayo, se reconocen de forma positiva las secuencias de tipo salvaje a lo largo de la región de preCore completa, junto con la variación del codón 15 para el genotipo A frente a genotipos que no son A, y las mutaciones más habituales en el codón 28 (TAG), en el codón 29 (GAC) y la combina-25 ción del codón 28 y 29 (TAGGAC). La ausencia de reactividad en una de las otras sondas siempre indica la presencia de una variación. La naturaleza exacta de esta variación se puede revelar entonces mediante análisis de secuencias, o con otras sondas de LiPA diseñadas.

La Figura 3 muestra la reactividad de las muestras genotipadas seleccionadas en las sondas para la región de preCore. Las muestras se ensayaron previamente en busca de la presencia de HBeAg o de anti-HBe. La interpreta-30 ción de la reactividad en las sondas de LiPA para cada muestra se indica debajo de cada tira. Este enfoque permitió el cribado simultáneo de una muestra para mutaciones de preCore, y la caracterización del genotipo vírico.

La Figura 6 también muestra un panel de muestras con mutaciones en la región de preCore, así como mues-tras de tipo salvaje. Las sondas usadas en este ensayo se enumeran en la Figura 4. Este ensayo incluye un mutante del codón 29 (motivo M4), que no estaba presente en el experimento en la Figura 3. 35

Ejemplo 7. Detección de mutantes en la región de HBsAg.

Se han descrito mutantes de escape de vacuna. El mutante más habitualmente encontrado es la variación en el codón 145 de HBsAg (G145R o GGA a AGA). Se diseñaron sondas de LiPA para detectar sondas de tipo salvaje y mutantes. Existen variaciones genotípicas en la vecindad del codón 145. Por lo tanto, el genotipo A está cubierto por la sonda 77, el genotipo B por la sonda 78, el genotipo C por la sonda 79, y el genotipo D/E por la sonda 80. Por tanto, en 40 principio, es posible genotipar y detectar las cepas de tipo salvaje del virus en un único experimento. Las secuencias diana mutantes están cubiertas por la sonda 81 y 82 para el genotipo A y D, respectivamente. La sonda 83 se puede usar como un control positivo en estos experimentos. La detección adicional de mutantes en la región determinante a es posible por medio de un enfoque de barrido de sondas. Aquí por lo tanto, se diseñan sondas para cubrir la secuencia de tipo salvaje de los diferentes genotipos a lo largo de la región del epítopo de HBsAg, y se aplicaron en un formato de 45 LiPA. Nuevamente aquí, la ausencia de tinción en una de estas sondas indica la presencia de una cepa mutante. La naturaleza exacta de esta variante se determinó entonces mediante análisis de secuenciación.

Ejemplo 8. Detección de cepas de HBV resistentes a lamivudina.

A través de la analogía con el HIV y la resistencia frente al compuesto antiviral 3TC (lamivudina o (-)--2’,3’-didesoxi-3’-tiacitidina), se predijo que al tratar pacientes infectados con HBV con 3TC, se seleccionarían cepas víricas 50 que muestran resistencia al motivo YMDD en el gen de HB pol. El motivo YMDD está localizado físicamente en la región de HBsAg, pero está codificado en otro marco de lectura. Por tanto, esta parte de la región de pol de HBV es amplifica-da con la combinación de cebadores HBPr 75-HBr 94, pero no con la combinación HBPr 75-HBr 76. Las sondas que cubren el motivo YMDD de tipo salvaje y el motivo mutante YVDD se indican en la Figura 1, respectivamente sondas 95 a 100 y 101 a 103, así como las sondas 115, 116, 127 y 132, produciendo estas últimas sondas los mejores resultados 55 en el ensayo de LiPA. Tal ensayo se usó para determinar la presencia de mutaciones en el motivo YMDD en suero de

un paciente infectado con HBV durante el tratamiento con lamivudina. La Fig. 7 muestra que en la primera fase del tra-tamiento (mayo de 1995) no se detectaron mutaciones. Durante el tratamiento, la carga vírica disminuyó, alcanzando un nivel de aproximadamente 104 durante noviembre y diciembre de 1995, con lo que después se observó un rebrote, dan-do como resultado un nivel tan alto como durante los primeros meses de tratamiento hacia junio de 1996. De forma interesante, un ensayo de LiPA realizado en febrero de 1996 indicó que la mayoría del virus presente poseía una muta-5 ción en el motivo YMDD, que había cambiado a YVDD. En junio de 1996, no se pudo detectar ya más el motivo de tipo salvaje, sino sólo YVDD mutante. Con este ensayo, se pueden detectar fácilmente así cepas de HBV resistentes. Además, la detección combinada del motivo YMDD y los mutantes de preCore puede ser clínicamente importante en la predicción y pronóstico del tratamiento posterior.

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Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un método para la detección de tanto genotipos de cepas de HBV como de mutantes de HBV re-sistentes a fármacos, en una muestra biológica, que comprende:

   (i) si es necesario, liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

   (ii) si es necesario, amplificar la parte relevante de un gen de HBV adecuado presente en dicha muestra con al 5 menos un par de cebadores adecuados;

   (iii) hibridar los ácidos polinucleicos de la etapa (i) o (ii) con una combinación de al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos:

   - SEC ID 77, 81, 139-141, 190-194

   - SEC ID 78, 142-147, 149 10

   - SEC ID 79, 150-161, 204

   - SEC ID 82, 162-169, 208

   - SEC ID 170-176, 213

   - SEC ID 178-189, 214-219,

   - opcionalmente una o más de SEC ID 80, 148 y 177, y al menos una sonda procedente de cada uno de los 15 siguientes grupos:

   - SEC ID 114, 115, 127-129, 227-234, 243, 249, 250, 261

   - SEC ID 116, 117, 130-133, 244-248, 251-260, 262-266, y/o al menos una sonda procedente de:

   - SEC ID 267 y 269, cada una junto con SEC ID 268,

   (iv) detectar los híbridos formados en la etapa (iii); 20

   (v) inferir los genotipos de HBV y los mutantes de HBV resistentes a fármacos presentes en dicha muestra a par-tir de la señal o señales de hibridación diferenciales obtenidas en la etapa (iv).
2. 2.- Método según la reivindicación 1, en el que las sondas oligonucleotídicas de la etapa (iii) se carac-terizan porque detectan específicamente mutaciones de resistencia a fármacos en el motivo YMDD, siendo dichas son-das 25

   - SEQ ID 77, 140 y 193,

   - SEQ ID 78,

   - SEQ ID 153, 154 y 204,

   - SEQ ID 165 y 208,

   - SEQ ID 172 y 213, 30

   - SEQ ID 186, 216 y 219,

   - SEQ ID 80 y 177,

   - SEQ ID 115 y 127,

   - SEQ ID 116 y 132.
3. 3.- Un kit de ensayo para la detección de tanto genotipos de cepas de HBV como mutantes de HBV 35 resistentes a fármacos presentes en una muestra biológica según el método de la reivindicación 1, que comprende los siguientes componentes:

   (i) cuando sea apropiado, un medio para liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

   (ii) cuando sea apropiado, al menos un par de cebadores adecuado; 40

   (iii) al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos:

   - SEQ ID 77, 81, 139-141, 190-194

   - SEQ ID 78, 142-147, 149

   - SEQ ID 79, 150-161, 204

   - SEQ ID 82, 162-169, 208

   - SEQ ID 170-176, 213

   - SEQ ID 178-189, 214-219,

   - opcionalmente una o más de SEQ ID 80, 148 y 177, y al menos una sonda procedente de cada uno de los siguientes grupos: 5

   - SEQ ID 114, 115, 127-129, 227-234, 243, 249, 250, 261

   - SEQ ID 116, 117, 130-133, 244-248, 251-260, 262-266, y/o al menos una sonda de:

   - SEQ ID 267 y 269, cada una junto con SEQ ID 268, posiblemente fijada a un soporte sólido;

   (iv) un tampón de hibridación, o componentes necesarios para producir dicho tampón;

   (v) una disolución de lavado, o componentes necesarios para producir dicha disolución; 10

   (vi) cuando sea apropiado, un medio para detectar los híbridos que resultan de la hibridación anterior;

   (vii) cuando sea apropiado, un medio para unir dicha sonda a una localización conocida sobre un soporte sólido.
4. 4.- Un mutante de HBV que comprende una secuencia nucleotídica que contiene una mutación resistente a fármacos en el gen pol de RT de HBV, en el que la mutación da como resultado un cambio de aminoácido en el motivo YMDD de la polimerasa de HBV, en el que dicho cambio de aminoácido es M a V en la posición 552 según se indica en 15 la figura 1.
5. 5.- Un método para identificar un mutante de HBV como se define en la reivindicación 4, en una muestra, que comprende:

   (i) liberar, aislar o concentrar los ácidos polinucleicos presentes en dicha muestra;

   (ii) opcionalmente, amplificar al menos una parte del gen de HBV presente en dicha muestra con al menos un par 20 de cebadores;

   (iii) determinar la presencia o ausencia de una mutación en el gen pol de RT de HBV que da como resultado un cambio de aminoácido en el motivo YMDD de la polimerasa de HBV, en el que dicho cambio de aminoácido es M a V en la posición 552 como se indica en la figura 1, e identificar de ese modo la existencia en dicha muestra de una cepa de HBV resistente a fármacos. 25