TWI542334B - 修飾植入物之表面以提供含鈣表面的方法 - Google Patents
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Description
本發明關於一種具有含鈣表面之植入物,以及一種修飾植入物表面以提供含鈣表面的方法,其目的為獲得新穎之化學及生物效果,以在植入物對周圍組織的骨接合產生改良等益處。
達成令人滿意的植入物對相鄰組織之骨接合的程序為複雜的。該程序開始為在植入物周圍引發凝血梯瀑(coagulation cascade),血小板凝集及形成血栓,其均在植入物附近造成間質製造或暫時之血纖維蛋白網路。此暫時網路表現兩個重要之功能:對植入物提供初期安定性,及逐步釋放血小板因子與細胞標記。在其他之程序中,該細胞標記依序刺激細胞移向受傷區域,附著,分化及增殖,以及分泌細胞外間質,繼而為結果在植入物附近形成定型骨間質的礦化。
關於植入物之表面,現有三個因素具體地影響植入物對相鄰組織的骨接合力:首先有關用於製造植入物之材料;其次有關植入物表面之粗糙程度;第三為植入物之表面可接受處理以配置額外的生物上合適塗層。
關於用於植入之材料,在上述程序之發展中及在重點生物組織中,若其表面化學可與關鍵生物分子交互作用則被視為生物相容性。一般而言,這些材料係由鈦或鈦系合金、或鋯或鋯系合金所組成。視情況地,該材料可含有生物相容性金屬形式(如鈮或鉭)之添加物。
關於植入物表面之粗度,相較於非粗糙表面,現已證明在這些材料之表面上提供微米及奈米粗度則顯著地提升植入物-骨連接。現有許多種獲得粗度的已知方法,如噴砂或酸處理(或兩者之組合)。
最後關於植入物之表面處理,先前技術有許多種製造或處理植入物的已知方法,其中對植入物提供塗層以尋求改良植入物之一些性質,因此增強及加速其骨接合及/或降低病患排斥的風險。
這些表面處理係包括其中對植入物表面塗佈磷酸鈣(Ca/P)(其中具體而言為氫氧磷灰石),以對植入物提供類似骨頭的礦物部分之陶瓷塗層的方法。該陶瓷塗層之目的為增加植入物之骨傳導性質作為促進植入物周圍骨再生的手段。塗佈磷酸鈣的已知方法係包括其中藉濕式或SBF(模擬體液,參見Kim,H. M.;Miyaji,F.;Kokubo,T. & Nakamura,T.(1996)之“Preparation of bioactive Ti and its alloys via simple chemical surface treatment”,J Biomed Mater Res 32(3),409-417)對植入物塗佈磷酸鈣的方法。這些方法係將植入物浸泡於含有一系列離子(其中有Ca與P)之溶液中而造成磷酸鈣沉澱在植入物表面上。這些濕式或SBF方法之實例可在EP0389713、EP1384524及US6426114號專利中發現。亦已知藉電化學方式對植入物塗佈磷酸鈣的其他方法。這些方法係將植入物浸泡於含有一系列離子(其中有Ca與P)之溶液中;由於應用電化學程序而以較快速的方式在植入物上形成一層磷酸鈣(參見Yang,B.;Uchida,M.;Kim,H.-M.;Zhang,X. & Kokubo,T.(2004)之“Preparation of bioactive titanium metal via anodic oxidation treatment”,Biomaterials 25(6),1003-1010;參見Rssler,S.;Sewing,A.;Stlzel,M.;Born,R.;Scharnweber,D.;Dard,M. & Worch,H.(2003)之“Electrochemically assisted deposition of thin calcium phosphate coatings at near-physiological pH and temperature”,J Biomed Mater Res A 64(4),655-663)。這些電化學方法之實例可在EP1264606、US5478237及WO2004024200號專利中發現。或者亦已知藉物理方式對植入物塗佈磷酸鈣的方法。該方法係藉電漿噴灑或雷射對植入物噴灑Ca/P先質(參見Arias,J. L.;Garca-Sanz,F. J.;Mayor,M. B.;Chiussi,S.;Pou,J.;Len,B. & Prez-Amor,M.(1998)之“Physicochemical properties of calcium phosphate coatings produced by pulsed laser deposition at different water vapour pressures”,Biomaterials 19(10),883-888)。這些電化學方法之實例可在EP0202908、EP0864332及WO9821380號專利中發現。在所有上述方法中,植入物之最終表面修整為乾燥。
除了以上之外,現有已知為植入物表面調節法的其他方法,其中植入物之表面性質因將植入物儲存在氯化鈉(NaCl)稀釋溶液中(參見例如US20040210309A1號專利),或者事先將其浸泡於氫氧化鈉(NaOH)稀釋溶液中(參見例如Stadlinger,B.;Lode,A. T.;Eckelt,U.;Range,U.;Schlottig,F.;Hefti,T. & Mai,R.(2009)之“Surface-conditioned dental implants: an animal study on bone formation.”,J Clin Periodontol 36(10),882-891)而改變。第一種情形之目的為將植入物保持在不受大氣烴污染之環境中且維持原始乾淨程度。此外,儲存在離子性液體中則有助於對抗因植入物表面之粗度所造成的疏水性,其係藉極性液體增強該表面之潤濕力。第二種情形之目的為將表面羥基暴露,一旦將植入物置於牙槽中則其在植入物表面上形成磷酸鈣(Ca/P)時沉澱。相較於未修飾者,此後者處理提供改良之潤濕力,但是無法防止事先表面污染,因為浸泡於液體中係在使用時同步進行。
現有基於添加鈣以製造鈦酸鈣而修飾鈦結晶網路之其他植入物表面處理。其係將電化學或熱方法應用一段時間而實行。此型處理之一個實例可在JP2006102212號專利中發現。現已提出氧磷灰石在經歷這些處理之鈦表面上更快速地形成。
本發明之一個目的為提供一種替代性植入物製造方法,其中植入物具有不同之表面而不僅提供隨時間經過仍相當固定的高表面親水性,亦在病患之骨頭及身體中提供導致最適之骨接合及植入物植入的新穎生物性質。
本發明之一個目的為提供一種用於人體或動物體之植入物,指定特點為其外表面係包含至少一種可溶於極性液體之鈣鹽,即形成具有在暴露於極性溶劑(如水、乙醇等)時以實質上立即方式溶解之能力的部分化合物之鈣。鈣溶解相當於鈣離子化,即將其以離子形式從起初化合物釋放。
結果本發明之植入物在接觸極性液體時在其表面上具有自由鈣離子。該鈣離子可自由地作用,及提供在以後階段所解釋且已在測試中證實的一系列有利效果(該效果顯然包括促凝血作用)。相反地,在所揭述之具有表面磷酸鈣(Ca/P)或鈦酸鈣(CaTiO3)的習知植入物中,鈣係以不溶性化合物之形式存在(應了解,「不溶性」為任何水中溶解度小於1克/升的化合物);其表示習知植入物之表面鈣無法被釋放至環境中及自由地相互作用。結果該習知植入物之鈣無法提供由本發明之鈣所提供的生物功能。
存在於植入物表面上的極性液體可溶性鈣鹽可為各種較佳形式。在一個較佳具體實例中,鈣鹽係以固態存在(即植入物係具有乾燥表面修整或乾燥外觀)。在另一個較佳具體實例中,植入物之外表面係包含解離形式之鈣鹽離子,換言之,係包含溶於極性液體中之鈣鹽(即該植入物係具有潮濕表面修整)。在第三具體實例中,植入物之外表面係包含至少一種部分解離形式的極性液體可溶性鈣鹽(即植入物係具有水合修整,其中部分之鹽離子解離)。
本發明之一個目的亦為提供各種修飾植入物表面的方法,以對其表面提供至少一種極性液體可溶性鈣鹽。該方法係基於將植入物以暫時或永久方式浸泡在至少一種極性液體可溶性鈣鹽的溶液中。依該方法而定,植入物之最終表現可為乾燥或潮濕。
自由鈣(一旦從植入物表面上所含有的極性液體可溶性鈣鹽解離)對該表面提供四種化學上及生物上有利之性質:親水性、對抗大氣污染之保護、促凝血性質、及促礦化性質。
植入物表面之親水性特徵因其造成生物極性液體(如血液或其衍生物)與植入物表面完全地親和而有益。結果血液或其衍生物與全部植入物表面之間有快速及同等的相互作用,而將每表面單位之生物回應、及在全部植入物表面附近形成骨頭之能力最大化。此效果在粗植入物表面之情形特別令人感興趣,因為其克服由粗度所造成的疏水性且使全部植入物表面與生物培養基同等地接觸。
對抗大氣污染之保護為植入物表面本身保持隔離外部大氣污染試劑而乾淨的能力。該保護係源自表面上鈦氧化物與鈣之親和力較大,及由鈣鹽所形成的水溶性鹽之吸濕力在植入物表面上產生水合層而防止大氣烴穿透氧化物表面且被該表面吸收。結果本發明的方法可將植入物表面保持無污染,因此隨時間經過仍維持親水性。該方法亦將植入物保持在起初之清潔狀態,其可事先進行一些已知方法(溶劑清潔、電漿清潔、UV射線清潔)而達成。
促凝血性質特徵係表示具有指定表面濃度範圍的鈣之植入物表面在接觸含有血小板的血液或血液衍生物時造成凝血梯瀑活化。已知自由鈣離子引發凝血梯瀑內之許多程序而導致血栓的形成及安定化。事實上,在本發明中,植入物表面上之鈣使植入物表面類似鈣離子的儲存庫。
最後,植入物表面之促礦化特徵係由在形成氧磷灰石的關鍵元素之一:鈣的超飽和局部增加時,過量鈣或鍵聯植入物表面上羥基的鈣(參見Ellingsen,J. E.(1991)之“A study on the mechanism of protein adsorption to TiO2”,Biomaterials 12(6),593-596)可作為結晶相異質晶核生成點所造成。
上列優點之結果為本發明標的植入物提供較快及改良之骨接合的整體優點。在本發明標的植入物附近之骨接合速度及/或骨對合百分比增加而提高植入機會,降低發炎的風險,亦縮短進行植入物功能負荷之等待期。
本發明之細節可在非限制性附圖中發現。
本發明之一個目的為提供一種表面係包含至少一種可溶於極性液體之鈣鹽(以下稱為極性液體可溶性鈣鹽)的植入物。因其形成部分可溶性鹽,故鈣離子在暴露於極性溶劑時以實質上立即方式解離。繼而在將依照本發明之植入物與血液或血漿接觸時,鈣離子變成自由(自由鈣離子),因此可在植入物附近造成凝血,且可加速及改良植入物之骨接合。更具體而言,這些自由鈣離子對植入物表面至少提供先前已解釋的以下生物上及化學上之有利性質:親水性、對抗大氣污染之保護、促凝血性質、及促礦化性質。
依照本發明之植入物可以多種方式使用:其可置於髖部或膝蓋而可固定人工髖部或膝蓋關節;其可置於顎骨而可固定假牙。
依照本發明之植入物較佳為以市售純鈦、鈦合金、鋯、或鈦與鋯合金之混合物製造。或者該植入物亦可含有生物相容性金屬添加物,如鈮或鉭。植入物表面可具有可視粗度,較佳為由植入物本身之螺紋(植入物通常包含螺旋體)所提供,或者以植入物表面上之可視凹痕獲得。另外,如果適當,則植入物表面可具有疊加在可視粗度上之額外微米及奈米粗度。表面微米粗度通常包含1至75微米之範圍(峰至谷之高度)且較佳為5至40微米之範圍。疊加在微米粗度上之奈米粗度係包含0.1至1微米之範圍且較佳為0.5至0.9微米之範圍。
此外,本發明係包含三種製造或修飾植入物表面以對該表面提供至少一種極性液體可溶性鈣鹽的方法。所有三種方法均將植入物暫時或永久地浸泡於至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液中。依方法而定,植入物之最終表面修整可為乾燥或潮濕。
依照本發明,第一種修飾植入物表面的方法係包含將植入物浸泡於至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液中;將植入物移除,結果極性液體可溶性鈣鹽沉積在其表面上;及將植入物儲存在內部有乾燥大氣(應了解,乾燥大氣為其中無懸浮水粒子的大氣)之容器中的步驟。該植入物接觸該乾燥大氣,結果極性液體可溶性鈣鹽係以固態保留在植入物表面上。植入物之最終表面修整為乾燥,因此植入物表面係包含固態鈣鹽。植入物係保持乾燥直到其從容器移除,此時依環境之相對濕度而定,其本身趨於與懸浮水粒子水合。因植入物通常未移除直到恰在配接於病患之前,及該抽取因此在手術室中進行,故植入物係在極乾淨之環境中變成水合。結果此乾燥表現保證在配接於病患之前植入物污染最小。
容器內部之乾燥大氣可例如藉由一旦已將植入物置於內部則將容器內部維持在真空下而獲得。施加真空則造成完全無會將配有鈣化合物之塗層水合的水分子。此方法之結果為植入物表面係以其起初之乾淨狀態保存及包裝。在另一個具體實例中,乾燥大氣係將較植入物表面之鈣為吸濕性的乾燥劑插入容器中而製造。在此情形,植入物之乾燥狀態因吸收環境中水分子的乾燥劑而保存,故不必對包裝施加真空。該乾燥劑可為矽膠、氯化鈣或乙酸鈣。
依照本發明,第二種修飾植入物表面的方法係包含將植入物浸泡於至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液中,將植入物移除,結果極性液體可溶性鈣鹽沉積在植入物表面上,及將植入物儲存在內部有周圍大氣之容器中(植入物係接觸該周圍大氣)的步驟。結果鈣鹽保持固態,除非其為分枝鹽,如CaCl2,在此情形植入物之最終表面修整為潮濕,即植入物經由自動水合或表面鈣沉積物的潮解而水合。在此最後情形,植入物的自動水合係在包裝期間,結果為在最大乾淨度條件下發生。自動水合之結果為形成水合鈣之膜,其保護表面而隔離在以後階段可能發生之潛在大氣污染。
兩種所揭述的方法均可包含將植入物在從至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液移除後乾燥的額外步驟,將植入物乾燥的額外步驟係在將植入物儲存之前實行。較佳為該乾燥係藉一種或以上之以下方法進行:施熱、進行乾燥程序、及施加真空。施熱可例如藉由將植入物置於溫度為50至150℃之間的爐中歷時1分鐘至3小時之間的時間(時間及溫度係依所使用溶液之吸濕力及是否施加真空而定,其大幅減少爐時間及溫度)而實行。施加乾燥程序可例如藉由將植入物置於乾燥器、或有較植入物表面塗層為吸濕性之乾燥劑的容器中,歷時通常為10分鐘之時間而實行。在任何這些情形均必須限制在乾燥後暴露於一般大氣,以防止表面再水合。
依照本發明,第三種修飾植入物表面的方法係包含將植入物(以永久方式直到欲使用)儲存在含有至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的密封容器中之基本步驟,其中溶液之濃度為20至2000 mM之間。將植入物接觸該溶液而儲存且與外部隔絕。在此情形,植入物自然具有潮濕最終表面修整,而鹽解離成其離子與鈣,因此自由。因其從包裝相起一直都浸泡,故植入物受保護而隔離外部污染。
關於欲使用的至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的型式,依照本發明之第一種及第二種方法較佳為使用在去礦水中或在乙醇中之任何水合狀態的氯化鈣溶液,或在去礦水中之任何水合狀態的乙酸鈣溶液。這些鈣鹽由於高水中溶解解度而較佳:在周溫在氯化鈣之情形超過60克/100毫升,及在乙酸鈣之情形超過30克/100毫升,其表示這些鹽之離子在重點濃度完全地解離。其可使用乙醇中氯化鈣溶液,因為乙醇具有較水小之表面張力而增強欲處理表面的潤濕力。在此方法中,無關所使用溶劑之型式(去礦水或乙醇),在應用前之最終狀態植入物係包含氯化鈣或乙酸鈣水合物(具有水分子)。結果在溶劑為乙醇之情況,乙醇蒸發且在正常條件下被大氣水取代,直到達到表面上過量鈣沉積物的水合限制。水合限制係由環境之相對濕度指定。更大或更小之水合程度不會影響植入物表面上的有效鈣離子量,其決定在浸泡程序期間將鈣保留在鈣溶液中,且其係隨基本溶液及可得表面之鈣濃度而增加(參見表1)。浸泡時間必須為至少5秒,以確保植入物之全部表面被鈣均勻地覆蓋。
依照本發明之第三種方法較佳為使用在去礦水中之任何水合狀態的氯化鈣溶液,或者在去礦水中之任何水合狀態的乙酸鈣溶液。可用於第一種及第二種方法的乙醇中氯化鈣溶液並未用於此第三種方法。其乃因為植入物係儲存於溶液中而已保證全部植入物表面的潤濕力,及在使用乙醇之情況,臨床程序會延遲直到乙醇蒸發(一旦將植入物從容器移除)且離子化鈣被大氣水粒子再水合。其必須注意在其表面仍含有乙醇時裝設植入物並不適當,因為乙醇對血液有抗凝血效果。
對於第一種及第二種方法,至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液濃度較佳為在20至2000 mM之間,而對於第三種方法,溶液濃度必須在此範圍內。此範圍確保植入物提供上述親水性性質、對抗大氣污染之保護、及促礦化性質,如以下詳述的實驗所證。亦如該測試所證,為了確保植入物亦提供促凝血性質,至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液濃度必須在100至1000 mM之間。
又在獲得親水性、受保護對抗大氣污染、促凝血、及促礦化的表面之後,依照本發明之植入物提供以下詳細解釋的額外優點。
如所已知,鈦牙科植入物之表面為極性表面,因其隨表面鈦氧化物而包含O-與OH-離子。在將植入物配接於病患時,植入物之極性表面接觸血流。如所已知,病患所帶有的大量水溶性生物分子(其參與骨產生程序且其帶有電荷)可能被吸引至植入物之極性表面。具體而言,已知存在於血流中之自由鈣Ca2+離子(大約0.4毫克/毫升;參見Ellingsen JE,1991 Biomaterials)結果與植入物表面之負電荷形成靜電鍵,且該靜電鍵在中及長期後植入期間非常有幫助地促進植入物的骨接合。具體而言,OH--Ca2+靜電鍵之Ca2+離子造成從生物環境吸附HxPO4 3-x而促進磷酸鈣相(其為骨先質)形成。另外,鈣可吸引許多蛋白質與酸性殘基(帶負電),其因特定之鈣結合機構而參與骨再生程序。簡言之,鈦成功地作為生物材料可歸因於其與存在於血液中的鈣鍵結為將蛋白質吸附至其表面(的氧化物)之機構、及導致骨接合之後續程序的基礎。
本發明事先(在接觸病患之前)將鈦氧化物表面暴露於有鈣離子的溶液意指在將部分此鈣在接觸病患之前,以靜電方式鍵結帶負電的表面。結果因該表面尚未成為大氣污染之標的而完全利用表面之電位能吸附Ca2+離子(故改良每表面單位的吸附性能)。
本發明標的植入物之表面通常因兩個理由而可獲得更快及更佳的骨接合:首先為表面鈣離子之立即可得性;其次為可作為結晶相晶核生成點之大量表面鈣離子,其係由於使用植入物表面的實際上所有OH基所造成。結果本發明從最初之後植入時間點即可發生由鈣引發的程序,且獲得更快及更高品質之植入物周圍骨再生。
依照本發明的方法關於其中將植入物儲存在氯化鈉(NaCl)或氫氧化鈉(NaOH)之稀釋溶液中的習知方法亦有差別及不同之效果。在所有的方法中,植入物之疏水性因植入物粗度而排除(釋放保留在粗度中的空氣),且植入物受保護而不接觸特定之大氣烴(除了在Stadlinger B,2009 J Clin Periodontol所指之情形,因在此情形,植入物係恰在使用前浸泡而非保存或儲存在溶液中,或者如同本發明有保護層),而造成表面較乾淨。然而在該習知方法中,植入物係儲存在NaCl或NaOH中,故在凝血梯瀑內無生物活性(由第5圖之詳細解釋可知),而依照本發明之植入物則獲得兩個上述有利效果:首先為事先將鈣離子結合植入物表面的羥基,其促進植入物附近之生物礦化及定型間質形成,即骨接合;其次為未結合植入物表面羥基的過量鈣被釋放而提供其本身優點(在起初後插入期間引發凝血程序及暫時間質形成等)。依照本發明之植入物亦從一開始及在最大臨床重要性之處(即在骨-植入物界相中)保有品質。
此外,關於WO0224243A1號專利所揭述的方法(其揭述將植入物以在不同酸中連續泡浴而進行表面處理,繼而中和,清洗,及施加富生長因子之血漿(PRGF))則改良臨床應用力,因為不必將PRGF以氯化鈣活化,而是僅接觸植入物表面即活化,因依照本發明之植入物已具有可溶於PRGF的鈣鹽。
[實驗結果]
以下詳述一系列實驗,其結果顯示依照本發明之植入物的表面事實上的確有均已在全部本說明書中提及之親水性、對抗大氣污染之保護、及促凝血與促礦化性質。另外,後續實驗則研究表面之礦化力,且相較於未塗覆表面而測試鈣塗層形成氧磷灰石之能力(即測試表面之促礦化特徵)。最後進行細胞毒性研究而排除這些塗層對造骨母細胞的任何負面影響(即發現本發明之塗層可使造骨母細胞正確地附著在植入物上)。
該實驗如下:
-測試1:計算表面鈣量之基礎。
-測試2:地形特徵及組成分析。
-測試3:親水性及對抗污染之保護。
-測試4:促凝血特徵。
-測試5:促礦化特徵。
-測試6:細胞毒性。
前兩個測試之目的為依照以下參數測定每表面單位所帶走之鈣量:CaCl2溶液係使用去礦水或乙醇作為溶劑;該溶液之CaCl2濃度。
所有使用之反應物均得自西班牙巴塞隆納之Scharlab S.L.。
製備植入物之表面。使用粗度為Sa=0.7微米及Sdr=35%的植入物。將該植入物以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。各基本溶液濃度均使用5個植入物。
製備溶液。使用二水合氯化鈣CaCl2‧2H2O(CaCl2)作為溶質。使用95重量%乙醇及去礦水作為溶劑。溶液濃度為28至912 mM之範圍。
然後進行快速浸泡及實行滴定。具體而言,將植入物在含有1毫升之各種氯化鈣溶液的小玻璃瓶中進行快速浸泡(5秒)。然後將植入物移除及置於有1毫升之水的小玻璃瓶中。在5小時後將各小玻璃瓶之內容物(植入物+水)在錐形瓶中沉積。然後對小玻璃瓶加入1毫升之水4次,然後對錐形瓶以清除小玻璃瓶之全部內容物。在滴定期間植入物仍保持浸泡。使用0.05M EDTA作為滴定劑,以2M NaOH調整成pH 11。使用紫尿酸銨作為指示劑。
在快速浸泡後將植入物乾燥,暴露於65℃真空爐歷時1小時。
以上依照所使用溶劑之型式確定表面所帶走鈣量的測試顯示,在將鈣溶於乙醇時產生表面鈣質較在將鈣溶於水時之情形不分散的塗層(表1)。其乃由於乙醇為表面張力較水小之液體,故在快速浸泡中浸泡全部粗表面較均勻。在CaCl2於乙醇中但不乾燥之情形可能發生乙醇未完全蒸發而引起與水部分再水合。因此獲得更大再現力的方法則選擇涉及在CaCl2中快速浸泡繼而乾燥的方法。
第1圖顯示表面鈣量與處理植入物之溶液的起初鈣濃度之間的關係(數字係特定地顯示將粗表面在濃度不同之CaCl2於乙醇中溶液中快速浸泡(5秒),繼而在65℃真空乾燥1小時之後,每表面單位(平方毫米)之鈣質量(微克))。使用乙醇作為溶劑則各值之偏差最小。
由所獲得資料之線性迴歸所推導的表面負荷係數為3.4±3奈克‧毫米-2‧mM-1。
以下測試之結果係依照以此係數所計算的表面鈣量而非CaCl2溶液之起初濃度而表示。
此測試之目的為評估塗鈣表面在極性液體中浸泡前後之形態且測定其組成。
所有使用之反應物均得自西班牙巴塞隆納之Scharlab S.L.。
使用直徑為6毫米,高度為3毫米,且粗度為Sa=0.7微米及Sdr=35%的碟片製備植入物表面。將該碟片以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。
製備溶液。CaCl2‧2H2O(二水合物)作為溶質。95% wt%乙醇作為溶劑。
為了製造塗層而將類似植入物表面所帶走之相同體積沉積,以提供2.4微克/平方毫米的最終濃度。
在以溶液塗覆之後,然後將碟片在65℃真空爐中乾燥1小時。亦將所清洗之碟片在去礦水中浸泡3次及風乾。
樣品係使用JEOL JSM-5500LV掃描電子顯微鏡(日本東京之昭島市)及Oxford Inca 300能量分散式光譜儀(EDS)(英國Oxon之Witney)分析,其可偵測週期表中碳(含)以上之元素。相片係以20仟伏之加速電壓拍攝。
不似未塗覆碟片(第2圖),在塗鈣碟片上可見到粗表面上有一層(第3圖)。將該表面以去礦水清洗則可見到鈣塗層消失(第4圖),推論為溶於所處理之極性培養基中。其在接觸血液或血漿之情況為所欲效果(參見表4)。
含鈣表面之組成分析顯示表面上有鹽(第6圖)。Ca/Cl比例正確地對應鹽之組成(CaCl2),Cl之量大約為Ca的兩倍。在清洗後且如電子顯微鏡所顯示(第4圖),其可見到大部分鹽從表面消失(第7圖)且已移至所浸泡的極性培養基。其為在表面所暴露的極性液體為血液或血漿之情況在表面上引發凝血之所需效果(參見表4)。然而EDS仍偵測到少量,其為與先前藉XPS(X-射線光度光譜儀,參見Ellingsen JE,1991 Biomaterials)所獲得為一致之結果,且證實表面上存在定量之鈣而利於後續階段的生物礦化(參見表5)。
另一方面,經鈣處理、有或未清洗表面之光譜中無碳峰(第6圖及第7圖)顯示,在清潔後以鈣處理則防止在未以鈣處理之樣品所發生的經由吸附大氣烴而污染(第5圖)。
此測試有助於測定塗層之形態,亦測量其在暴露於極性液體前後的組成。此測試之結果亦在分析測試3、4及5之結果時非常有用。
第三測試之目的為測定接觸角之變異數如植入物所保留的鈣量、及依時間及不同之清洗而定的表面鈣普及度之函數。
所有使用之反應物均得自西班牙巴塞隆納之Scharlab S.L.。
使用直徑為12.7毫米,高度為1毫米,且粗度為Sa=0.7微米及Sdr=35%的碟片製備植入物之表面。將該碟片以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。各基本溶液濃度均使用8個碟片。
製備溶液。使用CaCl2‧2H2O(二水合物)作為溶質。使用95重量%乙醇作為溶劑。
為了製造塗層而將類似植入物表面所帶走之相同體積沉積,以提供0.2、0.7、1.4、2.4、與2.9微克/平方毫米的最終濃度。
然後分離三種碟片樣品:a)第一種樣品未進行清洗,用於測定空氣暴露時間對表面污染及其潛在親水性損失的影響;b)第二種樣品係進行溫和清洗(在去離子水中浸泡3次);c)第三種樣品係進行強烈清洗(以超音波清洗5分鐘)。
在以溶液塗覆之後,然後將碟片在65℃真空爐中乾燥1小時。將碟片暴露於空氣1及3日以測量其隨時間經過之安定性。
使用KSV Theta T-200光學張力儀(芬蘭赫爾辛基之Attension)測量接觸角。取暴露30秒後左及右接觸角測量的平均值。
對快速浸泡處理時間(5秒)、浸泡3小時、及浸泡50日測量各碟片在濃度不同之基本溶液中的保留時間對接觸角之影響。結果(未示)顯示對於在基本溶液中的保留時間之關係無顯著差異,因而採用該方法中所揭述的快速浸泡5秒及爐乾燥作為共用協定。
在製造塗層之後將表面對空氣暴露不同之時間長度以評定塗層對大氣暴露的影響,及測定由於加入懸浮在空氣中之疏水性粒子所造成的潛在親水性損失。第8圖顯示接觸角度數之變異數如表面Ca2+量及暴露時間的函數。結果顯示如果將表面暴露於環境污染歷時1至3日,則接觸角幾乎不改變。換言之,該測試顯示表面鈣沉積物防止由於經由大氣烴污染所造成的疏水化(亦參見測試2,含及無鈣之表面的元素組成)。
在塗覆及乾燥之後將碟片進行兩型水中清潔。該目的為測定在清洗後是否保留足夠之表面鈣而維持原始塗層的親水性條件。因此將碟片進行涉及將其在去礦水中浸泡3次之溫和清洗,及將其進行超音波清潔歷時5分鐘之強烈清洗。
第9圖顯示依照表面Ca2+量及清洗方法之接觸角度數的變異數。如所見到:
- 在每表面單位之鈣為0.7微克/平方毫米的未清洗碟片(圖中之方形符號)中,該塗層對表面提供超親水性特徵(接觸角<5°)。
- 在模擬將植入物浸泡於其他極性液體(水、血漿、血液)之條件(其中部分表面鈣可能在培養基中擴散,因此從表面脫離)而進行溫和清洗的碟片(圖中之圓形符號)中可見到,接觸角相對未清洗表面為增加,但是相較於未塗覆參考樣品則保持在極親水性條件(<20°)。
- 在模擬超音波清洗5分鐘之極端條件而進行強烈清洗的碟片(圖中之三角形符號)中,接觸角測量從未下降至溫和清洗所發生的低於20°,即使塗層有最少之鈣。此型清潔排除足夠比例之鈣塗層而導致接觸角顯著增加似乎合理。然而從1.4微克/平方毫米起,強烈清潔似乎不影響過量且接觸角係保持在20-30°之範圍。儘管如此仍應指出,均勻之超音波清潔無法改變鈣表面較無鈣表面為親水性的事實。其可假定非不顯著量之塗層殘留在粗表面的孔穴中。
在參考樣品(無鈣)之情形,接觸角之間的差異乃由於在乾燥及測量接觸角前之最後階段,在「經清洗」樣品之情形為水及在「未清洗」樣品之情形為乙醇所造成。此後者溶劑提供較大之表面羥化程度,因此這些型式的樣品之接觸角減小。
因此關於親水性性質,該測試顯示依照所揭述的方法而處理之植入物的性質仍實質上較未處理者為親水性,即使是在進行極端機械清潔程序之後。
第四測試之目的為測定可引發血漿凝血之每表面單位的鈣量。因此測定最適合造成體積凝血之血漿中鈣濃度範圍(無表面);然後測定何者表面鈣濃度範圍刺激凝血,此時係在表面存在下。亦研究額外之鈉系表面處理(NaOH及NaCl)以證實其無促凝血本性。
所有使用之反應物均得自西班牙巴塞隆納之Scharlab S.L.。
從3位健康病患抽取血液而製備血漿。應用類似EP1066838B1號專利所揭述的技術而獲得富生長因子之血漿(PRGF):將血液以460 G離心8分鐘;然後藉人工吸取將血漿柱體從紅血球與白血球分離(不似EP1066838B1號專利所揭述的協定,在此情形由於進行實驗之體積標準而選擇全部血漿柱體,並非僅富血小板的部分)。紅血球與白血球均被丟棄。
為了測定何者溶液中鈣濃度範圍可引發血漿凝血,及作為以該溶液修飾表面的先行步驟,如下測量凝血程度如鈣體積濃度的函數:
a) 凝血如鈣體積濃度的函數
為了測定引發凝血的血漿中鈣離子濃度範圍,在將10微升之CaCl2‧EtOH以28至2000 mM之間的濃度置於包含96井之多井板的底部。將井內容物乾燥(即蒸發乙醇繼而自動水合),然後將井充填200微升之血漿以製造1.3、2.5、12.5、22.8、45.6、與100 mM之最終血漿中鈣濃度。將正對照(Ctrl +)在置於板中之前於200微升之血漿中混合10微升的10重量%六水合鈣(最終濃度為22.8 mM),然後置於對照井中。負對照(Ctrl -)係以相同方式製備,但是不以10微升的10重量%六水合鈣活化。各情形均使用8個複製樣品。立即以後述方式測量吸收度。
b) 在含或無鈣表面存在下之凝血
首先製備表面。欲測量過量表面鈣之凝血研究係使用中空管使光束縱向地移動。該管係具有6毫米之直徑,1毫米之壁,且具有Sa=0.7微米及Sdr=35%之粗度。將其以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。每種濃度均使用8支管。
製備溶液。首先以CaCl2‧2H2O(二水合物)溶質及溶劑95重量%乙醇與去礦水製備鈣溶液。其次以去礦水及0.9重量% NaCl等滲透壓溶液製備50 mN NaOH溶液。
然後將該管在含有所研究之濃度不同的1毫升氯化鈣溶液之井中進行快速浸泡(5秒)。在浸泡後將該管在爐中暴露於65℃而真空乾燥1小時。將經NaOH及NaCl處理之管暴露於該溶液且未靜置乾燥而立即使用,如同其商業方式而使用。
將井中之管藉多重滴管之助各充填140微升的血漿。正及負對照係以如體積測量之相同方式,但是此時管在井中而製備。另外,依照血漿體積(140微升)而選擇用於正對照的10重量%六水合鈣之量,即7.4微升。
在將該管充填後立即以光譜光度儀測量在波長450奈米之吸收度(光學密度)。測量溫度為37℃且每分鐘均將測量記錄,歷時100分鐘。將結果相對正對照而標準化(對照之凝血程度=1)。
完整之動力凝血曲線(由於其比較性研究之複雜性而未包括)顯示有5至10分鐘之吸收度不變(等於開始值(0))的潛伏期,且因血纖維蛋白網路形成及稠化為凝血程序之一部分而從特定點起該值逐漸隨時間增加。此逐步交聯逐漸地阻止讀取光束通過,因此吸收度增加。吸收度值在程序開始之後約30分鐘時穩定,表示該程序已至終點。此時即為整理可得可進行各種樣品間之比較的吸收度(光學密度)值。
第10圖因此顯示依照可得鈣量(血漿中之最終鈣濃度係示於括號中),相對正對照(Ctrl + =1)標準化之最終體積凝血程度(無表面)。該圖表顯示在2.5至45.6 mM之間的血漿中鈣濃度範圍內,凝血程度有時甚至大於正對照。
第11圖顯示相對正對照值標準化之鈦管內部凝血程度如各種表面處理的函數(括弧內係提供如果樣品含有表面鈣之血漿中理論鈣濃度,且假設全部表面鈣均已自由地進入血漿中而產生凝血)。該圖表顯示一旦凝血程序結束則會應發生之管內部凝血程度。第12圖亦單獨顯示簡化不同表面濃度之表面鈣塗層的凝血程度。
第11圖及第12圖顯示如第10圖之相同實驗,但是係將鈣併入表面中而測量。亦研究市面上可得之NaOH及NaCl表面修飾作為確定其是否可促進表面凝血的方法(第11圖)。正對照係以如前述場合之相同方式進行:將10重量%六水合鈣混合22.8 mM的血漿且沉積在井中(有未處理表面)。
在無鈣表面之情形(負對照,NaOH及NaCl)顯然無凝血。在含鈣表面之情形,凝血程序在特定鈣濃度範圍中或較大或較小。具體而言,0.52微克/平方毫米之濃度不足以造成凝血,而0.7至3.5微克/平方毫米之範圍則在某些情形獲得甚至較正對照更大的信號。從1微克/平方毫米起,由含鈣表面所獲得之凝血程度係至少與正對照之凝血程度(即至少1)相同,且此值似乎在1-3.5微克/平方毫米之範圍內未顯著地增加。然而從3.5微克/平方毫米起凝血程度降低,直到從5微克/平方毫米起凝血程度被完全抑制。
簡言之,此測試已在表面確證如同在體積所已知,換言之,有引發理想凝血程序的表面鈣濃度範圍,但是在此範圍外則不發生凝血。因其缺鈣,基於NaOH及NaCl之市售塗層亦無法促進凝血。
此測試之目的為評估在進行鈣表面處理的樣品中形成磷酸鈣相之能力,以測定表面模擬氧磷灰石產生之能力。
所有使用之反應物均得自西班牙巴塞隆納之Scharlab S.L.。
使用直徑為8毫米,高度為3毫米,且粗度為Sa=0.7微米及Sdr=35%的碟片製備植入物之表面。將該碟片以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。在每型表面(含鈣、無鈣)之3個不同碟片的不同處進行測量。
製備鈣溶液。使用CaCl2‧2H2O(二水合物)作為溶質。使用95重量%乙醇作為溶劑。
為了製造塗層而將類似植入物表面所帶走之相同體積沉積,以提供2.4微克/平方毫米的最終濃度。
磷酸鈣相之電化學輔助沉積(ECAD)係組合PGSTAT T302N電壓穩定器/電流穩定器(荷蘭Utrecht之Metrohm Autolab B.V.)。此設備係附接外套電化學電池以在電解期間確保36±1℃之恆溫。將作業電極設計成陰極且極化係以電流穩定模式發生。實驗係其對各樣品施加-15毫安/平方公分之電流密度歷時30分鐘。以1.66 mM之CaCl2及1 mM之NH4H2PO4製備用於沉積磷酸鈣相的電解質。將電解質之pH以NH4OH調整成6.4。
在去礦化處理之後將樣品在去礦水中洗滌5次,以排除所有不穩定殘渣,及在後續分析之前靜置風乾。
評定樣品之去礦化係使用具有薄塗層用ATR(全反射衰減)模組的傅立葉FTIR Nicolet 6700 FT-IR轉換紅外線光譜儀(美國Waltam之Thermo Fisher Scientific)。將每個樣品在各樣品之5個不同點進行總共32次掃描,以檢查塗層之均勻性。
樣品之粗度及其磷酸鈣塗層之薄度使其無法抽取足量樣品以對KBr片進行分析。因此使用ATR法。在本情形,由於兩種塗層均以氧磷灰石形成而使ATR法不妥而缺乏400-600公分-1範圍之資訊。第13圖顯示含鈣樣品及無鈣樣品之紅外線光譜。磷酸鹽吸收峰之分裂(在1020與1090公分-1之ν3),及965公分-1之波峰均為氫氧磷灰石的特徵。875公分-1之小峰係歸因於結晶網路中的碳取代,表示為碳化氫氧磷灰石。1420公分-1之峰亦為此型氫氧磷灰石的指標。雖然兩種樣品均獲得碳化氫氧磷灰石,但在含鈣樣品之情形,峰之強度較大顯示這些塗層在相同的實驗條件下可造成氧磷灰石沉積增加。含鈣塗層亦產生更多水合氫氧磷灰石,羥基之特徵振動方式在3400公分-1附近非常明顯。除了峰之強度較大,在含鈣樣品之情形另一個應指出的態樣為存在碳化氫氧磷灰石(1460與1550公分-1)及水合氫氧磷灰石(1630公分-1)的額外峰,其在無鈣樣品中不存在。
簡言之,在相同之實驗條件下,此測試顯示事先經鈣處理的碟片可在表面上產生較未處理碟片為快之氫氧磷灰石沉積。
第六測試之目的為依照UNE-EN ISO 10993-5:2000標準,生物上評估含鈣塗層在與hFOB 1.19細胞接觸24小時後之細胞毒性。
將細胞培養液生長。將hFOB 1.19細胞株(ATTC CRL 11372)在DMEM-F12(Invitrogen 11039-021)中以10%牛胎血清、1%青黴素-鏈黴素、1%穀醯胺、與0.3毫克/毫升之G418完成培養。
使用直徑為6毫米,高度為3毫米,且粗度為Sa=0.7微米及Sdr=35%的碟片形式製備表面。將其以Triton X-100、丙酮及乙醇進行超音波清洗歷時20分鐘。每個濃度使用5個碟片。
使用CaCl2‧2H2O(二水合物)作為溶質及95重量%乙醇作為溶劑而製備溶液。
製造塗層:對各濃度將類似表面植入物所帶走之相等體積沉積在塗鈣碟片上,以提供0.36、1.79與3.26微克/平方毫米的最終濃度。
樣品處理均進行β 25-50 kGy滅菌。負對照係使用PVC測試管,且正對照係使用高密度PE測試管。使用乙醇將對照滅菌。在滅菌條件下將樣品置於96井板中,稍後將細胞加入。
細胞株及實行測試係將hFOB 1.19細胞株生長且獲得細胞懸浮液。將1.5x104個細胞散佈在研究樣品頂部之培養基/井中。將該板在37℃及5% CO2培養24小時。各樣品/對照係使用5個複製品,且為了測定各樣品/對照的背景信號而使用各樣品/對照之1個複製品作為「空白」(無細胞之生長培養基)。在接觸時間結束時藉WST-1*測試測量細胞/樣品之數量。其係將10微升之WST-1/井加入及培養4小時(37℃及5% CO2,黑暗)。最後將培養基從各井移至另一個板,且藉吸收度板式讀取器讀取板在波長450奈米之吸收度。
為了獲得細胞/樣品之數量,將已知細胞的數量結合藉WST-1法所獲得的吸收度而形成曲線。WST-1法為偵測細胞之粒線體的比色法。
至於測試之評估,結果係基於在接觸24小時後之培養的定量評估。其獲得各測試樣品相較於由正對照所獲得之結果的細胞存活率百分比。
相對細胞存活率(%)=樣品細胞之數量/對照細胞(+)之數量x100
結果係應用司徒頓-t檢定統計地處理而檢查相對正對照之差異是否為統計上顯著(p<0.05)。
第14圖顯示依照UNE-EN ISO 10993-5:2000標準之細胞毒性測試結果,其特別地顯示在暴露於無鈣(TiO2)及含鈣(1.79與3.26微克/平方毫米)樣品歷時24小時後相對正對照之細胞存活率。兩種表面均對所使用之造骨母細胞評定為細胞毒性,因未發現正對照與樣品的結果之間有統計上顯著差異,且其均未超過細胞毒性低限(相對存活率之70%)。表面鈣沉積物似未對細胞附著、及所培養細胞之24小時後存活率有負面影響。因其為高吸濕塗層,故有這些表面在受到高滲透壓時可能將細胞壁瓦解之顧慮。亦有相信膜受體可能由於過量鈣而飽和之理由。此測試排除此影響。具體而言,鈣塗層之高吸濕性係表示其與來自環境的水分子快速地水合,結果為在細胞與細胞培養基之接觸點處,滲透梯度下降至關於細胞分解為無害程度。
本發明可在鈦基材上獲得均勻之鈣塗層,其表面分布的分散極小。溶劑之鈣鹽匯集幾乎為立即性且不隨暴露時間但隨溶劑中溶質濃度而增加。氯化鈣之吸濕特徵可在表面上形成水合層,其防止由於氧化鈦因大氣烴之大氣污染所造成的「疏水」效應。此保護隨時間經過仍持續。另外,這些塗層基於每表面單位之相當低鈣離子濃度而對表面提供超親水性本性。親水性之些微損失僅在進行重量級清洗時觀察到,甚至表面之後具有較原先為覆鈣者更高之親水性特徵。這些塗層之指定特徵為其在極性液體(如血液或血漿)存在下可溶解。因鈣為凝血梯瀑及引發之基本成分,故表面的主要特徵為其在接觸上述生物流體時造成凝血。此程序係依鈣濃度而定,結果本說明書指定以最適方式發生濃血的表面鈣濃度之範圍:在以CaCl2處理之情形為0.70至3.5微克/平方毫米,或100至1000 mM之間的基本溶液濃度。礦化力(促礦化特徵)研究顯示鈣塗層係具有較未塗覆表面大的形成氧磷灰石之能力。最後,細胞毒性研究則排除這些塗層對造骨母細胞之任何負面影響。
- 第1圖顯示在各種濃度的CaCl2於乙醇中溶液中快速浸泡(5秒)後,及在65℃真空條件乾燥1小時後,每表面單位(平方毫米)之鈣質量(微克)。
- 第2圖顯示對無鈣塗層之粗表面以掃描電子顯微鏡所獲得的顯微相片。
- 第3圖顯示對鈣塗層為2.4微克/平方毫米之粗表面以掃描電子顯微鏡所獲得的顯微相片。
- 第4圖顯示對鈣塗層為2.4微克/平方毫米之粗表面在將該表面浸泡於極性液體中之後以掃描電子顯微鏡所獲得的顯微相片。
- 第5圖顯示由未塗以鈣之粗表面所獲得的分散光譜。
- 第6圖顯示由具有2.4微克/平方毫米的鈣塗層之粗表面所獲得的分散光譜。
- 第7圖顯示由具有2.4微克/平方毫米的鈣塗層之粗表面在將該表面浸泡於極性液體中之後所獲得的分散光譜。
- 第8圖顯示接觸角度數之變異數如表面上Ca2+量及暴露時間的函數。
- 第9圖顯示接觸角度數之變異數如表面上Ca2+量及清洗方法的函數。
- 第10圖顯示最終體積凝血程度(相對正對照標準化)如可得鈣量的函數。血漿中之最終鈣濃度係示於括弧中。
- 第11圖顯示最終凝血程度(相對正對照標準化)如各種表面處理的函數。括弧中係顯示如果表面上的全部鈣均在血漿中擴散而造成凝血之血漿中理論鈣濃度。
- 第12圖顯示最終凝血程度(相對正對照標準化)如表面鈣量的函數。
- 第13圖顯示以鈣(2.4微克/平方毫米)處理的樣品,及無表面鈣、暴露於電化學輔助沉積磷酸鈣相的樣品之紅外線光譜。
- 第14圖顯示將無鈣(TiO2)及含鈣(1.79與3.26微克/平方毫米)表面暴露24小時之後,相對正對照的細胞存活率。
Claims (4)
- 一種修飾植入物表面之方法,其包含將該植入物儲存在含有至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的容器中之步驟,該植入物係接觸該溶液且與外部隔離而儲存,其中該至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的濃度為20至2000mM之間。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的溶質為氯化鈣,且該溶液中之氯化鈣濃度為100至1000mM之間。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的溶質為氯化鈣,且溶劑為去礦水。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該至少一種極性液體可溶性鈣鹽之溶液的溶質為乙酸鈣,且溶劑為去礦水。
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