ES2354729T3

ES2354729T3 - Procedimiento para determinar la función plaquetaria y las condiciones de flujo.

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Publication number: ES2354729T3
Application number: ES07007504T
Authority: ES
Inventors: Andreas Dr. Rechner
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-12
Publication date: 2011-03-17
Anticipated expiration: 2027-04-12
Also published as: EP1850135A1; EP1850135B1; ATE487144T1; DE502007005519D1; CA2586227A1; CA2586227C; JP2007298512A; US8895259B2; US20070254324A1; DE102006020386A1

Abstract

Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre completa, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos: a) conducción de la sangre a través de un capilar y, posteriormente, a través de una abertura de un elemento de separación que contiene, al menos, un activador de trombocitos del grupo de activadores de receptores de adenosina; y b) medición del tiempo necesario para la formación de un trombo en la abertura del elemento de separación hasta el cierre de dicha abertura; caracterizado porque antes del paso a través del capilar, la muestra de sangre completa es mezclada con prostaglandina E1 en una concentración final de 11 a 13 nM o con forskolina en una concentración final de 0,1 a 5 μM.

Description

La presente invención se enmarca en el sector de diagnóstico de función de plaquetaria y comprende un procedimiento in vitro para determinar la función plaquetaria en condiciones de flujo. El 5 procedimiento es especialmente adecuado para determinar el efecto de clopidogrel tras la ingesta oral, y de otros antagonistas P2Y(12) de acción antitrombótica, así como para determinar antagonistas de acción antitrombótica del receptor P2Y(1).

Los procesos fisiológicos que, por un lado, garantizan la fluidez de la sangre en el sistema vascular y, por otro lado, aseguran, gracias a la formación de trombosis, que se impida la pérdida de 10 sangre extravascular, se reúnen bajo el término hemostasis. En la regulación de la hemostasis intervienen una gran cantidad de factores proteicos, así como también componentes celulares, por ejemplo, trombocitos (plaquetas). En el caso de una lesión vascular, primero se forma una acumulación de trombocitos en el colágeno subendotelial. Dicha adhesión se transmite a través de proteínas adhesivas, como aquellas del factor von Willebrand (VWF). Durante el proceso de adhesión, 15 los trombocitos son activados y vierten mediadores de sus gránulos, por lo cual se induce la agregación de otros trombocitos así como el fortalecimiento de la activación. De este modo, se lleva a cabo un cierre vascular primario (hemostasis primaria), que sólo se estabiliza a través de otras reacciones del sistema coagulante plasmático (hemostasis secundaria). Las regulaciones fallidas de dichos procesos pueden provocar una tendencia a la trombosis o a una tendencia a hemorragia y 20 tener consecuencias fatales, según el grado de complejidad.

En el diagnóstico de coagulación se desarrollaron diferentes procedimientos de prueba in vitro, con los que se puede determinar si la sangre de un paciente puede coagular perfectamente o si existe una disfunción en la coagulación. En el caso de una disfunción en la coagulación, a menudo es necesario saber con precisión la causa de la disfunción existente, para poder seleccionar medidas 25 terapéuticas óptimas. Una función parcial importante del sistema de coagulación, que puede ser analizado adecuadamente, es la hemostasis primaria, que depende, fundamentalmente, de la capacidad de funcionamiento de los trombocitos.

Los procedimientos para determinar la función plaquetaria no sólo se utilizan para el diagnóstico de disfunciones heredadas o adquiridas en la función plaquetaria, sino también para el 30 control de terapias antitrombóticas. Los medicamentos que inhiben la agregación de trombocitos se utilizan, predominantemente, en la profilaxis y la terapia de eventos tromboembólicos arteriales, como infarto de miocardio o apoplejía. Las sustancias activas más difundidas con efecto inhibidor de agregación de trombocitos son el ácido acetilsalicílico (ASS) y las tienopiridinas clopidogrel y ticlopidina. El ASS inhibe de modo irreversible la ciclooxigenasa-1 (CQX-1), una enzima intracelular 35 que participa de la síntesis de tromboxano A2, que estimula la agregación de trombocitos. El clopidogrel y la ticlopidina pertenecen a la clase de los antagonistas P2Y(12), debido a su mecanismo de acción. Tras la ingesta oral de clopidogrel o ticlopidina se producen metabolitos en el hígado que bloquean selectivamente el receptor P2Y(12). El receptor P2Y(12) purinérgico se expresa en la superficie de los trombocitos y se puede activar a través de 5’-difosfato extracelular de adenosina 40 (ADP). Como consecuencia de la activación del receptor P2Y(12), se desencadenan procesos intracelulares en los trombocitos, por ejemplo, la inhibición de la formación de cAMP, que originan una reacción de agregación de trombocitos. Los antagonistas P2Y (12) bloquean los receptores P2Y(12) en la superficie de los trombocitos y por ello presentan una acción antitrombótica.

El segundo receptor ADP P2Y(1) purinérgico también se expresa en la superficie de los 45 trombocitos y se puede activar a través de 5’-difosfato extracelular de adenosina. Como consecuencia de la activación del receptor P2Y(1), se desencadenan procesos intracelulares en los trombocitos, por ejemplo, el incremento del calcio intracelular, que originan una reacción de agregación de trombocitos. Los antagonistas del receptor P2Y(1) contrarrestan dicho proceso y por ello presentan una acción antitrombótica. 50

Un conocimiento preciso del estado de la función plaquetaria de pacientes que reciben terapia antitrombótica se considera cada vez más importante, ya que, por ejemplo, la presencia de una denominada resistencia al clopidogrel debe ser considerado un serio factor de riesgo. Se habla de una resistencia al clopidogrel cuando la función plaquetaria de un paciente no es influida o es escasamente influida por la suministración de la dosis estándar de clopidogrel. Determinando la 55

función plaquetaria se puede verificar, por un lado, si a través de la dosificación seleccionada realmente se logra un efecto antitrombótico suficiente. Por otro lado, se pueden comprobar y tratar dosificaciones demasiado elevadas o efectos de un medicamento antitrombótico, lo cual es necesario, por ejemplo, antes de intervenciones operativas para excluir complicaciones hemorrágicas.

Por el estado actual de la técnica se conocen diferentes procedimientos para el análisis de 5 la función plaquetaria. En el caso de la determinación de hemorragias se trata de una prueba global en vivo, que registra la hemostasis primaria. El tiempo de hemorragia se determina realizando en el paciente pequeñas lesiones de corte o pinchazo y midiendo el tiempo necesario para detener la hemorragia. Se trata de una prueba de difícil estandarización, que brinde información aproximada, aplicada, sobre todo, en situaciones de urgencia, para obtener una vista general de la hemostasis 10 primaria. La ingesta de inhibidores de la agregación de trombocitos produce una prolongación del tiempo de hemorragia. La desventaja de la determinación del tiempo de hemorragia es que en un tiempo de hemorragia normal no se puede excluir la disfunción de la función plaquetaria.

Diferentes procedimientos in vitro posibilitan una determinación notablemente más sensible de disfunciones de la función plaquetaria. En dichos procedimientos, en una muestra de sangre 15 completa, o en una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP), usualmente se induce la agregación de trombocitos a través de la adición de un activador y se mide la reacción de agregación. Los activadores más utilizados, que se implementan en la inducción de la agregación de trombocitos, son: ADP (5’-difosfato de adenosina), colágeno, epinefrina (adrenalina), ristocetina y diferentes combinaciones de ellos, así como trombina, TRAP (Thrombin-Receptor-Activating-Protein, o proteína 20 activadora de receptor de trombina) o serotonina.

En la geometría de agregación de transmisión luminosa, también denominada agregación de plaquetas, según Born, se mide fotométricamente la capacidad de agregación de los trombocitos en el plasma rico en plaquetas, en presencia de sustancias que inducen la agregación, en un agregómetro. A través de la formación de agregados, se incrementa la transparencia al paso de la luz 25 de la muestra PRP, de modo que a través de la medición de la transparencia al paso de la luz se puede determinar, por ejemplo, la velocidad de la formación de agregados. Mediante la geometría de agregación de transmisión luminosa también pueden determinarse efectos terapéuticos de inhibidores de agregación de trombocitos de uso medicamentoso. Una desventaja de la geometría de agregación de transmisión luminosa es que se puede utilizar exclusivamente plasma rico en plaquetas como 30 material de muestra. En el plasma rico en plaquetas no sólo faltan importantes componentes de la sangre, por ejemplo, glóbulos rojos y blancos, sino que, además, requiere de una preparación prolongada y falible de la muestra.

Otro principio de prueba para determinar la función plaquetaria fue llevado a la práctica en el Platelet Function Analyzer, o analizador de la función plaquetaria (PFA- 100®, Dade Behring 35 Marburg GmbH, Marburgo, Alemania). El PFA-100® es una prueba in vitro de sangre completa global, automatizada y estandarizada en la cual se mide la hemostasis primaria en condiciones de flujo y, con ello, en presencia de fuerza elevadas de cizallado. Para la simulación de las condiciones de flujo y de las fuerzas de cizallado, como las que reinan en vasos sanguíneos arteriales reducidos, en una célula de medición especial se genera una baja presión de, aproximadamente, -40 mbar, y la sangre 40 completa de citrato que se encuentra en un depósito de reserva de muestra fluye a través de un capilar con un diámetro de, aproximadamente, 200 μm. El capilar desemboca en una cámara de medición cerrada con un elemento de separación, por ejemplo, una membrana, que contiene una abertura capilar central a través de la cual pasa la sangre a causa de la baja presión. En la mayoría de los casos, la membrana está mezclada, al menos, en el área alrededor de la abertura, con uno o 45 múltiples activadores que inducen la agregación de trombocitos, de modo que la sangre que fluye a lo largo de ella es puesta en contacto con las sustancias que inducen la agregación en el área de la abertura. Como consecuencia de la adhesión y agregación inducidas de los trombocitos, se forma un trombo en el área de la abertura, que cierra la abertura de la membrana y detiene el flujo de sangre. En este sistema se mide el tiempo necesario para el cierre de la abertura de la membrana. El 50 denominado tiempo de cierre es correlativo con la capacidad de funcionamiento de los trombocitos. Una célula de medición para la aplicación en un procedimiento para la determinación de la función plaquetaria a partir del tiempo de cierre se describe, por ejemplo, en el documento de patente WO 97/34698. Hasta ahora, en el procedimiento para determinar el tiempo de cierre se utilizaban células de medición equipadas con una membrana revestida de colágeno (Kol) y, adicionalmente, o bien con 55 ADP o con epinefrina (Epi). Según el equipamiento, se diferencian entonces células de medición Kol/ADP y células de medición Kol/Epi. Usualmente, se analiza primero una muestra de paciente mediante una célula de medición Kol/Epi. En el caso de un tiempo de cierre anormalmente prolongado de Kol/Epi, que indica una disfunción de la agregación de trombocitos, se lleva a cabo, posteriormente,

una medición Kol/ADP. Si el tiempo de cierre Kol/ADP también es anormalmente prolongado, esto indica una función plaquetaria disfuncional o una disfunción del factor von Willebrand. Si, por el contrario, el tiempo de cierre Kol/ADP es normal, esto puede indicar la presencia de ácido acetilsalicílico o a la existencia de una trombocitopatía adquirida o heredada, por ejemplo, el síndrome de Pool de depósito. Una desventaja del sistema PFA-100® es que las células de medición 5 disponibles Kol/ADP y Kol/Epi sólo presentan una sensibilidad limitada para el efecto inhibidor de agregación de los inhibidores de agregación de trombocitos del conjunto de las tienopiridinas (por ejemplo, clopidogrel y ticlopidina). Una determinación fiable del efecto terapéutico de clopidogrel o ticlopidina de uso medicamentoso, especialmente, si el paciente ha tomado adicionalmente (por ejemplo, una aspirina®), no ha sido posible hasta ahora mediante las células de medición Kol/ADP y 10 Kol/Epi conocidas en el sistema PFA-100®.

El documento de patente WO 2005/007868 A2 describe otro procedimiento para determinar la función plaquetaria, que posibilita la determinación del efecto terapéutico del clopigogrel y otros antagonistas P2Y(12). En este procedimiento, se mezcla una muestra de sangre completa de un paciente con un anticoagulante y se mezcla con ADP para inducir la agregación de trombocitos. 15 Además, se agrega prostaglandina E1 (PGE 1) a la muestra. La prostaglandina E1, un producto del metabolismo humano del ácido araquidónico, ya es capaz de reducir notablemente, en pequeñas dosificaciones, la reactividad de los trombocitos y por ello se la utiliza para inhibir la activación de los trombocitos. Los procedimientos de prueba descritos en la memoria WO 2005/007868 A2 se utiliza PGE 1, para impedir la activación indeseada del receptor ADP P2Y(1) y con ello, incrementar la 20 especificidad del procedimiento de prueba para el receptor P2Y(12) o para los antagonistas P2Y(12), como clopidogrel. Adicionalmente, se agregan micropartículas acopladas a un ligando del receptor de GPllb/llla, por ejemplo, fibrinógeno, y la reacción de agregación se mide agregométricamente a partir de la creciente transparencia al paso de la luz. La desventaja del procedimiento descrito es que la función plaquetaria no se determina bajo influencias de condiciones de flujo y fuerza de cizallado, al 25 igual que en la geometría de agregación de transmisión luminosa.

La presente invención tenía como objeto presentar un procedimiento para determinar la función plaquetaria en condiciones de flujo, que posibilite, especialmente, la determinación del efecto antitrombótico de antagonistas P2Y(12). La solución de la presente invención consiste en la presentación del procedimiento acorde a la invención descrito en las reivindicaciones. 30

El objeto de la presente invención es un procedimiento in vitro para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre completa. Preferentemente, en el caso de la muestra de sangre completa se trata de sangre fresca, venosa, anticoagulada, humana o animal, analizada dentro de las cuatro horas después de la toma de la sangre con el procedimiento acorde a la invención. Preferentemente, la muestra de sangre completa se somete a anticoagulación, agregando un 35 anticoagulante. Para la utilización como anticoagulante son adecuadas las soluciones de citrato tamponadas, de enlace de calcio, como, por ejemplo, soluciones de citrato de sodio tamponadas al 3,2 o 3,8 %, así como inhibidores de la trombina naturales o sintéticos, por ejemplo, hirudina, PPACK (D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona, HCl), argatrobán y melagatrán, o inhibidores directos del factor Xa naturales o sintéticos, por ejemplo, antistasina, péptido anticoagulante de la garrapata, yagina, 40 draculina, GGACK (H-Glu-Glu-Arg-clorometilcetona), inhibidores del factor diamidino Xa e inhibidores del factor mono-benzamidina Xa.

El procedimiento acorde a la invención para determinar la función plaquetaria comprende múltiples pasos de procedimiento. Para la simulación de las condiciones de flujo fisiológicas, como las que reinan en las arterias pequeñas, la sangre, que se encuentra primero en una cámara de depósito, 45 es conducida a través de un capilar que tiene, preferentemente, un diámetro de, aproximadamente, 200 μm. El capilar desemboca en una cámara de medición, subdividida en dos compartimentos mediante un elemento de separación. El elemento de separación presenta una abertura a través de la cual se conduce la sangre del primer compartimento al segundo compartimento. El elemento de separación contiene, al menos, un activador de trombocitos, por lo cual la sangre que debe fluir por la 50 abertura del elemento de separación es puesta en contacto con, al menos, uno de los activadores de trombocitos, contenido en o sobre el elemento de separación. Como consecuencia de la agregación de trombocitos, inducida por el contacto con, al menos, un activador de trombocitos, se forma un trombo en la abertura del elemento de separación. Se mide el tiempo necesario para la formación de un trombo en la abertura del elemento de separación hasta el cierre de dicha abertura. 55

Preferentemente, se mide el tiempo de cierre utilizando un equipo que contiene un sensor de presión, que determina el flujo de sangre a través de la abertura durante la prueba. En ese caso, se determina primero la tasa de flujo inicial tras una aspiración inicial rápida del volumen muerto de la

célula de medición. Si la tasa de flujo baja por debajo del valor de 10 % durante más de 3 segundos, se finaliza la medición y el tiempo transcurrido hasta entonces se indica como el denominado tiempo de cierre. El denominado tiempo de cierre, que entre otros depende de la reacción de agregación de los trombocitos estimulados, es una medida de la función plaquetaria. Preferentemente, el tiempo de cierre medido para una muestra de sangre completa de un paciente es comparado con un rango de 5 referencia de tiempo de cierre para muestras de sangre completas de probandos sanos.

Preferentemente, el flujo de sangre es generado a través del capilar y la abertura del elemento de separación, creando una baja presión en la cámara de medición, es decir, por aspiración. En un modo de ejecución especialmente preferido, la baja presión es generada por la acción conjunta de una célula de medición adecuada y un instrumento. Un ejemplo de dicho sistema está descrito en 10 el documento de patente WO 97/034698.

El procedimiento acorde a la invención se caracteriza porque la muestra de sangre completa es mezclada con un activador de adenilato ciclasas intracelulares, a saber, o bien con prostaglandina E1 (PGE1) o con forskolina. La prostaglandina E1 se agrega a la muestra de sangre completa en una concentración final de 11 nM a 13 nM, la forskolina se agrega a la muestra de sangre 15 completa en una concentración final de 0.1 μM a 5 μM.

La forskolina puede ser agregada a la muestra de sangre completa en una concentración final de 0,5 μM a 2,5 μM, o de 1 μM a 1,5 μM.

La muestra de sangre completa puede ser mezclada a través de una mezcla simple con una solución que contiene, al menos, un activador de adenilato ciclasas intracelulares, con el activador 20 deseado. Para ello, al menos un activador de adenilato ciclasas intracelulares, puede hallarse, por ejemplo, o bien ya en el medio de toma, que contiene adicionalmente un anticoagulante, o la solución se agrega a la sangre completa ya anticoagulada. Además, es posible que, al menos, un activador de adenilato ciclasas intracelulares se encuentre en la cámara de depósito del dispositivo previsto para la determinación del tiempo de cierre de la muestra. En la cámara de depósito se puede disponer, al 25 menos, un activador de adenilato ciclasas intracelulares, o bien en forma liofilizada o en forma disuelta.

El elemento de separación utilizado en el procedimiento acorde a la invención contiene, al menos, un activador de trombocitos para la inducción de la agregación de trombocitos. El elemento de separación utilizado puede contener, por ejemplo, un activador de trombocitos del conjunto de los 30 activadores de receptores de adenosina, entre los que se encuentra, especialmente, el 5’-difosfato de adenosina (ADP) y el 5’-difosfato de 2-metiltioadenosina (2-MeSADP) así como sus derivados. En un modo de realización preferido, se utiliza un elemento de separación que contiene una sal de ADP o una sal de 2-MeSADP. En un modo de realización preferido, se utiliza un elemento de separación que contiene 1 a 100 μg, de modo especialmente preferido, 10 a 50 μg de ADP. Asimismo, el elemento de 35 separación utilizado puede contener un activador de trombocitos del conjunto de colágeno y epinefrina, de modo que se utilizan 0,1 - 5 μg, de modo especialmente preferido, 1 μg de colágeno, o 1 - 100 μg de epinefrina. En otros modos de ejecución preferidos, se utilizan elementos de separación que contienen ADP y colágeno o epinefrina y colágeno. Dichos elementos de separación, así como su obtención y aplicación están descritos, por ejemplo, en el documento de patente EP 716 744 B1. 40

En el procedimiento acorde a la invención se puede utilizar un elemento de separación que contiene adicionalmente iones de calcio, preferentemente, en forma de dihidrato de cloruro de calcio. Se puede utilizar un elemento de separación que contiene 50 a 200 μg o 100 a 150 μg o 125 μg de iones de calcio en forma de dihidrato de cloruro de calcio.

El elemento de separación utilizado es una matriz de soporte porosa o no porosa para el, al 45 menos, único activador de trombocitos para inducir la agregación de trombocitos y, eventualmente, para iones de calcio. Preferentemente, el elemento de separación está configurado en forma de una membrana. El material preferido absorbe líquidos, de modo que las sustancias mencionadas se pueden aplicar en forma disuelta. Los materiales especialmente preferidos son éster de celulosa, cerámica, Nylon, polipropileno, poliétersulfona y polivinilidenofluoruro (PVDF). Preferentemente, el 50 elemento de separación bañado o impregnado con las sustancias deseadas está seco. A través del contacto de la sangre con el elemento de separación se disuelven las sustancias del elemento de separación y se mezclan con la muestra de sangre.

Se descubrió que en el caso de que un procedimiento acorde a la invención se utilice un elemento de separación, que contiene, al menos, un activador de trombocitos del conjunto de los activadores de receptores de adenosina, por ejemplo, ADP (véase también la tabla 2), se puede minimizar considerablemente el efecto de inhibición de agregación de trombocitos del ácido acetilsalicílico (ASS), de modo tal que sea posible una determinación precisa del efecto 5 (antitrombótico) inhibidor de la agregación de trombocitos de otros inhibidores de la agregación de trombocitos, por ejemplo, de antagonistas P2Y(12) como clopidogrel, también en aquellas muestras que contienen ASS.

El procedimiento acorde a la invención se utiliza, de modo especialmente preferido, para determinar el efecto antitrombótico (inhibidor de la agregación de trombocitos) de un antagonista 10 P2Y(12), especialmente, para determinar un antagonista P2Y(12) del conjunto de: clopidogrel, ticlopidina, prasugrel (sinónimo: CS-747) y otras tienopiridinas, AR-C67085MX (5’-trifosfato de 2-propiltio-d-β,γ-diclormetileno-adenosina), cangrelor (sinónimo: ARC69931MX, ácido N6-[2-(metiltio)-etil]-2-(3,3,3-trifluoropropil)tio-5’-adenilo), C1330-7 (N1-(6-etoxi-1,3-benzotiazol- 2-il-2-(7-etoxi-4-hidroxi-2,2-dioxo-2h-2-6benzo[4,5][1,3]tiazolo[2,3-c][1,2,4]tiadiazin-3-il)-2-oxo-1-etansulfonamida), AZD 15 6140 (análogo de nucleósido), MRS 2395 (3-(2-cloro-6-metilaminopurin- 9-il)-2-(2,2-dimetil-propioniloximetil)propiléster de ácido 2,2-dimetil-propiónico) y 2-MeSAMP (5’-monofosfato de 2-metiltioadenosina).

Sorprendentemente, se descubrió además que el procedimiento acorde a la invención puede ser utilizado igualmente para determinar el efecto antitrombótico (inhibidor de la agregación de 20 trombocitos) de un antagonista P2Y(1). El procedimiento puede ser utilizado, especialmente, para determinar el efecto antitrombótico de antagonistas P2Y(1) del conjunto: MRS 2179 [sal de diamonio de 3’,5’-difosfato de 2’-deoxi-N6-metiladenosina], MRS 2279 [3’,5’-bisfosfato de (N)-metanocarba-N6-metil-2-cloro-2’-deoxiadenosina], MRS 2500 [3’,5’-bisfosfato de 2-yodo-N6-metil-(N)-metanocarba-2’-deoxiadenosina], A2P5P [2’,5’-bisfosfato de adenosina], A3P5P [ 3’,5’-bisfosfato de adenosina] y 25 A3P5PS [3’-fosfato,5’-fosfosulfato de adenosina].

El elemento de separación presenta una abertura preferentemente circular, que se efectuó a la matriz de soporte, preferentemente, por punzonado. El diámetro de la abertura en el elemento de separación posee tales dimensiones que en las condiciones del respectivo procedimiento se puede formar un trombo que cierre la abertura y detenga el flujo de sangre. Preferentemente, la abertura en 30 el elemento de separación presenta un diámetro de entre alrededor de 100 μm y 200 μm. De modo especialmente preferido, el diámetro de la abertura en el elemento de separación es de, aproximadamente, 150 μm.

Los siguientes ejemplos de ejecución sirven para detallar el procedimiento acorde a la invención y no se deben entender como limitación del mismo. 35

Figuras

Figura 1

La figura 1 muestra un ejemplo de cómo un dispositivo adecuado para la realización del procedimiento acorde a la invención puede ser configurado para determinar la función plaquetaria. Se muestra un corte longitudinal de una célula de medición acorde a WO 97/34698, dispuesta en un 40 instrumento adecuado para la realización del procedimiento acorde a la invención y en la cual penetra un equipo de vacío (15), responsable de la generación de la baja presión. El equipo de vacío (15) presenta para ello un sello anular (27), que se encuentra sobre el borde periférico (12) del vaso de la muestra (10) creando una obturación. La célula de medición presenta una carcasa que forma una cámara de depósito (61) y una cámara de prueba (63). La cámara de prueba (63) está configurada 45 para alojar un vaso de muestra (10), cuyo lumen también se puede denominar cámara de medición. El vaso de la muestra (10) apoya un elemento de separación (6) tratado con reactivos, con una abertura central y un inicio del capilar (30, 31), que establece una unión del capilar (40) con el vaso de la muestra (10). La cámara de depósito (61) y la cámara de prueba (63) están separadas por un elemento penetrable (70). La figura muestra una fase del ciclo de prueba después de que el equipo de 50 vacío (15) entre en contacto con el vaso de la muestra (10) y lo haya desplazado hacia abajo, de modo que la base del vaso de la muestra (10) entre con contacto con el elemento de apoyo (71) y el capilar (40) haya atravesado el elemento penetrable (70) y haya penetrado la muestra (11). El instrumento genera una baja presión en el vaso de la muestra (10), por lo cual la muestra (11) es

aspirada hacia arriba a través del capilar (40) hasta alcanzar el primer compartimento (18) de la cámara de medición y posteriormente, a través de la abertura del elemento de separación (6).

Figura 2

Diagrama para la representación de los tiempos de cierre (en segundos [s]), para las muestras de sangre completa normales, no tratadas (de control) y para muestras de sangre completa 5 mezcladas in vitro con el antagonista P2Y(12) MRS 2395 o el inhibidor de COX-1 ácido acetilsalicílico (ASS) (ver ejemplo 1). Se utilizaron muestras de sangre completa anticoaguladas con citrato de sodio tamponado de 11 donantes sanos. Se representan los valores medios y las desviaciones estándar de los tiempos de cierre determinadas con las células de medición Kol/Epi (cut-off: 158 segundos). En el bloque izquierdo se representan los tiempos de cierre de las muestras no mezcladas con un activador 10 de adenilato ciclasas intracelulares, acorde al estado actual de la técnica (no tratadas). En el bloque central y derecho se representan los tiempos de cierre de muestras mezcladas, acorde a la invención, a través del paso por el capilar, con PGE1 o con forskolina.

Figura 3

Diagrama para la representación de los tiempos de cierre (en segundos [s]), para las 15 muestras de sangre completa normales, no tratadas (de control) y para muestras de sangre completa mezcladas in vitro con el antagonista P2Y(12) MRS 2395 o el inhibidor de COX-1 ácido acetilsalicílico (ASS) (ver ejemplo 1). Se utilizaron muestras de sangre completa anticoaguladas con citrato de sodio tamponado de 11 donantes sanos. Se representan los valores medios y las desviaciones estándar de los tiempos de cierre determinadas con las células de medición Kol/ADP (cut-off: 115 segundos). En el 20 bloque izquierdo se representan los tiempos de cierre de las muestras no mezcladas con un activador de adenilato ciclasas intracelulares, acorde al estado actual de la técnica (no tratadas). En el bloque central y derecho se representan los tiempos de cierre de muestras mezcladas, acorde a la invención, a través del paso por el capilar, con PGE1 o con forskolina.

Ejemplos 25

Ejemplo 1: Utilización del procedimiento acorde a la invención para determinar el efecto antitrombótico de un antagonista P2Y(12) y el ácido acetilsalicílico in vitro con las células de medición estándar Kol/Epi y Kol/ADP

1a) Preparación de las muestras

Se tomó sangre venosa de 11 donantes sanos y se la sometió a anticoagulación con citrato 30 de sodio (3,2 % de citrato de Na tamponado).

Las alícuotas de muestras de sangre completa de citrato se mezclaron in vitro con el antagonista P2Y(12) MRS 2395 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania). Se mezcló asimismo una solución inicial etanólica de MRS 2395 (15 mg/mL) con la muestra de sangre completa, de modo que se alcanzó una concentración final de 100 μmol/L. 35

Otras alícuotas de las muestras de sangre completa de citrato se mezclaron con el inhibidor de COX-1 ácido acetilsalicílico (abrev.: ASS; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania). Se mezcló asimismo una solución inicial de ASS (1 mg/mL) con la muestra de sangre completa, de modo que se alcanzó una concentración final de 30 μmol/L.

Tras la adición de los reactivos la muestra de sangre se incubó a temperatura ambiente 40 durante 5 minutos.

1b) Determinación del efecto antitrombótico de MRS 2395 mediante geometría de agregación de transmisión luminosa inducida por ADP (según Born)

Para comprobar si las muestras tratadas con MRS 2395 realmente muestran una agregación de trombocitos reducida, a partir de la alícuota descrita en el ejemplo 1a), no tratada, y las 45 muestras de sangre completa tratadas con MRS 2395se obtuvo un plasma rico en plaquetas (PRP) y un plasma pobre en plaquetas (PPP), y luego las muestras fueron mezcladas con 5 μM de ADP. Las

muestras de PPP fueron utilizadas como controles de valor vacío. La medición fotométrica de la reacción de agregación se llevó a cabo en un equipo automático de coagulación BCT® (Dade Behring Marburg GmbH, Marburgo, Alemania) bajo agitación continua (600 U/min). La agregación de trombocitos de las muestras tratadas con MRS 2395 fue inferior en un 27 %, en comparación con la agregación de trombocitos de las muestras no tratadas. 5

1c) Determinación de los rangos de referencia para células de medición Kol/Epi- y Kol/ADP

Se tomó sangre venosa de donantes sanos y se la sometió a anticoagulación con citrato de sodio (3,2 % de citrato de Na tamponado). Para cada muestra de sangre completa se llevó a cabo la determinación del tiempo de cierre en el equipo PFA-100®. Con una célula de medición Kol/Epi PFA-100® [véase ejemplo 1d)] y una célula de medición Kol/ADP PFA-100® [véase ejemplo 1d)] se 10 analizaron las muestras de 186 donantes mediante prueba doble.

El rango de referencia (rango normal) para el tiempo de cierre Kol/Epi o el tiempo de cierre Kol/ADP se fijó determinando el rango de valor de medición en el cual se hallaba el 90 % de los valores de medición determinados para los probandos sanos (90 % de intervalo central de la distribución normal de todas las mediciones). Se obtuvieron los siguientes rangos de referencia para 15 los tiempos de cierre:

Kol/Epi 70 - 158 segundos

Kol/ADP 60 - 115 segundos.

Como cut-off, es decir, valor límite de una función plaquetaria, se fijó el límite superior de referencia del rango de referencia. Si el tiempo de cierre de una muestra de un paciente varía del área 20 de referencia, esto puede ser signo de una disfunción de la función plaquetaria. Es decir, los tiempos de cierre Kol/Epi mayores que 158 segundos o tiempos de cierre Kol/ADP mayores que 115 segundos indican la presencia de una función plaquetaria en el sentido de una capacidad de agregación reducida.

1d) Determinación del efecto antitrombótico de MRS 2395 y ácido acetilsalicílico mediante el 25 procedimiento acorde a la invención, en condiciones de flujo

Para determinar el tiempo de cierre mediante una célula de medición Kol/Epi PFA-100® (2 μg de colágeno y 10 μg de epinefrina en el elemento de separación; 150 μm de diámetro de apertura; Dade Behring Marburg GmbH, Marburgo, Alemania) o mediante una célula de medición Kol/ADP PFA-100® (2 μg de colágeno y 50 μg de ADP en el elemento de separación; 150 μm de diámetro de 30 apertura; Dade Behring Marburg GmbH, Marburgo, Alemania) como medida de la función plaquetaria, se analizaron las muestras de sangre completa descritas en el ejemplo 1a), en un equipo PFA-100® (Platelet Function Analyzer-100, Dade Behring Marburg GmbH, Marburgo, Alemania).

Se tomaron alícuotas de las muestras descritas en 1a) y, acorde a la invención, se mezclaron, o bien con prostaglandina E1 (abrev.: PGE1) o con forskolina (ambos adquiridos en 35 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania) para la activación de adenilato ciclasas intracelulares. Para ello, las muestras se mezclaron con una solución inicial etanólica de PGE1 (0,05 mg/mL) o con una solución inicial etanólica de forskolina (5 mg/mL), de modo que se alcanza una concentración final de PGE1 de 12,5 nM o una concentración final de forskolina de 1 μM. Otras alícuotas de las muestras descritas en 1a) no se mezclaron con un activador de adenilato ciclasas 40 intracelulares y sirven como control.

Luego se incubaron, respectivamente, 800 μL de las muestras de sangre mezcladas con PGE1 o forskolina o las muestras de control en la cámara de depósito de una célula de medición Kol/Epi o Kol/ADP (+37 °C) y se incubó durante 3 minutos a +37 °C en el equipo. Posteriormente, se generó con el equipo una baja presión de -40 mbar, por lo cual la sangre fue aspirada fuera de la 45 cámara de depósito a través de un capilar (diámetro 200 μm) y finalmente a través de una abertura del elemento de separación, ingresando en la cámara de medición. Como tiempo de cierre se determinó el tiempo necesario hasta el cierre de la abertura a través de la formación de un trombo. Cada muestra analizada fue analizada dos veces y como valor de medición se utilizó el valor medio de una prueba doble. 50

Los resultados de las investigaciones están resumidas en la figura 2 para la célula de medición Kol/Epi y en la figura 3 para la célula de medición Kol/ADP, en relación con las descripciones de las figuras correspondientes.

En la tabla 1 y la tabla está detallado, individualmente, para cuántas muestras tratadas con, respectivamente, 11 MRS 2395 o ácido acetilsalicílico se efectuaron las mediciones de un tiempo de 5 cierre por encima del cut-off, mediante el procedimiento acorde a la invención, utilizando una célula de medición convencional Kol/Epi (tabla 1) o una célula de medición Kol/ADP (tabla 2).

Célula de medición Kol/Epi

Con la célula de medición Kol/Epi sólo se mide, sin adición de un activador de adenilato ciclasas intracelulares (control) en sólo 3 de 11 muestras tratadas con MRS 2395 y en 8 de 11 10 muestras tratadas con ASS, una agregación de trombocitos anormalmente reducida. Utilizando el procedimiento acorde a la invención, es decir, a través de la mezcla previa de las muestras con PGE1 o forskolina, se comprobó una agregación de trombocitos anormalmente reducida utilizando PGE1 en todas las muestras tratadas con MRS 2395y en todas aquellas tratadas con ASS y utilizando forskolina, en 9 de 11 muestras tratadas con MRS 2395 y en todas las muestras tratadas con ASS. Sin 15 embargo, la cantidad utilizada de prostaglandina E1 también provoca una prolongación significativa de los tiempos de cierre de los controles, mientras que en el caso de la cantidad utilizada de forskolina sólo se observa una prolongación reducida de los tiempos de cierre de los controles. La utilización del procedimiento acorde a la invención provoca un notable incremento de la sensibilidad de la célula de medición Kol/Epi para una función plaquetaria provocada por el bloqueo del receptor P2Y(12) o a 20 través de la inhibición de la ciclooxigenasa- 1.

Tabla 1

Célula de medición Kol/Epi: Cantidad de muestras con tiempo de cierre por encima del cut- off (n: 11)

Muestra Activador: MRS 2395 (Antagonista P2Y(12)) Ácido acetilsalicílico (inhibidor de COX-1)

Control: 3 8

+12,5 nM de PGEI: 11 11

+1 μM de Forskolin: 9 11

Célula de medición Kol/ADP

Con la célula de medición Kol/ADP sólo se mide, sin adición de un activador de adenilato 25 ciclasas intracelulares (control) en sólo 2 de 11 muestras tratadas con MRS 2395 y en sólo 1 de 11 muestras tratadas con ASS, una agregación de trombocitos anormalmente reducida. Utilizando el procedimiento acorde a la invención, es decir, a través de la mezcla previa de las muestras con PGE1 o forskolina, se comprobó una agregación de trombocitos anormalmente reducida utilizando PGE1 en todas las muestras tratadas con MRS 2395 y en 4 de 11 muestras tratadas con ASS y utilizando 30 forskolina, en 10 de 11 muestras tratadas con MRS 2395 y en ninguna de las muestras tratadas con ASS. Ni la cantidad de forskolina utilizada ni la cantidad de Protaglandina E1 utilizada provocaron una prolongación significativa de los tiempos de cierre de los controles. Gracias a la adición de 1 μM de forskolina se puede incrementar notablemente la sensibilidad ante el bloqueo del receptor P2Y(12), sin originar por ello una sensibilidad significativa ante la función plaquetaria inducida por ASS, como 35 ocurre en le caso de la adición de 12,5 nM de prostaglandina.

Por ello, gracias a su elevada sensibilidad ante las funciones plaquetarias inducidas por antagonistas P2Y(12) o, en el caso de la célula de medición Kol/ADP, su sensibilidad reducida ante funciones de de trombocitos inducidas por ácido acetilsalicílico, el procedimiento acorde a la invención es adecuado para la diferenciación de ambas clases de antitrombóticos. 40

Tabla 2

Célula de medición Kol/ADP: Cantidad de muestras con tiempo de cierre por encima del cut- off (n: 11)

Control: 2 1

+12,5 nM de PGE1: 11 4

+1 μM de Forskolin: 10 0

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre completa, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos:

a) conducción de la sangre a través de un capilar y, posteriormente, a través de una abertura de un elemento de separación que contiene, al menos, un activador de 5 trombocitos del grupo de activadores de receptores de adenosina; y

b) medición del tiempo necesario para la formación de un trombo en la abertura del elemento de separación hasta el cierre de dicha abertura;

caracterizado porque antes del paso a través del capilar, la muestra de sangre completa es mezclada con prostaglandina E1 en una concentración final de 11 a 13 nM o con 10 forskolina en una concentración final de 0,1 a 5 μM.
2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento de separación utilizado en el paso a) contiene, al menos, un activadores de receptores de adenosina del conjunto de 5’-difosfato de adenosina, 5’-difosfato de 2-metiltioadenosina y sus derivados.
3. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el 15 elemento de separación utilizado en el paso a) contiene, adicionalmente, colágeno.
4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque a la muestra de sangre completa se le agrega forskolina en una concentración final de 0,5 a 2,5 μM, de modo especialmente preferido, de 1,0 a 1,5 μM.
5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la 20 muestra de sangre completa es anticoagulada con citrato, un inhibidor directo de la trombina, o un inhibidor de factor Xa directo.
6. Utilización de un procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 5 para determinar el efecto antitrombótico de un antagonista P2Y(12).
7. Utilización acorde a la reivindicación 6 para determinar el efecto antitrombótico de un 25 antagonista P2Y(12) del conjunto de clopidogrel, ticlopidina, prasugrel, MRS 2395, AR-C67085MX, cangrelor, C1330-7 y 5’-monofosfato 2-metiltioadenosina .
8. Utilización de un procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 5 para determinar el efecto antitrombótico de un antagonista P2Y(1).
9. Utilización acorde a la reivindicación 8 para determinar el efecto antitrombótico de un 30 antagonista P2Y(1) del conjunto de MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, 2’,5’-bisfosfato de adenosina, 3’,5’-bisfosfato de adenosina y 3’-fosfato,5’-fosfosulfato de adenosina.

“Siguen 3 páginas de dibujos”