ES2348706T3 - Reconocimiento de productos genicos especificos de tumores en cancer. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar aberraciones cromosó-micas en una muestra biológica vía detección citométrica de flujo de diferentes tipos de productos génicos específicos de tumores simultáneamente en un ensayo de un solo tubo, usando al menos una sonda de captura unida a perla y una sonda de detección dirigida contra cada producto génico, siendo cada sonda reactiva con sitios distintos en dicho producto génico.

Description

Esta invención se refiere al campo del diagnóstico 5 del cáncer y la aplicación de técnicas de diagnóstico en patología y hematología. Específicamente, la invención se refiere a técnicas que indican la presencia de aberracio-nes cromosómicas detectando productos génicos específicos de tumores que son expresados exclusivamente por células 10 tumorales, que contienen los cromosomas.

Antecedentes de la Invención

Las anormalidades o aberraciones cromosómicas son 15 la causa principal de trastornos o enfermedades genéti-cas, incluyendo trastornos congénitos y enfermedades ad-quiridas, tales como cánceres. Las células cancerosas tienen un origen clónico común puesto que se cree que se originan de una única célula que crece de forma autónoma 20 que se apartó de las señales reguladoras del crecimiento ambiental.

El término “cáncer” comprende un grupo heterogéneo de neoplasmas, en los que cada tipo tiene su propia ca-racterística cuando se considera su potencial maligno y 25 su respuesta a terapia. Actualmente, la eficacia del tra-tamiento del cáncer se determina empíricamente. Depen-diendo del momento en el tiempo en el desarrollo del cáncer, el origen y extensión del cáncer, y del estado fisiológico del paciente, se selecciona el tratamiento 30 más apropiado y más eficaz. Actualmente, se pueden reali-zar selecciones a partir de un tratamiento quirúrgico,

terapia de radiación y quimioterapia (o combinación de estas terapias). Incluso, se aprecia que cada terapia comporta efectos secundarios que comprometen enormemente a los beneficios del tratamiento. No es necesario decir que el diagnóstico exacto de los diversos tipos de cáncer 5 es preeminente a la hora de ayudar a seleccionar la tera-pia más eficaz.

La base del cáncer deriva de aberraciones cromosó-micas tales como translocaciones, inversiones, insercio-nes, supresiones y otras mutaciones en o entre los cromo-10 somas. A menudo, un cromosoma o dos cromosomas diferentes están implicados en el desarrollo de cánceres. De este modo, los genes o fragmentos de genes se retiran del con-texto fisiológico normal del cromosoma no aberrante y se fusionan con o encuentran una localización en un cromoso-15 ma receptor (ya sea el mismo o un segundo cromosoma) ad-yacente a genes o fragmentos de genes no relacionados (a menudo oncogenes o protooncogenes), en los que la nueva combinación genética puede encontrar el fundamento de un cáncer. 20

Los reordenamientos, tales como translocaciones, ocurren a menudo en un patrón en cierto modo establecido, en el que los genes, o sus fragmentos, se eliminan del cromosoma no aberrante en un punto de ruptura o una re-gión de agrupamiento de puntos de ruptura, y se insertan 25 en el cromosoma receptor en una región de fusión, creando de ese modo genes reordenados, suprimidos, translocados o fusionados que son específicos para ese cáncer específi-co. Además, los reordenamientos o translocaciones pueden ser recíprocos, por cuanto dos cromosomas intercambian 30 partes que conducen a células que contienen dos cromoso-mas recíprocamente reordenados los cuales contienen nue-

vos genes fusionados.

Cuando el gen fusionado se traduce, genera un pro-ducto génico, ARNm, que es único para el tumor. El ARNm quimérico comprende partes o fragmentos de dos ARNm que corresponden a y que se transcribieron originalmente por 5 los genes originalmente separados. Este ARNm específico del tumor se caracteriza de forma única por un punto de fusión, en el que se encuentran los fragmentos de ARN. En algunos casos, estos puntos de fusión se pueden detectar hibridando sondas de ácido nucleico. Sin embargo, consi-10 derando la gran variación en los reordenamientos indivi-duales observada en estas translocaciones y dependiendo de la localización del punto de ruptura en el gen no abe-rrante en la que (incluso cuando las translocaciones se producen en los mismos dos genes) se pueden generar dife-15 rentes genes específicos de tumores, se considera proba-ble que en cada caso separado de estos tipos de cáncer surjan nuevos puntos de fusión. Por lo tanto, la detec-ción de cáncer mediante detección específica del punto de fusión del producto génico (ARNm) específico del tumor 20 nunca se ha aplicado ampliamente.

Cuando el gen fusionado se fusiona en el marco, el ARNm fusionado se traduce en una proteína de fusión que es única para el tumor. La proteína comprende partes de dos proteínas que corresponden a y fueron transcritas 25 originalmente por y traducidas a partir de los genes ori-ginalmente separados. Las proteínas específicas de tumo-res se caracterizan de forma única por un punto de fu-sión, en el que se empalman las dos proteínas. Los puntos de fusión están expuestos antigénicamente, comprendiendo 30 distintos epítopos que algunas veces se pueden detectar inmunológicamente. Sin embargo, considerando la gran va-

riación dentro de los reordenamientos individuales obser-vada en estas translocaciones y dependiendo de la locali-zación del punto de ruptura en el gen no aberrante en el que (incluso cuando las translocaciones se producen de-ntro de los mismos dos genes) se pueden generar diferen-5 tes genes específicos de tumores, se considera probable que dentro de cada caso separado de estos tipos de cáncer surjan nuevos puntos de fusión. Por lo tanto, la detec-ción de cáncer mediante detección específica del epítopo de punto de fusión de la proteína específica de tumores 10 nunca se ha aplicado ampliamente. Los productos génicos específicos de tumores (productos de fusión) del gen fu-sionado o reordenado pueden contribuir al desarrollo pos-terior del cáncer.

Un área en el que las aberraciones cromosómicas 15 están relativamente bien estudiadas (en comparación con otros tipos de cáncer) es el campo de la leucemia. Compa-rable con los tumores más cancerígenos, las leucemias di-fieren en el grado de diferenciación de las células tumo-rales. Según la presentación clínica, las leucemias se 20 dividen en formas agudas y crónicas, dependiendo de la rapidez con la que evolucionan y, si no son tratadas, provocan la muerte. Dependiendo de la estirpe o estirpes celulares implicadas en el proceso leucémico, las leuce-mias agudas se clasifican como leucemias linfoblásticas 25 agudas (ALL) y leucemias no linfoblásticas agudas (ANLL), produciéndose las ALL, el tipo más predominante (>80%) en la niñez. Las leucemias crónicas son cánceres en los que las células leucémicas proliferantes descontroladas son capaces de madurar. Se distinguen dos subtipos de leuce-30 mia crónica, la leucemia linfocítica crónica (CLL) y la leucemia mieloide crónica (CML). Dentro de estos cuatro

grupos, se observa una considerable heterogeneidad en la biología y pronóstico, que actualmente se estratifica por características morfológicas. Esta estratificación tiene todavía poco valor en cuanto a una comprensión y predic-ción del pronóstico de un paciente leucémico y al diseño 5 racional de la terapia. Sin embargo, estudios genéticos moleculares recientes de pacientes leucémicos han demos-trado que se puede encontrar una amplia variedad de abe-rraciones cromosómicas con las diversas formas de leuce-mia. Un grupo consiste en reordenamientos del gen del re-10 ceptor de células T (TCR) o de inmunoglobulina (IG), que comprenden reordenamientos de genes antígeno-receptor que van más allá de los procesos fisiológicos normales que se requieren para generar la diversidad de las moléculas re-ceptoras de antígenos que tipifican la población de célu-15 las linfoides. En un gran grupo de reordenamientos de IG y TCR que se sabe que están asociados con leucemia, se expresan moléculas receptoras de antígenos específicas de tumores. Otro grupo de aberraciones comprende supresiones de un gen completo o partes de un gen de un genoma. Como 20 resultado de la supresión, las regiones promotoras que normalmente pertenecen al gen ahora suprimido pueden ejercer control sobre otro gen, dando como resultado la transcripción aberrante del gen. Un ejemplo es la supre-sión de las regiones codificantes del gen SIL en células 25 T, que da como resultado la transcripción del gen TAL-1 normalmente no expresado en células T, dando como resul-tado la expresión ectópica de la proteína de fusión de TAL-1. Aún otro grupo comprende translocaciones de frag-mentos génicos entre cromosomas, dando como resultado ge-30 nes de fusión que bien pueden transcribir proteínas de fusión únicas que contribuyen al desarrollo del cáncer.

Ejemplos bien conocidos son las translocaciones que dan como resultado genes de fusión de BCR-ABL encontrados en >95% de los casos de CML y en 30% de los casos de ALL de adultos, y TEL-AML1 que se encuentra en 25-30% de casos de ALL de niños. Sin embargo, se conocen muchos más genes 5 de fusión, tales como E2A-PBX1, ETO-AML1 y PML-RARa.

Las aberraciones cromosómicas se pueden detectar mediante un amplio conjunto de técnicas, varias de las cuales suponen una tecnología biomolecular moderna. Las técnicas tradicionales tales como análisis citogenético 10 mediante técnicas de bandas cromosómicas convencionales son muy laboriosas, aunque muy precisas, requieren un personal especializado, y de este modo son caras. El ca-riotipado automatizado es útil para algunas aplicaciones de diagnóstico, tales como el diagnóstico prenatal, pero 15 es ineficaz analizando características complejas de cánceres. Además, es posible detectar un aumento de acti-vidad de proteínas, por ejemplo actividad de tirosina ci-nasa (véase la Publicación Internacional PCT WO 95/31545) en células específicas de tumores. Las técnicas anterio-20 res requieren células recientes, las cuales no siempre están disponibles.

Existen otras técnicas, más modernas, que usan transferencia Southern u otras técnicas de hibridación del ácido nucleico o técnicas de amplificación tales como 25 PCR, para detectar aberraciones cromosómicas bien esta-blecidas para las cuales existen sondas de ácidos nuclei-cos o cebadores adecuados. Con estas técnicas, se pueden usar células recientes o congeladas, e incluso algunas veces muestras más antiguas que se han almacenado de for-30 ma apropiada (tales como después de la fijación con for-malina), en tanto que el ácido nucleico a hibridar y am-

plificar siga siendo accesible y esté intacto. Sin embar-go, incluso con esta tecnología moderna, se pueden encon-trar varias desventajas que dificultan la aplicación de estas técnicas de diagnóstico en la identificación rápida de aberraciones cromosómicas relacionadas con tales 5 cánceres.

Por ejemplo, la transferencia Southern necesita 3 a 4 semanas, lo que es demasiado lenta para permitir la in-tervención terapéutica en cánceres, y sólo permite anali-zar 10-15 kb de ácido nucleico por análisis de sonda. 10

La PCR, aunque en esencia muy adecuada para el en-sayo o incluso identificación masiva y rápida, permite el análisis de sólo 0,1 a 2 kb de ácido nucleico (ADN o ARN) por análisis de PCR, lo que impide enormemente la identi-ficación rápida de bastos tramos de cromosomas y de re-15 giones de fusión o de agrupamiento de puntos de fusión en los cromosomas o sus productos génicos. Una desventaja adicional de la PCR es su sensibilidad inherente a ceba-dores desemparejados. Las alteraciones pequeñas, normales y fisiológicas que siempre pueden estar presentes en la 20 secuencia de ácido nucleico del fragmento génico comple-mentario al cebador harán imposible funcionar la PCR con el efecto deseado, y pueden dar como resultado diagnósti-cos equivocados y resultados con falsos negativos. Espe-cialmente, los resultados de falsos negativos hacen a un 25 ensayo de diagnóstico a base de PCR, aunque muy específi-co, insuficientemente sensible para un diagnóstico fia-ble, y no es necesario decir que sólo un diagnóstico fia-ble de los cánceres puede contribuir a una comprensión del pronóstico y el diseño de una terapia adecuada. 30

Las técnicas fluorescentes de hibridación in situ (FISH) no son tan enormemente dependientes del empareja-

miento exacto de las secuencias de ácido nucleico para obtener resultados de diagnóstico positivos, pero sólo se pueden emplear para la detección de ADN cromosómico y en general no para la detección de productos génicos de los cromosomas. En general, la FISH emplea el análisis de 5 sondas con grandes sondas de ácidos nucleicos, principal-mente no específicas, que se hibridan, sin embargo a me-nudo con restricción variable, con los genes o fragmentos génicos localizados en el cromosoma reordenado en la célula cancerosa. El uso de grandes sondas hace a la 10 técnica de FISH muy sensible. La unión de las sondas se detecta mediante detección subsiguiente de las sondas con (a menudo múltiples) fluorocromos vía observación mi-croscópica de una población de células obtenida a partir de la muestra ensayada. Sin embargo, incluso los protoco-15 los de FISH usados actualmente tienen desventajas in-herentes, principalmente que se refieren a la selección de sondas de ácidos nucleicos empleadas en los protocolos actuales de FISH, dando como resultado a menudo resulta-dos de falsos positivos en el diagnóstico de aberraciones 20 cromosómicas, dando como resultado ensayos de diagnóstico que, aunque sensibles, no son muy específicos, al menos no suficientemente específicos para emplear técnicas estándar de FISH en el ensayo de diagnóstico masivo o rápido, y mucho menos en un ensayo o identificación auto-25 matizada. Un resultado de falso positivo necesita un nue-vo ensayo incómodo de pacientes, o incluso clientes no sospechados que se han sometido a protocolos de identifi-cación habituales, y puede alarmar enormemente a estas personas. 30

La detección inmunológica de las proteínas de fu-sión que resultan de aberraciones cromosómicas, aunque se

ha intentado ampliamente, nunca ha tenido éxito. Este fracaso está provocado principalmente por el hecho de que es duro encontrar reactivos inmunológicos que sean exclu-sivamente reactivos con proteínas específicas de tumores contrariamente a la detección inmunológica de proteínas 5 que no son de fusión que también son producidas normal-mente por el cuerpo, aunque a un nivel más bajo (véase, por ejemplo, Nagasaki et al., J. Imm. Methods 162, 235-245, 1993). Habitualmente, tales anticuerpos reaccionan de forma cruzada con proteínas celulares normales. Sólo 10 cuando las proteínas de fusión específicas son conocidas, puede ser posible seleccionar reactivos inmunológicos es-pecíficos que reaccionan exclusivamente con la proteína específica de tumores, mediante unión selectiva al epíto-po de la proteína de fusión. Sin embargo, la variación en 15 los puntos de fusión es tan grande que la detección inmu-nológica específica sólo funciona en muy pocas ocasiones, a menudo sólo en una base de paciente por paciente.

Además, los ensayos de diagnóstico identificados tienen la gran desventaja inherente de que requieren la-20 boratorios especializados y muy equipados y personas en-trenado y altamente cualificado. Adicionalmente, estos ensayos sólo se usan en casos en los que se sospechan los cánceres, y no son adecuados para una identificación a gran escala de poblaciones en riesgo de presentar aberra-25 ciones cromosómicas. La identificación preventiva y a gran escala puede conducir a la detección temprana de cánceres, después de lo cual el curso mortal de un cáncer se puede interceptar en una fase temprana de su desarro-llo. Finalmente, el foco de atención se ha desplazado a 30 un método para detectar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica vía la detección exclusiva de un pro-

ducto génico específico de tumores usando al menos dos sondas diferentes dirigidas contra el producto génico es-pecífico de tumores que se origina de la aberración cro-mosómica, como se sabe desde el documento WO 98/53317.

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Descripción de la Invención

La presente invención proporciona ahora un método a usar en el ensayo de diagnóstico de muestras biológicas tales como muestras de sangre, muestras de suero, mues-10 tras de células, muestras de tejidos, médula ósea, biop-sias, para determinar aberraciones cromosómicas. La in-vención proporciona un método a usar en ensayo de dia-gnóstico en el que se requiere tanto una gran sensibili-dad como una gran especificidad. La invención proporciona 15 un método que se puede llevar a cabo opcionalmente en la-boratorios normales por personal con pericias normales. La presente invención se caracteriza porque proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas rela-cionadas con un amplio conjunto de tipos de cáncer, por 20 ejemplo la invención proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas relacionadas con leucemia.

En particular, la invención proporciona un método para detectar aberraciones cromosómicas en una muestra biológica vía una detección citométrica de flujo de dife-25 rentes tipos de productos génicos específicos de tumores simultáneamente en un único ensayo de tubos, usando al menos una sonda de captura unida a perlas y una sonda de detección dirigida contra cada producto génico, siendo cada sonda reactiva con sitios distintos en dicho produc-30 to génico.

La invención proporciona así un método para detec-

tar productos génicos específicos de tumores de diversos tipos de aberraciones cromosómicas. Por ejemplo, la in-vención proporciona un método para detectar productos génicos que corresponden a los genes fusionados encontra-dos en supresiones, inversiones o translocaciones cro-5 mosómicas. Como ejemplo de la invención, se proporciona un método para detectar la aberración cromosómica de Fi-ladelfia encontrada en leucemias. La invención proporcio-na un método para detectar productos génicos específicos de tumores tales como ARNm específico de tumores, así co-10 mo proteína específica de tumores. Las sondas usadas por la invención se ajustan opcionalmente a la naturaleza del producto génico, y la detección del ARNm se proporciona usando al menos dos sondas de ácido nucleico diferentes, siendo cada una reactiva con sitios distintos en el pro-15 ducto génico. La detección de la proteína específica de tumores se proporciona usando como sondas al menos dos proteínas de unión diferentes, siendo cada una reactiva con sitios distintos en el producto génico. Como proteí-nas de unión, en la técnica se conoce un amplio conjunto 20 de proteínas, tales como moléculas receptoras, anticuer-pos policlonales o monoclonales (sintéticos), péptidos de unión o anticuerpos “fágicos” derivados vía técnicas de presentación de fagos, etc.

En particular, la invención proporciona un método 25 en el que se detecta un producto génico (ya sea ARNm o la proteína derivada del mismo) derivado de un gen fusionado mediante detección citométrica de flujo mediante al menos dos proteínas de unión o sondas, en el que al menos una está dirigida contra un fragmento proteico o de ARNm que 30 corresponde al fragmento amino-terminal de la proteína específica de tumores, y al menos alguna otra se dirige

contra un fragmento proteico o de ARNm que corresponde al fragmento carboxi-terminal de la proteína específica de tumores, correspondiendo cada uno de dichos fragmentos a una proteína o ARNm no específico de tumores. Usando an-ticuerpos o sondas de ácido nucleico, la invención pro-5 porciona un método para detectar inmunológicamente abe-rraciones cromosómicas o en base a la detección de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la invención proporciona un méto-do en el que se detecta ARNm derivado de un gen fusionado mediante al menos dos sondas de ácido nucleico, en el que 10 al menos una se dirige contra un fragmento de ARNm que comprende el sitio 5’ del ARNm específico de tumores, y al menos alguna otra se dirige contra un fragmento de ARNm que comprende el sitio 3’ del ARNm específico de tu-mores, correspondiendo cada uno de dichos fragmentos a un 15 ARNm no específico de tumores.

Adicionalmente, la invención proporciona un método en el que se detecta una proteína derivada de un gen fu-sionado mediante al menos dos proteínas de unión, al me-nos una está dirigida contra un fragmento proteico que 20 comprende el fragmento amino-terminal de la proteína es-pecífica de tumores, y al menos alguna otra está dirigida contra un fragmento proteico que comprende el fragmento carboxi-terminal de la proteína específica de tumores, correspondiendo cada uno de los fragmentos a una proteína 25 no específica de tumores. Como ejemplo, la invención pro-porciona un método para detectar un producto génico es-pecífico de tumores en el que el fragmento proteico ami-no--terminal del producto génico corresponde a la proteí-na de ABL o BCR, mientras que el fragmento proteico car-30 boxi-terminal corresponde a la proteína de BCR o ABL, respectivamente. Con este ejemplo, se usan sondas que

tienen especificidades antigénicas similares como se ob-serva para los anticuerpos 7C6, ER-FP1, Yae, 8E9, G98-271.1.3, como se muestra en la parte experimental aquí descrita más a conciencia. En particular, la invención proporciona un método en el que se detecta una proteína 5 derivada de un gen fusionado mediante detección citomé-trica de flujo mediante al menos dos proteínas de unión, en el que al menos una está dirigida contra un fragmento proteico que comprende el fragmento amino--terminal de la proteína específica de tumores, y al menos alguna otra 10 está dirigida contra un fragmento proteico que comprende el fragmento carboxi-terminal de la proteína específica de tumores, correspondiendo cada uno de dichos fragmentos a una proteína no específica de tumores. Como ejemplo, la técnica de anticuerpo de sándwich basada en perlas des-15 crita aquí permite la detección citométrica de flujo fácil y rápida de diferentes tipos de proteínas de fusión o ARNm relacionados con ellas, preferiblemente en un solo ensayo de tubos, usando diferentes anticuerpos o sondas de captura unidas a perlas contra una parte de las dife-20 rentes proteínas de fusión o ARNm, y los anticuerpos o sondas de detección correspondientes pertinentes contra la otra parte de las proteínas de fusión.

Por razones de eficacia, se investiga simultánea-mente en un tubo la aparición de la diferente proteína 25 del gen de fusión. Esta preferencia no es debida a que un cáncer particular tendrá más de una proteína del gen de fusión, sino debido a que es conveniente tener un único tubo de ensayo para la detección de varias proteínas de gen de fusión bien establecidas dentro de una categoría 30 de enfermedad. Basándose en las diferentes característi-cas citométricas de flujo de las perlas (por ejemplo, ta-

maño, color del fluorocromo, intensidad de la tinción del fluorocromo, o características de difusión lateral), en el mismo ensayo se pueden detectar específicamente múlti-ples proteínas de fusión. Esto incluye la detección de proteínas de fusión procedentes de diversas translocacio-5 nes variantes del mismo gen diana, así como proteínas de fusión procedentes de translocaciones con puntos de rup-tura variantes. Por supuesto, el método de detección ci-tométrico de flujo descrito aquí también se puede aplicar a productos génicos de fusión de naturaleza de ácido nu-10 cleico, en el que diferentes sondas de ácido nucleico son marcadas con diferentes perlas o fluorocromos como se describe aquí. El documento WO 1998/053317 describe un ensayo de sándwich para detectar una proteína de fusión específica de tumores. No está relacionada con la detec-15 ción combinada de varios productos génicos específicos de tumores. El documento WO 1998/053317 usa Sepharose-transferencia Western o un ensayo capilar de inmersión, que no permite la detección simultánea de múltiples pro-teínas de fusión diferentes en un único tubo. 20

James et al. (J. Immunol. Methods, Vol. 210m, nº 1, 1997, páginas 79-87) describe que se puede usar un método citométrico de flujo adaptado a un formato de inmunoensa-yo inmovilizado en perlas para la detección de una pro-teína, por ejemplo beta2-microglobulina en sangre comple-25 ta. No está relacionado con la detección en un único tubo de múltiples productos génicos específicos de tumores que resultan de aberraciones cromosómicas.

La invención proporciona un método que usa sondas que se pueden marcar o conjugar con moléculas informado-30 ras, tales como biotina, digoxigenina, enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, u otras moléculas infor-

madoras o partículas informadoras, tales como perlas, co-nocidas en la técnica. La descripción define además un kit de diagnóstico que comprende todos los medios, tales como sondas (marcadas) o reactivos o sustrato o instruc-ciones, necesarios para llevar a cabo el método según la 5 invención. Más específicamente, la descripción define un kit de diagnóstico para detectar aberraciones cromosómi-cas en una muestra biológica vía detección citométrica de flujo a base de perla de diferentes tipos de productos génicos específicos de tumores simultáneamente en un úni-10 co ensayo de tubos, comprendiendo dicho kit al menos una sonda de captura unida a perlas y una sonda de detección dirigida contra cada uno de los diferentes tipos de pro-ductos génicos específicos de tumores, siendo cada sonda reactiva con sitios distintos en dicho producto génico, y 15 teniendo dicha perla las características apropiadas para la citometría de flujo. Los métodos o kits de diagnóstico proporcionados por la invención se usan preferiblemente para detectar aberraciones cromosómicas encontradas con ciertos tipos de cáncer, por ejemplo con leucemia, ya sea 20 en la detección de cáncer (residual) en pacientes o la identificación de cáncer en grandes poblaciones como un todo.

Descripción de las Figuras 25

FIG. 1. Principio del ensayo citométrico de flujo a base de perla para la detección de proteínas de fu-sión codificadas por genes de fusión de células can-cerosas. 30

FIG. 2. Detección de proteínas de fusión en cánceres. La porción A de la FIG. 2 muestra la detección de

proteínas de fusión AML1-ETO derivadas de t(8;21) en AML. Las perlas marcadas con diferentes intensidades del fluorocromo ficoeritrina se pueden revestir con diferentes anticuerpos de captura, por ejemplo, diri-gidos a una parte de CBFB de la proteína de fusión 5 CBFB-MYH11 (inv(16)), la parte de AML1 de la proteína de fusión AML1-ETO (t(8;21)), o la parte de PML de la proteína de fusión PML-RARA (t(15;17)). Las perlas se pueden incubar entonces con un lisado celular de una muestra de médula ósea o de sangre obtenida de un pa-10 ciente con AML, se pueden lavar, y se pueden incubar con una mezcla de anticuerpos de detección conjugados con FITC dirigidos contra la otra parte de las pro-teínas génicas de fusión indicadas (véase la Tabla 1). Tras el lavado, las perlas se pueden analizar me-15 diante citometría de flujo. Como se muestra en la porción A, una población de las perlas puede mostrar positividad para el anticuerpo de detección pertinen-te, por ejemplo un anticuerpo anti-ETO conjugado con FITC, indicando la presencia de proteínas de fusión 20 AML1-ETO. Esto implicaría que el paciente estudiado tuvo una AML positiva a t(8;21). La porción B de la FIG. 2 muestra la detección de la proteína de fusión E2A-PBX1, derivada de una ALL de precursores de B con t(1;19), usando un enfoque comparable al de la por-25 ción A (véase la Tabla 1 para proteínas de fusión).

FIG. 3. Detección de un reordenamiento del gen MLL mediante el ensayo citométrico de flujo con perlas en un lactante con ALL de precursores de B. Las células leucémicas no contenían proteínas de fusión MLL-AF4 30 ni MLL-AF9 (paneles A y B), pero el panel C muestra positividad para proteínas de fusión MLL-ENL deriva-

das de t(11;19).

FIG. 4. Las diferentes variantes de las proteínas de fusión BCR-ABL están provocadas por el uso de dife-rentes puntos de ruptura del gen BCR (porción A). El uso de anticuerpos contra diferentes dominios de BCR 5 puede detectar tres variantes (paneles B a D de FIG. 4). Las células leucémicas del paciente en este ejem-plo tuvieron t(9;22) con proteínas de fusión BCR-ABL (panel B). Basándose en la reactividad con anti-BCR (exón 1-13) pero no con anti-BCR (exón 5-19) (paneles 10 C y D), se puede concluir que la proteína de fusión BCR-ABL deriva de t(9;22) con un punto de ruptura M-bcr (véase la Tabla 3).

Descripción Detallada de la Invención 15

PARTE EXPERIMENTAL

La parte experimental describe con más detalle la invención que se refiere al campo de la leucemia, pero de 20 ningún modo se puede ver como limitante de la invención.

La translocación recíproca t(9;22)(q34;q11), obser-vada en leucemia mieloide crónica (CML), leucemia lin-foblástica aguda (ALL), y leucemia mieloide aguda (AML), resulta de la fusión entre dos genes: BCR y ABL. Depen-25 diendo de la localización del punto de ruptura en el gen BCR, se generan diferentes genes BCR-ABL específicos de tumores. Estos genes BCR-ABL son transcritos y traducidos en ARNm de BCR-ABL específico de tumores y proteínas BCR-ABL específicas de tumores, respectivamente. Por tanto, 30 existen diferentes dianas de diagnóstico, permitiendo ca-da una el diagnóstico específico de leucemia positiva a

t(9;22)(q34;q11).

Aunque la citogenética convencional descansa en la detección de la aberración cromosómica característica (es decir, el cromosoma de Filadelfia: un cromosoma 22 dimi-nuto), se usan otras técnicas para detectar específica-5 mente el gen de fusión de BCR-ABL (por ejemplo, hibrida-ción in situ fluorescente) o el ARNm de fusión de BCR-ABL (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa). Aunque todas las técnicas mencio-nadas anteriormente están bien establecidas como técnicas 10 de diagnóstico, ninguna de estas técnicas se puede llevar a cabo fácilmente en una base habitual y a corto plazo. Incluso, especialmente en ALL, la presencia del cromosoma de Filadelfia (Ph) está asociada con un mal pronóstico. Para mejorar el resultado del mal pronóstico, las ALL po-15 sitivas para Ph requieren una identificación temprana pa-ra permitir regímenes de inducción intensos o protocolos de tratamiento alternativos.

Se presenta una nueva técnica de diagnóstico que se basa en la detección exclusiva de proteínas de fusión es-20 pecíficas de tumores. Esta técnica se diseña para la identificación de cánceres tales como leucemias positivas a Ph en un primer diagnóstico de una manera rápida y sim-ple.

El cromosoma de Ph fue la primera aberración ca-25 riotípica que se encontró que estaba relacionada con tu-mores. Hasta la fecha, el cromosoma de Ph se identifica en diversos trastornos hematopoyéticos, por ejemplo, CML, ALL, y AML, tanto en adultos como en niños.

El cromosoma de Ph se genera mediante la transloca-30 ción recíproca entre los brazos largos del cromosoma 9 y 22: t(9;22)(q34;q11), e implica el gen ABL en el cromoso-

ma 9 y el gen BCR en el cromosoma 22. Ambos genes se in-terrumpen y se reordenan, dando como resultado un gen de fusión BCR-ABL específico de tumores en el cromosoma 22q-, y un gen de fusión ABL-BCR en el cromosoma 9+.

Aunque los informes sobre el gen de fusión ABL-BCR 5 todavía son limitados, los genes de fusión BCR-ABL se han estudiado ampliamente durante las dos décadas pasadas. Dependiendo de la localización cromosómica en los puntos de ruptura, se han identificado diferentes tipos de genes de fusión de BCR-ABL. Se ha demostrado que los puntos de 10 ruptura en el gen BCR están agrupados en dos regiones: la región principal de agrupamiento de puntos de ruptura (M-BCR), que comprende cinco exones denominados b1 a b5; y una región menor de agrupamiento de puntos de ruptura (m-BCR), localizada 5’ de la M-BCR en el gen BCR. Por el 15 contrario, los puntos de ruptura en el gen ABL están dis-persos a lo largo de grandes distancias y se producen ma-yoritariamente 5’ de un exón a2. Tanto en pacientes con CML Ph+ como pacientes con ALL Ph+, los puntos de ruptura en la M-BCR están distribuidos uniformemente: ya sea lo-20 calizados entre el exón b2 y b3 o localizados entre el exón b3 y b4. Sin embargo, los puntos de ruptura en ALL Ph+ se encuentran mayoritariamente (aprox. 70%) en la m-BCR, localizada en un intrón entre el exón e1 y e2.

Debido a que los puntos de ruptura están dispersos 25 a lo largo de grandes distancias (especialmente en el gen de ABL), se generan diferentes intrones de punto de fu-sión en los genes de BCR-ABL. Aunque estos intrones de punto de fusión son muy variables entre pacientes con Ph+ cuando se consideran la longitud y secuencia nucleotídica 30 de los intrones de punto de fusión del gen de BCR-ABL, los puntos de fusión de los transcritos de BCR-ABL son

muy consistentes. De este modo, dependiendo del reordena-miento del gen de BCR-ABL original, habitualmente se de-tecta un único tipo de ARNm de BCR-ABL: variando desde un ARNm de 7 kb que comprende una unión ela2 hasta un ARNm de BCR-ABL de 8,5 que comprende una unión b2a2 o b3a2. 5 Puesto que el marco de lectura traduccional de los ARNm de BCR-ABL se mantiene, las células de leucemia Ph+ ex-presan proteínas de BCR-ABL únicas.

1 Aunque los cromosomas de Ph están casi invariablemen-te presentes en los casos de CML, los cromosomas de Ph se 10 detectan menos frecuentemente en células de leucemia pro-cedentes de pacientes que sufren AML o ALL. Aún, el 5% de los casos de AML, el 25% a 30% de adultos con ALL y el 3% al 5% de niños con ALL son diagnosticados como Ph+. Re-flejado por una tasa elevada de fracaso del tratamiento y 15 mortalidad en leucemias con Ph+, tanto en adultos como en niños, los cromosomas de Ph son considerados distintivos como factores significativos de riesgo considerando el fracaso del tratamiento.

2 La importancia de identificar factores de riesgo, ta-20 les como el cromosoma de Ph, está más allá de la duda. Los actuales protocolos de tratamiento se pueden mejorar mediante la identificación de la t(9;22)(q11;q34) en un punto de tiempo temprano de la enfermedad. Actualmente, las leucemias Ph+ son identificadas mediante un número de 25 técnicas, ya sea detectando el cromosoma aberrante, el gen, el ARNm o la proteína aberrante. Aún más, cada una de estas técnicas se caracteriza por especificaciones y limitaciones típicas que se deberían de considerar antes de que se intente diagnosticar específicamente leucemias 30 positivas a t(9;22)(q34;q11).

3 Se describe aquí un ensayo desarrollado para discri-

minar entre leucemias Ph+ y leucemias Ph- en un primer diagnóstico de una manera relativamente rápida y simple. El principio subyacente del ensayo se basa en la detec-ción de proteínas específicas de tumores mediante anti-cuerpos específicamente reactivos con fragmentos que co-5 rresponden a las proteínas de fusión de BCR-ABL y a frac-ciones de las proteínas de BCR y ABL originales, no fu-sionadas.

4 Materiales y métodos.

5 Muestras celulares. 10

6 Estirpes celulares: Se usaron seis estirpes celulares Ph+ para examinar la especificidad tanto del procedimien-to con sepharose-transferencia Western como el ensayo de tira reactiva de BCR-ABL: LAMA-84 y K562, KCL-22 y BV-173, y TOM-1 y ALL/MIK. Todas las estirpes celulares se 15 cultivaron en RPMI-1640 suplementado con suero fetal de ternero al 10%.

7 Muestras de células leucémicas: Para examinar la es-pecificidad del ensayo con tira reactiva de BCR-ABL, se usaron dos muestras de sangre periférica leucémicas crio-20 conservadas procedentes de pacientes leucémicos en el diagnóstico. Los datos clínicos y de laboratorio de estos pacientes se han descrito previamente: un paciente sufrió una CML negativa a Ph, con genes de BCR-ABL b2a2 reorde-nados, y el otro sufrió una ALL de precursores B positiva 25 a Ph, con genes de BCR-ABL ela2 reordenados.

8 Anticuerpos.

9 Todos los anticuerpos usados fueron purificados me-diante proteína G y se categorizan como: anticuerpos de captura: anticuerpo monoclonal (moAb) 7C6 (un regalo ge-30 neroso de Dr. S. Dhut), dirigido contra el epítopo b2 presente en b2a2P210BCR-ABL, b3a2P210BCR-ABL, P160BCR y

P130BCR; moAb ER-FP1, dirigido contra el punto de fusión e1a2 en e1a2P190BCR-ABL y; moAb Yae (Santa Cruz Biotechn., Santa Cruz, CA, USA) dirigido contra el término amino de proteínas E2A. Anticuerpos de detección: moAb 8E9 (un re-galo generoso de Dr. J. Wang), dirigido contra el dominio 5 SH2 presente en e1a2P190BCR-ABL, b2a2P190BCR-ABL, b3a2P190BCR-ABL y P145ABL; y moAb G98-271.1.3 (un regalo generoso de Dr. G. Bain) dirigido contra el término carboxílico de proteínas E2A. Tanto moAb 8E9 como moAb G98-271.1.3 se biotinilaron. 10

36 DETECCIÓN CITOMÉTRICA DE FLUJO DE PROTEÍNAS GÉNICAS DE FUSIÓN

37 ANTECEDENTES

38 Las aberraciones cromosómicas, que están presentes frecuentemente en células cancerosas, pueden dar como re-15 sultado la expresión alterada de genes (por ejemplo, so-breexpresión de la proteína BCL2 en linfomas con t(14;18) en los que el gen BCL2 está enlazado al promotor IGH) o en genes de fusión aberrantes (por ejemplo, t(1;19) en el que una parte del gen E2A está enlazado a una parte del 20 gen PBX1). Los genes de fusión pueden dar como resultado la presencia de transcritos del gen de fusión, los cuales pueden ser traducidos subsiguientemente a proteínas de fusión (FIG. 1).

39 Las aberraciones cromosómicas con genes de fusión se 25 producen en varios tipos de cánceres. Por ejemplo, t(9;22) se encuentra en >95% de leucemias mieloides crónicas (CML) y en el 25 a 40% de leucemias linfoblásti-cas agudas (ALL) de precursores B de adultos, mientras que t(12;21), con el gen de fusión TEL-AML1, se encuentra 30 en aproximadamente el 25% de ALL de precursores B de la niñez. La detección de estas aberraciones cromosómicas es

de importancia diagnóstica, debido a que las aberraciones cromosómicas específicas con genes de fusión se puede usar como factores de pronóstico de PCR en varios tipos de cáncer, por ejemplo, la presencia de t(4;11) en leuce-mia de lactantes está asociada con un resultado pobre. 5 Además, las aberraciones cromosómicas se pueden usar como dianas para monitorizar el nivel de enfermedad residual durante y después de la terapia, proporcionando de ese modo una idea de la eficacia del tratamiento. Por lo tan-to, la detección de aberraciones cromosómicas con genes 10 de fusión es importante para obtener el diagnóstico apro-piado, para la clasificación, y para evaluar la eficacia del tratamiento.

40 Las aberraciones cromosómicas con genes de fusión se pueden detectar a varios niveles y mediante varias técni-15 cas: a nivel del ADN (por ejemplo, mediante FISH), a ni-vel de ARNm (por ejemplo, mediante análisis por RT-PCR), y a nivel proteico (por ejemplo, mediante ELISA). Si las aberraciones cromosómicas con genes de fusión se analizan a nivel proteico, se usa una técnica de sándwich de anti-20 cuerpos. Esta técnica se basa en un anticuerpo de captu-ra, que reconoce parte de la proteína de fusión codifica-da por el gen A, y un anticuerpo de detección, que reco-noce parte de la proteína de fusión codificada por el gen B (FIG. 1). En la mayoría de los casos, el anticuerpo de 25 captura está enlazado a un portador, tal como una membra-na (por ejemplo, ensayo de tira reactiva) o una placa de pocillos (por ejemplo, ELISA). Aunque estos métodos en general son rápidos y eficaces, son difíciles de incorpo-rar en un laboratorio hematológico habitual, debido a que 30 estas técnicas y el equipo correspondiente no están fácilmente disponibles en tales laboratorios. Sin embar-

go, la citometría de flujo se usa ampliamente en labora-torios hematológicos, y por lo tanto sería preferible un ensayo citométrico de flujo para la detección de aberra-ciones cromosómicas. Se propone aquí un ensayo para el análisis de aberraciones cromosómicas, que usa un método 5 de detección que se basa en perlas, que tiene las carac-terísticas apropiadas para la citometría de flujo.

41 MÉTODO

42 Lo principal del método propuesto es:

43 1. se acopla un anticuerpo de captura, que reconoce 10 parte de la proteína del gen de fusión codificada por el gen A, a una partícula tal como una perla;

44 2. se añade un lisado celular (por ejemplo, proceden-te de células leucémicas u otras células cancerosas) a las perlas revestidas con el anticuerpo; 15

45 3. tras un intenso lavado de las perlas, la mezcla de perlas se incuba con un anticuerpo de detección, que re-conoce una parte diferente de la proteína del gen de fu-sión codificada por el gen B; este anticuerpo se conjuga con un fluorocromo o cualquier otro método de visualiza-20 ción, que sea adecuado para la detección citométrica de flujo;

46 4. tras el lavado intenso, las perlas se analizan me-diante citometría de flujo.

47 Por razones de eficacia, será conveniente investigar 25 la aparición de diferentes proteínas génicas de fusión simultáneamente en un tubo. Esto no es debido a que un cáncer particular tendrá más de una proteína génica de fusión, sino debido a que es conveniente tener un único tubo de ensayo para la detección de varias proteínas 30 génicas de fusión bien establecidas dentro de una cate-goría de enfermedad, por ejemplo leucemia mieloide aguda

(AML) o ALL de precursores B (Tabla 1 y FIG. 2).

48 Tabla 1. Ejemplos de detección combinada de varias proteínas de fusión en un solo tubo.

Categoría de la en-fermedad

Aberración cro-mosómica Proteína de fusión Frecuencia rela-tiva

niños adultos

AML

t(8;21) (q22;q22) AML1-ETO 10%-14% 6%-8%

t(15;17) (q22;q21) PML-RARA 8%-10% 5%-15%

inv(16) (p13;q22) CBFB-MYH11 5%-7% 5%-6%

ALL de pre-cursores B

t(1;19) (q23;p13) E2A-PBX1 5%-8% 3%-4%

t(4;11) (q21;q23) MLL-AF4 3%-5% 3%-4%

t(9;22) (q34;q11) BCR-ABL 3%-6% 25%-40%

t(12;21) (p13;q22) TEL-AM L1 25%-30% 0%-2%

5

1 Para la discriminación entre diferentes tipos de pro-teínas de fusión, se usan diferentes perlas. Estas perlas pueden diferir en tamaño, fluorocromo conjugado, intensi-dad del fluorocromo conjugado, u otras características de las perlas (FIG. 2). 10

Tabla 2. Ejemplos de detección combinada de varias pro-teínas de fusión diferentes derivadas de un gen diana (por ejemplo, MLL, RARA, ALK, o EWS), que se puede fusio-nar a diferentes genes compañeros. Las perlas aplicadas 15 se revisten con un único anticuerpo de captura y se usan en combinación con anticuerpos de detección diferentemen-te conjugados.

20

Aberración cromosómica

Gen de fusión Anticuerpo de captura en perlas Anticuerpo de detección (por ejemplo, conju-gado al fluoro-cromo

Genes de fusión de MLL en ALL de lactante

t(4;11)(q21;q23)

MLL-AF4 anti-MLL anti-AF4

t(9;11)(p21-22;q23)

MLL-AF9* anti-MLL anti-AF9

t(11;19)(q23; 19p13.3)

MLL-ENL anti-MLL anti-ENL

Genes de fusión de MLL en AML

t(6;11)(q27;q23)

MLL-AF6 anti-MLL anti-AF6

t(9;11)(p21-22;q23)

MLL-AF9* anti-MLL anti-AF9

t(10;11)(p12;q23)

MLL-AF10 anti-MLL anti-AF10

t(11;19)(q23;19p13.1)

MLL-ELL anti-MLL anti-ELL

Genes de fusión de RARA en AML-M3

t(15;17)(q22;q21)

AML-RARA ant-RARA anti-PML

t(11;1 7)(11q23;q21)

PLZF-RARA anti-RARA anti-PLZF

t(5;17)(q35;q21)

NPM*-RARA ant-RARA anti-NPM

t(11;17)(11q13;q21)

NUMA-RELRA ant-RARA anti-NUMA

Genes de fusión de ALK en linfoma anaplásico de células grandes

t(2;5)(p23; q35)

NPM*-ALK anti-ALK anti-NPM

t(1;2)(q25;p23)

TPM3-ALK anti-ALK anti-TPM3

t(2;3)(p23; q21)

TFG-ALK anti-ALK anti-TFG

inv(2)(p23q35)

ATIC-ALK anti-ALK anti-ATIC

Genes de fusión de EWS en sarcoma de Ewing

t(11;22)(q24;q12)

EWS-FLI1 anti-EWS anti-FLI1

t(21;22)(q22;q12)

EWS-ERG anti-EWS anti-ERG

t(7;22)(p22;q12)

EWS-ETV1 anti-EWS anti-ETV1

1* Algunos genes compañeros o genes de fusión aparecen

en diferentes tipos de cánceres.

2 En varios tipos de cánceres, el mismo gen diana puede estar implicado en diferentes translocaciones variantes, dando como resultado la fusión a diferentes genes compa-ñeros (Tabla 2). En consecuencia, el mismo gen diana (por 5 ejemplo, MLL o EWS) produce diferentes proteínas de fu-sión, dependiendo del tipo de translocación variante. Las proteínas de fusión variantes se pueden detectar en un ensayo de un solo tubo vía el uso de anticuerpos de de-tección marcados diferentemente. Por ejemplo, los dife-10 rentes tipos de proteínas de fusión procedentes de las translocaciones variantes que implican el gen MLL en ALL de precursores B de lactantes (Tabla 2) se pueden detec-tar mediante el uso de anticuerpos AF4, AF9, y ENL dife-rentemente conjugados (FIG. 3). 15

3 Tabla 3. Ejemplos de detección combinada de variantes de proteínas de fusión, provocadas por diferentes regio-nes de punto de ruptura, por ejemplo, en el gen BCR de t(9;22) en CML y ALL de precursores B de adultos. 20

Región de punto de rup-tura de BCR

Exones de BCR expresados en proteína de fusión Regiones diana para anticuerpos anti-BCR*

Región menor de puntos de ruptura (m-bcr)

exón 1 exón 1

Región principal de puntos de ruptura (M-bcr)

exón 1-13 exones 2-13

Región micro de puntos de ruptura (-bcr)

exones 1-19 exones 15-19

1* El anticuerpo anti-exón 1 de BCR detectará las tres variantes de proteínas de fusión de BCR-ABL, el anticuerpo anti-exones 2-13 de BCR detectará las va-riantes M-bcr y m-bcr, mientras que el anticuerpo an-ti-exón 15-19 de BCR sólo detectará la variante m-bcr 5 (véase la FIG. 4).

2 Finalmente, algunas proteínas de fusión pueden aparecer en formas variantes dependiendo de la región del punto de ruptura, tales como en t(9;22), t(15;17), e inv(16). Por ejemplo, se sabe que el gen 10 BCR, implicado en t(9;22), tiene tres regiones de punto de ruptura: la región principal de agrupamiento de puntos de ruptura (M-bcr), la región menor de agrupamiento de puntos de ruptura (m-bcr), y la re-gión micro de agrupamiento de puntos de ruptura (-15 bcr) (Tabla 3 y FIG. 4). Dependiendo de la región del punto de ruptura, varios exones de BCR pueden estar presentes o ausentes en las regiones codificantes de los diferentes tipos de proteínas de fusión BCR-ABL. La discriminación entre las tres proteínas de fusión 20 BCR-ABL variantes es posible vía anticuerpos, que re-conocen los diferentes dominios de BCR, que están presentes en una forma variante pero ausente en la otra (véanse la Tabla 3 y la FIG. 4).

3 La técnica de anticuerpos en sándwich a base de 25 perlas descrita aquí permite la detección citométrica de flujo fácil y rápida de diferentes tipos de pro-teínas de fusión en un ensayo de un solo tubo usando diferentes anticuerpos de captura unidos a perlas frente a una parte de las diferentes proteínas de fu-30 sión y los anticuerpos de detección correspondientes pertinentes contra la otra parte de las proteínas de

fusión. Basándose en diferentes características ci-tométricas de flujo de las perlas (por ejemplo, tama-ño, color del fluorocromo, intensidad de la tinción del fluorocromo, o características de dispersión la-teral), se pueden detectar específicamente múltiples 5 proteínas de fusión en el mismo ensayo (FIGS. 2-4). Esto también incluye la detección de proteínas de fu-sión procedentes de diversas translocaciones varian-tes del mismo gen diana (Tabla 2 y FIG. 3), así como proteínas de fusión procedentes de translocaciones 10 con puntos de ruptura variantes (Tabla 3 y FIG. 4).

4 La técnica citométrica de flujo a base de perlas presentada aquí para la detección de proteínas de fu-sión es aplicable en lisados celulares de cualquier cáncer con una aberración cromosómica que da como re-15 sultado un gen de fusión con la expresión de la pro-teína de fusión correspondiente.

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20

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Claims (22)

1. Reivindicaciones

   1.- Un método para detectar aberraciones cromosó-micas en una muestra biológica vía detección citométrica de flujo de diferentes tipos de productos génicos especí-5 ficos de tumores simultáneamente en un ensayo de un solo tubo, usando al menos una sonda de captura unida a perla y una sonda de detección dirigida contra cada producto génico, siendo cada sonda reactiva con sitios distintos en dicho producto génico. 10
2. 2.- El método de la reivindicación 1, en el que dichos productos génicos específicos de tumores son ARNm específicos de tumores que codifican proteínas específi-cas de tumores, y en el que dichas sondas son sondas de ácido nucleico. 15
3. 3.- El método de la reivindicación 1, en el que dichos productos génicos específicos de tumores son pro-teínas específicas de tumores, y en el que dichas sondas son sondas de anticuerpos.
4. 4.- El método según la reivindicación 2 ó 3, en 20 el que las diferentes proteínas específicas de tumores comprenden cada una un fragmento proteico amino-terminal y un fragmento carboxi-terminal los cuales corresponden cada uno a una proteína no específica de tumores diferen-te. 25
5. 5.- El método según la reivindicación 4, en el que al menos una sonda es específicamente reactiva con el fragmento proteico amino-terminal, y al menos una sonda es específicamente reactiva con el fragmento proteico carboxi-terminal. 30
6. 6.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 5, en el que dichos productos génicos di-

   ferentes específicos de tumores derivan de translocacio-nes variantes de un gen diana fusionado a diferentes ge-nes compañeros.
7. 7.- El método según la reivindicación 6, en el que dicho gen diana es MLL, RARA, ALK o EWS. 5
8. 8.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 5, en el que los diferentes tipos de pro-ductos génicos específicos de tumores derivan de translo-caciones con puntos de ruptura variantes.
9. 9.- El método de la reivindicación 8, en el que 10 los diferentes tipos de productos génicos específicos de tumores están provocados por diferentes regiones de pun-tos de ruptura en el gen BCR de t(9;22).
10. 10.- El método de la reivindicación 9, en el que el punto de ruptura está en la región principal de agru-15 pamiento de puntos de ruptura (M-bcr), la región menor de agrupamiento de puntos de ruptura (m-bcr) o la región mi-cro de agrupamiento de puntos de ruptura (-bcr).
11. 11.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 10, en el que al menos una sonda está mar-20 cada con un fluorocromo.
12. 12.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 11, que usa perlas revestidas con una úni-ca sonda de captura en combinación con sondas de detec-ción conjugadas diferentemente. 25
13. 13.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 12, en el que se usan diferentes tipos de perlas para discriminar entre diferentes tipos de produc-tos génicos específicos de tumores.
14. 14.- El método según la reivindicación 13, en el 30 que las perlas difieren en tamaño, color o intensidad del fluorocromo conjugado, o características de dispersión

    lateral.
15. 15.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 14, que comprende detectar diferentes ti-pos de productos génicos específicos de tumores en una categoría de enfermedad, preferiblemente en un trastorno 5 hematopoyético.
16. 16.- El método según la reivindicación 15, en el que la enfermedad se selecciona de leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia linfoblástica aguda (ALL). 10
17. 17.- El método según la reivindicación 15 ó 16, que comprende la detección de una aberración del cromoso-ma de Filadelfia.
18. 18.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 17, que comprende la detección simultánea 15 de al menos dos productos génicos específicos de tumores seleccionados del grupo que consiste en AML1-ETO, PML-RARA, CBFB-MYH11, E2A-PBX1, MLL-AF4, BCR-ABL y TEL-AML1.
19. 19.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 17, que comprende la detección simultánea 20 de al menos dos productos génicos específicos de tumores seleccionados del grupo que consiste en MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-ENL, MLL-AF10, MLL-ELL, PML-RARA, PLZF-RARA, NPM-RARA, NUMA-RARA, NPM-ALK, TPM3-ALK, TFG-ALK, ATIC-ALK, EWS-FLI1, EWS-ERG y EWS-ETV1. 25
20. 20.- El método según una cualquiera de las reivin-dicaciones 1 a 19, en el que se selecciona al menos una sonda, preferiblemente al menos dos sondas, del grupo que consiste en un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento AML1 de la proteína de fusión AML1-ETO, un an-30 ticuerpo que reconoce específicamente un fragmento MLL de la proteína de fusión MLL-AF4, un anticuerpo que reconoce

    específicamente un fragmento RARA de una proteína de fu-sión TML-RARA, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento TEL de una proteína de fusión TEL-AML1, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento ETO de una proteína de fusión AML1-ETO, un anticuerpo que re-5 conoce específicamente un fragmento PML de una proteína de fusión PML-RARA, un anticuerpo que reconoce específi-camente un fragmento CBFB de una proteína de fusión CBFB-MYH11, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento MYH11 de una proteína de fusión CBFB-MYH11, un 10 anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento E2A de una proteína de fusión E2A-PBX1, un anticuerpo que re-conoce específicamente un fragmento PBX1 de una proteína de fusión E2A-PBX1, un anticuerpo que reconoce específi-camente un fragmento AF4 de una proteína de fusión MLL-15 AF4, un anticuerpo que reconoce específicamente un frag-mento BCR de una proteína de fusión BCR-ABL, y un anti-cuerpo que reconoce específicamente un fragmento ABL de una proteína de fusión BCR-ABL.
21. 21.- El método según una cualquiera de las reivin-20 dicaciones 1 a 19, en el que se selecciona al menos una sonda, preferiblemente al menos dos sondas, del grupo que consiste en anticuerpos que reconocen específicamente fragmentos MLL de proteínas de fusión MLL-AF4, MLL-AF6, MLL-AF9, MLL-AF10, MLL-ENL o MLL-ELL, anticuerpos que re-25 conocen específicamente un fragmento RARA de la proteína de fusión PML-RARA, PLZF-RARA, NPM-RARA o NUMA-RARA, an-ticuerpos que reconocen específicamente un fragmento ALK de la proteína de fusión NPM-ALK, TPM3-ALK, TFG-ALK o ATIC-ALK, anticuerpos que reconocen específicamente un 30 fragmento EWS de la proteína de fusión EWS-FLI1, ESW-ERG o EWS-ETV1, un anticuerpo que reconoce específicamente un

    fragmento PML de una proteína de fusión PML-RARA, un an-ticuerpo que reconoce específicamente un fragmento AF4 de una proteína de fusión MLL-AF4, un anticuerpo que recono-ce específicamente un fragmento AF9 de una proteína de fusión MLL-AF9, un anticuerpo que reconoce específicamen-5 te un fragmento ENL de una proteína de fusión MLL-ENL, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento AF6 de una proteína de fusión MLL-AF6, un anticuerpo que re-conoce específicamente un fragmento AF10 de una proteína de fusión MLL-AF10, un anticuerpo que reconoce específi-10 camente un fragmento ELL de una proteína de fusión MLL-ENL, un anticuerpo que reconoce específicamente un frag-mento PLZF de una proteína de fusión PLZF-RARA, un anti-cuerpo que reconoce específicamente un fragmento NPM de una proteína de fusión NPM-RARA o NPM-ALK, un anticuerpo 15 que reconoce específicamente un fragmento NUMA de una proteína de fusión NUMA-RARA, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento TPM3 de una proteína de fu-sión TPM3-ALK, un anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento TFG de una proteína de fusión TFG-ALK, un 20 anticuerpo que reconoce específicamente un fragmento ATIC de una proteína de fusión ATIC-ALK, un anticuerpo que re-conoce específicamente un fragmento FLI1 de una proteína de fusión EWS-FLI1, un anticuerpo que reconoce específi-camente un fragmento ERG de una proteína de fusión EWS-25 ERG y un anticuerpo que reconoce específicamente un frag-mento ETV1 de una proteína de fusión EWS-ETV1.
22. 22.- Uso de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en la detección o identificación de cáncer. 30