ES2352635A1 - Implante con calcio en su superficie, y método de modificación de la superficie de un implante para dotar a dicha superficie de calcio. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a un implante para cuerpo humano o animal, que en su superficie externa comprende al menos una sal de calcio soluble en líquido polar, y a diversos métodos para la preparación del implante anterior. Los iones de calcio contenidos en la superficie del implante dotan a dicha superficie de cuatro propiedades química o biológicamente muy deseables: hidrofilicidad, protección frente a la contaminación atmosférica, propiedad procoagulante y propiedad promineralizante.
Description
Implante con calcio en su superficie, y métodos
de modificación de la superficie de un implante para dotar a dicha
superficie de calcio.
La invención se refiere a un implante con calcio
en su superficie, y a un método de modificación de la superficie de
un implante para dotar a dicha superficie de calcio, pretendiendo
así conseguir nuevos efectos químicos y biológicos interesantes para
conseguir, entre otros beneficios, mejorar la osteointegración del
implante en el tejido circundante.
El proceso que conduce a la osteointegración
satisfactoria de un implante en el tejido adyacente es complejo y
comienza con el desencadenamiento de la cascada de coagulación,
agregación plaquetaria y formación del coágulo de la sangre
circundante al implante, lo que se deriva en el establecimiento de
una matriz o red provisional de fibrina alrededor del implante. Esta
red provisional cumple dos funciones importantes: permite la
estabilidad inicial del implante y la liberación gradual de factores
plaquetarios y señalizadores celulares. Los señalizadores celulares
estimulan, entre otros procesos y por este orden, la migración
celular a la zona de la herida, su adhesión, diferenciación y
proliferación y la secreción de la matriz extracelular con su
consiguiente mineralización para acabar formando la matriz ósea
definitiva alrededor del implante.
En la capacidad de osteointegración de un
implante en el tejido adyacente influyen, en lo que respecta a la
superficie del implante, especialmente tres factores: por un lado,
son relevantes los materiales utilizados para fabricar el implante;
por otro lado, influye el grado de rugosidad de la superficie del
implante; en tercer lugar, la superficie del implante puede recibir
tratamientos para disponer de un recubrimiento adicional
biológicamente conveniente.
En lo que respecta a los materiales usados para
implantología, estos se consideran biocompatibles en la medida en
que su química superficial permite la interacción con las moléculas
biológicas claves en el desarrollo del proceso arriba citado y en el
tejido biológico en cuestión. Típicamente, estos materiales
consisten en titanio o aleaciones en base a titanio, zirconio o
aleaciones en base a zirconio; opcionalmente, los materiales pueden
contener aditivos en forma de metales biocompatibles como el niobio
o el tántalo.
En lo que respecta a la rugosidad de la
superficie del implante, se ha podido comprobar que la aportación de
micro y nanorrugosidad en la superficie de estos materiales
incrementa notablemente la conexión implante-hueso
con respecto a las superficies no rugosas. Se conocen numerosos
métodos para obtener rugosidad, como por ejemplo el granallado o el
tratamiento ácido (o combinaciones de ambos).
Por último, en lo que respecta al tratamiento de
la superficie de los implantes, en el estado de la técnica se
conocen múltiples métodos de fabricación o tratamiento de implantes
en los cuales el implante es provisto de un recubrimiento que
persigue mejorar algunas de las propiedades del implante, mejorar y
acelerar la osteointegración del mismo y/o reducir el riesgo de
rechazo del mismo por parte del paciente.
Entre ellos, se conocen métodos que permiten la
aplicación sobre la superficie del implante de fosfatos cálcicos
(Ca/P) (particularmente, de entre ellos, la hidroxiapatita) con el
fin de dotar al implante de un recubrimiento cerámico similar a la
parte mineral del hueso. El fin de dicho recubrimiento cerámico es
aumentar las propiedades osteoconductivas del implante para fomentar
la regeneración ósea periimplante. Dentro de estos métodos de
aplicación de fosfatos cálcicos se conocen, por un lado, métodos en
los cuales los fosfatos cálcicos son aplicados al implante por vías
húmedas o SBF ("Simulated Body Fluid", ver Kim, H. M.; Miyaji,
F.; Kokubo, T. & Nakamura, T. (1996), "Preparation of
bioactive Ti and its alloys via simple chemical surface
treatment", J Biomed Mater Res 32(3),
409-417). En estos métodos el implante se sumerge en
una solución que contiene una serie de iones, entre ellos iones Ca y
P, dando lugar a la precipitación de fosfatos cálcicos en la
superficie del implante. Ejemplos de estos métodos por vías húmedas
o SBF pueden encontrarse en EP0389713, EP1384524 y US6426114. Se
conocen por otro lado métodos en los que los fosfatos cálcicos son
aplicados al implante por vías electroquímicas. En estos métodos, el
implante es sumergido en una solución que contiene una serie de
iones, entre ellos iones Ca y P, formándose capas de fosfato cálcico
sobre el implante de manera mas acelerada gracias a la aplicación de
procesos electroquímicos (ver Yang, B.; Uchida, M.; Kim, H.-M.;
Zhang, X. & Kokubo, T. (2004), "Preparation of bioactive
titanium metal via anodic oxidation treatment", Biomaterials
25(6), 1003-1010; ver Rössler, S.; Sewing,
A.; Stölzel, M.; Born, R.; Scharnweber, D.; Dard, M. & Worch, H.
(2003), "Electrochemically assisted deposition of thin calcium
phosphate coatings at near-physiological pH and
temperature", J Biomed Mater Res A 64(4),
655-663). Ejemplos de estos métodos por vías
electroquímicas pueden encontrarse en EP1264606, US5478237, y
WO2004024200. Se conocen también métodos en los que los fosfatos
cálcicos son aplicados al implante por vías físicas. En dichos
métodos se pulverizan precursores de Ca/P sobre el implante mediante
plasma spray o láser (ver Arias, J. L.; García-Sanz,
F. J.; Mayor, M. B.; Chiussi, S.; Pou, J.; León, B. &
Pérez-Amor, M. (1998), "Physicochemical properties
of calcium phosphate coatings produced by pulsed láser deposition at
different water vapour pressures", Biomaterials 19(10),
883-888). Ejemplos de estos métodos pueden
encontrarse en EP0202908, EP0864332 y WO9821380. En todos los
citados métodos, el acabado superficial final del implante es
seco.
Además de los anteriores, existen otros métodos
llamados "de acondicionamiento" de la superficie de implantes,
en los cuales se varían las propiedades superficiales del implante
mediante su almacenamiento en soluciones diluidas de cloruro sódico
(NaCl) (ver por ejemplo el documento US20040210309A1) o su inmersión
previo uso en soluciones diluidas de hidróxido sódico (NaOH) (ver
por ejemplo Stadlinger, B.; Lode, A. T.; Eckelt, U.; Range, U.;
Schlottig, F.; Hefti, T. & Mai, R. (2009),
"Surface-conditioned dental implants: an animal
study on bone formation"., J Clin Periodontol 36(10),
882-891). En el primer caso se persigue mantener el
implante en un medio que evite su contaminación atmosférica por
hidrocarburos y que preserve el nivel de limpieza original. Además,
el almacenamiento en un líquido iónico permite vencer la
hidrofobicidad inducida por la rugosidad de la superficie del
implante, lo que favorece la humectabilidad de dicha superficie por
líquidos polares. En el segundo caso se pretende la exposición de
grupos hidroxilo superficiales, los cuales participan en la
formación de fosfatos cálcicos (Ca/P) en la superficie del implante
una vez colocado en el alveolo. Este último acondicionamiento
presenta una mejor humectabilidad con respecto al no modificado,
pero no evita la contaminación superficial previa ya que la
inmersión en el líquido se realiza en el mismo momento de su
uso.
Existen otros tratamientos de la superficie de
implantes que se basan en la modificación de la red cristalina del
titanio por la introducción de calcio, dando lugar a titanatos de
calcio. Esto se realiza mediante la aplicación de métodos
electroquímicos o térmicos durante un tiempo determinado. Un ejemplo
de este tipo de tratamiento puede encontrarse en JP2006102212. En
superficies de titanio dotadas de estos tratamientos se preconiza
una más rápida formación de apatita.
La presente invención tiene como objetivo
proporcionar un método de fabricación de un implante alternativo a
los anteriores, en el cual se dote al implante de una superficie
diferente, que no sólo presente una alta hidrofilicidad superficial
relativamente constante en el tiempo sino que aporte nuevas
propiedades biológicas interesantes para la óptima osteointegración
e implantación del implante en el hueso y el cuerpo del
paciente.
Es objeto de la invención un implante para
cuerpo humano o animal que presenta la particularidad de que su
superficie externa comprende al menos una sal de calcio soluble en
líquido polar, es decir, calcio formando parte de un compuesto con
capacidad para solubilizarse de forma sustancialmente inmediata al
exponerse a un solvente polar (como por ejemplo agua, etanol, etc.).
La disolución del calcio equivale a que el calcio se ioniza, es
decir, se libera en forma de ion del compuesto inicial.
De este modo, el implante según la invención es
tal que, al entrar en contacto con un líquido polar, pasa a disponer
de iones de calcio superficiales, en estado libre (iones de calcio
libres). Los iones de calcio son capaces de actuar libremente y
proporcionar una serie de efectos ventajosos que se explican más
adelante (destacando entre dichos efectos su acción procoagulante) y
que han sido comprobados mediante ensayo. En cambio, en los
implantes convencionales descritos provistos de fosfatos cálcicos
(Ca/P) o de titanatos de calcio (CaTiO_{3}), el calcio se
encuentra presente en forma de compuesto insoluble (entendiendo por
insoluble cualquier compuesto con una solubilidad en agua menor de 1
g/L) y por lo tanto bloqueado para ser liberado al medio y poder
interactuar libremente. Por ello, en dichos implantes convencionales
el calcio no es capaz de proporcionar las funciones biológicas que
ofrece el calcio en la presente invención.
La sal de calcio soluble en líquido polar
presente en la superficie del implante puede presentar varias formas
preferentes. Por un lado, la sal de calcio puede estar presente en
estado sólido (es decir, el implante tendría un acabado superficial
seco o presentación seca). Por otro lado, la superficie externa del
implante puede comprender los iones de dicha sal de calcio
disociados, o lo que es lo mismo, disueltos en líquido polar (es
decir, el implante tendría un acabado superficial húmedo). En tercer
lugar, la superficie externa del implante puede comprender al menos
una sal de calcio soluble en líquido polar en estado parcialmente
disociado (es decir, el implante puede tener un acabado hidratado,
donde parte de las sales se encuentren disociadas en sus iones).
Son objeto asimismo de la invención diversos
métodos de modificación de la superficie de un implante, para dotar
a la superficie del mismo de al menos una sal de calcio soluble en
líquido polar. Dichos métodos se basan en sumergir de forma temporal
o permanente el implante en una solución de al menos una sal de
calcio soluble en líquido polar. La presentación del implante puede
ser seca o húmeda, dependiendo del método.
El calcio libre (una vez disociado de la sal de
calcio soluble en líquido polar contenida en la superficie del
implante) dota a dicha superficie de cuatro propiedades química o
biológicamente muy deseables: hidrofilicidad, protección frente a la
contaminación atmosférica, propiedad procoagulante y propiedad
promineralizante.
El carácter hidrofílico de la superficie del
implante es interesante ya que produce que los líquidos biológicos
polares como la sangre o derivados de ésta presenten una afinidad
completa por la superficie. Por ello, la interacción se produce
instantáneamente con todos los puntos de la superficie por igual,
maximizando la respuesta biológica por unidad de superficie y la
capacidad de formación ósea alrededor de toda la superficie del
implante. Este efecto es especialmente interesante en el caso de
superficies rugosas, ya que supone el vencimiento de la
hidrofobicidad causada por la rugosidad y permite el contacto de
toda la superficie por igual con el medio biológico.
\newpage
La protección frente a la contaminación
atmosférica es la capacidad de la superficie del implante de
mantenerse limpia de los agentes de contaminación atmosféricos
externos. Dicha protección proviene de que la mayor afinidad de los
óxidos de titanio superficiales por el calcio y la higroscopicidad
de las sales solubles en agua formadas por este último generan una
capa hidratada que impide que los hidrocarburos atmosféricos
penetren hasta la superficie del óxido y sean adsorbidos por dicha
superficie. Esto significa que el presente método según la invención
permite preservar libre de contaminación la superficie del implante
y, por tanto, permite mantener la hidrofilicidad en el tiempo.
Además, permite preservar la limpieza inicial del implante, la cual
puede haber sido efectuada previamente por algún proceso conocido
(limpieza mediante solventes, limpieza por plasma, limpieza por
radiación ultravioleta).
El carácter procoagulante supone que la
superficie del implante, provista de calcio en un determinado rango
de concentraciones superficiales, produce la activación de la
cascada de coagulación al entrar en contacto con la sangre o
derivados de ésta con contenido en plaquetas. Es conocido que los
iones de calcio libres actúan desencadenando numerosos procesos
dentro de la cascada de coagulación que llevan a la formación y
estabilización del coágulo. Esta forma de calcio superficial implica
que la superficie del implante se asimila a un repositorio de iones
de calcio.
Por último, el carácter promineralizante de la
superficie del implante viene dado por que el calcio remanente o
unido a los hidroxilos en la superficie del implante (ver Ellingsen,
J. E. (1991), "A study on the mechanism of protein adsorption to
TiO_{2}", Biomaterials 12(6), 593-596)
puede actuar como punto de nucleación heterogénea de la fase
cristali-
na al incrementar localmente la supersaturación de uno de los elementos clave para la formación de apatita: el calcio.
na al incrementar localmente la supersaturación de uno de los elementos clave para la formación de apatita: el calcio.
Como consecuencia de las ventajas enumeradas, el
implante objeto de la invención presenta la ventaja global de
proporcionar una más rápida y mejor osteointegración. El aumento de
la velocidad de osteointegración y/o del porcentaje de aposición
ósea alrededor de los implantes objeto de la invención incrementa
las posibilidades de implantación, reduce los riesgos de inflamación
y los tiempos para realizar la carga funcional.
Los detalles de la invención se aprecian en las
figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del
alcance de la invención:
- La Figura 1 muestra la masa de calcio (\mug)
por unidad de superficie (mm^{2}) tras inmersión rápida (5 s) en
solución de CaCl_{2} en etanol a distintas concentraciones y tras
secado 1 h a 65ºC y vacío, para superficies lisas y rugosas.
- La Figura 2 muestra una micrografía de
microscopía electrónica de barrido sobre una superficie rugosa sin
recubrir con calcio.
- La Figura 3 muestra una micrografía de
microscopía electrónica de barrido sobre una superficie rugosa con
un recubrimiento de calcio de 2,4 \mug/mm^{2}.
- La Figura 4 muestra una micrografía de
microscopía electrónica de barrido sobre una superficie rugosa con
un recubrimiento de calcio de 2,4 \mug/mm^{2} después de haber
sido sometida a inmersión en líquido polar.
- La Figura 5 muestra el espectro de dispersión
obtenido a partir de una superficie rugosa sin recubrir con
calcio.
- La Figura 6 muestra el espectro de dispersión
obtenido a partir de una superficie rugosa con un recubrimiento de
calcio de 2,4 \mug/mm^{2}.
- La Figura 7 muestra el espectro de dispersión
obtenido a partir de una superficie rugosa con un recubrimiento de
calcio de 2,4 \mug/mm^{2} después de haber sido sometida a
inmersión en líquido polar.
- La Figura 8 muestra la variación del ángulo de
contacto en grados en función de cantidad de Ca^{2+} superficial y
del tiempo de exposición.
- La Figura 9 muestra la variación del ángulo de
contacto en grados en función de cantidad de Ca^{2+} superficial y
del método de lavado.
- La Figura 10 muestra el grado de coagulación
final en volumen normalizado con respecto al control positivo en
función de la cantidad de calcio disponible; entre paréntesis figura
la concentración final de calcio en el plasma.
- La Figura 11 muestra el grado de coagulación
final normalizado al valor del control positivo en función de los
distintos tratamientos superficiales; entre paréntesis figura la
concentración teórica de calcio en el plasma si todo el calcio que
hay en la superficie difunde en el plasma para provocar la
coagulación.
- La Figura 12 muestra el grado de coagulación
final normalizado al valor del control positivo en función de la
cantidad de calcio superficial.
- La Figura 13 muestra el espectro de
infrarrojos de una muestra tratada con calcio (2,4 \mug/mm^{2})
y de una muestra sin calcio superficial, sometidas a deposición
electroquímicamente asistida de fases de fosfatos de calcio.
- La Figura 14 muestra la viabilidad celular
relativa al control positivo tras 24 h de exposición a superficies
sin calcio (TiO_{2}) y con calcio (1,79 y 3,26
\mug/mm^{2}).
Es objeto de la invención un implante cuya
superficie comprende al menos una sal de calcio soluble en líquido
polar. Al formar parte de una sal soluble, los iones de calcio
quedan disociados de forma sustancialmente inmediata al exponerse a
un solvente polar. Entonces, cuando el implante según la invención
es puesto en presencia de sangre o plasma, los iones de calcio
quedan libres (iones de calcio libres) y son capaces, entre otros
efectos, de provocar la coagulación alrededor del implante y de
acelerar y mejorar su osteointegración. Más concretamente, estos
iones de calcio libres aportan a la superficie del implante al menos
las siguientes propiedades biológica y químicamente ventajosas,
explicadas con anterioridad: propiedad hidrofílica, protección
frente a la contaminación atmosférica, propiedad procoagulante y
propiedad promineralizante.
El implante según la invención puede presentar
diversos usos: puede ser colocado en una cadera o en una rodilla
para permitir la fijación de una prótesis de cadera o rodilla, puede
ser colocado en el hueso maxilar para permitir la fijación de una
prótesis dental, etc.
El implante según la invención está
preferentemente fabricado con titanio comercialmente puro, titanio
aleado, circonia o mezclas de aleaciones de titanio y circonia.
Opcionalmente, el implante puede contener además aditivos metálicos
biocompatibles, como niobio o tántalo. La superficie del implante
puede estar provista de macrorrugosidad, preferiblemente
proporcionada por los propios hilos de rosca del implante (los
implantes generalmente comprenden un cuerpo roscado) u obtenida con
depresiones macroscópicas en la superficie del implante. Además, la
superficie del implante puede estar provista, si se considera
apropiado, de micro y nanorrugosidad adicional superpuesta a la
macrorrugosidad. Generalmente la microrrugosidad superficial está en
el rango 1 a 75 \mum (altura de pico a valle) y preferiblemente en
el rango 5 a 40 \mum; la nanorrugosidad, superpuesta a la
microrrugosidad, se encuentra en el rango 0,1 a 1 \mum y
preferiblemente en el rango 0,5 \mum a 0,9 \mum.
Por otra parte, la invención comprende tres
métodos de fabricación o modificación de la superficie del implante,
para dotar a dicha superficie de al menos una sal de calcio soluble
en líquido polar. En todos ellos, el implante es sumergido, bien de
forma temporal o bien de forma permanente, en una solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar. Dependiendo del
método, el implante puede presentar un acondicionamiento superficial
final húmedo o seco.
El primer método de modificación de la
superficie de un implante de acuerdo con la invención comprende los
pasos de sumergir el implante en una solución de al menos una sal de
calcio soluble en líquido polar, extraer el implante, de manera que
sobre su superficie queda depositada una sal de calcio soluble en
líquido polar, y almacenar el implante en un envase en cuyo interior
existe un ambiente seco (entendiéndose por ambiente seco una
atmósfera carente de partículas de agua en suspensión). El implante
queda en contacto con dicho ambiente seco, de manera que la sal de
calcio soluble en líquido polar permanece en la superficie del
implante en estado sólido. El acabado superficial final del implante
es por lo tanto seco, dado que la superficie del implante comprende
sal de calcio en estado sólido. El implante permanece seco hasta que
es extraído del envase, momento en el cual tiende a hidratarse con
las partículas de agua en suspensión, en función de la humedad
relativa del entorno. Dado que el implante generalmente no es
extraído hasta instantes previos a la colocación en el paciente, y
que por lo tanto dicha extracción se realiza en quirófano, la
hidratación del implante se produce en unas condiciones de extrema
limpieza ambiental. Por ello, la presentación en seco garantiza una
mínima contaminación del implante (por partículas que estén en
suspensión en el aire) previa a su colocación en el paciente.
El ambiente seco del interior del envase puede
conseguirse por ejemplo sometiendo el interior del envase al vacío
una vez introducido el implante. La aplicación de vacío implica la
ausencia total de moléculas de agua que puedan hidratar el
recubrimiento por coordinación con el compuesto cálcico. Mediante
este método, se preserva la superficie en su estado de limpieza
inicial de envasado. En otro modo de realización, el ambiente seco
se consigue introduciendo en el envase un agente desecante de mayor
poder higroscópico que el calcio de la superficie del implante. En
este caso, sin necesidad de someter el envase al vacío se preserva
el estado seco del implante ya que es el agente desecante el que
absorbe las moléculas de agua ambientales. Este agente desecante
puede ser gel de sílice, cloruro de calcio o acetato de calcio.
El segundo método de modificación de la
superficie de un implante de acuerdo con la invención comprende los
pasos de sumergir el implante en una solución de al menos una sal de
calcio soluble en líquido polar, extraer el implante, de manera que
sobre su superficie queda depositada una sal de calcio soluble en
líquido polar, y almacenar el implante en un envase en cuyo interior
existe una atmósfera ambiente, quedando el implante en contacto con
dicha atmósfera ambiente. En consecuencia, la sal de calcio
permanece en estado sólido, a menos que se trate de una sal
delicuescente como el CaCl_{2}, en cuyo caso el acabado
superficial final del implante es húmedo, es decir, el implante se
encuentra hidratado, por la propia autohidratación o delicuescencia
del depósito cálcico superficial. En este caso, la autohidratación
del implante ocurre durante el envasado y, por lo tanto, también en
condiciones de máxima limpieza. Como consecuencia de la
autohidratación se forma una película de calcio hidratado que
protege la superficie de posibles contaminaciones atmosféricas
subsiguientes.
Ambos métodos descritos pueden comprender el
paso adicional de secar el implante una vez extraído de la solución
de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar y antes de
ser almacenado, se ejecuta el paso adicional de secar el implante.
Preferentemente, el secado se realiza mediante uno o varios de los
siguientes métodos: aplicación de calor, aplicación de desecado y
aplicación de vacío. La aplicación de calor puede realizarse por
ejemplo mediante el mantenimiento en estufa durante un tiempo de
entre 1 minuto y 3 horas a una temperatura de entre 50 y 150ºC (el
tiempo y la temperatura dependen del poder higroscópico de la
solución utilizada y de si se aplica vacío, lo cual supone reducir
considerablemente los tiempos y temperaturas de la estufa). La
aplicación de un desecado puede realizarse por ejemplo manteniendo
el implante en un desecador o en un contenedor con agentes
desecantes de mayor poder higroscópico que el recubrimiento
superficial del implante durante un tiempo mínimo generalmente de 10
minutos. En cualquiera de los casos, la exposición a la atmósfera
normal posterior al secado ha de limitarse para evitar la
rehidratación superficial.
El tercer método de modificación de la
superficie de un implante de acuerdo con la invención comprende el
paso fundamental de almacenar el implante (de forma permanente hasta
que éste vaya a ser utilizado) en un envase hermético que contiene
una solución de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar,
donde la concentración de la solución está entre 20 y 2000 mM. El
implante se almacena en contacto con dicha solución y aislado del
exterior. En este caso, evidentemente el implante presenta un
acabado superficial final húmedo, estando la sal disociada en sus
iones y por lo tanto el calcio en forma libre. Al encontrarse
siempre sumergido desde el envasado, el implante queda protegido de
contaminación externa.
En cuanto al tipo de solución de al menos una
sal de calcio soluble en líquido polar utilizada, en el primer y
segundo método de acuerdo con la invención se utiliza
preferentemente una disolución de cloruro de calcio en cualquiera de
sus estados de hidratación en agua desmineralizada o en etanol o,
alternativamente, una disolución de acetato de calcio en cualquiera
de sus estados de hidratación en agua desmineralizada. La
preferencia por estas sales de calcio se debe a la alta solubilidad
de ambas en agua: mayor de 60 g/100 mL a temperatura ambiente en el
caso del cloruro de calcio y mayor de 30 g/100 mL en el caso del
acetato de calcio, lo que supone que en las concentraciones de
interés, estas sales están completamente disociadas en sus iones. La
disolución de cloruro de calcio en etanol es interesante porque
permite una mayor mojabilidad de la superficie a tratar ya que el
etanol posee una menor tensión superficial que el agua. En este
método, el implante en su estado final previo a la aplicación
comprende cloruro de calcio o acetato de calcio hidratado (con
moléculas de agua), independientemente del tipo de solvente
utilizado (agua desmineralizada o etanol). Así, en caso de que el
solvente sea etanol, éste se evapora y, en condiciones normales, es
reemplazado con agua atmosférica hasta llegar al límite de
hidratación del depósito cálcico remanente en la superficie. Este
límite de hidratación viene dado por la humedad relativa del
ambiente. El mayor o menor nivel de hidratación no afecta la
cantidad efectiva de calcio en la superficie del implante, que viene
determinada por la retención del mismo durante el proceso de
inmersión en la solución cálcica y que aumenta con la concentración
en calcio de la solución de partida y la superficie disponible (ver
Ensayo 1). El tiempo de inmersión debe ser de al menos 5 segundos
para que toda la superficie del implante quede cubierta de calcio
homogéneamente.
En el tercer método de la invención se utiliza
preferentemente una disolución de cloruro de calcio en cualquiera de
sus estados de hidratación en agua desmineralizada o,
alternativamente, una disolución de acetato de calcio en cualquiera
de sus estados de hidratación en agua desmineralizada. La disolución
de cloruro de calcio en etanol, utilizable en los métodos primero y
segundo, no se utiliza en este tercer método. El motivo es que,
siendo un almacenamiento en solución, la mojabilidad de toda la
superficie del implante está garantizada y, en caso de usar etanol,
el proceso en clínica se ve retrasado a la espera de la evaporación
del etanol (una vez extraído el implante del envase) y la posterior
rehidratación del calcio ionizado con las partículas de agua
atmosféricas. Realizar la implantación con la superficie todavía
conteniendo etanol no interesa ya que el etanol tiene un efecto
anticoagulante en la sangre.
Para el primer y segundo método, la
concentración de la solución de al menos una sal de calcio soluble
en líquido polar está preferentemente comprendida entre 20 y 2000
mM, mientras que para el tercer método la concentración de la
solución se encuentra necesariamente dentro de este rango. Este
rango permite que el implante presente las propiedades citadas de
hidrofilicidad, protección frente a la contaminación atmosférica y
propiedad promineralizante, como se demuestra mediante los
experimentos que se detallan más adelante. Para que el implante
presente además propiedades procoagulantes, la concentración de la
solución de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar debe
estar entre 100 y 1000 mM, como se ha demostrado también mediante
ensayos.
Además de contar con una superficie hidrofílica,
protegida frente a la contaminación atmosférica, con propiedad
procoagulante y propiedad promineralizante, el implante de acuerdo
con la invención presenta una ventaja adicional que se explica en
detalle a continuación.
Como es sabido, la superficie de un implante
dental de titanio es una superficie polar ya que comprende iones
O^{-} y OH^{-} junto con los óxidos de titanio superficiales.
Cuando el implante se coloca en el paciente, la superficie polar del
implante entra en contacto con el torrente sanguíneo. Como es
conocido, multitud de biomoléculas hidrosolubles presentes en el
paciente, que participan en los procesos osteogeneradores y que
poseen cargas eléctricas, son potencialmente atraíbles por la
superficie polar del implante. En particular, es conocido que iones
de calcio libres Ca^{2+} presentes en el torrente sanguíneo
(alrededor de 0,4 mg/mL; ver Ellingsen JE, 1991 Biomaterials) llegan
a formar uniones electrostáticas con las cargas negativas de la
superficie del implante y que dichas uniones electrostáticas
presentan importantes ventajas en el medio y largo plazo
post-implantación, favoreciendo la osteointegración
del implante. Así, los iones de calcio Ca^{2+} de las uniones
electrostáticas OH^{-}-Ca^{2+} inducen la
adsorción de H_{x}PO_{4}^{3-x} del medio
biológico, fomentando la formación de fases de fosfato de calcio,
que son las precursoras óseas. Además, el calcio es capaz de atraer
muchas proteínas con residuos ácidos (cargadas negativamente) que
participan en el proceso de regeneración ósea mediante mecanismos
específicos de unión de calcio. En definitiva, el éxito del titanio
como biomaterial se debe a que su unión con el calcio presente en la
sangre es el pilar fundamental del mecanismo de adsorción de
proteínas a su superficie (a sus óxidos) y de los procesos
subsiguientes que dan lugar a la osteointegración.
Por lo tanto, el hecho de someter una superficie
de óxido de titanio previamente a soluciones con iones de calcio
implica que una parte de este calcio queda unido de forma
electrostática a las cargas parcialmente negativas de la superficie
antes de entrar en contacto con el paciente. Así se aprovecha todo
el potencial de la superficie para adsorber iones de Ca^{2+}
(mayor rendimiento de adsorción por unidad de superficie) ya que
ésta no ha sido objeto de contaminación atmosférica.
En conjunto, la superficie del implante objeto
de la presente invención permite una más rápida y mejor
osteointegración, debido a dos motivos: en primer lugar, por la
disponibilidad inmediata de iones de calcio superficiales; en
segundo lugar, por el mayor número de iones de calcio superficiales
capaces de actuar como puntos de nucleación de la fase cristalina,
gracias al aprovechamiento de prácticamente todos los grupos OH de
la superficie del implante. De este modo, se consigue que los
procesos desencadenados por el calcio ocurran desde el primer
momento post-implantación y permitan una
regeneración ósea peri-implante más rápida y de
mejor calidad.
El método de acuerdo con la invención presenta
también diferencias y efectos distintos con respecto a métodos
convencionales en los que se almacena el implante en soluciones
diluidas de cloruro sódico (NaCl) o hidróxido sódico (NaOH). Tanto
en dichos métodos convencionales como en el método de la presente
invención se consigue eliminar la hidrofobicidad del implante debida
a su rugosidad (liberando el aire retenido en la rugosidad) y
preservar el implante del contacto con especies de hidrocarburos
atmosféricos (excepto en el caso referido en Stadlinger B, 2009 J
Clin Periodontol porque, en ese caso, el implante se sumerge justo
antes de su uso, en vez de estar preservado o almacenado en
solución, o con una capa protectora, como en la presente invención),
consiguiendo mayor limpieza superficial. Sin embargo, en dichos
métodos convencionales se almacena el implante en NaCl o NaOH sin
ninguna actividad biológica dentro de la cascada de coagulación
(como se podrá entender posteriormente a partir de la explicación
detallada de la Figura 5), mientras que en el implante según la
invención se consiguen los dos efectos ventajosos descritos: por un
lado, la unión previa de iones de calcio a los grupos hidroxilo de
la superficie del implante, la cual favorece la biomineralización y
la formación de la matriz definitiva alrededor del implante, es
decir, la osteointegración; por otro lado, el exceso de calcio no
unido a los hidroxilos superficiales del implante queda libre para
proporcionar ventajas propias (desencadenar el proceso de
coagulación y la formación de la matriz provisional en los momentos
iniciales post-inserción, etc.). Las cualidades del
implante según la invención, además, están presentes desde los
primeros instantes y en los puntos de mayor relevancia clínica, es
decir, en la interfase hueso-implante.
Por otro lado, con respecto al método descrito
en la patente WO0224243A1 (en la cual se describe el tratamiento
superficial de un implante mediante su baño sucesivo en diferentes
ácidos, seguido de una neutralización, lavado y aplicación de Plasma
Rico en Factores de Crecimiento, PRGF) se consigue una mejora de la
aplicabilidad en clínica ya que no es necesario activar el PRGF con
cloruro de calcio sino que éste se activa simplemente al entrar en
contacto con la superficie del implante, dado que ésta está provista
de sales de calcio solubles en el PRGF.
A continuación se detallan una serie de
experimentos cuyos resultados han demostrado que la superficie del
implante de acuerdo con la invención efectivamente posee las
propiedades hidrofílica, de protección frente a la contaminación
atmosférica, procoagulante y promineralizante, mencionadas a lo
largo del presente documento. Además, en un subsiguiente experimento
se ha estudiado la mineralizabilidad de la superficie y se ha
comprobado la capacidad de los recubrimientos de calcio para formar
apatita en comparación con las superficies no recubiertas (es decir,
se ha comprobado el carácter promineralizante de la superficie). Por
último, se ha realizado un estudio de citotoxicidad que ha permitido
descartar cualquier efecto negativo de estos recubrimientos sobre
células osteoblásticas (es decir, se ha comprobado que el
recubrimiento según la invención permite que sobre el implante tenga
lugar una correcta adhesión de células osteoblásticas).
Dichos experimentos son los siguientes:
- Ensayo 1: Bases para el cálculo de la cantidad
de calcio superficial.
- Ensayo 2: Caracterización topográfica y
análisis composicional.
- Ensayo 3: Hidrofilicidad y protección frente a
la contaminación.
- Ensayo 4: Carácter procoagulante.
- Ensayo 5: Carácter promineralizante.
- Ensayo 6: Citotoxicidad.
Ensayo
1
El objetivo del primer ensayo fue determinar la
cantidad de calcio arrastrada por unidad de superficie en función de
los siguientes parámetros: el hecho de que la solución de CaCl_{2}
utilice como disolvente agua desmineralizada o etanol; la
concentración de CaCl_{2} de dicha solución.
Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos
de Scharlab S.L., Barcelona, España.
Por un lado se prepararon las superficies de los
implantes. Para ello se utilizaron implantes con una rugosidad Sa =
0,7 \mum y Sdr = 35%. Dichos implantes fueron lavados con tritón
X-100, acetona y etanol durante 20 min cada uno en
ultrasonidos. Se utilizaron 5 implantes por cada una de las
concentraciones de soluciones de partida.
Por otro lado se prepararon las soluciones. Como
soluto se utilizó cloruro cálcico dihidrato
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (CaCl_{2}). Como solvente se utilizó
por una parte etanol 95 wt.% y por otra agua desmineralizada. El
rango de concentraciones de la solución que se utilizó fue de 28 a
912 mM.
Entonces se procedió a una inmersión rápida y a
realizar las valoraciones. Así, los implantes se sometieron a una
inmersión rápida (5 s) en viales que contenían 1 mL de las
diferentes soluciones de cloruro cálcico; posteriormente se
extrajeron los implantes y se colocaron en viales con 1 mL de agua.
Tras 5 h, se depositó el contenido de cada vial (implante + agua) en
un erlenmeyer; se añadió 4 veces 1 mL de agua al vial y a
continuación al erlenmeyer para arrastrar todo el contenido del
vial. El implante permaneció sumergido durante la valoración. Como
agente valorante se utilizó EDTA 0,05M, con unas condiciones de pH
11 ajustado con NaOH 2M. Como indicador se utilizó murexida.
Posteriormente se aplicó un secado de los
implantes, sometiéndolos a 65ºC en estufa al vacío durante 1 h tras
la inmersión rápida en las soluciones.
Los ensayos previos de cantidad de calcio
arrastrada por las superficies en función del tipo de solvente
utilizado permitieron determinar que en el caso de disolver el
calcio en etanol se generan recubrimientos con menor dispersión en
el valor de calcio superficial que en el caso de calcio disuelto en
agua (Tabla 1). Esto se debe a que, siendo el etanol un líquido con
menor tensión superficial que el agua, la humectación de toda la
superficie rugosa en inmersión rápida es más homogénea. En el caso
de CaCl_{2} en etanol pero sin secado, puede ocurrir que la
evaporación del etanol no haya sido completa, dando lugar a una
rehidratación con agua parcial. Por lo tanto, para una mayor
reproducibilidad se elige el método de inmersión rápida en
CaCl_{2} en etanol y secado posterior.
En la Figura 1 se muestra la relación entre la
cantidad de calcio superficial y la concentración de inicial en
calcio de las soluciones con las que se tratan los implantes
(concretamente, se muestra la masa de calcio (\mug) por unidad de
superficie (mm^{2}) tras inmersión rápida (5 s) en solución de
CaCl_{2} en etanol a distintas concentraciones y tras secado 1 h a
65ºC y vacío, para superficies rugosas). El uso de etanol como
solvente supone que las desviaciones sobre cada valor son
mínimas.
El coeficiente de arrastre que se deduce al
hacer una regresión lineal de los datos obtenidos 3,4 \pm 3
ng\cdotmm^{-2}\cdotmM^{-1}.
Los resultados de los siguientes ensayos se
expresarán en función de la cantidad de calcio superficial calculada
con este coeficiente y no de las concentraciones iniciales de
solución de CaCl_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
El objetivo de este ensayo es evaluar la
morfología de la superficie recubierta con calcio y determinar su
composición elemental antes y después de ser sometida a la inmersión
en un líquido polar.
Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos
de Scharlab S.L., Barcelona, España.
Por un lado se prepararon las superficies de los
implantes. Para ello se utilizaron discos de 6 mm de diámetro por 3
mm de alto con una rugosidad Sa = 0,7 \mum y Sdr = 35%. Dichos
discos fueron lavados con tritón X-100, acetona y
etanol, 20 min cada uno en ultrasonidos.
Por otro lado se prepararon las soluciones. Como
soluto se utilizó CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (dihidrato). Como
solvente se utilizó etanol 95 wt.%.
Para realizar los recubrimientos, se depositó el
volumen equivalente al arrastrado por implantes de superficie
semejante para dar una concentración finales de 2,4
\mug/mm^{2}.
Posteriormente se efectuó un secado de los
discos, sometiéndolos a 65ºC en estufa al vacío durante 1 h tras el
recubrimiento con las soluciones. Los discos sometidos a lavado
fueron además sumergidos 3 veces en agua desmineralizada y se
dejaron secar al aire.
Para el análisis de las muestras se usó un
microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-5500LV
(Akishima City, Tokyo, Japón) y un espectrómetro de energías
dispersadas (EDS) Oxford Inca 300 (Witney, Oxon, UK) que permite la
detección de los elementos situados por encima del carbono
(incluido) en la tabla periódica de los elementos. Las imágenes
fueron tomadas a una tensión de aceleración de 20 kV.
A diferencia de los discos sin recubrir (Figura
2), en los discos recubiertos con calcio se aprecia una capa sobre
la superficie rugosa subyacente (Figura 3). Al realizar el lavado de
la superficie en agua desmineralizada, se puede observar como el
recubrimiento de calcio parece haber desaparecido (Figura 4),
presumiblemente disuelto en el medio polar en el que ha sido
tratado. Este es el efecto deseado en el caso de entrar en contacto
con la sangre o el plasma (ver Ensayo 4).
El análisis composicional de las superficies con
calcio revela la presencia de la sal en la superficie (Figura 6). El
ratio Ca/Cl corresponde bien con la composición de la sal,
encontrándose aproximadamente el doble de Cl que de Ca (CaCl_{2}).
Tras el lavado y tal y como se intuye por microscopía electrónica
(Figura 4) se puede comprobar como la mayor parte de la sal ha
desaparecido de la superficie (Figura 7), pasando al medio polar en
el que ha sido sumergida. Este es el efecto deseado para
desencadenar la coagulación sobre la superficie en el caso de que el
líquido polar al que estén expuestas sea sangre o plasma (ver Ensayo
4). Sin embargo, una pequeña cantidad todavía es detectable por EDS,
resultado que coincide con lo obtenido previamente mediante XPS
(X-Ray PhotoSpectroscopy en sus siglas en inglés,
ver Ellingsen JE, 1991 Biomaterials) y que corrobora la presencia de
una cantidad de calcio en la superficie que puede ser beneficiosa
para etapas posteriores de la biomineralización (ver Ensayo 5).
Por otro lado, la ausencia de picos de carbono
en los espectros de las superficies tratadas con calcio, lavadas o
no (Figuras 6 y 7), indica que el tratamiento con calcio tras la
limpieza permite evitar la contaminación por adsorción de
hidrocarburos atmosféricos que sí ocurre en las muestras que no han
sido tratadas con calcio (Figura 5).
Este ensayo ha permitido determinar la
morfología de los recubrimientos, así como evaluar la composición de
los mismos, antes y después de ser sometidos a líquidos polares. Los
resultados de este ensayo son muy útiles para analizar a su vez los
resultados de los Ensayos 3, 4 y 5.
\newpage
Ensayo
3
El objetivo del tercer ensayo fue determinar la
variación del ángulo de contacto en función de la cantidad de calcio
retenida por los implantes y su prevalencia en la superficie en
función del tiempo y de distintos lavados.
Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos
de Scharlab S.L., Barcelona, España.
Por un lado se prepararon las superficies de los
implantes. Para ello se utilizaron discos de 12,7 mm de diámetro por
1 mm de alto con una rugosidad Sa = 0,7 \mum y Sdr = 35%. Dichos
discos fueron lavados con tritón X-100, acetona y
etanol, 20 min cada uno en ultrasonidos. Se utilizaron 8 discos por
cada una de las concentraciones de soluciones de partida.
Por otro lado se prepararon las soluciones. Como
soluto se utilizó CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (dihidrato). Como
solvente se utilizó etanol 95 wt.%.
Para realizar los recubrimientos, se depositó el
volumen equivalente al arrastrado por implantes de superficie
semejante para cada una de las concentraciones para dar unas
concentraciones finales de 0,2; 0,7; 1,4; 2,4 y 2,9
\mug/mm^{2}.
Seguidamente se separaron tres muestras de
discos: a) una primera muestra destinada a no someterse a lavado,
para ser utilizada con el fin de determinar la influencia del tiempo
de exposición al aire en la contaminación de la superficie y su
potencial pérdida de hidrofilicidad; b) una segunda muestra que fue
sometida a lavado suave (inmersión 3 veces en agua desionizada); c)
una tercera muestra que fue sometida a lavado fuerte (aplicación de
ultrasonidos durante 5 minutos).
Posteriormente se efectuó un secado de los
discos, sometiéndolos a 65ºC en estufa al vacío durante 1 h tras el
recubrimiento con las soluciones. Para los ensayos de estabilidad en
el tiempo, los discos se dejaron expuestos al aire durante 1 y 3
días.
Para la medida del ángulo de contacto se usó un
medidor de tensión óptico KSV Theta T-200
(Attension®, Helsinki, Finlandia). Se tomó la media entre la medida
del ángulo de contacto derecho e izquierdo a los 30 s de
exposición.
La influencia del tiempo de incubación de cada
disco en las soluciones de partida a distintas concentraciones en el
ángulo de contacto se midió para tiempos de tratamiento de inmersión
rápida (5 s), de inmersión durante 3 h y de inmersión durante 50
días. Los resultados (no mostrados) indican que no existen
diferencias significativas con respecto al tiempo de incubación en
las soluciones de origen, por lo que se adoptó un protocolo común de
inmersión rápida de 5 s y secado en estufa como se describe en los
métodos.
Tras la realización de los recubrimientos, las
superficies se dejaron expuestas al aire durante distintos períodos
de tiempo para evaluar el efecto de la exposición de los
recubrimientos a la atmósfera y determinar una potencial pérdida de
hidrofilicidad por la incorporación de especies hidrofóbicas en
suspensión en el aire. En la Figura 8 se muestra la variación del
ángulo de contacto en grados en función de la cantidad de Ca^{2+}
superficial y del tiempo de exposición. Los resultados muestran que
el ángulo de contacto apenas varía si las superficies quedan
expuestas durante 1 y 3 días a la contaminación ambiental. Es decir,
el ensayo demostró que el depósito de calcio superficial consigue
evitar la hidrofobización debida a la contaminación por
hidrocarburos atmosféricos (ver también el Ensayo 2, sobre la
composición elemental de la superficie con y sin calcio).
Una vez recubiertos y secos, los discos fueron
sometidos a dos tipos de limpieza en agua. El objetivo era
determinar si tras los lavados permanecía suficiente calcio
superficial como para mantener las condiciones hidrofílicas del
recubrimiento de origen. Para ello se sometió a los discos a un
lavado suave, consistente en la inmersión 3 veces en agua
desmineralizada y a un lavado fuerte, en el que se sometieron a
limpieza por ultrasonidos durante 5
minutos.
minutos.
\newpage
La Figura 9 muestra la variación del ángulo de
contacto en grados en función de la cantidad de Ca^{2+}
superficial y del método de lavado. Como puede observarse:
- -
- En los discos sin lavar (marcas cuadradas en la figura), a partir de 0,7 \mug/mm^{2} de calcio por unidad de superficie, el recubrimiento dota a la superficie de un carácter superhidrofílico (ángulo de contacto < 5º).
- -
- En los discos sometidos a un lavado suave (marcas circulares en la figura), simulando condiciones de inmersión del implante en otro líquido polar (agua, plasma, sangre) en las que parte el calcio superficial pueda difundirse al medio y, por tanto, desvincularse de la superficie, se observa que el ángulo de contacto aumenta con respecto a las superficies sin lavado pero se mantiene en condiciones muy hidrofílicas (< 20º) comparado con la referencia sin recubrimiento.
- -
- En los discos sometidos a un lavado fuerte (marcas triangulares en la figura), simulando condiciones extremas, con 5 min de lavado en ultrasonidos, la medida de ángulo de contacto no desciende en ningún momento de los 20º, cosa que sí ocurre incluso para el recubrimiento con menos calcio en el caso del lavado suave. Parece lógico que una limpieza de este tipo logre eliminar un porcentaje del recubrimiento de calcio suficiente como para ver su efecto en un aumento del ángulo de contacto. A partir de 1,4 \mug/mm^{2}, sin embargo, este tipo de limpieza no parece afectar al remanente y el ángulo de contacto permanece en el intervalo 20-30º. En cualquier caso, cabe destacar que incluso una limpieza mediada por ultrasonidos es incapaz de eliminar el carácter más hidrofílico de las superficies con calcio respecto a las que no tienen calcio. Se puede suponer que una cantidad no despreciable de recubrimiento sigue presente en las cavidades de la superficie rugosa.
En el caso de las muestras de referencia, sin
calcio, la diferencia entre ángulos de contacto se debe a que la
última etapa antes del secado y medida de ángulo de contacto fue
agua en el caso de las muestras "lavadas" y etanol en el caso
de las muestras "sin lavar". Este último solvente proporciona
un mayor grado de hidroxilación superficial y de ahí el descenso de
ángulo de contacto de este tipo de muestras.
Por lo tanto, en lo que se refiere a las
propiedades hidrofílicas, el ensayo demostró que los implantes
tratados según el método descrito siguen manteniendo su propiedades
sustancialmente más hidrofílicas que los no tratados, incluso tras
ser sometidos a procesos de limpieza mecánica extremos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
4
El objetivo del cuarto ensayo fue determinar
para qué cantidades de calcio por unidad de superficie permiten
desencadenar la coagulación del plasma sanguíneo. Para ello, primero
se determinó el rango de concentración de calcio en plasma más
óptimo para provocar la coagulación en volumen (sin superficie) y
después se evaluó qué rangos de concentración superficial de calcio
estimulan la coagulación, esta vez en presencia de la superficie.
Además, se incluyeron acondicionamientos superficiales basados en
sodio (NaOH y NaCl) para confirmar su carácter no procoagulante.
Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos
de Scharlab S.L., Barcelona, España.
Por un lado se preparó un plasma. Para ello, se
extrajo sangre de tres pacientes sanos. Se aplicó una técnica
similar a la descrita en la patente EP1066838B1 para obtener un
Plasma Rico en Factores de Crecimiento (PRGF): se centrifugó la
sangre durante 8 min a 460 G, separando la columna de plasma de la
de glóbulos rojos y glóbulos blancos por pipeteado manual (a
diferencia del protocolo descrito en EP1066838B1, en este caso por
criterios de volumen para la realización de los experimentos, se
seleccionó toda la columna de plasma y no solamente la parte más
rica en plaquetas). Se desecharon tanto los glóbulos rojos como los
glóbulos blancos.
Con el fin de determinar los rangos de
concentración de calcio en las soluciones capaces de desencadenar la
coagulación del plasma y como paso previo a la modificación de las
superficies con dichas soluciones, se midió el grado de coagulación
en función de la concentración de calcio en volumen como sigue:
Con el fin de determinar los rangos de
concentraciones de calcio en plasma que provocan la coagulación, se
colocaron 10 \mul de CaCl_{2}\cdotEtOH en concentraciones
entre 28 y 2000 mM en el fondo de una placa multipocillo de 96. Se
dejó secar el contenido de los pocillos (es decir, que se produjera
la evaporación del etanol y una posterior autohidratación) y se
rellenaron con 200 \mul de plasma para dar unas concentraciones
finales de 1,3; 2,5; 12,5; 22,8; 45,6 y 100 mM de calcio en plasma.
Para el control positivo (Ctrl +) se mezclaron previamente a la
colocación en la placa 10 \mul de 10 wt.% de calcio hexahidrato en
200 \mul de plasma (22.8 mM de concentración final) y se colocaron
posteriormente en los pocillos de control. El control negativo (Ctrl
-) se preparó de la misma manera pero sin activar con 10 \mul de
10 wt.% de calcio hexahidrato. Se usaron 8 réplicas por caso.
Inmediatamente se procedió a la medida de la absorbancia como se
detalla más abajo.
En primer lugar se prepararon las superficies.
Para el estudio de la coagulación mediada por el calcio remanente
superficial se usaron tubos huecos (para permitir el paso del haz de
lectura longitudinalmente) de 6 mm de diámetro y 1 mm de pared
dotados de una rugosidad Sa = 0,7 \mum y Sdr = 35%, lavados con
tritón X-100, acetona y etanol, 20 min cada uno en
ultrasonidos. Se utilizaron 8 tubos por concentración.
Se prepararon las soluciones. Por un lado, se
prepararon soluciones de calcio, realizadas con soluto
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (dihidrato) y solventes Etanol 95 wt.% y
agua desmineralizada. Por otro lado se preparó una solución de NaOH
50 mM en agua desmineralizada y una solución de NaCl isotónica 0,9
wt.%.
Entonces, los tubos se sometieron a inmersión
rápida (5 s) en pocillos con las soluciones de cloruro cálcico (1
ml) a cada una de las concentraciones de estudio. Acto seguido, se
efectuó un secado de los tubos, sometiéndolos a 65ºC en estufa al
vacío durante 1 h tras la inmersión en las soluciones. Aquéllos
tubos tratados con NaOH y NaCl fueron expuestos a dichas soluciones
y usados inmediatamente, sin dejar secar, tal y como se usan en sus
versiones comerciales.
Los tubos en los pocillos fueron rellenados con
140 \mul de plasma cada uno con la ayuda de una multipipeta. Los
controles positivos y negativos se prepararon como en el caso de la
medida en volumen pero, esta vez con los tubos en los pocillos.
Además, la cantidad de 10 wt.% de calcio hexahidrato usada para el
control positivo fue acorde al volumen de plasma (140 \mul), es
decir, 7,4 \mul.
Inmediatamente después de rellenar los tubos, se
inició la medida de la absorbancia (densidad óptica) con un equipo
de espectrofotometría a la longitud de onda de 450 nm. La
temperatura de medida fue de 37ºC y se tomaron puntos cada minuto de
medida durante 100 min. Los resultados se presentan normalizados con
respecto al control (grado de coagulación del control = 1).
Las curvas de cinética de coagulación completas
(no incluidas por su difícil lectura comparativa) muestran cómo
existe un período de latencia de unos 5 a 10 min en los que la
absorbancia permanece en los valores iniciales (0) y como, a partir
de un punto, el valor aumenta progresivamente en función del tiempo
a medida que la red de fibrina se va formado y densificando tal y
como es característico del proceso de coagulación. Esta reticulación
progresiva implica un mayor bloqueo del paso del haz de lector y de
ahí el aumento de la absorbancia. En alrededor de 30 min desde el
inicio del proceso se llega a una estabilización del valor de
absorbancia que indica el fin del mismo. Es en ese punto donde se
recogen los valores de absorbancia (densidad óptica) para comparar
entre las diferentes muestras.
De este modo, la Figura 10 muestra el grado de
coagulación final en volumen (sin superficies) normalizado con
respecto al control positivo (Ctrl + = 1), en función de la cantidad
de calcio disponible (entre paréntesis figura la concentración final
de calcio en el plasma). En el gráfico se puede observar que existe
un rango de concentración por encima de 2,5 y por debajo de 45,6 mM
de calcio en plasma en el que el grado de coagulación llega en
algunos casos incluso a ser superior al del control positivo.
La Figura 11 muestra el grado de coagulación en
el interior de los tubos de titanio normalizado al valor del control
positivo en función de los distintos tratamientos superficiales
(entre paréntesis figura la concentración teórica de calcio en el
plasma si la muestra contenía calcio en su superficie y si todo el
calcio hubiera difundido en el plasma para provocar la coagulación).
El gráfico refleja el grado de coagulación en el interior de los
tubos una vez el proceso de coagulación ha terminado, en el caso de
que éste haya tenido lugar. A su vez, la Figura 12 muestra el grado
de coagulación para el caso exclusivamente de recubrimientos
superficiales con calcio a distintas concentraciones
superficiales.
En las Figuras 11 y 12 se puede observar el
mismo experimento que en la Figura 10 pero esta vez las medidas se
tomaron con el calcio incorporado a las superficies. También se
añadieron modificaciones superficiales existentes en el mercado
basadas en NaOH y en NaCl para saber si éstas eran capaces de
promover la coagulación superficial (Figura 11). El control positivo
se realizó de la misma manera que en la ocasión anterior: 10 wt.% de
calcio hexahidrato mezclado con plasma a 22,8 mM y depositado en el
pocillo (con una superficie sin tratar en él).
En el caso de las superficies sin calcio
(control negativo, NaOH y NaCl) resulta evidente la ausencia de
coagulación. En el caso de las superficies con calcio, el proceso de
coagulación es mayor o menor en un determinado rango de
concentración de calcio. Así, una concentración de 0,52
\mug/mm^{2} es insuficiente para provocar la coagulación,
mientras que en el intervalo 0,7 a 3,5 \mug/mm^{2} se obtiene en
algunos casos incluso más señal que en el caso del control positivo.
A partir de 1 \mug/mm^{2}, el grado de coagulación obtenido por
las superficies con calcio es al menos el mismo que el grado de
coagulación del control positivo (es decir, al menos 1) y este valor
no parece aumentar significativamente en el intervalo
1-3,5 \mug/mm^{2}. Sin embargo, a partir de 3,5
\mug/mm^{2} se produce un descenso en el grado de coagulación
final hasta el punto de que a partir de unos 5 \mug/mm^{2} se
inhibe el proceso de coagulación por completo.
En definitiva, este ensayo ha servido para
corroborar en superficie lo que se conocía en volumen, esto es,
existe un rango de concentraciones superficiales de calcio que
desencadenan un proceso de coagulación óptimo pero fuera de ese
rango, la coagulación no se produce. Los recubrimientos comerciales
basados en NaOH y NaCl, por carecer de calcio, tampoco son capaces
de promover la coagulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
5
El objetivo de este ensayo fue evaluar la
capacidad de formación de fases de fosfato de calcio en las muestras
sometidas al tratamiento superficial con calcio con el fin de
determinar su capacidad para estimular la generación de apatita.
Todos los reactivos utilizados fueron obtenidos
de Scharlab S.L. Barcelona, España.
Por un lado se prepararon las superficies de los
implantes. Para ello se utilizaron discos de 8 mm de diámetro por 3
mm de alto con una rugosidad Sa = 0,7 \mum y Sdr = 35%. Dichos
discos fueron lavados con tritón X-100, acetona y
etanol, 20 min cada uno en ultrasonidos. Se tomaron medidas en
diferentes puntos de 3 discos diferentes por tipo de superficie (con
calcio, sin calcio).
Por otro lado se preparó la solución con calcio.
Como soluto se utilizó CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (dihidrato). Como
solvente se utilizó etanol 95 wt.%.
Para realizar los recubrimientos, se depositó el
volumen equivalente al arrastrado por implantes de superficie
semejante para dar una concentración final de 2,4
\mug/mm^{2}.
Para deposición de fases de fosfato de calcio
asistida electroquímicamente (ECAD en sus siglas en inglés) se
utilizó un potenciostato/galvanostato combinado PGSTAT T302N
(Metrohm Autolab B.V., Utrecht, Holanda) acoplado a una celda
electroquímica encamisada para asegurar una temperatura constante de
36 \pm 1ºC durante la electrólisis. El electrodo de trabajo fue
configurado en catódico y la polarización se llevó a cabo en modo
galvanostático. Para el experimento se aplicó una densidad de
corriente por cada muestra de -15 mA/cm^{2} durante 30 minutos.
El electrolito usado para la deposición de fases de fosfato de
calcio se preparó con concentraciones de 1,66 mM de CaCl_{2} y 1
mM de NH_{4}H_{2}PO_{4}. El pH del electrolito se ajustó a 6,4
con NH_{4}OH.
Tras el tratamiento de mineralización, las
muestras se enjuagaron cinco veces en agua desmineralizada para
eliminar todos los restos lábiles y se dejaron secar al aire para su
posterior análisis.
Para evaluar el nivel de mineralización de las
muestras se utilizó un espectrómetro de infrarrojos por transformada
de Fourier FTIR, Nicolet® 6700 FT-IR (Thermo Fisher
Scientific®, Waltam, USA) con módulo de ATR (reflectancia total
atenuada en sus siglas en inglés) para recubrimientos delgados. Se
hicieron 32 escaneos por muestra en 5 puntos distintos de cada
muestra para verificar la homogeneidad del recubrimiento.
La rugosidad de las muestras y lo delgado del
recubrimiento de fases de fosfato de calcio sobre las mismas hacen
inviable la extracción de suficiente cantidad de muestra para
realizar el análisis por pastilla de KBr. Es por ello que se ha
utilizado el método de ATR. En el presente caso, la falta de
información en el rango 400-600 cm^{-1} debida al
uso del método ATR no es relevante ya que ambos recubrimientos son
de hidroxiapatita. La Figura 13 muestra los espectros de infrarrojo
de las muestras con calcio y las muestras sin calcio. El
desdoblamiento del pico de absorción de fosfato (\nu_{3} en 1020
y 1090 cm^{-1}), así como el hombro en 965 cm^{-1}, son
característicos de la hidroxiapatita. El pequeño pico en 875
cm^{-1} se asigna a sustituciones de carbono en la red cristalina,
lo que indica que se trata de una hidroxiapatita de tipo
carbonatado. También el pico en 1420 cm^{-1} es indicador de este
tipo de hidroxiapatita. Aunque en ambas muestras se ha obtenido
hidroxiapatita carbonatada, en el caso de las muestras con calcio,
la mayor intensidad de picos supone que, para las mismas condiciones
experimentales, estos recubrimientos son capaces de provocar una
mayor deposición de apatita. Los recubrimientos con calcio también
han generado una hidroxiapatita mucho más hidratada, con el
característico modo de vibración de los hidroxilos muy marcado hacia
3400 cm^{-1}. Otro aspecto a destacar en el caso de las muestras
con calcio, además de la mayor intensidad de los picos, es la
presencia de picos adicionales propios de las hidroxiapatitas
carbonatadas (1460 y 1550 cm^{-1}) e hidratadas (1630 cm^{-1})
que no están presentes en las muestras sin calcio.
En definitiva, este ensayo ha servido para
corroborar que los discos tratados previamente con calcio son
capaces de producir una más rápida deposición de hidroxiapatita en
la superficie que los discos sin tratamiento, en las mismas
condiciones experimentales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
6
El objetivo del sexto ensayo fue evaluar
biológicamente la toxicidad a las 24 horas de contacto con las
células hFOB 1.19 de los recubrimientos con calcio según norma
UNE-EN ISO 10993-5:2000.
Por un lado se realizó un cultivo celular. Se
cultivó la línea celular hFOB 1.19 (ATTC CRL 11372) en medio
DMEM-F12 (Invitrogen 11039-021)
completado con 10% Suero Fetal Bovino, 1%
Penicilina-Streptomicina, 1% Glutamina, y 0,3 mg/mL
de G418.
Por otro lado se prepararon las superficies, en
forma de discos de 6 mm de diámetro por 3 mm de alto con una
rugosidad Sa = 0,7\mum y Sdr = 35%. Se lavaron con tritón
X-100, acetona y etanol, 20 min cada uno en
ultrasonidos. Se utilizaron 5 discos por concentración.
Se prepararon las soluciones, utilizando como
soluto el CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (dihidrato) y como solvente
Etanol 95 wt.%.
Se realizaron los recubrimientos: en los discos
recubiertos con calcio, se depositó el volumen equivalente al
arrastrado por implantes de superficie semejante para cada una de
las concentraciones para dar unas concentraciones finales de 0,36;
1,79 y 3,26 \mug/mm^{2}.
En cuanto a la manipulación de las muestras,
todas las muestras se sometieron a esterilización \beta
25-50 kGy. Como control negativo se utilizaron
probetas de PVC y como control positivo, de PE alta densidad. Los
controles fueron esterilizados mediante etanol. En condiciones
estériles, las muestras se introdujeron en los pocillos de placas de
96 pocillos para después añadirles las células.
En cuanto a la línea celular y realización del
ensayo, se hicieron crecer las células de la línea celular hFOB 1.19
y se obtuvo una suspensión celular. Se sembraron 1,5x104 células en
medio/pocillo encima de las muestras a estudio. Se incubó la placa
durante 24 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. Se emplearon 5 réplicas para
cada muestra/control y una réplica para cada muestra/control como
"blanco" (medio de cultivo sin células) con el fin de
determinar el ruido de fondo de cada muestra/control. Transcurrido
el tiempo de contacto, se realizó la medida del número de
células/muestra mediante el ensayo por WST-1*. Para
ello, se añadieron 10 \mul de WST-1/pocillo y se
incubó durante 4 horas (37ºC y 5% CO_{2}, oscuridad). Finalmente,
se retiró el medio de cada pocillo a otra placa y se leyó la
absorbancia de la placa a 450 nm de longitud de onda en un lector de
placas de absorbancia.
Para conocer el número de células/muestra, se
debió realizar previamente una curva donde se relacionara un número
de células conocido con la absorbancia obtenida mediante el método
por WST-1. El método WST-1 es un
método colorimétrico que detecta la actividad mitocondrial de las
células.
En cuanto a la valoración del ensayo, los
resultados se basaron en la evaluación cuantitativa de los cultivos
después de las 24 horas de contacto. Se obtuvo el porcentaje de
viabilidad celular para cada muestra ensayada en comparación a los
resultados obtenidos para el control positivo.
Viabilidad
celular relativa (%) = Nº células muestra/Nº células control (+) x
100
Se procedió al tratamiento estadístico de los
resultados, aplicando el test estadístico t de Student para
comprobar si las diferencias respecto al control positivo eran o no
significativas estadísticamente (p<0,05).
La Figura 14 muestra los resultados del ensayo
de citotoxicidad según la norma UNE-EN ISO
10993-5:2000, mostrando más concretamente la
viabilidad celular relativa al control positivo, tras 24 h de
exposición a las superficies sin calcio (TiO_{2}) y con calcio
(1,79 y 3,26 \mug/mm^{2}. Ninguna de las superficies evaluadas
es citotóxica para las células osteoblásticas utilizadas, ya que no
se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre los
resultados del control positivo y las muestras y ninguna de ellas
rebasa el umbral de citotoxicidad (70% de viabilidad relativa). El
depósito de calcio superficial no parece tener efectos negativos
sobre la adhesión celular y su viabilidad a las 24 h de cultivadas.
Al ser recubrimientos altamente higroscópicos, se podría temer que
estas superficies pudieran romper las paredes celulares al
someterlas a una elevada presión osmótica. También se podría pensar
en una saturación de receptores de membrana por exceso de calcio. El
presente ensayo descarta tales efectos. Precisamente, la elevada
higroscopicidad del recubrimiento con calcio hace que este se
hidrate rápidamente con moléculas de agua del entorno, de manera que
en el momento del contacto con las células y el medio celular, el
gradiente osmótico baje a niveles inocuos en términos de lisis
celular.
La presente invención permite obtener
recubrimientos homogéneos de calcio sobre sustratos de titanio con
muy poca dispersión en su distribución superficial. El acopio de
sales de calcio del solvente es casi inmediato y no aumenta con el
tiempo de exposición al mismo pero sí con la concentración de soluto
en el solvente. El carácter higroscópico del cloruro de calcio
permite formar en la superficie una capa hidratada que evita el
efecto "hidrofobizante" debido a la contaminación atmosférica
del óxido de titanio con hidrocarburos atmosféricos. Esta protección
es duradera en el tiempo. Además, estos recubrimientos otorgan a las
superficies un carácter superhidrofílico a partir de concentraciones
de calcio por unidad de superficie relativamente bajas. Sólo se
perciben ligeras pérdidas de hidrofilicidad, en el caso de ejercer
lavados muy fuertes y, aún así, las superficies tienen un carácter
más hidrofílico que aquéllas no recubiertas originalmente con
calcio. Estos recubrimientos tienen como particularidad que pueden
disolverse en presencia de líquidos polares como la sangre o el
plasma. Siendo el calcio un componente básico en la cascada de
coagulación y su desencadenamiento, estas superficies tienen como
característica principal la de provocar la coagulación al entrar en
contacto con los fluidos biológicos mencionados. Este proceso es
dependiente de la concentración de calcio y, por lo tanto, en este
documento se especifica un rango de concentraciones superficiales de
calcio en el cual la coagulación se realiza de manera óptima: en el
caso de tratar con CaCl_{2}, entre 0,70 a 3,5 \mug/mm^{2} o
concentraciones de la solución de partida entre 100 y 1000 mM. El
estudio de mineralizabilidad (carácter promineralizante) demuestra
una mayor capacidad de los recubrimientos de calcio para formar
apatita en comparación con las superficies no recubiertas. Por
último, el estudio de citotoxicidad descarta cualquier efecto
negativo de estos recubrimientos sobre células osteoblásticas.
Claims (18)
1. Implante para cuerpo humano o animal, que se
caracteriza por que su superficie externa comprende al menos
una sal de calcio soluble en líquido polar.
2. Implante, según la reivindicación 1, que se
caracteriza por que su superficie externa comprende sal de
calcio en estado sólido.
3. Implante, según la reivindicación 1, que se
caracteriza por que su superficie externa comprende los iones
de dicha sal de calcio disociados.
4. Implante, según la reivindicación 1, que se
caracteriza por que su superficie externa comprende al menos
una sal de calcio soluble en líquido polar en estado parcialmente
disociado.
5. Método de modificación de la superficie de un
implante, que se caracteriza por que comprende los pasos
de:
- -
- sumergir el implante en una solución de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar,
- -
- extraer el implante, de manera que sobre su superficie queda depositada una sal de calcio soluble en líquido polar,
- -
- almacenar el implante en un envase en cuyo interior existe un ambiente seco, quedando el implante en contacto con dicho ambiente seco.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método, según la reivindicación 5, que se
caracteriza por que el envase donde se almacena el implante
se encuentra al vacío.
7. Método, según la reivindicación 5, que se
caracteriza por que el envase contiene un agente desecante de
mayor poder higroscópico que el compuesto cálcico de la superficie
del implante.
8. Método de modificación de la superficie de un
implante, que se caracteriza por que comprende los pasos
de:
- -
- sumergir el implante en una solución de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar,
- -
- extraer el implante, de manera que sobre su superficie queda depositada una sal de calcio soluble en líquido polar,
- -
- almacenar el implante en un envase en cuyo interior existe una atmósfera ambiente, quedando el implante en contacto con dicha atmósfera ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Método, según la reivindicación 5 ó 8, que se
caracteriza por que el implante se sumerge en la solución de
al menos una sal de calcio soluble en líquido polar durante al menos
5 segundos.
10. Método, según la reivindicación 5 ó 8, que
se caracteriza por que un soluto de la solución de al menos
una sal de calcio soluble en líquido polar es cloruro de calcio y el
solvente es etanol.
11. Método, según la reivindicación 5 ó 8, que
se caracteriza por que tras extraer el implante de la
solución de al menos una sal de calcio soluble en líquido polar y
antes de ser almacenado, se ejecuta el paso adicional de secar el
implante.
12. Método, según la reivindicación 11, que se
caracteriza por que el secado se realiza mediante uno o
varios de los siguientes métodos: aplicación de calor, aplicación de
desecado y aplicación de vacío.
13. Método, según la reivindicación 5 ó 8, que
se caracteriza por que la concentración de la solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar está entre 20 y
2000 mM.
14. Método, según la reivindicación 13, que se
caracteriza por que la concentración de la solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar está entre 100 y
1000 mM.
15. Método de modificación de la superficie de
un implante, que se caracteriza por que comprende el paso de
almacenar el implante en un envase que contiene una solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar, almacenándose el
implante en contacto con dicha solución y aislado del exterior,
donde la concentración de la solución de al menos una sal de calcio
soluble en líquido polar está entre 20 y 2000 mM.
\newpage
16. Método, según la reivindicación 15, que se
caracteriza por que la concentración de cloruro de calcio en
la solución está entre 100 y 1000 mM.
17. Método, según la reivindicación 5, 8 ó 15,
que se caracteriza por que un soluto de la solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar es cloruro de
calcio y el solvente es agua desmineralizada.
18. Método, según la reivindicación 5, 8 ó 15,
que se caracteriza por que un soluto de la solución de al
menos una sal de calcio soluble en líquido polar es acetato de
calcio y el solvente es agua desmineralizada.
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