WO2009106047A1 - Verfahren zur bestimmung der thrombozytenfunktion des blutes - Google Patents

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WO2009106047A1
WO2009106047A1 PCT/DE2009/000237 DE2009000237W WO2009106047A1 WO 2009106047 A1 WO2009106047 A1 WO 2009106047A1 DE 2009000237 W DE2009000237 W DE 2009000237W WO 2009106047 A1 WO2009106047 A1 WO 2009106047A1
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blood
substance
platelet
platelets
aperture
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PCT/DE2009/000237
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Michael Kratzer
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Vdg-Von Der Goltz Gmbh
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/88—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving prostaglandins or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the platelet function of the blood.
  • EP 0 223 044 B1 discloses a device in which the blood from a blood reservoir is sucked through an aperture with the aid of a piston movable in a cylinder and the pressure in the space between the piston and the drawn-in blood is measured. wherein the piston is moved by a drive so that a target pressure value is held in space. The movement of the piston serves as a measure of the blood flow rate.
  • EP 1 504 262 A1 discloses a method for determining the platelet function of the blood, in which blood is passed through an aperture.
  • each platelet determines the time after which the individual platelets first allow adherence of other platelets.
  • This platelet delay time is of utmost importance in connection with certain health risks and with the development of drugs means that the determination of said dr / dt slope, ie the platelet delay time, enables targeted statements to be made about health risks, eg about the risk of heart attack of a patient, and that therefore it is possible to specifically develop medicaments which inhibit the platelet delay. Affect delay time.
  • DE 10 2006 020 386 A1 discloses a method for determining platelet function in a whole blood sample, in which the whole blood is passed through a capillary and then through an aperture of a separating element (PFA-100® system, DADE / BEHRING Marburg GmbH, Marburg , Germany), wherein the separating element contains at least one platelet inactivator. It measures the time required to form a platelet plug at the aperture of the separator until the aperture is closed. Before the whole blood sample is passed through the capillary, it is mixed with at least one platelet inhibitor from the group prostaglandin El (PGEl), forskolin, prostaglandin 12
  • PFA-100® system DADE / BEHRING Marburg GmbH, Marburg , Germany
  • the object of this method is the measurement of e.g. Clopidogrel resistance by determination of CT. Disadvantage of this arrangement is that the determination of CT is often not possible because the blood volume of about 800 ⁇ l used is not sufficient to close the aperture by platelets
  • FIG. 5 shows a known method (PFA P2Y) in which the time required until the occlusion of a blood-perfused aperture is measured is measured.
  • PFA P2Y a known method
  • Figure 5 is part of the publication "van Werkum JW, th mountain JM, Calculator AR, de Haan J, hackeng CM. COMPARISON OF A NEW CARTRIDGE * FOR THE PFA-100® WITH OTHER PLATELET FUNCTION ASSAYS FOR MEASURING THE EFFECT OF CLOPIDOGRAPH THERAPY IN CARDIOVASCULAR PATIENTS.
  • clopidogrel resistance exists when the Platelet function of a patient by the administration of the standard dose of clopidogrel is not or hardly affected.
  • it can be checked whether a sufficient antithrombotic effect is actually achieved by the selected dosage.
  • Excessively high doses or effects of an antithrombotic drug can also be detected and treated, which is necessary, for example, before surgical interventions to exclude bleeding complications.
  • the object of the present invention is to provide a method for the relatively rapid and accurate determination of the blood platelet function after the addition of an antithrombotic agent.
  • the essential advantage of the present invention is that, in contrast to the method known from DE 10 2006 020 386 A1, the measurement of the platelet function of blood mixed with an antithrombotic agent does not reach the so-called cut-off, ie, not the actual Formation of a platelet graft must be performed in the aperture of a partition. Instead, the measurement of the platelet function of the blood which has been mixed with the antithrombotic agent can be carried out quickly and very reproducibly, even with small blood volumes, by determining the angle of the line indicating the aperture in accordance with the invention. In particular, it is not necessary to await the actual closure of the aperture, which may not occur for very long time or not at all. From the angle of said straight line, a statement about the expected cut-off can be made immediately.
  • the addition of the antithrombotic agent to the blood of a patient inhibits the action of ADP on the P2Y (12) platelet receptor (P2Y (12) antagonist). It is advantageously thought of, inter alia, groups of the following substances: clopidogrel, ticlopidine, prasugrel, cangrelor and other thienopyridines.
  • Figure 1 is a diagram showing the dependence of the diameter of the aperture of a platelet-functional system of time, due to the closure of the aperture by platelets;
  • Figure 2 is a schematic representation for explaining a platelet-functional system
  • FIG. 3 shows a diagram for explaining the measurement of the PTGA angle
  • Figure 4 is an illustration for explaining the principle of the present invention.
  • platelets After injury to a small vessel (arteriole), platelets adhere to the site of injury under physiological conditions to form a platelet thrombus that stops bleeding. Under pathological conditions, such platelet thrombi can shoot narrowed blood vessels and trigger a heart attack.
  • the platelets are activated by the nucleotide ADP (adenosine 5'-diphosphate).
  • ADP adenosine 5'-diphosphate
  • ADP adenosine 5'-diphosphate
  • adenylate cyclase is inhibited by ADP and more intracellular cAMP (adenosine-3 ', 5'-monophosphate) is formed, which inhibits the inhibition of phospholipase C, the intracellular Ca 2+ influx and thus the platelet aggregation.
  • cAMP adenosine-3 ', 5'-monophosphate
  • a second possibility to increase the intracellular cAMP concentration of platelets would be the administration of inhibitors of phosphodiesterase, which degrades cAMP to AMP (adenosine monophosphate).
  • inhibitors of phosphodiesterase which degrades cAMP to AMP (adenosine monophosphate).
  • phosphodiesterase inhibitors e.g. the stimulant caffeine, the bronchodilator theophylline or IBMX (I-sobutylmethylxanthine).
  • an antithrombotic agent for example in the form of clopidogrel, may be added to the patient's blood.
  • clopidogrel does not work in some patients for some reasons that are not yet known. It is therefore of utmost importance to provide a safe and practical test procedure that can be used to quickly determine whether clopidogrel works or not.
  • clopidogrel does not work under in-vitro conditions, so the conventional PFA-100® test can not be used with clopidogrel. It must therefore be determined under in-vitro conditions whether or not clopidogrel is effective in a patient.
  • the platelets flow in actual vessels, constantly releasing prostaglandin 12 from the vessels. These prostaglandins lead to an elevation of cAMP and thus to an inhibition of platelet function.
  • ADP is produced.
  • This ADP activates the platelets via a P2Y platelet receptor (1).
  • P2Y (12) receptor By adding clopidogrel to the blood of a patient, the lowering of cAMP of the platelets by ADP is prevented via the P2Y (12) receptor, so that the platelets are inhibited by the intracellular cAMP.
  • This method makes possible a particularly advantageous and clear and meaningful evaluation or measurement of the thrombocyte function of blood mixed with an antithrombotic agent with a relatively small blood volume, with small measurement times and with even better reproducibility and a significantly improved informative value.
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of a present device for determining the platelet delay time or the PTGA.
  • blood is passed through an aperture 3 of an aperture holder 2 from a reservoir, not shown, for example via a capillary 4, which forms a flow resistance Wc for the blood.
  • the aperture 3 forms a flow resistance Wa for the blood.
  • the hemodynamically effective radius of the aperture 3 can be calculated by time-dependent measurement of the resistance Wa and plotted over time as shown in FIG.
  • the aperture of the aperture 3 closes in a defined manner as a function of time in accordance with a straight line.
  • the straight dr / dt is determined in vitro using the method described above in whole blood of a patient treated with clopidogrel (or other P2Y (12) antagonists).
  • PGEI or other substances are also added to the blood before the measurement is carried out, which makes the effect of the clopidogrel visible by raising the cAMP concentration.
  • the clopidogrel acts and inhibits the thrombotic effect of ADP on the lowering of cAMP.
  • the high cAMP concentration induced by the PGEl inhibits the platelets, and therefore the measured angle PTGA becomes small and differs significantly from controls that did not receive clopidogrel.
  • a direct measurement of CT is often no longer possible because the measurement times would be too long to allow the complete formation of a platelet thrombus. Only an extrapolated CT (exCT) can be calculated from the angle PTGA.
  • Clopidogrel (or other P2Y (12) antagonists) does not work and ADP is able to lower cAMP and produce thrombus.
  • the PTGA angle increases and approaches the PTGA of controls who did not receive clopidogrel.
  • angle PTGA exCT
  • the angle PTGA ' (FIG. 3) can also be used to determine the slope dr / dt of the straight line.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro- Bestimmung der Thrombozytenfunktion des mit einer die Blutplättchen inhibierenden ersten Substanz versetzten Blutes eines Patienten, wobei dem Blut eine die Blutplättchen aktivierende zweite Substanz zugeführt wird, das Blut zum Nachweis der Wirkung der ersten Substanz mit einer die Plättchen inhibierenden dritten Substanz versetzt wird, das Blut durch eine Apertur (3) geleitet wird, und die Steigung (dr/dt) einer Geraden ermittelt wird, die die zeitabhängige Änderung des hämodynamischen Radius der Apertur (3) als Maß für die Wirkung der ersten Substanz darstellt.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion des Blutes
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion des Blutes.
Es sind verschiedene Einrichtungen zur Untersuchung der Aggregation der Blutplättchen bzw. der Koagulation des Blutes bekannt. Beispielsweise geht aus der EP 0 223 044 Bl eine Einrichtung hervor, bei der das Blut aus einem Blut- Vorratsraum mit der Hilfe eines in einem Zylinder bewegbaren Kolbens durch eine Apertur hindurchgesaugt und der Druck im Raum zwischen dem Kolben und dem eingesaugten Blut gemessen werden, wobei der Kolben durch einen Antrieb so bewegt wird, dass ein Solldruckwert im Raum gehalten wird. Die Bewegung des Kolbens dient als Maß für die Blutflussmenge.
Aus der EP 1 504 262 Al geht ein Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion des Blutes hervor, bei dem Blut durch eine Apertur geführt wird. Bei der zeitabhängigen Bestimmung des Zusetzens der Apertur durch Blutplättchen beim Durchströmen von Blut hat sich überraschenderweise ergeben, dass sich die Apertur in einer ganz definierten Weise verschließt, nämlich entsprechend der in der Figur 1 der vorliegenden Patentanmeldung dargestellten Geraden, deren Steigung dr/dt (r = hämodyamische Durchmesser der Apertur; t = Zeit) die Wachstumsrate angibt. Bei einer gleichzeitigen Berechnung der zeitabhängigen Wand-Scherrate der Blutplättchen, die ein Maß für die Transportrate der Blutplättchen darstellt, wurde erkannt, dass die Wand-Scherrate von einem anfangs niedrigen Wert im Bereich der Apertur stark ansteigt. Da die Wachstumsrate während dieser Zeit aber exakt gleich bleibt, kann ge- folgert werden, dass eine Blutplättchen-Delay-Time besteht, die diejenige Zeit angibt, nach der die einzelnen Blutplättchen erst ein Anhaften anderer Blutplättchen zulassen. Anders ausgedrückt „bestimmt" jedes Blutplättchen wann, d.h. also nach welcher Verzögerungszeit bzw. Delay-Time, andere Blutplättchen an ihm haften dürfen. Diese Blutplättchen-Delay- Time ist im Zusammenhang mit bestimmten Gesundheitsrisiken und mit der Entwicklung von Medikamenten von größter Bedeutung. Dies bedeutet, dass durch die Ermittlung der genannten Steigung dr/dt, d.h. also der Blutplättchen-Delay-Time, gezielte Aussagen über Gesundheitsrisiken, z.B. über das Herzinfarktrisiko eines Patienten, getroffen werden können und dass daher gezielt Medikamente entwickelt werden können, die die Blutplättchen-Delay-Time beeinflussen.
Im Zusammenhang mit der Figur 2 der vorliegenden Patentanmeldung wird ein ebenfalls aus der EP 1 504 262 Al bekanntes Verfahren erläutert, nach dem eine besonders vorteilhafte und für den Anwender klare und aussagefähige Auswertung bzw. Messung der Thrombozytenfunktion von mit einem antithrombotischen Mittel versetztem Blut mit einem relativ kleinen Blutvolumen, bei kleinen Messzeiten und einer noch besseren Reproduzierbarkeit möglich ist. Dabei wird der Winkel PTGA (Platelet Thrombus Growth Angle) , der zwischen der Geraden und der t-Achse besteht, ermittelt. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn dieser Winkel relativ klein ist und die Gerade daher flach verläuft, wie dies bei einer sehr langsamen Thrombusausbildung in der Apertur der Fall ist, welche z.B. auf eine Medikamenteneinnahme (beispielsweise von Aspirin oder eines sonstigen antithrombotischen Mittels) zurückzuführen ist. In diesem Fall würden sich nämlich bei der Ermittlung des Wertes CT (Closure Time) nach dem weiter oben erläuterten Verfahren schon bei geringen Abweichungen der Steigung dr/dt der Geraden riesige Schwankungen des Wertes CT ergeben. Diese Schwankungen sind umso größer, je weiter der Wert CT vom Nullpunkt der t-Achse entfernt ist. In einem sol- chen Fall ist die Ermittlung bzw. Angabe des Winkels PTGA aussagekräftiger, weil sie den genannten Schwankungen nicht unterworfen ist. Außerdem kann dieser Winkel PTGA sehr schnell aus der am Anfang einer Messung ermittelten Steigung der Geraden ermittelt werden, so dass die Messzeit relativ kurz sein kann und zur Messung ein nur relativ kleines Blutvolumen benötigt wird. Man kann dann über eine lineare Extrapolation auf die t-Achse eine CT errechnen.
Aus der DE 10 2006 020 386 Al geht ein Verfahren zur Bestimmung der Thrombozytenfunktion in einer Vollblutprobe hervor, bei dem das Vollblut durch eine Kapillare und anschließend durch eine Apertur eines Trennelements geleitet wird (PFA- 100® System, DADE/BEHRING Marburg GmbH, Marburg, Deutschland) , wobei das Trennelement mindestens einen Thrombozyte- naktivator enthält. Es wird die Zeit gemessen, die für die Ausbildung eines Thrombozytenpfropfs an der Apertur des Trennelementes bis zum Verschluss der Apertur benötigt wird. Vor dem Durchleiten der Vollblutprobe durch die Kapillare wird diese mit mindestens einem Plättcheninhibitor aus der Gruppe Prostaglandin El (PGEl), Forskolin, Prostaglandin 12
(PGI2, Prostacyclin) und deren Derivate versetzt. Aufgabe dieses Verfahrens ist die Messung z.B. einer Clopidogrelre- sistenz durch Bestimmung der CT. Nachteil dieser Anordnung ist es, dass die Bestimmung der CT häufig nicht möglich ist, weil das eingesetzte Blutvolumen von ca. 800μl nicht ausreicht um die Apertur durch Blutplättchen zu verschließen
(siehe: „Specific and sensitive detection of the inhibition of the platelet P2Y12-receptor with the PFA-100® System using a new cartridge design"; Rechner et al. Congress Abstract CD- ROM; XXIst Congress of the International Society on Thrombo- sis and Haemostasis, Geneva 2007) .
Aus der Figur 5 geht ein bekanntes Verfahren (PFA P2Y) hervor, bei dem die Zeit gemessen wird, die bis zum Verschluss einer von Blut durchströmten Apertur erforderlich ist. Dabei hat sich ergeben, dass die PFA P2Y Werte keine Normalverteilung zeigen. Die Figur 5 ist Bestandteil der Veröffentlichung „van Werkum JW, ten Berg JM, Rechner AR, de Haan J, Hackeng CM. COMPARISON OF A NEW CARTRIDGE* FOR THE PFA-100® WITH OTHER PLATELET FUNCTION ASSAYS FOR MEASURING THE EFFECT OF CLOPIDOGREL THERAPY IN CARDIOVASCULAR PATIENTS. J Thromb Hae- most 2007; 5 Supplement 2: P-T-362". Überraschenderweise erhielten die Verfasser dieser Studie ein Ergebnis mit zwei Gipfeln (Ja/-Nein Aussage) . Das erste Maximum liegt, wie die nachfolgende Vergrößerung der Figur 5 deutlich zeigt, bei einer Closure Time (CT) von etwa 95 s. Das zweite Maximum kann mit dem PFA P2Y Verfahren nicht mehr gemessen werden, da die CT über 300 s liegt. Sie wird aber fälschlicherweise im Test mit CT = 300 s gleichgesetzt. Die Ursache für dieses merkwürdige Verhalten der in vitro Thrombogenese unter diesen Bedingungen ist nicht bekannt. Wahrscheinlich kommt es daher, weil im Test zugegebenes plättcheninhibierendes Prostaglandin die CT Werte nach oben verschiebt.
Bei dem beschriebenen Verfahren PFA P2Y ist es daher prinzipiell nur möglich, einen unteren Referenzwert („Cut-off Ie- vel" : 95 s) anzugeben. Jedes Medikament hat aber immer einen optimalen Konzentrations-Bereich, d.h. es muss auch ein oberer Referenzwert angegeben werde können (wie z.B beim Quicktest bei der Marcumar Behandlung) , der anzeigt, wenn ein Patient mit Clopidogrel überdosiert ist. Dies ist besonders wichtig da der Patient unter diesen Bedingungen verbluten könnte. Das geschilderte Problem mit dem PFA P2Y Test ist möglicherweise auch die Ursache dafür, dass der neue interessante PFA P2Y-Test nicht in die Routine eingeführt wurde.
Im Zusammenhang mit der Thrombozytenfunktion von Patienten, die antithrombotisch therapiert werden, ist das Auftreten einer Clopidogrelresistenz ein ernst zu nehmender Risikofaktor. Eine solche Clopidogrelresistenz liegt dann vor, wenn die Thrombozytenfunktion eines Patienten durch die Gabe der Standarddosis Clopidogrel nicht oder kaum beeinflusst wird. Durch die Bestimmung der Thrombozytenfunktion kann überprüft werden, ob durch die gewählte Dosierung tatsächlich eine ausreichende antithrombotische Wirkung erzielt wird. Es können auch zu hohe Dosierungen oder Wirkungen eines antithrombotischen Medikamentes festgestellt und behandelt werden, was z.B. vor operativen Eingriffen zum Ausschluss von Blutungskomplikationen notwendig ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur relativ schnellen und genauen Bestimmung der Thrombozytenfunktion von Blut nach der Zugabe eines antithrombotischen Mittels zu schaffen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
Der wesentliche Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass im Gegensatz zu dem aus der DE 10 2006 020 386 Al bekannten Verfahren die Messung der Thrombozytenfunktion von mit einem antithrombotischen Mittel versetztem Blut nicht bis zum so genannten Cut-Off, d. h. also nicht bis zur tatsächlichen Ausbildung eines Thrombozytenpfropfs in der Apertur einer Trennwand ausgeführt werden muss. Stattdessen kann durch die erfindungsgemäße Bestimmung des Winkels der das Verschließen der Apertur anzeigenden Geraden zur Zeitachse die Messung der Thrombozytenfunktion des mit dem antithrombotischen Mittels versetzten Blutes schnell und sehr gut reproduzierbar auch bei kleinen Blutvolumina erfolgen. Insbesondere ist es nicht erforderlich den tatsächlichen Verschluss der Apertur abzuwarten, der möglicherweise erst nach sehr langer Zeit oder überhaupt nicht eintreten wird. Aus dem Winkel der genannten Geraden kann sofort eine Aussage über den zu erwartenden Cut-Off getroffen werden. Durch die Zugabe des antithrombotischen Mittels zum Blut eines Patienten wird die Wirkung von ADP auf den thrombozytären P2Y(12) Rezeptor gehemmt (P2Y ( 12 ) -Antagonist ). Dabei wird vorteilhafterweise u. a. an Gruppen folgender Substanzen gedacht: Clopidogrel, Ticlopidin, Prasugrel, Cangrelor und andere Thienopyridine .
Im folgenden werden die Erfindung und deren Ausgestaltungen im Zusammenhang mit den Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeit des Durchmessers der Apertur eines Thrombozyten-Funktions-Systems von der Zeit, bedingt durch den Verschluss der Apertur durch Blutplättchen;
Figur 2 eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Thrombozyten-Funktions-Systems;
Figur 3 eine Darstellung zur Erläuterung der Messung des PTGA-Winkels; und
Figur 4 eine Darstellung zur Erläuterung des Prinzips der vorliegenden Erfindung.
Zu der Erfindung führten die folgenden Überlegungen. Nach Verletzung eines kleinen Gefäßes (Arteriole) haften Blutplättchen unter physiologischen Bedingungen an der Verletzungsstelle und bilden einen Plättchenthrombus, der die Blutung stoppt. Unter pathologischen Bedingungen können solche Plättchenthromben verengte Blutgefäße verschießen und so einen Herzinfarkt auslösen. Dabei werden die Blutplättchen unter anderem durch das Nucleotid ADP (Adenosin-5 ' -diphosphat ) aktiviert. Dieses ADP kann aus verletzten Gefäßwandzellen o- der aus aktivierten Thrombozyten freigesetzt werden. Es sind daher Medikamente von Bedeutung, die die Aktivierung von Blutplättchen durch ADP hemmen. Ein solcher Antagonist ist z.B. Clopidogrel. Metaboliten dieser Substanz hemmen die Aktivierung des P2Y(12) Thrombozyten-Membran-Rezeptors durch ADP irreversibel, wie dies in der Figur 4 dargestellt ist. Auf diese Weise wird die Hemmung der Adenylatzyklase durch ADP inhibiert und es entsteht mehr intrazelluläres cAMP (Ade- nosin-3 ' , 5 ' -monophosphat ) welches über die Hemmung der Phospholipase C den intrazellulären Ca2+-Einstrom und somit die Plättchenaggregation inhibiert.
Es ist nun aus der Druckschrift „Inhibition of ADP-induced intracellular Ca2+ responses and platelet aggregation by the P2Y12 receptor antagonists AR-C69931MX and Clopidogrel is en- hanced by Prostaglandin El": Fox et al. Cell Calcium 35 (2004), Seiten 39 - 46 bekannt und auch logisch dass die Hemmung der Plättchenaktivierung durch Clopidogrel effektiver ist wenn man zusätzlich Substanzen zugibt, die die cAMP Konzentrationen anheben, wie z. B. durch Prostaglandin El, welches über G-Protein-gekoppelten Prostaglandin-E-Rezeptoren die Adenylatzyklase aktiviert. Man kann natürlich die Konzentration des cAMP durch Metaboliten des Clopidogrel nur dann senken, wenn tatsächlich eine signifikante Konzentration des cAMP vorhanden ist.
Eine zweite Möglichkeit die intrazelluläre cAMP Konzentration von Blutplättchen anzuheben wäre die Gabe von Inhibitoren der Phosphodiesterase, welche cAMP zu AMP (Adenosinmonophosphat ) abbaut. Hier kann an selektive oder an nicht selektive Phosphodiesterasehemmer gedacht werden, wie z.B. das Stimulans Koffein, der Bronchodilatator Theophyllin oder IBMX (I- sobutylmethylxanthine) .
Der geschilderte Mechanismus ist eine Erklärung dafür, dass Metaboliten von Clopidogrel unter In-vitro-Bedingungen z. B. im konventionellen Plättchenfunktionstest PFA-100® (Kolla- gen/ADP, Kollagen/Epi Messzellen) nicht wirken, im Gegensatz zur physiologischen Situation in vivo, in der die Blutplätt- chen ständig durch aus dem Endothel freigesetzten Prostaglandine gehemmt werden.
Es kann also beispielsweise im Falle eines Herzinfarktes oder im Falle eines drohenden Herzinfarktes ein antithrombotisches Mittel, beispielsweise in der Form von Clopidogrel dem Blut des Patienten zugegeben werden.
Eine Tatsache ist aber, dass das Clopidogrel bei manchen Patienten aus bestimmten Gründen, die bisher nicht bekannt sind, nicht wirkt. Es ist daher von größter Bedeutung ein sicheres und praktikables Testverfahren bereitzustellen, mit dem schnell festgestellt werden kann, ob Clopidogrel wirkt oder nicht. Da aber, wie oben bereits erläutert Clopidogrel unter in-vitro Bedingungen nicht wirkt, kann der konventionelle PFA-100® Test im Zusammenhang mit Clopidogrel nicht angewendet werden. Es muss daher unter in-vitro Bedingungen festgestellt werden, ob Clopidogrel bei einem Patienten wirkt oder nicht .
Hierzu werden zunächst die in vivo-Situation und die in- vitro-Situation anhand der Figur 4 miteinander verglichen.
In vivo fließen die Blutplättchen in wirklichen Gefäßen, wobei ständig Prostaglandin 12 von den Gefäßen abgegeben werden. Diese Prostaglandine führen zu einer Anhebung von cAMP und somit zu einer Inhibierung der Plättchenfunktion. Beim Auftreten von intravasalen Gefäßverletzungen entsteht ADP. Dieses ADP aktiviert einerseits über einen thrombozytären Rezeptor P2Y(1) die Blutplättchen. Wenn man nun Clopidogrel zu dem Blut eines Patienten zugibt, wird die Absenkung von cAMP der Blutplättchen durch ADP über den P2Y(12) Rezeptor verhindert, sodass die Blutplättchen durch das intrazelluläre cAMP inhibiert werden. Wenn man nun aber dem Blut in-vitro eine Lösung wie PGEl, Forskolin oder PGI2 zusetzt, welche die intrazelluläre cAMP Konzentration der Plättchen anhebt, wird die durch das Clopidogrel (oder andere P2Y(12) Antagonisten) bewirkte Inhibition der ADP Wirkung auf die Senkung von cAMP im Plättchenfunktionstest besser sichtbar. Der additive Effekt der beiden Plättchen-inhibierenden Pharmaka führt allerdings zu langen in-vitro Blutungszeiten (CT) . Das eingesetzte Blutungsvolumen von z.B. 800μl reicht dann häufig nicht aus, um die Apertur durch einen Plättchenthrombus zu verschließen.
Im folgenden wird das vorliegende Verfahren im Zusammenhang mit den Figuren 2 und 3 näher erläutert. Dieses Verfahren ermöglicht eine besonders vorteilhafte und für den Anwender klare und aussagefähige Auswertung bzw. Messung der Thrombo- zytenfunktion von mit einem antithrombotischen Mittel versetztem Blut mit einem relativ kleinen Blutvolumen, bei kleinen Messzeiten und mit einer noch besseren Reproduzierbarkeit und einer wesentlich verbesserten Aussagekraft.
Die Figur 2 zeigt in schematischer Darstellung eine vorliegende Einrichtung zur Ermittlung der Blutplättchen-Delay-Time bzw. des PTGA. Im wesentlichen wird dabei entsprechend dem Pfeil 1 Blut aus einem nicht näher dargestellten Vorratsraum, beispielsweise über eine Kapillare 4, die einen Strömungswiderstand Wc für das Blut bildet, durch eine Apertur 3 eines Aperturhalters 2 hindurchbewegt. Die Apertur 3 bildet einen Strömungswiderstand Wa für das Blut. In der aus der EP 1 504 262 Al bekannten Weise kann durch zeitabhängiges Messen des Widerstandes Wa der hämodynamisch wirksame Radius der Apertur 3 berechnet und gemäß Figur 3 über der Zeit aufgetragen werden.
Aus der Figur 3 ist erkennbar, dass sich die Öffnung der Apertur 3 in Abhängigkeit von der Zeit entsprechend einer Geraden definiert verschließt. Erfindungsgemäß wird nun wie folgt vorgegangen. Die Gerade dr/dt wird nach dem zuvor beschriebenen Verfahren in-vitro mit dem Vollblut eines mit Clopidogrel (oder andere P2Y(12) Antagonisten) behandelten Patienten bestimmt. Um zu testen, ob das Clopidogrel bei dem bestimmten Patienten wirkt oder nicht, wird dem Blut vor der Ausführung der Messung ferner PGEl oder andere Substanzen zugeführt, die über die Anhebung der cAMP Konzentration die Wirkung des Clopidogrels sichtbar macht .
Folgende Möglichkeiten sind denkbar:
1) Das Clopidogrel (oder andere P2Y(12) Antagonisten) wirkt und inhibiert die thrombotische Wirkung des ADP auf die Absenkung des cAMP. Die durch das PGEl induzierte hohe cAMP Konzentration hemmt die Blutplättchen, weshalb der gemessene Winkel PTGA klein wird und sich signifikant von Kontrollpersonen unterscheidet, die kein Clopidogrel erhalten haben. Eine direkte Messung der CT ist oft nicht mehr möglich, da die Messzeiten zu lang würden, um die vollständige Ausbildung eines Plättchenthrombus zu ermöglichen. Nur eine extrapolierte CT (exCT) kann anhand des Winkels PTGA berechnet werden.
2) Das Clopidogrel (oder andere P2Y(12) Antagonisten) wirkt nicht und das ADP ist in der Lage cAMP abzusenken und eine Thrombusausbildung zu erzeugen. Der PTGA Winkel wird größer und nähert sich dem PTGA von Kontrollpersonen, die kein Clopidogrel erhalten haben.
Durch diese Bestimmung des Winkels PTGA (exCT) gemäß der vorliegenden Erfindung, kann schnell und sicher bestimmt werden, ob Clopidogrel (oder andere P2Y(12) Antagonisten) im Blut von Patienten eine inhibierende Wirkung auf Thrombozyten ausübt oder nicht. Anstelle des Winkels PTGA kann zur Bestimmung der Steigung dr/dt der Geraden auch der Winkel PTGA' (Figur 3) herangezogen werden.

Claims

Patentansprüche
1) Verfahren zur In-vitro-Bestimmung der Thrombozyten- funktion des mit einer die Blutplättchen inhibierenden ersten Substanz versetzten Blutes eines Patienten, wobei dem Blut eine die Blutplättchen aktivierende zweite Substanz zugeführt wird, das Blut zum Nachweis der Wirkung der ersten Substanz mit einer die Plättchen inhibierenden dritten Substanz versetzt wird, das Blut durch eine Apertur (3) geleitet wird, und die Steigung (dr/dt) einer Geraden ermittelt wird, die die zeitabhängige Änderung des hämody- namischen Radius der Apertur (3) als Maß für die Wirkung der ersten Substanz darstellt.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Substanz die Absenkung von intrazellulären cAMP der Blutplättchen durch die zweite Substanz über den P2Y (12) -Rezeptor hemmt.
3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Substanz ein P2Y(12) Antagonist ist, wie z.B. Clopidogrel, Ticlopidin, Prasugrel, Cangrelor und andere Thienopyridine .
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Substanz ein Ago- nist des P2Y(12) Plättchenrezeptors, vorzugsweise ADP oder Analoge von ADP, ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Substanz die intrazelluläre cAMP Konzentration der Blutplättchen durch Aktivierung der Adenylatzyklase ansteigen lässt und vorzugsweise PGEl, Forskolin oder PGI2 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die dritte Substanz die intrazelluläre cAMP Konzentration der Blutplättchen durch Inhibierung der Phosphodiesterase anhebt und vorzugsweise Koffein, Theophyllin oder IBMX(I- methyl-3- (2-methylpropyl) -7H-purine-2, 6-dione) ist.
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