ES2349970A1 - Uso de la rnasa p como agente antiviral. - Google Patents
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Abstract
Uso de la RNasa P como agente antiviral. Uso de la RNasa P de Synechocysitis sp. para inhibir la replicación de virus de RNA, y para la elaboración de medicamentos para el tratamiento de enfermedades provocadas por virus de RNA.
Description
Uso de la RNasa P como agente antiviral.
La presente invención pertenece al campo de la
biología, biología molecular y la medicina, y en concreto se refiere
al uso de la RNasa P para inhibir la replicación de virus de RNA, y
para la elaboración de medicamentos para el tratamiento de
enfermedades provocadas por virus de RNA.
Las ribozimas (de ribonucleic acid
enzyme), llamadas también enzimas de RNA ó RNA catalítico, son
moléculas de RNA que catalizan reacciones químicas.
Fue durante los años 80 cuando se describió que
el RNA podía presentar actividad catalítica. Inicialmente se detectó
que era capaz de catalizar reacciones de procesamiento del RNA y más
tarde esta propiedad catalítica se extendió a un buen número de
reacciones bioquímicas distintas. Una de las dos primeras
descripciones de reacciones catalizadas por RNA y por la que recibió
el premio Nobel de química el Prof. Sydney Altman, fue la llevada a
cabo por el RNA de la actividad RNasa P.
La RNasa P es una endonucleasa que se encuentra
presente en todos los organismos vivos (Bacteria, Eukarya y
Archaea). Lleva a cabo una reacción enzimática simple, la
hidrólisis de un puente fosfodiester específico en los precursores
del tRNA (pre-tRNA). Procesa el precursor del tRNA
en la terminación 5' dando lugar a la forma madura del tRNA. En
E. coli la responsable de la actividad natural es una
ribonucleoproteína compuesta por una subunidad proteica, y otra de
RNA. A la parte de RNA se le llamó M1. Se demostró in vitro,
que la actividad catalítica residía en el RNA, mientras que la parte
proteica no era necesaria, y simplemente podía ser sustituida por
una mayor concentración de sales en la reacción (Altman 1989. Adv
Enzymol Relat Areas Mol Biol 62: 1-36).
Posteriormente se valoró el potencial
terapéutico de esta molécula evaluando si podía ser dirigida
específicamente contra un RNA patógeno: RNAs víricos, de oncogenes,
o de resistencia a antibióticos en bacterias. Para eso, se diseñaron
construcciones derivadas de la ribozima M1 adicionando a ésta lo que
se vino a denominar como secuencias guía. Estas secuencias guía son
secuencias cortas (\sim12 bases) que se unen covalentemente al
extremo 3' RNA de M1 y que son complementarias al RNA patógeno
(Altman 1995. Biotechnology (N Y) 13,
327-329). La hibridación de la secuencia guía con el
RNA patógeno aproxima a este a la ribozima M1, que acaba provocando
su procesamiento e inactivación (Liu & Altman, 1995. Genes
& Dev. 9: 471-480).
Generalmente, los virus de RNA presentan tasas
de mutación muy elevadas, y por tanto un alto grado de variabilidad
genética. Esto sucede porque las ARN polimerasas carecen -a
diferencia de las ADN polimerasas- de sistema que puedan detectar y
corregir los errores (reparación del ARN). Los virus de RNA, gracias
a la velocidad con que se replican, explotan la variación genética
como un mecanismo para escapar de la presión de selección del
sistema inmune de sus huéspedes, o de fármacos antivirales, que
intentan impedir su replicación. Es casi inevitable que cuando se
ataca a una población de virus con un fármaco antiviral, surja una
mutación que confiere resistencia al fármaco. Los virus resistentes
prosperan y se replican en gran número, para después diseminarse.
Con el tiempo, los virus resistentes terminan por predominar y un
fármaco antiviral que solía dar buenos resultados pierde su
eficacia. Los individuos afectados por este tipo de virus, incluso
aquellos que no han recibido nunca tratamiento, pueden tener una
variedad de virus ("quasiespecies") entre los que se encuentran
aquellas variantes que no responden del mismo modo al tratamiento.
Así, las estrategias tradicionales de prevención y tratamiento de
afecciones virales se están haciendo obsoletas, hasta el punto de
que no existen vacunas o agentes antivirales para muchas
enfermedades virales en animales y humanos.
En 2002 se demostró (Nadal et al., 2002.
J Biol Chem 277: 30606-30613) que la RNasa P
humana, un complejo de al menos 9 proteínas y un RNA eran capaces de
reconocer y cortar in vitro el RNA del virus de la hepatitis
C de forma específica en dos regiones, una de ellas justo en la
entrada interna del ribosoma (IRES de internal ribosome entry
site) de HCV, una región que es esencial para la reproducción
vírica.
Utilizando modelos en cultivo se obtuvieron
evidencias de que esta reacción no forma parte del ciclo viral
(Pirón et al., 2005. Nucleic Acids Res 33:
1487-1502), probablemente porque la actividad RNasa
P reside en el núcleo, mientras que el virus se reproduce en el
citoplasma. La detección de la sensibilidad a la RNasa P humana se
generalizó a los pestivirus animales (Lyons & Robertson, 2003.
J Biol Chem 278, 26844-26850), picornavirus
(Serrano et al., 2007. RNA 13:849-859)
y a otro virus de insectos.
Esto permitía pensar que un RNA catalítico
derivado de alguna bacteria e introducido en el interior celular
podría cortar in vivo el RNA del virus de la hepatitis C o de
los pestivirus animales relacionados. Sin embargo, pruebas
posteriores mostraron la incapacidad de la ribozima de M1 de E.
coli para procesar el RNA de HCV en el IRES, pero encontramos
que el RNA (RNasa P) catalítico de la cianobacteria
Synechocysitis sp., si era capaz de procesarlo
específicamente in vitro (Sabariegos et al., 2002.
FEBS Lett 577: 517-522).
Los autores de la presente invención han
observado que la ribozima de la cianobacteria (Synechocystis
sp.) que se había mostrado activa contra el RNA de hepatitis C in
vitro también lo es contra el RNA de los pestivirus animales
relacionados peste porcina clásica (PPC) y diarrea viral bovina
(BVDV) in vitro. Esto les ha permitido ensayar la actividad
de la ribozima natural contra el IRES del virus de la peste porcina
clásica in vivo, demostrando la actividad de la ribozima en
el interior celular inhibiendo la reproducción viral, y que esta
inhibición viral no se debe a ningún efecto inespecífico de
inhibición del metabolismo celular por la introducción del RNA. Esto
supone una serie de ventajas clave respecto a la tecnología
preexistente:
1- no es necesario modificar la secuencia
natural de un ribozima, para que este sea activo en el interior
celular contra un virus de RNA,
2- la RNasa P reconoce estructuras miméticas al
tRNA en sus RNAs sustrato. La RNasa P reconoce todos los tRNAs
celulares, independientemente de las variaciones de secuencia de
estos. Incluso se ha demostrado que la RNasa P humana puede
reconocer tRNAs bacterianos y viceversa. Es decir, la actividad de
la RNasa P es independiente de la variación de la secuencia de
bases que conforman la estructura del RNA sustrato, siempre que este
mantenga una estructura mimética al tRNA. Incluso se ha
observado que variaciones en las posiciones adyacentes al punto de
corte en el caso del RNA de hepatitis C no afectan a la actividad.
Esta propiedad minimiza el efecto de la enorme variabilidad que
presentan estos virus y que les permite evadir cualquier droga, ya
que es posible postular que, aquellas mutaciones que modificasen la
estructura de tipo tRNA para evadir la actividad del ribozima,
supondrían también una pérdida de su función biológica.
Por tanto, un primer aspecto de esta invención
se refiere al uso de una secuencia nucleotídica, de ahora en
adelante secuencia nucleotídica de la invención, que se selecciona
de entre:
- a)
- moléculas de ácido nucléico que comprenden la SEQ ID NO: 1, ó
- b)
- moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
para inhibir la replicación de virus de RNA.
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La SEQ ID NO: 1 recoge la secuencia de
nucleótidos de la ribozima RNAasa P aislada de la especie
Synechocystis sp. del Superreino Bacteria, Phylum
Cyanobacteria, Orden Chroococcales.
Cuando se compara la secuencia de la RNasa P (de
Synechocystis sp.) con la secuencia de otras RNAasa P
aisladas en otras especies, es evidente que existen ciertas regiones
que están más conservadas que otras. Esta información puede ser
indicativa de que esas zonas son cruciales para mantener la
estructura o función de la ribozima. Al estudiar la estructura
secundaria de las RNasas P bacterianas se han reconocido dos tipos
estructurales distintos (tipo A y tipo B). El tipo A es la forma
ancestral, mientras que el tipo B emergió posteriormente con el
linaje Gram positivo. El RNasa P se organiza en dominios
estructurales: el dominio I, involucrado en el reconocimiento de la
T-loop de los pre-tRNAs, y que forma
la parte "superior" de la RNasa P, y el Dominio II, que incluye
la mitad "inferior" y que comprende la mayoría de los
nucleótidos que parecen involucrados en la formación del sitio
catalítico.
Por tanto las regiones activas que determina la
especificidad de las RNasas P conservadas importantes para la
actividad de la ribozima, estarán más conservadas entre distintas
RNAsas P, mientras que en otras regiones la divergencia será mayor.
Se han propuesto estructuras consenso (Massire et al., 1998.
JMB 279: 773-793).
Así pues, una realización preferida de este
aspecto de la invención se refiere al uso de un fragmento de la
secuencia de ácidos nucléicos SEQ ID NO: 1, que posee la actividad
catalítica de la ribozima RNAasa P de Synechocystis sp., para
inhibir la replicación de los virus de RNA.
Además, por todo lo dicho anteriormente, puede
esperarse que la identidad global de las RNAsas P homologas a la
RNasa P aislada de la especie Synechocystis sp., a nivel de
la secuencia nucleotídica que se recoge en la SEQ ID NO: 1, sea de
un 70% o mayor, y más preferiblemente de un 80% o mayor y más
preferiblemente de un 90, o un 95% o mayor. La correspondencia entre
la secuencia nucleotídica de la(s) RNasa(s) P
putativa(s) y la secuencia de otras RNasas P se puede
determinar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo,
aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de la
información de secuencia nucleotídica procedente de la RNAsa P
homologa putativa, y la secuencia nucleotídica que se recoge en la
SEQ ID NO: 1 de esta memoria.
Por tanto, en otra realización preferida de este
aspecto de la invención, la secuencia de nucleótidos de RNAsa P
presenta una identidad de, al menos, un 70% con la SEQ ID NO: 1,
preferiblemente al menos de un 80%, más preferiblemente al menos de
un 90% y aún más preferiblemente al menos de un 95%.
El término "homología", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos
estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más
concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias de
nucleótidos. Puesto que dos secuencias se consideran homologas si
tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura
similares, en general, se asume que valores superiores de similitud
o identidad del 70% indicarían homología. Podemos considerar por
tanto que porcentajes de identidad de al menos un 80% mantendrán la
función RNAasa P de dicha secuencia.
El término "identidad", tal y como se
utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de
nucleótidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas que se
comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en
el estado de la técnica e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el
programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids
Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of
Wisconsin, Madison, (WI); BLAST o BLASTN, y FASTA (Altschul et
al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).
Adicionalmente, el algoritmo de Smith Waterman debe usarse para
determinar el grado de identidad de dos secuencias.
El término "fragmento" ó "derivado" de
una secuencia "que posea la actividad catalítica de la RNAasa
P", se refiere a fragmentos derivados de la RNAasa P de
Synechocystis sp en su estado natural que carecen de algún o
algunos nucleótidos, y que aún actúan inhibiendo la replicación de
los virus de RNA. Alternativamente este término también se refiere a
secuencias derivadas de la RNAasa P de Synechocistys sp.
natural, donde se ha cambiado uno o más nucleótidos, se han
eliminado, o añadidos, y/o que hayan sufrido inversiones o
duplicaciones. Tales modificaciones se hacen preferentemente
mediante tecnología recombinante. También pueden hacerse otras
modificaciones mediante alteraciones químicas de la RNasa P. La
secuencia resultante (o los fragmentos derivados del mismo) pueden
ser producidos recombinantemente, y retener características
idénticas, o esencialmente idénticas a la RNasa P natural de
Synechocystis sp.
En esta memoria se entiende por "virus de
RNA" ó "virus de ARN" a un virus que usa ácido ribonucleico
(RNA) como material genético, o bien que en su proceso de
replicación necesita el RNA. Por ejemplo, el virus de la Hepatitis B
es un virus clasificado como virus RNA, aunque su genoma es ADN de
doble cadena, ya que el genoma es trascrito en RNA durante la
replicación. Su ácido nucleico es usualmente RNA monocatenario pero
también puede ser RNA bicatenario. Los virus RNA monocatenarios
pueden clasificarse, según el sentido o polaridad de su RNA en
negativos o positivos. Los virus RNA positivos son idénticos al RNA
mensajero (RNAm) viral y por lo tanto pueden ser inmediatamente
traducidos por la célula huésped. El RNA viral negativo es
complementario del RNAm y por lo tanto debe convertirse en RNA
positivo por una RNA polimerasa antes de la traducción.
Los retrovirus, al contrario que otros virus RNA
monocatenarios, usan ADN intermedio para replicarse. La
transcriptasa inversa, una enzima viral procedente del propio virus,
convierte el RNA viral en una cadena complementaria de DNA, que se
copia para producir una molécula de ADN bicatenario viral. Este DNA
dirige la formación de nuevos viriones.
Los virus ARN pertenecen a los grupos
III-VII de la Clasificación de Baltimore.
Por tanto, en otra realización preferida de este
aspecto de la invención, los virus de RNA cuya replicación es
inhibida por la secuencia de nucleótidos de la invención pertenecen
a los grupos III-VII de la Clasificación de
Baltimore. En una realización aún más preferida de este aspecto de
la invención, el virus pertenece a cualquiera de las familias que se
seleccionan de la lista que comprende: Hepadnaviridae,
Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retroviridae,
Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Totiviridae, Partitiviridae,
Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae,
Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae,
Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornaviridae,
Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae,
Potyviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Tetraviridae,
Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae,
Roniviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Bromoviridae, Tymoviridae,
Closteroviridae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de
los géneros que se seleccionan de la lista que comprende:
Varicosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus,
Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus,
Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus,
Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus.
Hepadnaviridae es una familia de virus
que causan infecciones en hígado de humanos y de animales. Comprende
dos géneros:
- Género Orthohepadnavirus; especie tipo: Virus de la hepatitis B.
- Género Avihepadnavirus; especie tipo: Virus de la hepatitis B del pato.
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Caulimoviridae es una familia de virus
ADN retrotranscritos (o pararetrovirus), que no presentan envoltura.
Las partículas del virus contienen una nucleocápside de dos posibles
formas: baciliforme o isométrica. Todos los virus de esta familia
infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Badnavirus; especie tipo: Virus del moteado amarillo de Commelina.
- Género Caulimovirus; especie tipo: Virus del mosaico de la coliflor
- Género Tungrovirus; especie tipo: Virus baciliforme del tungro del arroz.
- Género Soymovirus; especie tipo: Virus del moteado clorótico de la soja.
- Género Cavemovirus; especie tipo: Virus del mosaico veteado de la yuca.
- Género Petuvirus; especie tipo: Virus del veteado claro de la petunia.
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Pseudoviridae es una familia de virus que
infecta hongos e invertebrados. La familia incluye los siguientes
generas:
- Género Pseudovirus; especie tipo: Virus Ty1 de Saccharomyces cerevisiae.
- Género Hemivirus; especie tipo: Virus copia de Drosophila melanogaster.
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Metaviridae es una familia de virus que
se insertan como retrotransposones en el genoma de un huésped
eucarionte. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Metavirus; especie tipo: Virus Ty3 de Saccharomyces cerevisiae.
- Género Errantivirus; especie tipo: Virus gypsy de Drosophila melanogaster.
- Género Semotivirus; especie tipo: Virus Tas de Ascaris lumbricoides.
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Retroviridae es una familia de virus que
comprende los retrovirus. Son virus con envoltura Los retrovirus son
responsables de muchas enfermedades, incluyendo algunos cánceres y
el SIDA (VIH). La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Alpharetrovirus; especie tipo: Virus de la leucosis aviar.
- Género Betaretrovirus; especie tipo: Virus del tumor mamario del ratón.
- Género Gammaretrovirus; especie tipo: Virus de la leucemia murina; otra: Virus de la leucemia felina.
- Género Deltaretrovirus; especie tipo: Virus de la leucemia bovina; otra: Virus linfotrópico T humano, causante de cáncer.
- Género Epsilonretrovirus; especie tipo: Virus del sarcoma cutáneo del Walleye, que afecta a peces.
- Género Lentivirus; especie tipo: Virus de la inmunodeficiencia humana 1; otras: Virus de la inmunodeficiencia del simia, Virus de la inmunodeficiencia felina.
- Género Spumavirus; especie tipo: Virus espumoso del chimpancé.
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Cystoviridae es una familia de virus
infectivos para bacterias Gram negativas (bacteriófagos). El único
género de la familia es Cystovirus.
Reoviridae es una familia de virus ARN de
vertebrados que pueden afectar al sistema gastrointestinal (como los
Rotavirus) y a las vías respiratorias del huésped. El nombre
de "Reoviridae" se deriva de "virus respiratorio
entérico huérfano", en donde el término "virus huérfano"
hace referencia al desconocimiento de alguna enfermedad a la que
poder asociar al virus. Aunque recientemente han sido identificadas
diversas enfermedades causadas por los virus de la familia
Reoviridae, el nombre original aún se utiliza.
- Género Orthoreovirus; especie tipo: Orthoreovirus de los mamíferos.
- Género Orbivirus; especie tipo: Virus de la lengua azul.
- Género Rotavirus; especie tipo: Rotavirus A, una causa común de diarrea.
- Género Coitivirus; especie tipo: Virus de la fiebre por garrapatas de Colorado (CTFV).
- Género Aquareovirus; especie tipo: Aquareovirus A.
- Género Cypovirus; especie tipo: Cypovirus 1 (CPV 1).
- Género Fijivirus; especie tipo: Virus de la enfermedad de Fiji.
- Género Phytoreovirus; especie tipo: Virus del enanismo del arroz.
- Género Oryzavirus; especie tipo: Virus del raquitismo andrajoso del arroz.
- Género Idnoreovirus; especie tipo: Idnoreovirus 1.
- Género Mycoreovirus; especie tipo: Mycoreovirus 1.
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Birnaviridae es una familia de virus que
afecta a animales. Incluye los siguientes géneros:
- Género Aquabirnavirus; especie tipo: Virus de la necrosis pancreática infecciosa.
- Género Avibirnavirus; especie tipo: Virus de la enfermedad bursal infecciosa.
- Género Entomobirnavirus; especie tipo: Virus X de la Drosophila.
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Totiviridae es una familia de virus que
afecta a animales. Incluye los siguientes géneros:
- Género Totivirus; especie tipo: Virus L-A de Saccharomyces cerevisiae.
- Género Giardiavirus; especie tipo: Virus de Giardia lamblia.
- Género Leishmaniavirus; especie tipo: Virus ARN de Leishmania 1-1.
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Partitiviridae es una familia de virus
que infectan a plantas y hongos. La familia comprende actualmente
tres géneros:
- Género Partitivirus, por ejemplo, Virus de Atkinsonella hypoxylon (AhV) (infecta a un hongo).
- Género Alphacryptovirus, por ejemplo, Virus críptico del trébol blanco 1 (WCCV-1).
- Género Betacryptovirus, por ejemplo, Virus críptico del trébol blanco 2 (WCCV-2).
\vskip1.000000\baselineskip
Chrysoviridae es una familia de virus que
infectan a hongos, en particular a Penicillium.
Hypoviridae es una familia de virus que
afecta a hongos. Se conoce un sólo género, Hypovirus.
Bornaviridae es una familia de virus que
contiene una única especie, el virus de la enfermedad de Borna. La
enfermedad de Borna es un síndrome infeccioso neurológico de los
animales de sangre caliente, que causa comportamiento anormal y de
mortalidad. Inicialmente fue identificado en el ganado ovino y en
los caballos de Europa, y desde entonces se ha encontrado en una
gran variedad de animales de sangre caliente incluyendo aves,
ganado, perros y primates en Europa, Asia, África y América del
Norte. Aunque el virus es considerado principalmente como el agente
causal de la enfermedad en caballos y otros animales, recientes
hallazgos parecen indicar que el virus de Borna puede desempeñar un
papel en algunos desórdenes humanos neurológicos y psiquiátricos
incluyendo el trastorno bipolar y la depresión.
Rhabdoviridae es una familia de virus
infectivos para animales y plantas. Entre los animales infectados
están insectos, peces y mamíferos, incluidos los humanos.
Rhabdoviridae es una familia de virus infectivos para
animales y plantas. Entre los animales infectados están insectos,
peces y mamíferos, incluidos los humanos. La familia incluye los
siguientes géneros:
- Género Cytorhabdovirus; especie tipo: Virus de la necrosis amarilla de la lechuga.
- Género Ephemerovirus; especie tipo: Virus de la fiebre efímera bovina.
- Género Lyssavirus; especie tipo: Virus de la rabia.
- Género Novirhabdovirus; especie tipo: Virus de la necrosis hematopoyética infecciosa.
- Género Nucleorhabdovirus; especie tipo: Virus del enanismo amarillo de la patata.
- Género Vesiculovirus; especie tipo: Virus de la estomatitis vesicular.
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Adicionalmente se conoce un gran número de virus
que todavía no han sido asignados a ningún género.
Filoviridae es una familia de virus del
orden Mononegavirales. Causan serias fiebre hemorrágica
virales, caracterizadas por anormalidades en el sangrado y en
coagulación sanguínea, incluyendo el sangrado difuso. El virus Ébola
destruye el sistema inmunológico. Incluye los géneros:
- Género Marburgvirus.
- Género Ebolavirus.
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Los paramixovirus son miembros de la familia de
virus Paramyxoviridae, infectivos para animales.
Paramixovirus son retrovirus responsables de distintas
enfermedades humanas, como el sarampión y las paperas; dos de los
virus se sabe que provocan neumonía en los humanos: el virus
sincicial respiratorio (VSR) y el de la Parainfluenza. El
virus de la Parainfluenza también causa bronquitis y
garrotillo (o croup), especialmente en los niños. Los
Paramixovirus son también responsables de un determinado
rango de enfermedades, como el moquillo canino, de entre otras
especies animales. Sus géneros representativos son:
Subfamilia Paramyxovirinae:
- Género Avulavirus (especie tipo Newcastle disease virus)
- Género Henipavirus (especie tipo Hendravirus; incluye otros como Nipahvirus)
- Género Morbillivirus (especie tipo Measles virus; incluye otros como Rinderpest virus, Canine distemper virus, phocine distemper virus)
- Género Respirovirus (especie tipo Sendai virus; incluye otros como Human parainfluenza viruses 1 y 3, así como el virus del resfriado común).
- Género Rubulavirus (especie tipo Mumps virus; incluye otros como Simian parainfluenza virus 5, Menangle virus, Tioman virus)
- Género TPMV-like viruses (especie tipo Tupaia paramyxovirus)
\vskip1.000000\baselineskip
Subfamilia Pneumovirinae:
- Género Pneumovirus (especie tipo virus respiratorio sincitial humano, incluye otros como el virus respiratorio sincitial bovino).
- Género Metapneumovirus (especie tipo pneumovirus aviar, metapneumovirus humano).
\vskip1.000000\baselineskip
Virus no asignados a géneros:
- Fer-de-Lance virus.
- Nariva virus.
- Tupaia paramyxovirus.
- Salem virus.
- J virus.
- Mossman virus.
- Beilong virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Los Orthomyxoviridae son una familia de
virus RNA que infectan a los vertebrados. Incluyen a los virus
causante de la gripe. Incluye los géneros:
- Influenzavirus A: aves y humanos, equinos, suinos, visón, focas, ballenas.
- Influenzavirus B: humanos solamente.
- Influenzavirus C: humanos y suinos (rara enfermedad seria)
- Orthomyxovirus trasmitidos por garrapatas: infección humana ocasional.
\vskip1.000000\baselineskip
El Bunyaviridae es una familia de virus
ARN de vertebrados y plantas. Aunque por lo general se encuentran en
artrópodos y roedores, ciertos virus de esta familia pueden infectar
también a los humanos. La familia Incluye más de 300 miembros
serológicamente distintos, divididos en 6 géneros, en tres
grupos:
Grupo A: trasmitidos por artrópodos a
vertebrados
- Orthobunyavirus: encefalitis Bunyamera, encefalitis de La Cross, fiebre Bwamba, fiebre por Guama, fiebre por Orepuche o Sambu.
- Phlebovirus: fiebre del valle del Rift, fiebre de las moscas de la arena de Panamá y Brasil, fiebre de Nápoles y Sicilia.
Uukuniemi
- Nairovirus: fiebre hemorrágica del Congo y Crimea, enfermedad de la cabra de Nairobi.
Grupo B trasmitidos por artrópodos a
plantas Tospovirus
Grupo C trasmitidos por roedores a otros
mamíferos
\vskip1.000000\baselineskip
Hantavirus; Infecciones por
Hantavirus: fiebre hemorrágica con síndrome renal y el
síndrome pulmonar por Hantavirus.
Todos los virus de estos géneros infectan
vertebrados, excepto los Tospovirus que sólo infectan artrópodos y
plantas.
Arenaviridae es una familia de virus
caracterizados por poseer un genoma constituido por dos segmentos de
RNA de cadena simple. Los miembros del taxón se dividen en dos
serotipos, que difieren tanto en su genética como en su distribución
geográfica: el complejo del virus Lassa, del Viejo Mundo, y el
complejo del virus Tacaribe, del Nuevo Mundo. La familia
posee un único género, Arenavirus, cuya especie tipo es el
virus de la coriomeningitis linfocitaria. Sus representantes afectan
a vertebrados.
Leviviridae es una familia de virus
infectivos para bacterias. Incluye:
- Género Levivirus; especie tipo: Fago MS2 de Enterobacteria
- Género Allolevivirus; especie tipo: Fago Q\beta de Enterobacteria
\vskip1.000000\baselineskip
Narnaviridae es una familia de virus que
infectan hongos. Comprende los siguientes géneros:
- Género Narnavirus; especie tipo: Narnavirus 20SRNA de Saccharomyces cerevisiae.
- Género Mitovirus; especie tipo: Mitovirus-1 NB631 de Cryphonectria parasitica.
\vskip1.000000\baselineskip
Picornaviridae es una familia de virus
infectivos para animales. Los picornavirus incluyen importantes
patógenos para humanos y animales. Las enfermedades que causa son
variadas, como el resfriado común, poliomielitis e infecciones
crónicas en el ganado. Dos categorías principales son los
Enterovirus y Rhinovirus.
Los Enterovirus infectan al tracto
entérico, mientras que los Rhinoviruses infectan
principalmente nariz y garganta.
- Enterovirus (EV).
- Enterovirus bovino (BEV) BEV-1, BEV-2.
- Enterovirus humano A 17 serotipos incluyendo virus coxsackie A y enterovirus.
- Enterovirus humano B 56 serotipos incluyendo enterovirus, virus coxsackie B, echovirus y virus de la enfermedad vesicular porcina.
- Enterovirus humano C 13 serotipos incluyendo enterovirus y virus coxsackie A1.
- Enterovirus humano D EV-68, EV-70, EV-9.
- Poliovirus (PV), PV-1 (cepa Mahoney), PV-2 (cepa Lansing), PV-3 (P3/Leon/37).
- Enterovirus porcino (PEV) A PEV-8.
- Enterovirus porcino B PEV-9, PEV-10.
- Enterovirus A del simio SEV-A1.
\vskip1.000000\baselineskip
Entre los Rhinovirus :
- Rhinovirus humano A, 74 serotipos.
- Rhinovirus humano B 25 serotipos.
\vskip1.000000\baselineskip
Hepatovirus :
- Virus de la hepatitis A, Virus de la hepatitis A humano, virus de la hepatitis A del simio.
- Virus de a encefalomielitis aviar.
\vskip1.000000\baselineskip
Cardiovirus :
- Virus de la encefalomiocarditis, Virus Columbia SK, virus Maus Elberfeld, Mengovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Theilovirus :
- Virus de la encefalomielitis murina de Theiler, virus de la encefalomielitis humana de Vilyuisk, virus de la encefalomielitis de la rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Aphthovirus :
- Virus de la fiebre aftosa.
- Virus de la rinitis equina A (ERAV).
\vskip1.000000\baselineskip
Parechovirus :
- Parechovirus humano (HPeV) HPeV-1, HPeV-2, HPeV-3.
- Virus Ljungan Parechovirus del roedor.
\vskip1.000000\baselineskip
Erbovirus :
- Virus de la rinitis equina B (ERBV), ERBV-1, ERBV-2
\vskip1.000000\baselineskip
Kobuvirus :
- Virus Aichi.
- Kobuvirus bovino
\vskip1.000000\baselineskip
Teschovirus :
- Teschovirus porcino.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Dicistroviridae es una familia de virus
que infectan insectos. Comprende las siguientes especies:
- Virus de la parálisis letal del áfido.
- Virus celular de la reina negra (infecta abejas).
- Virus infeccioso de la flacided de Bombyx mori (gusano de seda).
- Virus de la parálisis del grillo.
- Virus C de la Drosophila.
- Virus P de Himetobi.
- Virus intestinal de Plautia stali (un pentatómito).
- Virus de Rhopalosiphum padi (un áfido).
- Virus del Triatoma (vinchuca).
- Virus de Homalodisca coagulata 1 (HoCV-1) (una cicadella).
- Virus de Soienopsis invicta 1 (SINV-1) (una hormiga roja).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos virus todavía no han sido asignados a un
género:
- Virus de Acheta domesticus (un grillo).
- Virus de la parálisis aguda de la abeja.
- Virus Israel de la parálisis aguda (en parte responsable de la reciente desaparición de abejas).
- Virus Cachemira de la abeja.
- Virus del síndrome Taura (camarones).
\vskip1.000000\baselineskip
Marnaviridae es una familia de virus de
la cual se conoce un sólo género, Marnavirus. La especie tipo
infecta al alga microscópica Heterosigma akashiwo.
Sequiviridae es una familia de virus que
infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Sequivirus; especie tipo: Virus del moteado amarillo del rábano.
- Género Waikavirus; especie tipo: Virus esférico del tungro del arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
Comoviridae es una familia de virus que
afectan a plantas. Comprende los siguientes géneros:
- Género Comovirus; especie tipo: Virus del mosaico del caupí.
- Género Fabavirus; especie tipo: Virus del marchitamiento del haba.
- Género Nepovirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del tabaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Potyviridae es una familia de virus que
infectan plantas. Incluye los siguientes géneros:
- Género Potyvirus; especie tipo: Virus Y de la patata.
- Género Rymovirus; especie tipo: Virus del mosaico del raigrás.
- Género Bymovirus; especie tipo: Virus del mosaico amarillo de la cebada.
- Género Macluravirus; especie tipo: Virus del mosaico de la Madura.
- Género Ipomovirusm, especie tipo: Virus del moteado suave de la patata.
- Género Tritimovirus; especie tipo: Virus del mosaico estriado del trigo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Caliciviridae (del latín calix,
"cáliz") es una familia de virus infectivos para animales y
causantes de gastroenteritis en humanos. Los Calicivirus han
sido encontradoso en la mayoría de los animales domésticos y muchos
silvestres, como cerdos, conejos, gallinas y anfibios. Sus géneros
representativos son:
- Género Vesivirus; especie tipo: Virus del Exantema Vesicular Porcino.
- Género Lagovirus; especie tipo: Virus de la Enfermedad Hemorrágica del Conejo.
- Género Norovirus; especie tipo: Virus de Norwalk (gastroenteritis en humanos).
- Género Sapovirus; especie tipo: Virus de Sapporo (gastroenteritis en humanos).
\vskip1.000000\baselineskip
Astroviridae es una familia de virus que
infectan mamíferos y aves. La familia Astroviridae contiene
dos géneros: Mamastrovirus que infecta a los mamíferos y
Avastrovirus que infecta a aves. Dentro de cada género se
conocen varias especies, cada una de las cuales se denomina en
función del huésped que infecta. Además, cada especie es
subclasificada en serotipos. La única cadena de ARN tiene una cola
de poli A en el extremo 3', pero no 5' cap.
- Astrovirus bovino
- Astrovirus felino
- Astrovirus humano
- Astrovirus ovino
- Astrovirus porcino
- Astrovirus de visón
\vskip1.000000\baselineskip
- Astrovirus del pollo
- Astrovirus del pato
- Astrovirus del pavo
\vskip1.000000\baselineskip
Nodaviridae es una familia de virus que
infectan animales. Su genoma es lineal y consta de 4.500 nucleótidos
con un terminal cap 5' de metilato y un terminal 3' no de
poliadenilato. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Alphanodavirus; especie tipo: Virus Nodamura.
- Género Betanodavirus; especie tipo: Virus de la necrosis nerviosa del lucio rallado.
\vskip1.000000\baselineskip
Tetraviridae es una familia de virus que
infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Betatetravirus; especie tipo: Virus \beta de Nudaurelia capensis.
- Género Omegatetravirus; especie tipo: Virus \omega de Nudaurelia capensis.
\vskip1.000000\baselineskip
Luteoviridae es una familia de virus que
infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Luteovirus; especie tipo: Virus del enanismo amarillo de la cebada.
- Género Polerovirus; especie tipo: Virus del enrollado de la hoja de patata.
- Género Enamovirus; especie tipo: Virus del mosaico enanizante del guisante 1.
\newpage
Tombusvidae es una pequeña familia de
virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes
géneros:
- Género Tombusvirus; especie tipo: Virus del enanismo ramificado del tomate.
- Género Carmovirus; especie tipo: Virus del moteado del clavel.
- Género Necrovirus; especie tipo: Virus A de la necrosis del tabaco.
- Género Dianthovirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del clavel.
- Género Machlomovirus; especie tipo: Virus del moteado clorótico del maíz.
- Género Avenavirus; especie tipo: Virus del enanismo clorótico de la avena.
- Género Aureusvirus; especie tipo: Virus latente del Pothos.
- Género Panicovirus; especie tipo: Virus del mosaico del Panicum.
\vskip1.000000\baselineskip
Arteriviridae es una familia de virus que
infectan animales. La especie tipo es el virus de la arteritis
equina (EAV), pero la familia incluye además el virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), el virus de elevación
de la lactato deshidrogenasa (LDV) del ratón y el virus de la fiebre
hemorrágica del simio (SHFV).
Los Coronaviridae son una familia de
virus ARN desarrollados e infecciosos, con más de 12 patógenos
específicos de mamíferos y aves. Ambos 5' y 3' terminales del genoma
tienen una cubierta y un politracto (A) respectivamente, incluyendo
a los siguientes géneros:
- Género Coronavirus; sp. tipo: Virus bronquitis infecciosa
- Género Torovirus; sp. tipo: torovirus equino
\vskip1.000000\baselineskip
Roniviridae es una familia de virus de la
que se conoce un solo género, Okavirus. La especie tipo es el
Virus asociado a las branquias, que infecta peces.
Flaviviridae es una familia de virus que
se propagan principalmente por vectores artrópodos (especialmente
garrapatas y mosquitos). Incluye los siguientes géneros:
- Género Flavivirus (la especie tipo es el Virus de la fiebre amarilla, también incluye el Virus del Nilo Occidental y el Virus del dengue). Se han identificado en total 67 virus en humanos y animales.
- Género Hepacivirus (la especie tipo es el Virus de la hepatitis C, único miembro).
- Género Pestivirus (la especie tipo es la Virus de la diarrea bovina, también Virus de la peste porcina). Otras especies infectan mamíferos no humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las terminaciones 5' de Flavivirus
presentan un cap del nucleótido metilato, mientras que otros
miembros de esta familia no lo tienen y codifican un punto de
entrada ribosómico.
Las principales enfermedades causadas por la
familia Flaviviridae incluyen: Dengue, Encefalitis japonesa,
Enfermedad de Kyasanur, Encefalitis del Valle de Murray, Encefalitis
de San Luis, Meningoencefalitis de garrapata, Encefalitis del Nilo,
Fiebre amarilla y la Hepatitis C.
Togaviridae es una familia de virus que
incluye los siguientes géneros:
- Género Alphavirus; especies típicas: Sindbis virus, Virus de la encefalitis equina oriental, Virus de la encefalitis equina occidental, Virus de la encefalitis equina venezolana, Virus del Río Ross, Virus O'nyong'nyong.
- Género Rubivirus; especies típicas: Rubeola virus.
\vskip1.000000\baselineskip
La terminación o extremo 5' es un nucleótido
metilado y el tercer término (extremo 3') tiene una cola
poliadenilada de unos 70 nucleótidos, que recuerda a un ARN
mensajero.
Bromoviridae es una familia de virus que
infectan a plantas. Comprende las siguientes especies:
- Género Alfamovirus; especie tipo: Virus del mosaico de la alfalfa.
- Género Ilarvirus; especie tipo: Virus del estriado del tabaco.
- Género Bromovirus; especie tipo: Virus del mosaico del Bromus.
- Género Cucumovirus; especie tipo: Virus del mosaico del pepino.
- Género Oleavirus; especie tipo: Virus latente de la oliva 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Tymoviridae es una familia de virus
monopartícula que infectan plantas. El genoma consiste de un gran
marco abierto de lectura con un cap en el término 5'. La familia
incluye los siguientes géneros:
- Género Tymovirus; especie tipo: Virus del mosaico amarillo del nabo
- Género Marafivirus; especie tipo: Virus del rayado fino del maíz
- Género Maculavirus; especie tipo: Virus del moteado de la vid
\vskip1.000000\baselineskip
El género más extenso es Tymovirus con 24
especies, mientras que los otros dos géneros, Marafivirus y
Maculavirus contienen 4 y 2 especies, respectivamente.
Closteroviridae es una familia de virus
que afectan a plantas. Comprende los siguientes géneros:
- Género Closterovirus; especie tipo: Virus de la amarillez de la remolacha.
- Género Crinivirus; especie tipo: Virus de la amarillez infecciosa de la lechuga.
- Género Ampelovirus; especie tipo: Virus del enrollado de las hojas de vid.
\vskip1.000000\baselineskip
Flexiviridae es una familia de virus que
infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
- Género Allexivirus; especie tipo: Virus X de la chalota.
- Género Capillovirus; especie tipo: Virus del tallo ranurado del manzano.
- Género Carlavirus; especie tipo: Virus latente del clavel.
- Género Foveavirus; especie tipo: Virus de las picaduras del tallo del manzano.
- Género Mandarivirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del mandarino.
- Género Potexvirus; especie tipo: Virus X de la patata.
- Género Trichovirus; especie tipo: Virus de las manchas cloróticas de la hoja del manzano.
- Género Vitivirus; especie tipo: Virus A de la vid
\vskip1.000000\baselineskip
Especies no asignadas a un género:
- Virus del mosaico suave del banano.
- Virus del moteado en anillo verde del cerezo.
- Virus del moteado necrótico del cerezo.
- Virus del manchado de la hoja del cítrico.
\vskip1.000000\baselineskip
Barnavidae es una familia de virus de la
que actualmente sólo se conoce un género, Barnavirus, cuya
especie tipo es el Virus baciliforme de la seta.
El género Varicosavirus comprende virus
de plantas asociados con la inflamación que causan en los tejidos
vasculares. La infección ocurre a través del suelo por las esporas
del hongo Olpidium brassicae.
\newpage
El género Ophiovirus se caracteriza por
una nucleocápside alongada y muy filamentosa con simetría
helicoidal. La especie mejor estudiada de este género es el virus de
Citrus psorosis.
El género Tenuivirus comprende virus de
plantas que son transmitidos por artrópodos (de las familias
Cicadellidae o Delphacidae) y que causan enfermedad en
su hospedador, caracterizada por rayas cloróticas en las hojas
afectadas.
En el género Deltavirus se encuentra el
virus causante de la hepatitis D (Hepatitis delta virus o hepatitis
D virus, HDV). El virus de la Hepatitis D: es un virus con genoma
ARN de polaridad negativa, con cápside icosaédrica, y envoltura que
corresponde a la envoltura del Virus de la Hepatitis B (por lo tanto
requiere de la coinfección con este virus para su desarrollo).
Los géneros Iflavirus, Sadwavirus,
Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus,
Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus
comprenden virus que infectan plantas y aún no se les ha asignado
familia.
Todos los virus de RNA que inician la síntesis
proteica mediada por una entrada interna del ribosoma (IRES) y que
se han testado son portadores de estructuras sensibles a la RNasa P,
bien sea esta de origen humano, y/o bacteriano. Entre estos virus se
encuentra el virus de la hepatitis C, y otros virus de la Familia
Flaviviridae y Picornaviridae. Así pues, en otra
realización más preferida de la invención, el virus de RNA pertenece
a la familia Flaviviridae. Dentro de la familia
Flaviviridae se encuentran el virus de la Hepatitis C, el
virus de la Peste Porcina Clásica (PPC), y el virus de la diarrea
viral bovina. Por tanto, en una realización aún más preferida de la
invención, el virus de RNA se selecciona de la lista que comprende
el virus de la Hepatitis C, el virus de la Peste Porcina Clásica
(PPC), y el virus de la diarrea viral bovina.
Dentro de la familia Picornaviridae se
encuentra el virus de la Hepatitis A, el Poliovirus, el
Rhinovirus, el virus de la encefalomiocarditis y el virus de
la fiebre aftosa (Aphtovirus). Por tanto, en una realización
aún más preferida de la invención, el virus de RNA se selecciona de
la lista que comprende el virus de la Hepatitis A, el
Poliovirus, el Rhinovirus, el virus de la
encefalomiocarditis y el virus de la fiebre aftosa
(Aphtovirus).
En otra realización más preferida de la
invención, el virus de RNA se selecciona de la lista que comprende:
virus de la Leucemia Murina de Friend, virus de la Leucemia Murina
de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de Plautia
stali, Rhopalosiphum padi virus, virus de la parálisis Cricket,
Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi. En todos estos
virus se han detectado secuencias IRES.
En esta memoria se entiende por "entrada
interna del ribosoma" ó "internal ribosome entry
site" ó "IRES" a una secuencia nucleotídica que permite
la iniciación de la síntesis proteica en el medio de la traducción
del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A
diferencia del mecanismo más conocido de traducción proteica en
organismos eucariontes que requiere una modificación previa en el
extremo 5' del mRNA mensajero para el ensamblaje de la maquinaria de
traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de
pre-iniciación 43S, de manera que pueden comenzar la
traducción del RNA mensajero pesar de carecer de modificación Cap en
su extremo 5'. Recientemente se han encontrado secuencias IRES en
mRNA de organismos eucariontes que se expresan en condiciones de
estrés, en el ciclo celular y en mecanismos apoptóticos.
Otro aspecto se relaciona con el uso de una
construcción genética que permite la transcripción de una secuencia
nucleotídica de DNA a la secuencia nucleotídica de RNA de la
invención, tal y como se ha descrito anteriormente. Así, otro
aspecto de la presente invención se refiere al uso de una
construcción genética, de aquí en adelante construcción genética de
la invención, que dirige la trascripción in vitro o
intracelular de la secuencia nucleotídica de la invención, y
que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de
secuencias:
a) secuencia de nucleótidos de DNA,
preferiblemente de doble cadena, que comprende cualquiera de las
secuencias que se transcribe in vitro o intracelularmente a
la secuencia de nucleótidos de la invención,
b) secuencia de nucleótidos de DNA,
preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o
vector de expresión génica que comprende la secuencia según a)
operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la
transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con
otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su
regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de
inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación,
origen de replicación, activadores transcripcionales
(enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc ... para inhibir la replicación de virus de
RNA.
Múltiples de estos sistemas o vectores de
expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos
por los expertos en la materia y forman parte de la presente
invención.
Un "vector" es un replicón al que se ha
unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación y/o
expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento
genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación
polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse
bajo su propio control.
"Secuencia de control" se refiere a
secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la
expresión de las secuencias a las que están ligadas. La naturaleza
de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo
huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente
incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de
terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de
control incluyen promotores, señales de terminación,
intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el
término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los
componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también
puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea
ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a
una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una
relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una
secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia
que se transcribe a la secuencia nucleotídica de la invención, está
ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora
se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de
control.
Tal como se usa "secuencia codificadora" en
esta memoria, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que se
transcribe al RNA de la invención cuando está bajo control de
secuencias reguladoras apropiadas.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, los virus de RNA pertenecen a las familias que se
seleccionan de la lista que comprende: Hepadnaviridae,
Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retroviridae,
Cystoviridae, Reoviridae, Bimaviridae, Totiviridae, Partitiviridae,
Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae,
Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae,
Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornaviridae,
Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae,
Potyviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Tetraviridae,
Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae,
Roniviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Bromoviridae, Tymoviridae,
Closteroviridae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de
los géneros que se seleccionan de la lista que comprende:
Varicosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus,
Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus,
Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus,
Benyvirus, Ourmiavirus, idaeovirus. En otra realización más
preferida, el virus de RNA pertenece a la familia
Picornaviridae. En otra realización más preferida, el virus
de RNA pertenece a la familia Flaviviridae. En una
realización aún más preferida el virus de RNA se selecciona de la
lista que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de la
encefalomiocarditis, virus de la fiebre aftosa (Aphtovirus),
virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis C, virus de la Peste
Porcina Clásica (PPC), virus de la diarrea viral bovina, virus de la
Leucemia Murina de Friend, virus de la Leucemia Murina de Moloney
(MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali,
Rhopalosiphum padi virus, virus de la parálisis Cricket,
Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi. En una realización
particular de este aspecto de la invención, el virus de RNA es el
virus de la Peste Porcina Clásica (PPC).
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica, de ahora en adelante composición
farmacéutica de la invención, que comprende la secuencia
nucleotídica de la invención, o la construcción genética de la
invención.
Las composiciones de la presente invención
pueden formularse para su administración a una planta ó animal, y
más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una
variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden
estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos
biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar
tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos
adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular
la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a,
agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y
nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales.
Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su
administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse
con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin
limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma
tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa;
agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz;
lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como
dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como
sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o
salicilato de metilo.
Tales composiciones o sus formulaciones pueden
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al
hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a,
intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal,
intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o
dérmico.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como
por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, ... de la planta ó
animal. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad
de secuencia nucleotídica o construcción genética de la invención
que produzcan el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos
farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas
composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la
materia.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de la secuencia nucleotídica, la construcción genética o la
composición farmacéutica de la invención como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de la secuencia nucleotídica, la construcción genética o la
composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un
medicamento.
El término "medicamento", tal y como se usa
en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para
prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de
enfermedades en plantas, animales y/o en el hombre. En el contexto
de la presente invención se refiere a la secuencia nucleotídica o la
construcción genética de la invención, o a una composición que
comprende la secuencia nucleotídica o la construcción genética de la
invención con vehículos, excipientes y/o adyuvantes
farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de las enfermedades
provocadas por los virus de RNA.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de la secuencia nucleotídica, la construcción genética o la
composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento de las enfermedades provocadas por
los virus de RNA. En una realización preferida de este aspecto de la
invención, los virus de RNA pertenecen a las familias que se
seleccionan de la lista que comprende: Hepadnaviridae,
Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retroviridae,
Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Totiviridae, Partitiviridae,
Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae,
Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae,
Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornaviridae,
Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae,
Potyviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Tetraviridae,
Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae,
Roniviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Bromoviridae, Tymoviridae,
Closteroviridae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de
los géneros que se seleccionan de la lista que comprende:
Varicosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus,
Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus,
Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus,
Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus. En una realización más
preferida, los virus de RNA pertenecen a la familia
Picornaviridae. En otra realización más preferida, los virus
de RNA pertenecen a la familia Flaviviridae.
Más preferiblemente, los virus de RNA se
seleccionan de la lista que comprende: Poliovirus,
Rhinovirus, virus de la encefalomiocarditis, virus de la fiebre
aftosa (Aphtovirus), virus de la Hepatitis A, virus de la
Hepatitis C, virus de la Peste Porcina Clásica (PPC), virus de la
diarrea viral bovina, virus de la Leucemia Murina de Friend, virus
de la Leucemia Murina de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous,
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de
Plautia stali, Rhopalosiphum padi virus, virus de la
parálisis Cricket, Triatoma virus y el virus del sarcoma
de Kaposi. En una realización particular de la invención, el virus de RNA es el virus de la Peste Porcina Clásica.
de Kaposi. En una realización particular de la invención, el virus de RNA es el virus de la Peste Porcina Clásica.
Los términos "nucleótido",
"polinucleótido" y "ácidos nucléicos" se usan aquí de
manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de
nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (RNA ó ARN)
como desoxiribonucleótidos (DNA ó ADN).
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. Corte in vitro de la ribozima
de Synechocystis sp. sobre el fragmento de RNA
1-770 nt del genoma del virus de la peste porcina
clásica (PPC).
El ensayo se llevó a cabo en un volumen de 100
\mul durante 1 hora y a una temperatura de 37ºC. La ribozima, a
una concentración de 135 nM se preincubó en tampón de reacción (50
mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl2 y 1M KCl), 4% PEG
y 20U RNAsin durante 15 minutos a 37ºC antes de añadir el sustrato
de corte: PPC RNA 1-770nt a una concentración de 1.8
nM. La reacción se paró incorporando dos volúmenes de tampón de
carga al tubo de reacción y los productos de corte resultantes se
resolvieron en gel de acrilamida al 4%, 7 M urea, siendo
visualizados por autoradiografía. En el carril izquierdo puede
observarse un control de reacción en el cual el RNA de PPC fue
incubado en buffer sin ribozima. A continuación la reacción con la
ribozima en la que se observan bandas diferenciales de corte con
respecto al control indicadas mediante flechas. Los marcadores de
peso molecular se encuentran en el carril derecho. Algunas de las
bandas de corte, marcadas por flechas como 1 y 2, fueron aisladas de
gel y mediante técnica de 5' RACE y posterior clonaje y
secuenciación se determinaron sus extremos en 5'. Tanto la banda 1
como la banda 2 dieron como resultado que el corte se producía entre
las bases 354-355.
Fig. 2. Efecto antiviral del
ribozima.
Se muestran los resultados de 2 experimentos
representativos. En el experimento A la ribozima supuso una
reducción del RNA viral de unas 10 veces. En el experimento B, de
unas 2 veces. En ambos casos las diferencias son estadísticamente
significativas.
Fig. 3. La transfección del ribozima
(carriles 3) no induce la inhibición general de la síntesis de
proteínas, mientras que la transfección del RNA de doble cadena poly
I:C (carriles 4), si.
Las bandas han sido cuantificadas mediante un
programa de análisis de imágenes. Solo las muestras 4 son
significativamente diferentes de las demás. 1.- Células no
transfectadas, 2.- Células transfectadas sin ribozima, 3.- Células
transfectadas con ribozima, 4.- Células tranfectadas con poly
I:C.
Fig. 4. la transfección del ribozima (foto 4)
no induce citotoxicidad, mientras que la transfección del RNA de
doble cadena poly I:C (foto 3), si.
Fig. 5. Clonaje y secuenciación del producto
de corte.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de la RNAasa P como
antiviral.
\vskip1.000000\baselineskip
La molécula de ribozima se sintetizó mediante
transcripción in vitro utilizando el kit Megascript (Ambion)
a partir del plásmido pT76803 digerido con el enzima de restricción
Dral. Este plásmido contiene el gen de la subunidad de RNA de la
RNasa P perteneciente a la cianobacteria Synechocystis sp. de
437 nt de longitud, bajo el promotor de la T7 RNA polimerasa. El RNA
catalítico se purificó mediante columna comercial Megaclear
(Ambion). Posteriormente la actividad del ribozima se calibró en un
rango de concentraciones de 0.5 a 250 nM utilizando para ello el RNA
sustrato natural correspondiente al precursor
pretRNA-GIn de Synechocystis sp. marcado
internamente con el isótopo radiactivo
[\alpha-P32]GTP. La concentración empleada
en los ensayos de corte se eligió en base a estos resultados de
calibración.
\vskip1.000000\baselineskip
La ribozima se preincubó en tampón de reacción
(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl2 y 1M KCl), 4%
PEG y 20U RNAsin (Promega) durante 15 minutos a 37ºC antes de añadir
el sustrato de corte a una concentración final de 1'8 nM. Estas
condiciones iónicas fueron optimizadas en trabajos previos de
Pascual y Vioque A. Ejemplifican el plegamiento correcto del
ribozima para que pueda ejercer su actividad catalítica. El ensayo
se llevó a cabo en un volumen de 10 \mul durante 1 hora y a una
temperatura de 37ºC. La reacción se paró incorporando dos volúmenes
de tampón de carga (0.3% azul de bromofenol, 0.3% xilencianol, 10 mM
EDTA pH 7.5 y 97.5% de formamida desionizada) al tubo de reacción y
los productos de corte resultantes se resolvieron en gel de
acrilamida al 4%, 7 M urea, siendo visualizados por autoradiografía
(Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células PK-15
(línea celular derivada de riñón porcino) en placas de cultivos de
24 pocillos (m24), aproximadamente 105 células por pocillo, en medio
DMEM suplementado con 10% suero de ternera fetal (STF). Al día
siguiente se cambió el medio por medio Optimem (Gibco) y se
prepararon las mezclas de transfección utilizando el reactivo
Lipofectina (Invitrogen) y las condiciones recomendadas por el
fabricante. La mezcla de transfección, para 4 pocillos, contenía 2
\mug de ribozima y 20 \mul de lipofectina, en un volumen final
de 250 \mul de Optimem por pocillo. Como control se preparó una
mezcla de transfección sin ribozima, en idénticas condiciones.
La mezcla de transfección se añadió a las
monocapas celulares y se incubaron 3 h a 37ºC. A continuación se
cambió el medio por 250 \mul de medio DMEM suplementado con 1%
STF, conteniendo virus de la peste porcina clásica (cepa Alfort) a
una multiplicidad de infección de aprox. 0.5 TCID (tissue culture
infectious dose) por célula. Transcurrida 1 h de adsorción se retiró
el inoculo y se sustituyó por medio DMEM suplementado con 1%
STF.
A las 24 h post-infección se
aspiró el medio y se recogió el RNA celular total utilizando el
reactivo TriReagent (Sigma), 250 \mul por pocillo, y las
condiciones recomendadas por el fabricante. A continuación se
cuantificó el RNA viral mediante Real Time RT-PCR en
un termociclador Light Cycler (Roche), utilizando el kit LightCycler
RNA Amplification Kit SYBR Green I (Roche) y los oligonucleótidos
PPC-A (SEQ ID NO: 2) y PPC-D (SEQ ID
NO: 3) como primers.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se transfectaron con ribozima como
se describe en el apartado anterior. Como controles se utilizaron
células no transfectadas, células transfectadas sin RNA y células
transfectadas con poly (I:C). A las 8 h
post-transfección el medio de cultivo se sustituyó
por medio sin metionina y 2 h después se cambió por 250 \mul de
medio sin metionina conteniendo 50 \muCi de
^{35}S-Metionina. Al cabo de 2 h de incubación se
recogieron los extractos celulares en buffer de lisis, se
resolvieron en un gel de 10% poliacrilamida y se visualizó la
radiactividad incorporada mediante autoradiografía. Para cuantificar
la radiactividad incorporada se utilizó el programa de análisis de
imágenes ImageGauge (Fujifilm) sobre la imagen digitalizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Para amplificar el producto de corte dejado por
el ribozima se utilizó el kit 573' RACE Kit, 2nd generation, de
Roche, y las condiciones recomendadas por el fabricante. Brevemente,
el RNA procedente de células transfectadas e infectadas como se
describe anteriormente se utilizó como molde para sintetizar una
copia de cDNA mediante transcripción reversa (primer.
Alf751-R, SEQ ID NO: 4). A continuación se utilizó
transferasa terminal para añadir una cola de poly(A) en el
extremo 3' del cDNA, seguido por dos rondas de PCR (nested PCR)
utilizando en cada una un primer específico de la secuencia
viral (Alf 626-R SEQ ID NO: 5 y
Alf601-R SEQ ID NO: 6) y otro complementario a la
cola de poly(A), suministrado en el kit. Finalmente el
producto de la PCR se visualizó en un gel de 2% agarosa y se clonó
utilizando el sistema pGEM-T-Easy
(Promega).
\vskip1.000000\baselineskip
RNAs conteniendo la secuencia correspondiente al
extremo 5' del genoma de los virus indicados, y marcados con
^{32}P se incubaron en presencia y en ausencia del ribozima de
Synechocystis sp., en las condiciones que se describen en
materiales y métodos. A continuación los RNAs se resolvieron en un
gel de poliacrilamida 4% desnaturalizante y se visualizaron por
autoradiografía. Como se puede ver en la figura 1, en presencia de
ribozima se observa específicamente la aparición de una banda de
menor tamaño, correspondiente al producto de corte del ribozima.
\vskip1.000000\baselineskip
Cultivos de células PK-15 (línea
celular procedente de riñón de cerdo y susceptible a la replicación
del virus de la peste porcina clásica) se transfectaron con
ribozima, según se describe en materiales y métodos. Como control,
células fueron transfectadas en paralelo con una mezcla de
transfección que no contenía RNA. En algunos experimentos (no
mostrado) se utilizaron como control negativo células transfectadas
con un RNA irrelevante, obteniéndose los mismos resultados. A las 3
h el medio de transfección se sustituyó por medio conteniendo virus
de la peste porcina clásica (cepa Alfort).
A las 24 h post-transfección se
obtuvo el RNA total de las células infectadas y se cuantificó el RNA
viral mediante RT-PCR en tiempo real. La figura 2
muestra el resultado de 2 experimentos representativos. Como se
puede ver en la figura, en presencia del ribozima la cantidad de RNA
viral a las 24 h post-infección se reduce entre 2 y
10 veces respecto a los controles sin ribozima.
\vskip1.000000\baselineskip
Para descartar la posibilidad de que el efecto
antiviral detectado fuese debido a la activación de mecanismos de
defensa no específicos que resultasen en una parada generalizada de
la síntesis de proteínas, analizamos la incorporación de
^{35}S-Metionina en células transfectadas con
ribozima. Como controles negativos se utilizaron células no
transfectadas y células transfectadas sin ribozima. Como control
positivo se transfectó poly (I:C), un RNA de doble cadena sintético
que induce la respuesta de Interferón de tipo I. Como se puede ver
en la figura 3, la incorporación de
^{35}S-Metionina en células transfectadas con
ribozima no presentó diferencias estadísticamente significativas
(p<0.05) respecto a las células no transfectadas o transfectadas
sin ribozima, mientras que las células transfectadas con poly (I:C)
si experimentaron una reducción significativa en la síntesis de
proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Paras descartar que la disminución en los
niveles de replicación viral en células con ribozima pudiese ser
debida a un aumento de la mortalidad celular, debida a toxicidad de
la lipofectina o a la inducción de apoptosis en las células
transfectadas, se observaron las células mediante microscopía, a las
24 h post-transfección. Como se puede apreciar en
la figura 4, las monocapas celulares transfectadas con ó sin
ribozima presentaban un aspecto similar al de las células control,
mientras que las células transfectadas con poly (I:C) mostraban un
grado alto de mortalidad, debida a la apoptosis inducida por la
respuesta interferón de tipo I.
\vskip1.000000\baselineskip
Para intentar detectar el producto de corte del
ribozima en las células transfectadas e infectadas, se utilizó la
técnica de 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Esta técnica
permite identificar el extremo 5' de una molécula de RNA. Como se
puede ver en la figura 5, en células transfectadas sin ribozima, el
producto mayoritario amplificado corresponde al tamaño esperado al
amplificar la secuencia correspondiente al RNA viral genómico
intacto. Sin embargo, cuando se aplicó la técnica de RACE sobre RNA
proveniente de células transfectadas con Ribozima, el producto
mayoritario amplificado correspondía a un tamaño menor. El producto
de PCR fue clonado y secuenciado para determinar el punto exacto de
corte por el ribozima. La secuencia revela que el primer nucleótido
correspondiente a la secuencia viral es el nucleótido 366, lo que
sugiere que el corte por el ribozima tiene lugar entre los
nucleótidos 365 y 366. Este punto de corte (8 nucleótidos antes del
codón de iniciación de la poliproteína) es compatible con el
resultado de corte obtenidos en los experimentos de corte in
vitro (figura 1), tan sólo a 11 nt corriente arriba. La
no-exactitud puede ser debida tanto a una pequeña
degradación del RNA viral en el interior celular, o a una pequeña
diferencia en la zona de corte de la ribozima in vivo e in
vitro. Tan solo señalar que el punto de corte de la actividad
RNasa P humana ensayada in vitro sobre este PPC se localiza
justo entre los puntos corte de la ribozima in vitro e in
vivo.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC).
\hskip1cmCentro de Investigación Biomédica en Red en el Área Temática de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd)
\hskip1cmInstituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA)
\hskip1cmUniversidad de Castilla La Mancha (UCLM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de la RNasa P como agente
antiviral.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 437
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis PCC6803
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (22)
1. Uso de la secuencia nucleotídica con
actividad catalítica de la ribozima RNasa P de Synechocystis
sp. que se selecciona de entre:
- a.
- las moléculas de ácido nucléico que comprenden la SEQ ID NO: 1, ó
- b.
- moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de (a),
para inhibir la replicación de virus de RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de un fragmento de la secuencia
nucleotídica según la reivindicación anterior, donde el fragmento
posee la actividad catalítica de la ribozima RNasa P de
Synechocystis sp.
3. Uso de la secuencia nucleotídica con
actividad catalítica de la ribozima 5 RNasa P de
Synechocystis sp. según cualquiera de las reivindicaciones
1-2, donde la secuencia nucleotídica presenta una
identidad de al menos un 70% con la SEQ ID NO: 1.
4. Uso de la secuencia nucleotídica con
actividad catalítica de la ribozima RNasa P de Synechocystis
sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde la secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos
un 80% con la SEQ ID NO: 1.
5. Uso de la secuencia nucleotídica con
actividad catalítica de la ribozima RNasa P de Synechocystis
sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-4,
donde la secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos
un 90% con la SEQ ID NO: 1.
6. Uso de la secuencia nucleotídica con
actividad catalítica de la ribozima RNasa P de Synechocystis
sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-5,
donde la secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos
un 95% con la SEQ ID NO: 1.
7. Uso de una construcción genética que dirige
la trascripción in vitro o intracelular de la
secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones
1-6, que comprende:
- a.
- secuencia de nucleótidos de DNA que comprende cualquiera de las secuencias que se transcriben in vitro o intracelularmente a la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6,ó
- b.
- secuencia de nucleótidos de DNA correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia según (a) operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Uso de una construcción genética según la
reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos de DNA es de
doble cadena.
9. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, donde los virus de RNA pertenecen a las
familias que se seleccionan de la lista que comprende:
Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae,
Retroviridae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Totiviridae,
Partitiviridae, Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae,
Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae,
Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae,
Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae,
Comoviridae, Potyviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Nodaviridae,
Tetraviridae, Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae,
Coronaviridae, Roniviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Bromoviridae,
Tymoviridae, Closteroviridae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a
cualquiera de los géneros que se seleccionan de la lista que
comprende: Varicosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus,
Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus,
Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus,
Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus.
10. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, donde el virus de RNA pertenece a la familia
Picornaviridae.
11. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, donde el virus de RNA pertenece a la familia
Flaviviridae.
12. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, donde el virus de RNA se selecciona de la lista
que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de la
encefalomiocarditis, virus de la fiebre aftosa (Aphtovirus),
virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis C, virus de la Peste
Porcina Clásica (PPC), virus de la diarrea viral bovina, virus de la
Leucemia Murina de Friend, virus de la Leucemia Murina de Moloney
(MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali,
Rhopalosiphum padi virus, virus de la parálisis Cricket,
Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi.
13. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, donde el virus de RNA es el virus de la Peste
Porcina Clásica.
14. Composición farmacéutica que comprende la
secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones
1-6, o una construcción genética según cualquiera de
las reivindicaciones 7-8.
15. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, como medicamento.
16. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, para la elaboración de un medicamento.
17. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, para la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de las enfermedades provocadas por los virus de RNA.
18. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, según la reivindicación 17, donde los virus de
RNA pertenecen a las familias que se seleccionan de la lista que
comprende: Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae,
Metaviridae, Retroviridae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae,
Totiviridae, Partitiviridae, Chrysoviridae, Hypoviridae,
Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae,
Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae,
Namaviridae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae,
Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Caliciviridae, Astroviridae,
Nodaviridae, Tetraviridae, Luteoviridae, Tombusviridae,
Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flaviviridae,
Togaviridae, Bromoviridae, Tymoviridae, Closteroviridae,
Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que
se seleccionan de la lista que comprende: Varicosavirus,
Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus,
Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus,
Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus,
Ourmiavirus, Idaeovirus.
19. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, según la reivindicación 17, donde los virus de
RNA pertenecen a la familia Picornaviridae.
20. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, según la reivindicación 17, donde los virus de
RNA pertenecen a la familia Flaviviridae.
21. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, según la reivindicación 17, donde los virus de
RNA se seleccionan de la lista que comprende: Poliovirus,
Rhinovirus, virus de la encefalomiocarditis, virus de la fiebre
aftosa (Aphtovirus), virus de la Hepatitis A, virus de la
Hepatitis C, virus de la Peste Porcina Clásica (PPC), virus de la
diarrea viral bovina, Friend murine leucemia, Moloney murine
leukemia (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), Plautia stali intestine virus,
Rhopalosiphum padi virus, Cricket paralysis virus, Triatoma virus y
el virus del sarcoma de Kaposi.
22. Uso de la secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una
construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de la composición farmacéutica según la
reivindicación 14, según la reivindicación 17, donde el virus de
RNA es el virus de la Peste Porcina Clásica.
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2009
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|---|---|---|---|---|
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| WO2007052046A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | King's College London | Anti-hepatitis b virus ribozymal nucleic acid |
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Also Published As
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