ES2351620T3

ES2351620T3 - Procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas y genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia.

Info

Publication number: ES2351620T3
Application number: ES07727050T
Authority: ES
Inventors: Bertrand Pain; Fabrice Lavial; Jacques Samarut
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Ecole Normale Superieure de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Ecole Normale Superieure de Lyon
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2011-02-08
Anticipated expiration: 2027-03-19
Also published as: ATE479744T1; JP5124748B2; WO2007110341A1; US20090311789A1; DE602007008863D1; AU2007229556A1; EP2007882B1; FR2898908A1; JP2009529899A; EP2292739A1; EP2007882A1; EP2292739B1; DK2007882T3; CA2647806A1

Abstract

Procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas a partir de células cepas aviarias cultivadas en un medio de cultivo apropiado, caracterizado porque comprende una etapa de inducción de la diferenciación de las células cepas por inhibición de la expresión o de la actividad del gen 1P06 de la SEC ID nº 1 expresado en dichas células cepas.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas, a partir de células cepas en cultivo. Unos genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células cepas aviarias han sido identificados y clonados. Inhibiendo la expresión de estos genes en las células cepas, éstas pierden sus características de pluripotencia y entran en una vía de diferenciación. Estas células diferenciadas obtenidas in vitro pueden servir de células hospedantes para unos agentes patógenos, en particular unos virus, y ser así utilizadas para la producción de vacunas anti-víricas.

Una célula cepa es una célula pluripotente o multipotente de origen embrionario o adulto que presenta una capacidad de auto-renovación. En otros términos, una célula cepa es una célula no cancerígena capaz de dividirse indefinidamente en cultivo y dar una célula hija que presenta la misma capacidad de proliferación y de diferenciación que la célula madre de la que procede, y que es capaz de dar origen a unas células diferenciadas.

Las células cepas embrionarias de pollo (CESC por Chicken Embryonic Stem Cells) han sido aisladas mediante el cultivo de células de blastodermis de pollo en la etapa X (Pain et al., 1996; solicitud de patente nº FR 94/12598). Estas células CESC presentan todas las características de células cepas embrionarias (ESC). Un medio de cultivo que permite mantener el carácter pluripotente de estas células de pájaros ha constituido el objeto de la solicitud de patente WO 96/12793. La mayoría de las características de estas células se describen en la publicación Lavial et al. (abierta a inspección pública).

Una de las propiedades de las células cepas es su capacidad para proporcionar unas células diferenciadas al mismo tiempo in vitro e in vivo. La obtención de estas células diferenciadas a partir de una población homogénea de precursores se realiza mediante la modificación de las condiciones de cultivo. En efecto, las células CESC siguen en proliferación en un estado no diferenciado sólo en unas condiciones definidas de cultivo in vitro, en presencia de factores de crecimiento y de citoquinas así como de un "feeder" desactivado. En cuanto el medio se empobrece, el equilibrio de proliferación se modifica y la célula entra en diferenciación. Una de las ventajas de la obtención de células diferenciadas in vitro a partir de las células CESC es la paleta tan amplia de fenotipos que pueden ser generados a partir de estas células. En efecto, las células CESC presentan unas propiedades de pluripotencia; éstas pueden diferenciarse en todas las estirpes definidas a nivel embriológico, es decir, en derivados mesodérmicos, ectodérmicos o endodérmicos. Esta propiedad de pluripotencia, específica de una célula cepa, no está presente en las células primarias de un tejido que ya han entrado en una vía de diferenciación. Esta propiedad es máxima en las células cepas embrionarias y está presente, pero de manera más limitada, a nivel de las células cepas adultas tisulares, que son multipotentes. Estas últimas pueden diferenciarse sólo en unas vías de diferenciación que pertenecen a una única y misma estirpe.

Los procesos de reprogramación nuclear permiten que una célula diferenciada vuelva a encontrar una plasticidad de diferenciación. Estos mecanismos empiezan a ser descifrados a nivel molecular en particular por la comprensión de las modificaciones epigenéticas que se producen a nivel del ADN (metilación sobre los islotes CpG) y/o de sus componentes tales como las histonas por unos procesos de acetilación y de desacetilación, de metilación y de desmetilación, de ubiquitinación de las lisinas, de fosforilación de las serinas, de isomerización de las prolinas, y de los cuales una de las consecuencias es reclutar numerosos complejos proteicos que controlan por su asociación sobre unos promotores el nivel de expresión de los genes clave. Unas modificaciones post-traducionales directas de estos actores son asimismo un elemento de regulación suplementario.

Diferentes procedimientos son conocidos por el experto en la materia para inducir o controlar la diferenciación de las células cepas pluripotentes en células diferenciadas in vitro.

Uno de los primeros enfoques consiste en inocular las células en un medio de cultivo que contiene pocas citoquinas o ninguna citoquina y factores de crecimiento necesarios para el mantenimiento de la proliferación de las células. En particular, la ausencia o la baja concentración de una de las citoquinas de la familia ge130 (LIF, IL-6, CNTF, GPA, IL-11, etc.) induce una ralentización de la proliferación y una pérdida progresiva de los marcadores de la pluripotencia.

La diferenciación de las células sometidas a este procedimiento no es homogénea; se obtendrán diferentes tipos celulares según las condiciones de densidad, de secreción autocrina y paracrina de las células, y de sus relaciones entre sí. La heterogeneidad de las células obtenidas se puede estimar por la detección en el conjunto del cultivo de la mayoría de los marcadores precoces de estirpes, tales como por ejemplo los genes Brachyury y Goosecoid específicos de la estirpe mesodérmica, algunos genes Pax y Sox específicos de la estirpe neurectodérmica, y Hnf3 específico de la estirpe endodérmica.

Un segundo enfoque consiste en realizar unos cuerpos embrioides mediante la inoculación de las células en una caja que no está tratada para el cultivo celular. Las células desasociadas se suspenden o bien en un gran volumen de medio empobrecido (menos suero -de 0,5 a 5% por ejemplo -y una ausencia de factores de crecimiento y de citoquinas específicas) y sometido a una agitación lenta, o bien en un pequeño volumen de medio empobrecido, que se utiliza entonces en la técnica de las gotas colgantes. Diferentes ejemplos se proporcionan en las patentes US nº 5.456.357; US nº 5.914.268 y US nº 6.458.589. Otro acondicionamiento es la formación de los cuerpos embrioides directamente en un tubo cónico (Kurosawa et al., 2003), sobre una superficie tratada particular (Konno et al., 2005) o mediante encapsulación en unas microbolas de alginato (Magyar et al., 2001). Al impedir así la adhesión de las células y su polarización baso-lateral, las células cepas embrionarias proliferan y adoptan una estructura tridimensional que imita las diferentes hojas embrionarias (Dang et al., 2002). Los tipos celulares así obtenidos son muy heterogéneos. Además, se observa una heterogeneidad en la cinética de obtención de las diferentes etapas de diferenciación.

Un tercer enfoque es la utilización de inductores químicos de diferenciación. Por sustancia inductora química, se entiende cualquier molécula química no peptídica que no se parece a un factor de crecimiento o a una citoquina, ya sea de origen natural u obtenida mediante síntesis química.

Por ejemplo, se utiliza el DMSO (dimetilsulfóxido) como un inductor general que permite la obtención de poblaciones diferenciadas mixtas con varios tipos celulares derivados (Dinsmore et al., 1996). El ácido retinoico permite, solo o en combinación con el AMPc por ejemplo, de manera no exclusiva, obtener la diferenciación de las células cepas en particular en derivados mesodérmicos, con la obtención de adipocitos en unas condiciones de cinética precisas (Dani et al., 1997), de cardiomiocitos, de diferentes células musculares caracterizadas por una actividad contráctil y la presencia de miosina específica (Rohwedel et al., 1994; Drab et al., 1997).

La mayoría de los protocolos publicados actualmente y que permiten la obtención de células con un fenotipo particular a partir de células cepas embrionarias de ratones asocian unos inductores químicos y unas combinatorias complejas de factores de crecimiento. Unas variaciones en las cinéticas de inducción y de puesta en presencia de estos agentes permiten modular los fenotipos obtenidos. Se proporcionan unos ejemplos con la cinética de obtención de células adipocitarias (Dani et al., 1997), de células osteoblásticas (ZurNieden et al., 2003; Philips et al., 2001) y de precursores neuronales que presentan diferentes fenotipos (Fraichard et al., 1995; Plachta et al., 2004; Glaser y Brustle, 2005).

La reproducibilidad de dichos enfoques resulta difícil a veces y no permite obtener unos enriquecimientos en células diferenciadas satisfactorios para unas aplicaciones industriales, tales como la replicación de virus particulares o la producción de moléculas de interés. Además, los procesos comprenden numerosas etapas, que implican la utilización de medios de cultivo bien particulares y numerosas etapas de manipulación de las células.

Los enfoques descritos anteriormente permiten inducir la diferenciación de células cepas; siendo las poblaciones obtenidas heterogéneas, es necesario a continuación seleccionar y aislar las células que presentan el fenotipo deseado; para ello el experto en la materia conoce varias técnicas. Se puede citar de manera no exclusiva la selección mediante seleccionador de superficie tras los marcajes por unos anticuerpos de superficie específicos, mediante depleción o mediante enriquecimiento magnético.

Otro enfoque consiste en utilizar unos protocolos de enriquecimiento que recurren unos procesos de selecciones genéticas positivas. Para ello, la expresión de un gen de selección de una droga (neomicina, higromicina, ceomicina, blasticidina) o de un marcador fenotípico que permite la selección física de una célula que lo expresa (proteínas fluorescentes tales como las GFP salvajes o modificadas, beta-galactosidasa, alcohol deshidrogenasa) se dispone bajo la dependencia de un promotor tejido-específico. Entre los promotores utilizados se pueden citar los de las cadenas de Miosina (Muller et al., 2000), los de los genes inductores de la miogénesis Mvf5 o MyoD, los de la Nestina (Keyoung et al., 2001), de Hb9 (SinghRoy et al., 2005), de promotores específicos de los astrocitos tal como GFAP (Benveniste et al., 2005) o de otros tipos neuronales tales como los oligodendrocitos con los genes CNP (3'-fosfodiesterasa cíclica) (Glaser et al., 2005; Schmandt et al., 2005).

Otro enfoque consiste en sobreexpresar el ADNc de interés capaz de inducir la diferenciación en una estirpe determinada, tal como por ejemplo con los ADNc de estirpe mioblástica (genes Pax3, MyoD, Myf5, Miognenina, Mft-4, etc.). Esta sobreexpresión se puede realizar con la ayuda de vectores de sobreexpresión de inserción aleatoria, pero también con la ayuda de un estrategia de "knock in" en un locus determinado de la actina

o en el locus específico de la estirpe, o también con la ayuda de vectores víricos y retrovíricos.

En la actualidad, no existe por lo tanto ningún método que permita obtener una población de células diferenciadas in vitro que sean homogéneas, sin realizar ulteriormente una etapa de selección. Por esta razón, los inventores han puesto a punto una nueva técnica que permite obtener una población de células diferenciadas que presentan unas características morfológicas, bioquímicas y funcionales homogéneas, que no necesita ninguna etapa de selección suplementaria. Según la invención, es posible obtener una modificación morfológica, fenotípica y molecular de 80 a 100% de las células de un clon inducido, es decir, de un clon compuesto por células diferenciadas.

En los mamíferos, se han identificado varios genes que controlan la pluripotencia y las capacidades de proliferación de las células cepas. En particular el gen Oct4 (Nichols et al., 1998) es un gen clave expresado únicamente en las células pluripotentes in vivo. In vitro, Oct4 se expresa en las células cepas embrionarias de ratones y de primates, así como en ciertas líneas celulares tumorales. El nivel de expresión de Oct4 en unas células cepas embrionarias murinas parece controlar el futuro de estas células cepas (Niwa et al., 2000).

El gen Oct4 pertenece a la familia POU de los factores de transcripción de homeodominio; la proteína producto del gen tiene una localización nuclear y puede fijarse directamente sobre los elementos de regulación de los genes diana a través de su dominio de fijación al ADN.

Desde un punto de vista filogenético, era poco probable que un gen de función equivalente exista en las especies no mamíferas. En los pájaros, dicho gen no pudo ser identificado durante las investigaciones anteriores (Sooden-Karamath & Gibbins, 2001). Además, no se ha informado de ninguna homología a nivel genómico.

En los mamíferos, los genes Nanog (Chambers et al., 2003: Mitsui et al., 2003; Hart et al.; 2004) y Eomes (Russ et al., 2000, Ginis et al., 2004) han sido asimismo identificados como desempeñando un papel clave en el mantenimiento de la pluripotencia de las células cepas. La presente invención propone un procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas a partir de células cepas aviarias cultivadas en un medio de cultivo apropiado, caracterizado porque comprende una etapa de inducción de la diferenciación de las células cepas mediante la inhibición de la expresión o de la actividad del gen IP06 expresado en dichas células cepas.

La ventaja de este procedimiento es que las células diferenciadas obtenidas son homogéneas. Los clones obtenidos ya no presentan la morfología característica de un clon de células cepas, sino una morfología diferenciada. Estos clones ya no presentan tampoco la proliferación característica de las células parentales y la celularidad permanece constante después de la inducción.

Esta inducción de la diferenciación de las células cepas es al mismo tiempo rápida e irreversible.

De manera preferida, las células aviarias proceden de un pájaro que pertenece al orden de los galliformes, en particular de un pollo o de una codorniz, y más preferentemente de la especie Gallus gallus.

Mediante la expresión "células cepas", el experto en la materia comprende que las células presentan las características siguientes:

-la capacidad de proliferar en auto-renovación in vitro en presencia de factores de crecimiento bien conocidos en la bibliografía, y durante unos tiempos importantes;

-desde un punto de vista morfológico, una célula cepa se caracteriza por una relación nucleocitoplásmica elevada, una tamaño relativo de 10 a 15 µm con un núcleo de 5 a 10 µm, presenta diferentes actividades bioquímicas intrínsecas tales como las de la alcalina fosfatasa y de la telomerasa, y es reconocida por diferentes anticuerpos específicos tales como los descritos en las patentes FR 94/12598 y FR 00/06029. Otra particularidad de las células cepas embrionarias aviarias es sus contactos membranarios estrechos cuando proliferan;

-las células son pluripotentes, lo cual significa que pueden dar lugar a varios tipos celulares, en particular las células cepas aviarias de la invención pueden diferenciarse en células de derivados ectodérmicos, mesodérmicos y endodérmicos.

Mediante la expresión "células diferenciadas", el experto en la materia entiende que las células proliferan menos o nada, que presentan una relación nucleocitoplásmica más baja, un tamaño en general más grande (>15-20 µm o más para algunos tipos celulares particulares tales como los osteoclastos, los adipocitos maduros, las células musculares diferenciadas, algunos macrófagos, etc.), con una morfología menos compacta y que han perdido los marcadores bioquímicos de las células cepas no inducidas.

En particular, las células cepas pueden ser diferenciadas en células epiteliales, caracterizadas por la presencia de marcadores tales como las citoqueratinas 8, 18 y 19, la queratina 16 para los queratinocitos, algunas mucinas, cadherinas e integrinas específicas. Según el origen de las células epiteliales consideradas, diferentes asociaciones de marcadores serán características del origen y del grado de diferenciación de las células epiteliales, en particular en los procesos neoplásicos (Barak et al., 2004).

Según otro aspecto de la invención, las células cepas pueden ser diferenciadas en células hematopoyéticas precursoras y diferenciadas, caracterizadas, entre otros, por la presencia de marcadores membranarios, conocidos en el ratón y en el ser humano por la nomenclatura CD (Cluster of Differentiation) e ilustrada por Lai et al., en una revista publicada en el Journal of Immunology (1998). Se pueden utilizar asimismo otros marcadores no membranarios, en particular unos factores de transcripción específicos.

Mediante la expresión "inhibición de la expresión o de la actividad de un gen", el experto en la materia entiende que se pueden utilizar todos los medios habituales que permiten controlar la expresión de los genes, en particular la utilización de inhibidores de transcripción o de traducción. En particular, la utilización de ARN interferentes permite inhibir específicamente la expresión de genes de interés.

Según un aspecto particular de la invención, la inhibición de la expresión o de la actividad del gen se realiza de manera condicional. De esta manera, la diferenciación de las células puede ser iniciada en un momento deseado por el experto en la materia.

Según un aspecto particular de la invención, la inhibición de la expresión o de la actividad del gen se realiza mediante por lo menos un ARN interferente.

Las moléculas de ARN interferentes se utilizan para determinar específicamente unos ARN mensajeros (ARNm): el ARN interferente se hibridará al ARNm y como consecuencia inhibe la traducción de la proteína correspondiente, o bien por simple impedimento estérico, o bien favoreciendo la escisión del ARNm.

Esta estrategia de inhibición de la expresión de genes ha sido aplicada a las células embrionarias cepas murinas al mismo tiempo in vitro e in vivo (Grabarek et al., 2003; Kunath et al., 2003; Lickert et al., 2005). El uso de los ARNi in ovo en el pollo es posible, tal como se ha demostrado en (Nakamura et al., 2004).

El ARN interferente se puede seleccionar de entre varias formas tales como: ARN antisentido, ARN bicatenario, "small interfering" ARN, "small Hairpin" ARN o ARN ribosómico.

Los ARNsi, por "Small Interfering RNA", o ARN interferente de pequeño tamaño, son unas secuencias cortas de aproximadamente 15 a 30 pares de bases (pb), preferentemente de 9 a 25 pb. Comprenden una primera hebra y una hebra complementaria idénticas a la región diana del ARN del gen diana. Por ARNsi se entiende las formas de ARN bicatenario sintéticas.

Los shARN por "Small Hairpin RNA" son unos ARN bicatenarios producidos por una secuencia clonada en un vector de expresión, que codifica para una molécula de ARN que adoptará una forma en horquilla después de la escisión por el complejo Dicer y Ioquacious (Du et al., 2005).

El diseño y la preparación de ARN interferentes y su utilización para la transfección de células in vivo e in vitro son bien conocidos y están ampliamente descritos en numerosas publicaciones, tales como: US nº 6.506.559, US 2003/0056235, WO 99/32619, WO 01/75164, WO 02/44321, US 2002/0086356, WO 00/44895, WO 02/055692, WO 02/055693, WO 03/033700, WO 03/035082, WO 03/035083, WO 03/035868, WO 03/035869, WO 03/035870, WO 03/035876, WO 01/68836, US 2002/0162126, WO 03/020931, WO 03/008573, WO 01/70949, WO 99/49029, US nº 6.573.099, WO2005/00320, WO 2004/035615, WO 2004/019973, WO 2004/015107, http://www.alugen.com/sirnatechnology.htm, http://www.alnylam.com/sciencetechnology/index.asp, http://www.protocol-online.orgiprot/Research_Tools/Online_Tools/SiRNA_Design/, http://www.hqmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/sirna.htmI, http://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html, http://www.upstate.com/browse/categories/RNAsi.q.

Los ARNsi pueden ser concebidos y preparados utilizando unos programas apropiados disponibles en Internet, por ejemplo:

-"siSearch Program" http://sonnhammer.cgb.ki.se/siSearch/siSearch 1.6.html ("Improved and automated prediction of effective siRNA", Chalk AM, Wahlesdelt C, y Sonnhammer ELL, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004).

-"SiDirect" http://design.mai.jp/sidirect/index.php (Direct: highly effective, targetspecific siRNA design software for mammalian RNA interference, Yuki Naito et al, Nucleic Acids Res, vol. 32, No. Web Server issue © Oxford University Press 2004).

-"siRNA design tool" de Whitehead Institute of Biomedical Research en el MIT http://jura.wi.mit.edu/pubint/Ihttp://iona.wi.mit.edu/siARN-ext/

-siRNA wizardTM de Invitrogen http://www.sirnawizard.com/.

-"siRNA Target Finder" de Ambion http://www.ambion.com/techib/misc/siRNAfinder.html,

-https://www.genscript.com/ssl-bin/app/mai

-http://www.promega.com/siRnADesigner/default.htm

-http://bioweb.pasteur.fr/seganal/interfaces/sirna.html

-Otros programas están referenciados en la página de Internet http://web.mit.edu/mmcmanus/ivww/home1.2files/siRNAs.htm, tal como http://athena.bioc.uvic.ca/cgi-bin/emboss.pl?action=input&app=sirna.

Las herramientas para la preparación de ARNsi y la transfección de células están a la disposición del público, tales como, por ejemplo, los vectores de ARNsi comercializados por la compañía Invitrogen (http://www.invitrogen.com).

Según las secuencias de ARN interferentes seleccionadas por el experto en la materia, se podrán obtener diferentes niveles de inhibición, permitiendo modular el efecto inhibidor buscado. De manera preferida, los ARN interferentes se preparan y se seleccionan para obtener por lo menos 50% de inhibición de la expresión del gen diana en una célula, incluso por lo menos 75%, 90%, 95%, incluso más de 99% de inhibición. El experto en la materia sabrá seleccionar los ARNi más eficaces mediante una simple investigación de rutina, por ejemplo analizando su capacidad para inducir la diferenciación de las células cepas (véanse las figuras 1 y 3).

El ARN interferente inhibe específicamente la expresión del gen 1P06.

En particular, la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente puede presentar una secuencia tal como se representa en el listado de secuencias con el título SEC ID nº 3.

Una técnica habitual para inhibir la expresión de un gen con un ARN interferente consiste en introducir en la célula un ARN interferente bicatenario; pero, como este ARNdb se degradará rápidamente, la inhibición del gen será limitada en el tiempo. Esta limitación ha llevado a los inventores a buscar un sistema que permita producir en la célula diana unos ARN interferentes "a petición".

La presente invención se refiere a unos vectores de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica para un ARN interferente, dispuesta bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante. La célula hospedante será preferentemente una célula cepa aviaria mantenida en cultivo in vitro.

Dichos vectores comprenden preferentemente un promotor, unas señales de iniciación y de terminación de la traducción, así como unas regiones apropiadas de regulación de la transcripción.

Según un modo particular de la invención, el promotor del vector de expresión que controla la expresión del ARN interferente es un promotor inducible.

La ventaja de un sistema de expresión inducible es que se puede dominar la duración de presencia del ARN interferente, y por lo tanto de la inhibición del gen diana. En efecto, algunos genes, esenciales para la supervivencia de la célula, no se pueden inhibir demasiado tiempo puesto que esto induciría la muerte celular; se deben inhibir otros genes durante un largo periodo antes de poder observar los efectos de esta inhibición. El dominio de la expresión del ARN interferente en el seno de la célula hospedante permite evitar estas dos limitaciones.

El experto en la materia conoce varios tipos de promotores transcripcionales inducibles, como por ejemplo el del operón lactosa, que ha sido el primer identificado y analizado. Se puede citar asimismo el sistema tet off/tet on basado en un promotor que se deriva del operón de resistencia a la tetraciclina de E. coli (Gossen et al., 1992).

La inducción de la actividad de un promotor se puede realizar o bien activando un promotor desactivo, o bien levantando la inhibición que pesa sobre un promotor activo constitucionalmente. Cada factor inhibidor o activador de transcripción puede a su vez ser inducible en función del entorno celular.

Por ejemplo, si el promotor posee un dominio de fijación a unos factores inhibidores de la transcripción, el levantamiento de la inhibición se realizará mediante el atrapado de estos factores que ya no podrán fijarse sobre las secuencias reguladoras del promotor; el promotor estará entonces "liberado" de los factores que inhiben la transcripción.

Según otro ejemplo, el promotor es activo constitucionalmente, pero es inhibido por la presencia de un casete insertado en su locus; el casete está dispuesto de tal manera que los elementos reguladores del promotor ya no pueden cooperar entre sí puesto que están demasiado alejados; el levantamiento de la inhibición se realiza entonces escindiendo el casete, en particular por medio de secuencias reconocidas por una recombinasa, dispuestas en cada extremo del casete. El casete puede comprender una secuencia larga de ADN "tampón" que sirve únicamente para realizar el impedimento estérico (Tiscomia et al., 2004), pero puede comprender asimismo unos genes "marcadores" como, por ejemplo, unos genes de resistencia a los antibióticos, o unos genes de fluorescencia tales como la GFP (Green Fluorescence Protein). La presencia de este casete de selección permite asimismo mantener el locus en una configuración cromática activa que limita los mecanismos de "silencing" de las secuencias, en particular en las células cepas.

Para obtener la escisión del casete, se utilizan frecuentemente dos sistemas, el sistema Cre-Lox y el sistema FLP-FRT. El sistema Cre-lox se basa en la habilidad de una enzima, la Cre recombinasa, para suprimir cualquier fragmento de ADN que se encuentra entre unas secuencias precisas de ADN: las secuencias loxP. El sistema FLP-FRT se basa en la actividad de la FLP recombinasa que suprime los fragmentos de ADN que se encuentran entre dos secuencias FRT. Los sitios de reconocimiento Lox P y FRT y las recombinasas Cre y FLP correspondientes son bien conocidos por el experto en la materia, descritos en particular en Kilby et al.; 1993, Sauer y Henderson, 1988, Gu et al.; 1994, Cohen-Tannoudji y Babinet; 1998, Shibata et al.; 1997, Schlake y Bode 1994.

En particular, un promotor inducible puede contener un casete lox -promotor de la timidina quinasa (TK)-neomicinR-lox cuya presencia inhibe su funcionamiento (Coumoul et al., 2004). El promotor se vuelve funcional sólo después de la escisión mediante la recombinasa CRE de este casete. La recombinasa utilizada CRE tiene a su vez una actividad que depende de la presencia de tamoxifeno en el medio de cultivo (Metzger et al., 1999). De esta manera, mediante la adición de tamoxifeno en el medio de cultivo de las células, la recombinasa se vuelve activa y escinde la secuencia inhibidora del promotor, convirtiendo así el promotor en funcional, permitiendo así la expresión del ARN interferente.

Entre los promotores de interés, se seleccionan preferentemente los promotores pol III dependientes tal como el promotor U6 o H1, bien conocido por el experto en la materia para su utilización en la expresión de los ARN interferentes.

El vector de expresión según la invención puede ser integrado en una célula hospedante, en particular una célula aviaria mantenida en cultivo in vitro. Se dice entonces que las células están "transformadas". Para ello, se pueden utilizar unos vectores de replicación autónoma en el seno de la célula hospedante, o unos vectores integrativos que permitirán la integración de la molécula de ácido nucleico exógeno en el ADN de la célula hospedante.

Entre los sistemas de replicación autónoma, se utilizan preferentemente unos sistemas de tipo plasmídico o vírico, pudiendo los vectores víricos ser en particular unos adenovirus (Perricaudet et al., 1992), unos retrovirus, unos lentivirus, unos poxvirus o unos virus herpéticos (Epstein et al., 1992). El experto en la materia conoce las tecnologías que se pueden utilizar para cada uno de estos sistemas.

Cuando se desea la integración de la secuencia en los cromosomas de la célula hospedante, se pueden utilizar, por ejemplo, unos sistemas de tipo plasmídico o vírico; dichos virus son, por ejemplo, los retrovirus (Temin, 1986), o los AAV (Carter, 1993).

Entre los vectores no víricos, se prefieren los polinucleótidos desnudos tales como el ADN desnudo o el ARN desnudo según la técnica desarrollada por la compañía VICAL.

En las células aviarias, se utilizarán preferentemente unos retrovirus, unos adenovirus aviarios, unos poxvirus o bien un ADN desnudo introducido mediante transfección o electroporación.

Dichos vectores se preparan según los métodos utilizados habitualmente por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden ser introducidos en una célula hospedante mediante unos métodos estándares, tales como la lipofección, la electroporación, el choque térmico, la transformación después de la permeabilización química de la membrana o la fusión celular.

Según otro aspecto de la invención, el procedimiento se caracteriza porque las células sufren por lo menos una etapa de activación o de inhibición de genes específicos, con el objetivo de obtener una diferenciación específica de dichas células.

En particular, la utilización de ciertos promotores y fases codificantes permite controlar la expresión de genes que inducen a su vez la diferenciación terminal de las células en unas vías definidas. Estos genes codifican en particular para unos factores de transcripción. Entre estos genes, se pueden citar los reguladores de la estirpe miogénica ('MRF') tal como Myf5, MyoD, Mrf4, los implicados en el determinismo de la línea adipocitaria tal como el gen PPARg, en el determinismo neuronal tal como Sox1 y Nestina, en el determinismo de la vía hematopoyética tal como Gata2 y Gata 3.

Esta etapa de activación o de inhibición de la expresión o de la actividad de genes puede ser o bien simultánea a la etapa de inhibición del gen 1P06, o bien desplazada en el tiempo, y preferentemente seguir en algunas horas la inducción de la inhibición. Este desplazamiento permite que la célula inicie el programa de diferenciación terminal de manera secuencial y reproduzca así mejor las cinéticas de diferenciación observadas in vivo.

Según otro aspecto del procedimiento de la invención, las células cepas aviarias de la invención se cultivan en unas condiciones apropiadas, en particular en presencia de ciertos factores de crecimiento e inductores, para obtener una diferenciación específica de dichas células.

Entre estos factores, se pueden citar los factores de crecimiento de la familia de los BMP, de los FGF y de la familia wnt cuyos papeles relativos muy complejos en el control de las vías mesodérmicas y ectodérmicas empiezan a ser descritos al mismo tiempo en el ratón, el xenopo y el pollo. Se utilizarán preferentemente estos factores en una gama de concentración del orden de 1 a 10 ng/ml, en particular para el BMP-4 y el BMP-7. Otros numerosos factores intervienen en las inducciones de las vías ecto y mesodérmicas.

El procedimiento según la invención puede comprender asimismo una etapa de selección y de destrucción de las células no inducidas en diferenciación.

La desaparición de los clones no inducidos se puede llevar a cabo de manera concomitante a la inducción, mediante una selección negativa con la ayuda de un vector que expresa un gen tóxico (timidina-quinasa, toxina diftérica), dispuesto bajo el control de un promotor activo únicamente en las células cepas, por ejemplo el promotor del gen Ens1

o del gen 1P06 descrito a continuación. De esta manera, sólo desaparecerán las células que presentan las características de células cepas.

Entre 24 y 72 horas después de la inducción de la diferenciación de las células cepas, las células se ponen en presencia del virus de interés en un medio de cultivo adecuado. Es necesario poner el virus en contacto con las células mientras que éstas están en su fase de inducción para presentar una división residual que permite la integración del virus y su producción, incluso si las células inducidas se dividen poco con relación a las células en proliferación. El tiempo de desdoblamiento pasa de 12 a 15 horas aproximadamente hasta más de 24 a 36 horas en la fase precoz de inducción para llegar a una célula que ya no se divide más allá de 96 horas después del principio de la inducción. Los m.o.i necesarios para la infección se calculan sobre el número de células obtenido después de 24 a 48 horas después del inicio de la inducción.

Las células cepas y sus derivadas diferenciadas pueden servir de soporte para la replicación de diferentes virus en función del tropismo particular de estos últimos. Esta estrategia se puede desarrollar con éxito con las células cepas frente a su gran plasticidad fenotípica. La adaptación de muchos virus a unos sustratos celulares uniformes de laboratorio (tales como las células de las estirpes BHK-21, CV-1 por ejemplo), modifica los rendimientos de producción de los virus afectando a su ciclo replicativo. Los mecanismos que controlan estas restricciones empiezan a ser elucidados (Wang & Shenk, 2005).

Otro objeto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica para un ARN interferente tal como se ha definido anteriormente en la invención.

La invención se refiere asimismo a un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un ARN interferente según la invención, dispuesta bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante, preferentemente una célula aviaria mantenida en cultivo in vitro.

Según un aspecto preferido de la invención, este promotor es inducible.

La invención se refiere asimismo a las células cepas aviarias transformadas con un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente.

Los ejemplos siguientes permiten ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos de la misma.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: La inhibición de la expresión del gen 1P06 por unos ARNi específicos induce una pérdida drástica de la proliferación de las células CESC e induce su diferenciación. Este efecto se mide en la morfología de los clones cuya diferenciación ha sido inducida por el hidroxi-tamoxifeno.

Figura 2: Análisis molecular de los clones diferenciados obtenidos por la inhibición de la expresión del gen 1P06 por el ARNi-1 P06-2. El contenido transcriptómico de los clones diferenciados o proliferativos se analiza mediante PCR en tiempo real.

Figura 3: La inhibición de la expresión del gen Nanog por unos ARNi específicos induce la diferenciación de las células CESC y por lo tanto una parada de la proliferación celular. Este efecto se mide sobre la morfología de los clones cuya diferenciación ha sido inducida por el hidroxi-tamoxifeno.

Figura 4: Inhibición de la expresión de los genes 1P06 y Nanog por un ARN interferente específico:

A-Marcaje de las células inducidas en diferenciación por el anticuerpo anti-SSEA-1

B-Cinética de la parada de la proliferación inducida por los ARN interferentes

C-Análisis molecular de la expresión de genes marcadores de diferenciación en las

células después de la inducción de esta diferenciación

Figura 5: Árbol de filogenia de los diferentes miembros de la multifamilia POU, que comprende los ortólogos y parálogos del gen 1P06 de G. gallus.

Figura 6: Porcentaje de homología del gen 1P06 de G. gallus con sus ortólogos de diferentes especies.

Figura 7: Porcentajes de homología del gen 1P06 con otros factores de la familia POU en la especie G. gallus.

Figura 8: Localización de la proteína de fusión GFP-1P06 en unas células CESC en proliferación (N: nuclear; C: citoplásmico; N+C: nuclear y citoplásmico).

Figura 9: Impacto de la sobreexpresión de la proteína de fusión GFP-1P06 en unas células CESC en proliferación. Se determina el nivel de estructuración de la cromatina.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1: INDUCCIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS CEPAS

AVIARIAS MEDIANTE LA INHIBICIÓN DEL GEN 1P06 POR MEDIO DE UN ARN INTERFERENTE

a) Construcción del vector de expresión que codifica para el ARN interferente

El plásmido pFLΔNeo se obtiene mediante la inserción del fragmento mU6ΔneoD de 2kb, amplificado mediante PCR en los sitios SmaI/HindIII del pBSK (Stratagene). Este fragmento mU6ΔneoD está amplificado con los oligonucleótidos primers m-U6-smal-S y m-U6-HindIII-AS a partir de la matriz mU6D-Neo-DApaIDXhol que ha sido suministrada por el Dr. Sheng, NIH Bethesda y que se describe en el artículo (Coumoul et al., 2004).

Una vez diseñados con la ayuda de los programas suministrados en las páginas Internet http://wwwproligo.com; http://www.qiaqen.com, http://www.ambion.com, se hibridan 100 pM de cada oligonucleótido ARNi para obtener el fragmento bicatenario mediante renaturalización lenta a temperatura ambiente en presencia de 1 mM de MgCl2 después de una desnaturalización por calentamiento a 95ºC durante 5 minutos. El oligonucleótido bicatenario resultante se clona directamente en los sitios HindIII/XhoI del vector pFLΔNeo preparado mediante digestión con estas mismas enzimas. El cribado se valida mediante la desaparición del sitio HincII y mediante una secuenciación sistemática de estos plásmidos positivos. Para cada ARN 'X' diana, se obtiene así el vector pFLΔNeo X-ARNi. La secuencia de los diferentes ARNi utilizados se presenta en el listado de secuencias. Antes de la transfección, los vectores son linearizados mediante Ahdl, sitio único presente en el gen de resistencia a la ampicilina.

El vector de expresión de la recombinasa CRE-ERT2-hygro se deriva del vector comercial pCI-Neo (Promega) tras varias etapas. El casete de resistencia a la higromicina se obtiene a partir del vector comercial pIRES-Hygro (Clonteh) mediante amplificación PCR con la ayuda del par de oligonucleótidos Nrul-hygroS y BamHI-hygro AS. El fragmento resultante se clona directamente en Nrul-BamHI en el vector pCl-Neo en el que el casete de resistencia a la neomicina ha sido previamente retirado mediante una digestión Kpnl-BamHI. El plásmido resultante es el plásmido pCI FL-Hygro. La fase codificante de la recombinasa CRE-ERT2 se amplifica a partir del plásmido pCRE-ERT2 suministrado por el Dr P. Chambon, IGMC, Estrasburgo y descrito en la publicación Feil et al., 1997, utilizando el par de oligonucleótidos CRE-ERT-SaII S y CRE-ERT2-smaI AS. El fragmento amplificado resultante se clona directamente en el vector de recepción pCI FL-Hygro preparado mediante una digestión por SaII-SmaI. La clonación es direccional y resulta de ella el vector pGRE-ERT2-Hygro. El conjunto de las fases codificantes se secuencia con el fin de verificar la integralidad de las amplificaciones y permitir una buena actividad de la recombinasa.

b) Introducción del vector de expresión que comprende el ARN interferente en las células cepas aviarias

Las células CESC se obtienen, se amplifican y se mantienen in vitro tal como se ha descrito anteriormente en Pain et al., 1996 y en las solicitudes FR nº 94/12598, FR nº 00/06029. Para las transfecciones, se transfectan 0,5 a 1 x 106 células con la ayuda de liposomas (Fugène 6, Roche) tal como se ha descrito anteriormente (Pain et al., 1999, solicitudes de patente FR nº 00/06029 y FR nº 01/15111) con la ayuda de 2 a 10 µg de diferentes vectores linearizados. La primera etapa consiste en transfectar los vectores de expresión pFLΔNeo X-ARNi. La selección con neomicina (de 100 a 250 µg/ml) se aplica durante 7 días. Los clones resistentes obtenidos se cuentan y pueden ser extraídos, amplificados y congelados individualmente para permitir una utilización ulterior después de la amplificación. Han integrado el vector de expresión del ARNi, pero no lo expresan. Estos clones son desasociados a continuación y sometidos a una nueva transfección por el vector de expresión de la recombinasa pCRE-ERT2-Hygro. Las células se seleccionan en presencia de higromicina (de 25 a 75 µg/ml) con una presencia mantenida de una selección con neomicina (de 50 a 200 µg/ml). Después de 7 días, los clones obtenidos se vuelven a contar, a extraer y a amplificar individualmente.

c) Expresión condicional del ARN interferente en las células cepas

El vector pFLD Neo XARNi permite controlar la expresión de los ARNi mediante la presencia de una secuencia lox-TK-Neo-lox, en el promotor U6 murino, secuencia que vuelve condicional el funcionamiento de este promotor (Coumoul et al., 2004). El promotor se vuelve funcional después de la escisión mediante la recombinasa CRE de esta inserción. Se ha utilizado en particular una recombinasa CRE-ERT2 cuya actividad es dependiente de la presencia de tamoxifeno en el medio de cultivo (Metzger et al., 1999).

En los clones obtenidos después de las dos etapas de transfección descritas, la adición de 1 µM de 4-hidroxi-tamoxifeno en el medio de cultivo durante 96 horas induce la escisión del casete de resistencia a la neomicina, enmarcada por los sitios loxP, y permite la producción del ARNi diana.

d) Caracterización morfológica de las células diferenciadas obtenidas

Después de la inducción mediante el 4-hidroxi-tamoxifeno de la expresión de la recombinasa CRE, la morfología de las células obtenidas se analiza mediante la observación microscópica directa y la grabación con la ayuda de una cámara CCD CoolSNAP (Photometrix).

Los clones se cuentan 4 días (96 horas) después de la inducción por el 4-hidroxitamoxifeno; los resultados obtenidos se representan en la figura 1. El número total de clones obtenidos en 3 experimentos independientes es respectivamente de n = 45 para el pFLΔNeo-0 (vector de control vacío), n = 59 para el pFLΔNeo-1, n = 61 para el pFLΔNeo-2 yn = 76 para elpFLΔNeo-4.

La figura 1 muestra el porcentaje de clones cuya diferenciación ha sido inducida y el porcentaje de clones que están todavía en proliferación. Sólo el ARNi-2 permite la obtención del fenómeno de inducción a la inversa del vector de control vacío y de los ARNi-1 y -4, para los cuales no se observa ningún cambio fenotípico, tal como lo muestra el número de clones no diferenciados.

De esta manera, incluso en presencia de los factores de crecimiento y de citoquinas necesarias para la proliferación de las células no diferenciadas, se observa en las células que expresan el ARNi-2 un cambio rápido y drástico de la morfología de las células en los clones. La capacidad proliferativa de estos clones se pierde y se vuelven proporcionalmente más pequeños con relación a los clones no inducidos. Estos clones no inducidos pueden resultar de una no escisión del casete lox por la recombinasa, y por lo tanto de una no expresión del ARNi.

Las células inducidas presentan una morfología plana, con un tamaño más grande que las células parentales no inducidas. Unas observaciones en microscopía de barrido muestran asimismo un mayor esparcimiento de las células inducidas.

e) Caracterización molecular de las células inducidas

Con el fin de caracterizar a nivel molecular los clones inducidos por la expresión del ARNi que inhibe la expresión del gen 1P06, se han extraído y analizado unos clones diferenciados y no diferenciados. Los resultados obtenidos se presentan en la figura 2. Se representa el nivel de expresión de diferentes genes marcadores. El nivel 1 es el observado en los clones que han integrado el vector vacío pFLDNeo-0.

El análisis del contenido transcriptómico de estos clones mediante unos enfoques de RT-PCR en tiempo real indica que el nivel global de expresión del gen 1P06 es menos importante en estos clones con relación a las células parentales (resultado no mostrado). Los niveles de expresión de los genes Nanog, Eomes y Gcnf han disminuido. Por el contrario, el gen Gata6 ve su expresión aumentada, lo que sugiere una inducción en una vía de diferenciación equivalente al endodermo primitivo.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2: INDUCCIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS CEPAS AVIARIAS MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN NANOG POR MEDIO DE UN ARN INTERFERENTE

Realizando unos experimentos similares a los realizados en el gen 1P06, con unos vectores de expresión de ARNi dirigidos contra el gen Nanog, se observa asimismo una inhibición de la proliferación y una inducción de la diferenciación de los clones seleccionados. Los clones se cuentan 4 días (96 horas) después de la inducción de la recombinasa CRE mediante la adición del 4-hidroxitamoxifeno. El número total de clones obtenidos es respectivamente de n = 5 para el pFLΔNeo-0 (vector de control vacío), n = 21 para el pFLΔNeo-nan-1, n = 37 para el pFLΔNeo-nan-3 y n = 15 para el pFLΔNeo-nan-5. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 3.

La figura 3 muestra el porcentaje de clones cuya diferenciación ha sido inducida (clones inducidos o diferenciados), y el porcentaje de clones que se encuentran todavía en proliferación. A la inversa del vector vacío, los ARNi-nan-1 y ARNi-nan-3 son capaces de inducir una diferenciación de la mayoría de las células: menos de 30% de los clones están todavía en proliferación. El ARNi-nan-5 induce asimismo esta diferenciación, en menor medida.

EJEMPLO 3: INDUCCIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN MEDIANTE LA INHIBICIÓN DE LOS GENES 1P06 Y NANOG EN PARALELO

En estos experimentos, los shARN utilizados han sido los siguientes:

ARNi-2 para la desactivación de 1P06, y ARNi-nan1 para la desactivación de Nanog

La diferenciación de las células cepas aviarias, a consecuencia de la inducción mediante la inhibición de la expresión de los genes 1P06 y Nanog, ha sido evaluada por medio de las mediciones siguientes:

-porcentaje de células positivas al marcaje por el anticuerpo anti-SSEA-1 (figura 4A)

-porcentaje de proliferación de los clones obtenidos en 48 y 96 horas (figura 4B)

-expresión relativa de genes "marcadores": 1P06, Tert, Nanog, Gata4, Gata6 (figura 4C).

La figura 4A muestra que las células obtenidas, en su gran mayoría, ya no expresan el antígeno SSEA-1 (Stage-Specific Embryonic Antigen-1), cuya expresión es característica de las células cepas (100% de células positivas cuando la transfección se realiza con un vector vacío).

La figura 4B demuestra la cronología de los eventos, y en particular el hecho de que la parada de la proliferación de clones se obtiene rápidamente.

Los clones se cuentan mediante observación microscópica directa, tal como se ha descrito anteriormente, 48 y 96 horas después de la inducción por el 4-hidroxi-tamoxifeno; la figura muestra el porcentaje relativo de clones cuya diferenciación ha sido inducida o que se encuentran todavía en proliferación: después de 48 horas sólo 60% de los clones están todavía en proliferación, siendo esto el efecto máximo obtenido inhibiendo la expresión del gen Nanog; después de 96 horas de inhibición del gen 1P06, se observa sólo 40% de clones en proliferación.

La figura 4C muestra la caracterización molecular de las células inducidas en diferenciación por inhibición de la expresión de los genes 1P06 y Nanog.

La expresión de los diferentes genes "marcadores" está normalizada con relación al índice de expresión '1' observado en los clones que han integrado el vector vacío pFLDNeo-0. El análisis del contenido transcriptómico de estos clones mediante unos enfoques de RT-PCR en tiempo real indica que el nivel global de expresión del gen 1P06 es menos importante después de la diferenciación. Los niveles de expresión de los genes Tert y Nanog han disminuido. Por el contrario, los genes Gata-4 y Gata-6 tienen una expresión aumentada, lo que sugiere una inducción en una vía de diferenciación equivalente al endodermo primitivo.

EJEMPLO 4: CLONACIÓN DEL GEN 1P06

Oligonucleótidos y secuenciación

Todos los oligonucleótidos han sido diseñados con la ayuda del programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi), y después sintetizados por la compañía Proligo. Las secuencias de los diferentes genes ensayados son identificados en el índice TIGR (http://www.tiqr.orp-/tigr-scripts/tgi/T index.cgi?species=ggallus) o buscados directamente sobre el sitio de ensamblaje del genoma del pollo (http://www.ensembl.orp,/Gallus gallus/) u obtenidos directamente a partir de las secuencias nuevamente identificadas.

Extracción de ARN

Los ARN totales de las células no diferenciadas en proliferación o de las células CESC inducidas en diferenciación en cuerpos embrioides durante 2 días son extraídos con la ayuda del kit RNAEasy mini (Qiagen, ref. 74104). Los ARN totales de los clones son extraídos con la ayuda del kit RNA Easy micro (Qiagen ref. 74004). La cantidad y la calidad de los ARN se miden mediante el BioAnalyser 2100 (Agilent Biotechnologies).

Hibridación líquida sustractiva

Después de una etapa de transcripción inversa, los ADNc se someten a la digestión mediante la enzima de restricción Sau3A, y se constituyen dos poblaciones según el tipo de cebador que se añade mediante ligación. Una se utiliza para agotar los mensajeros presentes en el otro y viceversa. Estos ADNc se utilizan entonces como matriz con unos oligonucleótidos complementarios de una u otra población, y se amplifican en unas condiciones que preservan la representatividad de cada muestra. Después de las amplificaciones, los amplicones se mezclan en un ratio 1:4 para una y otra población. Uno de los dos cebadores contiene un elemento de biotinilación en 5'. Después de la mezcla, los ADN son precipitados en etanol, centrifugados y recogidos en un pequeño volumen de reacción para favorecer la renaturalización que tiene lugar durante 20 horas después de una corta etapa de desnaturalización. Se añaden unas bolas acopladas a la estreptavidina para eliminar los ADN 'drivers' biotinilados y los fragmentos monocatenarios del tester aislados por la adición de la proteína SSB (Single Strand DNA binding protein). Se añade nuevamente ADN y el ciclo de enriquecimiento del ADN monocatenario se repite nuevamente dos veces. Sobre el ADN obtenido al final de estas etapas, se realiza una reacción de PCR con unos oligonucleótidos específicos. Esta reacción permite la amplificación de las dianas expresadas de manera diferencial. Los fragmentos obtenidos son sometidos a una digestión mediante BamHI y se subclonan en el plásmido pUC18. Después de la transformación y de la amplificación, se extraen individualmente unas colonias, el ADN plasmídico es extraído y sometido con el cebador universal M13rev a una reacción de secuencia con el BigDye Terminator Cycle Sequencing kit sobre AB1 Prism 3730 Sequencer.

El conjunto de este procedimiento de clonación y de identificación de los insertos por comparación con los datos de los bancos tales como los datos TIGR (http://www:tigr. org/tigr/Tindex.cgi?species=g_gallus) ha sido realizado por la compañía Genome Express (http://www.genome-express.com/, Meylan).

Cribado de bancos y clonación del gen 1P06

Los ARN totales de las células CESC no diferenciadas en proliferación se utilizan para construir un banco de ADNc en el vector λZAP-II (Stratagene) abierto en EcoRI y desfosforilado mediante un tratamiento con CIAP (Stratagene) y previamente descrito en la solicitud FR00/06009 y Acloque et al., 2001. Se criban 150 ng del ADN de fago mediante PCR genómica utilizando 40 pM de diferentes pares de oligonucleótidos que asocian o bien el oligonucleótido T7, o bien el T3 presente en el vector λZap y los oligonucleótidos pou(1P06)S o pou(1P06)AS derivados del clon 1P06G01. Las condiciones de amplificación son una desnaturalización durante 5 minutos a 96ºC, y después 10 ciclos compuestos por 30s a 95ºC, 30s a 54ºC y 1 minuto a 72ºC seguidos de 20 ciclos de 30s a 96ºC, 30s a 54ºC y 1 minuto a 72ºC. La última etapa de elongación se mantiene durante 7 minutos. El producto de amplificación se somete a una electroforesis sobre gel de agarosa, se purifica mediante el kit Gel Extraction kit (Qiagen), se subclona en el vector pGEM-Teasy (Promega) y se secuencia. El clon pL9-4 contiene un codón de terminación a 40 pb después del final del clon IP06g01 inicial y el clon pL7-2 permite la

obtención de 350 pb corriente arriba de la secuencia.

Se desarrolla una estrategia 5'RACE con la ayuda del kit 5'RACE (Invitrogen). Se retrotranscriben 2 µg de ARN totales durante 1h a 42ºC con 10 pM del cebador 1P06G01 (RAAS2). Una vez purificado el producto, se añade una cola de polyA mediante la acción de la terminal transferasa TdT durante 30 minutos a 37ºC (Invitrogen). Se utiliza 1/5 de la reacción como matriz en una reacción de PCR en presencia de 20 pM de los cebadores 1P06 (RAAS1) y AnchPrimSeq. Los parámetros de la reacción son una desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos seguida de 30 ciclos compuestos por una desnaturalización de 30s a 94ºC, de una hibridación de 30s a 55ºC y de una fase de elongación de 2 minutos a 72ºC, con la excepción de la última reacción que dura 7 minutos. Un segundo conjunto de amplificación se realiza sobre 5 µl del producto diluido 100 veces utilizando los cebadores P06 (pL7-2)AS y PCRprimseq. El producto final se purifica después de la migración por electroforesis y después se subclona en el vector pGEMTeasy. El clon R1-8 resultante contiene 300 pb corriente arriba del clon pL7-2 con un ATG en fase. Resulta de ello un marco de lectura abierto de 888 pb.

RT-PCR

Se retrotranscriben 2 µg de ARN totales durante 1 hora a 42ºC utilizando un cebador oligodT y la enzima Superscript II (Invitrogen). La PCR en tiempo real se realiza sobre el sistema MXP 3000P PCR (Strategene). Se mezclan 2 µl de la mezcla diluida 100x en un volumen final de 25 µl con 12,5 µl del tampón Mix Quantitect SYBRGreen (Qiagen) en presencia de 10 pM de cada cebador (Proligo). Cada muestra se ensaya por triplicado en una placa de 96 pocillos (ref. 410088 Stratagene). Los parámetros son: una etapa de desnaturalización de 15 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos compuestos por una desnaturalización de 30s a 95ºC, de una renaturalización de 30s a 55ºC y de una etapa de elongación de 30s a 72ºC. El nivel de expresión de los genes se calcula mediante el método del ΔΔCt según un procedimiento detallado disponible en la página de Internet: http://www.gene-quantification.info. El nivel de expresión del gen ribosómico RS17 (X07257) se utiliza como referencia interna entre las muestras.

El resultado de las diferentes etapas es la identificación de un primer fragmento de 228 pb que contiene un dominio POU, y después, de una secuencia de 888 pb (SEC ID nº 2) al final de las etapas de cribado del banco y de la estrategia 5'RACE. Esta secuencia codifica para una proteína de 296 aminoácidos (SEC ID nº 1). El dominio POU de la proteína así identificada empieza en el aminoácido nº 90, y está compuesto por 149 aminoácidos.

Comparando las secuencias conocidas e identificadas en los bancos de datos de los genes de diferentes especies que comprenden un dominio POU, se puede representar el posicionamiento filogenético del nuevo gen identificado en el pollo, denominado a continuación 1P06: véanse las figuras 5, 6 y 7.

Gracias al programa NTiVector (InVitrogen), alineando los 888 pares de bases de la fase que codifica el gen 1P06 del pollo G. Gallus con las secuencias de los diferentes genes Pou5f1, en particular las secuencias de los genes de:

1155 pb de la secuencia del tunicado O. dioica (AY613856), los 1134 pb de la secuencia del ratón M. Musculus Pou5f1 (NM 013633), los 1615 pb del bovino B. taurus (NM 174580), los 1080 pb de la secuencia de cerdo S. scrofa (Q9TSV5), los 1080 pb de la secuencia del mono P. troglodytes (Q7YR49), los 1413 pb de la secuencia del ser humano H. sapiens pou5f1 (NM 002701), los 1141 pb de la secuencia de la rata R. rattus (XM 579282), los 3111 pb de la secuencia del axolote A. mexicanum (AY542376), los 1418 pb de la secuencia del pez cebra D. reno (NM 131112), los 570 pb de la secuencia del dominio POU del marsupial T. vulpecula (AY345973), los 2111 pb de la secuencia del xenopo X. laevis Oct60 (M60075), los 2418 pb de la secuencia del xenopo X. Laevis Oct91 (M60077) y los 1998 pb de la secuencia del xenopo X. Laevis Oct25 (M60074),

se puede identificar que 1P06 es un ortólogo de los genes Pou5f1 de las otras especies, puesto que la secuencia identificada es más cercana de la secuencia de estos genes que de las secuencias de los genes parálogos que comprenden un dominio POU (figuras 4, 5, y 6).

La figura 6 muestra que el ADNc 1P06 del pollo presenta respectivamente 51, 46 y 51% de homología con los ortólogos bovino, murino y humano. Se observan unos porcentajes de homología de 35 a 38% con el gen spg (Pou2) del pez cebra y de los diferentes homólogos de xenopo.

La figura 7 muestra los porcentajes de homología que existen entre los diferentes parálogos conocidos e identificados en el pollo, y la secuencia del ADNc 1P06:1P06 presenta respectivamente 14, 60, 62 y 61% de homología con los ADNc de Oct-1, Factor I, Brn3.2 y Oct6 (Barth et al., 1998, Levavasseur et al., 1998).

EJEMPLO 5: ESTUDIO DE LA PROTEÍNA PRODUCTO DEL GEN 1P06

La proteína de fusión GFP-1P06 es una proteína nuclear

El vector comercial pE-GFP-C1 (Clontech) ha sido utilizado para clonar diferentes ADNc en fase con la GFP con el fin de visualizar su localización celular después de la transfección.

Se han introducido en este vector las fases codificantes de los ADNc de 1P06, Nanog, Gcnf, Sox2, Lrh1, Sf1 y Gata4.

Los plásmidos pGFP-1P06, Nanog, Gcnf, etc. han sido introducidos de manera transitoria en las células. Las células CESC son inoculadas sobre la lámina de vidrio estéril en unos pocillos a una densidad media de 15.000 a 20.000 células por cm2. Después de algunas horas de adhesión, se prepara la mezcla de transfección que comprende 1 µg de ADN lineal, 3 µg de Fugene (Roche) en 100 µl de medio sin suero, se deja durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de ser depositada sobre las células que están dispuestas en la incubadora durante una noche en las condiciones normales de proliferación. En el día 2, la mezcla de transfección se retira, las células se lavan con PBS y después se cultivan en las condiciones normales. Después de 48 horas, las células se lavan y después se fijan con una mezcla en PBS de 0,5% de glutaraldehído/1,5% de formaldehído durante 15 minutos a 4ºC. Después del lavado, las células son incubadas con una disolución de Hoescht (10 µM/ml) con el fin de visualizar los núcleos al abrigo de la luz. Las láminas son montadas en presencia de una sustancia que garantiza el paso de los UV (Gel Mont BioMedia) y la observación de la fluorescencia emitida por la proteína de fusión se lleva a cabo con la ayuda de un microscopio de fluorescencia.

El número de células contadas es de n = 49 (GFP-T para control), n = 71 (GFP1P06) y n = 74 (GFP-Gata4). La figura 8 indica el porcentaje de células en las que la localización observada de la fluorescencia de la GFP está en el núcleo (N), en el citoplasma (C) o en el núcleo y en el citoplasma (N+C). Esta figura muestra que la proteína de fusión 1P06-GFP es principalmente nuclear.

Se han obtenido unos resultados similares en otros tipos celulares aviarios tales como los fibroblastos embrionarios de pollo (resultados no mostrados).

Por otra parte, unos análisis mediante la técnica del "band-shift" han permitido demostrar que la proteína 1P06 era capaz de reconocer y de fijarse sobre la secuencia de consenso Oct-4 del ADN.

En conclusión, la proteína 1P06 del pollo es una proteína de localización nuclear, que presenta una actividad de fijación sobre el ADN.

EJEMPLO 6: SOBREEXPRESIÓN DEL GEN 1P06

Con el fin de evaluar el impacto de la sobreexpresión del gen 1P06 en la fisiología de las células CESC, las células transfectadas con las construcciones pGFP-1P06 y otras proteínas de fusión tales como GFP-SOX2, GFP-NANOG, GFP-GATA4, han sido analizadas desde un punto de vista morfológico.

La figura 9 presenta los resultados obtenidos. El número total de células contadas es de n = 51 (GFP-T control), n = 93 (G FP-1P06) y n = 77 (GFP-Gata4).

La mayoría de las células transfectadas no parecen presentar ninguna modificación mayor en su morfología. Se observa una excepción con la construcción pGFP-1P06, para la cual se observa una proporción elevada de forma nuclear alterada, en particular con unas formas condensadas del núcleo, en aproximadamente 20% de los casos. El porcentaje de células que presentan una cromatina desestructurada es bastante más importante en estas células transfectadas con la construcción GFP-1P06. Esto podría indicar un fenómeno de apoptosis. Siendo el tiempo de la transfección relativamente corto (<72h), se puede prever no tener la posibilidad de poder identificar variaciones morfológicas y fenotípicas mayores en estas condiciones.

La hipótesis del solicitante es que la sobreexpresión de la construcción GFP-1P06 es tóxica para las células CESC. Se ha realizado una construcción GFP-1P06-ERT2 con el fin de volver condicional la localización nuclear de la proteína de fusión. Si la localización nuclear de la construcción de control GFP-ERT2 parece dependiente de la presencia de 4-hidroxi-tamoxifeno en el medio de cultivo, tal como se espera, no ha sido posible detectar un cambio principal de localización de la proteína de fusión GFP-1P06ERT2 en presencia o en ausencia de 4-hidroxi-tamoxifeno. La presencia de la GFP sigue siendo mayoritariamente nuclear, sean cuales sean las condiciones. Se debe suponer que la señal de localización nuclear del producto 1P06 es demasiado fuerte para ser equilibrada mediante la única presencia de la molécula protectora que se une a la parte ERT2 en ausencia de 4-hidroxi-tamoxifeno. Se ha realizado la misma observación con el

5 mutante 1P06mut, cuya mutación afecta a la señal de localización putativa nls, para la cual no se consigue obtener una señalización citoplásmica principal (Pan et al., 2004).

EJEMPLO DE REFERENCIA 7: CLONACIÓN DEL PROMOTOR DEL GEN NANOG

10 La clonación del promotor del gen Nanog permite demostrar la presencia de sitios específicos de fijación de factores de transcripción susceptibles de regular la expresión de estos genes en las células cepas embrionarias y germinales aviarias.

15 En los experimentos de transfección, se han obtenido los resultados siguientes con las construcciones del promotor de Nanog: este promotor es activo exclusivamente en las células proliferativas, no diferenciadas. De esta manera, unas transfecciones transitorias en las células CESC no diferenciadas e inducidas en diferenciación permiten demostrar que sólo las células no diferenciadas son capaces de transactivar este promotor. De esta

20 manera, unas células transfectadas con la construcción p2000Nanog-GFP muestran una expresión de la GFP en 42% de las células y sólo en 7% de las células cuando éstas son tratadas durante 48 horas por 10-7M de ácido retinoico.

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Claims

1.: Procedimiento de preparación de células aviarias diferenciadas a partir de células cepas aviarias cultivadas en un medio de cultivo apropiado, caracterizado porque comprende una etapa de inducción de la diferenciación de las células cepas por inhibición de la expresión o de la actividad del gen 1P06 de la SEC ID nº 1 expresado en dichas células cepas.

2.: Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la inhibición de la expresión o de la actividad del gen se realiza por medio de por lo menos un ARN interferente, seleccionado preferentemente de entre un ARN antisentido, un ARN bicatenario, un "small interfering" ARN, un "small hairpin" ARN o un ARN ribosómico.

3.: Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente presenta la secuencia SEC ID nº 3.

4.: Procedimiento según una de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente está integrada en un vector de expresión, bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante.

5.: Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor es un promotor inducible.

6.: Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica para el ARN interferente está integrado en una célula hospedante.

7.: Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las células cepas sufren por lo menos una etapa de activación o de inhibición de genes específicos, con el objetivo de obtener una diferenciación específica de dichas células.

8.: Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las células cepas se cultivan en unas condiciones apropiadas para obtener una diferenciación específica de dichas células.

9.: Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende una etapa de selección y de destrucción de las células no inducidas en diferenciación.

10.: Molécula de ácido nucleico que codifica para un ARN interferente tal como el definido según la reivindicación 3.

11.: Vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 10, dispuesta bajo el control de un promotor que permite la expresión de dicho ARN interferente en una célula hospedante, preferentemente bajo el control de un promotor inducible.

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12. Células cepas aviarias transformadas con un vector de expresión según la reivindicación 11.

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