WO2010139838A1 - Mamífero no humano modificado genéticamente, células y métodos para producirlas - Google Patents

Mamífero no humano modificado genéticamente, células y métodos para producirlas Download PDF

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José Balbino ALARCÓN SÁNCHEZ
Pilar DELGADO CAÑAVERAS
Xosé Ramón GARCÍA BUSTELO
Beatriz CUBELOS ÁLVAREZ
Nuria MARTÍNEZ MARTÍN
Enrique Calleja Sierra
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Definitions

  • the present invention is within the field of molecular biology and biotechnology, and refers to a genetically modified non-human mammal whose cells comprise a functionally inactivated nucleotide sequence or that has been totally or partially suppressed, where said sequence corresponds to a gene which codes for the TC21 protein (RRas2 or R-Ras2).
  • the invention also refers to an isolated cell, from a mammal, genetically modified to present the described genetic modification, as well as to the methods to produce both animals and genetically modified cells and to the use of said cells and methods which comprise them for the screening and selection of compounds with a modulating capacity for survival and homeostasis of B and T cells.
  • the present invention relates to a nucleotide sequence capable of generating a siRNA for post-transcriptional silencing of the expression product of said TC21 protein.
  • T and B lymphocytes In the absence of antigens, the number of peripheral T and B lymphocytes is constant thanks to strict homeostatic mechanisms, which prevent their uncontrolled proliferation and therefore the development of lymphomas (Seddon and Zamoyska. 2003. Curr Opin Immunol, 15: 321-324) . These mechanisms also guarantee the availability of clonal cell populations, whose specific proliferation in response to pathogens is regulated by signals transmitted by interleukins and by growth factors, signals that differ for T and B cells, and for "virgin" lymphocytes ( “naive”) with respect to memory lymphocytes. In the control of the proliferation of T and B cells, both in homeostasis and in response to antigen, their respective antigen receptors (TCR and BCR) have great relevance.
  • TCR and BCR antigen receptors
  • TCR is composed of the ligand binding subunits TCR ⁇ and TCR ⁇ and the signaling subunits CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ and CD3 ⁇ .
  • the TCR stimulates the passage of the GO phase to G1 of the cell cycle of the T lymphocytes, who, under the stimulation of the cytokines produced in response to the antigen binding (mainly the IL-2) progress in said cycle, resulting in a clonal expansion of lymphocytes that respond to a given antigen.
  • the survival of mature T lymphocytes is very limited, probably because they need the low intensity signals that this receptor constantly produces in response to the binding of the main histocompatibility complex (MHC) to non-peptides.
  • MHC main histocompatibility complex
  • antigenic Similarly, the absence of the B cell antigen receptor (BCR) greatly limits the survival of mature B cells (Lam et al. 1997. CeII, 90: 1073-1083).
  • PI3K phosphoinositidyl-3-kinase
  • This subunit is selectively activated by the R-Ras and R-Ras2 proteins (also called TC21), which belong to the Ras family of proteins. Ras proteins are molecules that regulate the cell cycle through conformations of their binding to GTP (active form) and their binding to GDP (inactive form).
  • lymphocytes the signal transmission pathways in which TC21 is involved are unknown. Therefore, it would be important to use certain cells from a genetically modified organism or directly modified cells, to facilitate the selection of compounds capable of modulating the homeostasis of B and T cells and, as a consequence, for the treatment of related cancerous diseases with said B and T lymphocytes.
  • the present invention is within the field of molecular biology and biotechnology, and refers to a genetically modified non-human mammal whose cells comprise a functionally inactivated nucleotide sequence (which has been suppressed) totally or partially where said sequence corresponds to a gene that codes for the TC21 protein (RRas2 or R-Ras2).
  • the invention also refers to an isolated cell, from a mammal, genetically modified that has the described genetic modification as well as to the methods to produce both animals and genetically modified cells and to the use of said cells and methods that they comprise for the screening of compounds with the modulation capacity of survival and homeostasis of B and T cells.
  • the present invention refers to a nucleotide sequence capable of generating a siRNA for post-transcriptional silencing of the expression product of Ia cited protein TC21.
  • TCR and BCR The receptors of the T and B cell antigens (TCR and BCR) transmit low intensity signals necessary for the survival and maintenance of mature cell populations.
  • TCR and BCR The receptors of the T and B cell antigens
  • the authors demonstrate here that the TC21, a small GTPase, constitutively interacts with TCRs and BCRs through tyrosine-based activation motifs associated with immunoreceptors (ITAM) found in their CD3 subunits.
  • ITAM immunoreceptors
  • the expression of both a dominant-negative TC21 mutant or a shRNA construct in T cells causes a rapid decrease in cell viability. More importantly, TC21 - / - mice have few mature T and B cells, possibly as a result of poor homeostatic proliferation and defective survival.
  • ITAM immunoreceptors
  • T cells The transfection of T cells with either a dominant negative mutant TC21 or with a shRNA consuruction leads to a rapid loss of cell viability, indicating that TC21 has a role not to redundancy in the survival of the T cell. Furthermore, when the TC21 gene has inactivated in roots, few peripheral B and T cells were said, although these develop normally. The lymph nodes of the deficit rails on TC21 appear to be reduced in the germinal girdles, and the marginal zone B (ZM) cells are virienically auseni. These results suggest that TC21 binds directly to TCR and BCR in which it plays an essential role in survival mediated by the anigene receptor and in homeosylagic signaling.
  • ZM marginal zone B
  • TC21 direct association of TC21 with non-phosphorylated viral and non-viral ITAMs (for example, those of TCR and BCR) suggests a role for TC21 in the signaling of low inertia of the anigene receptor, as well as in the transformation of lymphocytes.
  • non-phosphorylated viral and non-viral ITAMs for example, those of TCR and BCR
  • One aspect of the present invention is an isolated cell from a genetically modified mammal, comprising a nucleoid sequence that has at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1, functionally inactivated or partially or partially deleted. , in homozygosis or heyerozygosis.
  • the nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1 can be, but not limited to, a genomic DNA sequence, a sequence that contains exons and introns.
  • the sequence SEQ ID NO: 1 is the coding sequence (cDNA; sequence containing only exons) of the Musas musculus RRas2 gene (mouse). After processing (splicing) the messenger RNA (mRNA) transcribed in the cell from said genomic DNA sequence or from the cDNA sequence SEQ ID NO: 1, an identical protein is produced starting from any of the two sequences.
  • the proteins, product of the expression of the nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1, have an identity greater than 80% and have the same function. That is, sequences with at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1 are homologous sequences of the mammalian RRas2 gene.
  • Homologous sequences refer to sequences of different species with similar phenotypic expressions that come from a common ancestral sequence. Within the sequence homology, two types of homology are distinguished: orthology and paralogy. Orthologous sequences belong to species that have a common ancestor. The paralogic sequences are those found in the same organism and one comes from the duplication of the other. In this preferred embodiment of the present invention all homologous sequences are considered, both orthologs and paralogs, which have at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1. This homologous sequence covers the sequences that encode for a homologous sequence of SEQ ID NO: 1 in mice and in any other mammal.
  • the genetically modified cell contains a product of the expression of the sequence with at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1 not functional.
  • the product of the expression It is a non-functional protein as a consequence of the functional inactivation or total or partial deletion of its sequence (the term “disruption” can also be used to refer to "deletion”).
  • the cell contains said genetic modification in homozygosis (- / - or TC21 '/' ) or in heterozygosis (+/- or TC21 + / ⁇ ). In homozygosis, the genetic modification is present in the two copies of the genome, which ensures the transfer of the same to the descending cells if this is the nuclear DNA.
  • the genetic modification is present in a single copy of the genome (gene ID 66922, chromosome 7, annotation NC_000073.5 in mice; gene ID 22800, chromosome11 p15.2 annotation NC_000011.8 in humans).
  • the modified cell of the present invention contains said genetic modification in its genomic DNA.
  • the genetically modified cell can be achieved by crossing or by plastidium transformation of the host cell. Genetically modified cells can have said genetic modification in one or more types of genetic material of the cell; chloroplast, mitochondrial or nuclear.
  • a preferred embodiment of the present invention refers to the genetically modified cell isolated from a mammal, where the nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1, is the cDNA sequence itself SEQ ID NO: 1.
  • Another preferred embodiment refers to the genetically modified cell where said cell is somatic or germinal.
  • the term "somatic cells” as understood in the present invention refers to the cells that integrate the tissues or organs of a mammal.
  • the term “germ cells” as understood in the present invention refers to the cells that form the gametes of a mammal.
  • the germ cell is selected, but not limited to, from Oocyte (synonymous with oocyte) or female germ cell.
  • the genetically modified cell is a stem cell.
  • Stem cells are undifferentiated cells that have the ability to divide indefinitely without losing their properties and produce both differentiated and undifferentiated cells. Depending on the origin of the stem cells, it is possible to differentiate between embryonic stem cells and adult stem cells.
  • the stem cell referred to in this embodiment of the present invention refers to an adult, but not embryonic, stem cell.
  • Embryonic stem cells come from the internal cell mass of the blastocysts and have as their main characteristic the fact that they are pluripotential, which means that they can give rise to any adult tissue derived from the three embryonic layers (US 6,200,806).
  • the stem cell is selected from the list comprising pluripotent, multipotent or unipotent.
  • the pluripotent (or pluripotential) stem cell is able to differentiate itself to any type of cell derived from any of the three embryonic layers (ectoderm, mesoderm or endoderm) and as a consequence, to any adult tissue derived from any of said embryonic layers but it is not able to form a complete organism.
  • the multipotent (or multipotential) stem cell can generate cells of its own embryonic layer of origin.
  • the unipotent (or unipotential) stem cell can only form a particular type of cell.
  • a further preferred embodiment refers to the genetically modified cell where the mammal is a non-human mammal.
  • the mammal is Mus musculus (mouse).
  • Another preferred embodiment refers to a genetically modified cell isolated from a non-human mammal or a mouse, wherein said cell is selected, but not limited to, from the list comprising oocyte, blastomer, blastomer or embryonic cell.
  • An oocyte (or oocyte) is a female germ cell in a stage of maturity prior to the mature ovum.
  • a blastomer is the cell resulting from the segmentation of the zygote.
  • a blast is one of the cells that make up the blast.
  • the term "embryonic cell” as understood in the present invention refers to one of the cells that integrate the cell mass that is implanted in the uterus after crossing the fallopian tube.
  • said cell is a stem cell.
  • stem cells refers to embryonic stem cell. The behavior of these cells as stem cells is conditioned by factors that can be controlled in vitro and which, however, do not remain constant in vivo. Thus the stem cells of this preferred embodiment are obtained from cells in a suitable stage to allow their behavior as stem cells.
  • Any of the genetically modified cells of the invention can generate a derived cell line.
  • Another aspect of the present invention is a genetically modified non-human mammal that contains the genetically modified cell of a mammal or the genetically modified cell of a non-human mammal.
  • a preferred embodiment relates to a genetically modified non-human mammal where said mammal is a mouse.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the genetically modified cell of the invention for the screening of compounds with modulatory capacity of homeostasis of B and T cells.
  • screening refers to the exploration or testing of several compounds with respect to their modulating capacity of homeostasis of B and T cells.
  • the compounds used in said screening are candidate compounds derived or not derived from other leading compounds.
  • the compounds can be obtained by combinatorial chemistry or from natural sources.
  • moduleating capacity of homeostasis refers to the ability to modify the factors involved in the homeostasis of a certain process to obtain different results.
  • Homeostasis is defined as the set of self-regulation phenomena, which lead to the maintenance of the constancy in the composition and properties of the internal environment of an organism.
  • T cells are a type of lymphocyte that differentiates (specializes) initially in the thymus
  • B cells are another type of lymphocyte that differs in the liver and fetal spleen, and in the adult's bone marrow.
  • several compounds are explored or tested with respect to their ability to modify the normal metabolism of B and T cells, preferably the proliferation capacity of said cells.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for the production of the genetically modified cell of the invention comprising: a) Obtaining at least one isolated cell from a mammal, b) transfecting the cell of section (a) with a retroviral vector, capable of inserting a nucleotide sequence into any nucleotide position of a sequence that has at least one
  • transfection refers to the introduction of external genetic material into cells by means of plasmids, viral vectors (in this case also referred to as transduction) or other tools for transfer known in the state of the art.
  • transformation is preferred to describe non-viral transfers of genetic material into bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae or plants.
  • the nucleotide sequence (section [b] of the method) is preferably inserted into an intron of a nucleotide sequence with at least 80% identity with SEQ ID NO: 1. More preferably the nucleotide sequence is inserted at any nucleotide position of the first intron .
  • that cell is selected in which the product of the expression of the sequence with at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1 is not functional.
  • the product of the expression is a non-functional protein as a result of the functional or total or partial deletion (or disruption) of its sequence.
  • the selection can be carried out by means of the analysis of the product of the expression of the sequence with at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1 by means of detection and / or quantification methods known in the state of The technique
  • a preferred embodiment refers to the method for the production of the genetically modified cell of the invention, where the sequence having at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect of the present invention is a method for the production of the genetically modified non-human mammal of the invention comprising: a) Incorporating the stem cell according to any of claims 8 or 9 into an embryo, b) introducing the embryo of the section ( a) in a sexual organ of a female individual in conditions where said individual is able to develop progeny, ec) identify at least one descendant of the progeny of section (b) that contains the nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence coding for SEQ ID NO: 1 functionally inactivated or totally or partially deleted, in homozygosis or heterozygosis.
  • the incorporation of the stem cell is preferably carried out by microinjection.
  • the stem cell is totipotent, pluripotent, multipotent or unipotent.
  • the fertilized oocyte that is, the zygote or egg cell
  • the fertilized oocyte is totipotent, that is, it is capable of producing all the cell types that make up an individual including the placenta.
  • the blastomer, the blast cell or the embryonic cell, or any other cell of the cell mass internal they are not totipotent because they cannot give rise to a placenta, they are pluripotent, since they can give rise to cells that integrate each of the three embryonic tissues or layers, the ectoderm, the mesoderm and the endoderm.
  • embryonic cell refers to the cell that comes from the cell mass that is implanted in the uterus after crossing the fallopian tube.
  • section (b) of the method the introduction of the embryo into a sexual organ of a female individual is carried out under conditions where said individual is able to develop progeny. These conditions are, but not limited to, pseudopregnated females, that is, females experiencing psychological pregnancy.
  • a preferred embodiment of the present invention refers to the method for the production of the genetically modified non-human mammal of the invention, where the embryo of section (a) is a fertilized oocyte, morula or blastocyst.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the method for the production of the genetically modified non-human mammal of the invention where the incorporation of the stem cell of section (a) contributes to all cell lineages of said embryo.
  • Cell lineages are those that come from any of the three embryonic layers already mentioned in the present invention.
  • Another preferred embodiment of the invention is the method for the production of the genetically modified non-human mammal where the sequence nucleotide that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 1.
  • Another preferred embodiment is the method for the production of the genetically modified non-human mammal of the invention, where it also comprises crossing a descendant identified in section (c) to produce heterozygous non-human mammals in the genetic modification introduced.
  • another even more preferred embodiment refers to the method for the production of the non-human mammal, where it also comprises crossing two heterozygous offspring to produce at least one homozygous offspring in the genetic modification introduced.
  • Another aspect of the present invention is the method for screening compounds with modulatory capacity of homeostasis of B and T cells comprising: a) Cultivating at least one genetically modified cell according to any of claims 1 to 9 in a culture medium , b) administering a compound to the cell of section (a), or to said culture medium, to generate at least one treated cell, c) measuring the modulating capacity of the homeostasis of the cells
  • the compound is a substance that can be modulating, or potentially modulating or simply a substance whose modulating capacity of B and T cells is desired.
  • section (d) of the method said modulating capacity of section (c) is compared with the modulating capacity of homeostasis of the B and T cells produced by the compound of section (b) in control cells.
  • the cells control can be non-genetically modified cells or genetically modified cells.
  • the genetically modified control cells can produce the overexpression of the TC21 protein.
  • the method allows to determine the modulating capacity of the homeostasis of the B and T cells correctly since the determination of said capacity in control cells not genetically modified only, would not allow to differentiate between if the compound that modulates said homeostasis does it by means of the expression of the nucleotide sequence that codes for SEQ ID NO: 1 or through the expression of other sequences.
  • the compound administered to the cell of section (a) is useful for the purpose of the present invention provided that said compound exerts a modulating effect of the homeostasis of the B and T cells in the non-genetically modified (or modified) control cells genetically that overexpress the TC21 protein) and do not exert said modulating effect in the genetically modified cell of the present invention (or exert a minor effect).
  • This difference means that the modulating effect is carried out primarily through the expression of the nucleotide sequence coding for SEQQ ID NO: 1.
  • the contribution of said nucleotide sequence to the modulation of homeostasis can be determined by subtracting the measures of capacity modulator of the homeostasis of the B and T cells in the control cells of the measurements obtained in the genetically modified cells of the invention.
  • another method for screening compounds with modulatory capacity of homeostasis of B and T cells comprises: a) Selecting a genetically modified non-human mammalian individual according to any of claims 8 or 9, b) administering a compound to the animal of the section (a) to generate a treated transgenic animal, c) measure the modulating capacity of the homeostasis of the B and T cells in the treated transgenic animal of section (b), and d) compare said modulating capacity of section (c) with the capacity Homeostasis modulator of B and T cells that produces the compound of section (b) in a non-human control mammalian individual.
  • the non-human control mammalian individual may be genetically modified or unmodified.
  • the genetically modified non-human mammalian individual can produce the overexpression of the TC21 protein.
  • a preferred embodiment refers to the method for screening compounds in a genetically modified cell of the invention or in a genetically modified non-human mammal of the invention, where the compound administered is a nucleic acid sequence capable of forming a siRNA that hybridizes with any RNA fragment encoded by a nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1.
  • a more preferred embodiment refers to the method for screening compounds, where the nucleotide sequence having at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1 is SEQ ID NO: 1.
  • siRNA or interference RNAs are carried out.
  • the siRNAs small interference RNA
  • the precursor dsRNAs can be of endogenous origin, in which case they speak of miRNA (encoded in the genome of the organism) or of exogenous origin (such as viruses or transgenes).
  • Both siRNA and miRNA are two types of RNAi (RNA interference).
  • the RNAi suppresses the post-transductional expression of a particular messenger RNA recognized by the RNAi sequence.
  • dsRNA single stranded RNAs do not produce this effect
  • dsRNA single stranded RNAs do not produce this effect
  • Dicer a cytoplasmic enzyme of the RNAse III family.
  • Dicer cuts the dsRNA into fragments of about 21-25 nucleotides (siRNA), with the 5 'phosphorylated end and two nucleotides protruding, unpaired, at the 3' end.
  • siRNA RNA-induced silencing complex
  • thermodynamic characteristics of the 5 'end of the siRNA determine which of the two strands is incorporated into the RISC complex. Normally, the one with less stability at the 5 'end is incorporated as a guide thread, either because it contains a higher content in AU bases or due to imperfect mating.
  • the guide strand In order for post-transcriptional silencing to occur, the guide strand must be complementary to the mRNA that is intended to be silenced.
  • the RISC complex binds to the complementary mRNA of the guide strand of the siRNA present in the complex and the mRNA is cut. Subsequently, the degradation of the fragments obtained occurs.
  • the siRNAs cause post-transcriptional silencing of the target nucleotide sequences, so that the protein resulting from the expression of these sequences is not obtained.
  • Another aspect of the present invention is the use of a nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1, as a target, in a mammalian cell isolated, for the screening of compounds with modulating capacity of homeostasis of B and T cells.
  • a preferred embodiment of the invention refers to the use of a nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 1, where mammalian cells are of human or mouse, but not limited to these species.
  • Another aspect of the invention relates to a nucleotide sequence capable of generating a siRNA that hybridizes with any fragment of the RNA encoded by a nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 2, or encoded by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2.
  • sequence SEQ ID NO: 2 is the coding sequence (cDNA; sequence containing only exons) of the RRas2 gene of Homo sapiens.
  • sequences with at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 2 are homologous sequences of the mammalian RRas2 gene.
  • a preferred embodiment of the invention refers to the nucleotide sequence capable of generating a siRNA where said sequence is capable of forming an hpRNA.
  • An hpRNA (from the English hairpin RNA) is a hairpin formed by the hybridization of the transcribed nucleotide sequences.
  • An hpRNA is a double-stranded RNA (dsRNA) that is cut by an endoribonuclease, for example, Dicer endoribonuclease, resulting in fragments of about 21-25 base pairs. These fragments are known as siRNA.
  • siRNAs cause post-transcriptional silencing of the target nucleotide sequences, so that the protein resulting from the expression of messenger RNA sequences is not obtained.
  • hpRNA is a shRNA.
  • a shRNA is an RNA sequence that is capable of forming a short RNA hairpin, shorter than in the case of hpRNA capable of silencing post-transcriptional expression via interference RNA, as explained above.
  • nucleotide sequence capable of generating a siRNA where said sequence is capable of forming an hpRNA or capable of forming a shRNA, wherein said sequence comprises SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence corresponding to positions 434-452 of the sequence encoding the RRas2 gene of Homo sapiens (Accession number NM_012250).
  • the sequence SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence corresponding to positions 829-847 of the sequence coding for the RRas2 gene of Homo sapiens.
  • a binding sequence is necessary and then the complementary sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence capable of forming an hpRNA or a shRNA must contain the following structure: SEQ ID NO: 3 - binding sequence - reverse complementary sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 - sequence of union - inverted complementary sequence of SEQ ID NO: 4. More specifically, by way of assumption, the structure would be the following CCATTG - Union sequence - CAATGG. As can be seen in this non-binding example, the binding sequence will perform the hinge function, so that it is facilitated to generate the hybridization of the complementary sequences.
  • Another preferred embodiment of the present invention is an expression vector comprising the nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the preceding paragraphs.
  • a more preferred embodiment refers to a genetically modified cell, isolated from a mammal, transfected with the expression vector comprising the nucleotide sequence capable of generating said siRNA.
  • the introduction into the cell of the nucleotide sequence that is capable of forming an hpRNA or a shRNA is carried out by means of an expression vector that is in charge, by means of a regulatory sequence of the expression, of expressing said DNA and transcribing it to messenger RNA, then forming the RNA fork.
  • the hematopoietic cancer referred to in the present invention is a leukemia or a lymphoma.
  • the leukemia is selected from the list comprising, but not limited to, chronic myeloid leukemia (CML), chronic lymphoid leukemia (CLL), acute lymphoid leukemia (Lymphoblastic Leukemia; ALL), acute myeloid leukemia (Myeloblastic Leukemia; AML) or myelogenous leukemia (LM).
  • the hematopoietic cancer is a lymphoma.
  • the lymphoma is selected, but not limited to, from the list comprising, T-cell precursor lymphomas that produce acute T-cell precursor lymphoblastic leukemia (T-ALL), T-cell precursor lymphoblastic lymphoma (LBL), peripheral T-cell lymphoma , hepatosplenic gamma and delta T-cell lymphoma, subcutaneous T-cell lymphoma, angioimmunoblastic T-cell lymphoma, extranodal nasal-type T-cell lymphoma, enteropathic-type T-cell lymphoma, lymphoma that produces adult T-cell leukemia ( HTLV 1+), anaplastic large cell lymphoma, primary cutaneous type, aggressive NK cell leukemia (Natural Killer); Non-Hodgkin B lymphomas as B-cell precursor lymphomas: acute B-cell precursor lymphoblastic leukemia (ALL-B
  • Another aspect of the present invention is the use of the nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the previous paragraphs or the vector that comprises for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of a hematopoietic cancer.
  • the hematopoietic cancer is a lymphoma.
  • the medicament comprises, at least, any nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the preceding paragraphs or of the vector it comprises.
  • Said sequences or vector, or their pharmaceutically acceptable derivatives are formulated in an appropriate pharmaceutical composition, in the therapeutically effective amount, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or excipients.
  • a preferred embodiment of the present invention refers to the use of the nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the preceding paragraphs or the vector that comprises it, wherein the medicament includes at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • composition of the present invention can be presented in the form of solutions or any other form of Clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of any nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the previous paragraphs or of the vector that comprises, stabilizes said sequences or vector, or helps the preparation of the medication in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • the excipient must be pharmaceutically suitable, that is, an excipient that allows the activity of said sequences or vector.
  • Another preferred embodiment of the present invention is the use of the nucleotide sequence capable of generating a siRNA as argued in the preceding paragraphs or the vector it comprises, wherein the medicament includes at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • the vehicle like the excipient, is a substance that is used in the medicament to dilute any of the compounds of the present invention to a certain volume or weight.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is an inert substance or action analogous to any of the compounds of Ia present invention
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the medication.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
  • a “pharmaceutically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • Figure 1 Shows the constitutive association of TC21 with the TCR through non-phosphorylated ITAM.
  • TC21 is associated with all CD3 subunits. COS cells were transfected with the indicated Flag-labeled CD3 subunits and precipitation with GST-TC21 was used to recover proteins from the cellular used in NP40. Immunoblotting was probed with anti-Flag and the whole cell used were immunoblotted in parallel as a transfection control.
  • B TC21 is associated with CD3 ⁇ preferably in the form bound to GDP. COS cells were transfected together with CD3 ⁇ -His (6x) and any of the TC21-GFP mutants were indicated. Precipitation was performed with Ni-NTA beads.
  • C TC21 interacts directly with a non-phosphorylated ITAM.
  • TC21 is associated with the TCR independently of the activation.
  • the 1 D8 cell clone expressing CD3 ⁇ -His (6x) derived from 2B4 was stimulated with both the anti-CD3 antibody 145-2C11 or pervanadate, and the TCR complex was precipitated with Ni-NTA beads from used Brij96 cell phones.
  • TC21 is translocated together with the TCR in the immune synapse (Sl).
  • Sl immune synapse
  • Jurkat cells transfected with TC21-DsRed and CD3 ⁇ -GFP were stimulated with Raji APC (stably expressing CFP) preloaded with SEE.
  • the images selected at different time intervals are shown to highlight the accumulation of TCR and TC21 in the IS.
  • the APCs are surrounded by a circle in the agglomerated images.
  • F TC21 is constitutively present in an active form in T cells and only partially activated by TCR.
  • dnTC21-GFP Loss of cells expressing dnTC21-GFP.
  • Human Jurkat and PBL T cells were transfected with dnTC21-GFP or with the empty vector (GFP) and cultured in the absence of stimulus. The percentage of GFP + cells was estimated by flow cytometry, taking the value 100 to 1 day after transfection.
  • B The expression of dnTC21 induces apoptosis.
  • Jurkat and mouse spleen cells were transfected with dnTC21-GFP or with the empty vector. The induction of apoptosis between the GFP + populations was estimated 48 hours later by annexin V and 7-ADF staining, or through the number of cells with a sub-G1 DNA content.
  • the numbers indicate the percentage of cells in each quadrant. Total numbers of live GFP + spleen cells were measured by exclusion with propidium bromide.
  • C Effect on the activation of Akt.
  • Jurkat cells were transfected with the indicated TC21 mutants fused to GFP and phospho-Akt expression was evaluated 24 h later in the GFP + populations by flow cytometry.
  • the shaded histogram represents phospho-Akt in control cells expressing only GFP.
  • the numbers indicate the average fluorescence intensity (IFP).
  • D Dose-response effect. IFP values of phospho-Akt vs. are represented. GFP of the panel C experiment.
  • E Reduction of the expression of TC21 by means of RNAi.
  • COS cells were transfected with wild-type TC21-GFP together with any of the shRNA constructs for TC21 (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), an irrelevant shRNA construct for EB1 (E1) or with the empty vector ( ⁇ ).
  • the expression of the TC21 protein was examined in immunoblotted probes with anti-GFP and anti- ⁇ -tubulin as load control. (F and G).
  • Transfection of TC21 RNAi constructs induces apoptosis (F) and reduces Akt (G) activity.
  • Jurkat cells were transfected together with a vector expressing GFP and any of the constructs comprising SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, or an empty shRNA vector.
  • the induction of apoptosis (in percentage) and phospho-Akt levels (in IFP) are determined 24 hours later in the GFP + populations.
  • Figure 3. It shows how TC21 '/ m mice have fewer peripheral B and T cells.
  • TO Vignette illustrating the retroviral insertion point in intron 1 of the TC21 gene and the positions of the three primers used for genotyping.
  • B PCR genotyping. A mixture of primers 1, 2 and 3 was used to detect the wild type (WT) and directed (KO) alleles by PCR.
  • C The TC21 protein is absent or decreased in the TC21 '/' mice and in the TC21 + / ⁇ mice, respectively. Immunoblotting of complete thymus extracts from mice with the TC21 genotypes indicated with an antibody against TC21, and again Total Ras and ⁇ -tubulins as controls were probed. (D).
  • the deficiency in TC21 results in an increase in the proportion of T cells and a decrease in the proportion of B cells in the lymph nodes and spleen.
  • the deficiency in TC21 reduces the total numbers of B and T cells in the spleen and lymph nodes. The total numbers of B and T cells (mean ⁇ standard deviation of the sample) were estimated by flow cytometry in groups of 10 mice.
  • a single follicle is shown for TC27 + A and TC21 '/' , and the insertion of two TC21 + / + follicles.
  • the red pulp (the area surrounding the area of cell B) is unspecifically stained with the anti-TC21 and anti-CD3 antibodies (RP, clearly visible in the TC2V'- sample).
  • Figure 4. It shows how the deficiency in TC21 eliminates ZM B cells and prevents the formation of GC.
  • mice were immunized with red blood cells from sheep blood and 6 days later, the lymph nodes were collected and the sections were stained with PNA and B220 to demonstrate the presence of the GC.
  • the quantification of the number of CG per section from groups of 3 mice is shown to the right of panel F.
  • Panel G shows the staining of lymph node sections from mice immunized with the Ki-67 proliferation marker.
  • H Reduced proliferative response of B lymphocytes against a recall antigen.
  • Spleen cells from mice immunized with TNP-KLH (n 3) were stimulated in vitro for 48 h in the presence of TNP-BSA.
  • B cell proliferation was evaluated by incorporation of 3 H-thymidine.
  • Figure 5 It shows how the deficiency of TC21 reduces the survival and homeostatic proliferation of B cells and CD8 + T cells.
  • Figure 6 Shows the overexpression of TC21 in human T and B cell lymphomas.
  • A, B Overexpression of TC21 in human lymphomas.
  • the expression of TC21 in human tissue sections embedded in paraffin with an anti-TC21 antibody was studied and the tissue was counterstained with hematoxylin-eosin.
  • a skin biopsy (25x) of a patient with cutaneous T-cell lymphoma (fungoid mycosis) is shown showing a plate with strong cytoplasmic staining in intraepithelial malignant cells.
  • the lymph node section (25x) of a patient with centroblastic DLBCL showing strong cytoplasmic staining and clear nuclei.
  • the lymph node section (4Ox) of a A patient with classic Hodgkin lymphoma shows intense cytoplasmic staining and strong reactivity in Reed-Sternberg (RS) cells.
  • a section (25x) of a healthy donor's lymph node is shown for comparison.
  • CG germinal center.
  • Panel (B) shows overexpression of TC21 in immunoblotting of lymph node detergent extracts from two patients with DLBCL (samples 886 and 6063) compared to a normal lymph node.
  • TC21 (Rras2 or R-ras2) is a protein encoded by a nucleotide sequence that has at least 80% identity with a sequence encoding SEQ ID NO: 1 or at least 80% identity with a sequence encoding for SEQ ID NO:
  • TC21 As a protein that interacts with the cytoplasmic tail of CD3 ⁇ (data not shown) using a system of SOS enlistment of double hybrid yeast (Aronheim. 2001. Methods Mol Biol, 177: 319-328).
  • SOS enlistment of double hybrid yeast
  • TC21 can interact with CD3 ⁇ and the remaining CD3 subunits of the TCR complex (Fig. 1A).
  • CD3 subunits preferentially bind to both active and non-active TC21
  • the authors simultaneously and constitutively transfected active or inactive mutants of TC21 together with CD3 ⁇ and analyzed the coprecipitated proteins.
  • CD3 ⁇ interacts clearly with TC21 » GDP (dnTC21, inactive) and binds more weakly with TC21 » GTP (oncoTC21, active, Fig. 1 B).
  • ITAM is the only known common motif to the tails of the four CD3 subunits.
  • the authors incubated the purified GST-TC21 proteins with a biotinylated synthetic peptide corresponding to the ITAM ⁇ A motif of CD3 ⁇ , as representative ITAM.
  • the p ⁇ A peptide was also prepared in the shape doubly phosphorylated ( ⁇ A-P).
  • ⁇ A-P A specific and direct interaction between TC21 and the synthetic ⁇ A peptide is determined (Fig. 1C).
  • dnTC21 joined ⁇ A better than oncoTC21, and ⁇ A better than ⁇ A-P. Therefore, it seems that TC21 interacts preferably in its GDP form, and with non-phosphorylated ITAMs.
  • TC21 interacts with the TCR in T cells
  • the authors precipitated the TCR from a mouse T 2 hybridoma derivative expressing a CD3 ⁇ version labeled His.
  • TC21 precipitates together with the TCR without depending on whether the T cells had been previously stimulated, either with anti-CD3 antibodies or with the pervanadate drug activator (Fig. 1 D).
  • Fig. 1 D pervanadate drug activator
  • TC21 is associated in form TC21 » GDP with the TCR in T cells independently of the phosphorylation of the ITAM.
  • T cells form an immune synapse (Sl) when it comes into contact with APC loaded with antigen, to which TCR translocates (Dustin. 2008.
  • TC21-DsRed concentrated on the Sl of human Jurkat T cells stimulated with Raji APC loaded with superantigen in a time interval identical to the TCR enlistment (as detected by joint transfection with CD3 ⁇ -GFP: Fig. 1 E). The earliest point at which an increase in the TCR concentration in the Sl (2 minutes) was detected coincided with the increase in the concentration of TC21 at the same point (Fig. 1 E), additional evidence that TCR and TC21 They associate physically.
  • the TCR stimulus induces the activation of the PI3K class IA causing the translocation of PH-Akt towards the Sl (Costello et al. 2002. Nat Immunol, 3: 1082-1089).
  • TC21 is enrolled in the Sl along with the TCR
  • Fig. 1G a role for TC21 in the TCR stimulation of the activity of PI3K in Sl.
  • EXAMPLE 2 The interference with the activity of TC21 stimulates a rapid loss of the viability of the T cell.
  • TC21 in the function of TCR, the authors transfected Jurkat cells with dnTC21 fused to GFP to follow the induction of the CD69 and CD25 activation markers after stimulation with anti-CD3 antibodies. The authors found no defect in the overexpression of these markers (data not shown), although there was a decrease in the number of GFP + cells regardless of the stimulation. The loss of GFP expression was more pronounced in Jurkat cells transfected with dnTC21-GFP than in cells transfected only with GFP (Fig. 2A). The effect of dnTC21 was even clearer in transfected human primary T cells (Fig. 2A, PBL). Since Jurkat cells transfected with dnTC21-GFP more strongly expressed the annexin apoptosis marker
  • dnTC21 The apoptosis induced by dnTC21 could be regulated by Akt activity and, therefore, the authors determined that transfection of dnTC21-GFP in Jurkat cells reduced the amount of active Akt detected with a phospho-Akt specific antibody. On the contrary, the transfection of oncoTC21-GFP and the wild-type TC21-GFP increased phospho-Akt levels above those of control cells transfected with GFP (Fig. 2C). In addition, both Effects of dnTC21 and oncoTC21 on phospho-Akt were dose dependent (Fig. 2D). Thus, TC21 seems to have influence on the survival of the T cell by means of the activation of the PI3K / Akt route.
  • EXAMPLE 3 Use of shRNA (RNA interference, RNAi) for post-transcriptional silencing of TC21.
  • the nucleotide sequence capable of forming an hpRNA or a shRNA contains the following structure: SEQ ID NO: 3 - binding sequence - inverted complementary sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 - binding sequence - inverted complementary sequence of SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 3 binding sequence - inverted complementary sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 - binding sequence - inverted complementary sequence of SEQ ID NO: 4.
  • RNAi confirms the important role that TC21 plays in the survival of the T cell in vitro through the activation of the PI3K-Akt pathway.
  • EXAMPLE 4 The phenotype of mice deficient in TC21 demonstrates an essential role of TC21 in maintaining peripheral B and T cell numbers.
  • the authors investigated in the Omni Bank database (http: / www. Lexgen.com) of clones of ES cells with retroviral insertions and identified a clone containing a copy of the retrovirus integrated into the intron of the TC21 gene (Fig. 3A).
  • a mouse line with the directed TC21 gene was obtained, and a PCR assay was performed to distinguish between intact and directed TC21 genes (Fig. 3B).
  • the TC21 protein was undetectable in complete thymus in used from 6 weeks old TC21 '/' mice and, interestingly, the levels of the TC21 protein were lower in TC21 + / ⁇ mice than in TC21 + / + mice, indicating a dose-dependent effect of gene (Figure 3C). This suggests that the expression of the TC21 protein is tightly regulated.
  • the percentage of ⁇ T cells in the lymph nodes was slightly higher in TC21 '/' and TC21 + / ⁇ mice than in TC21 + / + mice, while the percentage of B cells decreased (Fig. 3D).
  • a similar effect was observed in the spleen (Fig. 3D), an effect that was reflected by an increase in the T: B cell ratio (Fig. 3E).
  • the TC21 '/' mice suffered a 30% reduction in the total number of T cells in the spleen when compared to the TC21 + / + mice.
  • the effect of the deficiency of TC21 on the numbers of B cells in the spleen was stronger, producing a 50% reduction (Fig.
  • EXAMPLE 5 The deficiency of TC21 strongly affects B cells of the marginal zone and the formation of germinal centers.
  • GC germinal centers
  • Active caspase 3 an apoptotic cell marker, concentrates on the lymph node GC of the TC21 + / + mice, while in the TC21 '/' mice the apoptotic cells are dispersed (Fig. 4E), additional evidence of the loss of GC in TC21 '/' mice.
  • the size and number of the CG increases after exposure to the antigen, so that the authors further tested whether TC21 is necessary for the formation of GC by analyzing lymph nodes after immunization with sheep erythrocytes.
  • the lymph nodes of TC21 + / ⁇ mice and especially TC21 '/' mice contained less CG and smaller than TC21 + / + mice when tested with PNA (Fig.
  • TC21 is necessary for the survival and homeostatic proliferation of T and B cells.
  • mice expressed the Ly5.2 allele of the CD45 hematopoietic cell marker and thus, the fate of cells injected with antibodies against
  • TC21 seems to influence the survival of T and B cells, the authors examined whether TC21 should be associated with lymphatic cancers, perhaps intensifying or prolonging survival signals. Since the overexpression of TC21 in different carcinomas has been documented, the authors examined the distribution of TC21 in tissue sections of different human T and B cell lymphomas.
  • TC21 was overexpressed in cutaneous T-cell lymphoma (3 of 3 cases, Fig 6A, and data not shown) as well as in different Hodgkin and non-Hodgkin B cell lymphomas.
  • B-cell lymphomas with strong expression of TC21 include diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL, 68 of 80 cases) and lymphoma of Hodgkin (HL, 60 of 60 cases, see Fig. 6A).
  • the Jurkat line of human T-cell lymphoma, the CD3 ⁇ -negative derivative of murine hybridoma 2B4 (MA5.8), the Raji line of human B-cell lymphoblast and Ia line of myeloma cells J5778 and their derivatives was grown in RPMI + 5% fetal bovine serum (FBS).
  • Clone 1 D8 was derived from MA5.8 after transfection with a CD3 ⁇ -His (6x) construct in the pSR ⁇ expression vector and selection in G418.
  • TC21-GFP and TC21-DsRed were obtained by PCR cloning of the human-type human cDNA sequence in pEGFP-C1 and pDsRed2, respectively (Clontech).
  • the dnTC21 and oncoTC21 constructs were created by introducing an S28N and G23V mutation in TC21-GFP using the site-directed mutagenesis kit (Stratagene).
  • GST-TC21 was generated by inserting the TC21 cDNA into the vector pGEX-4T3 (Pharmacia), and the fusion protein was generated as indicated by the manufacturer.
  • TC21 shRNA comprising SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, corresponding to positions 434-452 and 829-847 of the human cDNA sequence, were prepared in Genscript plasmid pRN A-H 1.1 / neo.
  • the PH-Akt-DsRed, GST-RBD and HA-LMP2A constructions were generously supplied by Dr. Santos Manes (CNB, Madrid), Doreen Cantrell (University of Dundee, GB), and Chris Dawson (University of Birmingham, GB). Plasmids expressing human CD3 subunits labeled with flag have been described previously (Delgado and Alarcón. 2005. J Exp Med, 201: 555-566).
  • a specific rabbit antiserum was generated against TC21 by immunizing New Zealand rabbits with a purified GST-TC21 fusion protein.
  • the Cytotrap system (Stratagene) was used to select a human spleen cDNA library (Stratagene) with respect to proteins that interact with the cytoplasmic tail of CD3 ⁇ as described (Gil et al. 2002. CeII, 109: 901-912) .
  • 10x10 6 spleen cells from TC21 + / + and TC21 '/' mice were injected iv into C57 / BL6 (Ly5.1 + ) mice and 3 days later Lymph nodes and spleen cells of accepting mice were analyzed by flow cytometry using anti-10 and 5.2 antibody to screen the injected cells.
  • 5x10 6 cells of the bone marrow were injected iv into RAG2 ⁇ / ⁇ mice irradiated with a sublethal dose (400 rad).
  • the cells from the lymphoid organs of the accepting mice were analyzed by flow cytometry 5 weeks after the cell transfer.
  • lymph node cells were cultured in RPMI with 10% FBS, ⁇ ME (10 ⁇ M) and sodium pyruvate (50 mM) with or without IL7 (10 ng / ml, Preprotech).
  • the number of living cells was estimated by FAC by applying IP exclusion and comparing with the count beads.
  • the total number of T cells was estimated by FAC staining and cell count.
  • B cell proliferation in response to the recall antigen was analyzed in vitro by incorporating 3 H-thymidine after stimulation with TNP-BSA of spleen cells from pre-immunized TC21 + / + and TC21 '/' mice.

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Abstract

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y la biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células comprenden una secuencia nucleotídica inactivada funcionalmente o que ha sido suprimida total o parcialmente, donde dicha secuencia corresponde a un gen que codifica para la proteína TC21 (RRas2 o R-Ras2). Asimismo, la invención también se refiere a una célula aislada, procedente de un mamífero, modificada genéticamente para que presente la modificación genética descrita, así como a los métodos para producir tanto los animales como las células modificadas genéticamente y al uso de dichas células y métodos que las comprenden para el cribado y selección de compuestos con capacidad moduladora de la supervivencia y homeostasis de las células B y T. Por otra parte, la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA para la silenciación post-transcripcional del producto de expresión de la citada proteína TC21.

Description

MAMÍFERO NO HUMANO MODIFICADO GENÉTICAMENTE, CÉLULAS Y
MÉTODOS PARA PRODUCIRLAS
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular y Ia biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células comprenden una secuencia nucleotídica inactivada funcionalmente o que ha sido suprimida total o parcialmente, donde dicha secuencia corresponde a un gen que codifica para Ia proteína TC21 (RRas2 o R-Ras2). Asimismo, Ia invención también se refiere a una célula aislada, procedente de un mamífero, modificada genéticamente para que presente Ia modificación genética descrita, así como a los métodos para producir tanto los animales como las células modificadas genéticamente y al uso de dichas células y métodos que las comprenden para el cribado y selección de compuestos con capacidad moduladora de Ia supervivencia y homeostasis de las células B y T. Por otra parte, Ia presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA para Ia silenciación post-transcripcional del producto de expresión de Ia citada proteína TC21.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En ausencia de antígenos, el número de linfocitos periféricos T y B es constante gracias a mecanismos homeostáticos estrictos, que evitan su proliferación descontrolada y por tanto el desarrollo de linfomas (Seddon y Zamoyska. 2003. Curr Opin Immunol, 15: 321-324). Estos mecanismos garantizan también Ia disponibilidad de poblaciones de células clónicas, cuya proliferación específica en respuesta a patógenos se regula mediante señales transmitidas por interleuquinas y por factores de crecimiento, señales que difieren para las células T y B, y para los linfocitos "vírgenes" ("naive") respecto a los linfocitos de memoria. En el control de Ia proliferación de las células T y B, tanto en homeostasis como en respuesta a antígeno, tienen gran relevancia sus respectivos receptores de antígeno (TCR y BCR). En las células T αβ, TCR está compuesto por las subunidades de unión a ligando TCRα y TCRβ y por las subunidades de señalización CD3γ, CD3δ, CD3ε y CD3ζ. El TCR estimula el paso de Ia fase GO a G1 del ciclo celular de los linfocitos T, quienes, bajo el estímulo de las citoquinas producidas en respuesta a Ia unión de antígeno (principalmente Ia IL-2) progresan en dicho ciclo, resultando en una expansión clonal de los linfocitos que responden a un antígeno dado. Por otra parte, en ausencia del TCR, Ia supervivencia de los linfocitos T maduros es muy limitada, probablemente porque necesitan de las señales de baja intensidad que este receptor produce constantemente en respuesta a Ia unión del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) a péptidos no antigénicos. De manera similar, Ia ausencia del receptor de antígenos de las células B (BCR) limita mucho Ia supervivencia de las células B maduras (Lam et al. 1997. CeII, 90: 1073-1083).
Aunque sigue sin estar claro cómo TCR y BCR transducen las señales de supervivencia y homeostáticas, un mediador importante en esta transducción es Ia fosfoinositidil-3-quinasa (PI3K), cuya activación está directamente ligada a Ia recepción del antígeno por los receptores TCR y BCR. Consecuentemente, Ia inactivación de Ia subunidad p110δ reduce significativamente el número de células B y T periféricas (Okkenhaug et al. 2007. Trends Immuno. 28: 80-87). Esta subunidad es activada selectivamente por las proteínas R-Ras y R-Ras2 (también denominada TC21 ), que pertenecen a Ia familia de proteínas Ras. Las proteínas Ras son moléculas que regulan el ciclo celular por medio de las conformaciones de su unión a GTP (forma activa) y su unión a GDP (forma inactiva).
En línea con el papel clave de TC21 en Ia regulación de Ia proliferación de las células, se ha encontrado que el cáncer de ovario y el leiomiosarcoma presentan ciertas mutaciones que resultan en Ia activación de TC21. También se ha comprobado que su sobre-expresión está ligada a tumores de mama, esófago y estómago (Chan et al. 1994. Proc Nati Acad Sci U S A, 91 : 7558- 7562; Huang et al. 1995. Oncogene, 11 : 1255-1260; Clark et al. 1996. Oncogene, 12: 169-176).
En linfocitos no se conocen las vías de transmisión de señales en las que interviene TC21. Por tanto, sería importante el uso de determinadas células procedentes de un organismo modificado genéticamente o células modificadas directamente, para facilitar Ia selección de compuestos capaces de modular Ia homeostasis de las células B y T y, como consecuencia, para el tratamiento de enfermedades cancerosas relacionadas con dichos linfocitos B y T.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de Ia biología molecular y Ia biotecnología, y se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente cuyas células comprenden una secuencia nucleotídica inactivada funcionalmente o delecionada (que ha sido suprimida) total o parcialmente donde dicha secuencia corresponde a un gen que codifica para Ia proteína TC21 (RRas2 o R-Ras2). Asimismo, Ia invención también se refiere a una célula aislada, procedente de un mamífero, modificada genéticamente que presenta Ia modificación genética descrita así como a los métodos para producir tanto los animales como las células modificadas genéticamente y al uso de dichas células y métodos que las comprenden para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia supervivencia y homeostasis de las células B y T. Por otra parte Ia presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA para Ia silenciación post- transcripcional del producto de expresión de Ia citada proteína TC21.
Los receptores de los antígenos celulares T y B (TCR y BCR) transmiten señales de baja intensidad necesarias para Ia supervivencia y el mantenimiento de las poblaciones de células maduras. Los autores demuestran aquí que el TC21 , una GTPasa de pequeño tamaño, interactúa constitutivamente con los TCR y BCR a través de los motivos de activación basados en tirosina asociados a inmunoreceptores (ITAM) que se encuentran en sus subunidades CD3. La expresión tanto de un muíante TC21 dominante-negativo o de una construcción shRNA en células T provoca una rápida disminución de Ia viabilidad celular. De forma más importante, los ratones TC21-/- tienen pocas células T y B maduras, posiblemente como resultado de una proliferación homeostática deficiente y una supervivencia defectuosa. Los autores demuestran que TC21 se sobreexpresa en varios cánceres linfáticos y que se asocia con un ITAM vírico, sugiriendo que Ia desregulación de Ia actividad de TC21 o de su distribución contribuye a Ia formación de linfomas.
La transfección de células T tanto con un muíante TC21 dominante negaíivo o con una consírucción shRNA lleva a una pérdida rápida de viabilidad celular, indicando que TC21 íiene un papel no redundaníe en Ia supervivencia de Ia célula T. Además, cuando el gen TC21 se ha inacíivado en raíones, se deíecían pocas células B y T periféricas, aunque ésías se desarrollan con normalidad. Los ganglios linfáíicos de los raíones deficieníes en TC21 aparecen minorados en los ceñiros germinales, y las células B de zona marginal (ZM) esíán viríualmeníe auseníes. Esíos resulíados sugieren que TC21 se une direcíameníe a TCR y BCR en los que cumple un papel esencial en Ia supervivencia mediada por el recepíor aníigénico y en Ia señalización homeosíáíica. Además, Ia asociación direcía de TC21 con los ITAM víricos y no víricos (por ejemplo, los de TCR y BCR) no fosforilados sugiere un papel para TC21 en Ia señalización de baja iníensidad del recepíor aníigénico, así como en Ia íransformación de los linfociíos.
Un aspecío de Ia preseníe invención es una célula aislada procedeníe de un mamífero modificada genéíicameníe, que comprende una secuencia nucleoíídica que íiene al menos un 80% de ideníidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , inacíivada funcionalmeníe o delecionada íoíal o parcialmeníe, en homocigosis o heíerocigosis. La secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 puede ser, pero sin limitarse, una secuencia de ADN genómico, secuencia que contiene exones e intrones.
La secuencia SEQ ID NO: 1 es Ia secuencia codificante (ADNc; secuencia que contiene sólo los exones) del gen RRas2 de Mus musculus (ratón). Tras el procesado (splicing) del ARN mensajero (ARNm) transcrito en Ia célula a partir de Ia citada secuencia de ADN genómico o a partir de Ia secuencia de ADNc SEQ ID NO: 1 , se da lugar a una proteína idéntica partiendo de cualquiera de las dos secuencias. Las proteínas, producto de Ia expresión de Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , tienen una identidad superior al 80% y tienen Ia misma función. Es decir, las secuencias con, al menos, un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 son secuencias homologas del gen RRas2 de mamíferos.
Las secuencias homologas se refieren a secuencias de especies distintas con expresiones fenotípicas similares que proceden de una secuencia ancestral común. Dentro de Ia homología de secuencia se distinguen dos tipos de homología: Ia ortología y Ia paralogía. Las secuencias ortólogas pertenecen a especies que tienen un antepasado común. Las secuencias parálogas son aquellas que se encuentran en el mismo organismo y una procede de Ia duplicación de Ia otra. En esta realización preferida de Ia presente invención se consideran todas las secuencias homologas, tanto ortólogas como parálogas, que tienen, al menos, un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1. Esta secuencia homologa cubre las secuencias que codifican para una secuencia homologa de SEQ ID NO: 1 en ratón y en cualquier otro mamífero.
La célula modificada genéticamente contiene un producto de Ia expresión de Ia secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 no funcional. Preferiblemente, el producto de Ia expresión es una proteína no funcional como consecuencia de Ia inactivación funcional o deleción total o parcial de su secuencia (el término "disrupción" puede usarse también para referirse a "deleción"). La célula contiene dicha modificación genética en homocigosis (-/- o TC21'/') o en heterocigosis (+/- o TC21+/~). En homocigosis, Ia modificación genética está presente en las dos copias del genoma, Io que asegura Ia transferencia de Ia misma a las células descendientes si éste es el ADN nuclear. En heterocigosis, Ia modificación genética está presente en una sola copia del genoma (gen ID 66922, cromosoma 7, anotación NC_000073.5 en ratón; gen ID 22800, cromosoma11 p15.2 anotación NC_000011.8 en humanos). En cualquier caso, Ia célula modificada de Ia presente invención contiene dicha modificación genética en su ADN genómico. Asimismo, Ia célula modificada genéticamente puede conseguirse por cruzamiento o por transformación de plastidios de Ia célula huésped. Las células modificadas genéticamente pueden tener dicha modificación genética en uno o más tipos de material genético de Ia célula; cloroplástico, mitocondrial o nuclear.
Una realización preferida de Ia presente invención se refiere a Ia célula modificada genéticamente aislada de un mamífero, donde Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , es Ia propia secuencia de ADNc SEQ ID NO: 1.
Otra realización preferida se refiere a Ia célula modificada genéticamente donde dicha célula es somática o germinal.
El término "células somáticas" tal como se entiende en Ia presente invención, se refiere a las células que integran los tejidos u órganos de un mamífero. El término "células germinales" tal como se entiende en Ia presente invención, se refiere a las células que forman los gametos de un mamífero. La célula germinal se selecciona, pero sin limitarse, de Oocito (sinónimo de ovocito) o célula germinal femenina. Según otra realización preferida, Ia célula modificada genéticamente es una célula madre. Las células madre (o células troncales) son células indiferenciadas que tienen Ia capacidad de dividirse indefinidamente sin perder sus propiedades y llegar a producir tanto células diferenciadas como células no diferenciadas. Según el origen de las células madre se puede diferenciar entre células madre embrionarias y células madre adultas. La célula madre a Ia que se hace referencia en esta realización de Ia presente invención se refiere a una célula madre adulta, pero no embrionaria.
Según el origen de las células madre podemos diferenciar entre células madre embrionarias y células madre adultas. Las células madre embrionarias proceden de Ia masa celular interna de los blastocistos y tienen como característica principal el hecho de ser pluripotenciales, Io que significa que pueden dar lugar a cualquier tejido adulto derivado de las tres capas embrionarias (US 6.200.806).
Según una realización más preferida, Ia célula madre se selecciona de Ia lista que comprende pluripotente, multipotente o unipotente. La célula madre pluripotente (o pluripotencial) es capaz de diferenciarse a cualquier tipo de célula derivada de cualquiera de las tres capas embrionarias (ectodermo, mesodermo o endodermo) y como consecuencia, a cualquier tejido adulto derivado de cualquiera de dichas capas embrionarias pero no es capaz de formar un organismo completo. La célula madre multipotente (o multipotencial) puede generar células de su propia capa embrionaria de origen. La célula madre unipotente (o unipotencial) puede formar únicamente un tipo de célula particular.
Una realización preferida más se refiere a Ia célula modificada genéticamente donde el mamífero es un mamífero no humano. Según una realización más preferida, el mamífero es Mus musculus (ratón). Otra realización preferida se refiere a una célula modificada genéticamente aislada de un mamífero no humano o de un ratón, donde dicha célula se selecciona, pero sin limitarse, de Ia lista que comprende oocito, blastómero, blastocito o célula embrionaria.
Un oocito (u ovocito) es una célula germinal femenina en un estadio de madurez previo al óvulo maduro. Un blastómero es Ia célula resultante de Ia segmentación del cigoto. Un blastocito es una de las células que forman el blastocisto. El término "célula embrionaria" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere a una de las células que integran Ia masa celular que se implanta en el útero después de recorrer Ia trompa de Falopio.
En una realización más preferida de Ia célula modificada genéticamente, dicha célula es una célula madre. El término "células madre" tal como se entiende en Ia presente realización, se refiere a célula madre embrionaria. El comportamiento de dichas células como células madre, está condicionada por factores que pueden controlarse in vitro y que sin embargo in vivo no se mantienen constantes. Por tanto las células madre de esta realización preferida se obtienen de células en un estadio adecuado para permitir su comportamiento como células madre.
En adelante, para hacer referencia a cualquier célula modificada genéticamente descrita anteriormente, se utilizarán los términos "célula/s modificadas genéticamente de Ia invención" o "célula/s modificadas genéticamente de Ia presente invención".
Cualquiera de las células modificadas genéticamente de Ia invención puede generar una línea celular derivada.
Otro aspecto de Ia presente invención es un mamífero no humano modificado genéticamente que contiene Ia célula modificada genéticamente de un mamífero o Ia célula modificada genéticamente de un mamífero no humano. Una realización preferida se refiere a un mamífero no humano modificado genéticamente donde dicho mamífero es un ratón.
En adelante, para hacer referencia a cualquier mamífero no humano modificado genéticamente descrito anteriormente, se utilizarán los términos "mamífero/s modificados genéticamente de Ia invención" o "mamífero/s modificados genéticamente de Ia presente invención".
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia célula modificada genéticamente de Ia invención para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T.
El término "screening" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere a Ia exploración o ensayo de varios compuestos respecto a su capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T.
Los compuestos que se emplean en dicho screening son compuestos candidatos derivados o no de otros compuestos líder. Los compuestos se pueden obtener mediante química combinatoria o a partir de fuentes naturales.
El término "capacidad moduladora de Ia homeostasis" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere a Ia capacidad de modificar los factores que intervienen en Ia homeostasis de un determinado proceso para obtener distintos resultados. La homeostasis se define como el conjunto de fenómenos de autorregulación, que conducen al mantenimiento de Ia constancia en Ia composición y propiedades del medio interno de un organismo.
Las células T son un tipo de linfocitos que se diferencian (especializan) inicialmente en el timo, y las células B son otro tipo de linfocito que se diferencian en el hígado y bazo fetal, y en Ia médula ósea del adulto. En Ia presente invención se exploran o ensayan varios compuestos respecto a su capacidad para modificar el metabolismo normal de las células B y T, preferiblemente Ia capacidad de proliferación de dichas células.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método para Ia producción de Ia célula modificada genéticamente de Ia invención que comprende: a) Obtener al menos una célula aislada procedente de un mamífero, b) transfectar Ia célula del apartado (a) con un vector retroviral, capaz de insertar una secuencia nucleotídica en cualquier posición nucleotídica de una secuencia que tiene al menos un
80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , y c) seleccionar Ia célula en Ia que Ia secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 queda inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis.
El término "transfección" hace referencia a Ia introducción de material genético externo en células mediante plásmidos, vectores víricos (en este caso también se habla de transducción) u otras herramientas para Ia transferencia conocidas en el estado de Ia técnica. El término transformación se prefiere para describir las transferencias no-virales de material genético en bacterias y células eucariotas no animales como hongos, algas o plantas.
La secuencia nucleotídica (apartado [b] del método) se inserta preferiblemente en un intrón de una secuencia nucleotídica con al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente Ia secuencia nucleotídica se inserta en cualquier posición nucleotídica del primer intrón.
De acuerdo con el apartado (c), se selecciona aquella célula en Ia que el producto de Ia expresión de Ia secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 no es funcional. Preferiblemente, el producto de Ia expresión es una proteína no funcional como consecuencia de Ia inactivación funcional o deleción (o disrupción) total o parcial de su secuencia. La selección puede llevarse a cabo por medio del análisis del producto de Ia expresión de Ia secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 mediante métodos de detección y/o cuantificación conocidos en el estado de Ia técnica.
Una realización preferida se refiere al método para Ia producción de Ia célula modificada genéticamente de Ia invención, donde Ia secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
Otro aspecto de Ia presente invención es un método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente de Ia invención que comprende: a) Incorporar Ia célula madre según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 a un embrión, b) introducir el embrión del apartado (a) en un órgano sexual de un individuo hembra en condiciones donde dicho individuo sea capaz de desarrollar progenie, e c) identificar al menos un descendiente de Ia progenie del apartado (b) que contiene Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 inactivada funcionalmente o deleccionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis.
La incorporación de Ia célula madre se lleva cabo preferiblemente mediante microinyección. La célula madre es totipotente, pluripotente, multipotente o unipotente. Así pues, el oocito fecundado, es decir, el zigoto o célula huevo, es totipotente, es decir, es capaz de producir todos los tipos celulares que conforman a un individuo incluyendo Ia placenta. Sin embargo, el blastómero, el blastocito o Ia célula embrionaria, o cualquier otra célula de Ia masa celular interna, no son totipotentes porque no pueden dar lugar a una placenta, son pluripotentes, puesto que pueden dar lugar a células que integran cada uno de los tres tejidos o capas embrionarias, el ectodermo, el mesodermo y el endodermo. La pluripotencia de dichas células, es decir, su comportamiento como células madre, está condicionada por factores que pueden controlarse in vitro y que sin embargo in vivo no se mantienen constantes y por tanto, en condiciones in vivo sólo se comportarían como células madre en determinados momentos o etapas del desarrollo. El término "célula embrionaria" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere a Ia célula que procede de Ia masa celular que se implanta en el útero después de recorrer Ia trompa de Falopio.
En el apartado (b) del método, Ia introducción del embrión en un órgano sexual de un individuo hembra se lleva a cabo en condiciones donde dicho individuo sea capaz de desarrollar progenie. Dichas condiciones son, pero sin limitarse a, hembras pseudopreñadas, es decir, hembras que experimenten embarazo psicológico.
Una realización preferida de Ia presente invención se refiere al método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente de Ia invención, donde el embrión del apartado (a) es un oocito fecundado, mórula o blastocisto.
Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere al método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente de Ia invención donde Ia incorporación de Ia célula madre del apartado (a) contribuye a todos los linajes celulares de dicho embrión. Los linajes celulares son aquellos que provienen de cualquiera de las tres capas embrionarias ya citadas en Ia presente invención.
Otra realización preferida de Ia invención es el método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente donde Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
Otra realización preferida es el método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente de Ia invención, donde además comprende cruzar un descendiente identificado en el apartado (c) para producir mamíferos no humanos heterocigóticos en Ia modificación genética introducida. Además, otra realización aún más preferida se refiere al método para Ia producción del mamífero no humano, donde además comprende cruzar dos descendientes heterocigóticos para producir al menos un descendiente homocigótico en Ia modificación genética introducida.
Otro aspecto de Ia presente invención es el método para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T que comprende: a) Cultivar al menos una célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo, b) administrar un compuesto a Ia célula del apartado (a), o a dicho medio de cultivo, para generar al menos una célula tratada, c) medir Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células
B y T en Ia célula tratada del apartado (b), y d) comparar dicha capacidad moduladora del apartado (c) con Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T que produce el compuesto del apartado (b) en células control.
El compuesto es una sustancia susceptible de ser moduladora, o potencialmente moduladora o simplemente una sustancia cuya capacidad moduladora de las células B y T se desea evaluar.
En apartado (d) del método se compara dicha capacidad moduladora del apartado (c) con Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T que produce el compuesto del apartado (b) en células control. Las células control pueden ser células no modificadas genéticamente o células modificadas genéticamente. Las células control modificadas genéticamente pueden producir Ia sobreexpresión de Ia proteína TC21. De este modo el método permite determinar Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T correctamente ya que Ia determinación de dicha capacidad en células control no modificadas genéticamente únicamente, no permitiría diferenciar entre si el compuesto que modula dicha homeostasis Io hace por medio de Ia expresión de Ia secuencia nucleotídica que codifica para SEQ ID NO: 1 o a través de Ia expresión de otras secuencias. Es decir, el compuesto administrado a Ia célula del apartado (a) es útil para el objetivo de Ia presente invención siempre que dicho compuesto ejerza un efecto modulador de Ia homeostasis de las células B y T en las células control no modificadas genéticamente (o modificadas genéticamente que sobreexpresan Ia proteína TC21 ) y no ejerza dicho efecto modulador en Ia célula modificada genéticamente de Ia presente invención (o ejerza un efecto menor). Esta diferencia significa que el efecto modulador se lleva a cabo fundamentalmente a través Ia expresión de Ia secuencia nucleotídica que codifica para SEQQ ID NO: 1. La contribución de dicha secuencia nucleotídica a Ia modulación de Ia homeostasis se puede determinar restando las medidas de Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T en las células control de las medidas obtenidas en las células modificadas genéticamente de Ia invención.
Además, otro método para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T comprende: a) Seleccionar un individuo mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, b) administrar un compuesto al animal del apartado (a) para generar un animal transgénico tratado, c) medir Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T en el animal transgénico tratado del apartado (b), y d) comparar dicha capacidad moduladora del apartado (c) con Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T que produce el compuesto del apartado (b) en un individuo mamífero no humano control.
El individuo mamífero no humano control puede estar modificado genéticamente o no modificado. El individuo mamífero no humano control modificado genéticamente puede producir Ia sobreexpresión de Ia proteína TC21.
Una realización preferida se refiere al método para el screening de compuestos en una célula modificada genéticamente de Ia invención o en un mamífero no humano modificado genéticamente de Ia invención, donde el compuesto administrado es una secuencia de ácido nucleico capaz de formar un siRNA que híbrida con cualquier fragmento del RNA codificado por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1.
Una realización más preferida se refiere al método para el screening de compuestos, donde Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
Para facilitar el entendimiento del texto que se describe a continuación y de los dos párrafos anteriores, se lleva a cabo una breve explicación de siRNA o RNAs de interferencia.
Los siRNAs (de las siglas en inglés small interference RNA) son moléculas de RNA de doble hebra (dsRNA de las siglas en inglés double strand RNA) de 20- 21 nucleótidos, que se originan a partir de un dsRNA precursor más largo. Los dsRNAs precursores pueden ser de origen endógeno, en cuyo caso se habla de miRNA (codificados en el genoma del organismo) o de origen exógeno (como virus o transgenes). Tanto siRNA como miRNA son dos tipos de RNAi (RNA de interferencia). El RNAi suprime Ia expresión post-transduccional de un determinado ARN mensajero reconocidos por Ia secuencia de RNAi. Cuando una célula recibe un dsRNA precursor (los RNA de hebra simple no producen este efecto), que puede generarse a partir de un transgén exógeno, un agente viral o un elemento genético propio, se fragmenta en siRNAs por Ia acción de una enzima denominada Dicer, una enzima citoplásmica de Ia familia RNAsa III. Dicer corta el dsRNA en fragmentos de alrededor de 21-25 nucleótidos (siRNA), con el extremo 5' fosforilado y dos nucleótidos sobresaliendo, sin aparear, en el extremo 3'. De las dos cadenas del siRNA solo una, denominada hebra guía, se incorpora en el complejo enzimático RISC (RNA-induced silencing complex) mientras que Ia otra hebra se degrada. Las características termodinámicas del extremo 5' del siRNA determinan cual de las dos hebras se incorpora al complejo RISC. Normalmente se incorpora como hebra guía aquella con menor estabilidad en el extremo 5', bien porque contenga un mayor contenido en bases AU o bien por apareamientos imperfectos. Para que se produzca el silenciamiento post-transcripcional Ia hebra guía debe ser complementaria al mRNA que se pretende silenciar. A continuación, el complejo RISC se une al mRNA complementario de Ia hebra guía del siRNA presente en el complejo y se produce el corte del mRNA. Posteriormente se produce Ia degradación de los fragmentos obtenidos. De esta manera, los siRNAs provocan el silenciamiento post-transcripcional de las secuencias nucleotídicas diana, de forma que no se obtiene Ia proteína resultante de Ia expresión de estas secuencias.
Otro aspecto de Ia presente invención es el uso de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , o de SEQ ID NO: 1 , como diana, en una célula de mamífero aislada, para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T.
Una realización preferida de Ia invención se refiere al uso de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , o de SEQ ID NO: 1 , donde las células de mamífero son de humano o de ratón, pero sin limitarse a estas especies. Otro aspecto de Ia invención se refiere a una secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA que híbrida con cualquier fragmento del RNA codificado por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 2, o codificado por Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2.
La secuencia SEQ ID NO: 2 es Ia secuencia codificante (ADNc; secuencia que contiene sólo los exones) del gen RRas2 de Homo sapiens. De igual modo que se ha descrito SEQ ID NO: 1 , las secuencias con, al menos, un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 2 son secuencias homologas del gen RRas2 de mamíferos.
Una realización preferida de Ia invención se refiere a Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA donde dicha secuencia es capaz de formar un hpRNA.
Un hpRNA (del inglés hairpin RNA) es una horquilla formada por Ia hibridación de las secuencias nucleotídicas transcritas. Un hpRNA es un RNA de doble hebra (dsRNA) que es cortado por una endorribonucleasa, por ejemplo, Ia endorribonucleasa Dicer, dando como resultado fragmentos de alrededor de 21-25 pares de bases. Estos fragmentos se conocen como siRNA. Tal como se ha descrito anteriormente, los siRNAs provocan el silenciamiento post- transcripcional de las secuencias nucleotídicas diana, de forma que no se obtiene Ia proteína resultante de Ia expresión de las secuencias de ARN mensajero. Es decir, el siRNA formado a partir de dicho hpRNA híbrida con cualquier fragmento del RNA codificado por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 2, o codificado por Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2 y, como consecuencia, se produce el silenciamiento post-transcripcional de dicha secuencia. Según una realización más preferida de Ia invención, el hpRNA es un shRNA. Un shRNA es una secuencia de ARN que es capaz de formar una horquilla corta de ARN, más corta que en el caso de los hpRNA capaz de silenciar Ia expresión post-transcripcional via ARN de interferencia, tal como se ha explicado anteriormente.
Otra realización más preferida de Ia invención es Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA donde dicha secuencia es capaz de formar un hpRNA o capaz de formar un shRNA, donde dicha secuencia comprende SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia nucleotídica que corresponde a las posiciones 434-452 de Ia secuencia que codifica para el gen RRas2 de Homo sapiens (Número de acceso NM_012250). La secuencia SEQ ID NO: 4 es una secuencia nucleotídica que corresponde a las posiciones 829-847 de Ia secuencia que codifica para el gen RRas2 de Homo sapiens. Para que SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 sean capaces de formar un hpRNA o un shRNA, es necesaria una secuencia de unión y a continuación Ia secuencia complementaria de SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4. Es decir, a modo de ejemplo, Ia secuencia nucleotídica capaz de formar un hpRNA o un shRNA debe contener Ia siguiente estructura: SEQ ID NO: 3 - secuencia de unión - secuencia complementaria invertida de SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4 - secuencia de unión - secuencia complementaria invertida de SEQ ID NO: 4. Más concretamente, a modo de supuesto, Ia estructura sería Ia siguiente CCATTG - Secuencia de unión - CAATGG. Como puede observarse en este ejemplo no vinculante, Ia secuencia de unión ejercerá Ia función de bisagra, de forma que se facilita Ia genere Ia hibridación de las secuencias complementarias.
Otra realización preferida de Ia presente invención es un vector de expresión que comprende Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores. Una realización más preferida se refiere a una célula modificada genéticamente, aislada de un mamífero, transfectada con el vector de expresión que comprende Ia secuencia nucleotídica capaz de generar dicho siRNA. Según esta realización más preferida, Ia introducción en Ia célula de Ia secuencia nucleotídica que es capaz de formar un hpRNA o un shRNA se lleva a cabo por medio de un vector de expresión que se encarga, por medio de una secuencia reguladora de Ia expresión, de expresar dicho ADN y transcribirlo a ARN mensajero, formándose entonces Ia horquilla ARN.
Otra realización preferida de Ia presente invención es Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o el vector que Ia comprende, para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético. El cáncer hematopoyético al que se refiere Ia presente invención es una leucemia o un linfoma. La leucemia se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfoide crónica (LLC), leucemia linfoide aguda (Leucemia Linfoblástica; LLA), leucemia mieloide aguda (Leucemia Mieloblástica; LMA) o leucemia mielógena (LM). Según una realización más preferida el cáncer hematopoyético es un linfoma. El linfoma se selecciona, pero sin limitarse, de Ia lista que comprende, linfomas precursores de células T que producen leucemia linfoblástica precursora aguda de células T (LLA-T), linfoma linfoblástico precursor de células T (LBL), linfoma periférico de célula T, linfoma hepatoesplénico de células T gamma y delta, linfoma subcutáneo de células T, linfoma angioinmunoblástico de células T, linfoma extranodal de células T de tipo nasal, linfoma intestinal de células T de tipo enteropático, linfoma que produce leucemia de células T en adultos (HTLV 1+), linfoma anaplásico de células grandes tipo cutáneo primario, leucemia agresiva de células NK (Natural Killer); linfomas B no-Hodgkin como linfomas precursores de células B: leucemia linfoblástica precursora aguda de células B (LLA-B, y linfoma linfoblástico precursor de células B (LBL, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica de células B y linfoma linfocítico pequeño de células B, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma/inmunocitoma linfoplasmacítico, linfoma de células de manto, linfoma folicular, linfoma extranodal de zona marginal de células B de tipo MALT, linfoma nodal de zona marginal de células B (de células B ± monocitoide), linfoma esplénico de zona marginal (linfocitos ± vellosos), leucemia de células pilosas, plasmacitoma y mieloma de células plasmáticas, linfoma de células B grandes difuso, linfoma de Burkitt; linfomas Hodgkin como linfoma de Hodgkin nodular abundante en linfocitos y linfoma de Hodgkin clásico (linfoma de Hodgkin con esclerosis nodular, linfoma de Hodgkin clásico rico en linfocitos, linfoma de Hodgkin de celularidad mixta, linfoma de Hodgkin con depleción de linfocitos).
Otro aspecto de Ia presente invención es el uso de Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o el vector que Ia comprende para Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético. Según una realización preferida, el cáncer hematopoyético es un linfoma.
El medicamento comprende, al menos, cualquier secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o del vector que Ia comprende. Dichas secuencias o vector, o sus derivados farmacéuticamente aceptables, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Una realización preferida de Ia presente invención se refiere al uso de Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o el vector que Ia comprende, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En cada caso, Ia forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición de Ia presente invención se puede presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a Ia absorción de cualquier secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o del vector que Ia comprende, estabiliza dichas secuencias o vector, o ayuda a Ia preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que Io hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener Ia función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o Ia humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar Ia disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un excipiente que permita Ia actividad de dichas secuencias o vector.
Otra realización preferida de Ia presente invención es el uso de Ia secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA según se ha argumentado en los párrafos anteriores o el vector que Ia comprende, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de Ia presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de Ia presente invención. La función del vehículo es facilitar Ia incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando Ia forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las figuras muestran experimentos representativos realizados al menos 4 veces con resultados similares.
Figura 1. Muestra Ia asociación constitutiva de TC21 con el TCR a través de ITAM no fosforilados.
(A). TC21 se asocia con todas las subunidades CD3. Se transfectaron células COS con las subunidades CD3 etiquetadas con Flag indicadas y se usó precipitación con GST-TC21 para recuperar proteínas de los usados celulares en NP40. Se sondearon inmunotransferencias con anti-Flag y los usados de células completas se inmunotransfirieron en paralelo como control de transfección. (B). TC21 se asocia con CD3ζ preferiblemente en Ia forma unida a GDP. Las células COS se transfectaron conjuntamente con CD3ζ-His(6x) y se indicaron cualesquiera de los mutantes TC21-GFP. Se realizó precipitación con perlas Ni-NTA. (C). TC21 interactúa directamente con un ITAM no fosforilado. Las proteínas de fusión con GST de los mutantes TC21 indicados se incubaron con un péptido sintético marcado con biotina correspondiente al primer ITAM no fosforilado de CD3ζ (ζA), o con Ia forma de doble tirosina fosforilada (ζA-P), que se recuperó posteriormente con perlas de estreptavidina. (D). TC21 se asocia con el TCR independientemente de Ia activación. El clon celular 1 D8 que expresaba CD3ζ-His(6x) derivado de 2B4 se estimuló tanto con el anticuerpo anti-CD3 145-2C11 o pervanadato, y el complejo TCR se precipitó con perlas de Ni-NTA procedente de usados celulares Brij96. Se sondearon inmunotransferencias con anti-TC21 para demostrar Ia asociación de Ia proteína endógena al TCR. (E). TC21 se transloca conjuntamente con el TCR en Ia sinapsis inmune (Sl). Se estimularon células Jurkat transfectadas con TC21-DsRed y CD3ζ-GFP con Raji APC (expresando establemente CFP) precargadas con SEE. Las imágenes seleccionadas a diferentes intervalos de tiempo se muestran para destacar Ia acumulación de TCR y TC21 en Ia IS. Las APC están rodeadas por un círculo en las imágenes aglomeradas. (F). TC21 está constitutivamente presente en una forma activa en células T y sólo parcialmente activada por el TCR. Se transdujeron células 1 D8 con TC21-GFP y se estimularon con el anticuerpo anti-CD3 145-2C11 , y se realizó ensayo de precipitación con GST-RBD. Se realizó en primer lugar una inmunotransferencia con anti-TC21 y posteriormente con anti-Ras. Se calcularon las intensidades relativas de las bandas de TC21 y Ras por densitometría. (G). TC21 se localiza conjuntamente con emplazamientos de actividad PI3K en Ia Sl. Se transfectaron células Jurkat junto con TC21-GFP y PH-Akt-DsRed y se estimularon con Raji APC (rodeadas por un círculo) precargadas con SEE. Se muestran imágenes seleccionadas a diferentes intervalos de tiempo. Esta y las Figuras posteriores muestran experimentos representativos realizados al menos 4 veces con resultados similares. Figura 2. Muestra cómo TC21 es necesario para Ia supervivencia de células T y Ia activación de Akt in vitro.
(A). Pérdida de células que expresan dnTC21-GFP. Se transfectaron células T Jurkat y PBL humanas con dnTC21-GFP o con el vector vacío (GFP) y se cultivaron en ausencia de estímulo. Se estimó el porcentaje de células GFP+ mediante citometría de flujo, tomando el valor de 100 a 1 día tras Ia transfección. (B). La expresión de dnTC21 induce apoptosis. Se transfectaron células Jurkat y de bazo de ratón con dnTC21-GFP ó con el vector vacío. Se estimó Ia inducción de apoptosis entre las poblaciones GFP+ 48 h después mediante anexina V y tinción 7-AAD, o a través del número de células con un contenido en ADN sub-G1. Los números indican el porcentaje de células en cada cuadrante. Se midieron los números totales de células de bazo GFP+ vivas por exclusión con bromuro de propidio. (C). Efecto sobre Ia activación de Akt. Se transfectaron células Jurkat con los mutantes TC21 indicados fusionados a GFP y se evaluó Ia expresión de fosfo-Akt 24 h después en las poblaciones GFP+ mediante citometría de flujo. El histograma sombreado representa fosfo-Akt en células control que expresaban únicamente GFP. Los números indican Ia intensidad de fluorescencia promedio (IFP). (D). Efecto dosis-respuesta. Se representan los valores de IFP de fosfo-Akt vs. GFP del experimento del panel C. (E). Reducción de Ia expresión de TC21 mediante ARNi. Se transfectaron células COS con TC21-GFP de tipo natural junto con cualesquiera de las construcciones de shRNA para TC21 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), una construcción shRNA irrelevante para EB1 (E1 ) ó con el vector vacío (φ). Se examinó Ia expresión de Ia proteína TC21 en inmunotransferencias sondeadas con anti-GFP y anti-α-tubulina como control de carga. (F y G). La transfección de construcciones de ARNi TC21 induce apoptosis (F) y reduce Ia actividad Akt (G). Se transfectaron células Jurkat junto con un vector que expresaba GFP y cualesquiera de las construcciones que comprenden SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, o un vector shRNA vacío. Se determina Ia inducción de apoptosis (en porcentaje) y los niveles de fosfo-Akt (en IFP) 24 h después en las poblaciones GFP+. Figura 3. Muestra cómo los ratones TC21'/m tienen menos células B y T periféricas.
(A). Viñeta que ilustra el punto de inserción retrovírico en el intrón 1 del gen TC21 y las posiciones de los tres cebadores usados para Ia genotipificación. (B). Genotipificación por PCR. Una mezcla de los cebadores 1 , 2 y 3 se usó para detectar los alelos de tipo natural (WT) y dirigido (KO) mediante PCR. (C). La proteína TC21 está ausente o disminuida en los ratones TC21'/' y en los ratones TC21+/~, respectivamente. Se sondearon inmunotransferencias de extractos completos de timo procedentes de ratones con los genotipos TC21 indicados con un anticuerpo frente a TC21 , y de nuevo Ras total y α-tubulinas como controles. (D). La deficiencia en TC21 da como resultado un aumento en Ia proporción de células T y una disminución en Ia proporción de células B en los ganglios linfáticos y bazo. El análisis mediante citometría de flujo de Ia expresión de CD19+ (1 D3, células B) y TCRp+ (H57, células T) en ratones de los genotipos indicados. 1 D3 es el anticuerpo anti-CD19 y H57 es el anticuerpo anti-TCRbeta. (E). La deficiencia en TC21 reduce los números totales de células B y T en el bazo y ganglios linfáticos. Los números totales de células B y T (promedio ± desviación estándar de Ia muestra) se estimaron mediante citometría de flujo en grupos de 10 ratones. Un asterisco indica P< 0,05; dos asteriscos: P< 0,005; tres asteriscos: P< 0,0005. (F). La deficiencia en TC21 reduce el número total de células linfoides y el peso del bazo. Se pesaron 10 bazos de cada genotipo y a continuación se contó el número total de células linfoides mediante citometría de flujo. (G). Pequeño tamaño folicular en bazos procedentes de ratones TC21'/' y TC27+/\ M icrofotog rafias representativas de secciones de bazo con triple tinción con anticuerpos frente a TC21 , CD3 (marcador de célula T) y B220 (marcador de célula B). Se muestra un único folículo para TC27+A y TC21'/', y Ia inserción de dos folículos TC21+/+. La pulpa roja (Ia zona que rodea el área de Ia célula B) queda inespecíficamente teñida con los anticuerpos anti-TC21 y anti-CD3 (RP, claramente visible en Ia muestra TC2V'-). Figura 4. Muestra cómo Ia deficiencia en TC21 elimina células B ZM y evita Ia formación de CG.
(A). La deficiencia en TC21 elimina Ia población de células B ZM. La citometría de flujo de células de bazo de ratón con triple tinción con CD19, CD21 y CD23. Las células B foliculares (FO) (CD21intCD23hi) están rodeadas por un círculo gris y las células B ZM (CD21hlCD23l0) están rodeadas por un recuadro gris. (B). Los ratones TC2T/' tienen menos FO y carecen casi completamente de células B ZM cuando se estimó el número total de células en los bazos de ratón (n=10). (C). Evidencia inmunohistoquímica de Ia desaparición de células B ZM. Se tiñeron secciones de tejido de bazo con un marcador de célula B (B220) y un marcador de macrófagos metalofílicos (MOMA-1 ) que separan las zonas folicular y marginal. La pulpa roja se tiñó de forma no específica por ambos anticuerpos en el bazo TC21'/'). (D). TC21 se expresa fuertemente en los CG. Se tiñeron secciones de ganglios linfáticos de ratones no inmunizados con anti- TC21 y PNA como marcador CG. Los CG no fueron detectados en ratones TC21'/'. (E). Los CG están ausentes en ratones TC21'/'. Las secciones de ganglios linfáticos de ratones no inmunizados se tiñeron con un anticuerpo específico de Ia caspasa 3 activa. (F y G). Disminución de Ia respuesta CG en ausencia de TC21. Los ratones se inmunizaron con glóbulos rojos de sangre de oveja y 6 días después, los ganglios linfáticos se recogieron y las secciones se tiñeron con PNA y B220 para demostrar Ia presencia de los CG. La cuantificación del número de CG por sección procedente de grupos de 3 ratones se muestra a Ia derecha del panel F. El panel G muestra Ia tinción de las secciones de ganglios linfáticos procedentes de ratones inmunizados con el marcador de proliferación Ki-67. (H). Respuesta proliferativa reducida de linfocitos B contra un antígeno de recuerdo. Células de bazo procedentes de ratones inmunizados con TNP-KLH (n=3) se estimularon in vitro durante 48 h en presencia de TNP-BSA. Se evaluó Ia proliferación de célula B por incorporación de 3H-timidina. Figura 5. Muestra cómo Ia deficiencia de TC21 reduce Ia supervivencia y proliferación homeostática de células B y células T CD8+.
(A y B). La proliferación homeostática de células B y células T CD8+ TC21'/' se reduce en huéspedes linfopénicos. Se marcaron células de bazo y de ganglios linfáticos de ratones donantes TC27+/+ y TC2T'~ (n=3) con CFSE y se inyectaron i.v. en ratones C57BL/6 irradiados con una dosis subletal. Se obtuvieron el bazo y los ganglios linfáticos 13 días después y se analizaron para Ia expresión de CFSE en las poblaciones CD19+, CD4+ y CD8+. El índice de proliferación se calculó a partir del porcentaje de células encontradas en cada pico CFSE. (C). La supervivencia de células B y células T CD8+ disminuyó en ausencia de TC21. Se inyectaron i.v. números iguales de células de bazo procedentes de ratones donantes TC21+/+ y TC21'/' (Ly5.2+) en ratones Ly5.1+ (n=4). Tres días después se estimó el porcentaje de células B (CD19+), células T CD4+ y células T CD8+ en las poblaciones inyectadas (positivas para el marcador Ly5.2) encontradas en los ganglios linfáticos y bazo. (D). Efecto de IL-7 sobre Ia supervivencia de células T in vitro. Se incubaron números iguales de células de ganglios linfáticos procedentes de ratones TC21+/+ y TC21'/' (n=3) durante 24 h en presencia o ausencia de IL-7 10 ng/ml. El número de células T de tipo natural tras 24 h sin estímulo IL-7 se ajustó al 100%.
Figura 6. Muestra Ia sobreexpresión de TC21 en linfomas de células T y B humanos.
(A, B). Sobreexpresión de TC21 en linfomas humanos. Se estudió Ia expresión de TC21 en secciones de tejido humano incrustadas en parafina con un anticuerpo anti-TC21 y el tejido se contratiñó con hematoxilina-eosina. Se muestra una biopsia de piel (25x) de un paciente con linfoma de células T cutáneo (micosis fungoides) mostrando una placa con fuerte tinción citoplasmática en células malignas intraepiteliales. La sección (25x) de ganglio linfático de un paciente con DLBCL centroblástico mostrando fuerte tinción citoplásmica y núcleos límpidos. La sección (4Ox) de ganglio linfático de un paciente con linfoma de Hodgkin clásico muestra intensa tinción citoplásmica y fuerte reactividad en células Reed-Sternberg (RS). Se muestra una sección (25x) de ganglio linfático de un donante sano para comparación. CG, centro germinal. El panel (B) muestra sobreexpresión de TC21 en inmunotransferencias de extractos en detergente de ganglios linfáticos procedentes de dos pacientes con DLBCL (muestras 886 y 6063) comparados con un ganglio linfático normal.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos no pretenden limitar el campo de aplicación de Ia misma.
En los ejemplos siguientes se hace referencia a TC21. TC21 (Rras2 o R-ras2) es una proteína codificada por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 o al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO:
2 (secuencias nucleotídicas codificantes de Ia proteína TC21 de Mus musculus y Homo sapiens respectivamente). En cada caso se hace referencia a un tipo concreto de TC21.
EJEMPLO 1. TC21 se asocia constitutivamente con el TCR a través de sus ITAM
En una búsqueda de nuevos ligandos intracelulares de las subunidades CD3, los autores identificaron TC21 como una proteína que interactúa con Ia cola citoplasmática de CD3γ (datos no mostrados) usando un sistema de alistamiento SOS de levadura doble híbrido (Aronheim. 2001. Methods Mol Biol, 177: 319-328). Usando una proteína de fusión GST-TC21 en ensayos de precipitación de usados procedentes de células COS transfectadas con diferentes subunidades CD3, los autores encontraron que TC21 puede interactuar con CD3γ y el resto de subunidades CD3 del complejo TCR (Fig. 1A). Para determinar si las subunidades CD3 se enlazan preferentemente con TC21 tanto activa como no activa, los autores transfectaron simultánea y constitutivamente mutantes activos o inactivos de TC21 junto con CD3ζ y analizaron las proteínas coprecipitadas. CD3ζ interactúa claramente con TC21 »GDP (dnTC21 , inactivo) y se enlaza más débilmente con TC21 »GTP (oncoTC21 , activo, Fig. 1 B).
El ITAM es el único motivo conocido común a las colas de las cuatro subunidades CD3. Para evaluar si TC21 interactúa directamente con estos ITAM los autores incubaron las proteínas GST-TC21 purificadas con un péptido sintético biotinilado correspondiente al motivo ITAM ζA de CD3ζ, como ITAM representativo. Para estudiar el efecto de Ia fosforilación de Ia tirosina sobre Ia unión de TC21 , 'se preparó igualmente el péptido pζA en Ia forma doblemente fosforilada (ζA-P). Se determina una interacción específica y directa entre TC21 y el péptido sintético ζA (Fig. 1C). Además, dnTC21 se unió a ζA mejor que oncoTC21 , y a ζA mejor que a ζA-P. Por tanto, parece que TC21 interactúa preferiblemente en su forma GDP, y con ITAM no fosforilados.
Para evaluar si TC21 interactúa con el TCR en células T, los autores precipitaron el TCR procedente de un derivado del hibridoma T de ratón 2B4 expresando una versión de CD3ζ etiquetada con His. TC21 precipita conjuntamente con el TCR sin depender de si las células T se habían estimulado anteriormente, ya sea con anticuerpos anti-CD3 como con el activador farmacológico pervanadato (Fig. 1 D). Así, TC21 se asocia en forma TC21 »GDP con el TCR en células T independientemente de Ia fosforilación de los ITAM. Mediante la aposición estrecha de sus membranas celulares, las células T forman una sinapsis inmune (Sl) cuando entra en contacto con APC cargada de antígeno, a Ia que el TCR transloca (Dustin. 2008. Immunol Rev, 221 : 77- 89). Puesto que TC21 interactúa con el TCR (Fig. 1 D), los autores evaluaron si TC21 fue alistado en Ia Sl en células vivas. En videomicroscopía confocal con lapso de tiempo de fluorescencia en vivo, TC21-DsRed se concentró en Ia Sl de células T Jurkat humanas estimuladas con Raji APC cargadas con superantígeno en un intervalo de tiempo idéntico al alistamiento de TCR (tal como se detecta mediante transfección conjunta con CD3ζ-GFP: Fig. 1 E). El punto más temprano en el que se detecta un aumento en Ia concentración del TCR en Ia Sl (2 minutos) coincidía con el aumento en Ia concentración de TC21 en el mismo punto (Fig. 1 E), evidencia adicional de que TCR y TC21 se asocian físicamente.
Con el fin de investigar el efecto de TCR desencadenando Ia actividad de TC21 , los autores usaron GST-Rafl-RBD para precipitar TC21 »GTP tras estimulación de Ia célula T. únicamente las formas GTP de Ras y TC21 se asociaron con Rafl-RBD. Mientras que los niveles de Ras»GTP eran relativamente bajos en células Jurkat en reposo, se incrementaron 10 veces cuando los TCR fueron estimulados con un anticuerpo anti-CD3 (Fig. 1 F). Por el contrario, TC21 »GTP significativamente ya aparecía en las células T no estimuladas, y sus niveles sólo aumentaron ligeramente tras Ia estimulación del TCR (1 ,6 veces). Por tanto, aunque el estímulo de TCR promueve Ia activación de TC21 también está constitutivamente activo en células en reposo.
El estímulo de TCR induce Ia activación de las PI3K clase IA provocando Ia translocación de PH-Akt hacia Ia Sl (Costello et al. 2002. Nat Immunol, 3: 1082- 1089). Puesto que TC21 se alista en Ia Sl junto con el TCR, los autores estudiaron si Ia translocación de TC21 a Ia Sl iba acompañada de un aumento en Ia actividad de PI3K. Los autores encontraron que PH-Akt-DsRed se concentraba en Ia Sl de células JurkatRaji en el mismo intervalo de tiempo y de la misma forma que TC21»GFP (Fig. 1G). Así, estos datos sugieren un papel para TC21 en Ia estimulación mediante TCR de Ia actividad de PI3K en Ia Sl.
EJEMPLO 2. La interferencia con Ia actividad de TC21 estimula una pérdida rápida de Ia viabilidad de Ia célula T.
Para estudiar el papel de TC21 en Ia función de TCR, los autores transfectaron células Jurkat con dnTC21 fusionado a GFP para seguir Ia inducción de los marcadores de activación CD69 y CD25 tras estímulo con anticuerpos anti- CD3. Los autores no encontraron ningún defecto en Ia sobreexpresión de estos marcadores (datos no mostrados), aunque hubo una disminución en el número de células GFP+ independientemente de Ia estimulación. La pérdida de expresión de GFP fue más pronunciada en células Jurkat transfectadas con dnTC21-GFP que en células transfectadas únicamente con GFP (Fig. 2A). El efecto de dnTC21 fue incluso más claro en células T primarias humanas transfectadas (Fig. 2A, PBL). Puesto que las células Jurkat transfectadas con dnTC21-GFP expresaron más fuertemente el marcador de Ia apoptosis anexina
V y su ADN genómico resultó fragmentado, Ia pérdida de Ia expresión GFP parecía debida a Ia inducción de apoptosis y no al silenciamiento génico o dilución del plásmido transfectado (Fig. 2B). De Nuevo, Ia apoptosis inducida por Ia expresión de dnTC21-GFP fue más evidente en células primarias, y cuando se transfectaron en células T de bazo de ratón, Ia tinción de Ia anexina
V indicó que todas las células transfectadas experimentaron apoptosis. Además, el número total de células GFP+ de bazo disminuyó 3 veces (Fig. 2B, abajo a Ia derecha).
La apoptosis inducida por dnTC21 podría estar regulada por Ia actividad Akt y, por tanto, los autores determinaron que Ia transfección de dnTC21-GFP en células Jurkat redujo Ia cantidad de Akt activo detectado con un anticuerpo específico de fosfo-Akt. Por el contrario, Ia transfección de oncoTC21-GFP y el TC21-GFP de tipo natural incrementaron los niveles de fosfo-Akt por encima de los de las células control transfectadas con GFP (Fig. 2C). Además, ambos efectos de dnTC21 y oncoTC21 sobre fosfo-Akt fueron dependientes de Ia dosis (Fig. 2D). Así, TC21 parece tener influencia sobre Ia supervivencia de Ia célula T mediante Ia activación de Ia ruta PI3K/Akt.
EJEMPLO 3. Uso de shRNA (ARN de interferencia, ARNi) para Ia silenciación post-transcripcional de TC21.
Puesto que los activadores y efectores de TC21 son comunes a proteínas Ras clásicas (Ehrhardt et al. 2002. Exp Hematol, 30: 1089-1106), el efecto del dnTC21 puede que no sea específico del TC21 únicamente. Así, los autores diseñaron dos construcciones de shRNA (las construcciones comprenden las secuencias SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4) que eliminaron específicamente Ia expresión de TC21. Para que SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 sean capaces de formar un hpRNA o un shRNA, es necesaria una secuencia nucleotídica de unión y a continuación Ia secuencia complementaria de SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4. Es decir, Ia secuencia nucleotídica capaz de formar un hpRNA o un shRNA contiene Ia siguiente estructura: SEQ ID NO: 3 - secuencia de unión - secuencia complementaria invertida de SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4 - secuencia de unión - secuencia complementaria invertida de SEQ ID NO: 4 . Cuando ambas construcciones se transfectaron en células COS junto con TC21-GFP, se observó una fuerte reducción en Ia expresión de TC21 en comparación con Ia producida por un vector de control vacío o una construcción irrelevante (Figura 2E). La transfección de las construcciones que comprenden SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 en células Jurkat aumentó Ia proporción de células apoptóticas en 2 veces (Fig. 2F) y redujo los niveles de fosfo-Akt en un 28% en células no estimuladas (Fig. 2G). Por tanto, el uso de ARNi confirma el importante papel que juega TC21 en Ia supervivencia de Ia célula T in vitro mediante Ia activación de Ia ruta PI3K-Akt.
EJEMPLO 4. El fenotipo de ratones deficientes en TC21 demuestra un papel esencial de TC21 en el mantenimiento de los números de células B y T periféricas. Para estudiar el papel de TC21 en el desarrollo de Ia célula T y en Ia supervivencia de Ia célula T in vivo, los autores investigaron en Ia base de datos Omni Bank (http:/www. lexgen.com) de clones de células ES con inserciones retrovíricas e identificaron un clon que contenía una copia del retrovirus integrada en el intrón del gen TC21 (Fig. 3A). Usando este clon ES, se obtuvo una línea de ratón con el gen TC21 dirigido, y se realizó un ensayo PCR para distinguir entre los genes intacto y TC21 dirigido (Fig. 3B). Cuando se genotipificó Ia progenie de los cruces heterocigóticos de TC27+/~, los autores encontraron una ligera desviación de los índices mendelianos normales en ratones recién nacidos. El alelo dirigido se expresó menos que Ia frecuencia esperada tanto en ratones homocigóticos como heterocigóticos (21 % de TC21'/' , 49% de TC21+/~ n= 378), mientras que el alelo de tipo natural se expresó con frecuencia mayor únicamente en homocigosis (30% TC21+/+). Esto indica que TC21 juega un papel importante durante el desarrollo embrionario.
La proteína TC21 fue indetectable en timo completo en usados procedentes de ratones TC21'/' de 6 semanas de edad y, de manera interesante, los niveles de Ia proteína TC21 fueron inferiores en ratones TC21+/~ que en TC21+/+, indicando un efecto dependiente de dosis de gen (Figura 3C). Esto sugiere que Ia expresión de Ia proteína TC21 está estrechamente regulada.
Los autores estudiaron el efecto de Ia deficiencia de TC21 sobre Ia función de TCR analizando en primer lugar si se afectaba el desarrollo de Ia célula T. Se produjo una distribución normal de las poblaciones tímicas en ratones jóvenes sin depender de Ia dosis del alelo TC21 dirigido (datos no mostrados). Igualmente, Ia pérdida de TC21 no afectó al desarrollo de Ia célula B y el porcentaje de células B inmaduras fue similar en ratones TC21+/+, TC21+/~ y TC21'/'. Sin embargo, Ia deficiencia de TC21 produjo un efecto consistente sobre los números de linfocitos T y B en los órganos linfoides periféricos. El porcentaje de células αβ T en los ganglios linfáticos fue ligeramente mayor en ratones TC21'/' y TC21+/~ que en ratones TC21+/+, mientras que el porcentaje de células B disminuyó (Fig. 3D). Se observó un efecto similar en el bazo (Fig. 3D), un efecto que se reflejó por un aumento en el cociente célula T:B (Fig. 3E). Sin embargo, a pesar del incremento en Ia proporción de células T, los ratones TC21'/' sufrieron una reducción del 30% en el número total de células T en el bazo cuando se comparó con los ratones TC21+/+. El efecto de Ia deficiencia de TC21 sobre los números de células B en el bazo fue más fuerte, produciendo una reducción del 50% (Fig. 3E) y explicando por qué el cociente T:B aumentó en ratones deficientes en TC21. Así, Ia deficiencia en TC21 origina una reducción en el número de células T y B en el bazo, aunque las células B experimentan un efecto mucho más importante. La reducción de células linfoides fue también evidente cuando se estimó el número total de células linfoides del bazo, con una reducción del 40% en ratones TC21'/' y TC21+/~ (Fig. 3F, arriba). Más aún, los bazos de los ratones TC21'/' y TC21+/~ fueron claramente más pequeños que los de los ratones TC21+/+ (Fig. 3F, abajo), y los folículos fueron mucho más pequeños, con pocas células en las zonas T y B (Fig. 3G). En su conjunto, estos datos demuestran que TC21 es necesario para mantener normales los números de células T, y especialmente de células B en el bazo. Notablemente, los ratones heterocigóticos tienen un fenotipo similar a los ratones homocigóticos TC21'/' (Fig. 3D a G), sugiriendo que un gen TC21 es insuficiente para mantener un número de linfocitos normal.
EJEMPLO 5. La deficiencia de TC21 afecta fuertemente a células B de Ia zona marginal y Ia formación de centros germinales.
Las células B esplénicas maduras pueden considerarse como células B foliculares (FO) que pueden circular en diferentes tejidos y células B de Ia zona marginal (ZM) que son residentes permanentes de larga vida en el bazo. Para determinar cómo Ia deficiencia de TC21 afecta a ambos tipos de célula B, se analizó Ia expresión de los marcadores CD21 y CD23 en células CD19+ procedentes del bazo. Según esto, mientras que los ratones TC21'/' mostraron una reducción de 5 veces en Ia población de células B ZM (CD21hlCD23l0), hubo un aumento relativo en Ia proporción de células B FO (CD21ιntCD23hl) cuando se comparó con sus equivalentes TC21+/+ (Fig. 4A). Sin embargo, una estimación del número absoluto de células reveló una reducción en ambas poblaciones celulares en los ratones TC21'/', mientras que el efecto sobre las células B ZM fue mayor (Fig. 4B). Significativamente, el fenotipo de los ratones heterocigóticos TC21+/~ fue intermedio.
Para verificar el defecto en células B ZM, los autores examinaron secciones de tejido de bazo con un marcador de célula B general y con MOMA-1 , un marcador de macrófagos metalofílicos que delinean Ia división espacial entre células B ZM y FO. Los ratones TC21'/' y TC21+/~ mostraron una clara disminución de células B ZM, situadas entre los macrófagos MOMA-1 + y Ia pulpa roja (Fig. 4C). A pesar del efecto de Ia deficiencia de TC21 sobre las poblaciones de células B FO y ZM, no fue evidente una influencia significativa sobre las células B1 , un tercer tipo de células B maduras especialmente enriquecidas en las cavidades corporales (datos no mostrados).
Para determinar si el efecto de Ia deficiencia de TC21 sobre los linfocitos es intrínseco de Ia célula, los autores realizaron experimentos de reconstitución de médula ósea en ratones deficientes en RAG2. En ratones RAG2'/' está completamente abolido el desarrollo de los linfocitos T y B y, así, los autores inyectaron de forma intravenosa células de médula ósea procedentes de ratones TC21+/+ y TC2T/' a ratones RAG2~/~ sometidos a una dosis sub-letal de radiación. Tras reconstitución con medula ósea procedente de ratones TC21+/+, se detectaron células B y T en el bazo y ganglios linfáticos. Cuando se inyectó médula ósea procedente de ratones TC21'/' se produjo un aumento en el cociente célula T:B, comparado con el inyectado con médula ósea de tipo natural, y las células B ZM estuvieron virtualmente ausentes (datos no mostrados) reproduciendo el fenotipo de los ratones TC21'/'. Estos resultados indican que el efecto de Ia deficiencia de TC21 sobre las poblaciones linfoides es intrínseco de Ia célula.
Los centros germinales (CG) se forman en el bazo y ganglios linfáticos tras Ia estimulación con antígeno de células B y son áreas de intensa proliferación, apoptosis, cambio de tipo de Ig, y maduración de Ia afinidad (Klein y DaIIa- Favera. 2008. Nat Rev Immunol, 8: 22-33) Se han detectado CG en ganglios linfáticos de ratones TC21 +/+ teñidos con el marcador específico de CG aglutinina de cacahuete (PNA). Las células de los CG expresaron intensamente TC21 , más que las zonas foliculares circundantes (Fig. 4D). Sin embargo, los CG estaban ausentes de los ganglios linfáticos de ratones TC21'/'. La caspasa 3 activa, un marcador de células apoptóticas, se concentra en los CG de los ganglios linfáticos de los ratones TC21+/+, mientras que en los ratones TC21'/' las células apoptóticas están dispersas (Fig. 4E), evidencia adicional de Ia pérdida de CG en ratones TC21'/'. El tamaño y número de los CG aumenta tras Ia exposición al antígeno, de manera que los autores ensayaron adicionalmente si TC21 es necesario para Ia formación de CG analizando ganglios linfáticos tras inmunización con eritrocitos de oveja. Los ganglios linfáticos de ratones TC21+/~ y especialmente TC21'/' contenían menos CG y más pequeños que los ratones TC21+/+ cuando se ensayaron con PNA (Fig. 4F) y el marcador de proliferación Ki-67 (Fig. 4G). De este modo, Ia formación de CG parece estar fuertemente inhibida en ratones deficientes en TC21. Según esto, Ia proliferación de células B in vitro en respuesta a un antígeno quedó inhibida (Fig. 4H). Además, Ia respuesta secundaria al antígeno dependiente de T quedó desequilibrada en ratones TC21'/' y TC21+/~ en todos los subtipos de Ig detectables, pero especialmente en lgG3 (datos no mostrados). Por el contrario, Ia respuesta para antígenos independientes de T de tipo I y tipo Il no quedó significativamente alterada en los ratones deficientes en TC21.
EJEMPLO 6. TC21 es necesario para Ia supervivencia y proliferación homeostática de células T y B.
Para explicar por qué los números de linfocitos T y B se redujeron en los ratones TC21'/', los autores realizaron experimentos de transferencia adoptiva de linfocitos maduros en ratones tanto linfopénicos como normales. De esta forma, se mediría Ia capacidad de los linfocitos TC21'/' para proliferar y rellenar nichos vacíos (proliferación homeostática), y su capacidad para sobrevivir en ausencia de proliferación. Cuando se marcaron linfocitos TC21'/' con el marcador fluorescente CFSE y se transfirieron a ratones C57/BL6 linfopénicos irradiados, proliferaron menos que los linfocitos TC21+/+ (según se detectó mediante dilución de fluorescencia, Fig. 5A). Este efecto se observa claramente en células B y células T CD8+, pero no en células T CD4+ (Fig. 5B). Por tanto, parece que TC21 es necesario para Ia proliferación homeostática tanto de células T CD8+ como de células B, pero no para las células T CD4+.
Para examinar el efecto de Ia deficiencia en TC21 sobre Ia supervivencia de células T y B, se inyectaron células de bazo procedentes de ratones TC21+/+ o
TC21'/' en ratones Ly5.1 + con todos los linfocitos. Los ratones donantes expresaban el alelo Ly5.2 del marcador de célula hematopoyética CD45 y así, se podía seguir el destino de las células inyectadas con anticuerpos frente a
Ly5.2. La proporción de células CD8+ T y B entre Ia población de Ly5.2+ detectada tres días después de Ia inyección fue significativamente menor en ausencia de TC21 cuando se comparó con células TC21+/+ (Fig. 5C). Por tanto, parece que TC21 mantiene Ia supervivencia de células B y T in vivo. Además,
Ia supervivencia in vitro de células T también se redujo en ausencia de TC21 , independientemente de Ia adición de IL-7 exógena (Fig. 5D).
EJEMPLO 7. TC21 se sobreexpresa en cánceres linfáticos.
Puesto que TC21 parece tener influencia sobre Ia supervivencia de células T y B, los autores examinaron si TC21 debería asociarse con cánceres linfáticos, quizás intensificando o prolongando señales de supervivencia. Puesto que se ha documentado Ia sobreexpresión de TC21 en diferentes carcinomas, los autores examinaron Ia distribución de TC21 en secciones de tejido de diferentes linfomas humanos de células T y B. TC21 estaba sobreexpresado en linfoma cutáneo de células T (3 de 3 casos, Fig. 6A, y datos no mostrados) así como en diferentes linfomas de Hodgkin y no Hodgkin de células B. Los linfomas de células B con fuerte expresión de TC21 incluyen linfoma difuso de células B grandes (DLBCL, 68 de 80 casos) y linfoma de Hodgkin (HL, 60 de 60 casos, véase Ia Fig. 6A). Las 68 muestras de DLBCL en las que TC21 estaba sobreexpresado incluyeron linfomas Bcl6+ y Bcl6" (datos no mostrados), sugiriendo que Ia sobreexpresión de TC21 se produce en linfomas tanto derivados de CG como posderivados de CG. El HL clásico es también un linfoma CG caracterizado por Ia presencia de células Reed Sternberg multinucleadas, el citoplasma de las cuales fue fuertemente marcado con anti- TC21 (Fig. 6A). También se encontró que Ia proteína TC21 se sobreexpresaba en dos muestras de DLBCL analizadas mediante inmunotransferencia, cuando se compara con los ganglios linfáticos normales (Fig. 6B). Este resultado valida los datos de inmunotinción y refuerzan Ia idea de que TC21 está sobreexpresado en los linfomas humanos.
Procedimientos experimentales
Células y ratones.
La línea Jurkat de linfoma de células T humano, el derivado CD3ζ-negativo del hibridoma murino 2B4 (MA5.8), Ia línea Raji de linfoblastoide de células B humano y Ia línea de células de mieloma J5778 y sus derivados (generosamente proporcionados por el Dr. Michael Reth, Universidad de Freiburg, Alemania) se hicieron crecer en RPMI + suero fetal bovino al 5% (FBS). El clon 1 D8 fue derivado de MA5.8 tras transfección con una construcción CD3ζ-His(6x) en el vector de expresión pSRα y selección en G418. Los ratones deficientes en TC21 se generaron en Lexicón Genetics y se derivaron del clon ES OST361011 con una inserción retrovírica VICTR37 en mitad del intrón 1. Los ratones heterocigóticos se cruzaron y las carnadas se genotipificaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: SEQ ID NO: 5 (cebador directo en el intrón 1 de TC21 ); SEQ ID NO: 6 (cebador reverso en el intrón 1 de TC21 ), SEQ ID NO: 7 (cebador reverso en el LTR retroviral insertado), que se usaron en todos los experimentos. Los ratones transgénicos TC27+/+ y TC21'/' para OT1 TCR (OVAp específico, H-2Kb restringido) se obtuvieron cruzando ratones heterocigóticos. Plásmidos y anticuerpos.
TC21-GFP y TC21-DsRed se obtuvieron mediante clonación por PCR de Ia secuencia de ADNc humana de tipo natural en pEGFP-C1 y pDsRed2, respectivamente (Clontech). Las construcciones dnTC21 y oncoTC21 se crearon introduciendo una mutación S28N y G23V en TC21-GFP usando el kit de mutagénesis dirigida al emplazamiento (Stratagene). GST-TC21 se generó insertando el ADNc de TC21 en el vector pGEX-4T3 (Pharmacia), y Ia proteína de fusión se generó según indicaba el fabricante. Las construcciones de TC21 shRNA que comprenden SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, correspondiente a las posiciones 434-452 y 829-847 de Ia secuencia de ADNc humano, se prepararon en el plásmido pRN A-H 1.1 /neo de Genscript. Las construcciones PH-Akt-DsRed, GST-RBD y HA-LMP2A fueron generosamente suministrados por los doctores Santos Manes (CNB, Madrid), Doreen Cantrell (Universidad de Dundee, GB), y Chris Dawson (Universidad de Birmingham, GB). Los plásmidos que expresaban subunidades CD3 humanas etiquetadas con flag se han descrito con anterioridad (Delgado y Alarcón. 2005. J Exp Med, 201 : 555- 566).
Se generó un antisuero de conejo específico frente a TC21 inmunizando conejos Nueva Zelanda con una proteína de fusión GST-TC21 purificada.
Selección de Ia levadura doble híbrido.
Se usó el sistema Cytotrap (Stratagene) para seleccionar una biblioteca de ADNc de bazo humano (Stratagene) respecto de proteínas que interactúan con Ia cola citoplasmática de CD3γ según se ha descrito (Gil et al. 2002. CeII, 109: 901 -912).
Inmunoprecipitación, ensayos de precipitación y videomicroscopía de lapso de tiempo.
Todos estos procedimientos se realizaron según se ha descrito anteriormente (Gil et al. 2002. CeII, 109: 901-912).
Experimentos de transferencia adoptiva. Para los procedimientos de proliferación homeostática se marcaron un total de, 10x106 células procedentes de ganglios linfáticos y bazo de ratones TC21+/+ y TC21'/' con CFSE (Molecular Probes) y se inyectaron i.v. en ratones C57/BL6 irradiados con dosis sub-letal (600 rad). Las células de los ganglios linfáticos y bazo procedentes de los ratones aceptores se analizaron 13 días después mediante citometría de flujo.
Para los experimentos de supervivencia in vivo, 10x106 células de bazo procedentes de ratones TC21+/+ y TC21'/' (expresando Ly5.2) se inyectaron i.v. en ratones C57/BL6 (Ly5.1+) y 3 días después los ganglios linfáticos y células de bazo de los ratones aceptores se analizaron mediante citometría de flujo usando anticuerpo anti-l_y5.2 para rastrear las células inyectadas. Para Ia reconstitución de Ia médula ósea, se inyectaron i.v. 5x106 células de Ia médula ósea en ratones RAG2~/~ irradiados con una dosis subletal (400 rad). Las células procedentes de los órganos linfoides de los ratones aceptores se analizaron mediante citometría de flujo 5 semanas después de Ia transferencia celular.
Supervivencia y proliferación in vitro.
Para medir Ia supervivencia in vitro, las células de los ganglios linfáticos se cultivaron en RPMI con FBS al 10%, βME (10μM) y piruvato de sodio (50 mM) con o sin IL7 (10 ng/ml, Preprotech). Se estimó el número de células vivas mediante FAC aplicando exclusión IP y comparando con las perlas de recuento. El número total de células T se estimó mediante tinción FAC y recuento celular. La proliferación de células B en respuesta al antígeno de recuerdo se analizó in vitro mediante Ia incorporación de 3H-timidina tras estímulo con TNP-BSA de células de bazo procedentes de ratones TC21+/+ y TC21'/' preinmunizados. Para Ia inmunización, se inyectaron i.p. 100 μg de TNP-KLH en coadyuvante completo de Freund, dos semanas después se reinoculó otra dosis de 100 μg en coadyuvante incompleto, y finalmente se sacrificaron 1 mes después de Ia primera inmunización. Inmunohistoquímica.
Se realizó inmunohistoquímica tanto de tejidos congelados como de preparaciones en parafina según se ha descrito (Cúbelos et al. 2007. Cereb Cortex, 21 : 21 ).
Análisis estadístico. Los datos cuantitativos se muestran como media ± desviación estándar de Ia muestra. Se usó el test Mann-Whitney de dos colas para evaluar los intervalos de confianza.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Célula aislada procedente de un mamífero no humano, modificada genéticamente, que comprende una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ
ID NO: 1 , inactivada funcionalmente o deleccionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis.
2. Célula según Ia reivindicación 1 , donde Ia secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 1.
3. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha célula es somática o germinal.
4. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Ia célula es una célula madre.
5. Célula según Ia reivindicación 4, donde Ia célula madre se selecciona de Ia lista que comprende pluripotente, multipotente o unipotente.
6. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dicho mamífero no humano es Mus musculus (ratón).
7. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Ia célula se selecciona de Ia lista que comprende oocito, blastómero, blastocito o célula embrionaria.
8. Mamífero no humano modificado genéticamente que contiene Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Mamífero no humano modificado genéticamente según Ia reivindicación 8, donde dicho mamífero es un ratón.
10. Uso de cualquier célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T.
11. Método para Ia producción de Ia célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende: a) Obtener al menos una célula aislada procedente de un mamífero no humano, b) transfectar Ia célula del apartado (a) con un vector retroviral, capaz de insertar una secuencia nucleotídica en cualquier posición nucleotídica de una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , y c) seleccionar Ia célula en Ia que Ia secuencia con al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 queda inactivada funcionalmente o deleccionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis.
12. Método para Ia producción de Ia célula modificada genéticamente según Ia reivindicación 11 , donde Ia secuencia que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
13. Método para Ia producción de un mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 que comprende: a) Incorporar Ia célula madre según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7 a un embrión, b) introducir el embrión del apartado (a) en un órgano sexual de un individuo hembra en condiciones donde dicho individuo sea capaz de desarrollar progenie, e c) identificar al menos un descendiente de Ia progenie del apartado
(b) que contiene Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un
80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID
NO: 1 inactivada funcionalmente o deleccionada total o parcialmente, en homocigosis o heterocigosis.
14. Método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente según Ia reivindicación 13, donde el embrión del apartado (a) es un oocito fecundado, mórula o blastocisto.
15. Método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde Ia incorporación de Ia célula madre del apartado (a) contribuye a todos los linajes celulares de dicho embrión.
16. Método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
17. Método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde además comprende cruzar un descendiente identificado en el apartado (c) para producir mamíferos no humanos heterocigóticos en Ia modificación genética introducida.
18. Método para Ia producción del mamífero no humano modificado genéticamente según Ia reivindicación 17, donde además comprende cruzar dos descendientes heterocigóticos para producir al menos un descendiente homocigótico en Ia modificación genética introducida.
19. Método para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T que comprende: a) Cultivar al menos una célula modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un medio de cultivo, b) administrar un compuesto a Ia célula del apartado (a), o a dicho medio de cultivo, para generar al menos una célula tratada, c) medir Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T en Ia célula tratada del apartado (b), y d) comparar dicha capacidad moduladora del apartado (c) con Ia capacidad moduladora de Ia homeostasis de las células B y T que produce el compuesto del apartado (b) en células control.
20. Método para el screening según Ia reivindicación 19, donde el compuesto administrado es una secuencia de ácido nucleico capaz de formar un siRNA que híbrida con cualquier fragmento del RNA codificado por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1.
21. Método para el screening según Ia reivindicación 20, donde Ia secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 es SEQ ID NO: 1.
22. Uso de una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , o de SEQ ID NO: 1 , como diana, en una célula de mamífero no humano aislada, para el screening de compuestos con capacidad moduladora de Ia homeostasis de células B y T.
23. Uso según Ia reivindicación 22 donde las células de mamífero son de ratón.
24. Secuencia nucleotídica capaz de generar un siRNA que híbrida con cualquier fragmento del RNA codificado por una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 80% de identidad con una secuencia que codifica para SEQ ID NO: 1 , o codificado por Ia secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.
25. Secuencia nucleotídica según Ia reivindicación 24, donde dicha secuencia es capaz de formar un hpRNA.
26. Secuencia nucleotídica según Ia reivindicación 25, donde el hpRNA es un shRNA.
27. Secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicha secuencia comprende SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 4.
28. Vector de expresión que comprende Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.
29. CeIuIa modificada genéticamente, aislada de un mamífero no humano, transfectada con el vector según Ia reivindicación 28.
30. Secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, o del vector según Ia reivindicación 28 para su uso en el tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético.
31. Secuencia nucleotídica según Ia reivindicación 30, donde el cáncer hematopoyético es un linfoma.
32. Uso de Ia secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, o del vector según Ia reivindicación 30 para Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de un cáncer hematopoyético.
33. Uso de Ia secuencia nucleotídica según Ia reivindicación 32, donde el cáncer hematopoyético es un linfoma.
34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
35. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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