ES2344740T3 - Metodos para activar celulas nkt. - Google Patents
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Abstract
iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes al activar la célula NKT que comprende poner en contacto la célula NKT con una cantidad suficiente de iGb3 para inducir secreción de una citoquina proveniente de la célula NKT, estimular la proliferación de la célula NKT o regular hacia arriba la expresión del marcador de la superficie celular sobre la célula NKT.
Description
Métodos para activar células NKT.
La presente solicitud reivindica el beneficio de
prioridad de la solicitud Provisional U.S. Serie No. 60/606,941,
presentadas en septiembre 3, 2004, incorporada aquí como
referencia.
Esta invención fue hecha con soporte del
gobierno de los Estados Unidos otorgado por Institutos Nacionales
de Salud, bajo los otorgamientos P01 AL053725, RO1 AL38339 y
AL50487. Los Estados Unidos tienen ciertos derechos en esta
invención.
La molécula CD1d es un miembro de la familia CD1
de las moléculas asociadas a microglobulina \beta2. El contraste
con las moléculas del complejo de histocompatibilidad principal
clase I y clase II (MHC) que presentas los antígenos de péptido
presentes a las células T CD8+ y CD4+, respectivamente, las
moléculas CD1 han evolucionado para capturar y procesar tanto los
antígenos extraños como auto lípido para desplegar un subconjunto
particular de células ya conocidos de manera validas con células
NKT, células T restringidas con CD1d, células NKT invariantes o
iNKT. Las células NKT se caracterizan por reactividad de auto lípido
y una respuesta efectuadoras rápidas. Las células NKT expresan
tanto marcadores de superficie de célula cecinas naturales (NK) como
un receptor de célula T semi-invariante conservado
(TCR), específicamente, V\alpha14-j\alpha18
pareado con V\beta8 en ratones y
V\alpha24-j\alpha18 pareado con V\beta11 en
humanos.
La células NKT juegan un papel importante en un
numero de funciones inmunes, que incluyen las respuestas
antimicrobianas, la inmunidad antitumoral.
Y regular el balance entre la tolerancia y el
auto inmunidad. Ellas expresan un fenotipo de memoria natural
típicamente asociado con el reconocimiento auto reactivo y los
ligandos endógenos conservados.
Un número de agonistas naturales y sintéticos
para las células NKT se han reportado. El compuesto prototípico
utilizado para estudiar la activación de la célula NKT in
vitro e in vivo es KRN 7000, un
\alpha-galactosilceramida (\alphaGalCer)
originalmente aislada de la esponja marina Agelas mauritianus
(Kawano, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 278,
1626-29(1997); see also U.S. Patent No.
6,531, 453 to Taniguchi et al.). El trabajo previo también a
establecido el requisito para el tráfico Lisosómico de las moléculas
CD1d (Chiu, YH et al., Nat. Immunol.
3,55-60(2002)), y los papeles de la propiedad
lisosómica (Honey, K et al., Nat. Immunol. 3,
1069-74 (2002)) y las proteínas spingolipidas o
saposinas (Zhou, D et al., Science 303,
523-27(2004); Kang SJ et al., Nat
Immunol. 5, 175-81 (2004); Winau F et al.,
Nat. Immunol. 5, 169-74 (2004)). Sin embargo, el
ligando natural del receptor de la célula NKT no ha sido
previamente identificado.
Ogiso et al., Exp. Eye Res., Academia
Press Ltd., 60(2), 193-198, 1995 describe la
identificación caracterización de glicoespingolípidos neutros
aislado de lentes de rata y analiza las relaciones estructurales
entre seis de los glicoespingolípidos neutros identificados. Sin
embargo Ogiso et al. no relaciona al iGb3 o su precursor.
La EP 0 988 860, de Van Dommelen et al.
J. of Virology 2003, 77(3). 1877 y Smyth et al.
Current opinion in Immunology 2002, 14, 165 describe el uso de
células NKT activas \alphaGalCer en el tratamiento de enfermedades
autoinmunes, infecciones y cáncer. Sin embargo, estos documentos no
se relacionan con el iGb3 o su precursor.
Se describe aquí el descubrimiento de los
inventores desligando al receptor de célula NKT natural,
isoglobotrihexosilceramida (iGb3), un glicoespingolípidos
lisosómicos de la función previamente desconocida. No solamente este
descubrimiento suministra una herramienta investigativa para
estudiar y elucidar la función de la células NKT en contextos
múltiples (por ejemplo, enfermedades cancerosas, infecciosas y
autoinmunes), si no también suministra una base para la
aproximación terapéutica de estas condiciones también.
De acuerdo con esto, se describen aquí métodos
para activar la célula NKT que incluye la etapa de poner en
contacto la célula NKT con un cantidad suficiente de iGb3 para
inducir la secreción de una citoquina proveniente de una célula
NKT, estimular la proliferación de las células NKT o la expresión de
la regulación hacia arriba de un marcador de superficie celular de
la célula NKT.
En otro aspecto, la invención suministra iGb3
para uso en el tratamiento de trastornos cancerosos, infecciones o
autoinmunes al activar la célula NKT que comprende poder en contacto
la célula NKT con una cantidad suficiente de iGb3 para inducir la
secreción de citoquina proveniente de la célula NKT, estimular la
proliferación de célula NKT o la expresión de la regulación hacia
arriba de el marcador de superficie celular de la célula NKT.
La Figura 1A presenta los perfiles FACS
representativos que demuestran la selección tímica deficiente de las
células V\alpha14 NKT en el ratones Hexb^{-/-}. Los porcentajes
indican en los cuadrantes superiores. Los datos son representativos
de cinco pares de compañeros de camada examinados en tres
experimentos separados.
La Figura 1B representa los perfiles FACS de los
esplenocitos y timocitos teñidos para CD4/CD8 y CD4/CD44 en el
ratón es Hexb^{-/-}.
La Figura 2A describe las respuestas
alternativas del V\alpha14 ND32.D3 y los hibridomas
TCBII-no V\alpha14 contra los timocitos de CD1d-
de los compañeros de camada Hexb^{-/-} y Hexb^{-/-}.
La Figura 2B describe las respuestas al estimulo
del hibridoma de V\alpha14 DN32.D3 a la células de baso del
Hexb^{-/-} (\medcirc) los compañeros de camada Hexb^{-/-}
(\medbullet), \alphaGalAl-(\blacksquare) y ratones
CD1-TD knock-in (\ding{115}). Las
células de baso fueron pulsadas con variantes de \alphaGalCer
indicadas antes de la estimulación del hibridoma. Los datos son
representativos de 2 experimentos separados.
La Figura 3A es un esquema de la síntesis de
iGb3in de Golgi (flechas punteadas, derecha,) y su regradación en
el lisosoma (flechas continuas, izquierda). De la puerta superior a
la inferior, el iGb4, iGb3 y la Lactosil ceramida.
La Figura 3B describe la frecuencia del
hV\alpha24 NKT PBL, doblemente teñido mediante
anti-V\alpha24 y
CD1d-\alphaGalCer de tetrámeros, en PBMC cultivado
durante 4 días en la presencia de 100 ng/ml \alphaGalCer, iGb3, o
medio solo como se indicó.
La Figura 3C el panel izquierdo describe la
producción IFN-\gamma mediante la línea
V\alpha24 NKT humana estimulada con un rango de concertación de
iGb3 y \alphaGalCer en la presencia de PBMC como las células que
presentan antígeno que expresan CD1d. El panel de la derecha
describe la producción de IFN-\gamma vs.
IL-4 por la línea de V\alpha24 NKT humana en
respuesta al PBMC radiado y 100 ng/ml de iGb3 de origen sintético,
purificado y enzimático vs 100/ml de \alphaGalCer, Gb3 o LacCer,
como se indicó.
La figura 4A describe la estimulación de ratón
de V\alpha14 hibridoma DN32.D3 mediante iGb3 e iGb4 con este
derivado de medula ósea DC como CD1d- que expresa
antígeno-que presenta células de Hexb^{-/-},
Hexb^{-/-} y ratón CD1-TD como se indicó.
La Figura 4B describe el estimulo de hibridoma
V\alpha14 de ratón DN32.D3 mediante iGb3 con células dendríticas
derivadas de médula ósea provenientes de compañeros de camada
deficientes en (Sap ^{-/-}) y insuficientes (Sap ^{-/-}), como
se indicó.
Figura 4C el panel de la izquierda describe la
carga in vitro de iGb3 e iGb4 sobre el CD1d recombinante en
la presencia de saposina B, visualizado mediante isoelectroenfoque.
El cambio de electro movilidad indica el reemplazo parcial del GTI
b mediante iGb3 y iGb4, como se indicó. El panel de la derecha
muestra la presentación libre de célula DN32.D3 de iGb3 y iGb4
mediante el CD1d unido aplaca en la presencia saposinas B, como se
indicó.
La Figura 5A panel de la izquierda describe la
inhibición especifica mediante el IB4 de la estimulación de la
línea V\alpha24 NKT humana mediante el iGb3 pero no en PBMC
pulsado con \alphaGalCer. El panel de la derecha muestra la
inhibición del CD1 d anti-humano de mAb tanto de la
estimulación iGb3 como \alphaGalCer.
La figura 5B describe la inhibición especifica
de la respuesta autoreactiva del CD1d del V\alpha14+DN32.D3 pero
no de los hibridomas no-V\alpha14 TCB 11 y TBA7 al
RBL.CD1d mediante isolectina. B4 Los resultados se expresaron como
control % sin lectina, y son representativos de 4 experimentos
separados.
La figura 5C describe loso resultados en ELISA
(medidos como una liberación GMCSF en el sobrenadante) que
demuestra la inhibición especifica mediante IB4 de la respuesta auto
reactiva CD1d del la línea hV\alpha24 NKT a las células
dendríticas derivadas de PBMC solas, pero no la respuestas de la
células dendríticas derivadas de PBMC más el \alphaGalCer. Los
resultados se expresan como % del control sin lactina (es decir, 939
pg/ml para liberar exógeno y 294 pg/ml para liberar endógeno) y son
representativas de 3 experimentos separados.
La figura 6A describe la enzima iGb3 marcada con
FLAG-recombinante detectada mediante Western blot
como se indicó mediante la flecha:
La figura 6B describe el iGb3 sintetizado
detectado mediante el análisis HPTLC. Carril 1, lactosilceramida;
carril 2, 48% de lactosilceramida se convirtió en iGb3 (indicado
mediante la flecha) después de le incubación con enzima.
La figura 6C suministra un espectro RMN de iGb3
enzimáticamente sintetizado. El panel superior, región de campo
bajo 500-MHz espectro ^{1}H-RMN
(DMSO-d_{6}/2%D20,35ºC) de producto Gal
\alpha1,3 Gal \beta1,4 Glc\beta1,1 Cer de glucosilación
enzimática in vitro de Gal \alpha1,4 Glc \beta1,1 Cer;
panel inferior, un espectro del iGb3 químicamente sintetizado
adquirido bajo condiciones idénticas. Los números Arábigos se
refieren a los protones del anillo de los residuos designados
mediante numerales romanos en las estructuras correspondientes. El
Sph se refiere a los protones de la estructura de esfingosina; S,
resonancias que corresponden al sulfato residual; P, resonancias
que corresponden al producto. Los picos de impureza son marcadas
mediante asteriscos.
La figura 7 describe un esquema adecuado para
síntesis de iGb3.
En razón a su papel en regular varias
enfermedades de amplia dispersión, la naturaleza y la diversidad de
los ligandos reconocidas por las células NKT ha sido el objeto de
intensa investigación y especulación. Los presentes inventores han
identificado un glucoesfingolípido único,
isoglobotrihexosilceramida, denominada aquí como "iGb3", como
el ligando endógeno primario tanto el ratón de V\alpha14 como de
las células V\alpha 24 NKT.
La estructura del iGb3 se representa mediante la
siguiente formula química:
"Activar una célula NKT" aquí se refiere a
inducir un efecto observable en una célula NKT que es consistente
con una respuesta celular al TCR. Que se une mediante un estimulo.
Los efectos observables de la activación de las células NKT
incluyen secreción de las citoquinas, proliferación clonal de las
células NKT y regulación hacia arriba de la expresión de los
marcadores de superficie, por ejemplo, moléculas CD69 receptores
IL-12 y/o moléculas DC40L.
Para activar una célula NKT de acuerdo con los
presentes métodos, la células NKT es puesta en contacto con el iGb3
en una cantidad suficiente para diluir cualquiera de los efectos
observables enlistados anteriormente. La activación de la célula
NKT in vivo y ex vivo también se contemplan, como se
discutió aquí adelante.
Una "citoquina", como el término utilizado
aquí y en la técnica, es una proteína de señalización extra celular
o péptido que actúa como un mediador en la comunicación
célula-a-célula. El término
"citoquina" comprende cualquiera de tal molécula de
señalización, y puede incluir, pero no se limita a, linfoquinas,
interleuquinas, factores de necrosis tumoral, factores de
activación de colonia de granulocito-macrófago e
interferones.
Las citoquinas concretas por las células NKT
pueden regular hacia abajo o regular las reacciones inflamatorias
mediadas por célula o exhibir otras propiedades inmunosupresoras e
inmunomoduladoras. Ejemplos de las citoquinas inmonosupresoras o
inmunomoduladoras pueden incluir pero no están limitadas a,
IL-10, IL-4, y
IL-12, IL-13 y
GM-CSF. Alternativamente, la citoquina secretada
mediante las células NKT se pueden involucrar en la amplificación
de las reacciones inflamatorias. Las citoquinas inflamatorias pueden
inducir pero no están limitadas al IFN\gamma,
IL-2, IL-1, y IL-6,
IL-8, TNF, y TGF-\beta. Se aprecia
que las respuestas de los huéspedes a las citoquinas son
grandemente multifactoriales, y de acuerdo con esto, la citoquina
particular enlistadas anteriormente pueden evocar una respuesta
pro-inflamatoria o inmunomoduladora, dependiendo del
contexto celular. Más aun, las combinaciones de cualquiera de las
citoquinas anteriormente anotadas se puede secretar mediante las
células NKT luego de activación.
Los métodos para detectar y medir los niveles de
citoquina secretados también conocidos en la técnica, incluyen, por
ejemplo, ELISA, Western blotting, FACS, etc.
La proliferación de célula NKT también se puede
inducir luego de la activación mediante contacto por iGb3. La
proliferación es medida adecuadamente in vitro mediante
métodos estándar, por ejemplo, ^{3}H-timidina o
incorporación de BrdU o teñido de azul tripan.
La regulación hacia arriba de los marcadores de
superficie celular también es adecuadamente observada luego de la
activación de las células NKT. Por ejemplo, CD69, CD25, CD40L y los
receptores IL-12 son regulados hacia arriba luego
de la privación de las células NKT. Los métodos inmunológicos, tales
como los FACS, se pueden utilizar para detectar la regulación hacia
arriba de los marcadores de superficie celular, así como también
otros métodos comúnmente empleados en la técnica.
En los presentes métodos, la activación de las
células NKT se inicia típicamente al poner en contacto el TCR de la
célula NKT con el iGb3. El iGb3 se puede representar mediante las
moléculas CD1d sobre la superficie de las células que presentan
antígeno, tales como las células dendríticas, sin embargo, la
estimulación directa, es decir, el contacto del TCR con el iGb3
"libre" también se contempla. El iGb3 se puede suministra en
forma purificada o puede ser sintético. Como se utiliza aquí,
"purificado" se refiere a los compuestos que se han separado
de fuentes de naturales, aunque no se requiere ningún grado
particular de pureza. Como se utiliza aquí "sintético" se
refiere a los compuestos que se han producido de acuerdo con el
proceso sintético químico o producido mediante la acción libre de
enzima o un sustrato. Por ejemplo, el iGb3 se puede producir
mediante la acción de síntesis de iGb3 sobre lactosilcermamida, o
se puede producir mediante la acción de
\beta-hexosaminidasas sobre iGb4, que por la
siguiente estructura química:
Alternativamente, el iGb3 es adecuadamente
preparado de manera sintética de acuerdo con los métodos conocidos
en la técnica, o por ejemplo como se describió en el ejemplo 6 aquí
adelante.
El iGb3 es generado como un intermedio
transitorio durante la síntesis del iGb4 del aparato de Golgi y
durante de la degradación del iGb4 en el lisosoma (ver Figura. 3A).
Los inventores han descubierto que el iGb3 lisosoma sirve como la
fuente del antígeno para las células NKT restringidas a
CD-1d. De acuerdo con esto, los métodos presentes
pueden incluir suministar iGb4 como un "precursor iGb3" a una
célula que presenta antígeno, en donde esta se degrada a iGb3 en el
lisosoma, asociado con una molécula CD1d y cargada la membrana del
plasma para presentación de las células NKT.
Para no estar ligado con la teoría, se tiene la
hipótesis de que el iGb3 lisosómico se podría des regular en la
diabetes tipo 1 y el cáncer, donde las células NKT ejercen funciones
protectoras mediadas por las endocrinas Th2 y Th1, respectivamente.
Además, en razón a que los ligandos endógenos en lugar de los
exógenos inducen una liberación IFN-_{\gamma}
protectora mediante las células NKT durante la infección con
salmonella, el iGb3 puede activar las células con NKT durante la
infección así como también. De acuerdo con esto, la presente
invención contempla activar una población de célula NKT dentro de un
sujeto, o alternativamente, activar una población de célula NKT ex
vivo y reintroducir la población de célula NKT activada de regreso
al sujeto. El sujeto es adecuadamente un mamífero, por ejemplo, un
humano o un ratón.
Los métodos para activar una población de célula
NKT en un sujeto incluyen administrar el iGb3 o un precursor iGb3
al sujeto. La administración a un sujeto de acuerdo con algunos
métodos de la invención pueden incluir primero formular el iGb3 o
el precursor de iGb3 con unos con unos cortadores farmacéuticamente
aceptables y/o excipientes para suministrar las dosis deseadas,
etc. Las comulaciones adecuadas para los compuestos terapéuticos
son conocidas en la técnica. La administración se puede llevar a
cabo mediante cualquier método adecuado, que incluye una absorción
intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutánea,
transcutánea, oral, nasofaríngea o transmucósica, entre otras.
Sustancialmente, los compuestos se administran en una cantidad
efectiva para activar una población de célula NKT de tal manera que
el efecto terapéutico se logra en el sujeto, por ejemplo, un efecto
antineoplásico o antidiabético.
La administración del iGb3 o un precursor iGb3 a
un sujeto de acuerdo con la presente invención padece de exhibir
efectos benéficos de una manera dependiente de dosis. Así, dentro de
amplios limites, la administración de cantidades mayores de iGb3 o
del precursor iGb3 o precursor se espera para activar las células
NKT en un mayor grado que lo que lo hace la administración de una
cantidad más pequeña. Más aun, la eficacia también se contempla en
dosis bajas de nivel en el cual se ve la toxicidad. Además, en la
práctica, mayores dosis son utilizadas generalmente en donde el
tratamiento terapéutico de un estado de enfermedad es el fin
deseado, mientras que las dosis disminuidas son utilizadas
generalmente con propósitos profilácticos.
Se apreciará que la dosis especifica de
administrar un caso dado se ajustará de acuerdo con los compuestos
específicos que son administrados (por ejemplo, iGb3 o un precursor
iGb3), la enfermedad a ser tratada, la condición del sujeto, y
otros factores médicos relevantes que pueden modificar la actividad
del fármaco o la respuesta del sujeto o son bien conocidos por
aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la dosis específica
para un paciente particular depende de la edad, peso del cuerpo,
estado general de salud, de la dieta, del tiempo y del modo de
administración, de la tasa excreción, y de los medicamentos
utilizados en combinación y la serenidad del trastorno particular
al cual se aplica a terapia. Las dosis para un paciente dado se
pueden deteriorar utilizando consideraciones convencionales, por
ejemplo, mediante comparación de costumbre de las actividades
diferenciales de iGb3 (o de un precursor iGb3) y un agente conocido,
tal como por medio de un protocolo farmacológico convencional
apropiado.
La dosis máxima para un sujeto es la dosis más
alta que no origina efectos colaterales indeseables o intolerables.
El número de variables con relación al régimen de tratamiento
individual es grande, y se esperan rangos considerables de dosis.
Se anticipa que las dosis de iGb3 (o el precursor de iGb3) de
acuerdo con la presente invención reducirá los síntomas al menos en
50% comparados con síntomas pretratamiento.
Los siguientes ejemplos se suministran para
ayudar en el entendimiento adicional de la invención. Los materiales
particulares y las condiciones empleadas pretenden ser
adicionalmente ilustrativas de la invención y no limitantes luego
del alcance razonable de las reivindicaciones finales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales y métodos fueron
utilizados en los experimentos descritos en el ejemplo
2-5.
Los ratones \beta2M^{-/-}, de Jackson Labs
(Bar Harbor, MA), CD1d-/- y CD1-TD y los ratones
"Knock in" pueden llevar la molécula CD1 suprimida de cola,
los ratones \alphaGa1A^{-/-} estuvieron en el trasfondo del
C57BL/6; y los ratones Hexb ^{-/-}, GM2^{-/-} y GM3^{-/-}
estuvieron en el trasfondo de 129/Sv. En todos los casos, los
compañeros de la camada obtenidos de las parejas heterocigotos fue
reconocido el genotipo mediante PCR y utilizado para análisis
comparativo. Todos los ratones son generados en un ambiente libre de
patógeno específico en la Universidad de Chicago de acuerdo al
cuidado animal institucional y a las guías de comité de uso.
Preparación de Linfocitos y citometría de flujo.
Las preparaciones de linfocito, tetrámeros CD1d- \alphaGalCer, y
el teñido de la citometría de flujo fueron hechos acuerdo con los
protocolos estándar, por ejemplo, aquellos descritos en Zhou D
et al., Science 303, 523-27 (2004),
incorporado aquí como referencia en su totalidad.
Respuestas de células T restringidas a CD1d. Las
células que presentan antígeno fueron células de baso de ratón
cultivadas en 5x10^{5} células/pozo, las células dendríticas
derivadas de medula ósea de ratón generadas en la presencia de
GMC-SF e IL4, activada durante toda la noche 10
ng/mg de TNF-\alpha y cultivadas a 5x10^{4}
células/pozo, el PBMC humano o
GM-CSF/IL-4 células dendríticas
derivadas de PBMC- cultivadas a 2.5x10^{5} células/poso. Los
hibridomas NKT fueron cultivados a 5x10^{4} células/poso y a la
línea NKT humana fue cultivada a 2.5x10^{5} células/poso. Las
citoquinas liberadas en el sobrenadante del cultivo fueron medidas
mediante ELISA estándar para el IL-4 y
LFN-\gamma (Pharmingen-Becton
Dickinson, CA), y el bioensayo CTLL IL2 indicador para los
hibridomas de ratón. Los hibridomas NKT DN32.D3 (V\alpha14^{+}),
TCBII (V\alpha14^{-}) y el TBA7 de leucemia de basófilo de rata
RBL.CD1d línea transectal que fueron utilizadas como describió en
Park, S-H et al., J Immunol. 160
3128-34 (1998), incorporada aquí como referencia en
su totalidad. En la línea V\alpha24V\beta11 NKT policlonal
humana se derivó mediante estimulación \alphaGalCer repetida de
PBL humano saludable in vitro mantenida mediante PHA y
reestimulación IL2, y dos diferentes subclones, CD4 y ND, como
fueron utilizados en experimentos. La isolectina B4 Griffonia
Simplicifolia (IB4) fue proveniente de Vector labotatories, y el
CD1d mAb 51 anti-humano fue obtenido del Dr. S.
Porcelli. Para la estimulación con glucolípidos sintéticos, los APC
fueron pulsados durante 6 horas con varias concentraciones de
lípidos (proveniente de la solución madre en DMSO), lavada e
incubada con hibridoma de célula NKT o líneas celulares
durante 18-24 horas.
durante 18-24 horas.
La carga de lípidos CD1d y ensayo de
presentación libre de célula. Se hicieron los complejos purificados
de CD1d-GT y de intercambio de lípidos de estos
complejos se cuantifico de geles con enfoque isoeléctrico como se
describió por Cantu C III, et al., J Inmunol. 170,
4673-82 (2003), incorporado aquí como referencia en
su totalidad. L carga mediada por Saposina del lípido se efectuó con
saposina B humana recombinante descrita en Zhou D et al.,
Science 303, 523-27 (2004), incorporada aquí como
referencia en su totalidad, y con saposina de ratón de B. La
saposina de ratón recombinante de B se expreso en un sistema de
expresión al vuelo y se purifico de la misma manera utilizada para
la producción de DC1d de ratón, descrita en Benlagha K, et
al., J. Exp. Med 191, 1895-1903 (2000),
incorporada aquí como referencia en su totalidad. 2 \muM
Mcd1d-GT se incubo con 25 \muM de isoglobosido en
la presencia o esencia de 5 \muM de saposina B. Tanto las
saposinas de ratón como humano cargan igualmente iGb3 y el iGb4
sobre el Mcd1D-GT. La estimulación del hibridoma de
la célula NKT de DN32.D3 se midió. En resumen, la proteína CD1 de
ratón se recubrió durante 24 h a 1 \mug/poso en una solución
salina amortiguada con fosfato (PBS) sobre placas de 96 posos. Las
placas fueron lavadas 3 veces con PBS y luego encubadas durante
otras 24 h con una concentración de lípido constante de 6 \mug/ml
y en varias concentraciones de saposina B de ratón. Las placas
fueron lavas 3 veces con PBS; luego se agregaron 2x10^{4} células
de hibridoma. Los sobrenadantes se recolectaron después de 24 h para
medir la
liberación IL-2.
liberación IL-2.
Síntesis de iGb3. De acuerdo con la secuencia
mRNA de un homólogo de ratón de enzima de sintasa iGb3 (acceso
GenBank No: XM_144044), se diseñaron los cebadores para clonar una
forma soluble de la enzima proveniente de el cDNA preparado de
timos de ratón.
- 5' ATTATTATCAGGCTCATAGAAGG 3' (SEQ ID NO: 1)
- 5' CTAGTTTCGCACCAGCGTATATTC 3' (SEQ ID NO: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
Una enzima recombinante se produjo utilizando un
sistema de expresión de célula de insecto Sf9, con un péptido de
FLAG N-terminal para inmunopurificación mediante
glóbulos de agarrosa anti-FLAG M2 (Sigma). El iGb3
etiquetado con FLAG se detecto mediante Western blot, como se
mostró en la FIG. 6A. Para sintetizar el iGb3, se agregó sintasa
iGb3 recombinante purificada a 1 ml de mezcla de 2 mM de
UDP-galactosa (sigma), 0.2% de Triton
X-100, 200 \mug lactosilceramida (Matreya) y 20
mM de MnC1_{2} en 100 Mm de amortiguador Tris (pH 7.4), durante
toda la noche a 37ºC. Los glucolípidos se purificaron mediante
cromatografía de columna C18 de fase inversa y se eluyeron mediante
elusión isocracial de 10% a 100% de metanol. Los productos de
reacción se analizaron mediante HPTLC, como se muestra en la
Figura. 6B. Las muestras de glucoesfingolípido fueron de deuterio
intercambiado mediante edición repetida de
CDCI3-CD30D 1: 1, sonicación, evaporación bajo
nitrógeno seco, y luego disueltas en 0.5 mL
DMSO-d_{6}/29%D_{2}O, que contenía 0.03% de
tretametilsilano como referencia de cambio químico. El espectro
RMN-1D 1H mostrado en la Figura. 6C fue adquirido a
35ºC sobre un espectrómetro de Varian Inova de 500 MHz con su
presión del HOD residual mediante pulso de restauración durante el
retraso de relajación. Los datos espectrales para el producto
biosintético se interpreta mediante comparación con aquellos de los
estándares de glucoesfingolípido relevantes adquiridos bajo
condiciones virtualmente idénticas así como también los datos
previamente
publicados.
publicados.
Espectro RMN 1-D^{1}H de la
enzima incorporada al iGb3 como se muestra en la Figura. 6C, el
espectro RMN 1-D^{1}H de la mezcla de reacción
purificada claramente exhibió resonancia H-1
consistentes con la presencia de un producto CTH que contiene un
residuo de \alpha-galactosa terminado reductor, a
niveles de aproximadamente 40-50% de aquellos de
substrato aceptador CDH. La comparación con los datos con
^{1}H-RMN publicados para varias variantes CTH
naturales, y para estándares sintéticos de los variantes CTH
isoméricas Gal \alpha 1,4 Gal \beta1, 4 G1c \beta 1,1 Cer
(iGb3) y Gal \alpha 1,3 Gal \beta1,4 G1c \beta 1,1 Cer (iGb3),
como indicaron que los productos es iGb3. Como se mostró en la
Figura. 6, resonancias diagnosticas para H-1 de
Gal\alpha3, Gal\beta4, y Glc\beta1 del iGb3 se observaron en
4.836 ppm (^{3}J _{1,2}=3.7 Hz), 4.288 ppm (^{3}J
_{1,2}=7.8 Hz) y 4.168 (^{3}J _{1,2}=7.8 Hz), respectivamente.
En contraste, el H-1 del Gala4, Gal\beta4, y
Glc\beta1 y Gb3 se observaron a 4.798 ppmm (^{3}J _{1,2}=3.7
Hz) 4.257 ppm (^{3}J _{1,2}=7.6 Hz), y 4.163 ppm (^{3}J
_{1,2}=7.6 Hz), respectivamente (datos no mostrados). El anterior
conjunto de resonancia H-1 fue claramente
recapitulada en el espectro de los productos parcialmente
convertidos; así, en adición a las resonancias H-1 a
4.205 ppm (^{3}J _{1,2}=7.0 Hz) y 4.163 (^{3}J _{1,2}=7.7
Hz), que corresponde al H-1 del Gal\beta4 y
Glc\beta1 del substrato CDH, las resonancias H-1
se observaron a 4.836 ppm (^{3}J _{1,2}=3.7 Hz) y 4.288 ppm
(^{3}J _{1,2}=7.3 Hz), idénticas a aquellas del Gala3 y el
Gal\beta4 de iGb3 (el cambio químico del Glc\beta1
H-1 no se afecta significativamente mediante la
adición del residuo Gala 3 terminal, que aparece a 4.166 ppm
(^{3}J _{1,2}=8 Hz). Las resonancias diagnosticas adicionales
para la estructura iGb3 se puede observar para el
H-5 del Gala\alpha3. H-4 del
Gal\beta4, y el H-4 del Gala a 3.992,3.857, y
3.739 ppm, respectivamente, en ambos espectros. Las resonancias
comparables para el H-5 del Gala4,
H-4 de Gal\beta4, y H-4 de Gala4
en la estructura Gb3 se observaron a 4.074, 3.791 y 3.744 pmm,
respectivamente (datos nos mostrados). Estas diferencias de cambio
químico se pueden todas racionalizar sobre la base de influencia de
protección/desprotección mutuas de átomos de los dos residuos Gal
unidos uno al otro mediante enlaces \alpha 1,3 versus \alpha 1,4
en el iGb3 y el Gb3 respectivamente. Las características de
pseudotripleta para el H-5 del Gal\alpha4 en Gb3
esta conspicuamente ausente de los espectros de ambos iGb3 vio
sintéticos y sintéticos en la densidad de 4.074 ppm, y es en lugar
traslapado con la resonancia Sph-1b observada a
-3.98 ppm. Así, la identidad del producto vio sintético es solamente
demostrada como iGb3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los linfocitos del timo y baso de los
Hexb^{-/-} y los compañeros de camada Hexb^{-/-} teñidos con
tetrámeros CD1d-\alphaGalCer y
anti-CD44. Los números absolutos de los linfocitos
en el timo y el baso del mutante y de los ratones tipo silvestre
fueron similares. Como se muestra en la Figura. 1A, los ratones
Hexb^{-/-} deficientes en glicoesfingolípidos lisosomas que
degradan la subunidad de la enzima
\beta-Hexosaminidasa b, exhibió una reducción
severa en las células de V\alpha14 NKT. El tetrámero
CD1d-\alphaGalCer que tiene en ambos timos y
vasos se redujo en un 5% de los compañeros de camada de control,
cerca al nivel de trasfondo de los ratones deficientes en la
expresión de CD1d tal como ratones
\beta2-microglobul^{-/-} (\beta2M^{-/-}) y
ratones CD1d^{-/-}(no mostrado). En contraste, como se
muestra en las Figuras. 1B, el desarrollo de las células CD4 y CD8
T clásicas, inalteradas y de memoria, así como también las células B
\gamma\deltaT y células NK (no mostradas), se conservó.
Aunque la expresión de la superficie CD1d estuvo
inalterada, como se mostró en la Figura. 2A, las células
Hexb^{-/-} fallaron en provocar una respuesta del hibridoma de la
célula V\alpha14 dn32.d3. (Los timocitos
\beta-2M^{-/-} a los que les falta la expresión
CD1d sirvieron como control negativo). En contraste, la respuesta
de los hibridomas NKT auto reactivos CD1d
no-V\alpha14, tal como el CD11 se conservaron,
sugiriendo un defecto selectivo en la generación de ligandos
lisosómicos putativos de las células V\alpha14 NKT.
Utilizando un panel derivado diglicosilados de
\alphaGalCer que requieren procesamiento lisosómico en el
\alphaGalCer antes del reconocimiento mediante las células
V\alpha14 NKT (como se describo en Prigozyet TI et al.,
Science 291, 664-7 (2001), incorporada aquí mediante
referencia en su totalidad) las funciones lisosómicas de las
células Hexb^{-/-} fueron sondeadas adicionalmente. Como se
muestra en la Figura. 2B, consistentes con las especificidades del
substrato conocido de las enzimas correspondientes, hubo un defecto
selectivo en la presentación del GalNAc \beta1,4 Gal \alphaCer
por las células Hexb^{-/-} mientras, en contraste, las células de
\alpha-Galactosiasa A
(\alphaGalA)^{-/-} mostraron un defecto selectivo para
el Gal \alpha 1,4 Gal \alphaCer y Gal \alpha1,2 Gal
\alphaCer. Estos resultados demostraron la naturaleza específica
de los defectos de presentación del antígeno con estas mutaciones.
Como se espero, las células "Knock in" CD1-TD
fueron marcadamente defectuosas en la presentación de todos estos
glucolípidos de complejo, debido al reciclamiento lisosómico
afectado el CD1d que lleva un truncamiento del motivo del blanco
endosómico citoplasmático.
\vskip1.000000\baselineskip
Los globotrihexosilceramida sintetizados
químicamente (Gb3, Gal \alpha1,4 Gal \beta1,4 Glc \beta1,1
Cer) y la isoglobotrihexosilceramida (iGb3, Gal \alpha1,3 gal
\beta1,4 Glc \beta1,1 Cer) se probaron por su capacidad para
estimular las células NKT de la presencia de células que presentan
antígeno. Como se mostró en las Figuras. 3-4, iGb3
fue un estimulador potente tanto del V\alpha24 humano como de las
células V\alpha14 NKT de ratón. Como para el \alphaGalCer, el
iGb3 estimula selectivamente y expandió las células V\alpha14 NKT
humanas en cultivos de 4 días de PBMC (Figura. 3B). El iGb3
sintético presentado mediante PBMC irradiado estimulo un Th1
potente (IFN\gamma) y Th2 (IL4) secreción de citoquina mediante
líneas NKT humanas policlonales (Figura. 3C, paneles de la
izquierda y la derecha) así como también las líneas CD4y DN
clonadas 2/2 (no mostradas). El iGb3 derivado de otras fuentes,
incluye iGb3 natural purificado del intestino de gato y el iGb3
producido in vitro mediante la acción de iGb3 sintasa y
lactosilceramida y UDP-galactosa, fueron
estimulatorios también, provocando citoquinas Th1 y Th2 a niveles
comparables al de \alphaGalCer (Figura. 3C, panel de la derecha).
El iGb3 presentado por las células dendríticas derivadas de medula
ósea que expresan CD1d-estimularon el hibridoma de
la célula mV\alpha14 NKT DN32.D3 (Figura. 4A) así como también
5/5 de otros hibridomas mV\alpha14 individuales (no mostrados) y
fallaron en estimular los hibridomas 3/3
no-V\alpha14 (no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Como se mostró en la Figura. 4A, panel de la
derecha, iGb4 presentadas por células dendríticas derivadas de
médula ósea fueron estimuladoras para ratón y humano (no mostradas)
mientras que el LacCer, que también se generó mediante degradación
del GM3, tampoco lo fue. También se mostró en la Figura 4A, las
células Hexb^{-/-} presentadas por iGb3 pero fallaron en
presentar iGb4 y el tráfico CD1d al compartimiento lisosómico fue
esencial para presentar estos antígenos debido en parte a la
función esencial de las saposinas (Figura. 4B) Así, el
reconocimiento del ligando requiere por lo menos tres residuos de
sacárido de las series isoglobo.
En un ensayo libre de célula, el iGb3 y el iGb4
requiere ambas saposina B para reemplazar el GT1b precargado sobre
el CD1d (Figura. 4C. panel de la izquierda). Más aun, los complejos
CD1d-iGb3 directamente simularon las células
V\alpha14 NKT (Figura 14C, panel de la derecha). En contraste, el
CD1d/iGb4 solo licitaron una respuesta muy débil. Junto con estos
resultados demuestran que el iGb3 es el ligando directo de la célula
V\alpha14 NKT y que, in vivo, los residuos de sacárido
distantes del iGb4 tienen que ser removidos mediante la acción de
\beta-hexosaminidasas en el lisosoma antes del
reconocimiento TCR en la membrana del plasma.
\vskip1.000000\baselineskip
El bloque del desarrollo de la célula
V\alpha14 NKT en los ratones Hexb^{-/-} en la incapacidad de los
timositos Hexb^{-/-} para estimular los hibridomas V\alpha14
NKT siguieren que el iGb3 solo podría ser el ligando natural
principal de la célula mV\alpha14 NKT y hV\alpha14 NKT. Esta se
probo utilizando isolectina B4 de Griffonia Simplicifolia (IB4),
una lectina altamente específica para que Gal terminal \alpha1,3
Gal como se encontró en el iGb3. Como se mostró en la Figura 5A, el
IB4 daño la estimulación celular del hV\alpha14 NKT al agregar
exógenamente iGb3 pero no el \alphaGalCer. En contraste, el
anti-CD1d mAb bloque lo estimulación por ambos
glucolípidos. Estos resultados fueron consistentes con la
especificidad del IB4 y se indicó que este reconocía los sacáridos
terminales del iGb3 aun cuando se unieron al CD1d, como se podía
esperar de los modelos de estructura habituales que colocan los
residuos de sacarida por fuera de la ranura de las moléculas CD1
expuestas a los reconocimientos por el TCR o la lactina.
Esta propiedad del IB4 se explotó para probar si
los residuos Gal \alpha1,3 Gal residuales contribuyeron
significativamente al estimulo natural de las células mV\alpha14 y
hV\alpha24 NKT. Como se muestra en la Figura. 5B, el IB4 daño el
estimulo auto reactivo natural del DN32.D3 mediante las células RBL
que expresan el CD1d de ratón, mientras que, como esperaba, el
estimulo de los hibridomas auto reactivos sin V\alpha14 CD1d
tales como el TBA7 y el TCB11 no se afectaron. Adicionalmente, como
se muestra en la Figura. 5C, el IB4 también bloqueo el
reconocimiento natural de las células dendríticas derivadas de
PBMC-que expresan CD1d por la línea V\alpha24 NKT
humana, pero fallaron en bloquear el reconocimiento al agregar
exógenamente \alphaGalCer. De manera interesante, el bloqueo de
IB4 del reconocimiento del iGb3 en humanos requirió aproximadamente
1000 veces menos lactina que en ratón (0.2 ng/ml vs 0.2 \mug/ml,
respectivamente). Esto es probable por que los ratones, pero no los
humanos, expresan cantidad muy abundantes de un ligando IB4
adicional, el epítopo Gal \alpha 1,3 Gal expresado sobre
glicoproteína. Así, los experimentos que bloquean IB4 suministraron
una confirmación independiente del papel prominente del iGb3 como
un ligando natural tanto de las células mV\alpha14 y hV\alpha14
NKT.
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto 2, mostrado en la Figura. 7, se
utilizó como material en la generación de iGb3. El esquema sintético
1, también mostrado en la Figura. 7, se inició al acoplar el
compuesto 2 con el drenador 3, seguido al remover el grupo
protector bencilo. Los alcoholes restantes fueron asignados para
generar el compuesto 4. El alcohol anomérico se liberó, y el
trisacárido se acopló a la ceramida 5. La purificación del compuesto
6, seguido por la desprotección dio iGb3 con buen rendimiento. Los
reactivos utilizados en el esquema 1 fueron como sigue (rendimiento
en paréntesis): a) AgOTf, 4 A MS, CH_{2}Cl_{2} (61%); b) H2,
Pd/C (10%), EtOAc, EtOH (61%); c)Ac_{2}O, Et_{3}N, DMAP
(95%);d) TFA, CH_{2}CL_{2} (99%); e1) CCl_{3}CN,
K_{2}CO_{3} e2) 5, BF_{3}-OEt, MS AW300,
CH_{2}Cl_{2}; (45%); f) NaOMe, MeOH (86%).
Como se utilizó en esta especificación en las
reivindicaciones finales, unas formas singulares "un",
"una" y "el" incluyen las referencias plurales a menos
que su contenido claramente dicte otra cosa. Así, por ejemplo, la
referencia a una composición que contiene "un polinucleotido"
incluye una mezcla de dos o más polinucleótidos. Se debe notar
también que el término "o" es generalmente empleado en el
sentido de incluir "y/o" a menos que el contenido claramente
dicte otra cosa. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de
patentes referenciadas en estas especificaciones son indicativas
del nivel de desperdicio ordinario en la técnica a la cual esta
dimensión de esta dimensión pertenece. Todas las publicaciones,
patentes y solicitudes de patentes son expresamente preparadas aquí
mediante referencia en la misma proporción que si cada publicación
individual o solicitud de patente fuera específica e
individualmente indicada mediante referencia. En caso de conflicto
entre la presente descripción y las patentes incorporadas, las
publicaciones y referencias, la presente descripción debe
prevalecer.
También se entiende específicamente que
cualquier valor numérico citado aquí incluye todos los valores desde
el valor inferior al valor superior, es decir, todas las posibles
combinaciones de los valores numéricos entre el valor más bajo y el
valor más alto numerado para ser considerado como expresamente
establecido en esta solicitud. Por ejemplo si un rango de
concertación se establece como 1% a 50%, pretende que los valores
tales como 2% a 40%, 10% a 30%, o 1% a 3% etc. Sean expresamente
numerados en esta especificación. Esto son solo ejemplos de lo que
se pretende específicamente.
Claims (15)
1. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes al activar la célula NKT que
comprende poner en contacto la célula NKT con una cantidad
suficiente de iGb3 para inducir secreción de una citoquina
proveniente de la célula NKT, estimular la proliferación de la
célula NKT o regular hacia arriba la expresión del marcador de la
superficie celular sobre la célula NKT.
2. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el iGb3 es purificado o sintético.
3. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 1 o 2, en donde poner en contacto la célula NKT
comprende poner en contacto un receptor de célula T y la célula
NKT.
4. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes a una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el iGb3 se presentó a la célula NKT
mediante una célula que presenta antígeno que comprende una
molécula CD1d.
5. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 4, en donde la célula que presenta antígeno es una
célula dendrítica.
6. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 5, en donde un precursor iGb3 es suministrado a la
célula que antígeno para producir iGb3.
7. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 6, en donde un precursor iGb3 es iGb4.
8. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 1 a 7, en donde las células NKT es cultivada ex
vivo.
9. iGb3 para uso en el tratamiento de trastornos
cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la citoquina se selecciona el grupo que
consiste de IL-1, IL-2,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10, IL-13,
IL-15, TNF-\alpha,
TNF-\beta, IFN-\gamma y
combinaciones de las mismas.
10. iGb3 para uso en el tratamiento de
trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo a una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el marcador de
superficie celular es CD69, CD25 un receptor IL-12
o CD40L.
11. iGb3 para uso en el tratamiento de
trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la célula NKT es cultivada in
vitro.
12. iGb3 o precursor iGb3 para uso en el
tratamiento de trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes.
13. iGb3 para uso en el tratamiento de
trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 12, en donde el iGb3 se purifica o se sintetiza.
14. iGb3 para uso en el tratamiento de
trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 12, en donde el precursor es iGb3 también se purifica
o se sintetiza.
15. iGb3 para uso en el tratamiento de
trastornos cancerosos, infecciosos o autoinmunes de acuerdo con la
reivindicación 14, en donde el precursor es iGb4.
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