WO2010055187A2 - Uso de la rnasa p como agente antiviral - Google Patents

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WO2010055187A2
WO2010055187A2 PCT/ES2009/070497 ES2009070497W WO2010055187A2 WO 2010055187 A2 WO2010055187 A2 WO 2010055187A2 ES 2009070497 W ES2009070497 W ES 2009070497W WO 2010055187 A2 WO2010055187 A2 WO 2010055187A2
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Jordi GÓMEZ CASTILLA
Rosa TOLEDANO DÍAZ
Ignacio MENA PIÑEIRO
Mª del Rosario SABARIEGOS JAREÑO
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) (34%)
CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA EN RED EN EL ÁREA TEMÁTICA DE ENFERMEDADES HEPÁTICAS Y DIGESTIVAS (CIBERehd) (25%)
Instituto Nacional De Investigaciones Agrarias (Inia) (31%)
Universidad De Castilla La Mancha (10%)
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/126—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes involving RNAse P

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biology, molecular biology and medicine, and specifically refers to the use of RNase P to inhibit the replication of RNA viruses, and for the preparation of medicaments for the treatment of diseases caused by viruses. of RNA.
  • Ribozymes (from ribonucleic acid enzyme), also called RNA enzymes or catalytic RNA, are RNA molecules that catalyze chemical reactions.
  • RNase P is an endonuclease that is present in all living organisms (Bacteria, Eukarya and Archaea). It carries out a simple enzymatic reaction, the hydrolysis of a specific phosphodiester bridge in the precursors of tRNA (pre-tRNA). Processes the precursor of the tRNA at the 5 'termination giving rise to the mature form of the tRNA.
  • pre-tRNA a specific phosphodiester bridge
  • tRNA a specific phosphodiester bridge
  • tRNA tRNA
  • RNAs viral RNAs, oncogenes, or antibiotic resistance in bacteria.
  • guide sequences are short sequences (-12 bases) that covalently bind to the 3 'RNA end of M1 and that are complementary to the pathogenic RNA (Altman 1995. Biotechnology (NY) 13, 327-329). Hybridization of the guide sequence with the pathogenic RNA approximates this to the M1 ribozyme, which ends up causing its processing and inactivation (Liu & Altman, 1995. Genes & Dev. 9: 471-480).
  • RNA viruses have very high mutation rates, and therefore a high degree of genetic variability. This happens because RNA polymerases lack - as opposed to system DNA polymerases - that can detect and correct errors (RNA repair). RNA viruses, thanks to the speed with which they replicate, exploit the genetic variation as a mechanism to escape the selection pressure of their host's immune system, or of antiviral drugs, which try to prevent their replication. It is almost inevitable that when a virus population is attacked with an antiviral drug, a mutation arises that confers resistance to the drug. Resistant viruses thrive and replicate in large numbers, and then spread. Over time, resistant viruses eventually predominate and an antiviral drug that used to give good results loses its effectiveness.
  • RNA of the classical swine fever-related animal pestivirus (PPC) and Bovine viral diarrhea (BVDV) in vitro This has allowed them to test the activity of the natural ribozyme against the IRES of the classical swine fever virus in vivo, demonstrating the activity of the ribozyme inside the cell by inhibiting viral reproduction, and that this viral inhibition is not due to any effect non-specific inhibition of cellular metabolism by the introduction of RNA.
  • PPC classical swine fever-related animal pestivirus
  • BVDV Bovine viral diarrhea
  • RNase P recognizes mimetic structures to the tRNA in its substrate RNAs.
  • RNase P recognizes all cellular tRNAs, regardless of sequence variations thereof. It has even been shown that human RNase P can recognize bacterial tRNAs and vice versa. That is, the activity of RNase P is independent of the variation of the sequence of bases that make up the structure of the substrate RNA, provided that it maintains a mimetic structure to the tRNA. It has even been observed that variations in positions adjacent to the cut-off point in the case of RNA of hepatitis C do not affect the activity.
  • a first aspect of this invention refers to the use of a nucleotide sequence, hereinafter nucleotide sequence of the invention, which is selected from: a) nucleic acid molecules comprising SEQ ID NO: 1, or b) nucleic acid molecules whose complementary hybrid chain with
  • SEQ ID NO: 1 collects the nucleotide sequence of the RNAo P ribozyme isolated from the Synechocystis sp. of the Superreino Bacteria, Phylum Cyanobacteria, Order Chroococcales.
  • the RNasa P is organized into structural domains: domain I, involved in the recognition of the T-loop of the pre-tRNAs, and which forms the "top” part of the RNasa P, and Domain II, which includes half “inferior” and comprising the majority of nucleotides that appear to be involved in the formation of the catalytic site.
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to the use of a fragment of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1, which has the catalytic activity of the RNAase P ribozyme of Synechocystis sp., To inhibit the replication of RNA viruses.
  • RNAsas P homologous to RNase P isolated from the species Synechocystis sp. At the level of the nucleotide sequence that is collected in SEQ ID NO: 1, is of 70% or more, and more preferably 80% or more and more preferably 90, or 95% or more.
  • the correspondence between the nucleotide sequence of the putative RNase (s) and the sequence of other RNases P can be determined by methods known in the art. For example, those can be determined by a direct comparison of the nucleotide sequence information from the putative homologous RNAse P, and the nucleotide sequence that is collected in SEQ ID NO: 1 of this memory.
  • the nucleotide sequence of RNAse P has an identity of at least 70% with SEQ ID NO: 1, preferably at least 80%, more preferably at least 90% and even more preferably at least 95%.
  • homology refers to the similarity between two structures due to a common evolutionary ancestry, and more specifically, to the similarity between two or more nucleotide sequences. Since two sequences are considered homologous if they have the same evolutionary origin or if they have similar function and structure, in general, it is assumed that higher values of similarity or identity of 70% would indicate homology. We can therefore consider that identity percentages of at least 80% will maintain the RNAase P function of said sequence.
  • identity refers to the proportion of identical nucleotides between two nucleotide sequences that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art and include, but are not limited to, the GAG program, including GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST or BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. BIoI. 215: 403-410 (1999). Additionally, the Smith Waterman algorithm should be used to determine the degree of identity of two sequences.
  • fragment or “derivative” of a sequence “that possesses the catalytic activity of the RNAase P” refers to fragments derived from the RNAase P of Synechocystis sp in its natural state that lack some or some nucleotides, and that They still act by inhibiting the replication of RNA viruses.
  • this term also refers to sequences derived from the RNAase P of Synechocistys sp. natural, where one or more nucleotides have been changed, have been removed, or added, and / or have undergone reversals or duplications. Such modifications are preferably made by recombinant technology. Other modifications can also be made by chemical alterations of the RNase P.
  • the resulting sequence (or the fragments derived therefrom) can be produced recombinantly, and retain identical, or essentially identical characteristics to the natural RNase P of Synechocystis sp.
  • RNA virus or "RNA virus” means a virus that uses ribonucleic acid (RNA) as a genetic material, or that in its replication process needs RNA.
  • the Hepatitis B virus is a virus classified as an RNA virus, although its genome is double stranded DNA, since the genome is transcribed into RNA during replication. Its nucleic acid is usually single stranded RNA but it can also be double stranded RNA. Single stranded RNA viruses can be classified, according to the sense or polarity of their RNA, in negative or positive.
  • the positive RNA viruses are identical to the viral messenger RNA (mRNA) and therefore can be immediately translated by the host cell.
  • the negative viral RNA is complementary to the mRNA and therefore must be converted into a positive RNA by an RNA polymerase before translation.
  • Retroviruses unlike other single-stranded RNA viruses, use intermediate DNA to replicate.
  • Reverse transcriptase a viral enzyme from the virus itself, converts the viral RNA into a complementary strand of DNA, which is copied to produce a viral double stranded DNA molecule. This DNA directs the formation of new virions.
  • RNA viruses belong to NI-VII groups of the Baltimore Classification.
  • RNA viruses whose replication is inhibited by the nucleotide sequence of the invention belong to groups 11 I-VI I of the Baltimore Classification.
  • the virus belongs to any of the families that are selected from the list comprising: Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retrovir ⁇ dae, Cystoviridae, Reovir ⁇ dae, Birnaviridae, Totivir ⁇ dae, Partitivir ⁇ dae, chrysovirus, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, ARENAVIRIDAE, Leviviridae, narnaviridae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequ
  • Hepadnaviridae is a family of viruses that cause liver infections in humans and animals. It comprises two genres:
  • Genus Orthohepadnavirus type species: Hepatitis B virus Genus Avihepadnavirus; type species: Duck hepatitis B virus.
  • African mosaicoviridae is a family of retrotranscribed DNA viruses (or pararetroviruses), which have no envelope.
  • the virus particles contain a nucleocapsid in two possible ways: bacilliform or isometric. All viruses in this family infect plants.
  • the family includes the following genera:
  • Genus Badnavirus type species: Commelina yellow spotted virus.
  • Genus Caulimovirus type species: Cauliflower mosaic virus
  • Genus Tungrovirus type species: Bacilliform rice tungro virus.
  • Genus Soymovirus type species: Soy chlorotic mottling virus.
  • Genus Cavemovirus type species: Cassava veined mosaic virus.
  • Genus Petuvirus type species: Petunia clear vein virus.
  • Pseudovir ⁇ dae is a family of viruses that infect fungi and invertebrates.
  • the family includes the following genera: Genus Pseudovirus; type species: Saccharomyces cerevisiae Ty1 virus.
  • Genus Hemivirus type species: Drosophila melanogaster copy virus.
  • Metaviridae is a family of viruses that are inserted as retrotransposons in the genome of a eukaryotic host.
  • the family includes the following genera: Genus Metavirus; type species: Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus.
  • Genus Errantivirus type species: Drosophila melanogaster gypsy virus.
  • Genus Semotivirus type species: Ascar ⁇ s lumbr ⁇ coides virus Tas.
  • Retroviridae is a family of viruses that includes retroviruses. They are enveloped viruses Retroviruses are responsible for many diseases, including some cancers and AIDS (HIV). The family includes the following genera:
  • Genus Alpharetrovirus type species: Avian leukosis virus.
  • Betaretrovirus type species: Mouse mammary tumor virus.
  • Genus Gammaretrovirus type species: Murine leukemia virus; other: Feline leukemia virus.
  • Genus Deltaretrovirus type species: Bovine leukemia virus; other:
  • Genus Epsilonretrovirus type species: Walleye skin sarcoma virus, which affects fish.
  • Genus Lentivirus type species: Human immunodeficiency virus 1; others: Immunodeficiency virus of simia, Feline immunodeficiency virus.
  • Genus Spumavirus type species: Sparkling chimpanzee virus.
  • Cystoviridae is a family of infectious viruses for Gram negative bacteria (bacteriophages). The only genus of the family is Cystovirus.
  • Reovi ⁇ dae is a family of vertebrate RNA viruses that can affect the gastrointestinal system (such as Rotaviruses) and the host's respiratory tract.
  • the name "Reovir ⁇ dae” is derived from "orphan enteric respiratory virus", where the term “orphan virus” refers to the lack of knowledge of a disease to which the virus can be associated. Although recently several diseases caused by the viruses of the family Reovir ⁇ dae have been identified, the original name is still used.
  • Orthoreovirus type species: Mammalian orthoreovirus.
  • Genus Orbivirus type species: Bluetongue virus.
  • Genus Rotavirus type species: Rotavirus A, a common cause of diarrhea.
  • Genus Coltivirus type species: Colorado tick fever virus (CTFV).
  • Genus Aquareovirus type species: Aquareovirus A.
  • Genus Cypovirus type species: Cypovirus 1 (CPV 1).
  • Genus Fijivirus type species: Fiji disease virus.
  • Genus Phytoreovirus type species: Rice dwarf virus.
  • Genus Oryzavirus type species: Ragged rice rickets virus.
  • Genus Idnoreovirus type species: Idnoreovirus 1.
  • Mycoreovirus type species: Mycoreovirus 1.
  • Birnaviridae is a family of viruses that affects animals. It includes the following genera: Genus Aquabirnavirus; type species: Infectious pancreatic necrosis virus.
  • Genus Entomobirnavirus type species: Drosophila virus X.
  • Totiviridae is a family of viruses that affects animals. It includes the following genres:
  • Genus Totivirus type species: Saccharomyces cerevisiae LA virus.
  • Genus Giardiavirus type species: Giardia lamblia virus.
  • Genus Leishmaniavirus type species: Leishmania RNA virus 1 -1.
  • Partitiviridae is a family of viruses that infect plants and fungi. The family currently comprises three genres:
  • Genus Partitivirus for example, Atkinsonella hypoxylon (AhV) virus (infects a fungus).
  • Genus Alphacryptovirus for example, White Clover Cryptic Virus 1
  • Betacryptovirus for example, White Clover Cryptic Virus 2 (WCCV-2).
  • Chrysoviridae is a family of viruses that infect fungi, particularly Penicillium.
  • Hypovir ⁇ dae is a family of viruses that affects fungi. Only one genus, Hypovirus, is known.
  • Bornaviridae is a family of viruses that contain a single species, the Borna disease virus.
  • Borna's disease is a neurological infectious syndrome of warm-blooded animals, which causes abnormal behavior and mortality. It was initially identified in sheep and horses in Europe, and since then it has been found in a wide variety of warm-blooded animals including birds, cattle, dogs and primates in Europe, Asia, Africa and North America. Although the virus is considered primarily as the causative agent of the disease in horses and other animals, recent findings seem to indicate that Borna virus may play a role in some human neurological and psychiatric disorders including bipolar disorder and depression.
  • Rhabdoviridae is a family of infectious viruses for animals and plants. Among infected animals are insects, fish and mammals, including humans. Rhabdoviridae is a family of infectious viruses for animals and plants. Among infected animals are insects, fish and mammals, including humans. The family includes the following genera:
  • Genus Cytorhabdovirus type species: Yellow necrosis virus of lettuce.
  • Genus Ephemerovirus type species: Bovine ephemeral fever virus.
  • Genus Lyssavirus type species: Rabies virus.
  • Genus Novirhabdovirus type species: Infectious hematopoietic necrosis virus.
  • Genus Nucleorhabdovirus type species: Yellow dwarf virus of the potato.
  • Genus Vesiculovirus type species: Vesicular stomatitis virus.
  • Filovir ⁇ dae is a family of viruses of the order Mononegavirales. They cause serious viral hemorrhagic fever, characterized by abnormalities in bleeding and blood clotting, including diffuse bleeding.
  • the Ebola virus destroys the immune system. It includes the genera: Marburgvirus genus. Genus Ebolavirus.
  • Paramyxoviruses are members of the Paramyxoviridae virus family, infective to animals. Paramyxoviruses are retroviruses responsible for various human diseases, such as measles and mumps; Two of the viruses are known to cause pneumonia in humans: respiratory syncytial virus (RSV) and that of Parainfluenza. The Parainfluenza virus also causes bronchitis and garrotillo (or croup), especially in children. Paramyxoviruses are also responsible for a certain range of diseases, such as canine distemper, among other animal species. Their representative genera are: Subfamily Paramyxovir ⁇ nae:
  • Genus Avulavirus (Newcastle disease virus type)
  • Genus Henipavirus (Hendravirus type species; includes others such as Nipahvirus)
  • Genus Morbillivirus (species type Measles virus; includes others such as Rinderpest virus, Canine distemper virus, phocine distemper virus)
  • Genus Respirovirus (Sendai virus type species; includes others such as Human parainfluenza viruses 1 and 3, as well as the common cold virus).
  • Genus Rubulavirus (Mumps virus type species; includes others such as Simian parainfluenza virus 5, Menangle virus, Tioman virus)
  • Genus TPMV-like viruses (Tupaia paramyxovirus type species)
  • Genus Pneumovirus human syncytial respiratory virus type species, including others such as bovine syncytial respiratory virus.
  • Genus Metapneumovirus avian pneumovirus type species, human metapneumovirus. Viruses not assigned to genera:
  • Orthomyxoviridae are a family of RNA viruses that infect vertebrates. They include the viruses that cause influenza. It includes the genres:
  • Influenzavirus A birds and humans, equines, suinos, mink, seals, whales.
  • Influenzavirus B humans only.
  • Influenzavirus C humans and suinos (rare serious disease) Orthomyxovirus transmitted by ticks: occasional human infection.
  • Bunyaviridae is a family of vertebrate and plant RNA viruses. Although they are usually found in arthropods and rodents, certain viruses in this family can also infect humans.
  • the family includes more than 300 serologically distinct members, divided into 6 genders, into three groups:
  • Group A transmitted by arthropods to vertebrates
  • Orthobunyavirus Bunyamera encephalitis, La Cross encephalitis, fever
  • Phlebovirus Rift Valley fever, Panama and Brazil sand flies fever, ⁇ apóles fever and Sicily.
  • Nairovirus hemorrhagic fever of Congo and Crimea, disease of the Washington goat.
  • Group B transmitted by arthropods to Tospovirus plants
  • Group C transmitted by rodents to other mammals Hantavirus; Hantavirus infections: hemorrhagic fever with renal syndrome and Hantavirus pulmonary syndrome.
  • Arenaviridae is a family of viruses characterized by having a genome consisting of two segments of single stranded RNA. The members of the taxon are divided into two serotypes, which differ both in their genetics and in their geographical distribution: the Lassa virus complex, of the Old World, and the Tacaribe virus complex, of the New World. The family has a single genus, Arenavirus, whose type species is lymphocytic choriomeningitis virus. Their representatives affect vertebrates.
  • Leviviridae is a family of infectious viruses for bacteria. Includes: Genus Levivirus; type species: Phage MS2 of Enterobacteria
  • Narnaviridae is a family of viruses that infect fungi. It comprises the following genera: Genus Narnavirus; type species: Narnavirus 20SRNA of
  • Genus Mitovirus type species: Mitovirus-1 NB631 of parasitic Cryphonectria.
  • Picornavir ⁇ dae is a family of infectious viruses for animals. Picornaviruses include important pathogens for humans and animals. The diseases it causes are varied, such as the common cold, poliomyelitis and chronic infections in cattle. Two main categories are Enterovirus and Rhinovirus. Enteroviruses infect the enteric tract, while Rhinoviruses mainly infect the nose and throat. Enterovirus (EV).
  • Poliovirus Poliovirus (PV), PV-1 (Mahoney strain), PV-2 (Lansing strain), PV-3 (P3 / Leon / 37).
  • PEV Porcine Enterovirus
  • Rhinoviruses Human Rhinoviruses A, 74 serotypes.
  • Hepatitis A virus Human hepatitis A virus, Ape hepatitis A virus. Avian encephalomyelitis virus.
  • Encephalomyocarditis virus Columbia SK virus, Maus Elberfeld virus, Mengovirus.
  • Theilovirus Theiler murine encephalomyelitis virus, Vilyuisk human encephalomyelitis virus, rat encephalomyelitis virus.
  • Aphthovirus
  • Equine rhinitis A virus (ERAV). Parechovirus:
  • HPeV Human parechovirus
  • Equine rhinitis virus B (ERBV), ERBV-1, ERBV-2 Kobuvirus Equine rhinitis virus B (ERBV), ERBV-1, ERBV-2 Kobuvirus:
  • Dicistroviridae is a family of viruses that infect insects. It comprises the following species: Lethal aphid paralysis virus.
  • Triatoma virus (vinchuca). Homalodisca coagulata 1 virus (HoCV-1) (a scar).
  • Solenopsis invicta 1 virus (SINV-1) (a red ant). These viruses have not yet been assigned to a genus:
  • Taura syndrome virus (shrimp).
  • Marnaviridae is a family of viruses of which only one genus, Marnavirus, is known.
  • the type species infects the microscopic algae Heterosigma akashiwo.
  • Sequiviridae is a family of viruses that infect plants.
  • the family includes the following genera:
  • Genus Sequivirus type species: Yellow spotted radish virus.
  • Genus Waikavirus type species: Spherical tungro rice virus.
  • Comoviridae is a family of viruses that affect plants. It comprises the following genres:
  • Genus Comovirus type species: Cowpea mosaic virus.
  • Genus Fabavirus type species: Bean wilt virus.
  • Genus Nepovirus type species: Virus of tobacco ringed spots.
  • Potyviridae is a family of viruses that infect plants. It includes the following genres: Genus Potyvirus; type species: Virus Y of the potato. Genus Rymovirus; type species: Ryegrass mosaic virus. Genus Bymovirus; type species: Barley yellow mosaic virus. Genus Macluravirus; type species: Madura mosaic virus.
  • Genus Ipomovirus type species: Soft spotted potato virus.
  • Genus Tritimovirus type species: Striated mosaic virus of wheat.
  • Calicivir ⁇ dae (from the Latin calix, "calyx") is a family of infectious viruses for animals and causes gastroenteritis in humans. Caliciviruses have been found in most domestic and many wild animals, such as pigs, rabbits, chickens and amphibians. Their representative genera are: Genus Vesivirus; type species: Swine Vesicular Exanthema Virus. Genus Lagovirus; type species: Rabbit Hemorrhagic Disease Virus.
  • Norwalk virus human gastroenteritis
  • Genus Sapovirus type species: Sapporo virus (human gastroenteritis).
  • Astrovir ⁇ dae is a family of viruses that infect mammals and birds.
  • the Astroviridae family contains two genera: Mamastrovirus that infects mammals and Avastrovirus that infects birds. Within each genus several species are known, each of which is named according to the host it infects. In addition, each species is subclassified into serotypes. The only RNA chain has a poly A tail at the 3 'end, but not 5' cap.
  • Duck Astrovirus Turkey Astrovirus Nodavir ⁇ dae is a family of viruses that infect animals. Its genome is linear and consists of 4,500 nucleotides with a 5 'methylate cap terminal and a 3' non-polyadenylate terminal. The family includes the following genera:
  • Genus Alphanodavirus type species: Nodamura virus.
  • Genus Betanodavirus type species: Grated pike nerve necrosis virus.
  • Tetraviridae is a family of viruses that infect plants.
  • the family includes the following genera: Genus Betatetravirus; type species: Nudaurelia capensis ⁇ virus.
  • Genus Omegatetravirus type species: Nudaurelia capensis virus ⁇ .
  • Luteoviridae is a family of viruses that infect plants.
  • the family includes the following genera: Genus Luteovirus; type species: Barley yellow dwarf virus.
  • Genus Polerovirus type species: Potato leaf roll virus.
  • Genus Enamovirus type species: Pea dwarf mosaic virus 1.
  • Tombusvidae is a small family of viruses that infect plants.
  • the family includes the following genera:
  • Genus Carmovirus type species: Carnation mottling virus.
  • Genus Necrovirus type species: Tobacco necrosis virus A.
  • Genus Dianthovirus type species: Carnation ringed spots virus.
  • Genus Machlomovirus type species: Corn chlorotic mottle virus.
  • Genus Avenavirus type species: Oat chlorotic dwarfism virus.
  • Genus Aureusvirus type species: Pothos latent virus.
  • Genus Panicovirus type species: Panicum mosaic virus.
  • Arteriviridae is a family of viruses that infect animals. The type species is the equine arteritis virus (EAV), but the family also includes the porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV), the mouse lactate dehydrogenase (LDV) elevation virus of the mouse and the fever virus hemorrhagic ape (SHFV).
  • EAV equine arteritis virus
  • PRRSV porcine respiratory and reproductive syndrome virus
  • LDV mouse lactate dehydrogenase
  • SHFV fever virus hemorrhagic ape
  • Coronavir ⁇ dae are a family of developed and infectious RNA viruses, with more than 12 specific pathogens of mammals and birds. Both 5 'and 3' genome terminals have a cover and a polytract (A) respectively, including the following genera:
  • Genus Torovirus Genus Torovirus; sp. type: equine torovirus
  • Roniviridae is a family of viruses of which a single genus, Okavirus, is known.
  • the type species is the gill-associated virus, which infects fish.
  • Flaviviridae is a family of viruses that are spread primarily by arthropod vectors (especially ticks and mosquitoes). It includes the following genres:
  • Genus Flavivirus (the type species is the Yellow Fever Virus, it also includes the Western Child Virus and Dengue Virus). A total of 67 viruses have been identified in humans and animals.
  • Genus Hepacivirus (the type species is the hepatitis C virus, the only member).
  • Pestivirus genus the type species is the Bovine diarrhea virus, also swine fever virus). Other species infect non-human mammals.
  • Flavivirus The 5 'terminations of Flavivirus have a cap of the nucleotide methylate, while other members of this family do not have it and encode a ribosomal entry point.
  • the main diseases caused by the Flaviviridae family include: Dengue, Japanese Encephalitis, Kyasanur Disease, Murray Valley Encephalitis, St. Louis Encephalitis, Tick Meningoencephalitis, Child Encephalitis, Yellow Fever and Hepatitis C Togaviridae is a family of viruses that includes the following genera:
  • Genus Alphavirus Typical species: Sindbis virus, Eastern equine encephalitis virus, Western equine encephalitis virus, Venezuelan equine encephalitis virus, Ross River virus, O'nyong'nyong virus.
  • Genus Rubivirus Typical species: Rubella virus.
  • the 5 'end or terminus is a methylated nucleotide and the third term (3' end) has a polyadenylated tail of about 70 nucleotides, reminiscent of a messenger RNA.
  • Bromoviridae is a family of viruses that infect plants. It comprises the following species:
  • Genus Alfamovirus type species: Alfalfa mosaic virus.
  • Genus llarvirus type species: Tobacco striatum virus.
  • Genus Bromovirus type species: Bromus mosaic virus.
  • Genus Cucumovirus type species: Cucumber mosaic virus.
  • Genus Oleavirus type species: Latent olive virus 2.
  • Tymoviridae is a family of monoparticle viruses that infect plants.
  • the genome consists of a large open reading frame with a cap in the 5 'term.
  • the family includes the following genera:
  • Genus Tymovirus type species: Turnip yellow mosaic virus Genus Marafivirus; type species: Maize fine virus Maculavirus; type species: Vine mottle virus
  • the most widespread genus is Tymovirus with 24 species, while the other two genera, Marafivirus and Maculavirus contain 4 and 2 species, respectively.
  • Closteroviridae is a family of viruses that affect plants. It comprises the following genera: Genus Closterovirus; type species: Beet yellowing virus.
  • Genus Crinivirus type species: Infectious yellowness virus of lettuce.
  • Genus Ampelovirus type species: Vine leaf curl virus.
  • Flexivir ⁇ dae is a family of viruses that infect plants. The family includes the following genera:
  • Genus Allexivirus type species: shallot X virus.
  • Genus Capillovirus type species: Apple grooved stem virus.
  • Genus Carlavirus type species: latent carnation virus.
  • Genus Foveavirus type species: Apple tree stem bites virus.
  • Genus Mandarivirus type species: Mandarin ringed spots virus.
  • Genus Potexvirus type species: Potato Virus X.
  • Genus Tr ⁇ chovirus type species: Virus of the chlorotic spots of the apple tree leaf.
  • Genus Vitivirus type species: Virus A of the Vine Species not assigned to a genus: Soft banana mosaic virus.
  • Barnavidae is a family of viruses of which only one genus is currently known, Barnavirus, whose type species is the Bacilliform Mushroom Virus.
  • the Varicosavirus genus comprises plant viruses associated with the inflammation they cause in vascular tissues. Infection occurs through the soil by the spores of the fungus Olpidium brassicae.
  • the genus Ophiovirus is characterized by an elongated and very filamentous nucleocapsid with helical symmetry.
  • the best studied species of this genus is the Citrus psorosis virus.
  • the Tenuivirus genus includes virus from plants that are transmitted by arthropods (of the Cicadellidae or Delphacidae families) and that cause disease in their host, characterized by chlorotic stripes on the affected leaves.
  • Hepatitis delta virus In the genus Deltavirus is the virus that causes hepatitis D (Hepatitis delta virus or hepatitis D virus, HDV).
  • the Hepatitis D virus is a virus with RNA genome of negative polarity, with icosahedral capsid, and envelope that corresponds to the envelope of the Hepatitis B Virus (therefore requires coinfection with this virus for its development).
  • Iflavirus, Sadwavirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus comprise viruses that infect plants and have not yet been assigned family.
  • RNA viruses that initiate protein synthesis mediated by an internal ribosome entry (IRES) and that have been tested are carriers of structures sensitive to RNase P, either of human origin, and / or bacterial.
  • IRES internal ribosome entry
  • the RNA virus belongs to the family Flaviviridae. Within the Flaviviridae family are the Hepatitis C virus, the Classical Swine Plague virus (PPC), and the virus of bovine viral diarrhea. Therefore, in an even more preferred embodiment of the invention, the RNA virus is selected from the list comprising the Hepatitis C virus, the Classic Swine Plague virus (PPC), and the bovine viral diarrhea virus .
  • the RNA virus is selected from the list comprising the Hepatitis A virus, the Poliovirus, the Rhinovirus, the encephalomyocarditis virus and the FMD virus ( Aphtovirus)
  • the RNA virus is selected from the list comprising: Friend's Murine Leukemia virus, Moloney's Murine Leukemia virus (MMLV), Rous sarcoma virus, immunodeficiency virus human (HIV), intestinal virus of Plautia stali,
  • IRES internal ribosome entry or “infernal ribosome entry site” or “IRES” means a nucleotide sequence that allows the initiation of protein synthesis in the middle of the translation of the open reading frame of a messenger RNA (mRNA or mRNA).
  • IRES sequences are recognized by the 43S pre-initiation complex, so that can begin the translation of messenger RNA despite lacking Cap modification at its 5 'end.
  • IRES sequences have been found in mRNA of eukaryotic organisms that are expressed under conditions of stress, in the cell cycle and in apoptotic mechanisms.
  • Another aspect is related to the use of a genetic construct that allows the transcription of a nucleotide sequence of DNA into the nucleotide sequence of RNA of the invention, as described above.
  • another aspect of the present invention refers to the use of a genetic construction, henceforth genetic construction of the invention, which directs the in vitro or intracellular transcription of the nucleotide sequence of the invention, and which comprises, at least, one of the following types of sequences: a) DNA nucleotide sequence, preferably double stranded, comprising any of the sequences that is transcribed in vitro or intracellularly to the nucleotide sequence of the invention, b) DNA nucleotide sequence , preferably double-stranded, corresponding to a gene expression system or vector comprising the sequence according to a) operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said nucleotide sequence of interest, and with other necessary or appropriate sequences for the transcription and its adequate regulation in time and place, for example, start and end signals, site s cutting, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators ⁇ enhancers), transcriptional silencers ⁇ silencers), etc .. to inhibit
  • a "vector” is a replicon to which another polynucleotide segment has been attached, to perform the replication and / or expression of the bound segment.
  • a “replicon” is any genetic element that behaves as an autonomous unit of polynucleotide replication within a cell; that is, able to replicate under its own control.
  • Control sequence refers to polynucleotide sequences that are necessary to effect the expression of the sequences to which they are linked. The nature of such control sequences differs depending on the host organism; in prokaryotes, said control sequences generally include a promoter, a ribosomal binding site, and termination signals; in eukaryotes, generally, said control sequences include promoters, termination signals, enhancers and, sometimes, silencers. It is intended that the term “control sequences” includes, at a minimum, all components whose presence is necessary for expression, and may also include additional components whose presence is advantageous.
  • Operaationally linked refers to a juxtaposition in which the components thus described have a relationship that allows them to function in the intended way.
  • a control sequence "operatively linked" to a sequence that is transcribed to the nucleotide sequence of the invention, is linked in such a way that the expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequences.
  • coding sequence refers to a polynucleotide sequence that is transcribed to the RNA of the invention when it is under control of appropriate regulatory sequences.
  • the RNA viruses belong to the families selected from the list comprising: Hepadnavir ⁇ dae, Caulimovir ⁇ dae, Pseudovir ⁇ dae, Metaviridae, Retrovir ⁇ dae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Totiviridae, Partitiviridae, Chrysovirvir Hypovir ⁇ dae, Bornavir ⁇ dae, Rhabdovir ⁇ dae, Filovir ⁇ dae, Paramyxovir ⁇ dae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornavir ⁇ dae, Dicistrovir ⁇ dae, Marnavir ⁇ dae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Calicivir ⁇ dae, Astrovir ⁇ dae, Nodavir ⁇ d
  • the RNA virus belongs to the Picornavir ⁇ dae family. In another more preferred embodiment, the RNA virus belongs to the family Flaviviridae. In an even more preferred embodiment, the RNA virus is selected from the list comprising: Poliovirus, Rhinovirus, Encephalomyocarditis virus, FMD virus ⁇ Aphtovirus), Hepatitis A virus, Hepatitis C virus, virus Ia Classical Swine Plague (PPC), bovine viral diarrhea virus, Friend Murine Leukemia virus, Moloney Murine Leukemia virus (MMLV), Rous sarcoma virus, human immunodeficiency virus (HIV), virus Plautia stali gut, Rhopalosiphum padi virus, Cricket paralysis virus, Triatoma virus and Kaposi sarcoma virus. In a particular embodiment of this aspect of the invention, the RNA virus is the Classical Swine Plague (PPC) virus.
  • PPC Classical Swine Plague
  • composition of the invention which comprises the nucleotide sequence of the invention, or the genetic construction of the invention.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration to a plant or animal, and more preferably to a mammal, including man, in a variety of ways known in the state of the art.
  • they can be, without limitation, in sterile aqueous solution or in biological fluids, such as serum.
  • Aqueous solutions may be buffered or unbuffered and have additional active or inactive components. Additional components include salts to modulate the ionic strength, preservatives including, but not limited to, antimicrobial agents, antioxidants, chelants, and the like, and nutrients including glucose, dextrose, vitamins and minerals.
  • the compositions can be prepared for administration in solid form.
  • compositions may be combined with various inert vehicles or excipients, including but not limited to; binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin; excipients such as starch or lactose; dispersing agents such as alginic acid or corn starch; lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide; sweetening agents such as sucrose or saccharin; or flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • binders such as microcrystalline cellulose, gum tragacanth, or gelatin
  • excipients such as starch or lactose
  • dispersing agents such as alginic acid or corn starch
  • lubricants such as magnesium stearate, glidants such as colloidal silicon dioxide
  • sweetening agents such as sucrose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint or methyl salicylate.
  • compositions or their formulations may be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intracecal, intraventricular, oral, enteral. , parenteral, intranasal or dermal.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, age, weight, sex, tolerance, ... of the plant or animal. In the sense used in this description,
  • therapeutically effective amount refers to the amount of nucleotide sequence or genetic construction of the invention that produces the desired effect.
  • pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the nucleotide sequence, the genetic construction or the pharmaceutical composition of the invention as a medicament.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the nucleotide sequence, the genetic construction or the pharmaceutical composition of the invention for the preparation of a medicament.
  • RNA virus refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases in plants, animals and / or in man.
  • it refers to the nucleotide sequence or the genetic construction of the invention, or to a composition comprising the nucleotide sequence or the genetic construction of the invention with pharmaceutically acceptable vehicles, excipients and / or adjuvants for the treatment of diseases caused by RNA viruses.
  • RNA viruses belong to the families selected from the list comprising: Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retrovir ⁇ dae, Cystovir ⁇ dae, Reovir ⁇ dae, Birnavir ⁇ dae, Totivir ⁇ dae, Partitiviridae, Chrysovirida Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, FILOVIRIDAE, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae, narnaviridae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequivirida
  • RNA viruses are selected from the list comprising: Poliovirus, Rhinovirus, Encephalomyocarditis virus, FMD virus ⁇ Aphtovirus), Hepatitis A virus, Hepatitis C virus, Swine fever virus Classical (PPC), bovine viral diarrhea virus, Friend Murine Leukemia virus, Moloney Murine Leukemia virus (MMLV), Rous sarcoma virus, human immunodeficiency virus (HIV), Plautia intestinal virus stali, Rhopalosiphum padi virus, Cricket paralysis virus, Triatoma virus and Kaposi's sarcoma virus.
  • the RNA virus is the Classical Swine Plague virus.
  • nucleotide refers to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • Fig. 1 In vitro section of the ribozyme of Synechocystis sp. on the RNA fragment 1-770 nt of the genome of classical swine fever virus (PPC).
  • the test was carried out in a volume of 100 ⁇ l for 1 hour and at a temperature of 37 0 C.
  • the ribozyme, at a concentration of 135nM was pre-incubated in reaction buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM MgCI2 and 1 M KCI), and 4% PEG 2ou RNAsin for 15 minutes at 37 0 C before adding the substrate cutting: PPC 1-770nt RNA at a concentration of 1.8 nM.
  • the reaction was stopped by incorporating two volumes of loading buffer into the reaction tube and the resulting cut products were resolved in 4% acrylamide gel, 7 M urea, being visualized by autoradiography.
  • a reaction control can be observed in the left lane in which the PPC RNA was incubated in a buffer without ribozyme. Then the reaction with the ribozyme in which differential cutting bands are observed with respect to the control indicated by arrows. Molecular weight markers are found in the right lane. Some of the cutting bands, marked by arrows as 1 and 2, were isolated from gel and by 5 'RACE technique and subsequent cloning and sequencing their ends were determined at 5'. Both the band 1 and the band 2 resulted in the cut occurring between the bases 354-355. Fig. 2. Antiviral effect of ribozyme.
  • Fig. 3 The transfection of the ribozyme (lanes 3) does not induce the general inhibition of protein synthesis, while the transfection of the double stranded poly I: C RNA (lanes 4), yes.
  • the ribozyme molecule was synthesized by in vitro transcription using the Megascript kit (Ambion) from plasmid pT76803 digested with the restriction enzyme Dral.
  • This plasmid contains the RNA subunit gene of RNase P belonging to the cyanobacterium Synechocystis sp. 437 nt in length, under the promoter of the T7 RNA polymerase.
  • the catalytic RNA is purified by commercial column Megaclear (Ambion).
  • ribozyme activity was calibrated in a concentration range of 0.5 to 250 nM using the natural substrate RNA corresponding to the pretRNA-Gln precursor of Synechocystis sp. internally labeled with the radioactive isotope [ ⁇ -P32] GTP. The concentration used in the cutting tests was chosen based on these calibration results.
  • the ribozyme was pre-incubated in reaction buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM MgCI2 and 1 M KCI), 4% PEG and 2OU RNAsin (Promega) for 15 minutes at 37 0 C before adding the cutting substrate at a final concentration of 1'8 nM.
  • reaction buffer 50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM MgCI2 and 1 M KCI
  • PEG and 2OU RNAsin Promega
  • the reaction was stopped by incorporating two volumes of loading buffer (0.3% bromophenol blue, 0.3% xylencianol, 1OmM EDTA pH 7.5 and 97.5% deionized formamide) to the reaction tube and the resulting cutting products were resolved in 4% acrylamide gel, 7 M urea, being visualized by autoradiography ( Figure 1).
  • loading buffer 0.3% bromophenol blue, 0.3% xylencianol, 1OmM EDTA pH 7.5 and 97.5% deionized formamide
  • PK-15 cells (porcine kidney derived cell line) were seeded in 24-well culture plates (m24), approximately 105 cells per well, in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum (STF). The next day the medium was changed by Optimem (Gibco) medium and the transfection mixtures were prepared using the Lipofectin reagent (Invitrogen) and the conditions recommended by the manufacturer. The transfection mixture, for 4 wells, contained 2 ⁇ g of ribozyme and 20 ⁇ l of lipofectin, in a final volume of 250 ⁇ l of Optimem per well. As a control, a transfection mixture without ribozyme was prepared under identical conditions.
  • the transfection mixture was added to the cell monolayers and incubated 3 h at 37 0 C.
  • the medium was then changed to 250 ⁇ l of DMEM medium supplemented with 1% STF, containing classical swine fever virus (strain Comfort) at a multiplicity of infection of approx. 0.5 TCID (tissue culture infectious dose) per cell.
  • DMEM medium supplemented with 1% STF.
  • the medium was aspirated and the total cellular RNA was collected using the TriReagent reagent (Sigma), 250 ⁇ l per well, and the conditions recommended by the manufacturer.
  • the viral RNA was then quantified by Real Time RT-PCR in a Light Cycler thermocycler (Roche), using the LightCycler RNA Amplification Kit SYBR Green I (Roche) and the oligonucleotides PPC-A (SEQ ID NO: 2) and PPC -D (SEQ ID NO: 3) as firsts.
  • the cells were transfected with ribozyme as described in the previous section. As controls, non-transfected cells, cells transfected without RNA and cells transfected with poly (I: C) were used. At 8 h post-transfection the culture medium was replaced by medium without methionine and 2 h then changed to 250 ⁇ l of medium without methionine containing 50 ⁇ Ci of 35 S-Methionine. After 2 h of incubation, the cell extracts were collected in lysis buffer, resolved on a 10% polyacrylamide gel and the incorporated radioactivity was visualized by autoradiography. To quantify the incorporated radioactivity, the ImageGauge (Fujifilm) image analysis program on the digitized image was used.
  • ImageGauge Flujifilm
  • RNA from transfected and infected cells as described above was used as a template to synthesize a copy of cDNA by reverse transcription (first. AI ⁇ 751-R, SEQ ID NO: 4).
  • terminal transferase was used to add a tail of poly (A) at the 3 'end of the cDNA, followed by two rounds of PCR (nested PCR) using in each one a specific first of the viral sequence (AIf 626-R SEQ ID NO: 5 and AI ⁇ 601-R SEQ ID NO: 6) and another complementary to the poly (A) glue, supplied in the kit. Finally the product of the PCR is visualized on a 2% agarose gel and cloned using the pGEM-T-Easy system (Promega).
  • RNAs containing the sequence corresponding to the 5 'end of the genome of the indicated viruses, and labeled with 32 P were incubated in the presence and in the absence of the ribozyme of Synechocystis sp., Under the conditions described in materials and methods. The RNAs were then resolved on a 4% denaturing polyacrylamide gel and visualized by autoradiography. As can be seen in Figure 1, in the presence of ribozyme, the appearance of a smaller band is observed, corresponding to the ribozyme cutting product.
  • PK-15 cell cultures (cell line from pig kidney and susceptible to replication of the classical swine fever virus) were transfected with ribozyme, as described in materials and methods. As a control, cells were transfected in parallel with a transfection mixture that did not contain RNA. In some experiments (not shown), cells transfected with an irrelevant RNA were used as a negative control, obtaining the same results. At 3 h the transfection medium was replaced by means containing classical swine fever virus (Alfort strain).
  • FIG. 2 shows the result of 2 representative experiments. As can be seen in the figure, in the presence of ribozyme the amount of viral RNA at 24 h post-infection is reduced between 2 and 10 times compared to controls without ribozyme. 3.- The transfection of the ribozyme does not induce a generalized blockade of protein synthesis in the cell.
  • the 5 'RACE technique (Rapid Amplification of cDNA Ends) was used. This technique allows to identify the 5 'end of an RNA molecule. As can be seen in Figure 5, in transfected cells without ribozyme, the majority amplified product corresponds to the expected size when amplifying the sequence corresponding to the intact genomic viral RNA. Without However, when the RACE technique was applied to RNA from cells transfected with Ribozyme, the majority amplified product corresponded to a smaller size. The PCR product was cloned and sequenced to determine the exact point of cut by the ribozyme.
  • the sequence reveals that the first nucleotide corresponding to the viral sequence is nucleotide 366, which suggests that the cutting by the ribozyme takes place between nucleotides 365 and 366.
  • This cut-off point (8 nucleotides before the initiation codon of the polyprotein ) is compatible with the cutting result obtained in the in vitro cutting experiments (figure 1), only 11 nt upstream. The non-accuracy may be due either to a small degradation of the viral RNA inside the cell, or to a small difference in the ribozyme cutting zone in vivo and in vitro.
  • the cut-off point of the human RNase P activity tested in vitro on this PPC is located just between the cut-off points of the ribozyme in vitro and in vivo.

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Abstract

Uso de la RNasa P de Synechocysitis sp. para inhibir la replicación de virus de RNA, y para la elaboración de medicamentos para el tratamiento de enfermedades provocadas por virus de RNA.

Description

USO DE LA RNASA P COMO AGENTE ANTIVIRAL.
La presente invención pertenece al campo de Ia biología, biología molecular y Ia medicina, y en concreto se refiere al uso de Ia RNasa P para inhibir Ia replicación de virus de RNA, y para Ia elaboración de medicamentos para el tratamiento de enfermedades provocadas por virus de RNA.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las ribozimas (de ribonucleic acid enzyme), llamadas también enzimas de RNA ó RNA catalítico, son moléculas de RNA que catalizan reacciones químicas.
Fue durante los años 80 cuando se describió que el RNA podía presentar actividad catalítica. Inicialmente se detectó que era capaz de catalizar reacciones de procesamiento del RNA y más tarde esta propiedad catalítica se extendió a un buen número de reacciones bioquímicas distintas. Una de las dos primeras descripciones de reacciones catalizadas por RNA y por Ia que recibió el premio Nobel de química el Prof. Sydney Altman, fue Ia llevada a cabo por el RNA de Ia actividad RNasa P.
La RNasa P es una endonucleasa que se encuentra presente en todos los organismos vivos (Bacteria, Eukarya y Archaea). Lleva a cabo una reacción enzimática simple, Ia hidrólisis de un puente fosfodiester específico en los precursores del tRNA (pre-tRNA). Procesa el precursor del tRNA en Ia terminación 5' dando lugar a Ia forma madura del tRNA. En E. coli Ia responsable de Ia actividad natural es una ribonucleoproteína compuesta por una subunidad proteica, y otra de RNA. A Ia parte de RNA se Ie llamó M1. Se demostró in vitro, que Ia actividad catalítica residía en el RNA, mientras que Ia parte proteica no era necesaria, y simplemente podía ser sustituida por una mayor concentración de sales en Ia reacción (Altman 1989. Adv Enzymol Relat Áreas Mol Biol 62: 1-36).
Posteriormente se valoró el potencial terapéutico de esta molécula evaluando si podía ser dirigida específicamente contra un RNA patógeno: RNAs víricos, de oncogenes, o de resistencia a antibióticos en bacterias. Para eso, se diseñaron construcciones derivadas de Ia ribozima M1 adicionando a ésta Io que se vino a denominar como secuencias guía. Estas secuencias guía son secuencias cortas (-12 bases) que se unen covalentemente al extremo 3' RNA de M1 y que son complementarias al RNA patógeno (Altman 1995. Biotechnology (N Y) 13, 327-329). La hibridación de Ia secuencia guía con el RNA patógeno aproxima a este a Ia ribozima M1 , que acaba provocando su procesamiento e inactivación (Liu & Altman, 1995. Genes & Dev. 9: 471-480).
Generalmente, los virus de RNA presentan tasas de mutación muy elevadas, y por tanto un alto grado de variabilidad genética. Esto sucede porque las ARN polimerasas carecen - a diferencia de las ADN polimerasas- de sistema que puedan detectar y corregir los errores (reparación del ARN). Los virus de RNA, gracias a Ia velocidad con que se replican, explotan Ia variación genética como un mecanismo para escapar de Ia presión de selección del sistema inmune de sus huéspedes, o de fármacos antivirales, que intentan impedir su replicación. Es casi inevitable que cuando se ataca a una población de virus con un fármaco antiviral, surja una mutación que confiere resistencia al fármaco. Los virus resistentes prosperan y se replican en gran número, para después diseminarse. Con el tiempo, los virus resistentes terminan por predominar y un fármaco antiviral que solía dar buenos resultados pierde su eficacia. Los individuos afectados por este tipo de virus, incluso aquellos que no han recibido nunca tratamiento, pueden tener una variedad de virus ('quasiespecies') entre los que se encuentran aquellas variantes que no responden del mismo modo al tratamiento. Así, las estrategias tradicionales de prevención y tratamiento de afecciones virales se están haciendo obsoletas, hasta el punto de que no existen vacunas o agentes antivirales para muchas enfermedades virales en animales y humanos.
En 2002 se demostró (Nadal et al., 2002. J Biol Chem 277: 30606-30613) que Ia RNasa P humana, un complejo de al menos 9 proteínas y un RNA eran capaces de reconocer y cortar in vitro el RNA del virus de Ia hepatitis C de forma específica en dos regiones, una de ellas justo en Ia entrada interna del ribosoma (IRES de internal ríbosome entry site) de HCV, una región que es esencial para Ia reproducción vírica.
Utilizando modelos en cultivo se obtuvieron evidencias de que esta reacción no forma parte del ciclo viral (Pirón et al., 2005. Nucleic Acids Res 33: 1487-1502), probablemente porque Ia actividad RNasa P reside en el núcleo, mientras que el virus se reproduce en el citoplasma. La detección de Ia sensibilidad a Ia RNasa P humana se generalizó a los pestivirus animales (Lyons & Robertson, 2003. J Biol Chem 278, 26844-26850), picornavirus (Serrano et al., 2007. RNA 13:849-859) y a otro virus de insectos.
Esto permitía pensar que un RNA catalítico derivado de alguna bacteria e introducido en el interior celular podría cortar in vivo el RNA del virus de Ia hepatitis C o de los pestivirus animales relacionados. Sin embargo, pruebas posteriores mostraron Ia incapacidad de Ia ribozima de M1 de E. coli para procesar el RNA de HCV en el IRES, pero encontramos que el RNA (RNasa P) catalítico de Ia cianobacteria Synechocysitis sp., si era capaz de procesarlo específicamente in vitro (Sabariegos et al., 2002. FEBS Lett 577: 517-522).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de Ia presente invención han observado que Ia ribozima de Ia cianobacteria (Synechocystis sp.) que se había mostrado activa contra el RNA de hepatitis C in vitro también Io es contra el RNA de los pestivirus animales relacionados peste porcina clásica (PPC) y diarrea viral bovina (BVDV) in vitro. Esto les ha permitido ensayar Ia actividad de Ia ribozima natural contra el IRES del virus de Ia peste porcina clásica in vivo, demostrando Ia actividad de Ia ribozima en el interior celular inhibiendo Ia reproducción viral, y que esta inhibición viral no se debe a ningún efecto inespecífico de inhibición del metabolismo celular por Ia introducción del RNA. Esto supone una serie de ventajas clave respecto a Ia tecnología preexistente:
1- no es necesario modificar Ia secuencia natural de un ribozima, para que este sea activo en el interior celular contra un virus de RNA, 2- Ia RNasa P reconoce estructuras miméticas al tRNA en sus RNAs sustrato. La RNasa P reconoce todos los tRNAs celulares, independientemente de las variaciones de secuencia de estos. Incluso se ha demostrado que Ia RNasa P humana puede reconocer tRNAs bacterianos y viceversa. Es decir, Ia actividad de Ia RNasa P es independiente de Ia variación de Ia secuencia de bases que conforman Ia estructura del RNA sustrato, siempre que este mantenga una estructura mimética al tRNA. Incluso se ha observado que variaciones en las posiciones adyacentes al punto de corte en el caso del RNA de hepatitis C no afectan a Ia actividad. Esta propiedad minimiza el efecto de Ia enorme variabilidad que presentan estos virus y que les permite evadir cualquier droga, ya que es posible postular que, aquellas mutaciones que modificasen Ia estructura de tipo tRNA para evadir Ia actividad del ribozima, supondrían también una pérdida de su función biológica.
Por tanto, un primer aspecto de esta invención se refiere al uso de una secuencia nucleotídica, de ahora en adelante secuencia nucleotídica de Ia invención, que se selecciona de entre: a) moléculas de ácido nucleico que comprenden Ia SEQ ID NO: 1 , ó b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con
Ia secuencia polinucleotídica de a), para inhibir Ia replicación de virus de RNA.
La SEQ ID NO: 1 recoge Ia secuencia de nucleótidos de Ia ribozima RNAasa P aislada de Ia especie Synechocystis sp. del Superreino Bacteria, Phylum Cyanobactería, Orden Chroococcales.
Cuando se compara Ia secuencia de Ia RNasa P (de Synechocystis sp.) con Ia secuencia de otras RNAasa P aisladas en otras especies, es evidente que existen ciertas regiones que están más conservadas que otras. Esta información puede ser indicativa de que esas zonas son cruciales para mantener Ia estructura o función de Ia ribozima. Al estudiar Ia estructura secundaria de las RNasas P bacterianas se han reconocido dos tipos estructurales distintos (tipo A y tipo B). El tipo A es Ia forma ancestral, mientras que el tipo B emergió posteriormente con el linaje Gram positivo. El RNasa P se organiza en dominios estructurales: el dominio I, involucrado en el reconocimiento de Ia T-loop de los pre-tRNAs, y que forma Ia parte "superior" de Ia RNasa P, y el Dominio II, que incluye Ia mitad "inferior" y que comprende Ia mayoría de los nucleótidos que parecen involucrados en Ia formación del sitio catalítico.
Por tanto las regiones activas que determina Ia especificidad de las RNasas P conservadas importantes para Ia actividad de Ia ribozima, estarán más conservadas entre distintas RNAsas P, mientras que en otras regiones Ia divergencia será mayor. Se han propuesto estructuras consenso (Massire et al., 1998. JMB 279: 773-793). Así pues, una realización preferida de este aspecto de Ia invención se refiere al uso de un fragmento de Ia secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 , que posee Ia actividad catalítica de Ia ribozima RNAasa P de Synechocystis sp., para inhibir Ia replicación de los virus de RNA.
Además, por todo Io dicho anteriormente, puede esperarse que Ia identidad global de las RNAsas P homologas a Ia RNasa P aislada de Ia especie Synechocystis sp., a nivel de Ia secuencia nucleotídica que se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 , sea de un 70% o mayor, y más preferiblemente de un 80% o mayor y más preferiblemente de un 90, o un 95% o mayor. La correspondencia entre Ia secuencia nucleotídica de la(s) RNasa(s) P putativa(s) y Ia secuencia de otras RNasas P se puede determinar por métodos conocidos en Ia técnica. Por ejemplo, aquéllas se pueden determinar por una comparación directa de Ia información de secuencia nucleotídica procedente de Ia RNAsa P homologa putativa, y Ia secuencia nucleotídica que se recoge en Ia SEQ ID NO: 1 de esta memoria.
Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia secuencia de nucleótidos de RNAsa P presenta una identidad de, al menos, un 70% con Ia SEQ ID NO: 1 , preferiblemente al menos de un 80%, más preferiblemente al menos de un 90% y aún más preferiblemente al menos de un 95%.
El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a Ia semejanza entre dos o más secuencias de nucleótidos. Puesto que dos secuencias se consideran homologas si tienen el mismo origen evolutivo o si tienen función y estructura similares, en general, se asume que valores superiores de similitud o identidad del 70% indicarían homología. Podemos considerar por tanto que porcentajes de identidad de al menos un 80% mantendrán Ia función RNAasa P de dicha secuencia.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a Ia proporción de nucleótidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de Ia técnica e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl); BLAST o BLASTN, y FASTA (Altschul et al., J. Mol. BIoI. 215: 403-410 (1999). Adicionalmente, el algoritmo de Smith Waterman debe usarse para determinar el grado de identidad de dos secuencias.
El término "fragmento" ó "derivado" de una secuencia "que posea Ia actividad catalítica de Ia RNAasa P", se refiere a fragmentos derivados de Ia RNAasa P de Synechocystis sp en su estado natural que carecen de algún o algunos nucleótidos, y que aún actúan inhibiendo Ia replicación de los virus de RNA. Alternativamente este término también se refiere a secuencias derivadas de Ia RNAasa P de Synechocistys sp. natural, donde se ha cambiado uno o más nucleótidos, se han eliminado, o añadidos, y/o que hayan sufrido inversiones o duplicaciones. Tales modificaciones se hacen preferentemente mediante tecnología recombinante. También pueden hacerse otras modificaciones mediante alteraciones químicas de Ia RNasa P. La secuencia resultante (o los fragmentos derivados del mismo) pueden ser producidos recombinantemente, y retener características idénticas, o esencialmente idénticas a Ia RNasa P natural de Synechocystis sp.
En esta memoria se entiende por "virus de RNA" ó "virus de ARN" a un virus que usa ácido ribonucleico (RNA) como material genético, o bien que en su proceso de replicación necesita el RNA. Por ejemplo, el virus de Ia Hepatitis B es un virus clasificado como virus RNA, aunque su genoma es ADN de doble cadena, ya que el genoma es trascrito en RNA durante Ia replicación. Su ácido nucleico es usualmente RNA monocatenario pero también puede ser RNA bicatenario. Los virus RNA monocatenarios pueden clasificarse, según el sentido o polaridad de su RNA en negativos o positivos. Los virus RNA positivos son idénticos al RNA mensajero (RNAm) viral y por Io tanto pueden ser inmediatamente traducidos por Ia célula huésped. El RNA viral negativo es complementario del RNAm y por Io tanto debe convertirse en RNA positivo por una RNA polimerasa antes de Ia traducción.
Los retrovirus, al contrario que otros virus RNA monocatenarios, usan ADN intermedio para replicarse. La transcriptasa inversa, una enzima viral procedente del propio virus, convierte el RNA viral en una cadena complementaria de DNA, que se copia para producir una molécula de ADN bicatenario viral. Este DNA dirige Ia formación de nuevos viriones. Los virus ARN pertenecen a los grupos NI-VII de Ia Clasificación de Baltimore.
Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, los virus de RNA cuya replicación es inhibida por Ia secuencia de nucleótidos de Ia invención pertenecen a los grupos 11 I-VI I de Ia Clasificación de Baltimore. En una realización aún más preferida de este aspecto de Ia invención, el virus pertenece a cualquiera de las familias que se seleccionan de Ia lista que comprende: Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retrovirídae, Cystoviridae, Reovirídae, Birnaviridae, Totivirídae, Partitivirídae, Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxovirídae, Orthomyxovirídae, Bunyavirídae, Arenavirídae, Levivirídae, Narnaviridae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyvirídae, Caliciviridae, Astroviridae, Nodavirídae, Tetravirídae, Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flavivirídae, Togavirídae, Bromovirídae, Tymoviridae, Closterovirídae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que se seleccionan de Ia lista que comprende: Varícosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus,
Hepadnaviridae es una familia de virus que causan infecciones en hígado de humanos y de animales. Comprende dos géneros:
Género Orthohepadnavirus; especie tipo: Virus de Ia hepatitis B Género Avihepadnavirus; especie tipo: Virus de Ia hepatitis B del pato.
Caulimoviridae es una familia de virus ADN retrotranscritos (o pararetrovirus), que no presentan envoltura. Las partículas del virus contienen una nucleocápside de dos posibles formas: baciliforme o isométrica. Todos los virus de esta familia infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Badnavirus; especie tipo: Virus del moteado amarillo de Commelina.
Género Caulimovirus; especie tipo: Virus del mosaico de Ia coliflor
Género Tungrovirus; especie tipo: Virus baciliforme del tungro del arroz. Género Soymovirus; especie tipo: Virus del moteado clorótico de Ia soja.
Género Cavemovirus; especie tipo: Virus del mosaico veteado de Ia yuca. Género Petuvirus; especie tipo: Virus del veteado claro de Ia petunia.
Pseudovirídae es una familia de virus que infecta hongos e invertebrados. La familia incluye los siguientes géneros: Género Pseudovirus; especie tipo: Virus Ty1 de Saccharomyces cerevisiae.
Género Hemivirus; especie tipo: Virus copia de Drosophila melanogaster.
Metaviridae es una familia de virus que se insertan como retrotransposones en el genoma de un huésped eucarionte. La familia incluye los siguientes géneros: Género Metavirus; especie tipo: Virus Ty3 de Saccharomyces cerevisiae. Género Errantivirus; especie tipo: Virus gypsy de Drosophila melanogaster. Género Semotivirus; especie tipo: Virus Tas de Ascarís lumbrícoides.
Retroviridae es una familia de virus que comprende los retrovirus. Son virus con envoltura Los retrovirus son responsables de muchas enfermedades, incluyendo algunos cánceres y el SIDA (VIH). La familia incluye los siguientes géneros:
Género Alpharetrovirus; especie tipo: Virus de Ia leucosis aviar.
Género Betaretrovirus; especie tipo: Virus del tumor mamario del ratón.
Género Gammaretrovirus; especie tipo: Virus de Ia leucemia murina; otra: Virus de Ia leucemia felina. Género Deltaretrovirus; especie tipo: Virus de Ia leucemia bovina; otra:
Virus linfotrópico T humano, causante de cáncer.
Género Epsilonretrovirus; especie tipo: Virus del sarcoma cutáneo del Walleye, que afecta a peces.
Género Lentivirus; especie tipo: Virus de Ia inmunodeficiencia humana 1 ; otras: Virus de Ia inmunodeficiencia del simia, Virus de Ia inmunodeficiencia felina.
Género Spumavirus; especie tipo: Virus espumoso del chimpancé.
Cystoviridae es una familia de virus infectivos para bacterias Gram negativas (bacteriófagos). El único género de Ia familia es Cystovirus. Reoviήdae es una familia de virus ARN de vertebrados que pueden afectar al sistema gastrointestinal (como los Rotavirus) y a las vías respiratorias del huésped. El nombre de "Reovirídae" se deriva de "virus respiratorio entérico huérfano", en donde el término "virus huérfano" hace referencia al desconocimiento de alguna enfermedad a Ia que poder asociar al virus. Aunque recientemente han sido identificadas diversas enfermedades causadas por los virus de Ia familia Reovirídae, el nombre original aún se utiliza.
Género Orthoreovirus; especie tipo: Orthoreovirus de los mamíferos.
Género Orbivirus; especie tipo: Virus de Ia lengua azul. Género Rotavirus; especie tipo: Rotavirus A, una causa común de diarrea.
Género Coltivirus; especie tipo: Virus de Ia fiebre por garrapatas de Colorado (CTFV).
Género Aquareovirus; especie tipo: Aquareovirus A. Género Cypovirus; especie tipo: Cypovirus 1 (CPV 1 ).
Género Fijivirus; especie tipo: Virus de Ia enfermedad de Fiji.
Género Phytoreovirus; especie tipo: Virus del enanismo del arroz.
Género Oryzavirus; especie tipo: Virus del raquitismo andrajoso del arroz. Género Idnoreovirus; especie tipo: Idnoreovirus 1.
Género Mycoreovirus; especie tipo: Mycoreovirus 1 .
Birnaviridae es una familia de virus que afecta a animales. Incluye los siguientes géneros: Género Aquabirnavirus; especie tipo: Virus de Ia necrosis pancreática infecciosa.
Género Avibirnavirus; especie tipo: Virus de Ia enfermedad bursal infecciosa.
Género Entomobirnavirus; especie tipo: Virus X de Ia Drosophila.
Totiviridae es una familia de virus que afecta a animales. Incluye los siguientes géneros:
Género Totivirus; especie tipo: Virus L-A de Saccharomyces cerevisiae. Género Giardiavirus; especie tipo: Virus de Giardia lamblia. Género Leishmaniavirus; especie tipo: Virus ARN de Leishmania 1 -1 . Partitiviridae es una familia de virus que infectan a plantas y hongos. La familia comprende actualmente tres géneros:
Género Partitivirus, por ejemplo, Virus de Atkinsonella hypoxylon (AhV) (infecta a un hongo). Género Alphacryptovirus, por ejemplo, Virus críptico del trébol blanco 1
(WCCV-1 ).
Género Betacryptovirus, por ejemplo, Virus críptico del trébol blanco 2 (WCCV-2).
Chrysoviridae es una familia de virus que infectan a hongos, en particular a Penicillium.
Hypovirídae es una familia de virus que afecta a hongos. Se conoce un sólo género, Hypovirus.
Bornaviridae es una familia de virus que contiene una única especie, el virus de Ia enfermedad de Borna. La enfermedad de Borna es un síndrome infeccioso neurológico de los animales de sangre caliente, que causa comportamiento anormal y de mortalidad. Inicialmente fue identificado en el ganado ovino y en los caballos de Europa, y desde entonces se ha encontrado en una gran variedad de animales de sangre caliente incluyendo aves, ganado, perros y primates en Europa, Asia, África y América del Norte. Aunque el virus es considerado principalmente como el agente causal de Ia enfermedad en caballos y otros animales, recientes hallazgos parecen indicar que el virus de Borna puede desempeñar un papel en algunos desórdenes humanos neurológicos y psiquiátricos incluyendo el trastorno bipolar y Ia depresión.
Rhabdoviridae es una familia de virus infectivos para animales y plantas. Entre los animales infectados están insectos, peces y mamíferos, incluidos los humanos. Rhabdoviridae es una familia de virus infectivos para animales y plantas. Entre los animales infectados están insectos, peces y mamíferos, incluidos los humanos. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Cytorhabdovirus; especie tipo: Virus de Ia necrosis amarilla de Ia lechuga. Género Ephemerovirus; especie tipo: Virus de Ia fiebre efímera bovina.
Género Lyssavirus; especie tipo: Virus de Ia rabia. Género Novirhabdovirus; especie tipo: Virus de Ia necrosis hematopoyética infecciosa.
Género Nucleorhabdovirus; especie tipo: Virus del enanismo amarillo de Ia patata. Género Vesiculovirus; especie tipo: Virus de Ia estomatitis vesicular.
Adicionalmente se conoce un gran número de virus que todavía no han sido asignados a ningún género.
Filovirídae es una familia de virus del orden Mononegavirales. Causan serias fiebre hemorrágica virales, caracterizadas por anormalidades en el sangrado y en coagulación sanguínea, incluyendo el sangrado difuso. El virus Ébola destruye el sistema inmunológico. Incluye los géneros: Género Marburgvirus. Género Ebolavirus.
Los paramixovirus son miembros de Ia familia de virus Paramyxoviridae, infectivos para animales. Paramixovirus son retrovirus responsables de distintas enfermedades humanas, como el sarampión y las paperas; dos de los virus se sabe que provocan neumonía en los humanos: el virus sincicial respiratorio (VSR) y el de Ia Parainfluenza. El virus de Ia Parainfluenza también causa bronquitis y garrotillo (o croup), especialmente en los niños. Los Paramixovirus son también responsables de un determinado rango de enfermedades, como el moquillo canino, de entre otras especies animales. Sus géneros representativos son: Subfamilia Paramyxovirínae:
Género Avulavirus (especie tipo Newcastle disease virus) Género Henipavirus (especie tipo Hendravirus; incluye otros como Nipahvirus)
Género Morbillivirus (especie tipo Measles virus; incluye otros como Rinderpest virus, Canine distemper virus, phocine distemper virus)
Género Respirovirus (especie tipo Sendai virus; incluye otros como Human parainfluenza viruses 1 y 3, así como el virus del resfriado común).
Género Rubulavirus (especie tipo Mumps virus; incluye otros como Simian parainfluenza virus 5, Menangle virus, Tioman virus) Género TPMV-like viruses (especie tipo Tupaia paramyxovirus)
Subfamilia Pneumovirínae: Género Pneumovirus (especie tipo virus respiratorio sincitial humano, incluye otros como el virus respiratorio sincitial bovino).
Género Metapneumovirus (especie tipo pneumovirus aviar, metapneumovirus humano). Virus no asignados a géneros:
Fer-de-Lance virus.
Nariva virus.
Tupaia paramyxovirus.
Salem virus. J virus.
Mossman virus.
Beilong virus.
Los Orthomyxoviridae son una famila de virus RNA que infectan a los vertebrados. Incluyen a los virus causante de Ia gripe. Incluye los géneros:
Influenzavirus A: aves y humanos, equinos, suinos, visón, focas, ballenas.
Influenzavirus B: humanos solamente. Influenzavirus C: humanos y suinos (rara enfermedad seria) Orthomyxovirus trasmitidos por garrapatas: infección humana ocasional.
El Bunyaviridae es una familia de virus ARN de vertebrados y plantas. Aunque por Io general se encuentran en artrópodos y roedores, ciertos virus de esta familia pueden infectar también a los humanos. La familia Incluye más de 300 miembros serológicamente distintos, divididos en 6 géneros, en tres grupos:
Grupo A: trasmitidos por artrópodos a vertebrados
Orthobunyavirus: encefalitis Bunyamera, encefalitis de La Cross, fiebre
Bwamba, fiebre por Guama, fiebre por Orepuche o Sambu.
Phlebovirus: fiebre del valle del Rift, fiebre de las moscas de Ia arena de Panamá y Brasil, fiebre de Ñapóles y Sicilia.
Uukuniemi
Nairovirus: fiebre hemorrágica del Congo y Crimea, enfermedad de Ia cabra de Nairobi.
Grupo B trasmitidos por artrópodos a plantas Tospovirus
Grupo C trasmitidos por roedores a otros mamíferos Hantavirus; Infecciones por Hantavirus: fiebre hemorrágica con síndrome renal y el síndrome pulmonar por Hantavirus.
Todos los virus de estos géneros infectan vertebrados, excepto los Tospovirus que sólo infectan artrópodos y plantas.
Arenaviridae es una familia de virus caracterizados por poseer un genoma constituido por dos segmentos de RNA de cadena simple. Los miembros del taxón se dividen en dos serotipos, que difieren tanto en su genética como en su distribución geográfica: el complejo del virus Lassa, del Viejo Mundo, y el complejo del virus Tacaribe, del Nuevo Mundo. La familia posee un único género, Arenavirus, cuya especie tipo es el virus de Ia coriomeningitis linfocitaria. Sus representantes afectan a vertebrados.
Leviviridae es una familia de virus infectivos para bacterias. Incluye: Género Levivirus; especie tipo: Fago MS2 de Enterobacteria
Género Allolevivirus; especie tipo: Fago Qβ de Enterobacteria
Narnaviridae es una familia de virus que infectan hongos. Comprende los siguientes géneros: Género Narnavirus; especie tipo: Narnavirus 20SRNA de
Saccharomyces cerevisiae.
Género Mitovirus; especie tipo: Mitovirus-1 NB631 de Cryphonectria parasítica.
Picornavirídae es una familia de virus infectivos para animales. Los picornavirus incluyen importantes patógenos para humanos y animales. Las enfermedades que causa son variadas, como el resfriado común, poliomielitis e infecciones crónicas en el ganado. Dos categorías principales son los Enterovirus y Rhinovirus. Los Enterovirus infectan al tracto entérico, mientras que los Rhinoviruses infectan principalmente nariz y garganta. Enterovirus (EV).
Enterovirus bovino (BEV) BEV-1 , BEV-2.
Enterovirus humano A 17 serotipos incluyendo virus coxsackie A y enterovirus.
Enterovirus humano B 56 serotipos incluyendo enterovirus, virus coxsackie B, echovirus y virus de Ia enfermedad vesicular porcina. Enterovirus humano C 13 serotipos incluyendo enterovirus y virus coxsackie A1.
Enterovirus humano D EV-68, EV-70, EV-9.
Poliovirus (PV), PV- 1 (cepa Mahoney), PV-2 (cepa Lansing), PV-3 (P3/Leon/37).
Enterovirus porcino (PEV) A PEV-8.
Enterovirus porcino B PEV-9, PEV-10.
Enterovirus A del simio SEV-A1. Entre los Rhinovirus: Rhinovirus humano A , 74 serotipos.
Rhinovirus humano B 25 serotipos. Hepatovirus:
Virus de Ia hepatitis A, Virus de Ia hepatitis A humano, virus de Ia hepatitis A del simio. Virus de a encefalomielitis aviar.
Cardiovirus:
Virus de Ia encefalomiocarditis, Virus Columbia SK, virus Maus Elberfeld, Mengovirus. Theilovirus: Virus de Ia encefalomielitis murina de Theiler, virus de Ia encefalomielitis humana de Vilyuisk, virus de Ia encefalomielitis de Ia rata. Aphthovirus:
Virus de Ia fiebre aftosa.
Virus de Ia rinitis equina A (ERAV). Parechovirus:
Parechovirus humano (HPeV) HPeV-1 , HPeV-2, HPeV-3.
Virus Ljungan Parechovirus del roedor. Erbovirus:
Virus de Ia rinitis equina B (ERBV), ERBV-1 , ERBV-2 Kobuvirus:
Virus Aichi.
Kobuvirus bovino Teschovirus:
Teschovirus porcino.
Dicistroviridae es una familia de virus que infectan insectos. Comprende las siguientes especies: Virus de Ia parálisis letal del áfido.
Virus celular de Ia reina negra (infecta abejas).
Virus infeccioso de Ia flacided de Bombyx morí (gusano de seda).
Virus de Ia parálisis del grillo. Virus C de Ia Drosophila.
Virus P de Himetobi.
Virus intestinal de Plautia stali (un pentatómito).
Virus de Rhopalosiphum padi (un áfido).
Virus del Tríatoma (vinchuca). Virus de Homalodisca coagulata 1 (HoCV-1 ) (una cicadella).
Virus de Solenopsis invicta 1 (SINV-1 ) (una hormiga roja). Estos virus todavía no han sido asignados a un género:
Virus de Acheta domesticus (un grillo).
Virus de Ia parálisis aguda de Ia abeja. Virus Israel de Ia parálisis aguda (en parte responsable de Ia reciente desaparición de abejas).
Virus Cachemira de Ia abeja.
Virus del síndrome Taura (camarones).
Marnaviridae es una familia de virus de Ia cual se conoce un sólo género, Marnavirus. La especie tipo infecta al alga microscópica Heterosigma akashiwo.
Sequiviridae es una familia de virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Sequivirus; especie tipo: Virus del moteado amarillo del rábano. Género Waikavirus; especie tipo: Virus esférico del tungro del arroz.
Comoviridae es una familia de virus que afectan a plantas. Comprende los siguientes géneros:
Género Comovirus; especie tipo: Virus del mosaico del caupí. Género Fabavirus; especie tipo: Virus del marchitamiento del haba. Género Nepovirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del tabaco.
Potyviridae es una familia de virus que infectan plantas. Incluye los siguientes géneros: Género Potyvirus; especie tipo: Virus Y de Ia patata. Género Rymovirus; especie tipo: Virus del mosaico del raigrás. Género Bymovirus; especie tipo: Virus del mosaico amarillo de Ia cebada. Género Macluravirus; especie tipo: Virus del mosaico de Ia Madura.
Género Ipomovirus; especie tipo: Virus del moteado suave de Ia patata. Género Tritimovirus; especie tipo: Virus del mosaico estriado del trigo.
Calicivirídae (del latín calix, "cáliz") es una familia de virus infectivos para animales y causantes de gastroenteritis en humanos. Los Calicivirus han sido encontradoso en Ia mayoría de los animales domésticos y muchos silvestres, como cerdos, conejos, gallinas y anfibios. Sus géneros representativos son: Género Vesivirus; especie tipo: Virus del Exantema Vesicular Porcino. Género Lagovirus; especie tipo: Virus de Ia Enfermedad Hemorrágica del Conejo.
Género Norovirus; especie tipo: Virus de Norwalk (gastroenteritis en humanos).
Género Sapovirus; especie tipo: Virus de Sapporo (gastroenteritis en humanos).
Astrovirídae es una familia de virus que infectan mamíferos y aves. La familia Astroviridae contiene dos géneros: Mamastrovirus que infecta a los mamíferos y Avastrovirus que infecta a aves. Dentro de cada género se conocen varias especies, cada una de las cuales se denomina en función del huésped que infecta. Además, cada especie es subclasificada en serotipos. La única cadena de ARN tiene una cola de poli A en el extremo 3', pero no 5' cap. Género Mamastrovirus Astrovirus bovino Astrovirus felino Astrovirus humano
Astrovirus ovino Astrovirus porcino Astrovirus de visón Género Avastrovirus Astrovirus del pollo
Astrovirus del pato Astrovirus del pavo Nodavirídae es una familia de virus que infectan animales. Su genoma es lineal y consta de 4.500 nucleótidos con un terminal cap 5' de metilato y un terminal 3' no de poliadenilato. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Alphanodavirus; especie tipo: Virus Nodamura. Género Betanodavirus; especie tipo: Virus de Ia necrosis nerviosa del lucio rallado.
Tetraviridae es una familia de virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros: Género Betatetravirus; especie tipo: Virus β de Nudaurelia capensis.
Género Omegatetravirus; especie tipo: Virus ω de Nudaurelia capensis.
Luteoviridae es una familia de virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros: Género Luteovirus; especie tipo: Virus del enanismo amarillo de Ia cebada.
Género Polerovirus; especie tipo: Virus del enrollado de Ia hoja de patata.
Género Enamovirus; especie tipo: Virus del mosaico enanizante del guisante 1 .
Tombusvidae es una pequeña familia de virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Tombusvirus; especie tipo: Virus del enanismo ramificado del tomate.
Género Carmovirus; especie tipo: Virus del moteado del clavel. Género Necrovirus; especie tipo: Virus A de Ia necrosis del tabaco. Género Dianthovirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del clavel. Género Machlomovirus; especie tipo: Virus del moteado clorótico del maíz.
Género Avenavirus; especie tipo: Virus del enanismo clorótico de Ia avena.
Género Aureusvirus; especie tipo: Virus latente del Pothos. Género Panicovirus; especie tipo: Virus del mosaico del Panicum. Arteriviridae es una familia de virus que infectan animales. La especie tipo es el virus de Ia arteritis equina (EAV), pero Ia familia incluye además el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), el virus de elevación de Ia lactato deshidrogenasa (LDV) del ratón y el virus de Ia fiebre hemorrágica del simio (SHFV).
Los Coronavirídae son una familia de virus ARN desarrollados e infecciosos, con más de 12 patógenos específicos de mamíferos y aves. Ambos 5' y 3' terminales del genoma tienen una cubierta y un politracto (A) respectivamente, incluyendo a los siguientes géneros:
Género Coronavirus; sp. tipo: Virus bronquitis infecciosa
Género Torovirus; sp. tipo: torovirus equino
Roniviridae es una familia de virus de Ia que se conoce un solo género, Okavirus. La especie tipo es el Virus asociado a las branquias, que infecta peces.
Flaviviridae es una familia de virus que se propagan principalmente por vectores artrópodos (especialmente garrapatas y mosquitos). Incluye los siguientes géneros:
Género Flavivirus (Ia especie tipo es el Virus de Ia fiebre amarilla, también incluye el Virus del NiIo Occidental y el Virus del dengue). Se han identificado en total 67 virus en humanos y animales.
Género Hepacivirus (Ia especie tipo es el Virus de Ia hepatitis C, único miembro).
Género Pestivirus (Ia especie tipo es Ia Virus de Ia diarrea bovina, también Virus de Ia peste porcina). Otras especies infectan mamíferos no humanos.
Las terminaciones 5' de Flavivirus presentan un cap del nucleótido metilato, mientras que otros miembros de esta familia no Io tienen y codifican un punto de entrada ribosómico.
Las principales enfermedades causadas por Ia familia Flaviviridae incluyen: Dengue, Encefalitis japonesa, Enfermedad de Kyasanur, Encefalitis del Valle de Murray, Encefalitis de San Luis, Meningoencefalitis de garrapata, Encefalitis del NiIo, Fiebre amarilla y Ia Hepatitis C Togaviridae es una familia de virus que incluye los siguientes géneros:
Género Alphavirus; especies típicas: Sindbis virus, Virus de Ia encefalitis equina oriental, Virus de Ia encefalitis equina occidental, Virus de Ia encefalitis equina venezolana, Virus del Río Ross, Virus O'nyong'nyong. Género Rubivirus; especies típicas: Rubéola virus.
La terminación o extremo 5' es un nucleótido metilado y el tercer término (extremo 3') tiene una cola poliadenilada de unos 70 nucleótidos, que recuerda a un ARN mensajero.
Bromoviridae es una familia de virus que infectan a plantas. Comprende las siguientes especies:
Género Alfamovirus; especie tipo: Virus del mosaico de Ia alfalfa.
Género llarvirus; especie tipo: Virus del estriado del tabaco.
Género Bromovirus; especie tipo: Virus del mosaico del Bromus. Género Cucumovirus; especie tipo: Virus del mosaico del pepino.
Género Oleavirus; especie tipo: Virus latente de Ia oliva 2.
Tymoviridae es una familia de virus monopartícula que infectan plantas. El genoma consiste de un gran marco abierto de lectura con un cap en el término 5'. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Tymovirus; especie tipo: Virus del mosaico amarillo del nabo Género Marafivirus; especie tipo: Virus del rayado fino del maíz Género Maculavirus; especie tipo: Virus del moteado de Ia vid El género más extenso es Tymovirus con 24 especies, mientras que los otros dos géneros, Marafivirus y Maculavirus contienen 4 y 2 especies, respectivamente.
Closteroviridae es una familia de virus que afectan a plantas. Comprende los siguientes géneros: Género Closterovirus; especie tipo: Virus de Ia amarillez de Ia remolacha.
Género Crínivirus; especie tipo: Virus de Ia amarillez infecciosa de Ia lechuga.
Género Ampelovirus; especie tipo: Virus del enrollado de las hojas de vid. Flexivirídae es una familia de virus que infectan plantas. La familia incluye los siguientes géneros:
Género Allexivirus; especie tipo: Virus X de Ia chalota.
Género Capillovirus; especie tipo: Virus del tallo ranurado del manzano. Género Carlavirus; especie tipo: Virus latente del clavel.
Género Foveavirus; especie tipo: Virus de las picaduras del tallo del manzano.
Género Mandarivirus; especie tipo: Virus de las manchas anilladas del mandarino. Género Potexvirus; especie tipo: Virus X de Ia patata.
Género Tríchovirus; especie tipo: Virus de las manchas cloróticas de Ia hoja del manzano.
Género Vitivirus; especie tipo: Virus A de Ia vid Especies no asignadas a un género: Virus del mosaico suave del banano.
Virus del moteado en anillo verde del cerezo.
Virus del moteado necrótico del cerezo.
Virus del manchado de Ia hoja del cítrico.
Barnavidae es una familia de virus de Ia que actualmente sólo se conoce un género, Barnavirus, cuya especie tipo es el Virus baciliforme de Ia seta.
El género Varícosavirus comprende virus de plantas asociados con Ia inflamación que causan en los tejidos vasculares. La infección ocurre a través del suelo por las esporas del hongo Olpidium brassicae.
El género Ophiovirus se caracteriza por una nucleocápside alongada y muy filamentosa con simetría helicoidal. La especie mejor estudiada de este género es el virus de Citrus psorosis.
El género Tenuivirus comprende virus de plantas que son transmitidos por artrópodos (de las familias Cicadellidae o Delphacidae) y que causan enfermedad en su hospedador, caracterizada por rayas cloróticas en las hojas afectadas.
En el género Deltavirus se encuentra el virus causante de Ia hepatitis D (Hepatitis delta virus o hepatitis D virus, HDV). El virus de Ia Hepatitis D: es un virus con genoma ARN de polaridad negativa, con cápside icosaédrica, y envoltura que corresponde a Ia envoltura del Virus de Ia Hepatitis B ( por Io tanto requiere de Ia coinfección con este virus para su desarrollo).
Los géneros Iflavirus, Sadwavirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus comprenden virus que infectan plantas y aún no se les ha asignado familia.
Todos los virus de RNA que inician Ia síntesis proteica mediada por una entrada interna del ribosoma (IRES) y que se han testado son portadores de estructuras sensibles a Ia RNasa P, bien sea esta de origen humano, y/o bacteriano. Entre estos virus se encuentra el virus de Ia hepatitis C, y otros virus de Ia Familia Flaviviridae y Picornaviridae. Así pues, en otra realización más preferida de Ia invención, el virus de RNA pertenece a Ia familia Flaviviridae. Dentro de Ia familia Flaviviridae se encuentran el virus de Ia Hepatitis C, el virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), y el virus de Ia diarrea viral bovina. Por tanto, en una realización aún más preferida de Ia invención, el virus de RNA se selecciona de Ia lista que comprende el virus de Ia Hepatitis C, el virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), y el virus de Ia diarrea viral bovina.
Dentro de Ia familia Picornaviridae se encuentra el virus de Ia Hepatitis A, el Poliovirus, el Rhinovirus, el virus de Ia encefalomiocarditis y el virus de Ia fiebre aftosa (Aphtovirus). Por tanto, en una realización aún más preferida de Ia invención, el virus de RNA se selecciona de Ia lista que comprende el virus de Ia Hepatitis A, el Poliovirus, el Rhinovirus, el virus de Ia encefalomiocarditis y el virus de Ia fiebre aftosa (Aphtovirus).
En otra realización más preferida de Ia invención, el virus de RNA se selecciona de Ia lista que comprende: virus de Ia Leucemia Murina de Friend, virus de Ia Leucemia Murina de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali,
Rhopalosiphum padi virus, virus de Ia parálisis Cricket, Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi. En todos estos virus se han detectado secuencias IRES. En esta memoria se entiende por "entrada interna del ribosoma" ó "infernal ribosome entry site" ó "IRES" a una secuencia nucleotídica que permite Ia iniciación de Ia síntesis proteica en el medio de Ia traducción del marco abierto de lectura de un RNA mensajero (mRNA o ARNm). A diferencia del mecanismo más conocido de traducción proteica en organismos eucariontes que requiere una modificación previa en el extremo 5' del mRNA mensajero para el ensamblaje de Ia maquinaria de traducción, las secuencias IRES son reconocidas por el complejo de pre-iniciación 43S, de manera que pueden comenzar Ia traducción del RNA mensajero pesar de carecer de modificación Cap en su extremo 5'. Recientemente se han encontrado secuencias IRES en mRNA de organismos eucariontes que se expresan en condiciones de estrés, en el ciclo celular y en mecanismos apoptóticos.
Otro aspecto se relaciona con el uso de una construcción genética que permite Ia transcripción de una secuencia nucleotídica de DNA a Ia secuencia nucleotídica de RNA de Ia invención, tal y como se ha descrito anteriormente.
Así, otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de una construcción genética, de aquí en adelante construcción genética de Ia invención, que dirige Ia trascripción in vitro o intracelular de Ia secuencia nucleotídica de Ia invención, y que comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de nucleótidos de DNA, preferiblemente de doble cadena, que comprende cualquiera de las secuencias que se transcribe in vitro o intracelularmente a Ia secuencia de nucleótidos de Ia invención, b) secuencia de nucleótidos de DNA, preferentemente de doble cadena, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende Ia secuencia según a) operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales {silencers), etc.. para inhibir Ia replicación de virus de RNA.
Múltiples de estos sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia y forman parte de Ia presente invención. Un "vector" es un replicón al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar Ia replicación y/o expresión del segmento unido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleótida dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar Ia expresión de las secuencias a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para Ia expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.
"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en Ia que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en Ia manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia que se transcribe a Ia secuencia nucleotídica de Ia invención, está ligada de tal manera que Ia expresión de Ia secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Tal como se usa "secuencia codificadora" en esta memoria, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que se transcribe al RNA de Ia invención cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, los virus de RNA pertenecen a las familias que se seleccionan de Ia lista que comprende: Hepadnavirídae, Caulimovirídae, Pseudovirídae, Metaviridae, Retrovirídae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Totiviridae, Partitiviridae, Chrysoviridae, Hypovirídae, Bornavirídae, Rhabdovirídae, Filovirídae, Paramyxovirídae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornavirídae, Dicistrovirídae, Marnavirídae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Calicivirídae, Astrovirídae, Nodavirídae, Tetravirídae, Luteovirídae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flaviviridae, Togavirídae, Bromoviridae, Tymovirídae, Closterovirídae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que se seleccionan de Ia lista que comprende: Varícosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus. En otra realización más preferida, el virus de RNA pertenece a Ia familia Picornavirídae. En otra realización más preferida, el virus de RNA pertenece a Ia familia Flaviviridae. En una realización aún más preferida el virus de RNA se selecciona de Ia lista que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de Ia encefalomiocarditis, virus de Ia fiebre aftosa {Aphtovirus), virus de Ia Hepatitis A, virus de Ia Hepatitis C, virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), virus de Ia diarrea viral bovina, virus de Ia Leucemia Murina de Friend, virus de Ia Leucemia Murina de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali, Rhopalosiphum padi virus, virus de Ia parálisis Cricket, Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi. En una realización particular de este aspecto de Ia invención, el virus de RNA es el virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC).
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de Ia invención, que comprende Ia secuencia nucleotídica de Ia invención, o Ia construcción genética de Ia invención.
Las composiciones de Ia presente invención pueden formularse para su administración a una planta ó animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular Ia fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.
Tales composiciones o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, Ia edad, peso, sexo, tolerancia,... de Ia planta ó animal. En el sentido utilizado en esta descripción,
Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de secuencia nucleotídica o construcción genética de Ia invención que produzcan el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en Ia materia.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia secuencia nucleotídica, Ia construcción genética o Ia composición farmacéutica de Ia invención como medicamento.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia secuencia nucleotídica, Ia construcción genética o Ia composición farmacéutica de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento.
El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en plantas, animales y/o en el hombre. En el contexto de Ia presente invención se refiere a Ia secuencia nucleotídica o Ia construcción genética de Ia invención, o a una composición que comprende Ia secuencia nucleotídica o Ia construcción genética de Ia invención con vehículos, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de las enfermedades provocadas por los virus de RNA.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de Ia secuencia nucleotídica, Ia construcción genética o Ia composición farmacéutica de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades provocadas por los virus de RNA. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, los virus de RNA pertenecen a las familias que se seleccionan de Ia lista que comprende: Hepadnaviridae, Caulimoviridae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retrovirídae, Cystovirídae, Reovirídae, Birnavirídae, Totivirídae, Partitiviridae, Chrysoviridae, Hypoviridae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filovirídae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyavirídae, Arenaviridae, Leviviridae, Narnaviridae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequivirídae, Comovirídae, Potyviridae, Calicivirídae, Astrovirídae, Nodaviridae, Tetraviridae, Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flavivirídae, Togavirídae, Bromovirídae, Tymoviridae, Closteroviridae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que se seleccionan de Ia lista que comprende: Varícosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus. En una realización más preferida, los virus de RNA pertenecen a Ia familia Picornaviridae. En otra realización más preferida, los virus de RNA pertenecen a Ia familia Flaviviridae.
Más preferiblemente, los virus de RNA se seleccionan de Ia lista que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de Ia encefalomiocarditis, virus de Ia fiebre aftosa {Aphtovirus), virus de Ia Hepatitis A, virus de Ia Hepatitis C, virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), virus de Ia diarrea viral bovina, virus de Ia Leucemia Murina de Friend, virus de Ia Leucemia Murina de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali, Rhopalosiphum padi virus, virus de Ia parálisis Cricket, Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi. En una realización particular de Ia invención, el virus de RNA es el virus de Ia Peste Porcina Clásica.
Los términos "nucleótido", "polinucleótido" y "ácidos nucleicos" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (RNA ó ARN) como desoxiribonucleótidos (DNA ó ADN).
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Corte in vitro de Ia ribozima de Synechocystis sp. sobre el fragmento de RNA 1-770 nt del genoma del virus de Ia peste porcina clásica (PPC).
El ensayo se llevó a cabo en un volumen de 100 μl durante 1 hora y a una temperatura de 37 0C. La ribozima, a una concentración de 135nM se preincubó en tampón de reacción (50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM MgCI2 y 1 M KCI), 4% PEG y 2OU RNAsin durante 15 minutos a 370C antes de añadir el sustrato de corte: PPC RNA 1-770nt a una concentración de 1.8 nM. La reacción se paró incorporando dos volúmenes de tampón de carga al tubo de reacción y los productos de corte resultantes se resolvieron en gel de acrilamida al 4%, 7 M urea, siendo visualizados por autoradiografía. En el carril izquierdo puede observarse un control de reacción en el cual el RNA de PPC fue incubado en buffer sin ribozima. A continuación Ia reacción con Ia ribozima en Ia que se observan bandas diferenciales de corte con respecto al control indicadas mediante flechas. Los marcadores de peso molecular se encuentran en el carril derecho. Algunas de las bandas de corte, marcadas por flechas como 1 y 2, fueron aisladas de gel y mediante técnica de 5' RACE y posterior clonaje y secuenciación se determinaron sus extremos en 5'. Tanto Ia banda 1 como Ia banda 2 dieron como resultado que el corte se producía entre las bases 354-355. Fig. 2. Efecto antiviral del ribozima.
Se muestran los resultados de 2 experimentos representativos. En el experimento A Ia ribozima supuso una reducción del RNA viral de unas 10 veces. En el experimento B, de unas 2 veces. En ambos casos las diferencias son estadísticamente significativas.
Fig. 3. La transfección del ribozima (carriles 3) no induce Ia inhibición general de Ia síntesis de proteínas, mientras que Ia transfección del RNA de doble cadena poly I:C (carriles 4), si.
Las bandas han sido cuantificadas mediante un programa de análisis de imágenes. Solo las muestras 4 son significativamente diferentes de las demás. 1.- Células no transfectadas, 2.- Células transfectadas sin ribozima, 3.- Células transfectadas con ribozima, 4.- Células tranfectadas con poly I:C.
Fig. 4. Ia transfección del ribozima (foto 4) no induce citotoxicidad, mientras que Ia transfección del RNA de doble cadena poly I:C (foto 3), si.
Fig. 5. Clonaje y secuenciación del producto de corte.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad de Ia RNAasa P como antiviral.
1.- Síntesis del ribozima RNAsa P de Synechocystis sp. por transcripción in vitro.
La molécula de ribozima se sintetizó mediante transcripción in vitro utilizando el kit Megascript (Ambion) a partir del plásmido pT76803 digerido con el enzima de restricción Dral. Este plásmido contiene el gen de Ia subunidad de RNA de Ia RNasa P perteneciente a Ia cianobacteria Synechocystis sp. de 437 nt de longitud, bajo el promotor de Ia T7 RNA polimerasa. El RNA catalítico se purificó mediante columna comercial Megaclear (Ambion). Posteriormente Ia actividad del ribozima se calibró en un rango de concentraciones de 0.5 a 250 nM utilizando para ello el RNA sustrato natural correspondiente al precursor pretRNA-Gln de Synechocystis sp. marcado internamente con el isótopo radiactivo [α-P32]GTP. La concentración empleada en los ensayos de corte se eligió en base a estos resultados de calibración.
2.- Ensayo de corte del RNA in vitro
La ribozima se preincubó en tampón de reacción (50 mM Tris-HCI, pH 7.5, 100 mM MgCI2 y 1 M KCI), 4% PEG y 2OU RNAsin (Promega) durante 15 minutos a 370C antes de añadir el sustrato de corte a una concentración final de 1 '8 nM. Estas condiciones iónicas fueron optimizadas en trabajos previos de Pascual y Vioque A. Ejemplifican el plegamiento correcto del ribozima para que pueda ejercer su actividad catalítica. El ensayo se llevó a cabo en un volumen de 10 μl durante 1 hora y a una temperatura de 37 0C. La reacción se paró incorporando dos volúmenes de tampón de carga (0.3% azul de bromofenol, 0.3% xilencianol, 1OmM EDTA pH 7.5 y 97.5% de formamida desionizada) al tubo de reacción y los productos de corte resultantes se resolvieron en gel de acrilamida al 4%, 7 M urea, siendo visualizados por autoradiografía (Figura 1 ).
3.- Ensayo de actividad antiviral en cultivo celular
Se sembraron células PK-15 (línea celular derivada de riñon porcino) en placas de cultivos de 24 pocilios (m24), aproximadamente 105 células por pocilio, en medio DMEM suplementado con 10% suero de ternera fetal (STF). Al día siguiente se cambió el medio por medio Optimem (Gibco) y se prepararon las mezclas de transfección utilizando el reactivo Lipofectina (Invitrogen) y las condiciones recomendadas por el fabricante. La mezcla de transfección, para 4 pocilios, contenía 2 μg de ribozima y 20 μl de lipofectina, en un volumen final de 250 μl de Optimem por pocilio. Como control se preparó una mezcla de transfección sin ribozima, en idénticas condiciones.
La mezcla de transfección se añadió a las monocapas celulares y se incubaron 3 h a 370C. A continuación se cambió el medio por 250 μl de medio DMEM suplementado con 1 % STF, conteniendo virus de Ia peste porcina clásica (cepa Alfort) a una multiplicidad de infección de aprox. 0.5 TCID (tissue culture infectious dose) por célula. Transcurrida 1 h de adsorción se retiró el inoculo y se sustituyó por medio DMEM suplementado con 1 % STF.
A las 24 h post-infección se aspiró el medio y se recogió el RNA celular total utilizando el reactivo TriReagent (Sigma), 250 μl por pocilio, y las condiciones recomendadas por el fabricante. A continuación se cuantificó el RNA viral mediante Real Time RT-PCR en un termociclador Light Cycler (Roche), utilizando el kit LightCycler RNA Amplification Kit SYBR Green I (Roche) y los oligonucleótidos PPC-A (SEQ ID NO: 2) y PPC-D (SEQ ID NO: 3) como prímers.
4.- Incorporación de 35S-Metionina
Las células se transfectaron con ribozima como se describe en el apartado anterior. Como controles se utilizaron células no transfectadas, células transfectadas sin RNA y células transfectadas con poly (I:C). A las 8 h post- transfección el medio de cultivo se sustituyó por medio sin metionina y 2 h después se cambió por 250 μl de medio sin metionina conteniendo 50 μCi de 35S-Metionina. Al cabo de 2 h de incubación se recogieron los extractos celulares en buffer de lisis, se resolvieron en un gel de 10% poliacrilamida y se visualizó Ia radiactividad incorporada mediante autoradiografía. Para cuantificar Ia radiactividad incorporada se utilizó el programa de análisis de imágenes ImageGauge (Fujifilm) sobre Ia imagen digitalizada.
5.- Clonaje y secuenciación del producto de corte del ribozima
Para amplificar el producto de corte dejado por el ribozima se utilizó el kit 573' RACE Kit, 2nd generation, de Roche, y las condiciones recomendadas por el fabricante. Brevemente, el RNA procedente de células transfectadas e infectadas como se describe anteriormente se utilizó como molde para sintetizar una copia de cDNA mediante transcripción reversa (primer. AIÍ751-R, SEQ ID NO: 4). A continuación se utilizó transferasa terminal para añadir una cola de poly(A) en el extremo 3' del cDNA, seguido por dos rondas de PCR (nested PCR) utilizando en cada una un primer específico de Ia secuencia viral (AIf 626-R SEQ ID NO: 5 y AIÍ601-R SEQ ID NO: 6) y otro complementario a Ia cola de poly(A),suministrado en el kit. Finalmente el producto de Ia PCR se visualizó en un gel de 2% agarosa y se clonó utilizando el sistema pGEM-T- Easy (Promega).
RESULTADOS
1.- Actividad catalítica del ribozima in vitro sobre el RNA de los virus de hepatitis C, diarrea viral bovina y peste porcina clásica.
RNAs conteniendo Ia secuencia correspondiente al extremo 5' del genoma de los virus indicados, y marcados con 32P se incubaron en presencia y en ausencia del ribozima de Synechocystis sp., en las condiciones que se describen en materiales y métodos. A continuación los RNAs se resolvieron en un gel de poliacrilamida 4% desnaturalizante y se visualizaron por autoradiografía. Como se puede ver en Ia figura 1 , en presencia de ribozima se observa específicamente Ia aparición de una banda de menor tamaño, correspondiente al producto de corte del ribozima.
2.- Ensayo de Ia actividad antiviral del ribozima en cultivos celulares infectados por el virus de Ia peste porcina clásica.
Cultivos de células PK-15 (línea celular procedente de riñon de cerdo y susceptible a Ia replicación del virus de Ia peste porcina clásica) se transfectaron con ribozima, según se describe en materiales y métodos. Como control, células fueron transfectadas en paralelo con una mezcla de transfección que no contenía RNA. En algunos experimentos (no mostrado) se utilizaron como control negativo células transfectadas con un RNA irrelevante, obteniéndose los mismos resultados. A las 3 h el medio de transfección se sustituyó por medio conteniendo virus de Ia peste porcina clásica (cepa Alfort).
A las 24 h post-transfección se obtuvo el RNA total de las células infectadas y se cuantificó el RNA viral mediante RT-PCR en tiempo real. La figura 2 muestra el resultado de 2 experimentos representativos. Como se puede ver en Ia figura, en presencia del ribozima Ia cantidad de RNA viral a las 24 h postinfección se reduce entre 2 y 10 veces respecto a los controles sin ribozima. 3.- La transfección del ribozima no induce un bloqueo generalizado de Ia síntesis de proteínas en Ia célula.
Para descartar Ia posibilidad de que el efecto antiviral detectado fuese debido a Ia activación de mecanismos de defensa no específicos que resultasen en una parada generalizada de Ia síntesis de proteínas, analizamos Ia incorporación de 35S-Metionina en células transfectadas con ribozima. Como controles negativos se utilizaron células no transfectadas y células transfectadas sin ribozima. Como control positivo se transfectó poly (I:C), un RNA de doble cadena sintético que induce Ia respuesta de Interferón de tipo I. Como se puede ver en Ia figura 3, Ia incorporación de 35S-Metionina en células transfectadas con ribozima no presentó diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) respecto a las células no transfectadas o transfectadas sin ribozima, mientras que las células transfectadas con poly (I:C) si experimentaron una reducción significativa en Ia síntesis de proteínas.
4.- La transfección del ribozima no aumenta de modo apreciable Ia mortalidad celular.
Paras descartar que Ia disminución en los niveles de replicación viral en células con ribozima pudiese ser debida a un aumento de Ia mortalidad celular, debida a toxicidad de Ia lipofectina o a Ia inducción de apoptosis en las células transfectadas, se observaron las células mediante microscopía, a las 24 h post- transfección. Como se puede apreciar en Ia figura 4, las monocapas celulares transfectadas con ó sin ribozima presentaban un aspecto similar al de las células control, mientras que las células transfectadas con poly (I:C) mostraban un grado alto de mortalidad, debida a Ia apoptosis inducida por Ia respuesta interferón de tipo I.
5.- Detección del producto de corte in vivo.
Para intentar detectar el producto de corte del ribozima en las células transfectadas e infectadas, se utilizó Ia técnica de 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Esta técnica permite identificar el extremo 5' de una molécula de RNA. Como se puede ver en Ia figura 5, en células transfectadas sin ribozima, el producto mayoritario amplificado corresponde al tamaño esperado al amplificar Ia secuencia correspondiente al RNA viral genómico intacto. Sin embargo, cuando se aplicó Ia técnica de RACE sobre RNA proveniente de células transfectadas con Ribozima, el producto mayoritario amplificado correspondía a un tamaño menor. El producto de PCR fue clonado y secuenciado para determinar el punto exacto de corte por el ribozima. La secuencia revela que el primer nucleótido correspondiente a Ia secuencia viral es el nucleótido 366, Io que sugiere que el corte por el ribozima tiene lugar entre los nucleótidos 365 y 366. Este punto de corte (8 nucleótidos antes del codón de iniciación de Ia poliproteína) es compatible con el resultado de corte obtenidos en los experimentos de corte in vitro (figura 1 ), tan sólo a 11 nt corriente arriba. La no-exactitud puede ser debida tanto a una pequeña degradación del RNA viral en el interior celular, o a una pequeña diferencia en Ia zona de corte de Ia ribozima in vivo e in vitro. Tan solo señalar que el punto de corte de Ia actividad RNasa P humana ensayada in vitro sobre este PPC se localiza justo entre los puntos corte de Ia ribozima in vitro e in vivo.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de Ia secuencia nucleotídica con actividad catalítica de Ia ribozima
RNasa P de Synechocystis sp. que se selecciona de entre: a. las moléculas de ácido nucleico que comprenden Ia SEQ ID NO: 1 , ó b. moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con Ia secuencia polinucleotídica de (a), para inhibir Ia replicación de virus de RNA.
2. Uso de un fragmento de Ia secuencia nucleotídica según Ia reivindicación anterior, donde el fragmento posee Ia actividad catalítica de Ia ribozima RNasa P de Synechocystis sp.
3. Uso de Ia secuencia nucleotídica con actividad catalítica de Ia ribozima RNasa P de Synechocystis sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde Ia secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos un 70% con Ia SEQ ID NO: 1.
4. Uso de Ia secuencia nucleotídica con actividad catalítica de Ia ribozima RNasa P de Synechocystis sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde Ia secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos un 80% con Ia SEQ ID NO: 1.
5. Uso de Ia secuencia nucleotídica con actividad catalítica de Ia ribozima RNasa P de Synechocystis sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde Ia secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos un 90% con Ia SEQ ID NO: 1.
6. Uso de Ia secuencia nucleotídica con actividad catalítica de Ia ribozima RNasa P de Synechocystis sp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde Ia secuencia nucleotídica presenta una identidad de al menos un 95% con Ia SEQ ID NO: 1.
7. Uso de una construcción genética que dirige Ia trascripción in vitro o intracelular de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende: a. secuencia de nucleótidos de DNA que comprende cualquiera de las secuencias que se transcriben in vitro o intracelularmente a Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, ó b. secuencia de nucleótidos de DNA correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende Ia secuencia según (a) operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija Ia transcripción de dicha secuencia de nucleótidos de interés, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para Ia transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.
8. Uso de una construcción genética según Ia reivindicación 7, donde Ia secuencia de nucleótidos de DNA es de doble cadena.
9. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde los virus de RNA pertenecen a las familias que se seleccionan de Ia lista que comprende: Hepadnavirídae, Caulimovirídae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retroviridae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnavirídae, Totiviridae, Partitiviridae, Chrysovirídae, Hypovirídae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae,
Orthomyxoviridae, Bunyavirídae, Arenavirídae, Leviviridae, Narnavirídae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Calicivirídae, Astrovirídae, Nodavirídae, Tetraviridae, Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flavivirídae, Togavirídae, Bromovirídae, Tymovirídae, Closterovirídae,
Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que se seleccionan de Ia lista que comprende: Varícosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus, Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus.
10. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde el virus de RNA pertenece a Ia familia Picornaviridae.
11. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde el virus de RNA pertenece a Ia familia Flaviviridae.
12. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde el virus de RNA se selecciona de Ia lista que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de Ia encefalomiocarditis, virus de Ia fiebre aftosa {Aphtovirus), virus de Ia Hepatitis A, virus de Ia Hepatitis C, virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), virus de Ia diarrea viral bovina, virus de Ia Leucemia Murina de Friend, virus de Ia Leucemia Murina de Moloney (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH), virus intestinal de Plautia stali, Rhopalosiphum padi virus, virus de Ia parálisis Cricket, Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi.
13. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde el virus de RNA es el virus de Ia Peste Porcina Clásica.
14. Composición farmacéutica que comprende Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8.
15. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, como medicamento.
16. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, para Ia elaboración de un medicamento.
17. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, para Ia elaboración de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades provocadas por los virus de RNA.
18. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, según Ia reivindicación 17, donde los virus de RNA pertenecen a las familias que se seleccionan de Ia lista que comprende: Hepadnavirídae, Caulimovirídae, Pseudoviridae, Metaviridae, Retroviridae, Cystoviridae, Reoviridae,
Birnavirídae, Totiviridae, Partitiviridae, Chrysovirídae, Hypovirídae, Bornaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae,
Orthomyxoviridae, Bunyavirídae, Arenavirídae, Leviviridae, Narnavirídae, Picornaviridae, Dicistroviridae, Marnaviridae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Calicivirídae, Astrovirídae, Nodavirídae, Tetraviridae,
Luteoviridae, Tombusviridae, Arteriviridae, Coronaviridae, Roniviridae, Flavivirídae, Togavirídae, Bromovirídae, Tymovirídae, Closterovirídae, Flexiviridae, Barnaviridae y/o a cualquiera de los géneros que se seleccionan de Ia lista que comprende: Varícosavirus, Ophiovirus, Tenuivirus, Deltavirus, Iflavirus, Sadwavirus, Cheravirus, Sobemovirus,
Umbravirus, Tobamovirus, Tobravirus, Hordeivirus, Furovirus, Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus, Ourmiavirus, Idaeovirus.
19. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones
7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, según Ia reivindicación 17, donde los virus de RNA pertenecen a Ia familia
Picornaviridae.
20. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, según Ia reivindicación 17, donde los virus de RNA pertenecen a Ia familia Flavivirídae.
21. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, según Ia reivindicación 17, donde los virus de RNA se seleccionan de Ia lista que comprende: Poliovirus, Rhinovirus, virus de Ia encefalomiocarditis, virus de Ia fiebre aftosa {Aphtovirus), virus de Ia Hepatitis A, virus de Ia Hepatitis C, virus de Ia Peste Porcina Clásica (PPC), virus de Ia diarrea viral bovina,
Friend murine leucemia, Moloney murine leukemia (MMLV), virus del sarcoma de Rous, virus de Ia inmunodeficiencia humana (VIH), Plautia stali intestine virus, Rhopalosiphum padi virus, Cricket paralysis virus, Triatoma virus y el virus del sarcoma de Kaposi.
22. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, o de Ia composición farmacéutica según Ia reivindicación 14, según Ia reivindicación 17, donde el virus de RNA es el virus de Ia Peste Porcina Clásica.
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