ES2350698T3 - Procedimiento para la preparación de partículas a partir de una emulsión en co2 supercrítico o líquido. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de partículas que comprende las etapas que consisten en: i) preparar una emulsión que contiene: - como fase continua, CO2 líquido o supercrítico, y - como fase discontinua, que es un líquido inmiscible dispersado en dicha fase continua en forma de gotitas, un solvente que contiene una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión divalente catiónico o una mezcla de los mismos, siendo dicha sustancia soluble en dicho solvente que forma dicho un líquido inmiscible dispersado en dicha fase de CO2 e insoluble en dicha fase continua, ii) solidificar dicha fase discontinua, formando así las partículas.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de partículas, particularmente partículas que encapsulan una sustancia activa.

Se dan a conocer asimismo en la presente memoria partículas que pueden obtenerse mediante este procedimiento, su dispersión, y su utilización como carga o como vehículo para productos farmacéuticos, productos cosméticos, composiciones de diagnóstico o productos alimenticios tratados.

La encapsulación de sustancias en micro-o nanopartículas ha recibido un interés en aumento durante los últimos años para varias aplicaciones en diversos ámbitos como la medicina, la química, la cosmética o la nutrición. Por ejemplo, en el campo farmacéutico, la incorporación de las moléculas farmacológicamente activas en microesferas permite controlar su suministro temporal y espacial en el cuerpo humano y permite su protección contra la degradación.

Los procedimientos de encapsulación utilizados en la industria farmacéutica deben considerar varios requisitos tales como la estabilidad de las moléculas activas, el campo y la eficacia de la encapsulación de fármacos, la reproducibilidad de la calidad de las microesferas y del perfil de liberación del fármaco, y el nivel residual del disolvente orgánico en las micropartículas, que debería ser inferior al valor límite impuesto por la farmacopea.

Sin embargo, las técnicas comunes utilizadas por la industria farmacéutica para encapsular las moléculas activas, como la extracción de solvente-emulsión, la separación de fases polimérica, los procedimientos de molienda y secado por pulverización, no resultan siempre apropiados para formular las partículas sin apartarse de estos requisitos (Arshady et al, 1991; Benoit et al, 1996). Utilizan habitualmente condiciones de formulación rigurosas, que pueden provocar cambios físicos o químicos en los principios activos, especialmente si se trata de una proteína, y conducen a cantidades del solvente residual que resultan de difícil disminución bajo los valores autorizados anteriores. De hecho, los productos químicos orgánicos volátiles (VOC), utilizados habitualmente en estos procedimientos, están sometidos a unas regulaciones internacionales muy estrictas (ICH Harmonized Tripartite Guideline for Residual Solvents, 1997), debido a su toxicidad para los humanos y el medio ambiente.

Por lo tanto, requiriéndose descubrir nuevos procedimientos de encapsulación, que ofrezcan un campo de encapsulación satisfactorio, no dañar la estructura de los principios activos y no utilizar ningún solvente orgánico, algunas investigaciones se han orientado a procedimientos alternativos, tales como trabajar con dióxido de trabajo comprimido en lugar de con solventes orgánicos. De hecho, el dióxido de carbono no es tóxico, no es inflamable, es abundante, reciclable, no dañino para el medio ambiente, y presenta una poder de solvente ajustable cuando se aproxima a su punto crítico (Tc = 31,1ºC y Pc = 73,8 bares). Debido a sus propiedades, no es regulado como un VOC, ni limitado en las aplicaciones alimentarias o farmacéuticas. Todas estas ventajas convierten al CO2 comprimido en un solvente atractivo que ofrece una alternativa “verde” a los solventes orgánicos tradicionales ya utilizados en muchos procedimientos tales como la extracción (Saldana et al, 2002), separación (Mendes et al, 2003; Ozcan et al, 2004), fraccionamiento, limpieza (Campbell et al, 2001), medio de reacción (Jacobson et al, 1999; Kane et al, 2000) o fase para emulsiones-microemulsiones (Psathas et al, 2002; Eastoe et al, 1997; Hoefling et al, 1991; Lee et al, 1999).

Por lo tanto, las investigaciones sobre las propiedades y las aplicaciones posibles del CO2 comprimido han avanzado rápidamente durante los últimos diez años. A este respecto, se ha investigado mucho sobre los sistemas binarios dióxido de carbono-agua (A-C) (Eastoe et al, 1997, Bartscherer et al, 1995; Harrison et al, 1994; da Rocha et al, 2003; Johnston et al, 2001; Psathas et al, 2000; Ryoo et al, 2003; Zielinski et al, 2004), ya que presentan la ventaja que consiste en actuar como solventes “universales”, debido a su composición binaria que permite la disolución de tanto sustancias apolares de bajo peso molecular como las polares.

De entre los procedimientos para la preparación de partículas que utilizan fluidos presurizados o supercríticos, debe repararse en (i) la técnica que utiliza los fluidos supercríticos (en adelante denominados SF) como un solvente para solubilizar las moléculas portadoras y/o activas, tal como la técnica de la expansión rápida de disolución supercrítica (RESS), (ii) las técnicas que utilizan los SF como un antisolvente, en las que es puesto en contacto con una disolución orgánica para provocar la precipitación de las moléculas activas y/o el portador, tal como las técnicas relacionadas de gas antisolvente (GAS) y de antisolvente supercrítico (SAS), y (iii) las técnicas que utilizan los SF como un potenciador de pulverización tales como las técnicas denominadas partículas de soluciones saturadas de gas (PGSS), licuefacción de polímeros que utiliza la solvatación supercrítica (PLUSS), atomización asistida por supercríticos (SAA), despresurización de una disolución orgánica líquida expandida (DELOS), nebulización asistida por CO2 y secado de burbuja (CAN-BD).

Por lo tanto, los procedimientos de RESS pueden ser utilizados cuando la sustancia de interés es muy soluble en la fase supercrítica. La sustancia está disuelta en la fase supercrítica y la disolución formada es expandida rápidamente despresurizando el sistema a través de una boquilla calentada, de manera que la sustancia precipita como partículas muy pequeñas.

Los procedimientos de GAS y SAS pueden ser utilizados para la cristalización de sustancias que no son o son únicamente ligeramente solubles en el fluido supercrítico. Para los procedimientos de GAS, la sustancia de interés está disuelta en el solvente orgánico. Cuando el fluido supercrítico, que presenta una baja capacidad de solvente con respecto al (a los) soluto(s) pero es completamente miscible con el solvente orgánico, es añadido a una cantidad de la disolución orgánica, el (los) soluto(s) precipita(n) en partículas debido al solvente expandido por CO2 que presenta una fuerza de solvente inferior que el solvente puro.

Para los procedimientos de SAS, la disolución orgánica es pulverizada a través de una boquilla, produciendo gotitas de solvente pequeñas, en un recipiente lleno de CO2. A continuación, el CO2 expande el solvente de las gotitas, provocando la formación de partículas. Se han realizado algunas adaptaciones de los procedimientos de SAS tales como ASES, PCA y el procedimiento de dispersión de disolución mejorada mediante fluido supercrítico (SEDS).

La micronización de las proteínas y las micropartículas de polímeros ha sido preparada según estos procedimientos.

El principio de los procedimientos que utilizan CO2 como mejorador de la pulverización consiste en la disolución del CO2 supercrítico (denominado en adelante SCCO2) en sustancia(s) fundida(s) o en una solución/suspensión de sustancias y despresurizar esta mezcla a través de una boquilla, provocando la formación de partículas sólidas o de gotitas líquidas. Estos procedimientos permiten la formación de las partículas a partir de polímeros de fusión que no resultan solubles en SCCO2, pero que absorben una gran cantidad de CO2 (1 a 30% en peso) (Tomasko D.L. et al, 2003).

Sin embargo, estos procedimientos de tratamiento de materiales que utilizan fluidos supercríticos difícilmente posibilitan el control de la morfología y del tamaño de las partículas obtenidas. Finalmente, un gran número de estos procedimientos utilizan además cosolventes orgánicos que pueden provocar problemas de seguridad y medioambientales.

El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para preparar partículas que presentan un tamaño y una morfología controlados sin utilizar un solvente orgánico tóxico.

El objetivo de la presente invención es definido en la presente memoria mediante las reivindicaciones 1 a 7.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de partículas que comprende las etapas que consisten en:

i) preparar una emulsión que contiene:

-

como una fase continua, CO2 líquido o supercrítico, y

-

como una fase discontinua, que es un líquido inmiscible dispersado en dicha fase continua en forma de gotitas un solvente que contiene una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión divalente catiónico o una mezcla de los mismos;

siendo dicha sustancia soluble en dicho solvente que forma dicho un líquido inmiscible dispersado en dicha fase de CO2 e insoluble en dicha fase continua;

ii) solidificar dicha fase discontinua, formando así las partículas.

En el contexto de la presente invención se ha demostrado que resulta posible obtener partículas de tamaño uniforme y esféricas emulsionando una disolución de una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión divalente catiónico o una mezcla de los mismos en CO2 supercrítico o líquido, antes que se inicie el fenómeno de solidificación. En este procedimiento, las gotitas de emulsión actúan como patrones para la obtención de las partículas, guiando el procedimiento de solidificación y limitando el alcance de la solidificación.

Ventajosamente, el procedimiento de la invención permite la reducción de la agregación de las partículas.

Según otra ventaja, las partículas pueden producirse mediante este procedimiento con alto rendimiento, y sin utilizar VOC o procedimientos de temperatura elevada.

Este procedimiento resulta particularmente ventajoso para preparar partículas biodegradables y biocompatibles que contienen una sustancia activa, que pueden ser únicamente ligeramente reconocidas mediante el sistema proteico del complemento y mediante los macrófagos del sistema fagocitario mononuclear (MPS).

Partículas

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “partículas” hace referencia a una unidad física agregada de material sólido.

Las partículas dadas a conocer en la presente memoria pueden ser micro-o nanopartículas.

Las micropartículas hacen referencia a partículas que presentan un diámetro mediano d50 comprendido entre 500 µmy1 µm y más preferentemente entre 100 µmy1 µm, y todavía más preferentemente entre 10 µmy1 µm.

Las nanopartículas hacen referencia a partículas que presentan un diámetro mediano d50 inferior a 1 µm y particularmente comprendido entre 0,1 µm y 0,01 µm.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “diámetro mediano d50” hace referencia al diámetro de partícula de manera que el 50% del volumen o el número de la población de partículas presentan un diámetro menor.

El d50 de las partículas preparadas según el procedimiento de la invención a partir de una emulsión que contiene iones catiónicos divalentes es generalmente expresado mediante el número de partículas.

El d50 de las otras partículas es generalmente expresado en volumen.

Las partículas pueden ser asimismo definidas por su diámetro medio. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “diámetro medio” hace referencia a la suma de las mediciones de tamaño de la totalidad de las partículas mensurables medidas divididas por el número total de partículas medidas.

Los diámetros medio y mediano d50 son determinados en virtud de una medición del tamaño de partícula realizado en las suspensiones según el procedimiento sobre la base de “la difusión lumínica” o de la “variación de la impedancia entre dos electrodos”.

Más específicamente, las micropartículas o las nanopartículas pueden ser microesferas o microcápsulas, nanoesferas o nanocápsulas respectivamente, que contienen una sustancia activa.

Emulsión

Tal como se utilizan en la presente memoria, “microesferas” o “nanoesferas” son sistemas matriciales en los que la sustancia activa es dispersada homogéneamente.

Las “microcápsulas” o las “nanocápsulas” están compuestas de un núcleo de material activo revestido con una capa de polímero.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “emulsión” hace referencia a un sistema heterogéneo de un líquido inmiscible (fase discontinua) dispersado en otro fluido o líquido en forma de gotitas. El tamaño de las gotitas de la emulsión puede estar comprendido entre 10 nm y varios µm, por ejemplo 500 µm. Por lo tanto, el término “emulsión” en el contexto de la presente invención comprende particularmente las miniemulsiones, las nanoemulsiones, las macroemulsiones y las microemulsiones.

En el contexto de la presente invención, la emulsión puede ser particularmente una emulsión líquido-líquido, o una emulsión de fluido supercrítico-líquido, que significa que el CO2 puede estar en condiciones supercríticas o en estado líquido.

Es conocido que el CO2 está en condiciones supercríticas (SC CO2) si la temperatura es superior a 31ºC y su presión superior a 73,8 x 105 Pa. El SC CO2 presenta algunas propiedades de las fases líquida y de gas. Por lo tanto, por encima del punto crítico (Tc, Pc), es decir, entre Tc – 1,2Tc y Pc – 2Pc, las propiedades de fluido, como la densidad (ρ, kg/m3), varían según un continuo desde como de líquido a como de gas. A temperatura constante, un aumento en la presión provoca un aumento en la densidad, mientras que para una presión constante, un aumento de la temperatura conduce a una disminución de la densidad, que permanece sin embargo próxima a la densidad del líquido. Consecuentemente, la densidad y por lo tanto el poder de solvente del fluido supercrítico son ajustables en un pequeño intervalo de presión y temperatura. La viscosidad (η, Pa.s) varía como la densidad, pero es menos dependiente de la temperatura a presión constante y es de 10 a 100 veces inferior a la densidad del líquido.

La tensión interfacial (γ mN/m) entre CO2, particularmente SC CO2, y la fase discontinua es relativamente baja, comparada con las interfaces clásicas (aceite/agua) y puede ser ajustada mediante la densidad del fluido, es decir ajustando las condiciones de presión y de temperatura. A mayor densidad, más interacciones desarrolla el fluido con la segunda sustancia, conduciendo a una disminución de la tensión interfacial γ.

Por lo tanto, la emulsión puede prepararse poniendo en contacto un solvente que contiene una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión divalente catiónico o una mezcla de los mismos, soluble en dicho solvente, con CO2, en condiciones de temperatura y/o presión que permiten la disminución de la tensión interfacial y por lo tanto obtener una emulsión de la solución líquida en la fase de CO2.

La emulsión puede prepararse mediante cualesquier procedimientos convencionales que pueden comprender particularmente rotura, homogeneización a alta presión, mezclado estático, sonicación, inversión de fase inducida por temperatura y/o presión.

Preferentemente, el solvente que contiene dicha sustancia es puesto en contacto con CO2 bajo agitación. La agitación puede ser realizada con una paleta de movimiento, tal como una paleta de movimiento de hélice o de ancla. La tasa de agitación puede estar comprendida en un amplio intervalo y está generalmente comprendida entre 200 y 2.000 rpm, particularmente entre 500 y 1.500 rpm.

Fase continua de la emulsión

Preferentemente, la emulsión preparada en la etapa i) contiene una fase continua, CO2 supercrítico.

La presión del CO2 supercrítico pueden estar comprendida particularmente entre 80 y 350.105 Pa, preferentemente entre 200 y 250.105 Pa.

La temperatura del CO2 supercrítico puede estar comprendida entre 32 y 50ºC, preferentemente entre 35ºC y 45ºC.

Ventajosamente, esta temperatura no provoca la desnaturalización de los biopolímeros o de sus derivados tales como las proteínas que forman las partículas dadas a conocer en la presente memoria.

Fase discontinua de la emulsión

Sustancia contenida en la fase discontinua

La sustancia contenida en la fase discontinua es soluble en el solvente que forma la fase discontinua e insoluble en CO2 en las condiciones de temperatura y presión del procedimiento según la invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “la sustancia es soluble en el solvente e insoluble en la fase de CO2” hace referencia a una sustancia que es mucho más soluble en el solvente que en la fase de CO2. Esto puede evaluarse mediante el coeficiente de reparto (Kp), es decir, la relación entre la concentración de la sustancia en el solvente y la concentración de la sustancia en el CO2. Típicamente, la sustancia presenta un Kp superior a dicho 0,8. Por lo tanto, el término “insoluble” no debe interpretarse de manera estricta y puede hacer referencia a sustancias que son ligeramente solubles en la fase de CO2.

El polímero puede ser seleccionado de entre los biopolímeros o sus derivados o los polímeros sintéticos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “biopolímero” debe entenderse que hace referencia a una molécula que se encuentra en la naturaleza, que comprende más de 30 unidades de monómero, que comprende típicamente hasta un centenar de unidades de monómero individuales. Las unidades de monómero pueden ser particularmente azúcares, aminoácidos y nucleótidos.

En el contexto de la presente invención, el término “biopolímero” comprende asimismo los biooligómeros que comprenden 30 o menos unidades de monómero.

Como ejemplos de biopolímeros, deben mencionarse los péptidos, las proteínas (globulares o fibrosas) tales como el colágeno (monómeros aminoácidos), los polisacáridos tales como la celulosa (monómeros de azúcar), el ácido nucleico tal como el ARN y el ADN (monómeros nucleótidos). Otros ejemplos de biopolímeros son la lignina y el caucho natural.

Los biopolímeros pueden contener muchos monómeros diferentes tales como aminoácidos, o estar constituidos por uno o más de los monómeros repetidos tantas veces, por ejemplo el ácido hialurónico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “derivado de un biopolímero”

o “polímero modificado” hace referencia a los biopolímeros que han experimentado un cambio en su esqueleto, tal como, por ejemplo, la introducción de grupos funcionales reactivos (tales como los grupos carboxi o los grupos éster sulfúricos) o el injerto de entidades químicas (moléculas, compuestos fluorescentes, enlaces alifáticos, cadenas de PEG, por ejemplo) o despolimerización mediante procedimientos enzimáticos, químicos o físicos.

Los polisacáridos que resultan particularmente apropiados en la invención son o proceden de la D-glucosa, la D-galactosa, la D-manosa, la D-fructosa o la fucosa.

Los ejemplos de polisacáridos o sus derivados que comprenden una o más unidades de monómero de D-glucosa son particularmente:

-la celulosa o sus derivados tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa o metilhidroxipropilcelulosa,

-el almidón o sus derivados tales como los carboximetil almidones,

-el dextrano,

-la ciclodextrina.

Los ejemplos de polisacáridos o sus derivados que comprenden una o más unidades de monómero de D-fructosa son particularmente galactosano, manano, fructosano.

Un ejemplo de los polisacáridos o sus derivados que comprenden una o más fucosas como unidades de monómero es el fucano.

La mayoría de estos polisacáridos comprende los elementos carbono, oxígeno e hidrógeno.

Los polisacáridos según la invención pueden asimismo comprender el azufre y/o el nitrógeno. Pueden por lo tanto proceder de la glicoproteína o de glicolípidos. Asimismo, el ácido hialurónico (compuesto de unidades de ácido glucurónico y N-acetilglucosamida), ácido (poli)siálico, conocido asimismo como ácido colomínico o ácido (poli)N-acetilneuramínico, quitosán, quitina, heparina u orosomucoide comprenden nitrógeno, mientras que el agar-agar, un polisacárido extraído de las algas marinas, comprende azufre en forma de sulfato de hidrógeno (>CH-O-SO3H). El ácido sulfúrico de condroitina y la heparina comprenden azufre y nitrógeno.

Otros ejemplos de polisacáridos o sus derivados son particularmente:

-los alginatos extraídos de algas marrones,

-los carragenanos de tipo lambda, iota o kappa extraídos de las algas rojas,

-las pectinas extraídas de los limones, las manzanas o la remolacha,

-los pectatos que resultan de la desmetilación de las pectinas,

-la guar o la guar modificada, tal como la carboximetilguar,

-los xantanos.

Deben mencionarse, a título ilustrativo de los polisacáridos que resultan más particularmente apropiados en la invención, las polidextrosas, tal como dextrano, quitosano, pululano, almidón, amilosa, amilopectina, ciclodextrina, ácido hialurónico, heparina, celulosa, pectina, alginato, curdlano, fucano, succinoglicano, quitina, xilano, xantano, arabinano, carragenano, ácido (poli)glucurónico, ácido (poli)N-acetil-neuramínico, ácido (poli)manurónico y sus derivados (tales como, por ejemplo, sulfato de dextrano, ésteres de amilosa, acetato de celulosa, sulfato de pentosano, por ejemplo).

Los ejemplos de proteínas o de sus derivados comprenden particularmente albúminas, globulinas, gelatina, caseína, tubulina, actina, colágeno, queratina, proteínas vegetales (gliadina, gluteninas, legumina, vicilina, convicilina, albúminas).

Los biopolímeros son ventajosamente biodegradables y pueden resultar útiles para las utilizaciones terapéuticas.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “polímero sintético” hace referencia a una molécula grande que comprende típicamente hasta un centenar de unidades de monómero individuales que pueden ser idénticas o diferentes. Por lo tanto, el término “polímero sintético” comprende homopolímeros o copolímeros.

Preferentemente, el polímero sintético es biodegradable, que, según la invención, hace referencia a un polímero en el que la degradación puede resultar de la acción de las reacciones químicas naturales como la hidrólisis o con la ayuda de las células eucariotas o procariotas.

Según otra forma de realización preferida, el polímero es biocompatible.

Como se utiliza en la presente memoria, “polímero biocompatible” hace referencia a los polímeros que resultan, dentro del alcance del criterio médico estricto, apropiados para el contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivos, u otras complicaciones problemáticas acorde con una proporción de riesgo/beneficio razonable.

Los ejemplos de polímeros sintéticos comprenden particularmente:

-los polímeros acrílicos o sus derivados tales como el ácido poliacrílico o polimetacrílico, los poliésteres del ácido acrílico o metacrílico (tales como poli(metil

metacrilato) (PMMA)),

-poliacrilamida,

-polialquilcianoacrilatos,

-polímeros de vinilo y sus derivados tales como polímeros de ésteres de vinilo (por

ejemplo, poli(acetato de vinilo) o copolímeros de etileno y de acetato de vinilo), alcoholes polivinílicos,

-poliolefinas tales como polietileno, polipropileno,

-poliamidas,

-poliamidas de ésteres,

-polialquilenos de ésteres,

-poli(alfa hidroxi ácido)(s),

-poli(beta hidroxi ácido)(s),

-ácido poliláctico y sus copolímeros tales como los homopolímeros y los copolímeros de los ácidos láctico y glicólico,

-polianhídridos,

-polidimetilsiloxano,

-poli(ε-caprolactona) y sus derivados, copolímeros de poli(β-hidroxibutirato), poli(hidroxivalerato) y (β-hidroxibutirato-hidroxivalerato), o poli(ácido málico),

-polímeros en bloque anfifílicos de tipo poli(ácido láctico)-poli(óxido de etileno),

-poliésteres saturados (poli(etilén tereftalato)),

-polianhídridos, poliortoésteres y polifosfacenos.

Estos polímeros sintéticos, biopolímeros o sus derivados que son seleccionados con el fin de resultar de formación matricial y/o agentes de revestimiento eficaces, pueden mostrar una masa molar superior a 103 g/mol, preferentemente superior a 2 x 103 g/mol y más particularmente de entre 2 x 103 y 2 x 106 g/mol. Preferentemente, la concentración del polímero es inferior a la concentración de saturación del solvente por el polímero.

Solvente de la fase discontinua

Un solvente apropiado según la invención es un solvente que, bajo determinadas condiciones de presión y temperatura, es químicamente inerte con respecto al polímero, el ión catiónico divalente o la sustancia activa, y presenta propiedades físicas y químicas que posibilitan la obtención de una emulsión de solvente en CO2 líquido y/o supercrítico.

El solvente es preferentemente un solvente polar que puede solubilizar las sustancias, que comprenden las sustancias activas, presentes en la fase discontinua.

Puede seleccionarse de entre solventes próticos o apróticos, solventes orgánicos o agua.

El solvente es preferentemente biocompatible.

Tal como se utiliza en la presente memoria “biocompatible” hace referencia a los solventes que son, dentro del alcance del criterio médico estricto, apropiados para el contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otras complicaciones problemáticas acordes con una proporción de beneficio/riesgo razonable.

Los ejemplos de solventes biocompatibles apropiados son particularmente agua, tetraglicol, polietilenglicol de bajo peso molecular, propilenglicol, resultando el agua y el tetraglicol particularmente preferidos.

El tetraglicol es asimismo denominado glicofurol o tetrahidrofurfurilpolietilenglicol, tetrahidrofurfuril alcohol polietilenglicol éter (CAS: 9004-76-6).

El peso del solvente puede representar 0,02% a 20% del peso del fluido líquido o supercrítico.

Sustancia activa

Las partículas obtenidas pueden presentar actividad biológica, debido a la naturaleza del polímero a partir del que son formadas o debido a que incorporan una sustancia activa.

En una forma de realización preferida, la fase discontinua comprende además una

o más sustancias activas.

La sustancia activa puede ser soluble o insoluble en el solvente de la fase discontinua. Preferentemente, la sustancia activa es añadida en la solución de la fase discontinua antes de ponerla en contacto con la fase de CO2.

Como ejemplos de las sustancias activas que pueden estar contenidas en las micropartículas pueden particularmente mencionarse de manera no limitativa sustancias activas farmacéuticas, cosméticas, diagnósticas, veterinarias, de tratamiento alimentario, fitosanitarias.

Otros ejemplos de sustancias activas apropiadas según la invención son particularmente los aditivos para plásticos, cauchos sintéticos, resinas termoestables, tinta de dispersión y látex y textiles.

Los ejemplos de productos farmacéuticos comprenden particularmente antipiréticos, aspirina y derivados, antibióticos, antiinflamatorios, antiulcerativos, antihipertensivos, neurolépticos, antidepresivos, analgésicos, antifúngicos, antivirales, agentes antitumorales, inmunomoduladores, antiparkinsonianos, nucleótidos, oligonucleótidos, péptidos, proteínas, radionucleidos.

Los ejemplos de sustancias activas cosméticas comprenden particularmente autobronceadores o agentes anti-UV.

Los ejemplos de los productos alimenticios tratados son particularmente las vitaminas.

Los ejemplos de productos veterinarios comprenden particularmente las hormonas, las vacunas, los antiinflamatorios, los antibióticos.

Los ejemplos de la sustancias activas fitosanitarias son particularmente herbicidas, bactericidas, fungicidas, insecticidas, acaricidas o reguladores del crecimiento.

Resulta asimismo posible incorporar, en las partículas, compuestos con un fin de diagnóstico. Pueden ser así sustancias que emiten rayos electromagnéticos o sustancias detectables por rayos X, ultrasonidos o resonancia magnética nuclear. Las partículas pueden así comprender partículas de óxido de hierro, tales como la magnetita o la maghemita, los quelatos de gadolinio, los materiales radioopacos, tales como, por ejemplo, el aire o el bario, o compuestos fluorescentes, tales como la rodamina o el rojo del nilo, o emisores gamma, por ejemplo el indio o el tecnetio.

Surfactantes

Las gotitas de emulsión según el procedimiento de la invención pueden ser estabilizadas mediante la utilización de moléculas surfactantes. Los surfactantes pueden de hecho reducir la tensión interfacial (γ) y consecuentemente la energía libre interfacial (GS).

Preferentemente, el surfactante presenta una presión de punto de enturbiamiento y una temperatura de punto de enturbiamiento que son respectivamente inferior a las condiciones de presión y superior a las condiciones de temperatura utilizadas en el procedimiento según la invención.

El surfactante puede estar solubilizado en la fase de CO2 antes de poner el líquido (es decir, el solvente que contiene una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión catiónico divalente o una mezcla de los mismos) destinado a formar la fase discontinua en contacto con el mismo.

Como un ejemplo de surfactantes apropiados, debe mencionarse el grupo que presenta fluorocarbonos, polidimetilsiloxanos, siloxanos y policarbonatos.

Preferentemente, el surfactante de fluorocarbono es un compuesto de fórmula (I)

imagen1

fórmula (I)

en la que

Rf es un poli-o perfluoro alquilo (C4-C12),

n es 1 a 15.

Dichos surfactantes han sido dados a conocer en Riess et al (patente US nº 5.344.930) y Krafft et al, 1990.

Ventajosamente, las gotitas acuosas una vez formadas en la fase de CO2 son a continuación protegidas contra la coalescencia debido a la gran elasticidad de la capa interfacial formada por el surfactante (Tewes et al, 2004).

Preferentemente, el surfactante es un compuesto de fórmula (I) en la que Rf es un grupo perfluoroalquilo C8 y n es 5 (denominado 5-(F-octil)pentil][2’-N,N,Ntrimetilaminoetil]fosfato) o F8C5PC, u 11 (denominado 11-(F-octil)undecil][2’-N,N,Ntrimetilaminoetil]fosfato) o F8C11PC.

Formación de partículas mediante una emulsión de agua en dióxido de carbono

Según una forma de realización particularmente preferida el solvente de la fase discontinua es el agua.

El agua comprende preferentemente además un tampón acuoso, que significa que las sales presentan una capacidad de tampón.

Los ejemplos de tampón apropiado comprenden particularmente el tampón TRIS (Tris(Hidroximetil) aminometano), el tampón de fosfato o bicarbonato, el tampón de glicina/NaCl. La concentración de estos tampones es tal que el pH en las gotitas acuosas de la emulsión puede ser mantenido en el intervalo de 7 a 10, durante el procedimiento de solidificación. Típicamente, la concentración puede estar comprendida entre 0,1 mol/l y 1 mol/l.

En un aspecto preferido de la invención, el polímero es un biopolímero o un derivado del mismo, particularmente una proteína o un polisacárido, por ejemplo el ácido hialurónico o la ovalbúmina.

En una forma de realización, la solidificación de la fase discontinua en la etapa ii) comprende la adición de un agente de reticulación.

El agente de reticulación es preferentemente soluble en el CO2 líquido o supercrítico.

Los ejemplos de agentes de reticulación apropiados son particularmente gliceraldehído, formaldehído, glutaraldehído, cloruro de teleftaloil, epicloridrina, genipina, enzima como la transglutaminasa, tirosinasa, diamina oxidasa, peroxidasa.

El procedimiento de solidificación parece resultar de una reacción interfacial entre el agente de reticulación, que está presente en la fase continua, y el biopolímero que está presente en la fase discontinua.

Según otra forma de realización preferida, la fase discontinua comprende además un ión catiónico divalente M2+ .

Como ejemplos de cationes divalentes, deben mencionarse Ca2+, Fe2+, Mg2+, Mn2+ , Zn2+, Li2+, Al2+, Ni2+, Cd2+, Ti2+, Co2+, Ba2+, Cs2+, Cu2+, de entre los cuales el Ca2+ resulta particularmente preferido.

Como fuente de ión catiónico divalente, pueden ser utilizados los hidróxidos metálicos. A título de ejemplo, puede ser utilizado el hidróxido de calcio (CaOH2) como fuente de Ca2+ .

La concentración de los iones catiónicos divalentes es preferentemente próxima a la concentración de saturación de M2+ en el solvente al pH de la fase discontinua, por lo menos en el inicio del procedimiento de solidificación. Típicamente, la concentración de M2+ puede estar comprendida entre 0,5 y 5% en peso del peso total de la fase discontinua.

Preferentemente, el pH en las gotitas de la fase discontinua permite la formación de iones CO32-de la solvatación de las moléculas de CO2 en la fase discontinua. Preferentemente, el pH está comprendido entre 7 y 10 y más preferentemente entre 8 y 9.

Según un posible mecanismo, se ha demostrado en el contexto de la presente invención que la producción de partículas de MCO3 es provocada por dos fenómenos competitivos: el emulsionamiento de la solución acuosa mediante la fase de CO2 y la formación cristales sólidos de MCO3.

El fenómeno de cristalización de MCO3 es realizado en varias etapas.

En primer lugar, la difusión de las moléculas de CO2 en las soluciones tamponadas alcalinas es acompañada por la formación de varias especies iónicas debido a su combinación con los iones HO-y, si el pH disminuye, con las moléculas de H2O, como se define mediante las ecuaciones siguientes:

imagen2

imagen3

La proporción de las especies diferentes presentes en la solución depende del pH.

-

En la región alcalina, las especies de CO32-y HCO3 predominan.

formación de MCO3.

Por ejemplo, las sales de CaCO3 que presentan una solubilidad acuosa muy baja (~0,0013 g en 100 g de agua) cristalizan en varias formas (calcita, aragonita, vaterita, hidratos...) dependiendo de las condiciones iniciales (Kitamura et al; 2002; Hostomsky, 1991; Tai, 1993; Tai, 1995; Kitamura, 2002).

El pH puede asimismo influir en la formación de las partículas de MCO3.

De hecho, los iones CO32-, que contribuyen en el procedimiento de precipitación, están únicamente presentes a partir de un pH superior a 8 (Rigopoulos et al, 2003).

Esto implica que, tras la incidencia de una disminución de pH en el procedimiento, inducida por la combinación de CO2 con HO-o H2O ([Ec.] 1-3), las moléculas de CO32-ya no están presentes, y la finalización de la precipitación de MCO3. Además, el pH ácido provoca la disolución de MCO3.

Por otra parte, el pH de la solución controla asimismo la concentración de M2+ debido a la reacción entre M2+ y HO-, que provoca la formación de M(OH)2 sólido cuando el producto iónico (IP) es superior a la constante del producto de solubilidad (Ks) de la reacción, como se ha descrito mediante la ecuación 5. Por lo tanto, la formación de M(OH)2 es potenciada cuando el pH aumenta, conduciendo a una disminución en la concentración de M2+ .

imagen4

imagen5

Por lo tanto, un pH demasiado elevado disminuye la concentración de M2+ en la solución acuosa, mientras que un pH demasiado bajo conduce a una disminución en la concentración de CO32-. Estas dos especies son la base del procedimiento de cristalización y su presencia depende considerablemente del pH. Por lo tanto, resulta ventajoso tamponar de manera pronunciada y precisa la solución acuosa en el valor de pH correcto, con el fin de controlar el procedimiento.

El procedimiento de emulsionamiento provoca la formación de gotitas acuosas dispersadas en la fase de CO2.

En la formación de las partículas de MCO3, se ha demostrado en el contexto de la presente invención que la presión de ambos CO2 desempeñan un papel de fase discontinua y de reactivo que conduce a la solidificación de la fase discontinua.

De hecho, resulta particularmente preferido que la etapa de emulsionamiento se produzca antes de la cristalización, dado que las gotitas de emulsión son los patrones que controlan la cristalización y por lo tanto, la formación de las partículas. Cuando está presente un surfactante, cuanto más rápidamente se adsorben las moléculas de surfactante en la interfaz, más rápidamente se forman las gotitas estables. Este aspecto resulta favorecido por la baja viscosidad de la fase de CO2 en las condiciones según la invención, que mejoran la tasa de adsorción de las moléculas de surfactante.

Los fenómenos de cristalización y emulsionamiento son controlados por la presión de CO2 de una manera opuesta. De hecho, el aumento de la presión de CO2 conduce a un aumento de la eficacia de emulsionamiento y la estabilidad de emulsión debido a la disminución de la diferencia entre las densidades de las fases acuosa y de CO2 y debido a la reducción de la tensión interfacial.

Por otra parte, el aumento de la presión de CO2 conduce a un aumento de la solubilidad del CO2 en la fase acuosa, debido al equilibrio de la fugacidad entre la fase de CO2 gaseosa y la fase de agua. Lamentablemente, un exceso de CO2 disuelto en la fase acuosa provoca la descomposición de MCO3 debido a la disminución del pH como se ha descrito en la ecuación 6.

imagen6

Por lo tanto, la presión de CO2 es preferentemente controlada de manera precisa en un intervalo de presiones que permiten la obtención de la emulsión A/C, controlando simultáneamente la cantidad de CO2 disuelto en la fase de agua.

La presión de CO2 puede estar adaptada según la concentración de las moléculas de tampón en la fase discontinua con el fin de mantener un pH que permita la última reacción.

Las partículas de MCO3 de polímero preparadas según el procedimiento de la invención son generalmente microesferas.

La morfología de las partículas de MCO3 de polímero puede variar según el pH de las gotitas acuosas de la emulsión y de la naturaleza del polímero y el catión utilizados.

La diferencia en la forma de las partículas obtenidas a un pH de 9 a 8 pueden derivar de un efecto competitivo entre los fenómenos de emulsionamiento y cristalización.

Siendo el polímero solubilizado generalmente de manera homogénea en la gotita acuosa, la cristalización de MCO3 es generalmente uniforme, conduciendo a unas microesferas esféricas.

Las partículas obtenidas a partir de una emulsión de agua en dióxido de carbono

pueden ser liofilizadas, particularmente tras su lavado.

Típicamente, las partículas formadas a través de una emulsión de agua en CO2 presentan una distribución de tamaños estrecha, con un diámetro medio por volumen o por número comprendida entre 0,1 µm y10 µm.

Formación de las partículas mediante un solvente orgánico en una emulsión de dióxido de carbono

En otro aspecto de la invención, la fase discontinua es un solvente orgánico.

Los solventes orgánicos apropiados según la invención son solventes que resultan, para unas condiciones dadas de presión y temperatura y/o en mezcla con otro solvente, miscibles con el CO2 líquido o supercrítico, permitiendo así su extracción y la solidificación del polímero.

El solvente orgánico es preferentemente asimismo parcialmente o muy miscible con el agua.

Los ejemplos de los solventes apropiados son particularmente, el tetraglicol, el polietilenglicol de bajo peso molecular, el propilenglicol.

Preferentemente, el solvente es el tetraglicol.

Preferentemente, el polímero es un polímero sintético, más preferentemente un polímero de ácido láctico o un copolímero de ácido láctico y ácido glicólico.

Según este aspecto de la invención, la solidificación de la fase discontinua se realiza mediante la extracción del solvente de la fase discontinua, desolvatando así el polímero y solidificando la fase discontinua.

En una forma de realización de la invención, el solvente es extraído añadiendo un segundo solvente, siendo dicho segundo solvente miscible con el solvente de la fase discontinua y no siendo un solvente de las sustancias contenidas en la fase discontinua, formando así una mezcla de los solventes que es miscible en la fase continua.

Preferentemente, el segundo solvente es el agua o el propilenglicol.

En otra forma de realización, el solvente es extraído de la fase discontinua llevando el CO2 supercrítico al estado líquido. Esto puede realizarse reduciendo la temperatura y la presión de manera que se consiga la desolvatación del polímero de una manera controlada. Cuando la temperatura es inferior a Tc, la presión puede aumentarse mediante la mejora de la extracción del solvente orgánico.

La expresión “de una manera controlada” hace referencia a que el sistema está siempre en condiciones próximas al equilibrio y no está sometido a una variación súbita de la presión.

Preferentemente, el solvente es extraído mediante el contacto de un flujo de CO2

líquido nuevo.

Preferentemente, la temperatura del CO2 líquido está comprendida entre 10º y 20ºC y más preferentemente entre aproximadamente 15ºC y 16ºC.

Preferentemente, la presión del CO2 líquido está comprendida entre 80 y

160.105 Pa y más preferentemente entre 100 y 150.105 Pa.

Según otra forma de realización, el solvente es extraído tanto añadiendo dicho segundo solvente como llevando el CO2 supercrítico al estado líquido.

Tras la extracción de una cantidad sustancial de solvente, puede añadirse de manera ventajosa una solución acuosa de un agente dispersante de manera que endurezca las partículas obtenidas.

Los ejemplos de los agentes dispersantes apropiados son particularmente los copolímeros en tribloque de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno conocidos como poloxámeros o Pluronic®.

Preferentemente, el agente dispersante es el poloxámero comercializado con la marca comercial Pluronic F68, admitida por la FDA.

Preferentemente, el procedimiento según la invención se realiza en un reactor cerrado, tal como un autoclave.

Las partículas obtenidas pueden ser revestidas utilizando procedimientos convencionales tales como la filtración o la centrifugación y pueden ser liofilizadas tras su lavado.

Se dan asimismo a conocer en la presente memoria dispersiones de partículas que pueden obtenerse mediante el procedimiento de la invención. Preferentemente, la dispersión procede de una emulsión de agua en dióxido de carbono.

Se dan a asimismo a conocer en la presente memoria partículas que pueden obtenerse mediante el procedimiento de la invención.

Preferentemente, las partículas son microesferas o nanoesferas que comprenden un biopolímero, MCO3 y una sustancia activa dispersada en un sistema matricial de biopolímero/MCO3. Las partículas pueden comprender particularmente una sustancia activa revestida con un biopolímero o un polímero sintético biodegradable.

Típicamente, el diámetro medio por volumen o por número de las partículas obtenidas está comprendido entre 0,1 µm y 100 µm, preferentemente entre 1 µm y 20 µm y más preferentemente entre 2 µmy5 µm.

Se da a conocer asimismo en la presente memoria la utilización de partículas o de sus dispersiones como un vehículo para productos cosméticos, farmacéuticos, de diagnóstico, veterinarios, fitosanitarios o alimenticios.

Más particularmente, las partículas dadas a conocer en la presente memoria resultan útiles para la encapsulación de sustancias activas o particularmente para preparar sistemas de suministro de fármaco controlado, tales como las formulaciones de liberación de fármaco rápida o lenta.

Como resultado de la inmunogenicidad de determinados biopolímeros tales como la ovalbúbima, las partículas dadas a conocer en la presente memoria pueden ser capturadas específicamente mediante las células del sistema inmunológico (macrófagos) y por lo tanto resultar particularmente útiles en el campo de la vacunación antitumoral o de la formación de imágenes celulares.

Como ejemplo, las partículas que pueden ser capturadas por las células del sistema inmunológico pueden contener proteínas procedentes de tumores o un agente de contraste como sustancia activa.

Las partículas o sus dispersiones pueden ser asimismo utilizadas en otras diversas aplicaciones tales como:

-en papel como relleno o agente de retención;

-en adhesivos,

-en tintas,

-como revestimientos anticorrosión,

-composiciones aromáticas en textiles o cosméticos.

FIGURA

Figura 1: Representación esquemática del equipo utilizado para la formulación de las partículas de CaCO3 en un medio de CO2. A: Frasco de CO2; B: sistema de refrigeración para el CO2; C: bomba para el CO2; D: sistema de calentamiento; E: autoclave; F: bomba de HPLC.

EJEMPLOS

1. MATERIALES

Hidróxido de calcio; albúmina blanca de huevo de gallina de grado V (OVA); albúmina de suero bovino-isotiocianato de fluoresceína (BSA-FITC) se adquirieron en Sigma Aldrich, Francia. Se adquirió tris(hidroximetil) aminometano (TRIS) en Merck, Francia. El CO2 utilizado en los experimentos es de calidad médica (pureza del 99,99%) y se adquirió en Air Liquide, Francia. El agua ultrapura se produjo mediante un aparato MilliQ plus 188 (Millipore, Francia).

Los surfactantes fluorados a base de fosfocolina se sintetizaron según Krafft el al, 1990. Su pureza (>99%) se evaluó mediante HPLC, NMR y análisis elemental.

La BSA (albúmina de suero bovino) se adquirió en Sigma (Francia).

BASF proporcionó Pluronic F68®, Lutrol F68® (poloxámero 188) (HO-(C2H4O)80 (C3H6O)27-(C2H4O)80-H).

Se adquirieron en Phusis (Francia) los poli(α-hidroxiácidos) tales como PLA50 y PLGA 37.5/25.

Sigma (Francia) proporcionó el glicofurol.

Sigma (Francia) proporcionó el propilenglicol.

2. MÉTODOS

2.1. Preparación de las microesferas

El trabajo experimental se realizó utilizando el aparato presentado en la figura 1 (Separex Equipements, Champigneulles, Francia).

Se compone de un autoclave de 500 ml que presenta en su lado superior un agitador acoplado a una pala de teflón interior. Este agitador permite mezclar el contenido de la célula con una tasa máxima de 1.500 rpm. Una cantidad conocida de CO2 es introducida desde la parte superior de la célula a la temperatura y la presión deseadas. La solución polimérica se llevó desde el fondo de la célula a una magnitud de flujo controlada y a una presión superior a la existente en el autoclave.

2.2 Tamaño y morfología de las microesferas 2.2.1. Partículas preparadas a partir de la emulsión de agua en CO2

Se observaron los diferentes tipos de micropartículas en suspensión acuosa mediante un microscopio óptico (tipo Olympus BH-2) acoplado a una cámara CCD (COHU). Las capturas de imágenes y la determinación del tamaño de las partículas se realizaron con el software Archimed 3.9.0 (Microvision instruments, Evry, Francia).

El microscopio electrónico de barrido (SEM; JEOL 6301F; Jeol France, 78000 Croissy-sur-Seine), provisto de una unidad de rayos X de dispersión de energía (EDX), fue utilizado para examinar la morfología superficial, así como para recabar información sobre la distribución de tamaño de las microesferas. Las muestras liofilizadas de las microesferas se dispusieron sobre soportes de aluminio y fueron revestidas por bombardeo iónico con una capa de carbono. Se aplicó un voltaje de 5 o 20 kv.

Las mediciones del tamaño se realizaron utilizando un contador Coulter®.

2.2.2. Partículas preparadas a partir de un solvente orgánico en emulsión de CO2

Se observaron los diferentes tipos de micropartículas en suspensión acuosa mediante un microscopio óptico (tipo Olympus BH-2) acoplado a una cámara CCD (COHU). Las capturas de imagen y la determinación del tamaño de las partículas se realizaron con el software Archimed 3.9.0 (Microvision instruments, Evry, Francia).

El microscopio electrónico de barrido (SEM; JEOL 6301F; Jeol France, 78000 Croissy-sur-Seine), provisto de una unidad de rayos X de dispersión de energía (EDX), se utilizó para examinar la morfología superficial, así como para recabar información sobre la distribución de los tamaños de las microesferas. Las muestras liofilizadas de las microesferas se dispusieron sobre soportes de aluminio y fueron revestidas por bombardeo iónico con una capa de carbono. Se aplicó un voltaje de 5 a 20 kV.

2.3. Composición de las esferas preparadas a partir de una emulsión de agua en CO2.

La composición elemental de las microesferas se determinó mediante el registro de los espectros de rayos X de dispersión de energía (EDX) recogidos durante 60 segundos en diferentes ubicaciones. Las mediciones se realizaron con el mismo aparato que el utilizado para los experimentos de SEM. El límite de detección de las mediciones es de 1% en peso.

La composición de las microesferas liofilizadas y lavadas es examinada mediante espectroscopia FT-IR. Los espectros son registrados entre 4.000-500 cm-1 con un vector 22 FT-IR Bruker que utiliza microgránulos de bromuro de potasio. Para cada espectro, se recogió un interferograma de 20 barridos a una resolución de 2 cm-1 . Se restó tras la recogida de datos un espectro de absorción de vapor de agua prerregistrado bajo condiciones idénticas. Antes de la obtención del espectro de muestra, se registró un espectro de fondo de haz abierto.

2.4. Mediciones del potencial zeta de partículas

El potencial zeta (ζ) de varios tipos de partículas de CaCO3 se midió con un voltaje de 100 mV utilizando un Zetasizer 2000 (Malvern). Este valor se midió para las suspensiones que presentan aproximadamente la misma concentración de partículas. Se realizó una medición de punto único para un pH de 8 y con una conductividad de 400 µS/cm, ajustada mediante un tampón TRIS de 0,5 M. Cada valor representa el promedio entre las quince mediciones.

2.5. Carga de microesferas de FITC-BSA

Con el fin de conocer si resulta posible la encapsulación de proteínas en las partículas, y al mismo tiempo, visualizar la ubicación de las proteínas en las partículas, se formularon las partículas en presencia de una proteína fluorescente (BSA-FITC). La técnica es idéntica a la descrita en la sección 2.1. y en los ejemplos 1 a 3 a continuación, con la única diferencia de que son añadidos 5 mg/l de BSA-FITC a la solución acuosa alcalina inicial que contiene 1 g/l de OVA. Las partículas fueron analizadas mediante microscopia fluorescente (Zeiss Axiotop 2 MOT, lámpara de arco de 100 v HBO de tipo Atto Zeiss UV) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 519 nm, que corresponde al sustrato marcado con FITC.

2.6. Estudio de biocompatibilidad

El sistema de complemento está implicado en la opsonización del objeto extraño. La activación del sistema de complemento mediante las micropartículas es estudiada 5 mediante un procedimiento técnico denominado “procedimiento modificado CH50” (Mayer

et al, 1961; Kazatchkine et al, 1986; Passirani et al, 1998).

3. EJEMPLOS 1 A 3: PARTÍCULAS DE BIOPOLÍMEROS

10 3.1. Ejemplos 1 y 2: partículas de CaCO3/biopolímeros

Etapa 1: solubilización del surfactante en la fase de CO2 (etapa opcional)

Los surfactantes que fueron utilizados en este procedimiento para la formación de

15 partículas de CaCO3 fueron surfactantes fluorados tales como F8C5PC o F8C11PC (Prof. MP Krafft, Institut Charles Sadron, Strasbourg, Francia) (Riess et al, patente US nº 5.344.930; M.P. Krafft et al, 1990).

imagen1

Estos surfactantes presentan una cadena fluorada, un grupo fosfocolina y un 20 enlazador que comprende 5 u 11 átomos de carbono.

Se añadió una cantidad de surfactante (0 a 50 mg) al reactor de 500 ml, controlado termostáticamente a 25ºC.

25 Bajo agitación con una pala de movimiento de ancla o de hélice (300-400 rpm), se introdujo el dióxido de carbono en el autoclave hasta una presión de 200.105 Pa. Esta etapa de solubilización del surfactante se realizó durante por lo menos 10 minutos.

Observación: Esta etapa es opcional dado que es posible formular partículas de 30 CaCO3 y de biopolímero sin surfactante.

Etapa 2: Adición de la fase acuosa

La fase acuosa está compuesta por 3 elementos: 35 a) un tampón acuoso para mantener el pH en un intervalo determinado (pH básico= 8-10),

se utilizaron dos tipos de tampones para mantener el pH básico a una concentración comprendida entre 0,5 y 1 mol/l: tampón TRIS, y tampón de glicina/NaCl;

b) hidróxido de calcio (CaOH2) como fuente de Ca2+ para la formulación de carbonato cálcico en concentraciones comprendidas entre 0,5 y 1%;

c) un biopolímero que desempeña un papel de matriz en el que se produce la cristalización del CaCO3 y que permite estructurar la forma final de la micropartícula.

Se utilizaron el grado VII de ovalbúmina (proteína) y el ácido hialurónico (polisacárido) en concentraciones de 1 g/l en estos experimentos. La adición de la fase acuosa se realizó en una o dos etapas.

►

Adición en una etapa: una vez se ha solubilizado completamente el surfactante, se añadieron 25 ml de solución acuosa que contiene los tres elementos (a), (b) y (c) en el autoclave bajo condiciones de agitación a 1.000 rpm a una magnitud de flujo de 10 ml/min conduciendo a una presión final en la célula comprendida entre 220 y 240.105 Pa. Tras la adición del volumen total, la agitación fue prolongada durante 5 minutos debido a que para periodos de tiempo más elevados, el pH disminuye a un nivel que resulta en la descomposición de las partículas de CaCO3 en una sal soluble.

►

Adición en dos etapas: una vez se ha solubilizado completamente el surfactante, se añadieron 25 ml de una solución de un biopolímero a 1 g/l en un solución de tampón a un autoclave con una magnitud de flujo de 10 ml/min y estableciendo la tasa de agitación a 1.000 rpm. La agitación se prolongó durante 5 minutos administrándose en el reactor a continuación 15 ml de una solución de Ca(OH)2 a 1% en un tampón idéntico. La tasa de velocidad se mantuvo a una tasa de agitación de 1.000 rpm durante 5 minutos. La presión final en el autoclave estuvo comprendida entre 240 y 260 bares.

Etapa 3: Despresurización del autoclave

Al final de los procedimientos, la agitación fue interrumpida y el autoclave fue despresurizado lentamente (-40 a 50.105 Pa/min).

Etapa 4: Recuperación de las micropartículas

La suspensión de las micropartículas se centrifugó a 4.000 rpm durante 15 minutos.

Se añadieron a la masa sedimentada de centrifugado 40 ml de agua desmineralizada, centrifugándose a continuación de nuevo a 4.000 rpm durante 15 minutos. Este enjuague se realizó 3 veces. Se añadieron a la masa sedimentada de centrifugado de las micropartículas finalmente 2 ml de agua desmineralizada y se liofilizó para obtener un polvo seco de micropartículas.

Ejemplo 1: Partículas de CaCO3/ovalbúmina de grado (VII)

Se aplicó el procedimiento anterior con las condiciones siguientes.

5 ▪ Formulación

-10 mg de surfactante F8C5PC -25 ml de solución acuosa que comprende Ca(OH)2 a 0,5% y 1 g/l de ovalbúmina de grado VII en un tampón TRIS de 0,5 M, pH = 8,4. 10

▪ Procedimiento

-adición en una etapa -presión final = 235.105 Pa 15

▪ Campo -rendimiento medio = 115 mg por formulación (mediante autoclave) 20 ▪ Medición del tamaño con multiclasificador de tamaños Coulter® Este procedimiento utilizado para determinar el diámetro de las partículas está basado en la variación de la impedancia cuando una partícula pasa entre dos electrodos. 25 La medición del tamaño se realizó tras la dispersión de partículas en un medio de

ISOTON/Tween al 1%. Los resultados estadísticos fueron los siguientes:

Media (µm)

2,92

Desviación estándar (µm)

2,67

d 10 (µm)

0,87

d 50 (µm)

1,97

d 90 (µm)

6,38

30

Tabla 1: resultados estadísticos de las mediciones del tamaño con multiclasificador de tamaños Coulter® para la formulación estudiada.

35 ▪ Calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Se realizó un análisis de DSC en la formulación y en cada uno de los componentes

de la micropartícula, es decir ovalbúmina, CaCO3, y el surfactante fluorado. El perfil de

DSC de las micropartículas manifestó una señal a aproximadamente 155-158ºC, una

40 señal que corresponde a la albúmina VII. La señal correspondiente al surfactante no se detectó como si estuviera presente en cantidades demasiado bajas.

Este estudio permitió así concluir que las partículas formuladas contenían ovalbúmina en su estructura.

▪ Estudio de la activación del complemento (estudio de biocompatibilidad)

Los resultados obtenidos mediante la medición del consumo de CH50 frente a la 5 superficie mostraron que las partículas de CaCO3 fueron menos activas de manera significativa que las partículas control (sephadex G50).

Ejemplo 2: Partículas de CaCO3/Ácido hialurónico

10 Las partículas de CaCO3/ácido hialurónico fueron preparadas según el ejemplo 1, con o sin surfactante F8C11PC.

Los resultados obtenidos con el multiclasificador de tamaños Coulter® mostraron que la utilización de un surfactante no ejercía influencia en el tamaño de las partículas. 15 Las partículas obtenidas sin surfactante presentaron un diámetro medio 2 veces superior a

los obtenidos con un surfactante.

Formulación con un surfactante

Formulación sin surfactante

Media (µm)

2,40 5,86

Desviación estándar (µm)

2,25 4,05

d 10 (µm)

0,85 1,52

d 50 (µm)

1,05 4,70

d 90 (µm)

5,99 12,2

Tabla 2: Resultados estadísticos de las mediciones del tamaño con el 20 multiclasificador de tamaños Coulter® para las formulaciones de micropartículas de CaCO3/ácido hialurónico con o sin surfactante.

Se experimentó la encapsulación de BSA-FITC en partículas de CaCO3 con el fin de demostrar la ubicación de la proteína en el interior o en la superficie de las 25 microesferas, utilizando el procedimiento descrito en la sección 2.5. con OVA como patrón para la obtención de partículas y tamponando el pH a un valor de 8. Según el análisis del micrográfico óptico de transmisión, presentando las partículas obtenidas un tamaño de aproximadamente 1 µm y manteniéndose la distribución obtenida sin BSA-FITC. Además, según el micrográfico óptico de fluorescencia, la proteína se encapsuló en las

30 microesferas como pusieron de manifiesto los puntos fluorescentes, que coinciden con las microesferas del micrográfico óptico de transmisión. Se obtuvo una encapsulación de manera idéntica en ausencia de los dos surfactantes o procediendo con una única etapa o con la adición de dos etapas de la solución acuosa.

35 3.2. Ejemplo 3: Micropartículas de ovalbúmina

3.2.1. Preparación de las micropartículas

Las micropartículas de ovalbúmina se prepararon según el procedimiento siguiente.

Etapa 1: Solubilización del surfactante en la fase de CO2

Se añadieron de 10 a 20 mg del surfactante fluorado en el autoclave del reactor, controlado termostáticamente a una temperatura de 40ºC.

Se introdujo a continuación el CO2 en el autoclave bajo agitación con una pala de movimiento hasta una presión de 270.105 Pa.

Etapa 2: Adición de la fase acuosa

Una vez el surfactante es solubilizado completamente, se añadió 1 ml de una solución de ovalbúmina bajo agitación continua (1.500 rpm, a una magnitud de flujo de 10 ml/min que conduce a una presión final comprendida entre 200 y 300.105 Pa). Tras la adición del volumen total, la agitación fue mantenida durante 1 hora a 1.500 rpm.

Etapa 3: Adición del agente reticulante

Se añadieron 1 ml de gliceraldehído a una magnitud de flujo de 10 ml/min o 20 mg de cloruro de tereftaloílo en el autoclave con el fin de reticular las partículas formadas. En el caso del cloruro de tereftaloílo, se tamponó la solución de ovalbúmina en la etapa 2 a aproximadamente un pH de 10.

Etapa 4: Despresurización del autoclave

Al final del procedimiento, se interrumpió la agitación y el autoclave fue despresurizado lentamente (30-50.105 Pa/min).

Etapa 5: Recuperación de las micropartículas

La suspensión de las micropartículas fue centrifugada a 4.000 rpm durante 15 minutos.

Se añadieron a la masa sedimentada de centrifugación 40 ml de agua desmineralizada, centrifugándose a continuación nuevamente a 4.000 rpm durante 15 minutos. Este enjuague se realizó tres veces. Se añadieron a la masa sedimentada de centrifugación de micropartículas 2 ml de agua desmineralizada y se liofilizó para obtener un polvo seco de micropartículas.

3.2.2. Encapsulación de BSA-FITC

El procedimiento de encapsulación dado a conocer en la sección 2.5 se aplicó con las condiciones siguientes:

▪

Solución de ovalbúmina: 4 g/l + 5 mg/l de BSA-FITC en PBS pH = 7,4

▪

10 a 20 mg de surfactante fluorado

▪

Presión inicial de 210.105 Pa

▪

Temperatura = 40ºC

▪

Tasa de agitación = 1.500 rpm

▪

1,5 ml de una solución de ovalbúmina y BSA-FITC

▪

Presión final de 280.105 Pa

▪

Tiempo de agitación = 1 hora

▪

Agente de reticulación (gliceraldehído o cloruro de tereftaloílo)

Los puntos fluorescentes se observaron en las partículas analizando el micrográfico óptico de transmisión en luz visible y en fluorescencia (520 mm), demostrando así la encapsulación de BSA-FITC.

3.2.3 Encapsulación de ácido gadotérico

El procedimiento de encapsulación dado a conocer en la sección 2.5 se aplicó con las condiciones siguientes:

▪

Solución de ovalbúmina: 4 g/l

▪

10 a 20 mg de surfactante fluorado

▪

Presión inicial de 210.105 Pa

▪

Temperatura = 40ºC

▪

Tasa de agitación = 1.500 rpm

▪

0,8 ml de ovalbúmina 0,4 g/l mezclados con ácido gadotérico en 0,1 mol/l

▪

Presión final de 280.105 Pa

▪

Tiempo de agitación = 1 hora

▪

Agente de reticulación: 0,4 ml de gliceraldehído

Las partículas obtenidas se analizaron a continuación con un microscopio óptico. Las partículas observadas eran esféricas con un tamaño comprendido entre 1 a 10 µm.

A partir del microscopio electrónico de barrido las partículas esféricas presentaron una superficie plegada. A partir del análisis por EDX, el gadolinio se encapsuló principalmente en las partículas.

4. EJEMPLOS 4 Y 5

MICROPARTÍCULAS DE POLÍMEROS SINTÉTICOS BIODEGRADABLES

4.1. Ejemplo 4: Micropartículas de polímeros biodegradables preparados a partir de una emulsión de tetraglicol en CO2 supercrítico: Solidificación de las gotitas de fase discontinua mediante la adición de agua.

4.1.1. Preparación de las micropartículas

Etapa 1: Solubilización del polímero en el tetraglicol

El polímero consistió en un polímero de ácido láctico (PLA) o en un copolímero de ácido láctico y glicólico (PLGA) o cualquier polímero soluble en el tetraglicol.

El polímero se solubilizó en tetraglicol con el fin de obtener una solución de viscosidad baja. El porcentaje de polímero en la solución depende del peso molecular del polímero y de su solubilidad en el tetraglicol.

Típicamente, un PLGA de un peso molecular medio de 20.000 g/mol es solubilizado en una proporción de 2,5% a 20% (p/v) (peso/volumen) en tetraglicol.

Etapa 2: Emulsión = solución de polímero/tetraglicol dispersada en CO2

Se introdujeron 20 ml de la solución del polímero en tetraglicol en un reactor controlado termostáticamente de 500 ml a 35ºC.

Se añadió CO2 en el autoclave bajo agitación con una pala de movimiento hasta una presión de 180.105 Pa. Estas condiciones experimentales permitieron obtener una emulsión de la solución del polímero en CO2 supercrítico.

Esta etapa, que resulta necesaria para formar y estabilizar las gotitas de la solución del polímero en tetraglicol, se realizó durante 5 minutos.

El tiempo de esta etapa dependió de porcentaje del polímero solubilizado en tetraglicol.

Etapa 3: Extracción del solvente orgánico

Se añadieron a continuación 50 ml de la solución acuosa a 1% (p/v) a una magnitud de flujo de 10 ml/min en el autoclave. La presión en el autoclave fue entonces de

280.105 Pa. La adición en la solución del agente de dispersión fue: -para proporcionar la extracción de tetraglicol, favoreciendo la precipitación y el endurecimiento del polímero; -para prevenir la aglomeración de las micropartículas mediante la presencia del

agente dispersante Pluronic F68. Etapa 4: Despresurización del autoclave El autoclave se despresurizó lentamente a continuación (aproximadamente 30 a

50.105 Pa).

Se añadieron finalmente 25 ml de una solución acuosa a 1% (w/v) de Pluronic F68 a una magnitud de flujo de 10 ml/min en el autoclave una vez a la presión atmosférica.

Etapa 5: Recuperación de las micropartículas

La suspensión de las micropartículas se centrifugó a 4.000 rpm durante 20 minutos.

Se añadieron a cada masa sedimentada de micropartículas 45 ml de agua desmineralizada, centrifugándose a continuación de nuevo a 4.000 rpm durante 10 minutos. Este enjuague se realizó dos o tres veces.

Se añadieron a la masa sedimentada de micropartículas finalmente 2 ml de agua desmineralizada y se liofilizó para obtener un polvo seco de micropartículas.

4.1.2. Caracterización de las micropartículas

Las micropartículas obtenidas de una solución de PLA 50 al 10% (p/v) en el tetraglicol o de una solución de PLGA 37,5/25 a 5% (p/v) en tetraglicol se observaron mediante un microscopio óptico acoplado con un software (Microvision®) que permite la estimación del tamaño. Estas micropartículas presentaron un diámetro estimado comprendido entre 1 µm y10 µm.

4.2. Ejemplo 5: Micropartículas de polímeros sintéticos biodegradables a partir de una emulsión de tetraglicol en CO2 supercrítico que solidifica las gotitas de la fase discontinua mediante la extracción con CO2 líquido y a continuación mediante la adición de agua

4.2.1. Preparación de las micropartículas

Etapa 1: Solubilización del polímero en tetraglicol

El polímero consistió en un polímero de ácido láctico (PLA) o en un polímero de ácido láctico y glicólico (PLGA) o cualquier polímero soluble en el tetraglicol.

El polímero se solubilizó en tetraglicol con el fin de obtener una solución de viscosidad baja. El porcentaje del polímero en la solución dependerá del peso molecular del polímero y de su solubilidad en tetraglicol.

Típicamente, un PLGA de un peso molecular medio de 20.000 g/mol se solubilizó en una proporción de 2,5% a 20% (p/v) (peso/volumen) en el tetraglicol.

Etapa 2: Incorporación de la proteína en la solución

La BSA (albúmina de suero bovino) se seleccionó como modelo. Se sometió a esferización en presencia de Lutrol F68® según la técnica dada a conocer por Morita et al, 2000.

El coliofilizado BSA-Lutrol F68 se añadió a la solución de polímero-tetraglicol. El Lutrol F68 puede ser solubilizado a 37ºC en tetraglicol permitiendo obtener una suspensión de partículas de BSA en la solución de PLGA/Lutrol F68/tetraglicol.

Etapa 3: Emulsión de una solución de polímero/tetraglicol en CO2 supercrítico

Se introdujeron 10 ml de la suspensión de BSA en la solución de polímero/Lutrol F68/tetraglicol en el reactor de 500 ml termorregulado a 35ºC. Bajo agitación con una pala de movimiento de ancla o de hélice, el CO2 es introducido en el autoclave hasta una presión superior o igual a 240.105 Pa e inferior o igual a 300.105 Pa. Estas condiciones experimentales permiten obtener una emulsión de una solución de polímero/tetraglicol en el CO2 en condiciones supercríticas.

Esta etapa, que permite la formación y la estabilización de las gotitas de la solución de polímero/tetraglicol que contiene las partículas de BSA, es realizada durante 10 a 12 min, tiempo necesario para obtener una presión de 240.105 Pa en el autoclave.

Etapa 4: Extracción en la fase líquida de CO2 a 15ºC

Mientras se mantiene la agitación, la temperatura del medio es disminuida a 15ºC, convirtiéndose a continuación el CO2 en líquido. El descenso de la temperatura del medio condujo a una descenso de la presión que resultaba estable entre 100 y 150.105 Pa cuando la temperatura del medio era de 15 a 16ºC. En estas condiciones de presión y temperatura, el CO2 estaba en estado líquido, permitiendo una extracción de la parte de tetraglicol y la precipitación del polímero como micropartículas, alrededor de las partículas de BSA.

La fase de extracción (a 15ºC y 100-150.105 Pa) se realizó durante por lo menos 30 min.

Etapa 5: Curado de las micropartículas

Se añadieron a continuación 25 ó 50 ml de una solución acuosa que contenía 1% (p/v) de Pluronic F68 a un flujo de 10 ml/mm en el autoclave. La presión en el autoclave fue entonces de por lo menos 200.105 Pa.

La adición de una solución acuosa de surfactante se dirigió a:

-conseguir la extracción del tetraglicol, favoreciendo la precipitación y el endurecimiento del polímero,

-prevenir la aglomeración de las micropartículas mediante la presencia del surfactante Pluronic F68.

Etapa 6: Despresurización del autoclave

Se despresurizó a continuación lentamente el autoclave (aproximadamente 30 a

50.105 Pa/min).

Se añadieron finalmente 25 ml de una solución acuosa al 1% (p/v) de Pluronic F68 a una magnitud de flujo de 10 ml/min en el autoclave una vez a la presión atmosférica.

La suspensión de las micropartículas se introdujo a continuación en 100 o 150 ml de agua desmineralizada bajo agitación para completar la extracción.

Etapa 7: Recuperación de las micropartículas

La suspensión de las micropartículas se centrifugó a 4.000 rpm durante 20 minutos.

Se añadieron a cada masa sedimentada de micropartículas 45 ml de agua desmineralizada centrifugándose a continuación de nuevo a 4.000 rpm durante 10 minutos. Este enjuague se realizó dos o tres veces.

Se añadieron a la masa sedimentada de las micropartículas finalmente 2 ml de agua desmineralizada y se liofilizó para obtener un polvo seco de partículas.

4.2.2. Caracterización de las micropartículas

Las micropartículas obtenidas a partir de una solución de PLGA 37,5/25 al 5% (p/v) en tetraglicol se observaron mediante un microscopio óptico acoplado a un software (Microvision®) permitiendo la estimación del tamaño. Estas micropartículas presentaron un diámetro estimado comprendido entre 1 µm y15 µm.

Bajo microscopia de fluorescencia las micropartículas FITC-BSA de PLGA 37,5/25 mostraron una fluorescencia típica, indicando la incorporación de la proteína en el interior de las partículas.

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Sun, Q.; Deng, Y. Journal of Colloid and Interface Science 2004, 278, 376-382

5 Tai AlChE Journal 1995, 41, 68-77, Kitamura Journal of Crystal Growth 2002, 237-239, 2205-2214

Tewes, F.; Boury, F. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 2405-2412

10 Tewes, F.; Butoescu, N.; Krafft, M. P.; Boury, F. submitted 2004 Tomasko DL, Li H, Liu D, et al. A review of CO2 applications in the processing of polymers. Ind Eng Chem Res 2003; 42:6431-6456.

15 Zielinski, R. G.; Kline, S.

Claims (9)

1. Reivindicaciones

   1. Procedimiento para la preparación de partículas que comprende las etapas que consisten en:

   i) preparar una emulsión que contiene:

   -como fase continua, CO2 líquido o supercrítico, y

   -como fase discontinua, que es un líquido inmiscible dispersado en dicha fase continua en forma de gotitas, un solvente que contiene una sustancia seleccionada de entre el grupo constituido por un polímero, un ión divalente catiónico o una mezcla de los mismos,

   siendo dicha sustancia soluble en dicho solvente que forma dicho un líquido inmiscible dispersado en dicha fase de CO2 e insoluble en dicha fase continua,

   ii) solidificar dicha fase discontinua, formando así las partículas.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, en el que, en la etapa i) la emulsión contiene como fase continua CO2 supercrítico.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la fase discontinua comprende además una sustancia activa.

4. 4.

   Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polímero es un biopolímero o sus derivados, o un polímero sintético.

5. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el solvente es el agua.

6. 6.

   Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la fase discontinua comprende además un ión catiónico divalente.

7. 7.

   Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el solvente es un solvente orgánico.

8. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el solvente es el tetraglicol.
9. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que las partículas obtenidas son recuperadas.

   1/1