ES2344636T3 - Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites. - Google Patents
Marcadores microsatelites de repeticiones mononucleotido para detectar la inestabilidad de los microsatelites. Download PDFInfo
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Abstract
Método para evaluar la inestabilidad de los microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los productos de amplificación del ADN, caracterizado porque dicho método comprende la amplificación de un locus del microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T situada en la región no traducida 5'' del gen SLC7A8 (secuencia de ADNc GenBank XM_033393).
Description
Marcadores microsatélites de repeticiones
mononucleótido para detectar la inestabilidad de los
microsatélites.
La invención se refiere a nuevos marcadores
microsatélites y su uso para la detección de la inestabilidad de
los microsatélites (MSI) asociada con algunos tumores.
Los microsatélites son motivos de ADN cortos
(1-10 pares de bases), que se dan como repeticiones
en tándem en numerosos loci por todo el genoma.
El fenotipo de inestabilidad de microsatélite
(MSI) se define como la presencia en ADN tumoral de microsatélites
de tamaño alternativo que no se ven en el ADN germinal
correspondiente (AALTONEN et. al., Science, 260(5109),
812-816, 1.993; IONOV et. al., Nature,
363(6429), 558-561, 1.993; THIBODEAU et.
al., Science, 260(5109), 816-819, 1.993;
IACOPETTA et. al., Hum. Mutat., 12(5),
355-360, 1.998).
El fenotipo MSI es una característica del
síndrome de cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC),
en el que puede detectarse en más del 90% de todos los tumores HNPCC
(LIU et. al., Nature Med., 2, 169-174,
1.996); también se da en aproximadamente el 15% de los tumores
gástricos y de colon esporádicos. También se ha detectado en otros
tumores, como los carcinomas pancreáticos (HAN et. al.,
Cancer Res., 53, 5087-5089, 1.993), carcinomas de
próstata (GAO et. al., Oncogene, 9,
2999-3003, 1.994), carcinomas del endometrio
(RISINGER et. al., Cancer Res., 53,
5100-5103, 1.993; PELTOMAKI et. al., Cancer
Res., 53, 5853-5855, 1.993).
La MSI refleja un defecto de la reparación de
apareamientos incorrectos (MMR) subyacentes que no reconoce los
errores introducidos durante la replicación de las secuencias
microsatélite. En el síndrome del cáncer familiar HNPCC, el
fenotipo MSI es causado por mutaciones germinales en los genes
hMSH2, hMLH1 de reparación de apareamientos
incorrectos (MMR) y menos frecuentemente en hPMS1,
hPMS2 y hPMS6 (KINZLER et. al., Cell, 87,
159-170, 1.996). En los cánceres esporádicos a
menudo suele ser causado por metilación del promotor hMLH1
que lleva al silenciamiento transcripcional de este gen (HERMAN
et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(12),
6870-6875, 1.998).
Los tumores gástricos y de colon MSI tienen unos
perfiles clinicopatológicos y moleculares distintivos y a menudo
suelen asociarse con una prognosis favorable ((LOTHE et. al.,
Cancer Res., 53, 5849-5852, 1.993; KIM et.
al., Am. J. Pathol., 145, 148-156, 1.994;
OLIVEIRA et. al., Am. J. Pathol., 153,
1211-1219, 1.998). También existe evidencia que
sugiere que los pacientes de cáncer colorrectal con tumores MSI
muestran un buen beneficio de supervivencia de la quimioterapia
basada en 5FU (ELSALEH et. al., The Lancet, 355,
1745-1750, 2.000; LIANG et. al., Int. J.
Cancer, 101, 519-525, 2.002) y por tanto la MSI
podría resultar un marcador predictivo molecular útil para
responder a este tipo de terapia adyuvante. El análisis de rutina
del estado MSI también tiene una aplicación clínica para ayudar en
el diagnóstico de casos de HNPCC sospechosos (AALTONEN et.
al., N. Eng. J. Med., 338, 1481-1487, 1.998). De
hecho, los tumores de pacientes HNPCC carecen de las
características fenotípicas que los distinguen fácilmente de tumores
esporádicos y por tanto el diagnóstico de esta enfermedad se basó
históricamente en la historia familiar del cáncer utilizando por
ejemplo el criterio de Ámsterdam (VASEN et. al., Dis. Colon
Rectum, 34, 424-425, 1.991; VASEN et. al.,
Gastroenterology, 115, 1453-1456, 1.999). Tales
criterios resultan sin embargo demasiado restrictivos e identifican
sólo una fracción de familias HNPCC de manera que no se conoce la
incidencia verdadera de esta enfermedad y las estimaciones varían
desde el 0,5 hasta el 13%. Dado que los portadores familiares de
defectos MMR tienen un riesgo mayor del 80% de desarrollar cáncer,
resulta importante idear maneras eficaces y rentables de detectar
esta condición. Con este fin, se están desarrollando en la
actualidad métodos de laboratorio basados en moléculas que pueden
ayudar a establecer el diagnóstico de HNPCC. Se proponen en general
dos métodos: genotipificación de microsatélites e
inmunohistoquímica de las proteínas de reparación de apareamientos
incorrectos principales. El uso de uno u otro, o ambos métodos
todavía es una cuestión de debate, basada en su coste, especificidad
y eficacia relativos (LINDOR et. al., J. Clin. Oncol., 20,
1043-1048, 2.002; WAHLBERG et. al., Cancer
Res., 62, 3485-3492, 2.002; TERDIMAN et.
al., Gastroenterology, 120, 21-30, 2.001;
LOUKOLA et. al., Cancer Res., 61, 4545-4549,
2.001). Por ahora parece que la genotipificación de microsatélites
tiene una mayor sensibilidad que la IHC, pero es más cara y más
difícil de configurar en laboratorios de rutina. Por tanto resulta
importante desarrollar métodos simples y precisos para determinar
los tumores MSI para las informaciones de
diagnóstico-pronóstico y predisposición.
Los investigadores han estudiado numerosos
microsatélites diferentes con el objetivo de identificar tumores
MSI.
Dependiendo del tipo y número de microsatélites
analizados, se han publicado resultados muy variables de frecuencia
de MSI en tipos de tumores diferentes (PERUCHO, Cancer Res.,
59(1), 249-256, 1.999).
Se ha propuesto el uso de una combinación de
marcadores BAT-25 y BAT-26 para la
detección de MSI (ZHOU et. al., Genes, Chromosomes &
Cancer, 21(2), 101-107, 1.998; HOANG et.
al., Cancer Res., 57(2), 300-303,
1.997).
El BAT-25 y
BAT-26 son repeticiones de mononucleótidos situados
respectivamente en el intrón 16 de c-kit y
el intrón 5 de hMSH2. Estas dos repeticiones son
cuasimonomórficas en las poblaciones caucásicas (HOANG et.
al., Cancer Res., 57(2), 300-303, 1.997;
ZHOU et. al., Oncogene, 15(14),
1713-1718, 1.997). Esta propiedad permite una
clasificación rápida de las variaciones de tamaño alélicas grandes
vistas en el ADN tumoral MSI debidas a una alteración somática. En
la gran mayoría de los tumores, el análisis de
BAT-25 y BAT-26 resulta suficiente
para establecer su estado MSI sin referencia al ADN germinal (ZHOU
et. al., Genes, Chromosomes & Cancer, 21(2),
101-107, 1.998).
Sin embargo, se han identificado los alelos de
BAT-25 y BAT-26 de tamaño
alternativo en 18,4 y 12,6%, respectivamente, de americanos
africanos (PYATT et. al., Am. J. Pathol., 155(2),
349-353, 1.999; SAMOWITZ et. al., Am. J.
Pathol., 154(6), 1637-1641, 1.999). De esta
manera, puede necesitarse el análisis de repeticiones adicionales
para evitar el resultado de falsos positivos ocasionales que surgen
de estos polimorfismos germinales.
Por consiguiente se ha propuesto completar el
análisis de repeticiones de mononucleótidos mediante el análisis
adicional de repeticiones de dinucleótidos tanto en el tumor como en
el ADN germinal.
Por ejemplo, la patente US 6.150.100 propone el
uso de 2 repeticiones de mononucleótidos seleccionados de entre
BAT25, BAT26 y BAT40, asociadas con 2 ó 3 repeticiones de
dinucleótidos seleccionados de entre APC, Mfd15, D2S123, y D18S69,
y opcionalmente con la repetición de pentanucleótidos TP53Alu. Las
combinaciones mencionadas de marcadores microsatélites descritos en
la patente US 6.150.100 son BAT25, BAT26, APC, Mfd15 y D2S123 ó
BAT26, BAT40, APC, Mfd15 y D2S123.
En 1.997 una reunión de consenso internacional
sobre la detección de MSI recomendó un panel de cinco marcadores
para el análisis uniforme del estado MSI (BOLAND et. al.,
Cancer Res., 58(22), 5248-5257, 1.998). Esto
incluía dos repeticiones de mononucleótidos (BAT-25
y BAT-26) y tres repeticiones de dinucleótidos
(D5S346, D2S123 y D17S250). Los tumores con inestabilidad en dos o
más de estos marcadores se definieron como MSI-H.
Los tumores con inestabilidad en un marcador, y sin inestabilidad se
definieron como MSI-L y MSS respectivamente. Los
cánceres MSI-H tienen unas características
clinicopatológicas distintas de los tumores MSI-L y
MSS.
Algunas de las características de las
repeticiones de dinucleótidos hacen su uso como marcadores del
estado MSI un tanto problemático. Las repeticiones de dinucleótidos
en los paneles anteriormente indicados muestran generalmente
inestabilidad en sólo el 60-80% de los tumores
MSI-H (SUTTER et. al., Mol. Cell Probes,
13(2), 157-165, 1.999). Existe alguna
evidencia para sugerir que la pérdida de MMR y la posterior
alteración de las repeticiones de mononucleótidos sucede más
temprano en la ruta de progresión del tumor MSI-H
que la mutación de las repeticiones de dinucleótidos (PERUCHO
et. al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59,
339-348, 1.994). Además, algunas líneas de células
MSI con deficiencia MMR causada por mutación del hMSH6 no
muestran alteración en las repeticiones de dinucleótidos (AKIYAMA
et. al., Cancer Res., 57(18),
3920-3923, 1.997). Por tanto la deficiencia MMR
subyacente que afecta las repeticiones de mononucleótidos y
dinucleótidos puede ser diferente y el análisis de ambas puede
llevar a una mala interpretación del estado MSI de algunos tumores.
En muchos casos el análisis de repeticiones de dinucleótidos no
añade información adicional a los resultados obtenidos mediante el
análisis de repeticiones de mononucleótidos ((DIETMAIER et.
al., Cancer Res., 57(21), 4749-4756,
1.997; LOUKOLA et. al., Cancer Res., 61(11),
4545-4549, 2.001).
Además, a diferencia de las repeticiones de
mononucleótidos como BAT-25 Y
BAT-26, las repeticiones de dinucleótidos son
altamente polimórficas. Por tanto, su uso para la identificación de
MSI en el ADN tumoral siempre requiere el análisis del ADN germinal
correspondiente.
Esto hace que el proceso de cribado de MSI sea
considerablemente más caro y requiera más tiempo, así como la
introducción de errores potenciales debido al mezclado de las
muestras de ADN tumoral y germinal. Además, la interpretación de
las alteraciones de tamaño en estas repeticiones de dinucleótidos
resulta difícil y puede llevar a una mala clasificación (PERUCHO,
Cancer Res., 59(1), 249-256, 1.999).
Finalmente, en muchas situaciones el ADN germinal de pacientes con
cáncer no está disponible fácilmente.
Por todas estas razones, los métodos que
utilizan BAT-25 Y BAT-26 ya sea
solos, o en combinación con repeticiones de dinucleótidos no
resultan totalmente satisfactorios para la determinación precisa del
estado MSI en tumores humanos y existe una necesidad urgente de
mejora.
De esta manera, se necesitan repeticiones de
mononucleótidos cuasi monomórficos múltiples para el diagnóstico
preciso de los tumores MSI.
Los inventores han identificado recientemente
nuevas repeticiones de mononucleótidos que se conservan en el ADN
germinal de sujetos caucásicos y africanos y que, similar a
BAT-25 Y BAT-26, son altamente
sensibles a la deleción somática en los tumores
MSI-H.
Tres de estos nuevos marcadores microsatélites
son repeticiones poli(T) denominadas en lo sucesivo en la
presente memoria NR21, NR22, y NR24.
El marcador NR21 es una repetición 21T
identificada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8 (secuencia
de ADNc GenBank XM_033393).
El marcador NR22 es una repetición 22T
identificada en la región no traducida 3' del gen de la proteína B5
precursora transmembrana putativa (secuencia de ADNc GenBank
L38961).
El marcador NR24 es una repetición 24T
identificada en la región no traducida 3' del gen dedos de
cinc-2 (secuencia de ADNc GenBank X60152).
Un cuarto marcador microsatélite, denominado en
lo sucesivo en la presente memoria NR27, es una repetición 27A
identificada en la región no traducida 5' del gen de la proteína 1
inhibidora de la apoptosis (secuencia de ADNc GenBank
AF070674).
Los marcadores NR21, NR22, NR24 y NR27 resultan
útiles para la evaluación de la inestabilidad de microsatélites en
el diagnóstico de tumores.
La invención proporciona así un método para
evaluar la inestabilidad de microsatélites asociada con un tumor,
mediante amplificación de los loci de los microsatélites en una
muestra biológica de ADN genómico de dicho tumor y la determinación
de los tamaños de los productos de amplificación del ADN,
caracterizado porque dicho método comprende la amplificación
del locus NR21 del microsatélite.
De acuerdo con una forma de realización
preferente de la invención, dicho método comprende la amplificación
de los dos loci NR21 y NR24 del microsatélite, y la amplificación de
un tercer locus del microsatélite seleccionado de entre NR22 y
NR27.
Ventajosamente, dicho método comprende
adicionalmente la amplificación de por lo menos un locus del
microsatélite diferente de NR21, NR22, NR24 y NR27.
Preferentemente, dicho locus del microsatélite es un locus de una
repetición mononucleótido. Más preferentemente este locus de
repetición mononucleótido se selecciona de entre
BAT-25 y BAT-26.
De acuerdo con una forma de realización
concreta, el método de la invención comprende la amplificación de
los cinco loci del microsatélite BAT-25,
BAT-26, NR21, NR22 y NR24.
De acuerdo con otra forma de realización
concreta, el método de la invención comprende la amplificación de
los cinco loci del microsatélite BAT-25,
BAT-26, NR21, NR27 y NR24.
La inestabilidad de microsatélite en cada uno de
estos loci se evalúa mediante comparación del tamaño del producto
de amplificación obtenido del ADN tumoral con el tamaño del producto
de amplificación obtenido del ADN normal (es decir, no tumoral) con
el mismo conjunto de cebadores.
Esta comparación puede llevarse a cabo de una
manera convencional, obteniendo un producto de amplificación del
ADN normal del mismo sujeto con el mismo conjunto de cebadores, y
utilizándolo como referencia.
Sin embargo, la presente invención hace posible,
en la mayoría de los casos, evitar la necesidad de amplificar el
ADN normal del mismo sujeto. En cambio, la comparación puede hacerse
mediante referencia al tamaño medio de los productos de
amplificación obtenidos de los ADNs normales de un pool de sujetos
con el mismo conjunto de cebadores. En estos casos, la
inestabilidad de los microsatélites se asume en el caso del locus
BAT-26 si el tamaño del producto de amplificación
obtenido del ADN tumoral es más corto en más de 3 pb que el tamaño
medio del producto de amplificación obtenido a partir del ADN normal
utilizando el mismo conjunto de cebadores, y en el caso de los loci
BAT-25, NR21, NR22, NR25 y NR27, si el tamaño del
producto de amplificación obtenido a partir del ADN tumoral es más
corto en más de 2 pb que el tamaño medio del producto de
amplificación obtenido a partir del ADN normal utilizando el mismo
conjunto de cebadores.
El ADN genómico tumoral puede obtenerse a partir
de fuentes diferentes que incluyen principalmente biopsias o
tejidos tumorales, o fluidos o secreciones corporales que contienen
células tumorales diseminadas, tejido embebido en parafina.
La invención también proporciona unos reactivos
para llevar a cabo el método de la invención.
En concreto, un objeto de la invención es el uso
de pares de cebadores adecuados para la amplificación del locus
NR21 del microsatélite para la evaluación in vitro de la
inestabilidad de microsatélite asociada con un tumor. La invención
también proporciona unos kits para la evaluación de la inestabilidad
de microsatélite, cebadores de asociación adecuados para la
amplificación del locus NR21 del microsatélite con unos cebadores
adecuados para la amplificación de NR24 y opcionalmente con unos
cebadores adecuados para la amplificación de NR22 y/o NR27.
Los cebadores adecuados pueden derivarse de las
secuencias genómicas que rodean dichos loci del microsatélite.
Por ejemplo:
- -
- los cebadores que permiten la amplificación de NR21 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AL117258, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 1;
- -
- los cebadores que permiten la amplificación de NR22 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AP001132, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 2;
- -
- los cebadores que permiten la amplificación de NR24 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AC092835, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 3;
- -
- los cebadores que permiten la amplificación de NR27 pueden derivarse de la secuencia genómica GenBank AP001167, y preferentemente de la parte de la misma representada por SEQ ID Nº: 16.
\vskip1.000000\baselineskip
A modo de ejemplo:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consisten en los siguientes oligonucleótidos:
Los cebadores indicados anteriormente dan al ser
utilizados en ADN normal, unos productos de amplificación de 104,
143, y 134 pb para NR21, NR22 y NR24 respectivamente.
Pueden marcarse ventajosamente con tinciones
fluorescentes utilizadas en los ensayos de PCR múltiple.
Preferentemente, se utilizarán tinciones fluorescentes diferentes
para los cebadores que den unos productos de amplificación de
tamaño similar (es decir, con tamaños que difieren en menos de
15-20 pb). Esto permite evitar dudas que podrían
resultar de la superposición de los productos de PCR debido a la
deleción media de 5-12 pb para estos marcadores en
los tumores MSI.
Si se prefiere no utilizar tinciones
fluorescentes diferentes, pueden diseñarse cebadores para dar
productos de amplificación de tamaño claramente distinto (es decir
con tamaños que difieran en por lo menos 15 pb y preferentemente en
por lo menos 20 pb entre marcadores diferentes). Esto permite una
separación clara entre los marcadores en base al tamaño mediante
técnicas de electroforesis estándares, incluso cuando se delecionan
debido a la inestabilidad de microsatélite en el ADN tumoral.
Los cebadores que dan productos de amplificación
de un tamaño claramente distinto para NR21, NR24 y NR27 son a modo
de ejemplo:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27 consiste en los siguientes oligonucleótidos:
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores
anteriormente indicados dan productos de amplificación de 131, 109
y 87 pb para NR21, NR24 y NR27 respectivamente.
Ventajosamente un kit de la invención comprende
por lo menos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR21;
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR24;
- -
- un par de cebadores seleccionados de entre un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 y un par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una forma de realización
preferente dicho kit comprende adicionalmente por lo menos un par
de cebadores adecuados para la amplificación de por lo menos un
locus del microsatélite diferente de NR21, NR22, NR24 y NR27.
Preferentemente, dicho locus del microsatélite es un locus de
repetición mononucleótido. Más preferentemente este locus de
repetición mononucleótido se selecciona de entre
BAT-25 y BAT-26.
Los cebadores que permiten la amplificación de
BAT-26 pueden derivarse de la secuencia genómica
GenBank AC0799775, y preferentemente de la parte de la misma
representada por SEQ ID Nº: 10.
Los cebadores que permiten la amplificación de
BAT-25 pueden derivarse de la secuencia genómica
GenBank AC092545, y preferentemente de la parte de la misma
representada por SEQ ID Nº: 11.
A modo de ejemplo, un kit de la invención puede
comprender:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25, que consiste en los siguientes oligonucleótidos:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26, que consiste en los siguientes oligonucleótidos:
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores
anteriormente indicados amplifican un fragmento de 121 pb para
BAT-26, y 124 pb para BAT-25.
Pueden utilizarse en concreto en un ensayo de
PCR múltiple utilizando tinciones fluorescentes diferentes, por
ejemplo en combinación con los cebadores NR21 SEQ ID Nº: 4 y 5, los
cebadores NR22 SEQ ID Nº: 6 y 7, y los cebadores NR24 SEQ ID Nº: 8
y 9.
Si se prefiere obtener productos de
amplificación de tamaño claramente distinto para
BAT-25 y BAT-26, se pueden utilizar
por ejemplo:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25 que consisten en los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26 que consisten en los siguientes oligonucleótidos:
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se utilizan en ADN normal, los cebadores
anteriormente indicados dan respectivamente unos productos de
amplificación de 153 y 183 pb para BAT-25 y
BAT-26.
Pueden utilizarse ventajosamente en combinación
con cebadores NR21 (SEQ ID Nº: 17 y 18) y/o cebadores NR24 (SEQ ID
Nº: 19 y 9) y/o cebadores NR27 (SEQ ID Nº: 20 y 21), permitiendo una
clara separación de los cinco marcadores en base al tamaño.
Opcionalmente, los kits de la invención pueden
comprender adicionalmente unos materiales y reactivos apropiados
útiles para llevar a cabo la amplificación del ADN.
El método, reactivos y kits de la invención
pueden utilizarse en las mismas aplicaciones que en los métodos de
evaluación de inestabilidad de microsatélite de la técnica anterior.
Esto incluye principalmente el diagnóstico del fenotipo MSI de
tumores, en concreto de tumores del tracto gastrointestinal, y más
específicamente tumores gástricos o colorrectales, o tumores del
endometrio. Los tumores con inestabilidad en tres o más de los loci
BAT-25, BAT-26, NR21, NRE22 (ó
NR27), ó NR24 se definen como MSI-H.
El método de la invención tiene la ventaja sobre
los métodos de la técnica anterior de permitir establecer el estado
MSI sin ambigüedad en concreto en el caso de tumores del tracto
gastrointestinal, sin necesitar un análisis simultáneo del ADN
germinal correspondiente de cada paciente.
Proponemos que el uso concurrente de estos
marcadores mononucleótidos en un único sistema de PCR pentaplex
permita una evaluación precisa del estado MSI del tumor con una
sensibilidad del 100%, una especificidad del 100%. Este ensayo es
más sencillo de utilizar que aquellos que implican marcadores
dinucleótidos, y es más específico que utilizar
BAT-25 y BAT-26 solos. Este ensayo
podría utilizarse rutinariamente en el hospital para proporcionar
información sobre prognosis, como un posible indicador de respuesta
a terapias adyuvantes, y para la detección de nuevos miembros de la
familia HNPCC.
La invención se ilustrará adicionalmente
mediante la descripción adicional que sigue, que se refiere a un
ejemplo de uso de los marcadores mononucleótidos de la invención en
un análisis de PCR múltiple. Sin embargo debe entenderse que este
ejemplo se da sólo a modo de ilustración de la invención y no
constituye de ninguna manera una limitación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
Se identificaron tres nuevas repeticiones
poli(T) y una nueva repetición poli(A) respectivamente
en las regiones no traducidas 3' ó 5' de los genes
SLC7A8(NR21, 21T), de la proteína B5 precursora transmembrana
(NR22, 22T), dedo de cinc-2 (NR24, 24T), y de la
proteína-1 inhibidora de la apoptosis (NR27, 27A).
Los detalles que incluyen las secuencias cebadoras para estas
repeticiones y BAT-25 y BAT-26 se
muestran en la Tabla I que a continuación sigue.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se diseñaron cebadores para permitir que se
resolvieran diferentes tamaños de productos de PCR en geles de
desnaturalización al 5% en un secuenciador de ADN automático ABI
PRISM 377. Se utilizó el software GENESCAN (GENOTYPER 2.1) para
calcular el tamaño, el peso y el área de cada producto de PCR
fluorescente
Se utilizaron los siguientes cebadores en las
experimentaciones descritas a continuación:
- -
- cebadores BAT 26: SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 15;
- -
- cebadores BAT 25: SEQ ID Nº: 12 y SEQ ID Nº: 13;
- -
- cebadores NR21: SEQ ID Nº: 4 y SEQ ID Nº: 5;
- -
- cebadores NR22: SEQ ID Nº: 6 y SEQ ID Nº: 7;
- -
- cebadores NR24: SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9.
Se marcó un cebador en cada par con uno de los
marcadores fluorescentes FAM, HEX ó NED (PE APPLIED BIOSYSTEMS). Se
amplificaron las cinco repeticiones mononucleótido en un PCR
múltiple que contenía 20 \muM de cada cebador, 20o \muM de
dNTP, 1,5 mM de MgCl_{2} y 0,75 unidades de ADN polimerasa
Taq. El PCR se llevó a cabo utilizando las siguientes
condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 5 min, 35 ciclos de
desnaturalización a 94ºC durante 30 seg, templado a 55ºC durante 30
seg y extensión a 72ºC durante 30 seg, seguido de una etapa de
extensión a 72ºC durante 7 min.
Se obtuvo ADN germinal de 128 individuos
caucásicos en el Centre d'Etudes du Polymophisme Humain (CEPH) en
París y de 56 individuos descendientes de africanos.
Previamente se habían sometido a ensayo un total
de 124 tumores de colon, 50 gástricos, 20 endometriales y 16 líneas
celulares de colon para MSI utilizando diversos marcadores
dinucleótido y marcadores mononucleótido BAT-25 y
BAT-26 (147 casos) ó BAT26 y BAT25 solos (63 casos)
(HOANG et. al. Cancer Res., 57(2),
300-303, 1.997; SERUCA et. al., Int. J.
Cancer, 64, 32-36, 1.995; TIBELETTI et. al.,
Gynecol. Oncol., 73(2), 247-252, 1.999). De
éstos se consideró que un total de 81 tumores de cáncer primarios,
42 cánceres gástricos primarios, 20 tumores endometriales primarios
y 5 líneas celulares tumorales de colon eran MSI-H
en base a las deleciones en las repeticiones anteriores.
Se co-amplificaron los cinco
marcadores mononucleótidos BAT-25,
BAT-26, NR21, NR22 y NR24 en una sola mezcla PCR
múltiple utilizando las condiciones de PCR descritas anteriormente,
y se analizó el tamaño en un secuenciador de ADN automático. En
estas condiciones, se observaron bandas no específicas dentro del
intervalo de tamaños de 100-142 pb, permitiendo así
una identificación precisa de los cinco marcadores.
La Figura 1 muestra unos perfiles alélicos
típicos de (a), BAT25, BAT26, NR21, NR22 y NR24 en ADN de la línea
germinal o de tumores MSS, (b) un tumor primario
MSI-H que mostraba tanto alelos de tamaño normal
como delecionados, y (c) una línea celular MSI-H
que muestra deleciones homocigóticas.
La Figura 1a muestra un ejemplo de los picos
fluorescentes observados para cada marcador, en este caso
representando el tamaño de alelo más común encontrado en el ADN
germinal.
El tamaño de los productos de PCR y las
etiquetas fluorescentes correspondientes se eligieron para permitir
el análisis simultáneo de los alelos de tamaño normal con los alelos
de menor tamaño que contenían deleciones vistas por lo general en
tumores MSI-H (Fig. 1b). Además de los alelos más
pequeños la mayoría de los tumores primarios MSI-H
también mostraban unos alelos de tamaño normal que presumiblemente
se originan de células no cancerosas conta-
minantes. Estas se encontraban ausentes en la línea celular MSI-H mutante homocigótica mostrada en la Figura 1c.
minantes. Estas se encontraban ausentes en la línea celular MSI-H mutante homocigótica mostrada en la Figura 1c.
Los tamaños alélicos más comunes para BAT25,
BAT26, NR21, NR22 y NR24 eran 124, 120, 103, 142 y 132 pb
respectivamente, aunque para cada repetición, se observó una ligera
variación en la posición de los picos que representaban el tamaño
de producto de PCR (Figura 2).
Leyenda de la Figura 2:
\hskip0.1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Para explicar estas variaciones, se consideró
que para BAT-25, NR21, NR22 y NR24 los alelos de
\geq 3 pb y para BAT-26 los tamaños alélicos de
tamaño \geq 4 pb eran alteraciones sómaticas o polimorfismos.
Como se muestra en la Tabla IIa que continuación
sigue, cada marcador era por lo menos un 95% monomérico en 128
muestras de ADN germinal de caucasianos no emparentados (muestras
CEPH).
Además, 121 individuos (94,5%) de esta población
era monomórficos en las cinco repeticiones y los 7 individuos
restantes (5,5%) eran monomórficos en 4/5 marcadores. Ninguna
muestra de ADN CEPH contenía un polimorfismo en más de 1 de las 5
repeticiones. Los polimorfismos eran más comunes en el ADN germinal
africano, teniendo BAT 25 el nivel más alto de polimorfismo en un
21,4%. Aunque curiosamente, de 56 muestras de ADN germinal africano
sometidas a ensayo, 37 (66,1%) resultaron monomórficas en las cinco
repeticiones, 15 (26,8%) mostraron un polimorfismo en 1/5
marcadores y 4 (7,1%) en 2/5 marcadores. Ninguna de las muestras de
ADN germinal fue polimórfica en > 2/5 marcadores. Estos datos
también se muestran en la Figura 3.
Utilizando los criterios anteriormente indicados
la deleción media observada para cada repetición mononucleótido se
calculó en tumores de colon y gástricos MSI-H. La
sensibilidad, especificidad y deleciones medias de los cinco
marcadores en diferentes tipos de ADN se muestran en la Tabla IIb
que a continuación sigue:
Para BAT-26, la deleción media
fue de casi 12 pb, o aproximadamente dos veces la longitud media de
la deleción vista con los otros marcadores. Cada repetición
mononucleótido fue delecionada en tumores MSI-H con
una sensibilid > 86%. Los cambios alélicos debidos a
polimorfismos o a mutación somática resultaron infrecuentes en
tumores no MSI, lo que tuvo como resultado un alto grado de
especificidad para la detección de MSI por cada uno de estos
marcadores, a excepción de BAT-26 cuya especificidad
resultó reducida debido a la mala clasificación previa de 6 tumores
como se analiza más adelante.
Un total de 104 tumores gástricos y de colon y
líneas celulares que se identificaron previamente como
MSI-H mostraron datos de amplificación para los
cinco marcadores. Los tumores mostraron deleciones en todas las
repeticiones mononucleótido (88 tumores) ó en 4/5 repeticiones
mononucleótido (9 tumores) (Figura 3). Sólo una muestra mostró
deleciones en 3/5 marcadores. En 5 casos, previamente definidos como
MSI-H, se encontraron alteraciones de tamaño sólo
en Bat-26 ó Bat-25; estas muestras
se consideraron mal clasificadas debido a polimorfismos étnicos (4
casos) o acortamiento límite (1 caso). Finalmente, se clasificó
previamente una muestra de tumor adicional como
MSI-H utilizando repeticiones dinucleótido pero no
BAT-26 (HOANG et. al., Cancer Res.,
59(1), 300-303, 1.997). Esta muestra era
monomórfica para las cinco repeticiones mononucleótido utilizadas
en este estudio, lo que sugería que estaba mal clasificada con
repeticiones dinucleótido, posiblemente debido al hecho de que el
ADN germinal no coincidía con el ADN tumoral. En la tabla II y en la
Figura 3, estas 6 muestras se
consideraron MSS.
consideraron MSS.
De 55 tumores gástricos y de colon y líneas
celulares clasificadas previamente como MSS y que contenían datos
para las 5 repeticiones, 53 (96,4%) resultaron monomórficas en los 5
marcadores. Un tumor resultó monomórfico en 4 marcadores (25%) y 1
tumor resultó monomórfico en 3/5 (2%) repeticiones. Ninguno de los
55 tumores MSS mostró cambios alélicos en 3 o más repeticiones
(Figura 3), cumpliendo todavía con los criterios de identificación
MSI de 2/5 polimorfismos de repeticiones descritos
anteriormente.
Estos resultados se ilustran mediante la Figura
3, que muestra el porcentaje de muestras con cambios en el tamaño
alélico en las cinco repeticiones mononucleótido en el ADN germinal
caucásico ( \boxempty ), ADN germinal africano ( \ding{110} ),
tumores MSS (17 ), tumores colorrectales
MSI-H (18 ) y tumores gástricos
MSI-H (19 ).
Las tres repeticiones mononucleótido NR21, NR22,
y NR24 resultan cuasi monomórficas en el ADN germinal y, similar a
BAT-25 y BAT-26, resultan altamente
sensibles a la deleción somática en los tumores
MSI-H. La distinción de los tumores
MSI-H de los MSS resulta ambigua cuando estos tres
nuevos marcadores se utilizan conjuntamente con
BAT-25 y BAT-26. El PCR múltiple de
estos 5 marcadores tiene la ventaja adicional de evitar la necesidad
de un análisis simultáneo del ADN germinal correspondiente de cada
paciente.
Aunque la naturaleza cuasi monomórfica de las
tres repeticiones mononucleótido sigue estando plenamente
establecida en poblaciones diferentes, ninguno de los 128 casos de
ADN germinal caucásico y 56 africanos presentaron polimorfismos en
más de 2 de las repeticiones. Puesto que los 98 tumores
MSI-H verdaderos examinados en la presente memoria,
con una amplificación exitosa de los 5 marcadores, mostraron
deleciones en por lo menos 3 marcadores, la probabilidad de una
mala interpretación de un resultado MSI debido a polimorfismos en 3
o más de los 5 marcadores resulta estadísticamente insignificante.
Por tanto cuando se analizaron conjuntamente los resultados de las
cinco repeticiones, el estado MSI de esta serie completa de 159
tumores se determinó sin ambigüedad con una especificidad y una
sensibilidad del 100%. Además, esto se logró sin la necesidad de
analizar el ADN germinal
correspondiente.
correspondiente.
\newpage
La Tabla 3 que a continuación sigue indica
tumores donde el polimorfismo o la deleción límite en
BAT-26 ó BAT-25 habría clasificado
mal el estado MSI del tumor correspondiente. En todos los casos, el
uso del panel múltiple permitió clasificar sin ambigüedad el
tumor.
En 31 muestras adicionales de ADN de tumores
gástrico y de colon, solo cuatro de los cinco marcadores se
amplificaron correctamente. Esto de debió probablemente a la
calidad del ADN extraído de los tejidos embebidos en parafina y
fijados en formalina. Veinticuatro de estos casos mostraron 4/4 ó
3/4 loci inestables y se identificaron correctamente como
MSI-H, los 7 casos restantes que mostraban 0/4 ó 1/4
loci inestables se identificaron correctamente como MSS (resultados
no mostrados, pero incluidos en la Tabla II). Por lo tanto, la
amplificación incompleta de las cinco repeticiones podría todavía
utilizarse de manera eficaz para identificar el estado MSI del ADN
difícil.
Hemos observado anteriormente que los tumores
MSI-H endometriales muestran unas diferencias de
inestabilidad cuantitativas y cualitativas significativas comparado
con los tumores MSI-H gastrointestinales (DUVAL
et. al., Cancer Res., 62, 1609-1612, 2.002).
En el presente estudio, también se sometieron a ensayo 20 tumores
endometriales que se sabía que eran MSI-H con el
mismo ensayo pentaplex fluorescente. Estos tumores mostraron unas
longitudes medias significativamente más cortas en los cinco
marcadores de repeticiones mononucleótido comparado con los tumores
gastrointestinales MSI-H (Tabla II). Utilizando los
criterios de detección MSI establecidos con este panel
microsatélite, 17/20 tumores endometriales fueron identificados como
MSI-H y 1 tumor fue identificado como MSS (datos no
mostrados). No fue posible identificar de manera concluyente el
estado MSI de los 2 tumores restantes debido a unos cambios
alélicos muy pequeños observados en los cinco marcadores.
Por tanto, resultó posible identificar de manera
eficaz el estado MSI de los 190 tumores gástricos y de colon y las
líneas celulares sometidas a ensayo en este experimento, que
incluían seis muestras que fueron anteriormente mal clasificadas.
Debido al menor tamaño de los cambios alélicos encontrados en los
tumores endometriales MSI-H, recomendamos el
análisis continuado de ADN germinal coincidente para el cribado MSI
rutinario de este tipo de cáncer.
La evidencia que se acumula sugiere que el
estado MSI define un subconjunto de cánceres colorrectales con unas
propiedades clínicas y biológicas distintivas, lo que enfatiza la
importancia de marcadores para la detección simples y precisos.
Este conjunto de cinco marcadores mononucleótido, determina el
estado MSI de tumores con mayor sensibilidad y especificidad que
BAT-25 y BAT-26 solos, y es
técnicamente más simple de utilizar que el panel recomendado en la
reunión de consenso de Bethesda.
<110> INSERM
\hskip1cmHAMELIN, Richard
\hskip1cmSURAWEERA, Nirosha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MARCADORES MICROSATÉLITES DE
REPETICIONES MONONUCLEÓTIDO PARA DETECTAR LA INESTABILIDAD DE LOS
MICROSATÉLITES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPbv598-61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 02 290 483.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-02-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentín versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 960
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaatgtatg tctcccctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattcctactc cgcattcaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggcttgtc aaggacataa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcggatg ccatccagtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattgctga attttacctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgtgccat tgcattccaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1080
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgcctccaa gaatgtaagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgcatttt aactatggct c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgactacttt tgacttcagc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccattcaa catttttaac cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1020
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtcgctgg cacagttcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtcactc gcgtttacaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgaatttt acctcctgac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccatgctt gcaaaccact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgataatact agcaatgacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccaggtgg caaagggca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcggtaat caagttttta g
\hfill21
Claims (16)
1. Método para evaluar la inestabilidad de los
microsatélites asociada con un tumor, mediante amplificación de los
loci del microsatélite en una muestra biológica que comprende ADN
genómico de dicho tumor y determinación de los tamaños de los
productos de amplificación del ADN, caracterizado porque
dicho método comprende la amplificación de un locus del
microsatélite denominado NR21, definido como una repetición 21T
situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8 (secuencia de
ADNc GenBank XM_033393).
2. El método según la reivindicación 1,
caracterizado porque comprende adicionalmente la
amplificación de un segundo locus del microsatélite denominado
NR24, definido como una repetición 24T situada en la región no
traducida 3' del gen dedo de cinc-2 (secuencia de
ADNc GenBank X60152), y la amplificación de un tercer locus del
microsatélite seleccionado de entre:
- -
- el locus del microsatélite denominado NR22, definido como una repetición 22T situada en la región no traducida 3' del gen de la proteína B5 precursora transmembrana putativa (secuencia de ADNc GenBank L38961);
- -
- el locus del microsatélite denominado NR27, definido como una repetición 27A situada en la región no traducida 5' del gen de la proteína-1 inhibidora de la apoptosis (secuencia de ADNc GenBank AF070674);
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende
adicionalmente la amplificación de por lo menos un locus de
repetición mononucleótido seleccionado entre BAT-25
y BAT-26.
4. Método según la reivindicación 3,
caracterizado porque comprende la amplificación de los cuatro
loci del microsatélite BAT-25,
BAT-26, NR21, NR24, y la amplificación de un quinto
locus del microsatélite seleccionado de entre NR22 y NR27.
5. Uso de un par de cebadores adecuados para la
amplificación del locus NR21 del microsatélite, definido como una
repetición 21T situada en la región no traducida 5' del gen SLC7A8,
para evaluar in vitro la inestabilidad de microsatélite
asociada con un tumor.
6. Uso de la reivindicación 5 en el que dicho
par de cebadores se selecciona de entre:
- -
- un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 4 y SEQ ID Nº: 5;
- -
- un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 17 y SEQ ID Nº: 18.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Kit para el análisis de la inestabilidad de
microsatélite, caracterizado porque comprende por lo menos
un par de cebadores como se ha definido en cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, y un par de cebadores adecuados para la
amplificación de NR24.
8. Kit según la reivindicación 7,
caracterizado porque comprende adicionalmente un par de
cebadores seleccionados de entre:
- -
- un par de cebadores adecuados, para la amplificación de NR22;
- -
- un par de cebadores adecuados, para la amplificación de NR27.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
7 u 8, caracterizado porque comprende adicionalmente por lo
menos un par de cebadores seleccionados de entre:
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus del microsatélite BAT-25;
- -
- un par de cebadores adecuados para la amplificación del locus del microsatélite BAT-26.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
7 u 9, caracterizado porque el par de cebadores adecuados
para la amplificación de NR24 consiste en los oligonucleótidos SEQ
ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9.
11. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
8 a 10, caracterizado porque:
- -
- el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR22 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 6 y SEQ ID Nº: 7;
- -
- el par de cebadores adecuados para la amplificación de NR27 consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 20 y SEQ ID Nº: 21.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
9 a 11, caracterizado porque:
- -
- el par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-25 se selecciona de entre un par de cebadores que consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 12 y SEQ ID Nº: 13, y un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 22 y SEQ ID Nº: 13;
- -
- el par de cebadores adecuados para la amplificación de BAT-26 se selecciona de entre un par de cebadores que consiste en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 15, y un par de cebadores que consisten en los oligonucleótidos SEQ ID Nº: 23 y SEQ ID Nº: 15.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Método para el diagnóstico del fenotipo
MSI-H de un tumor, en el que dicho método comprende
evaluar la inestabilidad de microsatélite de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
14. Método según la reivindicación 13 en el que
dicho tumor es un tumor del tracto gastrointestinal.
15. Método según la reivindicación 13 en el que
dicho tumor es un tumor gástrico o colorrectal.
16. Método según la reivindicación 13 en el que
dicho tumor es un tumor del endometrio.
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