TW201300777A - 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記 - Google Patents

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Abstract

本發明包括藉由確定大腸直腸癌(CRC)患者體內四核苷酸重複(EMAST)處及單核苷酸與二核苷酸重複基因座(MSI-L)處之微衛星不穩定性或SMARCA2R-LOH的程度來預測無復發存活及確定大腸直腸肝轉移(LM)風險的生物標記及方法。所獲得之結果表明第II期及第III期MSI-M患者相比具有高程度MSI(MSI-H)或具有高度穩定微衛星之剩餘患者具有較短之無復發存活，且MSI-M為原發性第II期及第III期CRC中復發性遠端轉移之獨立預測因子。已發現，在第IV期原發性CRC及LM組織中發現SMARCA2R-LOH及MSI-M。

Description

預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
本發明一般而言係關於原發性大腸直腸癌(CRC)。更特定言之，本發明係關於用於預測第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移復發之標記及用於鑑別處於轉移復發的高風險下之CRC患者之方法。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2011年3月18日申請之美國臨時申請案第61/454,107號及2011年10月10日申請之美國臨時申請案第61/549,541號之優先權，各臨時申請案之完整內容以引用的方式併入本文中。
聯邦政府贊助研究之聲明
本發明係在美國政府支持下依據由美國國家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)/美國國家衛生研究院(National Institutes of Health，NIH)授權之合約第R01 CA72851號及第CA129286號進行。政府享有本發明中之某些權利。
序列表之參考
本申請案包括已經由EFS-Web以ASCII格式提交且以全文引用的方式併入本文中之序列表。創建於2012年3月12日之該ASCII複本命名為BHCS1126_Sequence_Listing.txt且大小為1,934位元組。
不限制本發明之範疇，與用於原發性大腸直腸癌(CRC) 中之復發預測及遠端肝轉移確定的遺傳標記相關聯來描述其先前技術。熟練技術人員應瞭解，即使約70%之CRC轉移位於肝中，轉移亦可能位於其他器官中，例如肺(約20-30%)、中樞神經系統(約10%)、腎上腺、骨骼、脾、皮膚等。
美國專利申請公開案第2011/0039272號(Cowens等人，2011)揭示一種在經診斷患有大腸直腸癌之個體中預測臨床結果之方法，其包含在獲自該個體之癌細胞生物樣本中確定一或多種預測性RNA轉錄物或其表現產物之表現跡象。
頒予Baker等人之美國專利第7,871,769號(2011)提供表現對於癌症預後至關重要之基因的集合。特定而言，本發明提供適用於預測癌症患者是否可能對化學療法具有有益治療反應之基因表現資訊：FHIT、MTA1、ErbB4、FUS、BBC3、IGF1R、CD9、TP53BP1、MUC1、IGFBP5、rhoC、RALBP1、STAT3、ERK1、SGCB、DHPS、MGMT、CRIP2、ErbB3、RAP1GDS1、CCND1、PRKCD、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、AK055699、ZNF38、SEMA3F、COL1A1、BAG1、AKT1、COL1A2、Wnt.5a、PTPD1、RAB6C、GSTM1、BCL2、ESR1；或確定相應表現產物，該報導包括關於該個體對化學療法之反應可能減少之預測。
本發明係關於基於在大腸直腸癌(CRC)組織中存在微衛 星變化(在所選四核苷酸重複處之所選升高的微衛星變化(EMAST))及/或在單核苷酸與二核苷酸重複基因座(MSI-L)表型處存在低程度之微衛星不穩定性(MSI)或在9p24.3上之SMARCA2區處存在異質性缺失，用於預測第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移復發的標記及用於鑑別處於轉移復發的高風險下之患者之方法。
在一實施例中，本發明提供用於在患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之方法，其包含以下步驟：(i)鑑別患有原發性CRC之人類個體；(ii)由獲自該個體之一或多個生物樣本分離染色體組DNA，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群；(iii)量測或確定單核苷酸重複基因座、二核苷酸重複基因座處之微衛星不穩定性(MSI)、所選四核苷酸重複(EMAST)基因座處升高之微衛星變化或SMARCA2R-LOH中至少一者之程度，其中該量測係使用包含表示單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座中每一者之至少一種標記之標記組的微衛星分析或微陣列來完成；(iv)確定在來自獲自人類個體之分離染色體組DNA之原發性CRC中存在抑或不存在MSI，其中該確定係藉由擴增該分離染色體組DNA來完成；(v)藉由使用分類機制將原發性CRC中之MSI分類為MSI-H、MSI-M及H-MSS，其中該分類機制包含：a)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上 處存在MSI之高程度微衛星不穩定性(MSI-H)表型；b)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之低程度微衛星不穩定性(MSI-L)表型；c)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之穩定程度微衛星穩定性(MSS)表型；d)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；e)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；f)表示MSI-L或EMAST+、或MSI-L與EMAST+表型兩者之中等程度微衛星不穩定性(MSI-M)表型；及g)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記處均無MSI之高度穩定微衛星(H-MSS)表型；及(vi)在對原發性CRC分類之後預測無復發存活之機率、確定復發風險或進行兩者，其中在人類個體中，存在MSI-M表型表示最高復發性遠端轉移風險，存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險。
在特定態樣中，單核苷酸重複基因座標記包含BAT25、BAT26或兩者；二核苷酸重複基因座標記包含D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69或其任何組合；且四核苷酸重複基因座標記包含MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其任何組合。在另一態樣中，標記組包含BAT25、BAT26、 D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。在又一態樣中，第II期及第III期原發性CRC中存在MSI-M表型表示在人類個體中存在高復發性遠端轉移風險，包括肝轉移(LM)。在另一態樣中，其中該方法用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者的抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。在一態樣中，存在MSI-M與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
本文揭示之另一實施例係關於一種對原發性大腸直腸癌(CRC)中之微衛星不穩定性(MSI)進行分類之方法，其包含：提供包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組以用於MSI分析，其中該等標記係選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群；提供自患有或疑似患有CRC之人類個體之一或多個生物樣本分離的染色體組DNA；確定來自獲自人類個體之分離染色體組DNA之原發性CRC中存在抑或不存在MSI，其中該確定係藉由擴增該分離染色體組DNA來完成；及基於如下機制對MSI分類或確定腫瘤表型，其中該機制包含：(a)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；(b)表示 在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；(c)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之MSS表型；(d)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；(e)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；(f)表示MSI-L、EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及(g)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記處均無MSI之H-MSS表型。在一態樣中，該方法進一步包含偵測SMARCA2R-LOH之存在，其中存在MSI-H與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
本文揭示之又一實施例係關於一種用於在患有或疑似患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險、確定肝轉移(LM)風險或其任何組合之生物標記，其包含偵測樣本中之四核苷酸重複處之微衛星變化(EMAST)、低程度之二核苷酸重複基因座(MSI-L)或兩者，其中在來自第II期及第III期CRC個體之樣本中之大部分細胞中存在MSI-M、或MSI-M及SMARCA2R-LOH表型表示在人類個體中存在高復發風險、高肝轉移(LM)風險或其任何組合。
在一態樣中，確定原發性CRC細胞中之MSI-H、MSI-M及H-MSS係基於包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複標記之組。在另一態樣中，該組包含BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、 MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。在另一態樣中，SMARCA2R-LOH表型係使用SEQ ID NO：1至6之核酸來確定。
本發明亦提供一種用於在患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之套組，其包含：用於量測來自個體之生物樣本中四核苷酸重複(EMAST)處、單核苷酸或二核苷酸重複基因座(MSI-L)處之微衛星不穩定性(MSI)或SMARCA2R-LOH的生物標記偵測試劑；及關於預測無復發存活之機率、確定復發風險或兩者之操作指南，其中該等操作指南包含針對在獲自患有第II期或第III期CRC之個體之生物樣本中確定MSI-M、MSI-H、H-MSS或SMARCA2R-LOH表型之存在且將其與獲自同一個體之正常組織之生物樣本進行比較的逐步指示。在一態樣中，該套組包括用於偵測一或多個選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸、二核苷酸或四核苷酸重複基因座標記的試劑。在另一態樣中，個體樣本之大部分細胞中存在MSI-M表型或MSI-M及SMARCA2R-LOH表型表示在人類個體中存在高復發風險及降低之無復發存活機率。在又一態樣中，一或多個細胞中存在MSI-M表型表示個體中存在轉移或高肝轉移(LM)風險。在又一態樣中，該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、生檢、糞便樣本、一或多種生物流 體或其任何組合組成之群。在一態樣中，SMARCA2R-LOH表型係使用SEQ ID NO：1至6之核酸(例如其中之核酸對)來確定。
本發明進一步係關於一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌(CRC)之患者中預測癌症療法成功機率或兩者之方法，該方法包含：鑑別經診斷患有原發性CRC之患者；及確定獲自患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複(EMAST)處或其任何組合之微衛星不穩定性(MSI)程度，其中在個體樣本之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高遠端轉移(包括肝轉移(LM))風險、降低之癌症療法成功可能性或其任何組合。
本發明之一實施例提供一種對經診斷患有原發性大腸直腸癌(CRC)之患者選擇癌症療法之方法，該方法包含：鑑別經診斷患有原發性CRC之患者；確定獲自患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複(EMAST)處或其任何組合之微衛星不穩定性(MSI)程度，其中在個體樣本之大部分細胞中存在MSI-M表型或MSI-M與SMARC2A-LOH表型表示高復發風險、高遠端轉移(包括肝轉移(LM))風險、降低之癌症療法成功可能性或其任何組合，且基於鑑別劑來選擇癌症療法以降低或抑制MSI-M。在上文所述方法之一態樣中，確定MSI之步驟進一步包含以下步驟：i)提供包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記的組以用於MSI分析，其中 該等標記係選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群；ii)提供自經診斷患有CRC之患者的一或多個生物樣本分離之染色體組DNA；iii)確定在來自獲自人類個體之分離染色體組DNA的第II期及第III期原發性CRC中存在抑或不存在MSI；及iv)基於如下機制對MSI分類或確定腫瘤表型且將CRC分類為3組，包括MSI-H、MSI-M及H-MSS，其中該機制包含：(a)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；(b)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；(c)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之MSS表型；(d)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；(e)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；(f)表示MSI-L、EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及(g)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記處均無MSI之H-MSS表型。
在又一實施例中，本發明提供一種用於在患有原發性大 腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之方法，其包含以下步驟：i)鑑別患有原發性CRC之人類個體；ii)由獲自該個體之一或多個生物樣本分離染色體組DNA，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群；iii)使用包含選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之2個單核苷酸重複基因座、5個二核苷酸重複基因座及7個四核苷酸(EMAST)重複基因座之組的微衛星分析來量測或確定微衛星不穩定性(MSI)之程度；iv)確定在來自獲自人類個體之分離染色體組DNA的第II期及第III期原發性CRC中存在抑或不存在MSI，其中該確定係藉由擴增該分離染色體組DNA來完成；v)藉由使用分類機制對原發性CRC中之MSI進行分類，其中該分類機制包含：(a)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；(b)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；(c)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之MSS表型；(d)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；(e)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；(f)表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及(g)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標 記處均無MSI之H-MSS表型；及vi)在對原發性CRC分類之後預測無復發存活之機率、確定復發風險或進行兩者，其中在人類個體中，存在MSI-M表型表示最高復發性遠端轉移風險，存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險。
本發明之一實施例揭示一種執行臨床試驗以評估咸信適用於治療大腸直腸肝轉移、促進無復發存活或用於兩者之候選藥物的方法，該方法包含：a)確定獲自患者之細胞中一或多個四核苷酸重複(EMAST)、單核苷酸及二核苷酸重複基因座(MSI-L)中至少一者之微衛星不穩定性或SMARCA2R-LOH的程度，其中患者樣本之大部分細胞中之MSI-M表型表示最高復發風險、高肝轉移(LM)風險或其任何組合，且存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險；b)向第一患者子集投與候選藥物，且向第二患者子集投與安慰劑；向第二患者子集投與比較藥物；或向第二患者子集投與候選藥物與另一活性劑之藥物組合；c)在投與候選藥物或安慰劑、比較藥物或藥物組合之後重複步驟a)；及d)監測由具有MSI-H、MSI-M或H-MSS表型之第II期及第III期原發性CRC患者所展現之無復發存活率，其與在第二 患者子集中出現之由具有MSI-H、MSI-M、H-MSS及SMARCA2R-LOH表型之患者所展現之無復發存活率相比在統計學上顯著，其中在統計學上顯著增加表示該候選藥物適用於治療該疾病病況。
在另一實施例中，本發明係關於一種用於在患有第II期及第III期原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之方法，其包含以下步驟：(i)鑑別患有原發性CRC之人類個體；(ii)由獲自該個體之一或多個生物樣本分離染色體組DNA，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群；(iii)使用包含選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸重複基因座、二核苷酸重複基因座及四核苷酸(EMAST)重複基因座之組的微衛星分析來量測或確定微衛星不穩定性(MSI)之程度，或量測或確定SMARCA2R-LOH之程度；(iv)確定在來自獲自人類個體之分離染色體組DNA的原發性CRC中存在抑或不存在MSI；(v)藉由使用分類機制對原發性CRC中之MSI進行分類且將CRC分為包括MSI-H、MSI-M及H-MSS之3組，其中該分類機制包含：a)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；b)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之 MSI-L表型；c)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之MSS表型；d)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；e)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；f)表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及g)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記處均無MSI之H-MSS表型；及(vi)在對原發性CRC分類之後預測無復發存活之機率、確定復發風險或進行兩者，其中患者樣本之大部分細胞中之MSI-M表型表示最高復發風險、高肝轉移(LM)風險或其任何組合，且存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險。
在又一實施例中，本發明提供一種確定患有大腸直腸癌(CRC)之人類個體中大腸直腸肝轉移之發展風險的方法，其包含以下步驟：鑑別患有原發性CRC之人類個體，自該個體獲得一或多個生物樣本，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群，使用包含選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸重複基因座、二核苷酸重複基因座及四核苷酸(EMAST)重複基因座之組的微衛星分析來量測或確定微衛星不穩定性(MSI)之程度及量測或確定SMARCA2R-LOH之程度，確定在來自獲自人類個 體之分離染色體組DNA的原發性CRC中存在抑或不存在MSI，藉由使用分類機制對原發性CRC中之MSI進行分類，及基於樣本中MSI-M表型之存在或增加來確定人類個體中大腸直腸癌肝轉移之風險。本文所述之分類機制包含：i)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；ii)表示在單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；iii)表示在任何單核苷酸或二核苷酸標記處均無MSI之MSS表型；iv)表示在至少一個四核苷酸標記處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；v)表示在任何四核苷酸標記處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；vi)表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及vii)表示在任何單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記處均無MSI之H-MSS表型。在一態樣中，存在SMARCA2R-LOH與MSI-M兩者表示第IV期原發性CRC及LM。
為了更完整理解本發明之特徵及優勢，現參考[實施方式]以及附圖。
儘管下文詳細論述本發明之各種實施例之進行及使用，但應瞭解本發明提供多種可以各種特定內容具體化之適用發明性概念。本文論述之特定實施例僅說明進行及使用本發明之特定方式且並非對本發明之範疇定界。
為便於理解本發明，下文定義多種術語。本文定義之術語具有如本發明相關領域之一般技術者通常所理解之含 義。諸如「一」及「該」之術語並不欲僅指單數實體，而包括可用於說明之特定實例的普通類別。本文之術語係用於描述本發明之特定實施例，但除非申請專利範圍中加以概述，否則其使用並非對本發明定界。
如本文所用，術語「大腸直腸癌」包括廣泛接受之醫學定義，其將大腸直腸癌定義為以小腸以下之腸道(亦即，大腸(結腸)，包括盲腸、上行結腸、橫結腸、下行結腸、乙狀結腸及直腸)的細胞癌症為特徵之醫學病狀。另外，如本文所用，術語「大腸直腸癌」亦進一步包括以十二指腸及小腸(空腸及迴腸)的細胞癌症為特徵之醫學病狀。
術語「組織樣本」(術語「組織」與術語「組織樣本」可互換使用)應理解為包括由一或多個細胞個別地或與任何基質複合或與任何化學物質結合而構成之任何物質。該定義應包括任何生物或有機物質及其任何細胞子部分、產物或副產物。「組織樣本」之定義應理解為包括(不限於)精子、卵、胚胎及血液組分。出於本發明之目的，「組織」定義中亦包括某些定義之非細胞結構，諸如具有細胞來源但不再表徵為細胞之皮膚真皮層。如本文所用之術語「大便」為臨床術語，係指人類排泄之糞便。
如本文所用之術語「生物流體」係指含有生物來源之細胞及化合物的流體，且可包括血液、淋巴液、尿液、血清、膿、唾液、精液、淚水、尿液、膀胱沖洗液、結腸沖洗液、痰或來自呼吸系統、消化系統、循環系統或其他身體系統之流體。出於本發明之目的，「生物流體」(即含有 生物標記之核酸)可存在於循環細胞中或可存在於無細胞之循環DNA或RNA中。
如本文所用之術語「基因」係指功能性蛋白、多肽或肽編碼單元。如熟習此項技術者所瞭解，該功能性術語包括染色體組序列、cDNA序列或其片段或組合，以及基因產物，包括可人工改變之彼等基因產物。純化基因、核酸、蛋白質及其類似物用於指經鑑別且與至少一種通常締合之污染核酸或蛋白質分離之彼等實體。術語「對偶基因」或「對偶基因形式」係指編碼相同功能性蛋白但相對於相同基因之另一形式在核苷酸序列中含有差異之替代基因形式。
如本文所用，「核酸」或「核酸分子」係指聚核苷酸，諸如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶鏈反應(PCR)產生之片段及由任何接合、切斷、核酸內切酶作用及核酸外切酶作用產生之片段。核酸分子可由單體構成，該等單體為天然產生之核苷酸(諸如DNA及RNA)或天然產生之核苷酸之類似物(例如，天然產生之核苷酸的α-對映異構形式)或兩者之組合。經修飾之核苷酸可在糖部分及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分中具有變化。糖修飾包括例如以鹵素、烷基、胺及疊氮基置換一或多個羥基，或糖可經官能化為醚或酯。此外，整個糖部分可經空間及電子學上類似之結構，諸如氮雜-糖及碳環糖類似物置換。鹼基部分中之修飾的實例包括烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶或其他熟知之雜環取代基。核酸單體可經 磷酸二酯鍵或該等鍵聯之類似物鍵聯。磷酸二酯鍵聯之類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。術語「核酸分子」亦包括所謂的「肽核酸」，其包含連接至聚醯胺主鏈之天然產生或經修飾核酸鹼基。核酸可為單股或雙股的。
如本文所用之「生物標記」係指與特定病理學或生理學狀態相關之分子指示物。如本文所用之「生物標記」為關於癌症之分子指示物，更特定言之為關於第II期及第III期原發性CRC之遠端轉移的指示物。「生物標記」之實例包括(但不限於)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其組合。如本文所用，術語「免疫組織化學(IHC)」(在應用於細胞時亦稱作「免疫細胞化學(ICC)」)係指診斷病理學中之工具，其中單株抗體之組可用於未分化贅瘤之鑑別診斷(differential diagnosis)中(例如，以辨別淋巴瘤、癌瘤及肉瘤)，以揭示對於某些腫瘤類型及其他疾病具特異性之標記、診斷表型惡性淋巴瘤且證明病毒抗原、癌蛋白、激素受體及增殖相關核蛋白之存在。
術語各研究組之間之「統計學上顯著」差異係有關於使用適當統計學分析(例如χ2(Chi-square)測試、t測試)時各組相同之機率小於5%(例如，p<0.05)之情形。換言之，在完全隨機基礎上獲得相同結果之機率為在100次嘗試中少於5 次。
術語「套組」或「測試套組」表示分析所需試劑與佐劑之組合。儘管測試套組在大多數情形下由若干單元組成，但單件式分析元件亦可適用，其須同樣視為測試套組。
MSH3基因(寄存編號P20585)為DNA錯配修復(MMR)基因之一。MSH3連同MSH2一起形成MutSβ異雙螺旋，其與由諸如順鉑(cisplatin)及補骨脂素(psoralen)之藥物誘發之股間交聯(ICL)相互作用。然而，MSH3在介導ICL誘發劑之細胞毒性作用中之確切作用仍難以理解。本案發明人在本文中表明MSH3缺乏對由順鉑及奧沙利鉑(oxaliplatin，另一ICL誘發鉑藥物)導致之細胞毒性的作用。
如本文所用，術語「微衛星不穩定性」係指在微衛星序列內在重複單元中發生連續膨脹或收縮之狀態。
如本文所用，縮寫EMAST係指在所選四核苷酸重複處升高之微衛星變化。
實例1.
本案發明人展示人類MutS同系物3(MSH3)活性損失導致在經組織培養之大腸癌細胞株(1)中所選四核苷酸重複處升高之微衛星變化(EMAST)及二核苷酸重複基因座處低程度之微衛星不穩定性(MSI)(MSI-L)。使用僅具有單核苷酸重複之標記的微衛星分析明確定義且以高準確度偵測微衛星不穩定、錯配修復(MMR)缺乏型CRC。2,3當該分析包括具有單核苷酸及二核苷酸重複之標記(諸如標準參考標記)時，連同MSI-H、MMR缺乏型CRC及微衛星穩定 (MSS)CRC一起偵測到較少百分比之在二核苷酸重複標記處展現低程度MSI(MSI-L)之CRC。3儘管在MSI-H與MSI-L之間或在MSI-H與MSS之間存在臨床病理學行為或分子型態之明顯差異，4,5,6,7但MSI-L與MSS之間之區別長久以來仍存在爭論。4,8,9
在大腸直腸癌(CRC)組織中，50-60%之偶發性原發性腫瘤展現EMAST，且MSH3之下調與MSI-L及EMAST相關(1)。然而，MSI-L/EMAST及MSH3下調在大腸直腸癌發生中之病理學意義尚未可知。若干研究已顯示，原發性CRC中之MSI-L與不良預後相關。因為CRC中不良預後之一端點為肝轉移(LM)。當本案發明人除NCI標記以外在MSI分析中亦包括含有四核苷酸重複之EMAST標記時，所有MSI-H CRC均在EMAST標記中展現高程度之MSI，且大部分但非所有MSI-L及約一半之MSS CRC在一些EMAST標記中展現MSI。1,10此外，偶發性CRC中EMAST基因座處之MSI-L及MSI可同樣表明MSH3蛋白損失。1此等觀察結果引導本案發明人假定MSI-L及/或EMAST CRC(在該研究中稱作中等程度之MSI(MSI-M))可能屬於不同於具有MSI-H之CRC及/或具有高度穩定性微衛星(H-MSS)之CRC的臨床病理組。
本案發明人首先確定在至少5年之追蹤時段期間所收集之連續167例原發性CRC及匹配正常組織的MSI狀態。使用14種標記自染色體組DNA執行PCR擴增：七種標準NCI標記及七種EMAST標記。使用以下分組根據MSI狀態對腫瘤 分類：1)MSI-H(在七種NCI標記之三者或三者以上處具有MSI之腫瘤)、MSI-L(在七種NCI標記之一或兩者處具有MSI之腫瘤)及MSS(在任何NCI標記處均無MSI之腫瘤)；2)MSI-H、EMAST(在七種EMAST標記中之一或多個基因座處具有MSI之非MSI-H腫瘤)及非EMAST(在七種EMAST標記之任一者處均無MSI之非MSI-H腫瘤)；及3)MSI-H、MSI-M(MSI-L及/或EMAST腫瘤)及在7種NCI及7種EMAST標記之任一者處均無MSI之H-MSS腫瘤。
患者及DNA分離：在Chonnam National University Hospital,Gwangju及Chonnam National University Hwasun Hospital,Chonnam,Republic of Korea，在至少5年之追蹤時段期間收集連續167例原發性CRC及匹配正常組織。所有患者均在2002年與2010年期間接受手術。對所有患者提供書面知情同意書，且該研究得到機構審查委員會(institutional review board)認可。對於DNA提取，分別自經石蠟嵌埋之切片(10 μm)微剝離腫瘤及正常組織。使用QIAamp DNA FFPE組織純化套組(QIAGEN,Valencia,CA)自經微剝離之組織分離及純化染色體組DNA。
MSI分析：為確定原發性CRC及LM組織之MSI狀態，使用經螢光標記之引子自染色體組DNA執行PCR擴增。使用兩種具有單核苷酸重複之標記(BAT25及BAT26)、五種具有二核苷酸重複之標記(D2S123、D5S346、D17S250、D18S64及D18S69)及七種EMAST標記(MYCL1、D20S82、 D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394)。熱變性之後，使經擴增PCR產物在ABI PRISM 3100 Avant遺傳分析器(Applied Biosystems,Foster City,CA)上電泳且由GeneMapper片段分析軟體(Applied Biosystems)進行分析。當由腫瘤組織產生之PCR產物與來自匹配正常組織之產物相比展現至少一個新峰時，確定基因座呈MSI陽性。
統計學分析：為評估特定CRC組之無復發存活，使用Kaplan-Meier方法。為評估各組之間之顯著差異，使用log-rank測試。使用Cox比例危險回歸分析來評估MSI-M與其他臨床病理因素之間之相關性以用於預測復發性遠端轉移。若P值小於0.05，則認為差異係統計學上顯著的。所有統計學分析均使用Medcalc 7.2(Mariakerke,Belgium)執行。
根據本發明之定義，鑑別分組1中之10例MSI-H、23例MSI-L、134例MSS，分組2中之10例MSI-H、90例非EMAST及67例EMAST，及分組3中之10例MSI-H、80例MSI-M及77例H-MSS(圖2A-2E)。在MSI-M(表2)或其他CRC種類(未展示)與臨床病理學特徵(諸如年齡、性別、腫瘤級別、位置、階段及存在抑或不存在佐劑化學療法)之間未發現顯著相關性。
在本案發明人使用Kaplan-Meier方法評估133例第II期及第III期原發性CRC之無復發存活時，在分組1中，在MSI-H與MSI-L之間(圖1A，P=0.015)或在MSI-H與MSS之間(圖1A，P=0.019)無復發存活存在顯著差異，但在MSI-L與 MSS之間無復發存活無差異(P=0.396)。類似地，在分組2中，在MSI-H與EMAST之間(圖1B，P=0.009)及在MSI-H與非EMAST之間(圖1B，P=0.029)偵測到顯著差異，但在EMAST與非EMAST之間未偵測到差異(圖1B，P=0.179)。相比之下，分組3中之MSI-H、MSI-M及H-MSS患者展示彼此顯著不同之無復發存活率(圖1C)。MSI-M腫瘤比H-MSS更可能隨遠端轉移而復發(圖1C，P=0.0415)。僅當將MSI-L及EMAST置於與MSI-M相同之組中時，其方可在非MSI-H患者中經識別為高風險組。此外，在藉由多變量Cox比例危險分析與H-MSS相比時，MSI-M為針對第II期及第III期原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子(表1，危險比：1.83，95% CI：1.06-3.15，P=0.03)。本文報導之結果表明，MSI-M為針對第II期及第III期原發性CRC之復發性遠端轉移的可預測性標記且可用於鑑別高風險患者。
表2：原發性CRC之MSI-M與臨床病理學特徵之間的關係。
本案發明人現已認識到，第II期及第III期原發性CRC中之MSI-M可與轉移至肝之能力相關(異時肝轉移)。本案發明人分析了98例肝轉移(LM)組織(48例異時及50例同時)(圖3A及圖3B)及131例導致LM之轉移性原發性CRC組織(56例第III期及18例第II期及57例第IV期)(圖3C及圖3D)的MSI狀態。圖3A-3D展示48例異時LM(圖3A)、50例同時LM(圖3B)、74例導致LM之第II期及第III期原發性CRC(圖3C)及57例第IV期原發性CRC(圖3D)的MSI型態。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)的MSI資料、NCI標記(「NCI」)處之MSI狀態、EMAST狀態、MSI-M狀態。對於MSI資料，實心盒表示存在框移突變。對於使用NCI組之MSI，L表示MSI-L，S表示MSS且H表示MSI-H。對於EMAST狀態，E表示EMAST陽性且非E表示EMAST陰性。對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HMSS表示H-MSS且H表示MSI-H。關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242，S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69。
在48例異時LM中，70.8%(34/48例)展示MSI-M(圖3A，表3)。與異時LM形成對比，46.0%之同時LM(50例中之23例)展示MSI-M(圖3B)。同時與異時LM之MSI-M頻率差異顯著(表3，p=0.013)。當本案發明人執行多變量邏輯回歸 分析來比較與異時及同時LM相關之因素時(表3)，結果證實與同時LM相比，MSI-M與異時LM顯著相關(勝算比：3.54，95% CI：1.41-8.93，P=0.007)，且進一步顯示異時LM所源自之原發性CRC與良好分化之狀態相關(P=0.02)且與遠端位置相關(P=0.01)。(表3)。
本案發明人接著檢查130例導致LM之轉移性原發性CRC的MSI狀態。其中，74例為第II期或第III期且56例為第IV期(圖3C及3D)。70.3%之導致LM之第II期及第III期原發性CRC(52/74例)對於MSI-M呈陽性(圖3C)，而48.2%之第IV期CRC(27/56例)展現MSI-M(圖3D)，且該差異係顯著的(P=0.012)(表4)。在導致LM之第II期及第III期原發性CRC中(P=0.007)觀測到比第II期及第III期原發性CRC中之平均MSI-M頻率(48.4%)顯著更高之MSI-M頻率。相比而言，第IV期原發性CRC與總體第II期及第III期原發性CRC之MSI-M頻率類似(48.2%對48.4%)。多變量邏輯回歸分析亦證實與導致同時LM之第IV期原發性CRC相比，MSI-M與導致異時LM之第II期及第III期原發性CRC相關(勝算比：2.61，95% CI：1.218-5.591，P=0.0137，表4)。
為確定MSI型態在散播之後是否變化，本案發明人將86例匹配LM(圖4A)與該等LM所源自之原發性CRC(圖4B)的MSI狀態相比較。發現MSI狀態僅在9例匹配病例中變化(10.5%)，包括4例在散播之後MSI狀態由MSS變為MSI-M之病例及5例在散播之後MSI狀態由MSI-M變為MSS之病例(圖4C)。該等結果表明原發性CRC之MSI狀態反映大多數病例(90%)中之轉移組織的MSI狀態(圖4D)。
圖4A展示77例LM之MSI型態且圖4B展示77例導致圖4A中所列LM之匹配原發性CRC的MSI型態。該77例匹配LM與原發性CRC之間MSI狀態無變化。圖4C展示9例LM之MSI型態且圖4D展示9例導致圖4C中所列LM之匹配原發性CRC的MSI狀態。該9例匹配LM與原發性CRC之間MSI狀態存在變化。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)的MSI資料。對於MSI資料，實心盒表示存在框移突變。關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242，S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69。
本發明之發現表明藉由Kaplan-Meier分析，第II期及第III期MSI-M患者相比具有高程度MSI(MSI-H)(P=0.0084)或具有高度穩定性微衛星(P=0.0415)之剩餘患者具有較短之無復發存活，且無論佐劑化學療法不存在抑或存在，MSI-M均為關於原發性第II期及第III期CRC中復發性遠端轉移的 獨立預測因子(Cox比例危險分析，風險比：1.83，95% CI：1.06-3.15，P=0.0301)。此外，本案發明人所進行之研究表明原發性CRC中之MSI-M可能與形成異時肝轉移之能力相關。本文所呈現之發現暗示第II期及第III期之異時LM生物學可能不同於來自在初始階段處於第IV期之病例的彼等同時LM，產生以下假設：MSI-M路徑在異時肝轉移中比在同時肝轉移中具有更為重要之作用。
實例2.來自CRC之肝轉移中的SMARCA2R LOH及MSI-M。
實例1表明由NCI參考標記及所選四核苷酸重複(EMAST)標記處升高之微衛星變化所定義之中等微衛星不穩定性(MSI-M)在原發性CRC中為常見的，且為關於第II期及第III期(II/III)原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子。然而，MSI-M與復發性遠端轉移如何關聯尚未可知。為鑑別與MSI-M及與原發性CRC之肝轉移(LM)顯著相關之遺傳變化或標記，57對匹配轉移性原發性CRC及來自相同患者之相應肝轉移(LM)及17例LM用於使用7種NCI參考標記及7種EMAST標記之微衛星不穩定性(MSI)。MSI-M與臨床病理因素之相關性係使用χ2測試來確定。藉由染色體組資料採擷選擇總計142種具有多形態微衛星之基因座，且檢查24例展現MSI-M之LM中每一基因座之MSI及異質性缺失(LOH)。由於9p24.3上SMARCA2處之LOH常見於MSI-M陽性LM(64%)中，吾人進一步檢查另外50例LM及224例原發性CRC中SMARCA2區域處之LOH狀態(SMARCA2R-LOH)。SMARCA2R-LOH與MSI-M、LM或其他臨床病理因素之相 關性係使用χ2測試來確定。
縮寫：大腸直腸癌(CRC)、肝轉移(LM)、微衛星不穩定性(MSI)、所選四核苷酸重複處升高之微衛星變化(EMAST)、異質性缺失(LOH)、低程度之MSI(MSI-L)、高程度之MSI(MSI-H)、中等MSI(MSI-M)、SMARCA2區域處之LOH(SMARCA2R-LOH)。
MSI-M在轉移性第II期/第III期原發性CRC中之頻率顯著高於MSI-M在非轉移性第II期/第III期原發性CRC中或在第IV期原發性CRC中之頻率。MSI狀態在LM與LM所源自之原發性CRC之間無變化。因此，MSI-M在異時LM中比在同時LM中顯著更為頻繁。SMARCA2R-LOH在異時LM中之頻率顯著高於異時LM所源自之轉移性第II期/第III期原發性CRC中的頻率，表明SMARCA2R-LOH可促進散播後之轉移過程。此外，該增加在異時LM之MSI-M人群中受到限制。因此，儘管在導致LM之第II期/第III期原發性CRC中MSI-M與SMARCA2R-LOH之間無相關性，但其在異時LM中顯著相關。相比而言，儘管SMARCA2R-LOH在同時LM中之頻率與在第IV期原發性CRC中發現之頻率相比不存在差異，但在第IV期原發性CRC及同時LM中偵測到MSI-M與SMARCA2R-LOH之間的顯著相關。因此，MSI-M及SMARCA2R-LOH共存於大部分(70~80%)之第IV期原發性CRC、異時LM或同時LM組織中。
微衛星不穩定性(MSI)係在微衛星序列內之重複單元中發生連續膨脹或收縮之狀態。1錯配修復(MMR)系統中之 缺陷無法修復由微衛星基因座中之DNA聚合酶所產生之滑裂錯誤，從而導致MSI。1源自MMR缺陷型病例之腫瘤組織通常展現高程度之MSI(MSI-H)。2
儘管可使用不同標記來鑑別具有缺陷型MMR之CRC，使用僅具有單核苷酸重複之標記的分析明確定義且以高準確度偵測此類型之CRC。3,4當使用具有單核苷酸或二核苷酸重複之標記(諸如NCI參考標記)時，連同MSI-H及微衛星穩定(MSS)CRC一起偵測到在二核苷酸重複處具有低MSI(MSI-L)之CRC。2大多數MSI-H偶發性CRC已藉由啟動子超甲基化作用獲取靜默hMLH1 5且具有比MSI-L及/或MSS CRC更佳之預後。6-8因此，MSI-H與MSI-L/MSSCRC之間之區別在遺傳學及表型方面較為明顯。相比而言，儘管MSI-L CRC在hMSH2或hMLH1中不具有缺陷，2但MSI-L之分子基礎在很大程度上尚未可知。此外，MSI-L及MSS CRC在一些研究中具有類似之臨床病理學表型。2,9該等觀察結果暗示，若檢查足夠多的標記，則大多數CRC可展現某種程度之MSI，且MSI-L可能與MSS CRC無區別。2,9,10然而，若干研究已顯示，MSI-L不同於MSS CRC。11-13 MSI-H、MSI-L及MSS CRC之基因表現型態彼此不同且每一CRC類型展現不同之基因表現集合。11兩個獨立研究已表明Duke C MSI-L CRC具有不良預後，可能係由於其與復發之相關性。12,13除NCI標記所定義之MSI以外，在人類癌症中亦觀測到微衛星基因座中另一類型之突變。14,15在非MSI-H CRC中，一些腫瘤展示在具有含有 aaag或agat之四核苷酸重複之基因座處之不穩定性，16-18但未展示在具有單核苷酸重複之基因座處之不穩定性。16此類型之微衛星變化稱作EMAST。儘管在非小細胞肺癌中已證明p53突變與EMAST之間之相關性，19但對於CRC中EMAST之臨床病理學意義及分子基礎尚未充分理解17。
上文中，本案發明人表明MSI-L與EMAST兩者均可為MSH3缺乏之結果且可屬於同一CRC病理組。20當檢查7個EMAST基因座之MSI時，約50%之非MSI-H原發性CRC展現EMAST。16,17由標準NCI標記定義之大部分但非所有MSI-L及一半MSS展現EMAST。16,17組織培養之大腸癌細胞中MSH3損失導致EMAST基因座處之MSI及具有二核苷酸重複之基因座處之低MSI。16在CRC組織中偵測到MSH3表現下調與MSI-L/EMAST之間之顯著相關性。16最後，當使用7種標準NCI標記及7種EMAST標記檢查同批167例原發性CRC之MSI時，識別到根據復發性遠端轉移風險不同之三組獨立的第II期及第III期CRC。20最高風險組展現MSI-L及/或EMAST。最低風險組展現MSI-H，且中等風險組展示高度穩定性微衛星(H-MSS)。基於該等發現，吾人建議將MSI-L/EMAST定義為一組且將該組CRC命名為中等MSI(MSI-M)。20然而，MSI-M與CRC中之復發及/或遠端轉移是如何相關仍待確定。
在該研究中，有跡象表明MSI-M牽涉於原發性CRC之肝轉移(LM)中。吾人鑑別與LM組織中之MSI-M相關之遺傳變化，藉由染色體組資料採擷選擇142種具有基因內微衛 星之候選基因且針對在24種展現MSI-M之LM組織中高頻率之MSI及LOH對其進行篩檢。本案發明人確定：1)LM組織應含有肝轉移所必需之所有遺傳及/或後生變化，2)含有具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之微衛星的基因可為誘發MSI-M之機制的標靶。該種基因可在MSI-M陽性LM中富集，3)由於實例1中之研究顯示EMAST(MSI-M)與某些基因座處之頻繁LOH事件相關，17因此可連同MSI-M一起選擇特定基因座處之LOH。一些該等基因座可在LM形成中起作用。在MSI-M陽性LM中展現高頻率LOH或MSI之基因座中，9p24.3上之SMARCA2R-LOH在LM及第IV期原發性CRC組織中與MSI-M相關，而在第II期及第III期原發性CRC組織中與此無關。該實例顯示兩種事件(一種與MSI-M相關且另一種與SMARCA2R-LOH相關)導致癌細胞可勝任肝轉移。
材料及方法。組織及DNA分離。在Chonnam National University Hospital,Gwangju及Chonnam National University Hwasun Hospital,Chonnam,Republic of Korea，在至少5年之追蹤時段期間收集連續167例原發性CRC及匹配正常組織。20自Chonnam National University之the Department of Pathology的存檔收集31對匹配轉移性原發性CRC組織及來自相同患者之相應肝轉移(LM)組織與17例LM組織。所有病例均在2002年與2010年期間接受手術。吾人亦獲得在Toho University,Ohmori Hospital(Tokyo,Japan)收集之26對匹配偶發性轉移性原發性CRC組 織及相應LM組織。對所有患者提供書面知情同意書，且研究得到機構審查委員會認可。對於DNA提取，分別自經石蠟嵌埋之切片(10 μm)微剝離腫瘤及正常組織。使用QIAamp DNA FFPE組織純化套組(QIAGEN,Valencia,CA)自經微剝離之組織分離及純化染色體組DNA。
MSI及LOH分析。為確定原發性CRC及LM組織之MSI狀態，使用經螢光標記之引子自染色體組DNA執行PCR擴增。使用兩種具有單核苷酸重複之標記(BAT25及BAT26)、五種具有二核苷酸重複之標記(D2S123、D5S346、D17S250、D18S64及D18S69)及七種EMAST標記(MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394)。17腫瘤經分類為：1)高程度MSI(MSI-H)：在七種單核苷酸或二核苷酸標記之三者或三者以上處展現MSI之腫瘤；2)中等程度MSI(MSI-M)：在七種單核苷酸及二核苷酸標記之一或兩者處展現MSI之腫瘤(MSI-L)及/或在七種EMAST標記(EMAST)中之一種或一種以上基因座處展現MSI之腫瘤；3)高度穩定性微衛星(H-MSS)：在14種標記之任一者處均不展現MSI之腫瘤。
對於含有多形態二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之142種基因座(參見下文)，使用來自該等重複之5'與3'端之染色體組序列以藉由線上軟體Prim3Plus設計PCR引子(http：//www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)。藉由Schuelke所述方法執行對該等基因座之擴增及對MSI或LOH之偵測。22熱變性之後，使經擴增PCR產物在ABI PRISM 3100 Avant遺傳分析器(Applied Biosystems,Foster City,CA)上電泳且由GeneMapper片段分析軟體(Applied Biosystems)進行分析。
當由腫瘤組織產生之PCR產物與來自匹配正常組織之產物相比展現至少一個新峰時，確定基因座呈MSI陽性。當正常組織在特定標記處展現異質性時，評估相應腫瘤組織中之LOH。使用PCR產物之電泳圖高度作為信號強度之量度。比較正常細胞中兩種對偶基因之間之信號強度比率及相應腫瘤細胞中兩種對偶基因之間之信號強度比率。當腫瘤細胞之比率展現小於正常細胞中比率之45%時，確定基因座呈LOH陽性。
篩檢與MSI-M及LM相關之基因。總而言之，吾人選擇142種具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之基因用於篩檢。選擇該等基因之主要準則為：1)微衛星重複位於基因之5'-UTR、外顯子、3'UTR或內含子處，2)該等重複足夠大以易受DNA聚合酶錯誤影響，及3)該等重複在長度方面為多形態的以使得可偵測LOH。NCBI blast搜尋(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)之後訪問Ensemble資料庫(www.ensembl.org/index.html)以偵測多形現象，鑑別出24種具有多形態四核苷酸重複之基因。對於選擇具有三核苷酸重複之基因，吾人使用Kozlowski等人公開之資料庫，22其中列舉878種具有6個以上三核苷酸重複單元之基因。其中，吾人選擇64種在5'-UTR、外顯子或3'-UTR中具有8個以上三核苷酸重複單元之多形態基因。為選擇具有二核苷 酸重複之基因，吾人使用Satellog資料庫。23吾人選擇45種在5'UTR、內含子或3'UTR中具有8個或8個以上單元(8至49個單元)之含有多形態CA/GT之基因(表5.1、5.2及5.3)。
藉由訪問NCBIPubMed文獻資料庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)檢查所選基因與「癌症」之相關性。已報導70%之所選基因與文獻中之癌症相關。除以上基因以外，吾人在清單中增加9種常在癌症組織中發生突變之EMAST標記。15對於該等基因座中之每一者，擴增來自24例展現MSI-M之LM組織與匹配正常組織的模板DNA且分析其MSI及LOH。
SMARCA2R LOH。使用四種多形態標記SMARCA2-2、SMARCA2-4、SMARCA2-230K及SMARCA2-240K來偵測橫 跨SMARCA2基因座之約300 Kb區域的LOH。該等基因座之引子序列如下：SMARCA2-2-F(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAGGGGAAAAGGACGTTGC-3')(SEQ ID NO：1)、SMARCA2-2-R(5'-TGTTGTTGCTGCGTCTGTG-3')(SEQ ID NO：2)、SMARCA2-4-F(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAGCCTGAACACTGCATAGTGAG-3')(SEQ ID NO：3)、SMARCA2-4-R(5'-TCATCTTTTGGAAATGGAATAAGG-3')(SEQ ID NO：4)、SMARCA2-230K-F(5'-GAAACATAACCAAGAAGATGGATG-3')(SEQ ID NO：5)、SMARCA2-230K-R(5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCCAGCTTCTGCAATGGTGTA-3')(SEQ ID NO：6)、SMARCA2-240K-F(5'-TTTTTAAACAGCCCAACTTTCA-3')(SEQ ID NO：7)及SMARCA2-240K-R(5'-CACACCCACTTTTCAGAGGA-3')(SEQ ID NO：8)。當四種標記之一展示LOH時將LOH定義為陽性，且當在所有三種標記中均偵測到同質性(homozygousity)時將LOH定義為不具資訊性。剩餘病例定義為非LOH。
統計學分析。使用χ2測試及多重邏輯回歸分析來評估MSI-M與臨床病理因素之相關性。為評估特定CRC組之無復發存活，使用Kaplan-Meier方法。為評估各組之間之顯著差異，使用log rank測試。使用Cox比例危險回歸分析來評估MSI-M與其他臨床病理因素之間之相關性以用於預測復發性遠端轉移。若P值小於0.05，則認為差異在統計學上顯著的。
原發性CRC及CRC肝轉移中之MSI-M。以上實例檢查了167例原發性CRC在7種參考NCI微衛星基因座及7種EMAST基因座處之微衛星突變。20在167例腫瘤中，42例為在初始診斷後60個月內不導致復發性遠端轉移之第II期/第III期原發性CRC，56例為在診斷後60個月內導致遠端轉移之第II期/第III期原發性CRC，且17例為與同時轉移相關之第IV期原發性CRC。如圖5A中所示，在轉移性第II期/第III期原發性CRC中(62.5%，56例中之35例)比在非轉移性第II期/第III期原發性CRC(35.3%，42例中之17例)或第IV期CRC(40.5%，17例中之6例)中更常觀察到MSI-M；每一情形下之差異均為顯著的(分別為P=0.031及P=0.048)。相比而言，非轉移性第II期/第III期原發性CRC(35.3%)與第IV期CRC(40.5%，17例中之6例)之MSI-M頻率無差異(P=0.712)。
由於MSI-M在第II期/第III期CRC中引起復發轉移之風險高於引起非MSI-M腫瘤之風險，20因此若MSI狀態在散播之後不變化，則預期在來自原發性CRC之異時轉移組織中可見更高頻率之MSI-M。為檢查MSI-M在原發性CRC之LM中如何普遍存在，確定74種LM組織(包括34種同時及40種異時LM)之MSI狀態(圖6A至6D)。當47.1%之同時LM(16/34例)展示MSI-M(圖1B，表6)時，70.0%之異時LM(40例中之28例)展示MSI-M。該差異在統計學上為顯著的(圖5B，表6，P=0.045)。
檢查49例導致LM之原發性CRC之MSI狀態(圖6A至6D)。亦在分析中增加52例導致LM(上文)之原發性CRC的資料。總計確定101種該等病例之MSI狀態。其中，37例為第IV期(圖6C)且64例為第II期/第III期(圖5B及圖6D)。40.5%之第IV期CRC(37例中之15例)展現MSI-M，而67.2%之導致 LM之第II期/第III期原發性CRC(64例中之43例)呈MSI-M陽性；該差異為顯著的(P=0.01)(圖5B，表6)。
如圖5B中所示，導致LM之原發性CRC與LM組織之MSI-M頻率無顯著變化。當將63例匹配LM與該等LM所源自之原發性CRC的MSI狀態相比較時，此結論得到證實。MSI狀 態僅在6例匹配病例中變化(9.5%)，其中4例中MSI狀態在散播之後由MSS變為MSI-M且其中2例中MSI狀態在散播之後由MSI-M變為MSS。因此，原發性CRC之MSI狀態在大多數病例(約90%)中反映轉移組織之MSI狀態(圖7A及7B)。
圖7A及7B展示成對LM與相應原發性CRC之MSI型態。圖7A及7B提供關於LM與LM所源自之相應原發性CRC之MSI型態的詳細資料。圖7A：MSI型態彼此類似之51對。圖7B：MSI型態在散播之後變化之6對。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(1至7)、5種具有CA重複之標記(a至e)、2種具有單A重複之標記(f及g)的突變資料。綠盒表示存在框移突變。每一數值對應於EMAST且字母對應於NCI標記，如下：1：MYCL1，2：D19S394，3：D20S85，4：D20S82，5：D9S242，6：L17835，7：D8S321，a：D2S123，b：D17S250，c：D5S346，d：D18S64，e：D18S69，f：BAT25，g：BAT26。
總而言之，該等結果表明MSI-M與導致遠端轉移(包括轉移至肝)之第II期/第III期原發性CRC顯著相關。在異時LM中亦偵測到與MSI-M之顯著相關性。該等結果可與上文之發現(即MSI-M為關於第II期/第III期原發性CRC之復發性遠端轉移的獨立預測因子)相容。然而，MSI-M與CRC中之復發性遠端轉移如何相關尚未可知。
一種可能性為MSI-M CRC可能比H-MSS或MSI-H CRC對5-FU治療更具耐受性。該假定來自於上文觀察結果，即與 同時LM相比，MSI-M富集於異時LM中(圖5B)；及如下實情，即異時LM之大多數前驅體而非同時LM之大多數前驅體暴露於以5-FU為主之佐劑化學療法。實際上，在吾人之64例異時LM中，82.4%(17例中之14例)對應於該等LM病例的第II期原發性CRC及85.1%(47例中之40例)對應於該等LM病例的第III期原發性CRC已接受以5-FU為主之佐劑化學療法。因此，異時LM中較高頻率之MSI-M可能反映其前驅體對5-FU暴露之抗性。然而，由於以下兩種原因可能並非此情形。首先，關於該研究中分析之48例異時LM的多變量邏輯回歸分析無法偵測先前以5-FU治療原發性CRC與異時LM所展現之MSI-M之間的任何顯著相關性(P=0.5205)。其次，上文之研究展示不考慮佐劑化學療法，由第II期/第III期原發性CRC所展現之MSI-M均為關於復發之獨立預測因子。20
篩檢具有與MSI-M相關之微衛星的基因。為確定MSI-M與遠端轉移如何相關，鑑別與MSI-M相關及與肝轉移之能力相關之遺傳變化。首先，選擇142種在基因內序列中含有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之候選基因(表5.1至5.3)。針對在24例已於上述研究中發現呈MSI-M陽性之LM中高頻率之MSI或LOH篩檢該等基因。
在所檢查之142種基因座中，29種基因座(20.4%)在24例MSI-M陽性LM中展現MSI(表8.1及8.2)。
如所預期，16具有較大重複之基因座比具有較小重複之基因座更多地展示MSI；53%具有四核苷酸重複之基因座、15%具有三核苷酸重複之基因座及4%具有二核苷酸重複之基因座展示MSI。如表1中所示，在MSI-M陽性LM中，RBM47(25%)、WIPF(18%)、D9S303(17%)、ZNF161(17%)、D8S1179(14%)、D21S11(13%)及KANK2(13%)在其 微衛星區域中展現較高程度之MSI。然而，在24例LM病例中，該等基因座之突變頻率不大於7種EMAST標記之平均突變頻率(約20%)。儘管在由PubMed搜尋之文獻中該等基因座均未與癌症相關，但仍欲確定該等基因座中之MSI是否具有任何生物功能或與MSI-M及轉移是否相關。
與MSI相比，LOH以較高頻率發現於更多基因座中。142種基因座中之87種(61%)在大於6%的資訊性病例中展現LOH(表8)。該等結果表明可經由與LOH相關之染色體不穩定性路徑在MSI-M陽性LM中產生大量遺傳變化，儘管該等腫瘤展現中等程度之MSI。
本案發明人發現10種具有高於50%之LOH頻率的基因座。該等基因座包括KDM6B(75%)、MNT(71%)、SMARCA2(64%)、HEC1(60%)、ANKRD5(58%)、BCL2(58%)、SEMA6D(57%)、D5S818(56%)、STYK1(50%)及BCL6B(50%)(表9)。除ANKRD5及D5S818以外，所有基因座均與癌症相關。儘管已在CRC組織中觀測到KDM6B(17p13)、MNT(17p13)、BCL6B(17p13)、HEC1(18p11)、BCL1(18q21)、ANKRD5(20p12)及SEMA6D(15q21)所居留之染色體區域中存在LOH，24,25但尚未報導在CRC致癌物中9p24處之SMARCA2及12p13處之STYK1兩處之LOH。因此，確定SMARCA2處之LOH與MSI-M或與LM形成之可能相關性。
SMARCA2基因座周圍之LOH與原發性及LM組織中之MSI-M之間的相關性。為增加用於SMARCA2 LOH分析之資訊性病例數目，吾人使用SMARCA2基因中之兩種多形態微衛星標記及分別位於距SMARCA2基因之3'側230 Kb及240 Kb處之兩種標記。使用本文所述關於SMARCA2區域(SMARCA2R)LOH之定義，分析由連續167例上文所述原發 性CRC病例組成之韓國人同批。20在165例資訊性病例中之59例(35.8%)中偵測到SMARCA2R LOH。藉由Kaplan-Meier分析，第II期及第III期原發性CRC之SMARCA2R LOH與無復發存活之間無顯著相關性(log-rank測試，P=0.205)。在該同批中，SMARCA2R LOH與MSI-M之間亦無相關性(表10，P=0.122)。與SMARCA2R LOH相關之唯一因素為較小之年齡(62，P=0.035)。
接著，針對SMARCA2R LOH檢查101例導致LM之原發性CRC(表10)。96例對於SMARCA2R LOH具資訊性(圖6A至6D)。其中，61例為第II期/第III期且22例(36.1%)對於SMARCA2R LOH呈陽性。35例為第IV期CRC且14例(40%)對於SMARCA2R LOH呈陽性。在導致LM之第IV期CRC中偵測到SMARCA2R LOH與MSI-M之間之顯著相關性(P=0.017)，但在導致LM之第II期/第III期原發性CRC中未偵測到(P=0.811)。SMARCA2R LOH與自韓國收集之第IV期組織之間亦存在顯著相關性，與來自日本之組織形成對比。
接著，針對SMARCA2R LOH檢查74例LM(表11，圖6A至6D)。總而言之，71例對於SMARCA2R LOH分析具資訊性。其中，39例為異時LM且26例(61.5%)對於SMARCA2R LOH呈陽性。32例為同時LM且18例(56.3%)對於SMARCA2R LOH呈陽性。在異時(P=0.002)及同時 LM(P=0.011)中均偵測到SMARCA2R LOH與MSI-M之間之顯著相關性(表11)。
以上結果表明，與非MSI-M腫瘤類型相比，SMARCA2R LOH常發生於MSI-M陽性第IV期原發性CRC、同時LM及異時LM中。為進一步證實該等結果，吾人執行多變量邏輯 回歸分析以評估MSI-M與各種因素(包括SMARCA2R LOH)之顯著相關性。如表12中所示，在導致LM之第IV期CRC中，SMARCA2R-LOH與MSI-M顯著相關(O.R.：9.36，95% CI：1.2-73.1，P=0.033)，但在導致LM之第II期/第III期原發性CRC中無關(P=0.731)。在異時LM(O.R.：45.6，95% CI：3.5-595.4，P=0.004)及同時LM(O.R.：9.74，95% CI：1.6-59.7，P=0.014)中SMARCA2R LOH與MSI-M亦顯著相關。
以上結果亦表明，LM組織(59.2%，71例中之42例)中之SMARCA2R-LOH頻率與導致LM之原發性CRC組織(37.5%，96例中之36例)相比顯著不同(圖8A，P=0.006)。該差異主要係由於異時LM與轉移性第II期/第III期原發性CRC之間之差異(P=0.013)，而非同時LM與第IV期原發性CRC之間之差異(P=0.183)(圖8B)。此外，在轉移性第II期/第III期原發性CRC之MSI-M陽性部分與異時LM之MSI-M陽性部分之間觀測到SMARCA2R-LOH頻率之顯著差異(P=0.001)，但在第II期/第III期原發性之非MSI-M部分與異時LM之非MSI-M部分之間未觀測到顯著差異(P=0.443)(圖8C)。在第IV期原發性CRC之MSI-M陽性部分與同時LM之MSI-M陽性部分之間(P=)或在第IV期原發性CRC(23.8%)之非MSI-M部分與同時LM(35.3%)之非MSI-M部分之間(P=0.438)，SMARCA2R-LOH頻率不存在顯著差異(圖8C)。
總而言之，該等結果暗示，SMARCA2R-LOH連同與MSI-M相關之事件在LM形成中起關鍵作用。在與同時LM相關之第IV期原發性CRC中，高百分比之MSI-M腫瘤獲得SMARCA2R-LOH(64.3%，圖8C)。該等結果暗示，已在腫瘤形成早期同時獲得MSI-M及SMARCA2R-LOH之CRC組織可能發展同時LM。另一方面，在散播之後獲得SMARCA2R-LOH之MSI-M陽性CRC可能發展異時LM。或者，在原發性組織中以微小群體存在之MSI-M及SMARCA2R-LOH雙陽性細胞若未經手術及/或化學療法去除，則可能發展異時LM。
已發現，在接近9p24.3上之SMARCA2基因座的區域處之LOH以高頻率與MSI-M共存於LM及與同時LM相關之第IV期原發性組織中。相比而言，SMARCA2R-LOH較不常見於第II期/第III期原發性CRC中，即使在導致LM之原發性CRC中。此外，在導致LM之第II期/第III期原發性CRC之MSI-M部分與異時LM之MSI-M部分之間偵測到SMARCA2R-LOH頻率之顯著差異。該等結果表明，MSI-M及SMARCA2R-LOH為關於原發性CRC之肝轉移之遺傳標記，且暗示與MSI-M相關之推定重要事件與SMARCA2基因座周圍重要基因之對偶基因缺失合作形成原發性CRC之LM。
上文已表明，第II期及第III期之MSI-M、H-MSS及MSI-H原發性CRC分別展現最高、中等及最低之復發性遠端轉移風險。20該等結果表明，定義MSI-H或MSI-M之機制亦可牽涉於確定未來復發機率之過程中。在MSI-H病例中，有跡象表明引起MSI-H之缺陷型MMR亦可經由該等過程中所牽涉之基因的超突變而導致腫瘤細胞之免疫原性增加及/或細胞凋亡潛能，從而導致良好預後。26
MSH3下調可在組織培養之細胞株中誘發MSI-M。16藉由IHC監測發現，MSH3在MSI-M原發性CRC組織中之表現與H-MSS原發性CRC相比在數量上減少且在該等組織中為異質性的。16又，在MSI-M腫瘤組織中接近壞死區域可見一些MSH3陰性腫瘤細胞。該等觀測結果可表明，CRC組織中MSH3下調可能並非由於遺傳原因，而是由於受微環境 因素(諸如低氧)影響之生理學原因。16此外，在置於低氧(0.1% O2)下之10種人類細胞株中之8者中觀測到MSH3下調(未公開資料)。已報導低氧使MMR基因(包括MSH2、MSH6、MSH3及MLH1)下調且在某些病例中誘發MSI。27-29最後，MSH3含量降低之MSI-M CRC組織過表現作為低氧標記之葡萄糖轉運體1蛋白(未公開資料)。30因此，低氧可導致CRC組織中之MSH3下調，從而導致MSI-M。由於亦已知腫瘤內低氧增強癌症侵襲性且促進原發性腫瘤組織之轉移潛能，31,32因此低氧可為經由MSH3下調誘發MSI-M且引起促進轉移之重要變化者。
考慮到關於腫瘤發生之LOH遺傳機制，可合理地假定存在於SMARCA2R周圍之基因可為隱性的且負向地調節轉移。若情形如此，則在第二正常對偶基因缺失之前須存在使對偶基因之一者不活化之第一次打擊。一種可能性在於，與MSI-M相關之推定重要事件可為經由MSH3下調或藉由另一由低氧誘發之機制使該基因座處之第一對偶基因不活化。當發生第二次打擊SMARCA2R-LOH時，該等細胞變得勝任遠端轉移。或者，低氧細胞可在另一基因座中獲得可與SMARCA2R-LOH合作用於轉移之變化。總而言之，本案發明人發現SMARCA2R-LOH為與MSI-M相關之重要遺傳標記且約50%之LM來自原發性CRC。
已發現，SMARCA2R-LOH與MSI-M常共存於第IV期原發性CRC及LM組織中，表明與該等遺傳變化相關之兩種事件對於肝轉移可起關鍵作用且可牽涉於至少50%之病例 之肝轉移中。
預期本說明書中論述之任何實施例均可關於本發明之任何方法、套組、試劑或組合物來實施，且反之亦然。此外，本發明組合物可用於實現本發明方法。
應瞭解，本文所述之特定實施例以說明方式展示，而非用於限制本發明。在不偏離本發明之範疇下，本發明之主要特徵可用於各種實施例中。熟習此項技術者將認知到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述特定程序之眾多等效物。該等等效物被視為在本發明之範疇內且由申請專利範圍所涵蓋。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案均指示本發明相關領域中之技術人員之技術水準。所有公開案及專利申請案均以引用之方式併入本文中，該引用之程度就如同已特定地且個別地指示將各個公開案或專利申請案以引用之方式併入一般。
當在申請專利範圍及/或說明書中結合術語「包含」使用時，詞語「一」之使用可意謂「一種(個)」，但其亦與「一或多種(個)」、「至少一種(個)」及「一種(個)或一種(個)以上」之含義一致。雖然本發明支持僅指替代意義及「及/或」之定義，但除非明確地說明僅指替代意義或替代意義互斥，否則在申請專利範圍中使用之術語「或」係用於意謂「及/或」。在本申請案中，術語「約」用於指示值包括用以確定該值之裝置、方法之誤差的固有偏差或研究個體間存在之偏差。
如本說明書及申請專利範圍中所用，詞語「包含」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)為包括性或開放性的且不排除額外、未陳述之要素或方法步驟。如本文所用，短語「基本上由...組成」將申請專利範圍之範疇限制為特定材料或步驟及不實質上影響所主張發明之基本及新穎特徵的彼等材料或步驟。如本文所用，短語「由...組成」排除申請專利範圍中未指定之任何要素、步驟或成分，除例如通常與要素或限制相關之雜質以外。
如本文中所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列項目之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情形下次序重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續此實例，明確地包括含有一或多個項目或術語的重複之組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟練技術人員應理解，除非自上下文顯而易見，否則一般對任何組合中之項目或術語數目均無限制。
如本文所用，諸如(不限於)「約」、「實質」或「實質 上」之近似詞語係指如下狀況，其經如此修飾時應理解為不必絕對或完全，而應由一般技術者認為足夠接近而能確認所指定狀況存在。描述內容可變化之程度將取決於可建立多大變化且一般技術者仍認為經修飾之特徵仍具有未經修飾特徵之所需特性及能力。一般而言且根據先前論述，本文中由諸如「約」之近似詞語修飾之數值可與指定值相差至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15%。
根據本發明，可在無不當實驗之情形下製造及執行本文中所揭示及主張之所有組合物及/或方法。儘管已根據較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯而易見，在不偏離本發明之概念、精神及範疇下，可對本文所述之組合物及/或方法，及該方法之步驟或步驟次序施加變化。熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代及修改均認為在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念內。
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圖1A-1C係展示對第II期及第III期原發性CRC患者中之 無復發存活之Kaplan-Meier分析的曲線。第II期及第III期CRC中之無復發存活率：圖1A再分為MSI-H、MSI-L及MSS。MSI-H對MSI-L(P=0.015)，MSI-H對MSS(P=0.019)，MSI-L對MSS(P=0.396)，圖1B再分為MSI-H、EMAST及非EMAST。MSI-H對EMAST(P=0.009)，MSI-H對非EMAST(P=0.029)，EMAST對非EMAST(P=0.179)，且圖1C再分為MSI-H、MSI-M及H-MSS。MSI-H對MSI-M(P=0.008)，MSI-H對H-MSS(P=0.036)，MSI-M對H-MSS(P=0.0412)(#：不顯著，*：P<0.05。P值係由log-rank測試來測定)；且圖2A-2E展示167例原發性CRC之MSI型態及復發結果。該圖提供來自分析MSI之167例原發性CRC之詳細資料及其關於復發性遠端轉移之結果資料。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)之MSI資料、標記(「」)處之MSI狀態、EMAST狀態、NCI標記處之MSI-M狀態、無復發存活持續時間及復發性遠端轉移之發生或未發生。對於MSI資料，實心盒表示存在框移突變。對於使用組之MSI，L表示MSI-L，S表示MSS且H表示MSI-H。對於EMAST狀態，E表示EMAST陽性且非E表示EMAST陰性。對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HS表示H-MSS且H表示MSI-H。對於無復發存活，每一數值表示每一患者無復發所持續之月數。對於復發資料，Y表示復發陽性且N表示復發陰性。關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242， S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69；圖3A-3D展示48例異時LM(圖3A)、50例同時LM(圖3B)、74例導致LM之第II期及第III期原發性CRC(圖3C)及57例第IV期原發性CRC(圖3D)的MSI型態。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)之MSI資料、NCI標記(「NCI」)處之MSI狀態、EMAST狀態、MSI-M狀態。對於MSI資料，實心盒表示存在框移突變。對於使用NCI組之MSI，L表示MSI-L，S表示MSS且H表示MSI-H。對於EMAST狀態，E表示EMAST陽性且非E表示EMAST陰性。對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HMSS表示H-MSS且H表示MSI-H。關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242，S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69；且圖4A展示77例LM之MSI型態且圖4B展示77例導致圖4A中所列LM之匹配原發性CRC的MSI型態。該77例匹配LM與原發性CRC之間MSI狀態無變化。圖4C展示9例LM之MSI型態且圖4D展示9例導致圖4C中所列LM之匹配原發性CRC的MSI型態。該9例匹配LM與原發性CRC之間MSI狀態存在變化。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(MYCL1至S321)、5種具有CA重複之標記(S123至S69)、2種具有單A重複之標記(BAT25及BAT26)的MSI資料。對於MSI資 料，實心盒表示存在框移突變。關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242，S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69。
圖5A及5B展示MSI-M第II期/第III期原發性CRC及LM。圖5A：在來自由連續167例原發性CRC病例組成之韓國人同批的非轉移性第II期/第III期、轉移性第II期/第III期及第IV期病例之中比較MSI-M百分比。17圖5B：在導致LM之第II期/第III期與第IV期之間及在異時與同時LM之間比較MSI-M百分比。*表示2組之間存在顯著差異(<0.05)。P值係使用χ2測試來測定。
圖6A至6D為LM及導致LM之原發性CRC中的MSI型態及SMARCA2R LOH。該圖提供來自圖6A：34例同時LM，圖6B：40例異時LM，圖6C：37例第IV期原發性CRC及圖6D：64例分析MSI及SMARCA2R處之LOH的導致LM之第II期/第III期原發性CRC的詳細資料。各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(1至7)、5種具有CA重複之標記(a至e)、2種具有單A重複之標記(f及g)的突變資料、MSI-M狀態、SMARCA2R LOH狀態。對於突變資料，綠盒表示存在框移突變。對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HS表示H-MSS且H表示MSI-H。對於LOH狀態，Y表示LOH陽性且N表示LOH陰性。N.I.表示非資訊性。每一數值對應於EMAST且字母對應於NCI標記，如下：1：MYCL1，2：D19S394，3：D20S85，4：D20S82，5：D9S242，6：L17835，7：D8S321， a：D2S123，b：D175250，c：D5S346，d：D18S64，e：D18S69，f：BAT25，g：BAT26。
圖7A及7B展示MSI狀態在散播之後不變化之成對LM與原發性組織(圖7A)，及MSI狀態在散播之後變化之成對LM與原發性CRC組織(圖7B)。
圖8A至8C展示轉移性原發性CRC及LM中之SMARCA2RLOH。圖8A：LM中之SMARCA2R-LOH百分比顯著高於轉移性第II期/第III期原發性CRC中(P=0.006)。圖8B：轉移性第II期/第III期原發性CRC與異時LM之間之SMARCA2R-LOH百分比差異顯著(P=0.013)，但第IV期原發性CRC與同時LM之間之SMARCA2R-LOH百分比差異不顯著(P=0.183)。S：階段，Syn：同時，Meta：異時。圖8C：在轉移性第II期/第III期原發性CRC之MSI-M部分與異時LM之MSI-M部分之間偵測到SMARCA2R-LOH百分比顯著增加(P=0.001)。MSI-M陽性第IV期(64%)、同時LM(約80%)及異時LM(約80%)之高百分比展示SMARCA2R-LOH。S：階段，Syn：同時，Meta：異時。
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<400> 8

Claims (35)

  1. 一種用於在患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之方法，其包含以下步驟：鑑別患有該原發性CRC之該人類個體；由獲自該個體之一或多個生物樣本分離染色體組DNA，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群；量測或確定單核苷酸重複基因座、二核苷酸重複基因座處之微衛星不穩定性(MSI)、所選四核苷酸重複(EMAST)基因座處升高之微衛星變化或SMARCA2R-LOH中至少一者之程度，其中該量測係使用包含表示該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座中每一者之至少一種標記之標記組的微衛星分析或微陣列來完成；確定在來自獲自該人類個體之該分離染色體組DNA之該原發性CRC中存在或不存在該MSI；藉由使用分類機制將該原發性CRC中之該MSI分類為MSI-H、MSI-M及H-MSS，其中該分類機制包含：表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之高程度微衛星不穩定性(MSI-H)表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之低程度微衛星不穩定性 (MSI-L)表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中任一者處均無MSI之穩定程度微衛星穩定性(MSS)表型；表示在該等四核苷酸標記中之至少一者處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；表示在該等四核苷酸標記中任一者處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST+表型兩者之中等程度微衛星不穩定性(MSI-M)表型；及表示在該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記中任一者處均無MSI之高度穩定性微衛星(H-MSS)表型；及在對該原發性CRC分類之後預測無復發存活之機率、確定復發風險或進行兩者，其中在該人類個體中，存在MSI-M表型表示最高復發性遠端轉移風險，存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險。
  2. 如請求項1之方法，其中該等單核苷酸重複基因座標記包含BAT25、BAT26或兩者。
  3. 如請求項1之方法，其中該等二核苷酸重複基因座標記包含D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69或其任何組合。
  4. 如請求項1之方法，其中該等四核苷酸重複基因座標記包含MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其任何組合。
  5. 如請求項1之方法，其中該標記組包含BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。
  6. 如請求項1之方法，其中在第II期及第III期原發性CRC中存在該MSI-M表型表示該人類個體中存在高復發性遠端轉移風險，包括肝轉移(LM)。
  7. 如請求項1之方法，其中該方法係用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者之抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。
  8. 如請求項1之方法，其中存在該MSI-M與該SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
  9. 一種用於對原發性大腸直腸癌(CRC)中之微衛星不穩定性(MSI)分類之方法，其包含：提供包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組以用於MSI分析，其中該等標記係選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群；提供由來自患有或疑似患有該CRC之人類個體之一或多個生物樣本分離之染色體組DNA； 確定來自獲自該人類個體之該分離染色體組DNA之該原發性CRC中存在或不存在該MSI；及基於機制對該MSI分類或確定腫瘤表型，其中該機制包含：表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中任一者處均無MSI之MSS表型；表示在該等四核苷酸標記中之至少一者處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；表示在該等四核苷酸標記中任一者處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；表示MSI-L、EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及表示在該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記中任一者處均無MSI之H-MSS表型。
  10. 如請求項9之方法，其中該方法進一步包含偵測SMARCA2R-LOH之存在，其中存在MSI-H與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
  11. 如請求項9之方法，其中該方法係用於在該人類個體中預測無復發存活之機率；確定復發風險；確定癌症轉移之階段；肝轉移(LM)風險；或其任何組合。
  12. 如請求項9之方法，其中該方法係用於治療患有大腸直腸癌之患者；選擇用於患有大腸直腸癌之患者之抗贅生劑療法；將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗；確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性；開發用於診斷大腸直腸癌之套組；或其任何組合。
  13. 一種生物標記，其係用於在患有或疑似患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險、確定肝轉移(LM)風險或其任何組合，其包含在樣本中偵測四核苷酸重複處之微衛星變化(EMAST)、低程度之二核苷酸重複基因座(MSI-L)或兩者，其中在來自第II期及第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M、或MSI-M與SMARCA2R-LOH表型表示在該人類個體中存在高復發風險、高肝轉移(LM)風險或其任何組合。
  14. 如請求項11之生物標記，其中確定該等細胞中之MSI-M表型係基於包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組。
  15. 如請求項11之生物標記，其中該組包含BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。
  16. 如請求項11之生物標記，其中該SMARCA2R-LOH表型係使用SEQ ID NO：1至6之核酸來確定。
  17. 一種用於在患有原發性大腸直腸癌(CRC)之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險或用於兩者之套組，其包含：用於量測來自個體之生物樣本中四核苷酸重複(EMAST)處、單核苷酸或二核苷酸重複基因座(MSI-L)處之微衛星不穩定性(MSI)或SMARCA2R-LOH的生物標記偵測試劑；及關於預測無復發存活之機率、確定復發風險或兩者之操作指南，其中該等操作指南包含針對在獲自患有第II期或第III期CRC之個體之生物樣本中確定MSI-M、MSI-H、H-MSS或SMARCA2R-LOH表型之存在且將其與獲自該同一個體之正常組織之生物樣本進行比較的逐步指示。
  18. 如請求項17之套組，其中該等偵測試劑偵測一或多個選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸、二核苷酸或四核苷酸重複基因座標記。
  19. 如請求項17之套組，其中在來自該個體之該樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型或該MSI-M與SMARCA2R-LOH表型表示在該人類個體中存在高復發風險及降低之無復發存活機率。
  20. 如請求項17之套組，其中在一或多個細胞中存在該MSI-M表型表示該個體中存在高肝轉移(LM)風險。
  21. 如請求項17之套組，其中該等生物樣本係選自由冷凍或 新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、生檢、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群。
  22. 如請求項17之套組，其中該SMARCA2R-LOH係使用SEQ ID NO：1至6來確定。
  23. 一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌(CRC)之患者中預測癌症療法成功機率之方法，該方法包含：鑑別該經診斷患有該原發性CRC之患者；及確定在獲自該患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複(EMAST)處或其任何組合處之微衛星不穩定性(MSI)程度，其中在來自該第II期或第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高肝轉移(LM)風險、降低之該癌症療法的成功可能性或其任何組合。
  24. 如請求項23之方法，其中該確定該MSI之步驟進一步包含以下步驟：提供包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組以用於MSI分析，其中該等標記係選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群；或SMARCA2R-LOH；提供自該經診斷患有該CRC之患者的一或多個生物樣本分離之染色體組DNA；確定在來自獲自該人類個體之該分離染色體組DNA的 該原發性CRC中存在或不存在該MSI；及基於機制對該MSI分類或確定腫瘤表型，其中該機制包含：表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中任一者處均無MSI之MSS表型；表示在該等四核苷酸標記中之至少一者處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；表示在該等四核苷酸標記中任一者處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及表示在該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記中任一者處均無MSI之H-MSS表型。
  25. 如請求項23之方法，其中該樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群。
  26. 如請求項23之方法，其中第II期或第III期CRC之該一或多個細胞中存在該MSI-M、EMAST/MSI-L表型表示異時肝轉移。
  27. 一種用於在經診斷患有原發性大腸直腸癌(CRC)之患者 中選擇癌症療法之方法，該方法包含：鑑別該經診斷患有該原發性CRC之患者；確定在獲自該患者之一或多個生物樣本之細胞中一或多個單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸重複(EMAST)處或其任何組合處之微衛星不穩定性(MSI)程度，其中在該人類個體中，在來自該第II期或第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M表型表示高復發風險、高肝轉移(LM)風險、降低之該癌症療法的成功可能性或其任何組合且存在H-MSS表型表示高無復發存活機率；及基於鑑別劑來選擇該癌症療法以降低或抑制該MSI-M、MSS表型。
  28. 如請求項27之方法，其中該確定該MSI之步驟進一步包含以下步驟：提供包含單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸重複基因座標記之組以用於MSI分析，其中該等標記係選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群；提供自該經診斷患有該CRC之患者之一或多個生物樣本分離之染色體組DNA；確定在來自獲自該人類個體之該分離染色體組DNA之該原發性CRC中存在或不存在該MSI；及基於機制對該MSI分類或確定腫瘤表型，且將CRC分類為3組，包括MSI-H、MSI-M及H-MSS，其中該機制包 含：表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中任一者處均無MSI之MSS表型；表示在該等四核苷酸標記中之至少一者處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；表示在該等四核苷酸標記中任一者處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及表示在該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記中任一者處均無MSI之H-MSS表型。
  29. 如請求項27之方法，其中該方法進一步包含偵測SMARCA2R-LOH之存在，其中存在MSI-H與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。
  30. 如請求項27之方法，其中該樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、細胞均質物、一或多個生物流體或其任何組合組成之群。
  31. 一種執行臨床試驗以評估咸信適用於治療大腸直腸肝轉移、促進無復發存活或用於兩者之候選藥物的活體外方法，該方法包含： a)確定獲自患者之細胞中一或多個四核苷酸重複(EMAST)、單核苷酸及二核苷酸重複基因座(MSI-L)中至少一者處之微衛星不穩定性或SMARCA2R-LOH之程度，其中來自該患者的樣本中之大部分細胞中之MSI-M表型表示最高復發風險、高肝轉移(LM)風險或其任何組合，且存在MSI-H表型表示最低風險且H-MSS表型表示中等復發性遠端轉移風險；b)在向該等患者的第一子集投與候選藥物，或向第二患者子集投與安慰劑、比較藥物或該候選藥物與另一活性劑之藥物組合之後重複步驟a)；及c)監測由具有MSI-H、MSI-M或H-MSS表型之第II期及第III期原發性CRC患者所展現之無復發存活率，其與在該第二患者子集中出現之由具有該MSI-H、該MSI-M、該H-MSS及該SMARCA2R-LOH表型之患者所展現之無復發存活率相比在統計學上顯著，其中在統計學上顯著增加表示該候選藥物適用於治療該疾病病況。
  32. 一種用於在患有大腸直腸癌(CRC)之人類個體中確定大腸直腸肝轉移的發展風險之方法，其包含以下步驟：鑑別該患有該原發性CRC之人類個體；由該個體獲得一或多個生物樣本，其中該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、一或多種生物流體或其任何組合組成之群；使用包含選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、 D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸重複基因座、二核苷酸重複基因座及四核苷酸(EMAST)重複基因座之組的微衛星分析來量測或確定微衛星不穩定性(MSI)之程度，及量測或確定SMARCA2R-LOH之程度；確定在來自獲自該人類個體之該分離染色體組DNA的該原發性CRC中存在或不存在該MSI；藉由使用分類機制對該原發性CRC中之該MSI分類，其中該分類機制包含：表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之三者或三者以上處存在MSI之MSI-H表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中之至少一者但不超過兩者處存在MSI之MSI-L表型；表示在該等單核苷酸或二核苷酸標記中任一者處均無MSI之MSS表型；表示在該等四核苷酸標記中之至少一者處具有MSI之非MSI-H表型的EMAST+表型；表示在該等四核苷酸標記中任一者處均無MSI之非MSI-H表型的EMAST-表型；表示MSI-L或EMAST、或MSI-L與EMAST表型兩者之MSI-M表型；及表示在該等單核苷酸、二核苷酸及四核苷酸標記中任一者處均無MSI之H-MSS表型；及基於該樣本中該MSI-M表型之存在或增加來確定該 人類個體中大腸直腸癌肝轉移之風險。
  33. 如請求項32之方法，其中該第II期及第III期原發性CRC樣本中存在該MSI-M表型可預測異時肝轉移。
  34. 如請求項32之方法，其中存在該SMARCA2R-LOH與該MSI-M兩者表示第IV期原發性CRC及LM。
  35. 如請求項32之方法，其中該方法係用於治療患有大腸直腸癌之患者、選擇用於患有大腸直腸癌之患者之抗贅生劑療法、將患者分階層於大腸直腸癌子組中或用於大腸直腸癌療法臨床試驗、確定對大腸直腸癌治療方案之抗性或反應性、開發用於診斷大腸直腸癌之套組，或其任何組合。
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