ES2344636T3 - Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites. - Google Patents

Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites. Download PDF

Info

Publication number
ES2344636T3
ES2344636T3 ES03724916T ES03724916T ES2344636T3 ES 2344636 T3 ES2344636 T3 ES 2344636T3 ES 03724916 T ES03724916 T ES 03724916T ES 03724916 T ES03724916 T ES 03724916T ES 2344636 T3 ES2344636 T3 ES 2344636T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
amplification
pair
primers
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03724916T
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Hamelin
Nirosha Suraweera
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Application granted granted Critical
Publication of ES2344636T3 publication Critical patent/ES2344636T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Método para evaluar la inestabilidad de los microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación de un locus del microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5'' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393).

Description

Marcadores microsatélites de repeticiones mononucleótido para detectar la inestabilidad de los microsatélites.
La invención se refiere a nuevos marcadores microsatélites y su uso para la detección de la inestabilidad de los microsatélites (MSI) asociada con algunos tumores.
Los microsatélites son motivos de ADN cortos (1-10 pares de bases), que se dan como repeticiones en tándem en numerosos loci por todo el genoma.
El fenotipo de inestabilidad de microsatélite (MSI) se define como la presencia en ADN tumoral de microsatélites de tamaño alternativo que no se ven en el ADN germinal correspondiente (AALTONEN et. al., Science, 260(5109), 812-816, 1.993; IONOV et. al., Nature, 363(6429), 558-561, 1.993; THIBODEAU et. al., Science, 260(5109), 816-819, 1.993; IACOPETTA et. al., Hum. Mutat., 12(5), 355-360, 1.998).
El fenotipo MSI es una característica del síndrome de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), en el que puede detectarse en más del 90% de todos los tumores HNPCC (LIU et. al., Nature Med., 2, 169-174, 1.996); también se da en aproximadamente el 15% de los tumores gástricos y de colon esporádicos. También se ha detectado en otros tumores, como los carcinomas pancreáticos (HAN et. al., Cancer Res., 53, 5087-5089, 1.993), carcinomas de próstata (GAO et. al., Oncogene, 9, 2999-3003, 1.994), carcinomas del endometrio (RISINGER et. al., Cancer Res., 53, 5100-5103, 1.993; PELTOMAKI et. al., Cancer Res., 53, 5853-5855, 1.993).
La MSI refleja un defecto de la reparación de apareamientos incorrectos (MMR) subyacentes que no reconoce los errores introducidos durante la replicación de las secuencias microsatélite. En el síndrome del cáncer familiar HNPCC, el fenotipo MSI es causado por mutaciones germinales en los genes hMSH2, hMLH1 de reparación de apareamientos incorrectos (MMR) y menos frecuentemente en hPMS1, hPMS2 y hPMS6 (KINZLER et. al., Cell, 87, 159-170, 1.996). En los cánceres esporádicos a menudo suele ser causado por metilación del promotor hMLH1 que lleva al silenciamiento transcripcional de este gen (HERMAN et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(12), 6870-6875, 1.998).
Los tumores gástricos y de colon MSI tienen unos perfiles clinicopatológicos y moleculares distintivos y a menudo suelen asociarse con una prognosis favorable ((LOTHE et. al., Cancer Res., 53, 5849-5852, 1.993; KIM et. al., Am. J. Pathol., 145, 148-156, 1.994; OLIVEIRA et. al., Am. J. Pathol., 153, 1211-1219, 1.998). También existe evidencia que sugiere que los pacientes de cáncer colorrectal con tumores MSI muestran un buen beneficio de supervivencia de la quimioterapia basada en 5FU (ELSALEH et. al., The Lancet, 355, 1745-1750, 2.000; LIANG et. al., Int. J. Cancer, 101, 519-525, 2.002) y por tanto la MSI podría resultar un marcador predictivo molecular útil para responder a este tipo de terapia adyuvante. El análisis de rutina del estado MSI también tiene una aplicación clínica para ayudar en el diagnóstico de casos de HNPCC sospechosos (AALTONEN et. al., N. Eng. J. Med., 338, 1481-1487, 1.998). De hecho, los tumores de pacientes HNPCC carecen de las características fenotípicas que los distinguen fácilmente de tumores esporádicos y por tanto el diagnóstico de esta enfermedad se basó históricamente en la historia familiar del cáncer utilizando por ejemplo el criterio de Ámsterdam (VASEN et. al., Dis. Colon Rectum, 34, 424-425, 1.991; VASEN et. al., Gastroenterology, 115, 1453-1456, 1.999). Tales criterios resultan sin embargo demasiado restrictivos e identifican sólo una fracción de familias HNPCC de manera que no se conoce la incidencia verdadera de esta enfermedad y las estimaciones varían desde el 0,5 hasta el 13%. Dado que los portadores familiares de defectos MMR tienen un riesgo mayor del 80% de desarrollar cáncer, resulta importante idear maneras eficaces y rentables de detectar esta condición. Con este fin, se están desarrollando en la actualidad métodos de laboratorio basados en moléculas que pueden ayudar a establecer el diagnóstico de HNPCC. Se proponen en general dos métodos: genotipificación de microsatélites e inmunohistoquímica de las proteínas de reparación de apareamientos incorrectos principales. El uso de uno u otro, o ambos métodos todavía es una cuestión de debate, basada en su coste, especificidad y eficacia relativos (LINDOR et. al., J. Clin. Oncol., 20, 1043-1048, 2.002; WAHLBERG et. al., Cancer Res., 62, 3485-3492, 2.002; TERDIMAN et. al., Gastroenterology, 120, 21-30, 2.001; LOUKOLA et. al., Cancer Res., 61, 4545-4549, 2.001). Por ahora parece que la genotipificación de microsatélites tiene una mayor sensibilidad que la IHC, pero es más cara y más difícil de configurar en laboratorios de rutina. Por tanto resulta importante desarrollar métodos simples y precisos para determinar los tumores MSI para las informaciones de diagnóstico-pronóstico y predisposición.
Los investigadores han estudiado numerosos microsatélites diferentes con el objetivo de identificar tumores MSI.
Dependiendo del tipo y número de microsatélites analizados, se han publicado resultados muy variables de frecuencia de MSI en tipos de tumores diferentes (PERUCHO, Cancer Res., 59(1), 249-256, 1.999).
Se ha propuesto el uso de una combinación de marcadores BAT-25 y BAT-26 para la detección de MSI (ZHOU et. al., Genes, Chromosomes & Cancer, 21(2), 101-107, 1.998; HOANG et. al., Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997).
El BAT-25 y BAT-26 son repeticiones de mononucleótidos situados respectivamente en el intrón 16 de c-kit y el intrón 5 de hMSH2. Estas dos repeticiones son cuasimonomórficas en las poblaciones caucásicas (HOANG et. al., Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997; ZHOU et. al., Oncogene, 15(14), 1713-1718, 1.997). Esta propiedad permite una clasificación rápida de las variaciones de tamaño alélicas grandes vistas en el ADN tumoral MSI debidas a una alteración somática. En la gran mayoría de los tumores, el análisis de BAT-25 y BAT-26 resulta suficiente para establecer su estado MSI sin referencia al ADN germinal (ZHOU et. al., Genes, Chromosomes & Cancer, 21(2), 101-107, 1.998).
Sin embargo, se han identificado los alelos de BAT-25 y BAT-26 de tamaño alternativo en 18,4 y 12,6%, respectivamente, de americanos africanos (PYATT et. al., Am. J. Pathol., 155(2), 349-353, 1.999; SAMOWITZ et. al., Am. J. Pathol., 154(6), 1637-1641, 1.999). De esta manera, puede necesitarse el análisis de repeticiones adicionales para evitar el resultado de falsos positivos ocasionales que surgen de estos polimorfismos germinales.
Por consiguiente se ha propuesto completar el análisis de repeticiones de mononucleótidos mediante el análisis adicional de repeticiones de dinucleótidos tanto en el tumor como en el ADN germinal.
Por ejemplo, la patente US 6.150.100 propone el uso de 2 repeticiones de mononucleótidos seleccionados de entre BAT25, BAT26 y BAT40, asociadas con 2 ó 3 repeticiones de dinucleótidos seleccionados de entre APC, Mfd15, D2S123, y D18S69, y opcionalmente con la repetición de pentanucleótidos TP53Alu. Las combinaciones mencionadas de marcadores microsatélites descritos en la patente US 6.150.100 son BAT25, BAT26, APC, Mfd15 y D2S123 ó BAT26, BAT40, APC, Mfd15 y D2S123.
En 1.997 una reunión de consenso internacional sobre la detección de MSI recomendó un panel de cinco marcadores para el análisis uniforme del estado MSI (BOLAND et. al., Cancer Res., 58(22), 5248-5257, 1.998). Esto incluía dos repeticiones de mononucleótidos (BAT-25 y BAT-26) y tres repeticiones de dinucleótidos (D5S346, D2S123 y D17S250). Los tumores con inestabilidad en dos o más de estos marcadores se definieron como MSI-H. Los tumores con inestabilidad en un marcador, y sin inestabilidad se definieron como MSI-L y MSS respectivamente. Los cánceres MSI-H tienen unas características clinicopatológicas distintas de los tumores MSI-L y MSS.
Algunas de las características de las repeticiones de dinucleótidos hacen su uso como marcadores del estado MSI un tanto problemático. Las repeticiones de dinucleótidos en los paneles anteriormente indicados muestran generalmente inestabilidad en sólo el 60-80% de los tumores MSI-H (SUTTER et. al., Mol. Cell Probes, 13(2), 157-165, 1.999). Existe alguna evidencia para sugerir que la pérdida de MMR y la posterior alteración de las repeticiones de mononucleótidos sucede más temprano en la ruta de progresión del tumor MSI-H que la mutación de las repeticiones de dinucleótidos (PERUCHO et. al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59, 339-348, 1.994). Además, algunas líneas de células MSI con deficiencia MMR causada por mutación del hMSH6 no muestran alteración en las repeticiones de dinucleótidos (AKIYAMA et. al., Cancer Res., 57(18), 3920-3923, 1.997). Por tanto la deficiencia MMR subyacente que afecta las repeticiones de mononucleótidos y dinucleótidos puede ser diferente y el análisis de ambas puede llevar a una mala interpretación del estado MSI de algunos tumores. En muchos casos el análisis de repeticiones de dinucleótidos no añade información adicional a los resultados obtenidos mediante el análisis de repeticiones de mononucleótidos ((DIETMAIER et. al., Cancer Res., 57(21), 4749-4756, 1.997; LOUKOLA et. al., Cancer Res., 61(11), 4545-4549, 2.001).
Además, a diferencia de las repeticiones de mononucleótidos como BAT-25 Y BAT-26, las repeticiones de dinucleótidos son altamente polimórficas. Por tanto, su uso para la identificación de MSI en el ADN tumoral siempre requiere el análisis del ADN germinal correspondiente.
Esto hace que el proceso de cribado de MSI sea considerablemente más caro y requiera más tiempo, así como la introducción de errores potenciales debido al mezclado de las muestras de ADN tumoral y germinal. Además, la interpretación de las alteraciones de tamaño en estas repeticiones de dinucleótidos resulta difícil y puede llevar a una mala clasificación (PERUCHO, Cancer Res., 59(1), 249-256, 1.999). Finalmente, en muchas situaciones el ADN germinal de pacientes con cáncer no está disponible fácilmente.
Por todas estas razones, los métodos que utilizan BAT-25 Y BAT-26 ya sea solos, o en combinación con repeticiones de dinucleótidos no resultan totalmente satisfactorios para la determinación precisa del estado MSI en tumores humanos y existe una necesidad urgente de mejora.
De esta manera, se necesitan repeticiones de mononucleótidos cuasi monomórficos múltiples para el diagnóstico preciso de los tumores MSI.
Los inventores han identificado recientemente nuevas repeticiones de mononucleótidos que se conservan en el ADN germinal de sujetos caucásicos y africanos y que, similar a BAT-25 Y BAT-26, son altamente sensibles a la deleción somática en los tumores MSI-H.
Tres de estos nuevos marcadores microsatélites son repeticiones poli(T) denominadas en lo sucesivo en la presente memoria NR21, NR22, y NR24.
El marcador NR21 es una repetición 21T identificada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393).
El marcador NR22 es una repetición 22T identificada en la región no traducida 3' del gen de la proteína B5 precursora transmembrana putativa (secuencia de ADNc GenBank L38961).
El marcador NR24 es una repetición 24T identificada en la región no traducida 3' del gen dedos de cinc-2 (secuencia de ADNc GenBank X60152).
Un cuarto marcador microsatélite, denominado en lo sucesivo en la presente memoria NR27, es una repetición 27A identificada en la región no traducida 5' del gen de la proteína 1 inhibidora de la apoptosis (secuencia de ADNc GenBank AF070674).
Los marcadores NR21, NR22, NR24 y NR27 resultan útiles para la evaluación de la inestabilidad de microsatélites en el diagnóstico de tumores.
La invención proporciona así un método para evaluar la inestabilidad de microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los loci de los microsatélites en una muestra biológica de ADN genómico de dicho tumor y la determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación del locus NR21 del microsatélite.
De acuerdo con una forma de realización preferente de la invención, dicho método comprende la amplificación de los dos loci NR21 y NR24 del microsatélite, y la amplificación de un tercer locus del microsatélite seleccionado de entre NR22 y NR27.
Ventajosamente, dicho método comprende adicionalmente la amplificación de por lo menos un locus del microsatélite diferente de NR21, NR22, NR24 y NR27. Preferentemente, dicho locus del microsatélite es un locus de una repetición mononucleótido. Más preferentemente este locus de repetición mononucleótido se selecciona de entre BAT-25 y BAT-26.
De acuerdo con una forma de realización concreta, el método de la invención comprende la amplificación de los cinco loci del microsatélite BAT-25, BAT-26, NR21, NR22 y NR24.
De acuerdo con otra forma de realización concreta, el método de la invención comprende la amplificación de los cinco loci del microsatélite BAT-25, BAT-26, NR21, NR27 y NR24.
La inestabilidad de microsatélite en cada uno de estos loci se evalúa mediante comparación del tamaño del producto de amplificación obtenido del ADN tumoral con el tamaño del producto de amplificación obtenido del ADN normal (es decir, no tumoral) con el mismo conjunto de cebadores.
Esta comparación puede llevarse a cabo de una manera convencional, obteniendo un producto de amplificación del ADN normal del mismo sujeto con el mismo conjunto de cebadores, y utilizándolo como referencia.
Sin embargo, la presente invención hace posible, en la mayoría de los casos, evitar la necesidad de amplificar el ADN normal del mismo sujeto. En cambio, la comparación puede hacerse mediante referencia al tamaño medio de los productos de amplificación obtenidos de los ADNs normales de un pool de sujetos con el mismo conjunto de cebadores. En estos casos, la inestabilidad de los microsatélites se asume en el caso del locus BAT-26 si el tamaño del producto de amplificación obtenido del ADN tumoral es más corto en más de 3 pb que el tamaño medio del producto de amplificación obtenido a partir del ADN normal utilizando el mismo conjunto de cebadores, y en el caso de los loci BAT-25, NR21, NR22, NR25 y NR27, si el tamaño del producto de amplificación obtenido a partir del ADN tumoral es más corto en más de 2 pb que el tamaño medio del producto de amplificación obtenido a partir del ADN normal utilizando el mismo conjunto de cebadores.
El ADN genómico tumoral puede obtenerse a partir de fuentes diferentes que incluyen principalmente biopsias o tejidos tumorales, o fluidos o secreciones corporales que contienen células tumorales diseminadas, tejido embebido en parafina.
La invención también proporciona unos reactivos para llevar a cabo el método de la invención.
En concreto, un objeto de la invención es el uso de pares de cebadores adecuados para la amplificación del locus NR21 del microsatélite para la evaluación in vitro de la inestabilidad de microsatélite asociada con un tumor. La invención también proporciona unos kits para la evaluación de la inestabilidad de microsatélite, cebadores de asociación adecuados para la amplificación del locus NR21 del microsatélite con unos cebadores adecuados para la amplificación de NR24 y opcionalmente con unos cebadores adecuados para la amplificación de NR22 y/o NR27.
Los cebadores adecuados pueden derivarse de las secuencias genómicas que rodean dichos loci del microsatélite.
Por ejemplo:
-
los cebadores que permiten la amplificación de NR21 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AL117258, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 1;
-
los cebadores que permiten la amplificación de NR22 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AP001132, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 2;
-
los cebadores que permiten la amplificación de NR24 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AC092835, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 3;
-
los cebadores que permiten la amplificación de NR27 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AP001167, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 16.
\vskip1.000000\baselineskip
A modo de ejemplo:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
1
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
2
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
3
Los cebadores indicados anteriormente dan al ser utilizados en ADN normal, unos productos de amplificación de 104, 143, y 134 pb para NR21, NR22 y NR24 respectivamente.
Pueden marcarse ventajosamente con tinciones fluorescentes utilizadas en los ensayos de PCR múltiple. Preferentemente, se utilizarán tinciones fluorescentes diferentes para los cebadores que den unos productos de amplificación de tamaño similar (es decir, con tamaños que difieren en menos de 15-20 pb). Esto permite evitar dudas que podrían resultar de la superposición de los productos de PCR debido a la deleción media de 5-12 pb para estos marcadores en los tumores MSI.
Si se prefiere no utilizar tinciones fluorescentes diferentes, pueden diseñarse cebadores para dar productos de amplificación de tamaño claramente distinto (es decir con tamaños que difieran en por lo menos 15 pb y preferentemente en por lo menos 20 pb entre marcadores diferentes). Esto permite una separación clara entre los marcadores en base al tamaño mediante técnicas de electroforesis estándares, incluso cuando se delecionan debido a la inestabilidad de microsatélite en el ADN tumoral.
Los cebadores que dan productos de amplificación de un tamaño claramente distinto para NR21, NR24 y NR27 son a modo de ejemplo:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
4
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
5
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
6
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores anteriormente indicados dan productos de amplificación de 131, 109 y 87 pb para NR21, NR24 y NR27 respectivamente.
Ventajosamente un kit de la invención comprende por lo menos:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21;
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24;
-
un par de cebadores seleccionados de entre un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 y un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una forma de realización preferente dicho kit comprende adicionalmente por lo menos un par de cebadores adecuados para la amplificación de por lo menos un locus del microsatélite diferente de NR21, NR22, NR24 y NR27. Preferentemente, dicho locus del microsatélite es un locus de repetición mononucleótido. Más preferentemente este locus de repetición mononucleótido se selecciona de entre BAT-25 y BAT-26.
Los cebadores que permiten la amplificación de BAT-26 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AC0799775, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 10.
Los cebadores que permiten la amplificación de BAT-25 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AC092545, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 11.
A modo de ejemplo, un kit de la invención puede comprender:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25, que consiste en los siguientes oligonucleótidos:
7
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26, que consiste en los siguientes oligonucleótidos:
8
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores anteriormente indicados amplifican un fragmento de 121 pb para BAT-26, y 124 pb para BAT-25.
Pueden utilizarse en concreto en un ensayo de PCR múltiple utilizando tinciones fluorescentes diferentes, por ejemplo en combinación con los cebadores NR21 SEQ ID Nº: 4 y 5, los cebadores NR22 SEQ ID Nº: 6 y 7, y los cebadores NR24 SEQ ID Nº: 8 y 9.
Si se prefiere obtener productos de amplificación de tamaño claramente distinto para BAT-25 y BAT-26, se pueden utilizar por ejemplo:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25 que consisten en los siguientes oligonucleótidos:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26 que consisten en los siguientes oligonucleótidos:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores anteriormente indicados dan respectivamente unos productos de amplificación de 153 y 183 pb para BAT-25 y BAT-26.
Pueden utilizarse ventajosamente en combinación con cebadores NR21 (SEQ ID Nº: 17 y 18) y/o cebadores NR24 (SEQ ID Nº: 19 y 9) y/o cebadores NR27 (SEQ ID Nº: 20 y 21), permitiendo una clara separación de los cinco marcadores en base al tamaño.
Opcionalmente, los kits de la invención pueden comprender adicionalmente unos materiales y reactivos apropiados útiles para llevar a cabo la amplificación del ADN.
El método, reactivos y kits de la invención pueden utilizarse en las mismas aplicaciones que en los métodos de evaluación de inestabilidad de microsatélite de la técnica anterior. Esto incluye principalmente el diagnóstico del fenotipo MSI de tumores, en concreto de tumores del tracto gastrointestinal, y más específicamente tumores gástricos o colorrectales, o tumores del endometrio. Los tumores con inestabilidad en tres o más de los loci BAT-25, BAT-26, NR21, NRE22 (ó NR27), ó NR24 se definen como MSI-H.
El método de la invención tiene la ventaja sobre los métodos de la técnica anterior de permitir establecer el estado MSI sin ambigüedad en concreto en el caso de tumores del tracto gastrointestinal, sin necesitar un análisis simultáneo del ADN germinal correspondiente de cada paciente.
Proponemos que el uso concurrente de estos marcadores mononucleótidos en un único sistema de PCR pentaplex permita una evaluación precisa del estado MSI del tumor con una sensibilidad del 100%, una especificidad del 100%. Este ensayo es más sencillo de utilizar que aquellos que implican marcadores dinucleótidos, y es más específico que utilizar BAT-25 y BAT-26 solos. Este ensayo podría utilizarse rutinariamente en el hospital para proporcionar información sobre prognosis, como un posible indicador de respuesta a terapias adyuvantes, y para la detección de nuevos miembros de la familia HNPCC.
La invención se ilustrará adicionalmente mediante la descripción adicional que sigue, que se refiere a un ejemplo de uso de los marcadores mononucleótidos de la invención en un análisis de PCR múltiple. Sin embargo debe entenderse que este ejemplo se da sólo a modo de ilustración de la invención y no constituye de ninguna manera una limitación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Material y Métodos Repeticiones de Mononucleótidos y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple
Se identificaron tres nuevas repeticiones poli(T) y una nueva repetición poli(A) respectivamente en las regiones no traducidas 3' ó 5' de los genes SLC7A8(NR21, 21T), de la proteína B5 precursora transmembrana (NR22, 22T), dedo de cinc-2 (NR24, 24T), y de la proteína-1 inhibidora de la apoptosis (NR27, 27A). Los detalles que incluyen las secuencias cebadoras para estas repeticiones y BAT-25 y BAT-26 se muestran en la Tabla I que a continuación sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
11
Se diseñaron cebadores para permitir que se resolvieran diferentes tamaños de productos de PCR en geles de desnaturalización al 5% en un secuenciador de ADN automático ABI PRISM 377. Se utilizó el software GENESCAN (GENOTYPER 2.1) para calcular el tamaño, el peso y el área de cada producto de PCR fluorescente
Se utilizaron los siguientes cebadores en las experimentaciones descritas a continuación:
-
cebadores BAT 26: SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 15;
-
cebadores BAT 25: SEQ ID Nº: 12 y SEQ ID Nº: 13;
-
cebadores NR21: SEQ ID Nº: 4 y SEQ ID Nº: 5;
-
cebadores NR22: SEQ ID Nº: 6 y SEQ ID Nº: 7;
-
cebadores NR24: SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9.
Se marcó un cebador en cada par con uno de los marcadores fluorescentes FAM, HEX ó NED (PE APPLIED BIOSYSTEMS). Se amplificaron las cinco repeticiones mononucleótido en un PCR múltiple que contenía 20 \muM de cada cebador, 20o \muM de dNTP, 1,5 mM de MgCl_{2} y 0,75 unidades de ADN polimerasa Taq. El PCR se llevó a cabo utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 seg, templado a 55ºC durante 30 seg y extensión a 72ºC durante 30 seg, seguido de una etapa de extensión a 72ºC durante 7 min.
Muestras de ADN
Se obtuvo ADN germinal de 128 individuos caucásicos en el Centre d'Etudes du Polymophisme Humain (CEPH) en París y de 56 individuos descendientes de africanos.
Previamente se habían sometido a ensayo un total de 124 tumores de colon, 50 gástricos, 20 endometriales y 16 líneas celulares de colon para MSI utilizando diversos marcadores dinucleótido y marcadores mononucleótido BAT-25 y BAT-26 (147 casos) ó BAT26 y BAT25 solos (63 casos) (HOANG et. al. Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997; SERUCA et. al., Int. J. Cancer, 64, 32-36, 1.995; TIBELETTI et. al., Gynecol. Oncol., 73(2), 247-252, 1.999). De éstos se consideró que un total de 81 tumores de cáncer primarios, 42 cánceres gástricos primarios, 20 tumores endometriales primarios y 5 líneas celulares tumorales de colon eran MSI-H en base a las deleciones en las repeticiones anteriores.
Resultados PCR Múltiple Fluorescente
Se co-amplificaron los cinco marcadores mononucleótidos BAT-25, BAT-26, NR21, NR22 y NR24 en una sola mezcla PCR múltiple utilizando las condiciones de PCR descritas anteriormente, y se analizó el tamaño en un secuenciador de ADN automático. En estas condiciones, se observaron bandas no específicas dentro del intervalo de tamaños de 100-142 pb, permitiendo así una identificación precisa de los cinco marcadores.
La Figura 1 muestra unos perfiles alélicos típicos de (a), BAT25, BAT26, NR21, NR22 y NR24 en ADN de la línea germinal o de tumores MSS, (b) un tumor primario MSI-H que mostraba tanto alelos de tamaño normal como delecionados, y (c) una línea celular MSI-H que muestra deleciones homocigóticas.
La Figura 1a muestra un ejemplo de los picos fluorescentes observados para cada marcador, en este caso representando el tamaño de alelo más común encontrado en el ADN germinal.
El tamaño de los productos de PCR y las etiquetas fluorescentes correspondientes se eligieron para permitir el análisis simultáneo de los alelos de tamaño normal con los alelos de menor tamaño que contenían deleciones vistas por lo general en tumores MSI-H (Fig. 1b). Además de los alelos más pequeños la mayoría de los tumores primarios MSI-H también mostraban unos alelos de tamaño normal que presumiblemente se originan de células no cancerosas conta-
minantes. Estas se encontraban ausentes en la línea celular MSI-H mutante homocigótica mostrada en la Figura 1c.
Los tamaños alélicos más comunes para BAT25, BAT26, NR21, NR22 y NR24 eran 124, 120, 103, 142 y 132 pb respectivamente, aunque para cada repetición, se observó una ligera variación en la posición de los picos que representaban el tamaño de producto de PCR (Figura 2).
Leyenda de la Figura 2:
12 = BAT-25
\hskip0.1cm
1200 = BAT-26
13 = NR21
100 = NR22
101 = NR24
\vskip1.000000\baselineskip
Para explicar estas variaciones, se consideró que para BAT-25, NR21, NR22 y NR24 los alelos de \geq 3 pb y para BAT-26 los tamaños alélicos de tamaño \geq 4 pb eran alteraciones sómaticas o polimorfismos.
Polimorfismos en el ADN Germinal
Como se muestra en la Tabla IIa que continuación sigue, cada marcador era por lo menos un 95% monomérico en 128 muestras de ADN germinal de caucasianos no emparentados (muestras CEPH).
TABLA IIa
14
Además, 121 individuos (94,5%) de esta población era monomórficos en las cinco repeticiones y los 7 individuos restantes (5,5%) eran monomórficos en 4/5 marcadores. Ninguna muestra de ADN CEPH contenía un polimorfismo en más de 1 de las 5 repeticiones. Los polimorfismos eran más comunes en el ADN germinal africano, teniendo BAT 25 el nivel más alto de polimorfismo en un 21,4%. Aunque curiosamente, de 56 muestras de ADN germinal africano sometidas a ensayo, 37 (66,1%) resultaron monomórficas en las cinco repeticiones, 15 (26,8%) mostraron un polimorfismo en 1/5 marcadores y 4 (7,1%) en 2/5 marcadores. Ninguna de las muestras de ADN germinal fue polimórfica en > 2/5 marcadores. Estos datos también se muestran en la Figura 3.
Identificación de tumores MSI-H
Utilizando los criterios anteriormente indicados la deleción media observada para cada repetición mononucleótido se calculó en tumores de colon y gástricos MSI-H. La sensibilidad, especificidad y deleciones medias de los cinco marcadores en diferentes tipos de ADN se muestran en la Tabla IIb que a continuación sigue:
TABLA IIb
15
16
Para BAT-26, la deleción media fue de casi 12 pb, o aproximadamente dos veces la longitud media de la deleción vista con los otros marcadores. Cada repetición mononucleótido fue delecionada en tumores MSI-H con una sensibilid > 86%. Los cambios alélicos debidos a polimorfismos o a mutación somática resultaron infrecuentes en tumores no MSI, lo que tuvo como resultado un alto grado de especificidad para la detección de MSI por cada uno de estos marcadores, a excepción de BAT-26 cuya especificidad resultó reducida debido a la mala clasificación previa de 6 tumores como se analiza más adelante.
Un total de 104 tumores gástricos y de colon y líneas celulares que se identificaron previamente como MSI-H mostraron datos de amplificación para los cinco marcadores. Los tumores mostraron deleciones en todas las repeticiones mononucleótido (88 tumores) ó en 4/5 repeticiones mononucleótido (9 tumores) (Figura 3). Sólo una muestra mostró deleciones en 3/5 marcadores. En 5 casos, previamente definidos como MSI-H, se encontraron alteraciones de tamaño sólo en Bat-26 ó Bat-25; estas muestras se consideraron mal clasificadas debido a polimorfismos étnicos (4 casos) o acortamiento límite (1 caso). Finalmente, se clasificó previamente una muestra de tumor adicional como MSI-H utilizando repeticiones dinucleótido pero no BAT-26 (HOANG et. al., Cancer Res., 59(1), 300-303, 1.997). Esta muestra era monomórfica para las cinco repeticiones mononucleótido utilizadas en este estudio, lo que sugería que estaba mal clasificada con repeticiones dinucleótido, posiblemente debido al hecho de que el ADN germinal no coincidía con el ADN tumoral. En la tabla II y en la Figura 3, estas 6 muestras se
consideraron MSS.
De 55 tumores gástricos y de colon y líneas celulares clasificadas previamente como MSS y que contenían datos para las 5 repeticiones, 53 (96,4%) resultaron monomórficas en los 5 marcadores. Un tumor resultó monomórfico en 4 marcadores (25%) y 1 tumor resultó monomórfico en 3/5 (2%) repeticiones. Ninguno de los 55 tumores MSS mostró cambios alélicos en 3 o más repeticiones (Figura 3), cumpliendo todavía con los criterios de identificación MSI de 2/5 polimorfismos de repeticiones descritos anteriormente.
Estos resultados se ilustran mediante la Figura 3, que muestra el porcentaje de muestras con cambios en el tamaño alélico en las cinco repeticiones mononucleótido en el ADN germinal caucásico ( \boxempty ), ADN germinal africano ( \ding{110} ), tumores MSS (17), tumores colorrectales MSI-H (18) y tumores gástricos MSI-H (19).
Las tres repeticiones mononucleótido NR21, NR22, y NR24 resultan cuasi monomórficas en el ADN germinal y, similar a BAT-25 y BAT-26, resultan altamente sensibles a la deleción somática en los tumores MSI-H. La distinción de los tumores MSI-H de los MSS resulta ambigua cuando estos tres nuevos marcadores se utilizan conjuntamente con BAT-25 y BAT-26. El PCR múltiple de estos 5 marcadores tiene la ventaja adicional de evitar la necesidad de un análisis simultáneo del ADN germinal correspondiente de cada paciente.
Aunque la naturaleza cuasi monomórfica de las tres repeticiones mononucleótido sigue estando plenamente establecida en poblaciones diferentes, ninguno de los 128 casos de ADN germinal caucásico y 56 africanos presentaron polimorfismos en más de 2 de las repeticiones. Puesto que los 98 tumores MSI-H verdaderos examinados en la presente memoria, con una amplificación exitosa de los 5 marcadores, mostraron deleciones en por lo menos 3 marcadores, la probabilidad de una mala interpretación de un resultado MSI debido a polimorfismos en 3 o más de los 5 marcadores resulta estadísticamente insignificante. Por tanto cuando se analizaron conjuntamente los resultados de las cinco repeticiones, el estado MSI de esta serie completa de 159 tumores se determinó sin ambigüedad con una especificidad y una sensibilidad del 100%. Además, esto se logró sin la necesidad de analizar el ADN germinal
correspondiente.
\newpage
La Tabla 3 que a continuación sigue indica tumores donde el polimorfismo o la deleción límite en BAT-26 ó BAT-25 habría clasificado mal el estado MSI del tumor correspondiente. En todos los casos, el uso del panel múltiple permitió clasificar sin ambigüedad el tumor.
TABLA III Tumores MSI-H reclasificados como MSS con el PCR pentaplex
20
En 31 muestras adicionales de ADN de tumores gástrico y de colon, solo cuatro de los cinco marcadores se amplificaron correctamente. Esto de debió probablemente a la calidad del ADN extraído de los tejidos embebidos en parafina y fijados en formalina. Veinticuatro de estos casos mostraron 4/4 ó 3/4 loci inestables y se identificaron correctamente como MSI-H, los 7 casos restantes que mostraban 0/4 ó 1/4 loci inestables se identificaron correctamente como MSS (resultados no mostrados, pero incluidos en la Tabla II). Por lo tanto, la amplificación incompleta de las cinco repeticiones podría todavía utilizarse de manera eficaz para identificar el estado MSI del ADN difícil.
Hemos observado anteriormente que los tumores MSI-H endometriales muestran unas diferencias de inestabilidad cuantitativas y cualitativas significativas comparado con los tumores MSI-H gastrointestinales (DUVAL et. al., Cancer Res., 62, 1609-1612, 2.002). En el presente estudio, también se sometieron a ensayo 20 tumores endometriales que se sabía que eran MSI-H con el mismo ensayo pentaplex fluorescente. Estos tumores mostraron unas longitudes medias significativamente más cortas en los cinco marcadores de repeticiones mononucleótido comparado con los tumores gastrointestinales MSI-H (Tabla II). Utilizando los criterios de detección MSI establecidos con este panel microsatélite, 17/20 tumores endometriales fueron identificados como MSI-H y 1 tumor fue identificado como MSS (datos no mostrados). No fue posible identificar de manera concluyente el estado MSI de los 2 tumores restantes debido a unos cambios alélicos muy pequeños observados en los cinco marcadores.
Por tanto, resultó posible identificar de manera eficaz el estado MSI de los 190 tumores gástricos y de colon y las líneas celulares sometidas a ensayo en este experimento, que incluían seis muestras que fueron anteriormente mal clasificadas. Debido al menor tamaño de los cambios alélicos encontrados en los tumores endometriales MSI-H, recomendamos el análisis continuado de ADN germinal coincidente para el cribado MSI rutinario de este tipo de cáncer.
La evidencia que se acumula sugiere que el estado MSI define un subconjunto de cánceres colorrectales con unas propiedades clínicas y biológicas distintivas, lo que enfatiza la importancia de marcadores para la detección simples y precisos. Este conjunto de cinco marcadores mononucleótido, determina el estado MSI de tumores con mayor sensibilidad y especificidad que BAT-25 y BAT-26 solos, y es técnicamente más simple de utilizar que el panel recomendado en la reunión de consenso de Bethesda.
<110> INSERM
\hskip1cm
HAMELIN, Richard 
\hskip1cm
SURAWEERA, Nirosha 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MARCADORES MICROSATÉLITES DE REPETICIONES MONONUCLEÓTIDO PARA DETECTAR LA INESTABILIDAD DE LOS MICROSATÉLITES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPbv598-61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 02 290 483.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-02-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentín versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
23 
\hskip1cm
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taaatgtatg tctcccctgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcctactc cgcattcaca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaggcttgtc aaggacataa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattcggatg ccatccagtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccattgctga attttacctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attgtgccat tgcattccaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
25 
\hskip1cm
250 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgcctccaa gaatgtaagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctgcatttt aactatggct c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgactacttt tgacttcagc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaccattcaa catttttaac cc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
27 
\hskip1cm
270 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtcgctgg cacagttcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggtcactc gcgtttacaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgaatttt acctcctgac 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaccatgctt gcaaaccact 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgataatact agcaatgacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taccaggtgg caaagggca 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcggtaat caagttttta g 
\hfill
21

Claims (16)

1. Método para evaluar la inestabilidad de los microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación de un locus del microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393).
2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la amplificación de un segundo locus del microsatélite denominado NR24, definido como una repetición 24T situada en la región no traducida 3' del gen dedo de cinc-2 (secuencia de ADNc GenBank X60152), y la amplificación de un tercer locus del microsatélite seleccionado de entre:
-
el locus del microsatélite denominado NR22, definido como una repetición 22T situada en la región no traducida 3' del gen de la proteína B5 precursora transmembrana putativa (secuencia de ADNc GenBank L38961);
-
el locus del microsatélite denominado NR27, definido como una repetición 27A situada en la región no traducida 5' del gen de la proteína-1 inhibidora de la apoptosis (secuencia de ADNc GenBank AF070674);
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende adicionalmente la amplificación de por lo menos un locus de repetición mononucleótido seleccionado entre BAT-25 y BAT-26.
4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la amplificación de los cuatro loci del microsatélite BAT-25, BAT-26, NR21, NR24, y la amplificación de un quinto locus del microsatélite seleccionado de entre NR22 y NR27.
5. Uso de un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus NR21 del microsatélite, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8, para evaluar in vitro la inestabilidad de microsatélite asociada con un tumor.
6. Uso de la reivindicación 5 en el que dicho par de cebadores se selecciona de entre:
-
un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 4 y SEQ ID Nº: 5;
-
un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 17 y SEQ ID Nº: 18.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Kit para el análisis de la inestabilidad de microsatélite, caracterizado porque comprende por lo menos un par de cebadores como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, y un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24.
8. Kit según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende adicionalmente un par de cebadores seleccionados de entre:
-
un par de cebadores adecuados, para la amplificación de NR22;
-
un par de cebadores adecuados, para la amplificación de NR27.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque comprende adicionalmente por lo menos un par de cebadores seleccionados de entre:
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus del microsatélite BAT-25;
-
un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus del microsatélite BAT-26.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 9, caracterizado porque el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9.
11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque:
-
el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 6 y SEQ ID Nº: 7;
-
el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 20 y SEQ ID Nº: 21.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque:
-
el par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25 se selecciona de entre un par de cebadores que consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 12 y SEQ ID Nº: 13, y un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 22 y SEQ ID Nº: 13;
-
el par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26 se selecciona de entre un par de cebadores que consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 15, y un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 23 y SEQ ID Nº: 15.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Método para el diagnóstico del fenotipo MSI-H de un tumor, en el que dicho método comprende evaluar la inestabilidad de microsatélite de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
14. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor del tracto gastrointestinal.
15. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor gástrico o colorrectal.
16. Método según la reivindicación 13 en el que dicho tumor es un tumor del endometrio.
ES03724916T 2002-02-28 2003-02-26 Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites. Expired - Lifetime ES2344636T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02290483A EP1340819A1 (en) 2002-02-28 2002-02-28 Microsatellite markers
EP02290483 2002-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2344636T3 true ES2344636T3 (es) 2010-09-02

Family

ID=27675769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03724916T Expired - Lifetime ES2344636T3 (es) 2002-02-28 2003-02-26 Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites.

Country Status (9)

Country Link
US (2) US7521180B2 (es)
EP (2) EP1340819A1 (es)
JP (1) JP4436685B2 (es)
AT (1) ATE464396T1 (es)
AU (1) AU2003227532A1 (es)
CA (1) CA2476892C (es)
DE (1) DE60332096D1 (es)
ES (1) ES2344636T3 (es)
WO (1) WO2003072822A2 (es)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1340819A1 (en) 2002-02-28 2003-09-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Microsatellite markers
DE602004024540D1 (de) * 2004-10-19 2010-01-21 Mtm Lab Ag Zusammensetzungen und Methoden zur Bestimmung des
EP3241832A1 (en) 2008-08-06 2017-11-08 Medivation Technologies, Inc. Dihydropyridophthalazinone inhibitors of poly(adp-ribose)polymerase (parp)
EP2218794A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-18 Alphagenics International SA Detection of instability in regions of genomic DNA containing simple tandem repeats
JP5883397B2 (ja) 2010-02-03 2016-03-15 ビオマリン プハルマセウトイカル インコーポレイテッド Ｐｔｅｎ欠損に関連した疾患の治療におけるポリ（ａｄｐリボース）ポリメラーゼ（ｐａｒｐ）のジヒドロピリドフタラジノン阻害剤の使用
DK2533640T3 (en) 2010-02-08 2017-01-23 Medivation Technologies Inc METHODS OF SYNTHESIS OF DIHYDROPYRIDOPHTHALAZINE DERIVATIVES
PL2630146T3 (pl) 2010-10-21 2020-11-02 Medivation Technologies Llc Krystaliczna sól tosylanowa (8S,9R)-5-fluoro-8-(4-fluorofenylo)-9-(1-metylo-1H-1,2,4-triazol-5-ilo)-8,9-dihydro-2H-pirydo[4,3,2-de]ftalazyno-3(7H)-onu
WO2012166151A1 (en) * 2011-06-03 2012-12-06 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of dihydropyridophthalazinone inhibitors of poly (adp-ribose) polymerase (parp) in the treatment of myelodysplastic syndrome (mds) and acute myeloid leukaemia (aml)
WO2014099979A2 (en) * 2012-12-17 2014-06-26 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Methods and compositions for identifying global microsatellite instability and for characterizing informative microsatellite loci
CN104087683B (zh) * 2014-08-01 2016-06-15 上海赛安生物医药科技有限公司 微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒
CA2966660A1 (en) 2014-11-13 2016-05-19 The Johns Hopkins University Checkpoint blockade and microsatellite instability
CN105256057A (zh) * 2015-11-19 2016-01-20 湖南宏雅基因技术有限公司 基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒
EP3464373B1 (en) * 2016-06-03 2021-10-27 Bristol-Myers Squibb Company Use of anti-pd-1 antibody in the treatment of patients with colorectal cancer
CN106755501B (zh) * 2017-01-25 2020-11-17 广州燃石医学检验所有限公司 一种基于二代测序的同时检测微卫星位点稳定性和基因组变化的方法
EP3601615A4 (en) * 2017-03-20 2020-12-09 Caris MPI, Inc. GENOMIC STABILITY PROFILING
US11104938B2 (en) 2017-06-20 2021-08-31 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital amplification assays for genetic instability
CN109593847B (zh) * 2017-09-29 2023-04-11 中山大学附属第六医院 检测微卫星nr24位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
US10699802B2 (en) 2017-10-09 2020-06-30 Strata Oncology, Inc. Microsatellite instability characterization
EP3739064A1 (en) 2019-05-15 2020-11-18 Biotype GmbH Comparative analysis of microsatellites by capillary electrophoresis (ce) dna profiles
KR102506176B1 (ko) * 2020-10-28 2023-03-03 사회복지법인 삼성생명공익재단 현미부수체 불안정성 진단용 마커 조성물 및 프라이머 세트
WO2023039430A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Amgen Inc. Sotorasib and an egfr antibody for treating cancer comprising a kras g12c mutation
WO2024015360A1 (en) 2022-07-11 2024-01-18 Amgen Inc. Methods of treating cancer
DE102023124346A1 (de) 2023-09-09 2025-03-13 Biotype Gmbh Verfahren zur Detektion des Endometriumkarzinoms Subtyp CN hoch

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE19712332A1 (de) * 1997-03-25 1998-10-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis von Mikrosatelliten-Instabilität zur Tumordiagnostik
EP1340819A1 (en) 2002-02-28 2003-09-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Microsatellite markers

Also Published As

Publication number Publication date
EP1478781B1 (en) 2010-04-14
CA2476892C (en) 2012-05-29
US20060068385A1 (en) 2006-03-30
ATE464396T1 (de) 2010-04-15
CA2476892A1 (en) 2003-09-04
WO2003072822A2 (en) 2003-09-04
EP1478781A2 (en) 2004-11-24
US7521180B2 (en) 2009-04-21
AU2003227532A1 (en) 2003-09-09
DE60332096D1 (de) 2010-05-27
US20090317815A1 (en) 2009-12-24
WO2003072822A3 (en) 2004-03-18
JP2005518798A (ja) 2005-06-30
JP4436685B2 (ja) 2010-03-24
US7951564B2 (en) 2011-05-31
EP1340819A1 (en) 2003-09-03
WO2003072822A9 (en) 2003-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2344636T3 (es) Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites.
Suraweera et al. Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR
JP3612080B2 (ja) メチル化特異的検出
US8785614B2 (en) Aberrantly methylated genes in pancreatic cancer
JP5091163B2 (ja) 癌またはその素因の早期検出のための方法およびキット
US20140206855A1 (en) Methods and compositions for detecting cancers associated with methylation of hmlh1 promoter dna
EP2218794A1 (en) Detection of instability in regions of genomic DNA containing simple tandem repeats
JP2010517582A (ja) 結腸癌の早期検出および予後診断の方法
TW201300777A (zh) 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
US7153653B2 (en) Differentially methylated sequences in pancreatic cancer
Aveyard et al. Measurement of relative copy number of CDKN2A/ARF and CDKN2B in bladder cancer by real-time quantitative PCR and multiplex ligation-dependent probe amplification
KR100617649B1 (ko) 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물 및 그 용도
JP2022528182A (ja) 神経膠腫の診断用または予後予測用の組成物、及びそれに係わる情報を提供する方法
JPWO2005021743A1 (ja) 核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法
US7611841B2 (en) Method for detecting methylation of promoter using restriction enzyme and DNA chip
Cho et al. Genomic aberrations in renal cell carcinomas detected by restriction landmark genomic scanning
US20150110897A1 (en) Sperm Protein as a Detection Biomarker of Early Stage Ovarian Cancer
US7771942B2 (en) Genetic marker for prostate cancer
Sugimura et al. Methods for genetic testing I: Assessing mutations in cancers