ES2342669T3 - Adzimas y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: (a) un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la proteolisis de un sustrato diana; y (b) un resto que elige diana que se une al sustrato diana.

Description

Adzimas y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a constructos de proteínas sintéticos útiles en la modulación de una variedad de moléculas elegidas como diana in situ. En aspectos particulares, se refiere a una familia de constructos que emplean partes moleculares ligadas que eligen como diana y modulan la actividad de una biomolécula catalíticamente para inducir un efecto terapéutico.

Muchas enfermedades están causadas, o se asocian a biomoléculas, tanto libres en disolución en fluidos corporales como expuestas a fluidos corporales extracelulares tales como proteínas unidas a la membrana y polisacáridos, tales como citocinas o factores de crecimiento, y se reconoce ampliamente que es posible desarrollar terapias para tales enfermedades modulando la actividad de la biomolécula.

Por ejemplo, la sobreproducción de TNF-\alpha y/o TNF-\beta está íntimamente ligada al desarrollo de muchas enfermedades que incluyen choque séptico, síndrome disneico del adulto, artritis reumatoide, trastornos autoinmunitarios selectivos, enfermedad de injerto-huésped tras trasplante de médula ósea y caquexia. Otras enfermedades asociadas a la producción excesiva de TNF-\alpha y/o TNF-\beta incluyen choque hemorrágico, asma y síndrome de diálisis posrenal. La multiplicidad de acciones de TNF-\alpha y TNF-\beta puede atribuirse al hecho de que las acciones de TNF-\alpha y/o TNF-\beta dan como resultado la activación de múltiples rutas de transducción de señales, cinasas, factores de transcripción, además de una matriz inusualmente grande de genes celulares. (Walajtys-Rode, Elizbieta, Kosmos (Warsaw), 44, 451-464, 1995, C.A. 124: 199735a, 1995). El TNF\alpha también se ha ligado al desarrollo de trastornos autoinmunitarios.

Las terapias actuales para combatir los anteriores trastornos incluyen la administración de un agente de unión tal como un anticuerpo o receptor soluble que se une a y así inhibe una biomolécula elegida como diana que produce o está asociada a la enfermedad. Sin embargo, hay muchos inconvenientes asociados a esta solución. Por ejemplo, los agentes de unión, por su propia naturaleza, sólo pueden inhibir la(s) biomolécula(s) a las que están unidos y no pueden ni inactivar catalíticamente una serie de biomoléculas ni alterar químicamente la(s) biomolécula(s) unida(s). Por esta razón es probable que frecuentemente se necesiten dosis relativamente grandes de agentes de unión para lograr eficacia terapéutica, exponiéndose el sujeto a efectos secundarios peligrosos y frecuentemente tóxicos. Además, la producción de tales cantidades grandes de anticuerpos y otros agentes de unión es cara.

El documento WO 02/097042 describe proteínas de fusión que comprenden (i) una porción de proteína inductora de apoptosis que puede ser una proteasa y (ii) una porción que elige células como diana.

La identificación y expresión de la mesotripsina (mesotripsinógeno) humana que codifica ADNc, una isoforma de tripsina (tripsinógeno) con resistencia a inhibidores, se describe en Cornelio N.M. Nyaruhucha, Makoto Kito y Shin-Ichi Fukuoka, The Journal of Biological Chemistry, vol. 272, 10573-10578, 1997.

Los agentes terapéuticos elegidos como diana con mayor eficacia que los agentes terapéuticos de unión tradicionales serían una mejora deseable.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden:

(a)

un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la proteolisis de un sustrato diana; y

(b)

un resto que elige diana que se une al sustrato diana.

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En ciertos aspectos, las proteínas de fusión de la invención son una nueva clase de constructos de proteínas manipulados denominados en el presente documento "adzimas", además de procedimientos y composiciones relacionados con el uso y la producción de adzimas. En general, las adzimas son constructos de proteínas quiméricas que se unen a uno o más dominios catalíticos con uno o más restos que eligen diana (o "direcciones"). Los dominios catalíticos y los restos que eligen diana no necesitan ser entidades separadas. En ciertas realizaciones, los restos que eligen diana/direcciones se introducen dentro de los dominios catalíticos. Un dominio catalítico de una adzima tiene un sitio enzimáticamente activo que cataliza una reacción que convierte un sustrato preseleccionado (la "diana" o "sustrato elegido como diana") en uno o más productos tales como por escisión, modificaciones químicas (transformaciones) o isomerización. Tales productos pueden tener una actividad alterada respecto al sustrato teniendo opcionalmente una actividad aumentada o disminuida que es cualitativamente diferente.

La invención se basa parcialmente en el descubrimiento inesperado que cuando se diseñan adzimas, pueden alterarse ciertas propiedades cinéticas de la adzima final para lograr un equilibrio entre la selectividad óptima y la potencia óptima de la adzima. Más específicamente, se determina que a medida que la enzima o dominio catalítico de una adzima llega a ser más potente, la adzima global pierde rápidamente su selectividad frente a un panel de sustratos diferentes comprometiendo por tanto la utilidad global de la adzima. Por otra parte, si va a lograrse una selectividad máxima sin considerar la potencia, la potencia puede aproximarse rápidamente a la de un agente de unión estequiométrico, por ejemplo, el dominio de dirección o resto que elige diana, y de nuevo se compromete la utilidad global de la adzima. Por tanto, hay una relación entre la potencia y la selectividad de una adzima. El equilibrio óptimo se logra cuando la eficiencia catalítica del dominio de enzima (k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES}) es igual a k_{off}^{AS}/[S]_{ef}. Tal equilibrio puede lograse más eficientemente ajustando [S]_{ef}, tal como ajustando la longitud del ligador entre el dominio catalítico y el resto que elige diana.

La adzima de la presente invención comprende el dominio catalítico de mesotripsina, o sus fragmentos funcionales, derivados, variantes o mutantes estabilizantes con semivida más larga y/o potencia aumentada. Por tanto, la invención proporciona una adzima que comprende: (a) dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la proteolisis de un sustrato diana; y (b) un resto que elige diana que se une al sustrato diana. En una realización, el dominio catalítico de mesotripsina está posicionado en el extremo N respecto al dominio de dirección. En una realización, el dominio catalítico de mesotripsina comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 70%, 80%, 85%, 90% o aproximadamente el 97% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de mesotripsina humano. En una realización, el dominio catalítico de mesotripsina comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. En una realización, el dominio catalítico de mesotripsina comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de SEQ ID NO: 45 sólo en uno o más cambios de aminoácidos conservativos.

Una adzima preferida adicional de la presente invención comprende un resto que elige diana que es un andamiaje de polipéptido, preferentemente un andamiaje similar a inmunoglobulina, que ha sido manipulado para unirse al sustrato elegido como diana. Ejemplos de tales restos que eligen diana incluyen aquellos que se basan en el dominio de fibronectina tipo III.

Por tanto, en ciertos aspectos, la invención proporciona adzimas que comprenden un dominio catalítico de mesotripsina y un resto que elige diana, en las que el dominio catalítico cataliza una reacción química que convierte un sustrato en uno o más productos y en las que el resto que elige diana se une reversiblemente a un sitio de dirección que está tanto en el sustrato como en proximidad funcional con el sustrato. Preferentemente, el resto que elige diana se une reversiblemente al sitio de dirección. Opcionalmente, dicho resto que elige diana y dicho dominio catalítico son heterólogos entre sí. Generalmente, dicho resto que elige diana, cuando se proporciona por separado, se une al sustrato, y dicho dominio catalítico, cuando se proporciona por separado, cataliza la reacción química que convierte dicho sustrato en uno o más productos.

En ciertas realizaciones, un dominio catalítico y un dominio que elige diana de la adzima se unen por un ligador de polipéptido para formar una proteína de fusión. Una proteína de fusión puede generarse en una variedad de formas que incluyen acoplamiento químico y cotraducción. En una realización preferida, la proteína de fusión es una proteína de fusión de cotraducción codificada por un ácido nucleico recombinante. En ciertas realizaciones, el ligador para la proteína de fusión es un péptido sin estructurar. Opcionalmente, el ligador incluye una o más repeticiones de Ser_{4}Gly (SEQ ID NO: 41), SerGly_{4} (SEQ ID NO: 42), Gly_{4}Ser (SEQ ID NO: 43), GlySer_{4} (SEQ ID NO: 44) o GS. En ciertas realizaciones, el ligador se selecciona para proporcionar geometría estérica entre dicho dominio catalítico y dicho resto que elige diana de forma que dicha adzima sea más eficaz frente al sustrato que tanto al dominio catalítico como al resto que elige diana solo. Por ejemplo, el ligador puede seleccionarse de forma que la adzima sea más potente que dicho dominio catalítico o resto que elige diana con respecto a la reacción con dicho sustrato. El ligador puede seleccionarse de forma que el resto que elige diana presente el sustrato respecto al dominio enzimático a una concentración eficaz al menos 5 veces superior a la que estaría presente en ausencia del resto que elige diana. Opcionalmente, el dominio catalítico (por ejemplo, los dominios catalíticos de mesotripsina de la invención) pueden ligarse directamente a la dirección/dominio que elige diana (por ejemplo, una diana que se une al andamiaje de proteína similar a inmunoglobulina) sin intervenir ligador. En otras realizaciones, el dominio catalítico (por ejemplo, los dominios catalíticos de mesotripsina de la invención) pueden ligarse a la dirección/dominio que elige diana (por ejemplo, una diana que se une al andamiaje de proteína similar a inmunoglobulina) por un péptido sin estructurar, péptido que puede tener al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 o más residuos de longitud. En una realización, el péptido sin estructurar comprende una pluralidad de aminoácidos de glicina y serina y tiene una longitud de entre 15 y 50 aminoácidos.

En una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión de cotraducción codificada por un ácido nucleico recombinante.

En ciertas realizaciones, la adzima es una fusión de inmunoglobulina en la que el dominio catalítico y el resto que elige diana se unen, en una geometría coherente con la eficacia frente al sustrato, a al menos una parte de una inmunoglobulina que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, la adzima puede comprender una primera proteína de fusión y una segunda proteína de fusión, en la que la primera proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio catalítico, y en la que la segunda proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio que elige diana que se une reversiblemente a un sitio de dirección sobre o en la proximidad funcional al sustrato. Preferentemente, las porciones de inmunoglobulina son porciones Fc que dimerizan por enlaces disulfuro.

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En ciertas realizaciones, una adzima está diseñada de manera que tenga una o más propiedades deseables con respecto a la reacción con dicho sustrato. En muchos casos, tales propiedades serán significativas para lograr el efecto deseado de la adzima sobre el sustrato. Por ejemplo, una adzima puede tener una potencia al menos 2 veces superior a la potencia del dominio catalítico o el resto que elige diana solo, y preferentemente al menos 3, 5, 10, 20 o más veces superior a la potencia del dominio catalítico o resto que elige diana solo.

En una realización, la potencia de la adzima es al menos 5 veces superior a un dominio catalítico de mesotripsina o el resto que elige diana solo.

Una adzima puede tener una k_{on} de 10^{3} M^{-1}s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{on} de 10^{4} M^{-1}s^{-1}, 10^{5} M^{-1}s^{-1}, 10^{6} M^{-1}s^{-1}, 10^{7} M^{-1}s^{-1} o superior. Una adzima puede tener una k_{cat} de 0,1 s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{cat} de 1 s^{-1}, 10 s^{-1}, 50 s^{-1} o superior. Una adzima puede tener una K_{D} que es al menos 5, 10, 25, 50 ó 100 o más veces menor que la K_{M} del dominio catalítico. Una adzima puede tener una k_{off} de 10^{-4} s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{off} de 10^{-3} s^{-1}, 10^{-2} s^{-1} o superior. Una adzima puede tener una eficiencia catalítica que es al menos 5 veces superior a la eficiencia catalítica del dominio catalítico solo, y opcionalmente una eficiencia catalítica que es al menos 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces superior a la del dominio catalítico.

En una realización, la eficiencia catalítica es al menos 10 veces superior a la de un dominio catalítico de mesotripsina solo.

Una adzima de la invención puede tener una K_{M} al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces menor que la K_{M} del dominio catalítico solo. Una adzima puede tener una concentración de sustrato eficaz que es al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces superior a la concentración de sustrato real. Una adzima puede tener un equilibrio óptimo entre selectividad y potencia de forma que la K_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} sea igual a k_{off}^{AS}/[S]_{eff}, y ambas iguales a k_{on}^{AS}[S]_{o}/[S]_{eff}. Preferentemente, la relación k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} no es superior a 10 veces diferente (más o menos), o 5 veces, 3 veces, 2 veces, el 100%, 50%, 20%, 5% o el 1% diferente de la relación de k_{off}^{AS}/[S]_{eff}. Por ejemplo, si k_{on} es 10^{6} M^{-1}s^{-1} y [S]_{0} es 10^{-12} M (pM), la adzima tiene una k_{off}^{AS} de aproximadamente 10^{-6} s^{-1} (k_{off}^{AS} = k_{on} \times [S]_{0} = 10^{-6} s^{-1}), y/o una k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} de aproximadamente 10^{-3} M^{-1} s^{-1}. En ciertas realizaciones preferidas, una adzima se diseñará de manera que combine dos o más de las propiedades descritas anteriores.

En ciertas realizaciones preferidas, el dominio catalítico de mesotripsina, cuando es activo, escinde al menos un enlace peptídico de un sustrato de polipéptido. En general se deseará diseñar la adzima de forma que sea al menos parcialmente resistente a la escisión por el dominio catalítico de mesotripsina. El dominio de proteasa puede generarse como un zimógeno (una forma inactiva) y luego activarse antes de uso. La adzima puede purificarse a partir de un cultivo celular en presencia de un inhibidor de proteasa reversible, y tal inhibidor puede incluirse en cualquier procesamiento posterior o actividades de almacenamiento.

En el caso de adzimas desveladas en el presente documento que tienen un dominio catalítico basado en mesotripsina, un resto que elige diana puede incluir esencialmente cualquier molécula o ensamblaje de moléculas que se unen al sitio de dirección (por ejemplo, sobre el sustrato en el caso de adzimas directas o sobre una molécula que se produce en proximidad funcional al sustrato en el caso de adzimas de proximidad). En muchas realizaciones, un resto que elige diana comprenderá un polipéptido o complejo de polipéptidos, y particularmente un anticuerpo o polipéptido(s) que incluyen un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, un resto que elige diana puede incluir un anticuerpo monoclonal, un Fab y F(ab)_{2}, un scFv, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera. Opcionalmente, el resto que elige diana es una proteína artificial o secuencia de péptidos manipulada para unirse al sustrato. En ciertas realizaciones, el resto que elige diana es un agente de unión polianiónico o policatiónico. Opcionalmente, el resto que elige diana es un oligonucleótido, un polisacárido o una lectina. En ciertas realizaciones, el sustrato es un receptor, y el resto que elige diana incluye un ligando (o porción de unión del mismo) que se une al receptor. En ciertas realizaciones, el sustrato es un ligando de un receptor, y el resto que elige diana incluye una porción de unión a ligando del receptor, particularmente una porción de unión a ligando soluble.

Una adzima puede usarse para elegir como diana esencialmente cualquier sustrato susceptible en una variedad de aplicaciones tecnológicas que incluyen usos terapéuticos, usos industriales, usos medioambientales y usos en microfabricaciones. En una realización preferida, un sustrato de adzima es de un mamífero tal como un roedor, un primate no humano o un ser humano. En una realización preferida, el sustrato es endógeno a un paciente humano. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula producida por una célula tal como un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido o una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el sustrato es una molécula extracelular difusible, y preferentemente una molécula de señalización extracelular que puede actuar en un receptor extracelular o intracelular para desencadenar señalización celular mediada por receptores. Opcionalmente, la molécula de señalización extracelular es una molécula de señalización de polipéptidos extracelular tal como una citocina inflamatoria. En una realización preferida, el sustrato es una interleucina 1 (por ejemplo, IL-1\alpha, IL-1\beta) o TNF-\alpha. En ciertas realizaciones, el sustrato es una hormona de polipéptido, un factor de crecimiento y/o una citocina, especialmente una citocina inflamatoria. Opcionalmente, la adzima actúa para reducir una actividad proinflamatoria de un sustrato. Un sustrato puede seleccionarse de entre los siguientes: factores de haces de cuatro hélices, factores similares a EGF, factores similares a insulina, factores de \beta-trébol y factores de nudo de cisteína. En ciertas realizaciones, el sustrato es un receptor, particularmente un receptor con alguna porción expuesta a la superficie extracelular. Opcionalmente, el sustrato es una única subunidad de receptor de un complejo de receptor heteromérico. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula que es un componente de una acumulación biomolecular tal como un depósito amiloide o una placa aterosclerótica. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula intracelular, y en tales casos puede desearse usar una adzima que puede entrar en las células elegidas como diana tales como una adzima que comprende además un resto de transcitosis que promueve la transcitosis de la adzima en la célula. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula producida por un patógeno tal como un protozoo, un hongo, una bacteria o un virus. El sustrato puede ser una proteína de prión. En una realización preferida, el sustrato es endógeno a un paciente humano. En una realización tal, la adzima es preferentemente eficaz contra el sustrato en presencia de niveles fisiológicos de una proteína de suero humano abundante tal como albúminas de suero o una globina abundante.

En un aspecto, la invención proporciona una adzima para alterar enzimáticamente un sustrato comprendiendo la adzima: un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza una reacción química que convierte dicho sustrato en uno o más productos y un resto que elige diana que reversiblemente se une a un sitio de dirección sobre dicho sustrato o a un sitio de dirección sobre una segunda molécula que se produce en la proximidad funcional al sustrato, en la que dicho resto que elige diana y dicho dominio catalítico son heterólogos entre sí, dicho resto que elige diana, cuando se proporciona por separado, se une al sustrato, dicho dominio catalítico de mesotripsina, cuando se proporciona por separado, cataliza la reacción química que convierte dicho sustrato en uno o más productos, y dicha adzima tiene una o más propiedades deseables, con respecto a la reacción con dicho sustrato.

Por ejemplo, en este aspecto, la adzima puede tener una potencia al menos 2 veces superior a la del dominio catalítico de mesotripsina o el resto que elige diana solo, y preferentemente al menos 3, 5, 10, 20 o más veces superior a la potencia del dominio catalítico de mesotripsina o resto que elige diana solo. La adzima puede tener una k_{on} de 10^{3} M^{-1}s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{on} de 10^{4} M^{-1}s^{-1}, 10^{5} M^{-1}s^{-1}, 10^{6} M^{-1}s^{-1}, 10^{7} M^{-1}s^{-1} o superior. La adzima puede tener una k_{cat} de 0,1 s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{cat} de 1 s^{-1}, 10 s^{-1}, 50 s^{-1} o superior. La adzima puede tener una K_{D} que es al menos 5, 10, 25, 50 ó 100 o más veces menor que la K_{M} del dominio catalítico. La adzima puede tener una k_{off} de 10^{-4} s^{-1} o superior, y opcionalmente una k_{off} de 10^{-3} s^{-1}, k_{off} de 10^{-2} s^{-1}, o superior. La adzima puede tener una eficiencia catalítica que es al menos 5 veces superior a la eficiencia catalítica del dominio catalítico de mesotripsina solo, y opcionalmente una eficiencia catalítica que es al menos 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces superior a la del dominio catalítico. La adzima puede tener una K_{M} al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces menor que la K_{M} del dominio catalítico de mesotripsina solo. La adzima puede tener una concentración de sustrato eficaz que es al menos 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces superior a la concentración de sustrato real. Una adzima puede tener un equilibrio óptimo entre selectividad y potencia de forma que la k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} sea igual a k_{off}^{AS}/[S]_{eff}, y ambas iguales a k_{on}^{AS}[S]_{o}/[S]_{eff}. Preferentemente, la relación k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} no es superior a 10 veces diferentes (más o menos), o 5 veces, 3 veces, 2 veces, el 100%, 50%, 20%, 5% o el 1% diferente de la relación de k_{off}^{AS}/[S]_{eff}. Por ejemplo, si k_{on} es 10^{6} M^{-1}s^{-1} y [S]_{0} es 10^{-12} M (pM), la adzima tiene una k_{off}^{AS} de aproximadamente 10^{-6} s^{-1} (k_{off}^{AS} = k_{on} \times [S]_{0} = 10^{-6} s^{-1}), y/o una k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} de aproximadamente 10^{-3} M^{-1} s^{-1}. En ciertas realizaciones preferidas, la adzima se diseñará de manera que combine dos o más de las propiedades descritas anteriores.

En ciertas realizaciones de una adzima que tiene una o más de tales propiedades, la adzima es una fusión de inmunoglobulina en la que el dominio catalítico de mesotripsina y el resto que elige diana se unen, en una geometría coherente con la eficacia frente al sustrato, a al menos una parte de una inmunoglobulina que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina. Por ejemplo, la adzima puede comprender una primera proteína de fusión y una segunda proteína de fusión, en la que la primera proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio catalítico, y en la que la segunda proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio que elige diana que se une reversiblemente a un sitio de dirección sobre o en la proximidad funcional al sustrato. Preferentemente, las porciones de inmunoglobulina son porciones Fc que dimerizan por enlaces disulfuro.

En ciertas realizaciones de una adzima que tiene una o más de las propiedades descritas anteriormente con respecto a la reacción con el sustrato, el sustrato es una biomolécula producida por una célula tal como un polipéptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido o una molécula pequeña. En ciertas realizaciones, el sustrato es una molécula extracelular difusible, y preferentemente una molécula de señalización extracelular que puede actuar en un receptor extracelular o intracelular para desencadenar señalización celular mediada por receptores. Opcionalmente, la molécula de señalización extracelular es una molécula de señalización de polipéptidos extracelular tal como una citocina inflamatoria. En una realización preferida, el sustrato es una interleucina 1 (por ejemplo, IL-1\alpha, IL-1\beta) o a TNF- \alpha. En ciertas realizaciones, el sustrato es una hormona de polipéptido, un factor de crecimiento y/o una citocina, especialmente una citocina inflamatoria. Opcionalmente, la adzima actúa para reducir una actividad proinflamatoria de un sustrato. Un sustrato puede seleccionarse del grupo que está constituido por factores de haces de cuatro hélices, factores similares a EGF, factores similares a insulina, factores de \beta-trébol y factores de nudo de cisteína. En ciertas realizaciones, el sustrato es un receptor, particularmente un receptor con alguna porción expuesta a la superficie extracelular. Opcionalmente, el sustrato es una única subunidad de receptor de un complejo de receptor heteromérico. En ciertas realizaciones, la biomolécula es un componente de una acumulación biomolecular tal como un depósito amiloide o una placa aterosclerótica. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula intracelular y, en tales casos, puede desearse usar una adzima que puede entrar en las células elegidas como diana tales como una adzima que comprende además un resto de transcitosis que promueve la transcitosis de la adzima en la célula. En ciertas realizaciones, el sustrato es una biomolécula producida por un patógeno tal como un protozoo, un hongo, una bacteria o un virus. El sustrato puede ser una proteína de prión. En una realización preferida, el sustrato es endógeno a un paciente humano. En una realización tal, la adzima es preferentemente eficaz contra el sustrato en presencia de niveles fisiológicos de una proteína de suero humano abundante tal como albúminas de suero o una globina abundante.

En ciertos aspectos, la invención proporciona preparaciones de adzimas para uso en una aplicación deseada tal como un uso terapéutico, un uso industrial, un uso medioambiental o en una microfabricación. Tales preparaciones pueden llamarse preparaciones de adzimas. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una preparación de adzima para uso terapéutico en un paciente humano comprendiendo la preparación cualquier adzima desvelada en el presente documento. Opcionalmente, la preparación comprende además un vehículo farmacéuticamente eficaz. Opcionalmente, la preparación de adzima se formula de forma que se inhibe la modificación autocatalítica de la adzima. Como la adzima comprende un dominio catalítico que es una proteasa, en ciertas realizaciones, la preparación comprende un inhibidor reversible de dicha proteasa, preferentemente un inhibidor reversible que es seguro para la administración a un paciente humano. Opcionalmente, una preparación de adzima para uso terapéutico está sustancialmente libre de pirógenos. Una preparación de adzima puede embalarse junto con instrucciones de uso. Por ejemplo, una preparación de adzima para uso terapéutico puede embalarse con instrucciones para administración a un paciente.

Por tanto, un aspecto de la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende la adzima basada en mesotripsina de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente eficaz. En una realización, la preparación farmacéutica se formula de forma que se inhibe la proteolisis autocatalítica de la adzima. En una realización, la preparación farmacéutica comprende además un inhibidor reversible del dominio de la proteasa mesotripsina. En una realización, el inhibidor reversible es seguro para administración a un paciente humano.

En ciertos aspectos, la invención proporciona procedimientos para preparar un medicamento para uso en el tratamiento de un trastorno que está asociado a una actividad del sustrato de cualquier adzima desvelada en el presente documento comprendiendo el procedimiento formular la adzima para administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un medicamento para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o alérgico comprendiendo el procedimiento formular una adzima para administración a un paciente humano en necesidad del mismo, en el que el sustrato de la adzima es una citocina inflamatoria.

En ciertos aspectos, la invención se refiere a la adzima para uso en procedimientos para tratar un trastorno que está asociado a una actividad del sustrato de una adzima comprendiendo el procedimiento administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una adzima a un paciente humano en necesidad del mismo. En ciertas realizaciones, una adzima puede ser para uso en un procedimiento para tratar un trastorno inflamatorio o alérgico comprendiendo el procedimiento administrar una dosis terapéuticamente eficaz de una adzima a un paciente humano en necesidad del mismo, en el que el sustrato de la adzima es una citocina inflamatoria.

En ciertos aspectos, la invención proporciona una adzima para inhibir la actividad de un polipéptido sustrato siendo la adzima un complejo de fusión de inmunoglobulina que comprende: una primera proteína de fusión unida a una segunda proteína de fusión, en la que la primera proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la escisión proteolítica de al menos un enlace peptídico del polipéptido sustrato, y en la que la segunda proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio que elige diana que se une a un sitio de dirección sobre dicho polipéptido sustrato, en la que dicho dominio que elige diana y dicho dominio de proteasa son discretos y heterólogos entre sí.

En ciertos aspectos, la invención proporciona una mesotripsina estabilizada que comprende uno o más cambios de secuencias de aminoácidos en sitios potencialmente autoproteolíticos, en la que dicho cambios no disminuyen sustancialmente la actividad catalítica de dicha mesotripsina. En una realización, los sitios potencialmente autoproteolíticos comprenden Arg o Lys. En una realización, los sitios potencialmente autoproteolíticos comprenden uno o más de: K98, R122, K159 y K193. En una realización, los cambios comprenden uno o más de: K98Q, R122H, K159Q y K193A. En una realización, la actividad aparente de la mesotripsina estabilizada es al menos aproximadamente 3 veces superior a la mesotripsina natural. En una realización, la mesotripsina estabilizada conserva sustancialmente la misma actividad durante un periodo de al menos aproximadamente 2 días, preferentemente aproximadamente 3, 4, 5, 6, 10 o más días. En ciertos aspectos, la invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de las mesotripsinas estabilizadas objeto. En ciertos aspectos, la invención proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de la mesotripsina estabilizada, cualquiera del polinucleótido que codifica la mesotripsina estabilizada o cualquier vector que comprenda un polinucleótido que codifica cualquiera de las mesotripsinas estabilizadas objeto. Otro aspecto de la invención proporciona cualquier adzima que comprenda un dominio catalítico derivado de la mesotripsina estabilizada de la invención.

En ciertos aspectos, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas porciones de polipéptido de la adzima descritas en el presente documento (incluyen los dominios catalíticos de mesotripsina, los ligadores si están presentes y/o los dominios de dirección), y particularmente ácidos nucleicos recombinantes que codifican una adzima de proteínas de fusión. Tales ácidos nucleicos pueden incorporarse en un vector de expresión en el que el vector de expresión dirige la expresión de la adzima a una célula huésped adecuada. La invención proporciona además células que comprenden tales ácidos nucleicos y vectores. En ciertas realizaciones, la invención proporciona células que comprenden un primer ácido nucleico que comprende una primera secuencia codificante y un segundo ácido nucleico que comprende una segunda secuencia codificante, en las que la primera secuencia codificante codifica una primera proteína de fusión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio catalítico, y en las que la segunda secuencia codificante codifica una segunda proteína de fusión que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio que elige diana. Preferentemente, tal célula, en condiciones de cultivo apropiadas, secreta una adzima que comprende un constructo de proteínas de fusión Fc que es un dímero de la primera proteína de fusión y la segunda proteína de fusión.

En ciertos aspectos, la invención proporciona procedimientos para preparar una mesotripsina objeto (incluyendo el mutante estabilizante) o adzima. Tales procedimientos pueden incluir la expresión de componentes de polipéptido en células. Tales procedimientos pueden incluir unión química de diversos componentes de adzimas o diversas mesotripsinas. En una realización, un procedimiento comprende cultivar una célula que tiene un vector de expresión para producir una adzima de proteínas de fusión en condiciones que hacen que la célula produzca la adzima codificada por el vector de expresión; y purificar la adzima hasta pureza sustancial. En una realización, un procedimiento comprende cultivar una célula diseñada para producir una fusión de inmunoglobulina (o mesotripsinas) en condiciones que hacen que la célula produzca la adzima (o las mesotripsinas) codificada por el vector de expresión; y purificar la adzima o mesotripsina hasta pureza sustancial. En ciertas realizaciones, purificar un polipéptido hasta pureza sustancial incluye el uso de un inhibidor reversible que inhibe la actividad autocatalítica del dominio catalítico, y particularmente, en el que el dominio catalítico de la adzima es un dominio de proteasa, y en el que purificar el polipéptido hasta pureza sustancial incluye el uso de un inhibidor de proteasa reversible que inhibe la actividad de proteasa del dominio catalítico.

En ciertos aspectos, la adzima objeto puede diseñarse para modificar una diana de manera que aumente su inmunogenicidad dando como resultado una respuesta inmunitaria, bien celular o humoral o ambas, dirigida a epítopes que también existen en las proteínas nativas. De esta forma, una adzima puede usarse para romper la tolerancia con un "auto"antígeno tal como un antígeno expresado en una célula tumoral o un inhibidor de factor de crecimiento. En otros casos, la adzima puede usarse para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno extraño tal como la de un patógeno (bacteria, virus, parásito, etc.).

En otros aspectos, la invención proporciona procedimientos para diseñar y producir adzimas con propiedades deseables y procedimientos para explotar un negocio que implica diseñar y comercializar adzimas con propiedades deseables tales como adzimas terapéuticamente eficaces.

Las realizaciones y prácticas de la presente invención, otras realizaciones y sus rasgos y características serán evidentes a partir de la descripción, figuras y reivindicaciones que siguen. Además, todas las realizaciones de la invención, tanto si se describen bajo los mismos aspectos como aspectos diferentes de la invención, pueden combinarse entre sí siempre que sean apropiados.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1J son representaciones esquemáticas de la estructura de una serie de constructos diferentes a modo de ejemplo que expresan la invención. Los recuadros representan restos que tienen propiedades de unión o catalíticas y puede expresarse como dominios de proteínas reales, es decir, secuencias unidas de aminoácidos que forman estructuras caracterizadas por plegamiento de la cadena de péptidos en hélices alfa, hojas plegadas beta, ovillos aleatorios, etc., para formar superficies de unión separadas o sitios enzimáticamente activos, y que incluyen restos catalíticos (CAT), restos de dirección (DIR) y dominios de proteínas que sirven para asociar estas partes juntas en diversas configuraciones operativas. Las líneas que conectan los recuadros representan un enlace covalente que liga juntos la secuencia de aminoácidos que define las regiones funcionales respectivas, o ligadores que comprenden, por ejemplo, un ligador lineal flexible tal como una serie de aminoácidos unidos a péptidos o una cadena de poli(etilenglicol). Las líneas entre los recuadros representan uniones reversibles no covalentes en las que las partes se mantienen juntas por una combinación de fuerzas tales como enlaces de hidrógeno, interacción hidrófoba-hidrófoba, emparejamiento de cargas opuestas, etc., por ejemplo, interacciones ligando-receptor.

La Figura 1K es un diagrama esquemático que ilustra el concepto básico de una adzima contingente.

Las Figuras 2A-2J son dibujos que ilustran diversas realizaciones a modo de ejemplo de constructos de adzima en diversos tipos de biomoléculas elegidas como diana en posición parar iniciar una reacción enzimática sobre el sitio de sustrato de la diana. La dirección se designa AD, el dominio catalítico CD.

Las Figuras 3A-3G son dibujos que ilustran diversas realizaciones a modo de ejemplo de constructos de adzimas contingentes en ausencia de y en la proximidad de sus biomoléculas elegidas como diana previstas respectivas.

La Figura 4 es un dibujo que ilustra componentes de una adzima pretrombina-scFv\alphaHA.

La Figura 5 es un análisis electroforético de adzima modelo purificada.

La Figura 6 es análisis de transferencia de Western de adzima modelo activada usando el factor Xa.

La Figura 7 muestra la actividad proteolítica de trombina y adzima modelo antes de y después de la activación sobre sustrato tripeptídico de trombina patrón.

La Figura 8 muestra que la actividad de adzima potenciada se acciona por la presencia de un dominio de dirección.

La Figura 9 muestra que la actividad de adzima potenciada requiere enlace de cotraducción de los dominios.

La Figura 10 muestra la inactivación proteolítica de la citotoxicidad de TNF\alpha.

La Figura 11 muestra que el dominio de dirección p55 del receptor de TNF\alpha soluble se une a TNF\alpha.

La Figura 12 es una expresión representativa de varios constructos de adzimas como se analizan por transferencia de Western con anticuerpo anti-myc. Carril 1: tripsinógeno expresado en ausencia de benzamidina estabilizante, Carril 2: tripsinógeno, Carril 3: tripsinógeno-0aa-sp55, Carril 4: tripsinógeno-20aa-sp55; Carril 5: tripsinógeno-3aa-sp55, Carril 6: sp55. El material en los carriles 2 a 6 se expresó en presencia de benzamidina 1 mM.

La Figura 13 muestra una instantánea de experimentos representativos en los que la fluorescencia detectada al final de 2 horas de incubación se compara para las diferentes adzimas recombinantes y otras proteínas de control.

La Figura 14 muestra la normalización de actividades de tripsina.

La Figura 15 muestra la detección de la unión a TNF\alpha de adzimas por ELISA.

La Figura 16 muestra resultados de modelos cinéticos que comparan el rendimiento de una adzima, una dirección y una enzima.

La Figura 17 muestra resultados de modelos cinéticos que indican que hay una relación entre potencia y selectividad cuando cambia la concentración del dominio de enzima.

La Figura 18 muestra que se necesita un exceso molar de mesotripsina para inactivar TNF en el bioensayo de L929.

La Figura 19 muestra actividades proteolíticas en gran parte equivalentes de enzima y adzima hacia el péptido sintético t-GPR-AMC, que se mete en el sitio activo de la proteasa.

La Figura 20 demuestra que la adzima es más selectiva que la enzima.

La Figura 21 demuestra que la adzima es más potente que el agente de unión estequiométrico.

La Figura 22 muestra la escisión de TNF por diferentes concentraciones de adzimas, pero no es apreciable por la enzima mesotripsina correspondiente. 15 \mul de reacciones de digestión durante la noche se sometieron a electroforesis en condiciones no reductoras desnaturalizantes en un gel de Tris glicina-SDS al 10-20%, se transfirieron a nitrocelulosa y luego se transfirieron con anticuerpo anti-TNF (Abcam 9348) a 1:1000. Carril 1: Mesotripsina 86 nM + TNF 100 nM; Carril 2: Mesotripsinógeno 86 nM + TNF 100 nM; Carril 3: Mesotripsina_35aa_p55_2.6 86 nM + TNF 100 nM; Carril 4: Mesotripsinógeno_35aa_p55_2.6 86 nM + TNF 100 nM; Carril 5: Mesotripsina 43 nM + TNF 100 nM; Carril 6: Mesotripsinógeno 43 nM + TNF 100 nM; Carril 7: Mesotripsina_35aa_p55_2.6 43 nM + TNF 100 nM; Carril 8: Mesotripsinógeno_35aa_p55_2.6 43 nM + TNF 100 nM; Carril 9: Mesotripsina 22 nM + TNF 100 nM; Carril 10: Mesotripsinógeno 22 nM + TNF 100 nM; Carril 11: Mesotripsina_35aa_p55_2.6 22 nM + TNF 100 nM; Carril 12: Mesotripsinógeno_35aa_p55_2.6 22 nM + TNF 100 nM; Carril 13: TNF 100 nM; Carril 14: TNF 100 nM + EC.

La Figura 23, en la que los paneles (a) y (b) muestran la bioactividad de TNF después de digestiones durante la noche como se ensaya usando la viabilidad de células L929.

La Figura 24 ilustra el requisito de activación para meso_Sc7 para demostrar el comportamiento de adzimas, es decir, inactivación de TNF a la relación subestequiométrica de 1:10. La pérdida de TNF bioactivo observado en la Figura 23 no puede provenir de la neutralización de TNF por el dominio de dirección solo ya que ni la adzima inactivada ni sc7 tienen ningún efecto sobre TNF.

La Figura 25 muestra el efecto de la longitud del ligador (0-60 aminoácidos) sobre la actividad de adzima.

La Figura 26 muestra la secuencia codificante de mesotripsina con las mutaciones estabilizantes.

La Figura 27 demuestra que la adzima estable con las mutaciones estabilizantes (línea continua) presenta propiedades significativamente superiores como se muestra por la inactivación superior a 2 logaritmos de TNF.

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Descripción detallada de la invención I. Visión general

La invención proporciona una nueva clase de constructos de proteínas manipulados, denominados en el presente documento "adzimas", además de procedimientos y composiciones relacionados con el uso y la producción de adzimas. Las adzimas son constructos de proteínas quiméricas que unen uno o más dominios catalíticos con uno o más restos que eligen diana (o "direcciones"). Los dominios catalíticos y los restos que eligen diana no necesitan ser entidades separadas. En ciertas realizaciones, los restos que eligen diana/direcciones se introducen dentro de los dominios catalíticos. Un dominio catalítico de una adzima tiene un sitio enzimáticamente activo que cataliza una reacción que convierte un sustrato preseleccionado (la "diana" o "sustrato elegido como diana") en uno o más productos tales como por escisión, modificaciones químicas (transformaciones) o isomerización. Generalmente, el dominio catalítico se selecciona de forma que uno o más del (de los) producto(s) de la reacción mediada por adzimas tenga una actividad cualitativamente o cuantitativamente diferente con respecto al sustrato seleccionado. Simplemente para ilustrar, la adzima puede alterar tales características funcionales de un sustrato seleccionado como afinidad, potencia, selectividad, solubilidad, inmunogenicidad, semivida, eliminación (tal como por la función renal o hepática), biodistribución u otras propiedades farmacocinéticas. En ciertos casos, el producto de una reacción mediada por adzimas es por sí mismo un antagonista de una actividad del sustrato seleccionado.

Según la invención, el dominio catalítico es el de una mesotripsina de la invención que incluye sus fragmentos funcionales, derivados, variantes, homólogos y mutantes estabilizantes de la misma.

En una realización preferida, el resto diana es una proteína de andamiaje de polipéptido, preferentemente una que tiene un pliegue similar a inmunoglobulina, que se une al sustrato elegido como diana. Un ejemplo de un andamiaje adecuado es el dominio FN3 (particularmente el 10º dominio FN3 de fibronectina) que tiene un pliegue similar a inmunoglobulina que presenta al menos tres porciones de bucle que pueden modificarse combinatoriamente para generar un espectro diverso de actividades de unión a diana. Aunque el dominio catalítico de mesotripsina y el resto que elige diana de andamiaje de polipéptido son realizaciones independientes, se contemplan las adzimas que tienen un dominio catalítico de mesotripsina y un resto que elige diana de andamiaje de polipéptido.

El resto que elige diana (o "dirección") es un resto que puede reconocer y unirse reversiblemente a un "sitio de unión a dirección" predeterminado (también en el presente documento "sitio de dirección") tal como, por ejemplo, una biomolécula soluble o unida a membrana o un componente de una acumulación biomolecular (por ejemplo, una placa u otro agregado que contiene proteína insoluble). En ciertos tipos de adzimas (llamadas "adzimas directas"), el resto que elige diana se une a la molécula diana. En ciertos tipos de adzimas (llamadas "adzimas de proximidad"), el resto que elige diana se une a una molécula que tiende a producirse en proximidad funcional a la diana. El término "resto" debe entenderse que incluye moléculas individuales o porciones de las mismas (por ejemplo, un polipéptido o azúcar que se une al sitio de unión de dirección), además de combinaciones de moléculas (por ejemplo, un anticuerpo que se une a un sitio de unión de dirección).

En una adzima, al menos un resto que elige diana está operativamente asociado a al menos un dominio catalítico. Una adzima puede ser una única cadena de polipéptidos (por ejemplo, una proteína de fusión) o un ensamblaje de cadenas de polipéptidos y/u otras moléculas que se unen mediante enlaces covalentes o no covalentes. Independientemente de cómo están asociadas las porciones constituyentes de una adzima, al menos un resto que elige diana y un dominio catalítico deben estar operativamente asociados. El término "operativamente asociado" como se usa en el presente documento para describir la relación entre un dominio catalítico y un resto que elige diana significa que la eficacia del dominio catalítico asociado y el resto que elige diana en alterar químicamente o por lo demás afectar la actividad del sustrato preseleccionado es superior a la eficacia de tanto el resto que elige diana como del dominio catalítico solo, y también superior a la eficacia de tanto el resto que elige diana como el dominio catalítico cuando se proporcionan en combinación, pero no en asociación entre sí (por ejemplo, cuando la diana se pone simultáneamente en contacto con tanto un dominio catalítico discreto como un resto que elige diana discreto). Como se describe más adelante, la adzima también puede incluir otros componentes tales como ligadores, restos que influyen la estabilidad o biodistribución y similares.

En ciertas realizaciones, las adzimas pueden contener dominio(s) catalítico(s) separado(s) y dominio(s) de dirección conectados por ligadores, o por lo demás operativamente asociados por otros medios (véase más adelante). Preferentemente, el dominio catalítico y el dominio de dirección son proteínas heterólogas no naturalmente asociadas entre sí.

En ciertas otras realizaciones pueden construirse adzimas en las que el (los) dominio(s) de dirección se introduce(n)
dentro del dominio catalítico de una enzima.

Las adzimas novedosas basadas en el dominio catalítico de mesotripsina, pero dirigidas hacia otras dianas, particularmente dianas heterólogas, pueden construirse usando procedimientos de ADN recombinante ligando diversos dominios de dirección específicos de diana al dominio catalítico de mesotripsina. Más específicamente, usando cualquiera de muchos programas de alineamiento de secuencias reconocidos en la técnica, tales como DNAStar's MegaAlign, pueden alinearse múltiples homólogos de mesotripsina. El alineamiento puede usarse para diseñar mutantes estabilizantes (véase más adelante).

Los dominios de dirección adecuados para adzimas de esta forma pueden ser péptidos constreñidos o no constreñidos, scFvs, Fabs, receptores solubles, citocinas solubles y factores de crecimiento, y otros andamiajes de proteínas que han sido preseleccionados por su capacidad para unirse a la diana de interés. La inserción de dominios de dirección en el dominio catalítico puede facilitarse adicionalmente incluyendo ligadores de polipéptidos (por ejemplo, (GGGGS)n, (GS)n) en el extremo N y/o C del dominio de dirección, asegurando que los dominios de dirección puedan plegarse correctamente y están óptimamente dispuestos para el ajuste de las dianas.

La eficacia de una adzima con respecto a sus partes constituyentes puede evaluarse en una variedad de formas. Por ejemplo, la eficacia puede evaluarse en términos de potencia de la adzima, con respecto a sus partes componentes, para afectar una actividad biológica del sustrato preseleccionado. Como otro ejemplo, la eficacia puede evaluarse en términos de una comparación de constantes cinéticas o de equilibrio que describe la reacción entre la adzima y el sustrato preseleccionado con aquellas que se aplican a la reacción entre las partes de componentes y el sustrato elegido como diana. En realizaciones en las que una adzima se pretende para uso en un mamífero, al menos un dominio catalítico y al menos un resto que elige diana de una adzima se asociarán de forma que estas porciones estén operativamente asociadas bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo, en sangre completa, suero, condiciones de cultivo celular o solución salina tamponada con fosfato, pH 7). Si la adzima se pretende para otros fines (por ejemplo, la modificación de un contaminante medioambiental o la modificación de un componente de una reacción molecular), al menos un dominio catalítico y al menos un resto que elige diana de una adzima se asociarán de forma que estas porciones estén operativamente asociadas bajo las condiciones de reacción esperadas o deseadas.

Simplemente para ilustrar, una adzima puede comprender un dominio catalítico que escinde o por lo demás modifica el TNF-\alpha convirtiéndolo en uno o más productos que tienen actividad reducida, no tienen actividad ni actividad antagonista, mejorando así un estado de enfermedad asociado a TNF-\alpha tal como artritis reumatoide u otras afecciones asociadas a la actividad de TNF-\alpha.

Aunque no se desea quedar ligado a ningún mecanismo de acción particular, se espera que un resto que elige diana se una al sustrato preseleccionado elegido como diana (adzima directa) o a otra molécula que se produce en la misma proximidad que el sustrato preseleccionado elegido como diana (adzima de proximidad), y así funcione para aumentar la concentración del dominio catalítico en o cerca del sustrato elegido como diana. De esta forma, la adzima es autoconcentrante en o en la proximidad de un sustrato elegido como diana y tiene una eficacia potenciada para reaccionar con y alterar la actividad del sustrato elegido como diana, con respecto a los dominios catalíticos o de unión solos. Como consecuencia de la eficacia mejorada de la reacción elegida como diana, la adzima tiene una selectividad y/o eficiencia catalítica superior para el sustrato elegido como diana con respecto a otros (posibles) sustratos no elegidos como diana del dominio catalítico.

De nuevo, aunque no se desea quedar ligado a ninguna teoría particular, para ciertas adzimas se espera que sea deseable una velocidad k_{on} relativamente rápida para el sustrato elegido como diana. En una realización, tal alta velocidad k_{on} es particularmente beneficiosa para mejorar la potencia de la adzima. Una k_{on} de al menos 10^{3} M^{-1}s^{-1}, preferentemente 10^{6} M^{-1}s^{-1} M^{-1}s^{-1}, puede ser deseable. A continuación se describen otros parámetros cinéticos y de realización que pueden ser útiles en ciertas realizaciones.

Además, aunque no se desea quedar ligado a ninguna teoría particular, para ciertas adzimas se espera que las adzimas sean particularmente ventajosas a concentraciones de diana algo superiores.

En la mayoría de las realizaciones, los componentes modulares de una adzima son heterólogos entre sí, que significa que estos dominios no se encuentran naturalmente como parte de una única molécula o ensamblaje de moléculas y, por consiguiente, las adzimas de estas realizaciones no son sustancias que se producen naturalmente. Cada uno de los diversos dominios y restos que están presentes en una adzima pueden por sí mismos ser una proteína que se produce naturalmente o fragmento de proteína u otra biomolécula que se produce naturalmente (por ejemplo, un azúcar, lípido o factor no proteináceo), o una molécula manipulada o completamente sintética.

En la mayoría de las realizaciones, un dominio catalítico comprenderá un polipéptido que tiene actividad enzimática. En ciertas realizaciones preferidas, un resto que elige diana comprenderá un polipéptido. En general, al menos un dominio catalítico y al menos un resto que elige diana de la adzima se seleccionan de entre entidades "modulares", es decir, pueden actuar independientemente de catalizador o agente de unión. Para ejemplificar, una adzima puede ser una única proteína de fusión que comprende (1) un dominio catalítico que comprende un polipéptido y tiene actividad enzimática y (2) un dominio que elige diana que comprende un polipéptido y se une a un sitio de unión de dirección, y, opcionalmente, (3) un ligador de polipéptido configurado de forma que el dominio catalítico y el dominio que elige diana estén operativamente asociados. Como otro ejemplo, una adzima puede ser un tipo de constructo de fusión de inmunoglobulina en la que una primera proteína de fusión comprende un dominio catalítico fusionado a una primera cadena de Fc y una segunda proteína de fusión comprende un dominio que elige diana fusionado a una segunda cadena de Fc, y en el que la primera y segunda cadena de Fc están asociadas de tal forma que hacen que el dominio catalítico y el dominio que elige diana estén operativamente asociados.

Dentro de la amplia categoría de adzimas pueden identificarse diversas subcategorías o clases de adzimas. Como se observa anteriormente, dos clases tales se llaman en el presente documento adzimas "directas" y adzimas "de proximidad". En una adzima directa, el resto que elige diana se une a un sustrato elegido como diana. El dominio catalítico actúa sobre el mismo tipo de molécula al que se ha unido el resto que elige diana. En ciertas realizaciones, esto requerirá que el resto que elige diana se disocie del sustrato elegido como diana con el fin de que el dominio catalítico altere esa molécula. Dependiendo de una variedad de condiciones, tales como la concentración de la adzima directa y la concentración del sustrato elegido como diana, el dominio catalítico de una adzima directa puede actuar principalmente sobre el sustrato elegido como diana que está o estaba unido por el resto que elige diana, o la adzima directa puede actuar sobre un sustrato mientras que el resto que elige diana está unido a otro. Aunque no se desea quedar ligado a un mecanismo, generalmente se espera que cuando el sustrato elegido como diana esté presente en concentraciones relativamente bajas (como es el caso para la mayoría de las moléculas de señalización extracelular en los fluidos extracelulares de un organismo multicelular), una adzima directa actúe principalmente sobre el sustrato elegido como diana que está o estaba unido por el resto que elige diana. En una adzima de proximidad, el resto que elige diana se une a una molécula que no es covalentemente parte del sustrato elegido como diana. En su lugar, el resto que elige diana se une a una molécula que se espera se encuentre en la proximidad funcional al sustrato elegido como diana. Por "proximidad funcional" se indica que el sitio de unión de dirección está presente a suficiente concentración o con suficiente estabilidad en la proximidad de sustratos elegidos como diana tal que la adzima reaccione con el sustrato elegido como diana con eficacia superior al dominio catalítico y el resto que elige diana solo o en combinación no asociada. Aunque la existencia de proximidad funcional entre un sitio de unión de dirección y un sustrato elegido como diana se evalúa más exactamente en el medio en el que la adzima se pretende para uso (por ejemplo, en el cuerpo humano, en un sitio de suelo contaminado), una adzima puede considerarse una adzima de proximidad si muestra la eficacia apropiada en un sistema experimental razonable tal como un cultivo de células relacionadas con el tipo de células que se predice que van a elegirse como diana por la adzima, o en una mezcla de proteínas purificadas en la que el sitio de unión de dirección y la adzima están presentes a concentraciones que casi se aproximan a las que se esperan en el medio previsto. En ciertas realizaciones, el resto que elige diana se une a una molécula que está difusionalmente limitada con respecto al sustrato elegido como diana, que significa que, por cualquier razón, el sustrato elegido como diana y el sitio de unión de dirección no están ni covalentemente unidos ni libres de difusión. Por ejemplo, el resto que elige diana puede unirse a una proteína en un complejo receptor mientras que el dominio catalítico actúa sobre otra proteína en el complejo receptor. Como otro ejemplo, el resto que elige diana puede unirse a una proteína que está depositada en membranas celulares y el sustrato elegido como diana también puede depositarse en o unirse a membranas celulares. Los términos "adzima directa" y "adzima indirecta", aunque son conceptos distintos que plantean cuestiones diferentes en el diseño de adzimas, no puede ser, en la práctica, completamente mutuamente exclusivos. Por ejemplo, un resto que elige diana puede unirse tanto al sustrato elegido como diana como a una molécula separada que se produce en proximidad funcional al sustrato elegido como diana.

Una clase apreciable adicional de adzimas son las "adzimas contingentes". El término "adzimas contingentes" se refiere a constructos de adzimas que están catalíticamente activados o regulados por incremento en la proximidad del sustrato elegido como diana pero son menos activos, tal como por inhibición, en otra parte. Tanto las adzimas directas como de proximidad pueden modificarse para ser adzimas contingentes en las que la interacción del dominio que elige diana con su componente afín altera la actividad del dominio catalítico tal como por mecanismos alostéricos, competitivos o no competitivos.

Como un ejemplo descriptivo se ha usado una variedad de anticuerpos con afinidad por dianas particulares (por ejemplo, receptor anti-TNF-a y anti-EGF) como agentes terapéuticos eficaces para ciertos trastornos y se espera, según las enseñanzas en el presente documento, que puedan diseñarse las adzimas con potencia superior a los anticuerpos solos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una adzima de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable, además de procedimientos para preparar un medicamento para uso en un ser humano combinando una adzima con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una adzima de la invención para uso en un procedimiento para tratar un sujeto, por ejemplo, un ser humano que padece una enfermedad. El procedimiento incluye administrar (por ejemplo, usando una formulación farmacéutica) una cantidad terapéuticamente, profilácticamente o analgésicamente eficaz de una adzima, tratándose así un sujeto que padece una enfermedad. En una realización, la enfermedad está asociada a una molécula soluble y la adzima se administra al sujeto en una cantidad eficaz para hacer la molécula soluble biológicamente inactiva.

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II. Definiciones

Por conveniencia, se recogen aquí ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención.

Como se usa en el presente documento, el término "aptámero", cuando se refiere a un resto que elige diana, engloba un oligonucleótido que interactúa con un sustrato elegido como diana o molécula asociada, por ejemplo, se une al sitio de dirección para una adzima.

Como se usa en el presente documento, el término "biológicamente inactivo" como se refiere a una biomolécula elegida como diana pretende significar que su función biológica está regulada por disminución, por ejemplo, suprimida o eliminada. Por ejemplo, si la diana es TNF\alpha, la inactivación biológica incluiría modificar TNF\alpha de forma que la respuesta inflamatoria mediada por NFKB se inhibiera, hay inhibición de la secreción de otras citocinas proinflamatorias, se inhibe la inducción de actividad procoagulante endotelial del TNF; se inhibe la unión de TNF a receptores sobre células endoteliales; la inducción de deposición de fibrina en el tumor y las actividades de regresión tumoral del TNF se potencian; y/o la citotoxicidad y las actividades de unión a receptor del TNF están inafectadas o potenciadas en células tumorales. Por ejemplo, un dominio catalítico que puede metilar TNF\alpha (por ejemplo, metilar TNF\alpha en ^{15}His como se describe en Yamamoto R. y col. (1989) Protein Engineering 2(7): 553-8) inactivaría TNF\alpha.

El término "k_{cat}", o el "número de renovación", es el número de sustratos convertidos en producto por molécula de enzima por unidad de tiempo cuando E se satura con sustrato.

El término "k_{cat}/K_{M}", es una constante de velocidad de segundo orden aparente que es una medida de cómo trabaja la enzima cuando la concentración de sustrato es baja (por ejemplo, no saturante). El límite superior para k_{cat}/K_{M} es el límite de difusión - es decir, la velocidad a la que la enzima y el sustrato difunden juntos. k_{cat}/K_{M} también se conoce como la "eficiencia catalítica" para la enzima.

El término "eficiencia catalítica", como se aplica a una adzima, es la constante de velocidad de segundo orden aparente de la adzima cuando la concentración de sustrato es sustancialmente (al menos diez veces) más baja que la constante de Michaelis-Menten (K_{M}) para la adzima (es decir, cuando [S]<< K_{M}), al menos con respecto a aquellas adzimas que pueden modelarse razonablemente usando teorías de modelación cinética de Michaelis-Menten. En el caso de muchos dominios catalíticos simples tomados aislados, la eficiencia catalítica puede definirse como la relación k_{cat}/K_{M} (véase anteriormente).

En la mayoría de los casos en los que se aplica el modelo de Michaelis-Menten, la eficiencia catalítica será diferente para la adzima y para su enzima componente, es decir, la eficiencia catalítica de la adzima no es k_{cat}/K_{M}. Tanto v_{máx} como K_{M} también son diferentes para la adzima. Para un caso en el que el análisis de estado seudoestacionario de Michaelis-Menten sea válido (generalmente [AE]_{o} << [S]_{o}, en la que [AE]_{o} es la concentración de adzima inicial, [S]_{o} es la concentración de sustrato inicial) y el retraso de sustrato es despreciable, las expresiones de forma cerrada simples para estas cantidades pueden derivarse:

1

en las que v_{máx}^{AE} y v_{máx}^{E} son la velocidad máxima para la adzima y su componente de enzima, respectivamente; K_{M}^{AE} y K_{M}^{E} son la K_{M} para la adzima y su componente de enzima, respectivamente. El superíndice "AS" indica que la constante cinética es la de una dirección/resto que elige diana que se determina por experimentos independientes en la dirección; el superíndice "ES" o "E" indica que la constante cinética es la de una enzima/resto catalítico que se determina por experimentos independientes en la enzima. [S]_{ef} o la "concentración eficaz" del sustrato elegido como diana es un parámetro geométrico de la adzima con unidades de concentración. k_{off} y k_{on} son constantes cinéticas usadas para describir la unión entre, por ejemplo, adzima, y una molécula diana.

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La eficiencia catalítica de una adzima es:

2

Un "constructo de proteínas quiméricas" es un ensamblaje que comprende al menos dos restos heterólogos, por ejemplo, un dominio catalítico y una dirección que son heterólogos entre sí, que están covalentemente o no covalentemente asociados para formar un complejo. Un constructo de proteínas quiméricas puede comprender moléculas no proteináceas.

"Diferenciación" en el presente contexto significa la formación de células que expresan marcadores conocidos por estar asociados a células con diferentes propiedades funcionales o células que están más especializadas y más próximas a llegar a ser células terminalmente diferenciadas incapaces de división o diferenciación adicional.

Una "proteína de fusión" es una proteína quimérica en la que al menos dos secuencias de aminoácidos heterólogos están covalentemente unidos mediante un enlace de esqueleto de amida, por ejemplo, para formar un polipéptido contiguo.

Como se usa en el presente documento, los términos "modular" o "alterar" la actividad del sustrato elegido como diana pretenden incluir inhibir, estimular, regular por incremento, regular por disminución, activar, inactivar o modificar la actividad de la diana de cualquier otra forma.

Una secuencia de polinucleótidos (ADN, ARN) está "operativamente ligada" a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótidos. El término "operativamente ligado" incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) enfrente de la secuencia de polinucleótidos que va a expresarse y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótidos bajo el control de la secuencia de control de la expresión, y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótidos.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo.

Las expresiones "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" también se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "proteína" es un polímero que está esencialmente constituido por cualquiera de los 20 aminoácidos. Por consiguiente, una proteína puede incluir diversas modificaciones (por ejemplo, glicosilación, fosforilación) o no aminoácidos. Aunque "polipéptido" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos relativamente grandes y "péptido" se usa frecuentemente en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica están solapados y es variado.

Como se usa en el presente documento, "proliferar" y "proliferación" se refieren a células que experimentan mitosis.

La Unión internacional de bioquímica y biología molecular (1984) ha recomendado usar el término "peptidasa" para el subconjunto de hidrolasas de enlace peptídico (subclase E.C 3.4.). El término ampliamente usado proteasa es sinónimo de peptidasa. Las peptidasas comprenden dos grupos de enzimas: las endopeptidasas y las exopeptidasas. Las endopeptidasas escinden enlaces peptídicos en puntos dentro de una proteína y las exopeptidasas eliminan aminoácidos secuencialmente de tanto el extremo N como C.

El término "proteinasa" también se usa como un sinónimo de endopeptidasa. Las proteinasas se clasifican según sus mecanismos catalíticos. La Unión internacional de bioquímica y biología molecular ha reconocido cinco clases mecanísticas: serina proteinasas, cisteína proteinasas, proteinasas aspárticas, treonina proteinasas y metaloproteinasas.

Se ha sugerido que esta clasificación por tipos catalíticos sea ampliada por una clasificación por familias basadas en las relaciones evolutivas de proteasas (Rawlings, N.D. y Barrett, A.J., (1993), Biochem. J., 290, 205-218). Esta clasificación está disponible en la base de datos SwissProt.

Además de estas cinco clases mecanísticas hay una sección de la nomenclatura de enzimas que está destinada a proteasas de mecanismo catalítico no identificado. Esto indica que el mecanismo catalítico no se ha identificado y queda la posibilidad de que existan novedosos tipos de proteasas.

La clase "serina proteinasas" comprende dos familias distintas: la familia de quimotripsina que incluye las enzimas de mamíferos tales como quimotripsina, tripsina o elastasa o calicreína, y la familia de subtilisina que incluye las enzimas bacterianas tales como subtilisina. La estructura tridimensional general es diferente en las dos familias, pero tienen la misma geometría de sitios activos y la catálisis procede por el mismo mecanismo. Las serina proteinasas presentan diferentes especificidades de sustratos que están relacionadas con sustituciones de aminoácidos en los diversos subsitios de enzimas (véase la nomenclatura de Schechter y Berger) que interaccionan con los residuos del sustrato. Tres residuos que forman la tríada catalítica son esenciales en el procedimiento catalítico: His-57, Asp-102 y Ser-195 (numeración del quimotripsinógeno).

La familia de "cisteína proteinasas" incluye las proteasas vegetales tales como papaína, actinidina o bromelaína, varias catepsinas liposómicas de mamíferos, las calpaínas citosólicas (activadas por calcio) y varias proteasas parasíticas (por ejemplo, Trypanosoma, Schistosoma). La papaína es el arquetipo y el miembro más estudiado de la familia. Al igual que las serina proteinasas, la catálisis procede mediante la formación de un producto intermedio covalente e implica un residuo de cisteína e histidina. La Cys-25 e His-159 (numeración de la papaína) esenciales desempeñan la misma función que la Ser-195 e His-57 respectivamente. El nucleófilo es un ión tiolato en vez de un grupo hidroxilo. El ión tiolato se estabiliza mediante la formación de un par iónico con un grupo imidazolio vecino de His-159. El nucleófilo de ataque es el par iónico tiolato-imidazolio en ambas etapas y por tanto no se requiere una molécula de agua.

La mayoría de las "proteinasas aspárticas" pertenecen a la familia de la pepsina. La familia de la pepsina incluye enzimas digestivas tales como pepsina y quimosina, además de catepsinas liposómicas D, enzimas de procesamiento tales como renina y ciertas proteasas fúngicas (penicilopepsina, rizopuspepsina, endotiapepsina). Una segunda familia comprende proteinasas víricos tales como la proteasa del virus del SIDA (VIH) también llamada retropepsina. Una diferencia de serina y cisteína proteinasas, la catálisis por proteinasas aspárticas no implica un producto intermedio covalente, aunque existe un producto intermedio tetraédrico. El ataque nucleófilo se logra por dos transferencias de protones simultáneas: una de una molécula de agua a la pareja de los dos grupos carboxilo y una segunda de la pareja al oxígeno de carbonilo del sustrato con la escisión del enlace CO-NH concurrente. Esta catálisis ácido-base general, que puede llamarse un mecanismo de "empuje-arrastre", conduce a la formación de un producto intermedio tetraédrico neutro no covalente.

Las "metaloproteinasas" se encuentran en bacterias, hongos, además de en organismos superiores. Se diferencian ampliamente en sus secuencias y sus estructuras, pero la gran mayoría de las enzimas contienen un átomo de cinc (Zn) que es catalíticamente activo. En algunos casos, el cinc puede sustituirse por otro metal tal como cobalto o níquel sin perder la actividad. La termolisina bacteriana se ha caracterizado muy bien y su estructura cristalográfica indica que el cinc está unido por dos histidinas y un ácido glutámico. Muchas enzimas contienen la secuencia HEXXH, que proporciona dos ligandos de histidina para el cinc mientras que el tercer ligando es o un ácido glutámico (termolisina, neprilisina, alanil aminopeptidasa) o una histidina (astacina). Otras familias presentan un modo distinto de unión del átomo de Zn. El mecanismo catalítico conduce a la formación de un producto intermedio tetraédrico no covalente después del ataque de una molécula de agua unida a cinc en el grupo carbonilo del enlace escindible. Este producto intermedio se descompone adicionalmente por transferencia del protón de ácido glutámico al grupo saliente.

En la discusión de las interacciones de péptidos con proteinasas, por ejemplo, serina y cisteína proteinasas y similares, la presente solicitud utiliza la nomenclatura de Schechter y Berger [(1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162)]. Los residuos de aminoácidos individuales de un sustrato o inhibidor se designan P1, P2, etc. y los subsitios correspondientes de la enzima se designan S1, S2, etc. El enlace escindible del sustrato es P1-P1'.

El sitio de unión para un sustrato de péptido está constituido por una serie de "subsitios de especificidad" a lo largo de la superficie de la enzima. El término "subsitio de especificidad" se refiere a una cavidad u otro sitio en la enzima que puede interaccionar con una parte de un sustrato para la enzima.

"Recombinante" como se usa en el presente documento con respecto a una proteína significa que la proteína se deriva de la expresión de un ácido nucleico recombinante por, por ejemplo, un sistema de expresión procariota, eucariota o in vitro. Un ácido nucleico recombinante es cualquier secuencia de ácidos nucleicos que se produce no naturalmente o combinación de secuencias de ácidos nucleicos que se generó como resultado de intervención humana.

El término "sustrato" se refiere a un sustrato de una enzima que actúa catalíticamente y se convierte químicamente por la enzima en producto(s).

El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen constitución química idéntica, pero se diferencian con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio. En particular, "enantiómeros" se refieren a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí. "Diaestereómeros", por otra parte, se refiere a estereoisómeros con dos o más centros de asimetría y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Con respecto a la nomenclatura de un centro quiral, los términos configuración "D" y "L" son como se definen por las recomendaciones de la IUPAC. En cuanto al uso de los términos, diaestereómero, racemato y enantiómero se usarán en su contexto normal para describir la estereoquímica de preparaciones de péptidos.

"Secuencia reguladora de la transcripción" es un término genérico usado en toda la memoria descriptiva para referirse a secuencias de ácidos nucleicos tales como señales de iniciación, potenciadores y promotores que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteínas con las que están operativamente ligadas. En algunos ejemplos, la transcripción de un gen recombinante está bajo el control de una secuencia de promotor (u otra secuencia reguladora de la transcripción) que controla la expresión del gen recombinante en un tipo de célula en el que se pretende la expresión. También se entenderá que el gen recombinante puede estar bajo el control de secuencias reguladoras de la transcripción que son las mismas o que son diferentes de aquellas secuencias que controlan la transcripción de la forma que se produce naturalmente de una proteína.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados se refieren en el presente documento como "vectores de expresión".

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III. Realizaciones a modo de ejemplo

Una adzima comprende al menos dos restos modulares: un resto que elige diana y un dominio catalítico. Con respecto a alterar la actividad de un sustrato elegido como diana, la adzima es más potente con respecto a tanto el dominio catalítico como al resto que elige diana solo.

El dominio catalítico estará frecuentemente basado en proteínas aunque incluso entonces puede incluir otros componentes tales como ligandos orgánicos o co-factores, o iones metálicos. Comprende un sitio catalíticamente activo que reacciona con un sustrato sin ser consumido en la reacción. Un dominio catalítico alterará generalmente uno o más enlaces de un sustrato, por ejemplo, rompiendo el enlace, quitando uno o más átomos a lo largo del enlace (incluyendo oxidación o reducción) y/o alterando la estereoquímica de un átomo que participa en el enlace. El sitio de modificación química sobre el sustrato elegido como diana se denomina en el presente documento el "sitio de sustrato".

El resto que elige diana reconoce y se une a una molécula predeterminada, es decir, un sitio de unión de dirección tal como sobre una biomolécula elegida como diana soluble o intracelular o extracelular unida a membrana o extracelular, molécula que es que la misma que o está asociada al sustrato elegido como diana. El efecto en ambos casos es conferir "direccionalidad" al constructo de adzimas, es decir, aumentar la concentración local del constructo en la proximidad del sustrato elegido como diana de manera que aumente la proximidad del dominio catalítico al sustrato elegido como diana y así aumente la eficiencia catalítica para ese sustrato.

El resto que elige diana y el dominio catalítico pueden unirse covalentemente o asociarse por medios no covalentes. Por ejemplo, los restos pueden unirse covalentemente como por fusión de dos dominios de proteínas, con o sin intervención de secuencias, para formar una única cadena de polipéptidos, o mediante derivación del extremo amino o carboxi, o una cadena lateral de una cadena de polipéptidos. En ciertas realizaciones preferidas, el resto que elige diana y el dominio catalítico se producen como una fusión de cotraducción mediante expresión de un único constructo de ácidos nucleicos recombinantes. Los diversos restos también pueden asociarse por interacciones no covalentes tales como entre dominios de proteínas, interacción con un ligando de reticulación común, etc.

El concepto de adzima puede explotarse en circunstancias apropiadas usando una solución de reclutamiento. Aquí se administra un agente de unión multiespecífico. Una dirección del agente de unión multiespecífico se compleja con un sitio de unión en o cerca de la biomolécula elegida como diana prevista. Una proteína chaperona u otra estructura del agente de unión multiespecífico, ligado a o constituyendo una parte de la dirección, muestra una superficie que se compleja con un dominio catalítico tal como una enzima ya presente en el cuerpo, o un resto activo enzimáticamente coadministrado. El agente de unión multiespecífico induce así la formación de complejos entre la dirección y un dominio catalítico. La afinidad de la dirección para el sitio de unión sirve para aumentar la concentración eficaz del dominio catalítico en la proximidad de la biomolécula elegida como diana.

El dominio de dirección y catalítico de una adzima cooperan frecuentemente para producir comportamiento sinérgico. La diana puede modularse, por ejemplo, inhibirse por escisión, por un dominio catalítico usado solo a una potencia determinada por su K_{M} y k_{cat}. La diana también puede inhibirse uniéndose a una molécula que define una dirección usada sola a una potencia determinada por su K_{a}, actuando simplemente como un fármaco convencional. La cantidad de modulación de la diana puede ser frecuentemente medida objetivamente por ensayos habituales. Por tanto, la modulación inducida independientemente por cada mecanismo puede ser frecuentemente al menos cuantificada aproximadamente. Frecuentemente se encontrará, al menos en algunos constructos de adzimas, que una adzima que comprende una combinación optimizada de un dominio catalítico que tiene las mismas K_{M} y k_{cat} y una dirección que tienen la misma K_{a} tendrá una potencia de al menos de 10, 10^{2}, 10^{3}, o incluso 10^{4} veces la suma de la potencia de los componentes individuales (catalítico y que elige diana) actuando solos.

Otra forma para expresar la mejora funcional de la adzima en un laboratorio farmacéutico con respecto al resto que elige diana y/o el dominio catalítico solo es que en ciertas realizaciones preferidas la adzima tendrá una dosis eficaz (DE_{50}) para alterar la actividad del sustrato elegido como diana in vivo al menos 2 veces menos del dominio catalítico y/o resto que elige diana (por ejemplo, si es un resto neutralizante) solo, y más preferentemente al menos 5, 10 o incluso 100 veces menos.

En el caso de realizaciones en las que el sustrato elegido como diana se degrada a una forma inactiva por la adzima, la potencia puede expresarse en términos de "HL_{50}", por ejemplo, la concentración de adzima requerida para reducir la semivida (T½) in vivo del sustrato elegido como diana al 50 por ciento. Cuanto más potente y selectiva sea la adzima, menor será la concentración HL_{50} con respecto al dominio catalítico solo. En ciertas realizaciones preferidas, la HL_{50} de la adzima es al menos 2 veces menos que la del dominio catalítico solo, y más preferentemente al menos 5, 10 o incluso 100 veces menos.

En ciertas realizaciones, la adzima tiene una eficiencia catalítica para la reacción catalizada con el sustrato elegido como diana de al menos 10^{4} M^{-1}s^{-1}, e incluso más preferentemente al menos 10^{5} M^{-1}s^{-1} o incluso al menos 10^{6} M^{-1}s^{-1}.

En ciertas realizaciones, la adzima tiene una eficiencia catalítica para la reacción catalizada con el sustrato elegido como diana al menos 5 veces superior al dominio catalítico solo, e incluso más preferentemente al menos 10, 50 o incluso 100 veces superior.

En ciertas aplicaciones terapéuticas será importante equilibrar la potencia y especificidad de una adzima. Puede lograrse un buen equilibrio de potencia y especificidad mediante el siguiente criterio de diseño:

3

El anterior valor debe ser aproximadamente k_{on}^{AS}[S]_{o}/[S]_{eff}.

En realizaciones de adzimas diseñadas con este criterio, el dominio catalítico será muy débil, teniendo en algunos casos una eficiencia catalítica de tan sólo 100, 10, o 1 M^{-1}s^{-1}, o incluso inferior, tal como 10^{-3} M^{-1}s^{-1}. Por tanto, las adzimas diseñadas para equilibrar la potencia y especificidad deben derivarse de dominios de enzimas débiles. Además, el valor de k_{off}^{AS} también es normalmente extremadamente bajo tal como 10^{-6} s^{-1}, 0,5 x 10^{-6} s^{-1}, 10^{-7} s^{-1}, o incluso inferior. Para lograr este objetivo puede seguirse el siguiente criterio en el diseño de adzimas:

4

Teóricamente, cualquiera de las cuatro variables de la ecuación anterior puede ajustarse para aproximarse al equilibrio óptimo entre potencia y selectividad. Sin embargo, la variable más fácil que puede cambiarse es probablemente [S]_{ef}, que viene dictada en gran parte por la longitud y la estructura del ligador entre el dominio de dirección y el dominio de enzima (véase el diseño de ligadores más adelante). Alternativamente, el diseño del propio dominio catalítico puede alterarse de forma que el valor de k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} (o la eficiencia catalítica del dominio catalítico) cambie. Para reducir la eficiencia catalítica, por ejemplo, tanto la mutagénesis aleatoria como la mutación elegida como diana en o alrededor del sitio activo del dominio catalítico y/o sitio de unión a sustrato puede realizar dominios catalíticos "subóptimos" con valores de k_{cat} ligeramente disminuidos y/o K_{M} aumentados. La ventaja de cambiar k_{cat}^{ES}/K_{M}^{ES} es que el diseño puede aceptar un valor de k_{off}^{AS}/[S]_{ef} producido por casualidad para lograr el equilibrio óptimo.

En ciertas realizaciones, la velocidad k_{off} del resto que elige diana será similar para el sustrato y el producto de reacción de adzimas, y se deseará optimizar la velocidad k_{off} para el sustrato de alta afinidad y la rápida liberación del producto cuando se una a la dirección. En estas realizaciones, la velocidad k_{off} óptima puede ser 0,001 s^{-1}, 0,01 s^{-1}, 0,1 s^{-1} o superior, y puede aproximarse por:

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si [S]_{ef} << K_{M}^{E}, en la que K_{M}^{E} es la K_{M} de la enzima (no de la adzima). La k_{on}^{AS} (k_{on} de adzima) anterior es la misma que k_{l} en la Ecuación 2 de más adelante.

Para una proteína de fusión de dos dominios ambos de los cuales se unen independientemente al sustrato, la "concentración eficaz de un sustrato" [S]_{ef} es el cociente de la constante de equilibrio de asociación global para la proteína de fusión que se une a su sustrato y el producto de las constantes de equilibrio de asociación para los dos dominios de dirección independientes que se unen al sustrato. Esta definición sigue la Figura 1 y la Ecuación 2 en Zhou, J. Mol. Biol. (2003) 329, 1-8. Cada una de las tres constantes de equilibrio requeridas para determinar [S]_{ef} puede medirse mediante ensayos de unión estándar. En la realización del análisis cinético se asume adicionalmente que las velocidades microscópicas para cada dominio en una proteína de fusión no están afectadas por la presencia del ligador.

En ciertas realizaciones, la adzima tiene una K_{M} para la reacción catalizada con el sustrato elegido como diana de al menos 5 veces menos que la del dominio catalítico solo, e incluso más preferentemente al menos 10, 50 o incluso 100 veces menos.

En líneas generales, la adzima puede diseñarse para interactuar con cualquier diana de biomolécula siempre que el sitio de ataque enzimático y el sitio de unión para la dirección sean accesibles al disolvente. Por tanto, tanto la biomolécula elegida como diana como el agente de unión para la dirección pueden ser una biomolécula soluble o una biomolécula unida a membrana. La diana puede ser intracelular, aunque las dianas extracelulares son más accesibles para constructos de proteínas y, por tanto, se prefieren.

Con referencia a la Figura 1, los diagramas esquemáticos ilustrativos de diversas estructuras que pueden explotar la invención se exponen como Figs. 1A a 1K. En 1A, quizás la adzima más simple, una dirección (DIR) está covalentemente unida a un dominio catalítico (CAT). Un constructo tal puede realizarse como dos dominios globulares separados de proteínas unidos por un ligador flexible o rígido como se ilustra, o por una única proteína globular en la que una porción de la superficie molecular actúa de dirección y la otra de sitio catalíticamente activo. En la Figura 1B, los dominios están complejados, es decir, cada uno comprende una superficie que se une reversiblemente a una superficie sobre su componente. En las Figuras 1C a 1F, los dominios de dirección y catalíticos están asociados mediante una proteína chaperona con uno o ambos ligados a la chaperona mediante enlaces covalentes tales como un ligador o complejación proteína-proteína no covalente. En las Figuras 1G y 1H, cada uno de los dominios de dirección y catalíticos está ligado covalentemente o no covalentemente a un dominio de proteína chaperona y los dominios de chaperona están no covalentemente complejados juntos.

Las Figuras 1I y 1J ilustran una forma de explotar la realización de reclutamiento de la invención. Estos constructos, como se ilustran, comprenden una dirección ligada (covalentemente o no covalentemente) a una proteína chaperona que define una superficie de unión específica para un dominio catalítico predeterminado, es decir, una enzima tanto ya presente en un fluido corporal como una coadministrada con el constructo. Este tipo de constructo funciona reclutando la enzima a la proximidad de la biomolécula elegida como diana, mediado por la afinidad de la dirección para la diana de manera que la adzima completamente funcional se ensamble in vivo. Por supuesto, tal enzima que recluta constructos también podría realizarse en otras formas proporcionadas siempre que tengan una superficie de unión que sirva de dirección que se une al sitio de unión sobre o adyacente a la diana, y una superficie de unión que sirve para unirse específicamente a una enzima. Por ejemplo, un constructo de reclutamiento puede realizarse como una única proteína globular o como una proteína globular que define una superficie de unión para un dominio catalítico y una molécula pequeña con afinidad para la diana ligada a ella mediante una longitud de polímero biocompatible.

Después de completarse la reacción enzimática, la adzima se disocia de la diana (ahora convertida en un producto) y se mueve para unirse y actuar sobre otra molécula de la diana, creando renovación. Como resultado de este rasgo de las adzimas, la potencia de los constructos de fármaco no depende directamente de la estequiometria del fármaco/diana. Esto proporciona una ventaja de manipulación significativa y puede permitir evitar cuestiones de toxicidad asociadas al uso de anticuerpos o fármacos de pequeñas moléculas que inhiben biomoléculas solubles asociadas a una enfermedad.

Las siguientes ecuaciones ilustran dos interacciones de adzimas posibles (A-E) entre una dirección (A) y su sitio de unión sobre una biomolécula elegida como diana (S), y entre el sitio enzimáticamente activo de la adzima (E) y el sustrato elegido como diana (S) para preparar el producto (P).

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La reacción 1 es la reacción catalítica normal en la que la dirección no participa tal como puede producirse con un sustrato que no muestra un sitio de unión para la dirección. En presencia de una concentración local de tanto la adzima (A-E) como la biomolécula (S), el sustrato elegido como diana tiene una velocidad k_{1} para la cavidad de enzima (E), forma un complejo A-E--S con la cavidad y se convierte a una velocidad dependiente de k_{cat} en el producto P y se libera.

La reacción 2 se produce cuando el sitio de unión sobre el sustrato elegido como diana S se une a la adzima mediante la formación de una dirección: interacción de sitio de unión (con una afinidad que puede ser superior a la afinidad de E- -S), formación de un complejo S- -AE con una velocidad k_{1}. Suponiendo una estructura adecuada de la adzima, por ejemplo, la longitud del ligador o estequeoquímica del complejo y su diana permite que este complejo pueda entrar en un estado de producto intermedio a la velocidad k_{2} cuando el sustrato elegido como diana interactúa simultáneamente con la dirección y la cavidad de enzima. En esta velocidad, el sustrato elegido como diana se convierte en el producto P a una velocidad gobernada por k_{cat}, y entonces se disocia de la adzima a la velocidad k_{3}.

El funcionamiento y la estructura de diversas formas de adzimas pueden entenderse mejor con referencia a las Figuras 2A-2J. La Figura 2A representa una adzima in situ en un momento en el que se ha unido a su biomolécula prevista. En este caso, la adzima se realiza como una única proteína globular que define un dominio catalítico (CD) que tiene un sitio enzimáticamente activo y una dirección (AD) definida por una superficie separada sobre la proteína. La dirección se une reversiblemente a un sitio de unión, en este caso realizado como una superficie sobre la biomolécula elegida como diana. El sitio del sustrato elegido como diana es vulnerable al ataque enzimático inmediato por el sitio enzimáticamente activo del dominio catalítico.

La Figura 2B muestra un constructo similar a la Figura 2A, excepto que la dirección es una molécula pequeña unida al dominio catalítico por un ligador flexible que se une reversiblemente directamente a un sitio de unión sobre la biomolécula elegida como diana prevista.

La Figura 2C es una adzima similar a 2B en la que el dominio de dirección y catalítico están unidos por una correa flexible. La unión del dominio de dirección al sitio de unión, ilustrado aquí de nuevo como una parte de la biomolécula elegida como diana, sirve eficazmente para aumentar la concentración local del dominio catalítico en la región de la diana, como se ilustra. El dominio de dirección y el dominio catalítico pueden ligarse mediante un ligador flexible o una estructura más rígida (no mostrada) de forma que la unión del dominio de dirección sirve para representar el dominio catalítico en posición de inducir cambio químico en su biomolécula elegida como diana.

La adzima de la Figura 2D es similar a la Figura 2C, excepto que el sitio de unión y la biomolécula elegida como diana son especies moleculares separadas, aquí ilustradas como que están depositadas en una membrana, tal como una membrana celular. Como en las realizaciones de las Figuras 2A-2C, la unión del dominio de dirección al sitio de reconocimiento el cual actúa aquí de una molécula atrayente sirve para aumentar eficazmente la concentración local del dominio catalítico en la región de la diana. Si la concentración de dos proteínas sobre una célula es significativa, especialmente en casos en los que se sabe que interactúan en balsas de lípidos o similares, una molécula puede usarse como sitio de unión para atraer el constructo a la otra molécula que se modulará catalíticamente.

La adzima de la Figura 2E es similar a la Figura 2C, excepto que el dominio de dirección y el dominio catalítico no están covalentemente asociados directamente entre sí. Ejemplos de este tipo de asociación incluyen dimerización, opcionalmente estabilizada por enlaces disulfuro, hibridación de nucleótidos complementarios o complejación proteína-proteína del tipo que es ubicua dentro de células.

La Figura 2F muestra una realización de una adzima similar a la Figura 2E, excepto que el dominio de dirección está diseñado para unirse a una biomolécula atrayente separada de, pero complejada, con la biomolécula elegida como diana. Sin embargo, la unión aumenta la concentración eficaz de la diana y su sitio de sustrato en la proximidad del dominio catalítico como se muestra.

La Figura 2G es la misma que la Figura 2F, excepto que la biomolécula elegida como diana está complejada con una proteína separada que muestra el sitio de unión a una tercera proteína complejante.

La Figura 2H ilustra una realización de una adzima en la que el dominio de dirección y catalítico no están covalentemente asociados mediante una tercera proteína chaperona para formar un complejo activo. Su biomolécula elegida como diana prevista se ilustra como que está incorporada en una bicapa de lípidos, y el sitio de unión se ilustra como que reside en una molécula separada en la bicapa de lípidos, similar a la Figura 2D. De nuevo, la unión aumenta sin embargo la concentración eficaz de la diana y su sitio de sustrato en la proximidad del dominio catalítico.

La Figura 2I ilustra una realización de una adzima similar a la Figura 2H, excepto que el dominio de dirección se une a un sitio de unión directamente sobre la biomolécula elegida como diana.

La Figura 2J es similar a la Figura 2G, excepto que el dominio de dirección y el dominio catalítico de la adzima se mantienen juntos mediante complejación con una proteína chaperona. En todo el constructo en el que AD y CD no están covalentemente complejados, la superficie sobre el dominio de dirección que se une al dominio catalítico (o una proteína chaperona) puede ser igual o diferente de la que se une al sitio de unión sobre la diana o molécula desencadenante.

Un rasgo adicionalmente opcional de adzimas es "contingencia manipulada", es decir, creación de una familia de adzimas que se vuelve capaz de reaccionar con su diana en presencia de la diana u otra molécula desencadenante o atrayente que tiene una afinidad por la dirección. La Figura 1K ilustra la idea fundamental detrás de la adzima contingente. Como se ilustra, la dirección tiene una afinidad por el dominio catalítico y está configurada de manera que puede unirse a ella e inhibir su actividad enzimática. En presencia de la diana se asegura una competición por la dirección, liberando el dominio catalítico para inducir cambio químico en su diana prevista.

Dicho de otro modo, los constructos de adzimas contingentes son inactivos (tienen baja actividad enzimática) en ausencia de una molécula desencadenante, pero pueden volverse activos en presencia de la molécula desencadenante, por ejemplo, la diana (véase Legendre D. y col. (1999) Nature Biotechnology 17: 67-72; Legendre D. y col. (2002) Protein Science 11: 1506-1518; Soumillion P. y Fastrez J. (2001) Current Opinion in Biotechnology 12: 387-394). Este tipo de adzima también requiere un dominio catalítico y una dirección. Sin embargo, en este caso, la unión de la dirección tiene el efecto de liberar el sitio catalítico del dominio catalítico para potenciar su actividad. Esto puede lograrse de varias formas ilustradas a modo de ejemplo en las Figuras 3A a 3G que se describen en más detalles en la sección de adzimas contingentes.

Además de los dominios de dirección y catalíticos, y de las proteínas chaperonas opcionales, los ligadores y otras estructuras que definen la relación de estas partes, una adzima puede comprender adicionalmente uno o más componentes de fusión operativamente ligados a cualquiera de sus componentes, por ejemplo, fusiones del extremo N o extremo C, o secuencias añadidas o sustituidas en bucles sobre dominios de proteínas. Las adzimas también pueden incluir cadenas laterales poliméricas, moléculas pequeñas o iones metálicos. Estos restos pueden restringir, por ejemplo, la adzima a una forma conformacionalmente restringida o estable; servir de secuencia que elige diana permitiendo la localización de la adzima en un compartimento subcelular o extracelular; ayudar en la purificación o aislamiento de tanto la adzima como los ácidos nucleicos que la codifican; servir para conferir una solubilidad deseada sobre la adzima; o conferir estabilidad o protección de la degradación a la adzima o la(s) molécula(s)
de ácido(s) nucleico(s) que codifica (por ejemplo, resistencia a degradación proteolítica). La adzima puede comprender una o cualquier combinación de los componentes de fusión anteriores según se necesite.

Los componentes de fusión pueden ser, por ejemplo, marca de (histidina)_{6}, glutatión S-transferasa, proteína A, dihidrofolato reductasa, epítope Tag\cdot100 (EETARFQPGYRS; SEQ ID NO: 1), epítope c-myc (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 2), epítope FLAG® (DYKDDDK; SEQ ID NO: 3), lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítope HA (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 4), epítope de proteína C (EDQVDPRLIDGK; SEQ ID NO: 5) o epítope VSV (YTDIEMNRLGK; SEQ ID NO: 6).

El componente de fusión también puede ser un dominio de translocalización de membrana, es decir, un péptido que puede permear la membrana de una célula y que se usa para transportar péptidos unidos dentro o fuera de una célula in vivo. Los dominios de translocalización de membranas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, la tercera hélice de la proteína de homeodominio antennapedia y la proteína de VIH-1 Tat o variantes de las mismas. Dominios de translocalización de membranas adicionales se conocen en la técnica e incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, Derossi y col., (1994) J. Biol. Chem. 269, 10444-10450; Lindgren y col., (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21, 99-103; Ho y col., Cancer Research 61, 474-477 (2001); la patente de EE.UU. nº 5.888.762; la patente de EE.UU. nº 6.015.787; la patente de EE.UU. nº 5.846.743; la patente de EE.UU. nº 5.747.641; la patente de EE.UU. nº 5.804.604; y las solicitudes PCT publicadas WO 98/52614, WO 00/29427 y WO 99/29721.

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A. Restos que eligen diana a modo de ejemplo

Se apreciará que puede usarse un amplio intervalo de entidades como restos que eligen diana en las adzimas objeto. Fundamentalmente, el resto que elige diana se une reversiblemente a un rasgo predeterminado ("sitio de dirección") asociado al sustrato elegido como diana. El resto que elige diana presenta una o más superficies que tienen características químicas (por ejemplo, hidrófobas, estéricas y/o iónicas) que permiten que se una selectivamente, o relativamente selectivamente, al sitio de dirección. En muchas realizaciones, la dirección será un dominio de proteína modular (incluyendo péptido) que se proporciona en asociación con el dominio catalítico. Por ejemplo, el resto que elige diana puede ser un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo que conserva la capacidad para unirse al sitio de dirección. Por consiguiente, el resto que elige diana puede derivarse de tal anticuerpo y fragmentos de anticuerpos como anticuerpos monoclonales que incluyen fragmentos Fab y F(ab)2, anticuerpos monocatenarios (scFv), diacuerpos e incluso fragmen-
tos que incluyen las regiones variables de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que se une al sitio de dirección.

Otros ejemplos de proteínas que pueden adaptarse adecuadamente para uso en las adzimas objeto que incluyen dominios de unión a ligando de receptores tales como en los que el sustrato elegido como diana de la adzima es el ligando de receptor. En cambio, el resto que elige diana puede ser un ligando de receptor en el que la adzima se dirige al receptor como el sustrato elegido como diana. Tales ligandos incluyen tanto restos de polipéptidos como ligandos de moléculas pequeñas.

En otra realización, un resto que elige diana puede derivarse de un polipéptido que tiene un pliegue similar a inmunoglobulina tal como el 10º dominio de tipo III de fibronectina humana ("Fn3"). Véanse las patentes de EE.UU. nº 6.673.901; 6.462.189. Fn3 es pequeño (aproximadamente 95 residuos), monomérico, soluble y estable. No tiene enlaces disulfuro que permitan mejorar la estabilidad en entornos reductores. La estructura puede describirse como un sándwich beta similar a la del dominio VH de Ab, excepto que Fn3 tiene siete cadenas beta en lugar de nueve. Hay tres bucles en cada extremo de Fn3; y las posiciones de tres de estos bucles se corresponden con las de CDR1, 2 y 3 del dominio VH. La secuencia Fn3 de 94 aminoácidos es:

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Las posiciones de los aminoácidos de los bucles similares a CDR se definirán como residuos 23-30 (bucle BC), 52-56 (bucle DE) y 77-87 (bucle FG). Por consiguiente, uno o más de los bucles similares a CDR pueden modificarse, y preferentemente aleatorizarse, para generar una biblioteca de dominios de unión de Fn3 que entonces puede cribarse para la unión a un sitio de unión de dirección deseado. Véase también la publicación PCT WO0232925. Fn3 es un ejemplo de una subfamilia grande de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF). La familia de Fn3 incluye moléculas de adhesión a células, receptores de hormonas de la superficie celular y citocinas, chaperonado y dominios de unión a carbohidratos, todos los cuales también pueden adaptarse para uso como agentes de unión. Adicionalmente, la estructura de dominios de unión a ADN del factor transcripción NF-kB también está íntimamente relacionada con el pliegue de Fn3 y también puede adaptarse para uso como agente de unión. Similarmente, la albúmina de suero tal como albúmina de suero humano contiene un pliegue similar a inmunoglobulina que puede adaptarse para uso como resto que elige diana. Andamiajes adicionales que pueden usarse como restos que eligen diana incluyen: anticalinas (derivados de lipocalina, véase Pieris Proteolab AG), Affibodies (basados en proteína A, véanse las patentes de EE.UU. nº 5831012, 6534628 y 6740734), knottinas (estructuras de nudo de cisteína, normalmente derivadas de inhibidores de proteasa), tendamistat, GST P1-1/A1-1, tetranectinas (proteína de unión al dominio 4 en rosquilla de plasminógeno) y proteínas de unión triméricas (Borean Pharma, documento WO04039841A2).

En otras realizaciones adicionales, el resto que elige diana puede ser una secuencia de polipéptidos manipulada que se seleccionó, por ejemplo, desarrollada sintéticamente, basándose en su cinética y selectividad para unirse al sitio de dirección.

El resto que elige diana también puede ser un agente de unión polianiónico o policatiónico tal como un oligonucleótido, un polisacárido, un poliaminopéptido (tal como poliaspartato, poliglutamato, polilisina o poliarginina). En ciertas realizaciones, tales restos que eligen diana mantienen varias cargas tanto negativas como positivas sobre su estructura a pH fisiológico. La dirección también puede ser un ácido nucleico de proteína (PNA), un ácido nucleico bloqueado (LNA) o una secuencia de nucleótidos tales como una monocadena de ADN o ARN.

El resto que elige diana también puede ser una molécula pequeña que se ha seleccionado basándose en la cinética y selectividad que muestra para la unión a un sitio de dirección asociado al sustrato elegido como diana.

Hay una variedad de técnicas muy conocidas para generar bibliotecas de restos de polipéptidos/péptidos, ácidos nucleicos (aptámeros) y moléculas pequeñas que pueden usarse para identificar moléculas que tienen la especificidad, selectividad y cinética de unión apropiadas para uso en cualquier adzima particular. Por ejemplo, técnicas tales como se describen en las patentes de EE.UU. 6258558 titulada "Procedimiento para la selección de proteínas usando fusiones de proteínas de ARN" y 5837500 titulada "Evolución dirigida de proteínas de unión novedosas" pueden adaptarse fácilmente para uso en la identificación de restos de péptidos o polipéptidos que eligen diana para uso en la generación de adzimas objeto. Asimismo, la preparación de los aptámeros previamente descritos en la técnica puede adaptarse para generar restos que eligen diana apropiados. Véanse, por ejemplo, Tuerk Science 249: 505-510 (1990); Klug Mol Biol Reports 20: 97-107 (1994); y Morris y col., PNAS 95: 2902-2907 (1998), además de las patentes de EE.UU. 5.843.701 y 5.843.653.

La dirección pueden tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 ó 100 residuos de aminoácidos. Los intervalos usando una combinación de cualquiera de los valores anteriormente citados como límites superiores y/o inferiores pretenden incluirse en la presente invención.

En ciertas realizaciones preferidas, la constante de disociación (K_{d}) para unir al sitio de dirección es más baja (mayor afinidad) y/o la velocidad K_{off} es más lenta cuando el sitio de dirección está unido al sustrato elegido como diana sin modificar con respecto a cuando está unido al producto de reacción de adzimas (por ejemplo, el sustrato elegido como diana que ha sido actuado por el dominio catalítico). Es decir, la conversión del sustrato elegido como diana en un producto de reacción de adzimas reduce la afinidad del resto que elige diana por el sitio de unión de dirección y promueve la disociación de la adzima a partir del producto de reacción. En ciertas realizaciones: la K_{d} del resto que elige diana para el producto de reacción de adzimas con respecto al sustrato elegido como diana es al menos 5 veces superior, e incluso más preferentemente 10, 100 o incluso 1000 veces superior; y/o la velocidad K_{off} del resto que elige diana para el producto de reacción de adzimas es al menos 5 veces más rápido, e incluso más preferentemente 10, 100 o incluso 1000 veces más rápido con respecto a la velocidad K_{off} para el sustrato elegido como diana.

En ciertas realizaciones de adzima directas, el sitio de dirección y el sitio de sustrato están solapándose en el sentido que la unión del resto que elige diana al sustrato elegido como diana interfiere con la capacidad del dominio catalítico de actuar sobre el sitio del sustrato elegido como diana. Esta interferencia puede ser el resultado de oclusión estérica o la falta de flexibilidad en la adzima y/o sustrato elegido como diana para permitir que ambas porciones de la adzima interactúen simultáneamente con el sustrato elegido como diana. En otras realizaciones, los sitios de dirección y de sustrato están suficientemente separados y la adzima tiene suficiente flexibilidad estérica que la disociación del resto que elige diana no se requiere para que la adzima modifique el sustrato elegido como diana. En muchas realizaciones, la adzima se diseñará de forma que haya cooperatividad funcional entre el dominio catalítico y el resto que elige diana, particularmente resultante de la selección apropiada de ligador(es) entre los dos componentes de forma que la afinidad de la adzima resultante sea al menos 2 veces superior a la suma de las afinidades del dominio catalítico y el resto que elige diana, e incluso más preferentemente al menos 5, 10, 100 o incluso 500 veces superior.

En algunos casos, el propio resto que elige diana interfiere con la actividad del sustrato elegido como diana. Por ejemplo, el resto que elige diana puede ser un agente bloqueante o neutralizante que inhibe una actividad o interacción intrínseca mediada por el sustrato elegido como diana. En tales casos, la adzima será preferentemente al menos un inhibidor 5 veces más potente, e incluso más preferentemente al menos 10, 100 o incluso 1000 veces más potente que el resto que elige diana solo.

En otras realizaciones, el resto que elige diana no tiene por sí mismo ningún efecto significativo sobre la actividad del sustrato elegido como diana.

Si hay más de un sitio de sustrato posible del dominio catalítico sobre un sustrato elegido como diana, tal como más de una secuencia de reconocimiento de sustrato para un dominio proteolítico, el resto que elige diana puede seleccionarse para potenciar la selectividad/preferencia de la adzima por uno de los sitios. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando un resto que elige diana que se une al sustrato elegido como diana de un modo que interfiera estéricamente con la capacidad del dominio catalítico para actuar en uno de los sitios. En otras realizaciones, el resto que elige diana puede usarse para aumentar la concentración del dominio catalítico en la proximidad del sitio de sustrato deseado.

En ciertas realizaciones, la adzima puede incluir dos o más restos de dirección/que eligen diana que pueden ser iguales o diferentes (es decir, sus K_{d} respectivas puede ser iguales o diferentes). En tales realizaciones, la K_{d} efectiva de la adzima para el sustrato elegido como diana puede ser de tan sólo 10^{-15}M (femtomolar) cuando la concentración de sustrato efectiva [S]_{ef} es superior a la mayor K_{d} individual de las direcciones (o restos que eligen diana).

En ciertas realizaciones, el resto que elige diana se une a un sustrato elegido como diana que es soluble bajo las condiciones de reacción tal como una proteína soluble. En muchos casos, estos sustratos de proteínas solubles estarán presentes en el medio de reacción a concentraciones relativamente bajas tales como menos de 0,1 \muM, y frecuentemente a menos de 10 nM. En tales realizaciones, y ciertas otras en el presente documento, puede desearse seleccionar un resto que elige diana que, cuando se proporciona en la adzima, da como resultado una adzima directa que tiene una k_{on} relativa rápida para unir al sustrato elegido como diana, por ejemplo, una k_{on} de 10^{3} M^{-1}s^{-1} o superior, por ejemplo, al menos 10^{4} M^{-1}s^{-1}, 10^{5} M^{-1}s^{-1} o incluso 10^{6} M^{-1}s^{-1}.

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(i) Biomoléculas elegidas como diana a modo de ejemplo

En ciertas realizaciones, las adzimas objeto se dirigen a moléculas biológicamente activas ("biomolécula elegida como diana"), por ejemplo, que incluyen sustratos extracelulares e intracelulares accesibles a disolventes, además de porciones extracelulares o citoplásmicas de sustratos asociados a membranas. Éstas incluyen, pero no se limitan a, sustratos de entre tales clases como sustratos de proteínas y de péptidos, ácidos nucleicos, lípidos, moléculas pequeñas que incluyen factores extracelulares (tales como esteroides y neurotransmisores) y segundos mensajeros intracelulares (tales como inositol fosforilado y AMPc). Modificando la realización funcional de un sustrato elegido como diana de relevancia biológica, las adzimas objeto pueden usarse para alterar tales procesos celulares como expresión génica, morfología, adhesión de células, crecimiento, proliferación, migración, diferenciación y/o viabilidad de célula.

Los sustratos elegidos como diana pueden ser modificados por la adzima de manera que se produzcan uno o más productos que tienen una o más diferencias en actividades biológicas con respecto al sustrato elegido como diana (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de toda o casi toda la actividad biológica del sustrato elegido como diana). Por ejemplo, para sustratos elegidos como diana que son por sí mismos enzimas, las adzimas objeto pueden usarse para alterar la actividad enzimática intrínseca de aquellos sustratos elegidos como diana. Para ilustrar, una adzima puede usarse para inhibir tales proteasas como elastasa (en el tratamiento de fibrosis quística, síndrome disneico agudo y enfisema) o metaloproteasas de matriz que participan en metástasis. En otras realizaciones, la adzima altera la capacidad de un sustrato elegido como diana para interactuar con otros restos biológicos, por ejemplo, tal como alterando interacciones receptor-ligando, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-lípido, interacciones proteína-ADN o proteína-ARN, por mencionar algunas. A este respecto, la adzima puede usarse para aumentar o disminuir la actividad intrínseca o actividad de unión del sustrato elegido como diana. Las adzimas también pueden usarse para alterar la semivida o biodistribución de un sustrato elegido como diana.

En ciertos casos, la adzima puede usarse para convertir un sustrato elegido como diana en un antagonista funcional de la biomolécula sin modificar. Simplemente para ilustrar, en el caso de un factor de polipéptido que actúa mediante una interacción de receptor, en vez de generar un producto que no puede interactuar con el receptor afín del sustrato elegido como diana, la adzima puede seleccionarse de manera que altere el sustrato elegido como diana para producir un producto que conserva la capacidad para unirse al receptor, pero no induce el nivel de activación de receptores posible por el sustrato elegido como diana sin modificar. De esta forma, la adzima inhibe la función del factor de polipéptido (a) reduciendo la concentración del factor de polipéptido y (b) generando un antagonista que reduce la concentración eficaz de receptor por el factor de polipéptido. En realizaciones preferidas de este sistema, el producto tiene una K_{i} de 10 \muM o menos para inhibir una actividad del sustrato elegido como diana, e incluso más preferentemente tiene una K_{i} menos del 10 \muM, 100 nM, 10 nM o incluso 1 nM.

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(a) Dianas extracelulares

En ciertas realizaciones, la adzima se dirige a una diana extracelular que incluye moléculas diana que normalmente están localizadas completamente fuera de una célula y moléculas diana que se introducen en una membrana celular pero que tienen una parte que se expone al entorno extracelular. Pueden reconocerse varias categorías de dianas extracelulares que incluyen, por ejemplo, moléculas extracelulares difusibles (por ejemplo, factores de crecimiento, proteínas del suero, anticuerpos, cualquier molécula pequeña difusible, nucleótidos extracelulares, lípidos), moléculas extracelulares que son parte de un agregado insoluble (por ejemplo, proteína \beta-amiloide, constituyentes de placas ateroscleróticas, fibras de fibrina insoluble), proteínas asociadas a membranas y otros restos unidos a membranas (por ejemplo, proteínas de transmembrana, lípidos, polisacáridos asociados a membranas) y constituyentes de o asociados a una matriz extracelular organizada.

Por consiguiente, las adzimas objeto pueden usarse para alterar, por ejemplo, inhibir o potenciar tal señalización mediada por la superficie de la célula como señalización autocrina (autoseñalización), señalización paracrina (entre células cercanas) y/o señalización endocrina (durante una larga distancia, normalmente mediante la circulación sanguínea u otro fluido corporal). Las adzimas objeto también pueden usarse para alterar la señalización yuxtacrina, por ejemplo, consecuencias de señalización de contacto de células.

A continuación se proporcionan en la Tabla I diversos ejemplos ilustrativos de diferentes tipos de dianas extracelulares, junto con afecciones asociadas, que pueden usarse para tratar adzimas antagonísticas.

TABLA I Ejemplos de diversas dianas extracelulares y afecciones asociadas

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Entre las moléculas extracelulares difusibles pueden reconocerse otras subcategorías. En una realización preferida, una diana de una adzima es una molécula de señalización extracelular, que significa una molécula que se produce por una célula con el efecto primario de desencadenar una respuesta en otra célula. Ejemplos de moléculas de señalización extracelular incluyen la mayoría de los factores de crecimiento y citocinas, neurotransmisores, hormonas y prostaglandinas. Muchas moléculas de señalización extracelular son en realidad parte de un ensamblaje mayor que lleva a cabo la función de señalización; por ejemplo, TGF-\beta1 contiene dos cadenas de 112 aminoácidos que están ligadas por un enlace disulfuro, y cualquiera de las dos cadenas de polipéptidos pueden considerarse como que son moléculas de señalización extracelular que son elegidas como diana por una adzima. Los anticuerpos no están explícitamente incluidos en el término "molécula de señalización extracelular".

En ciertas realizaciones, una molécula de señalización extracelular es una molécula que se une a una porción extracelular de un receptor unido a membrana y desencadena un acontecimiento de transducción de señales en la célula. En ciertas realizaciones, una molécula de señalización extracelular es una molécula que entra en una célula y se une a un receptor intracelular para desencadenar un acontecimiento de transducción de señales en la célula (por ejemplo, hormonas esteroideas, proteínas de horquilla de diversos patógenos bacterianos).

En una realización particularmente preferida, la diana de una adzima es una molécula de señalización de polipéptidos extracelular, por ejemplo, como puede encontrarse en fluido(s) biológico(s) tal(es) como un factor de crecimiento, citocina, hormona de polipéptido o similares. En ciertas realizaciones preferidas, el sustrato elegido como diana es una molécula de señalización, particularmente una molécula de señalización de polipéptidos, presente en suero u otro fluido corporal a una concentración de menos de 1 \muM, e incluso más preferentemente menos de 0,1 \muM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 10 pM o incluso 1 pM. El dominio catalítico se elige de manera que modifique la molécula de señalización de un modo que altere su interacción con un receptor afín (por ejemplo, derogando, uniendo o limitando la activación del receptor), capacidad para formar complejos de proteínas con otros factores solubles, semivida y/o biodistribución.

En ciertas realizaciones preferidas, la adzima altera el nivel de transducción de señales inducido por un factor extracelular. El término "transducción de señales" pretende englobar el procesamiento de señales físicas o químicas a partir del entorno extracelular por la membrana celular y en la célula, y puede producirse mediante uno o más de varios mecanismos tales como activación/inactivación de enzimas (tales como proteasas, o enzimas que pueden alterar los patrones de fosforilación u otras modificaciones pos-traducción), activación de canales de iones o almacenamiento de iones intracelulares, activación de enzimas efectoras mediante productos intermedios de proteínas de unión a nucleótidos de guanina, generación de segundos mensajeros (por ejemplo, hidrólisis de GTP, movilización de calcio, formación de fosfatos de inositol, nucleótidos cíclicos, nucleósidos de azúcares o gases disueltos tales como NO o O_{3}), redistribución de iones intracelulares (Ca^{+2}, Zn^{+2}, Na^{+}, K^{+}) y/o activación directa (o inhibición) de un factor de transcripción. La transducción de señales puede dar como resultado cambios fisiológicos en la célula tales como cambios en la morfología, adhesión de células, quimiotaxia, resistencia a fármacos, crecimiento, proliferación, muerte (apoptosis o necrosis), función efectora, secreción de matriz, etc.

La inducción de señales intracelulares por la unión de una molécula de señalización extracelular tal como un factor de crecimiento soluble a un receptor que atraviesa la membrana es de considerable importancia biológica. En muchos casos, la promoción de interacciones receptor-receptor por factores de proteínas es una etapa inicial clave en la inducción de un procedimiento de transducción de señales. En ciertas realizaciones preferidas, las adzimas objeto pueden usarse para alterar la función/realización biológica de un factor de proteína inductivo tal como un factor de proteína seleccionado de una de las superfamilias de los factores de proteínas conocidos como (i) factores de haces de cuatro hélices, (ii) factores similares a EGF, (iii) factores similares a insulina, (iv) factores de \beta-trébol y (v) factores de nudo de cisteína. Sustratos a modo de ejemplo dentro de estas clases se enumeran en la Tabla II.

TABLA II Superfamilias estructurales de factores de crecimiento

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A continuación se enumeran en la Tabla III ejemplos de moléculas de señalización extracelular particulares y afecciones asociadas a estas dianas que pueden tratarse usando una adzima apropiada.

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TABLA III Ejemplos de moléculas de señalización extracelular

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En ciertas realizaciones particularmente preferidas, el sustrato elegido como diana es una citocina inflamatoria tal como factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha), interleucina 6 (IL-6) o interleucina 1b (IL-1b) y la adzima puede usarse terapéuticamente para reducir inflamación.

En ciertas otras realizaciones preferidas, el sustrato elegido como diana es una hormona de polipéptido tal como hormona adrenocorticotrópica, péptido amilina, bombesina, calcitonina, colecistoquinina (CCK-8), gastrina, glicentina, GLP-1, GLP-2, PYY, NPY, GIP, glucagón, gonadotropina coriónica humana (\alpha), gonadotropina coriónica humana (\beta), hormona estimulante del folículo humana (\beta2), hormona de crecimiento humana, insulina, hormona luteinizante, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, lactógeno placentario, proinsulina, prolactina, secretogranina II, somatostatina, tiroglobulina, hormona estimulante de la tiroides, polipéptido intestinal vasoactivo.

Otros sustratos a modo de ejemplo para las adzimas objeto incluyen factores de polipéptidos seleccionados del grupo que está constituido por: factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento mielomonocítico, interleucina 3, interleucina 7, factor inhibidor de leucemia (LIF), oncostatina M, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor de diferenciación colinérgica (CDF), interleucina 4, interleucina 13, interleucina 16, interleucina 17, interferón-alfa (IFN-\alpha), interferón-beta (IFN-\beta), IFN-tau (IFN-\tau), interferón omega (IFN-\omega), interleucina 5, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), interleucina 10, interleucina 1-alfa (IL1-\alpha), interleucina 1-beta (IL1-\beta), gonadotropina, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor plaquetario 4 (PF-4), bTG, GRO, 9E3, HLA-A2, proteína 1 alfa inflamatoria de macrófagos (MIP-1\alpha), proteína 1 beta inflamatoria de macrófagos (MIP-1\beta), actividad estimulante del crecimiento de melanoma (MGSA), ligando 4-1BB, ADF, factores de motilidad autocrina, B61, betacelulina, cardiotropina 1, ligando CD27, ligando CD30, ligando CD40, ligando receptor CeK5, EMAP-II, ENA-78, proteína catiónica del eosinófilo, epiregulina, factor promotor del crecimiento derivado de eritrocito, eritropoyetina, ligando Fas, fibrosina, FIC, GDNF, factor 5 de crecimiento/diferenciación, antagonista del receptor de interleucina 1, interleucina 3, interleucina 6, interleucina 7, interleucina 9, interleucina 11, interleucina 12, interleucina 13, interleucina 14, interleucina 15, linfotactina, LT-beta, linfotoxina, MCP-2, MCP-3, megapoyetina, proteína reguladora del crecimiento derivada de melanoma, proteína 1 quimioatrayente de monocitos, factor inhibidor de la migración de macrófagos, factor de diferenciación Neu, oncostatina M, ligando OX40, factor de crecimiento placentario, PLF, factor Scatter, factor Steel, TCA 3, trombopoyetina, factor de crecimiento de células endoteliales vasculares, proteínas morfogenéticas óseas, antagonista del receptor de interleucina 1, proteína 1 quimioatrayente de monocitos, ligando c-Kit (factor de células madre), quimiocinas CXC, quimiocinas CC, linfotactina y quimiocinas C-X3-C (fractalquina/neurotactina).

En otras realizaciones, la adzima está dirigida a un sustrato asociado a una superficie celular tal como para alterar la actividad de un receptor de superficie celular, canal de iones, transportador, molécula de adhesión, lípido o molécula de matriz extracelular tal como un polisacárido o glicosaminoglicano.

En ciertas realizaciones preferidas, el sustrato elegido como diana es una proteína receptora de la superficie celular o canal de iones. Por ejemplo, la adzima puede diseñarse para modificar una proteína receptora de unión a ligando de un modo que altera la cinética de unión al ligando y/o actividad de transducción de señales del receptor. Las proteínas receptoras que pueden ser sustratos para las adzimas objeto incluyen cualquier receptor o canal que interactúa con una molécula extracelular (es decir, hormona, factor de crecimiento, péptido, ión) para modular una señal en la célula. Para ilustrar, el sustrato elegido como diana de la adzima puede ser un sitio sobre un receptor de serpentina (tal como receptor acoplado a proteína G), un receptor ligado a enzima (tal como una receptor tirosina cinasa, receptor serina/treonina cinasa, receptor proteína tirosina fosfatasa, receptor guanilil ciclasa o receptor óxido nítrico sintasa), o un canal de iones (incluyendo un receptor ligado a canal de iones). Los receptores a modo de ejemplo que puede alterarse por una adzima incluyen receptores de citocinas; receptores de reconocimiento inmunitario de multisubunidades (MIRR), receptores de quimiocinas; receptores de factores de crecimiento o receptores de péptidos quimioatrayentes, receptores de neuropéptidos, receptores de la luz, receptores de neurotransmisores y receptores de hormonas de polipéptido, por nombrar algunos. Otros ejemplos de receptores de la superficie celular se proporcionan en la Tabla IV, junto con afecciones asociadas que pueden tratarse por la administración de una adzima apropiadamente elegida como diana.

TABLA IV Ejemplos de receptores de superficie celular

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Ejemplos adicionales de dianas asociadas a la superficie celular o de matriz extracelular para las adzimas objeto incluyen moléculas de adhesión celular tales como selectinas, integrinas y otras proteínas hemidesmosómicas, cadherinas, lamininas, isoformas de CD44, proteoglicanos (tales como sindecanos), proteínas de la superfamilia de Ig (IgCAM), cateninas (tales como \alpha, \beta y \gamma cateninas) y cadherinas (tales como E-cadherina o P-cadherina), galectinas, colágenos, elastinas, fibrinas y similares.

En ciertas realizaciones, la adzima actúa sobre una proteína de cúmulo diferenciación (CD) tal como CD1a, CD2 (LFA-2), CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9 (proteína 1 relacionada con la motilidad), CD10 (CALLA), CD11b (Mac-1), CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18 (b2), CD19, CD20, CD21, CD22 (BL-CAM), CD23, CD25 (receptor de interleucina 2), CD27, CD29 (b1), CD30, CD31 (PECAM-1), CD34 (marcador endotelial celular), CD35, CD37, CD38, CD39, CD40, CD40L (CD154), CD41 (GPIIb/IIIa), CD42b (GPIb), CD43, CD44 (H-CAM), variante 3 de CD44, variante 4 de CD44, variante 5 de CD44, variante 6 de CD44, CD45 (antígeno común de leucocitos), CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD48, CD49b (VLA-2), CD49c (VLA-3), CD49f (VLA-6), CD50 (ICAM-3), CD51, CD54 (ICAM-1), CD56 (NCAM), CD57, CD58 (LFA-3), CD61 (GPIIIa), CD61 (GPIIIa), CD62E (E-selectina), CD62L (L-selectina), CD62P (P-selectina), CD63 (marcador de melanoma), CD66a (CEACAM1), CD66e (antígeno carcinoembriónico), CD68, CD69, CD71 (receptor de transferrina), CD72, CD74, CDw75, CD79a, CD81, CD82, CD83, CD95 (Fas), CD99 (MIC2), CD104, CD105 (endoglina), CD106 (VCAM-1), CD117 (oncoproteína c-kit), CD134 (OX40), CD137, CD138 (sindecano 1), CD141 (trombomodulina), CD141 (trombomodulina), CD143 (ACE), CD146 (MCAM), CD147 (EMMPRIN), CDw150 (SLAM), CD151 (PETA-3), CD154 (CD40L), CD162, CD163, CD166 (ALCAM), CD168 (RHAMM) o CD179a.

En ciertas realizaciones preferidas, la adzima sustrato es una selectina, por ejemplo, una proteína de la familia CD62. En otras realizaciones preferidas, la adzima sustrato es una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgCAM) tal como una proteína de la familia CD2, CD22, CD31, CD48, CD50, CD54, CD56, CD58, CD66a, CD83, CD106, CD146, CD147, CDw150 o CD166. En otras realizaciones adicionales preferidas, el sustrato de adzima es una integrina tal como la familia CD49, CD51, CD29, CD11b, CD18, CD41, CD61 o CD104.

Algunas de las adzimas objeto pueden usarse para alterar la actividad de la clase A de receptores secuestrantes (SR-A, CD204), receptor B1 secuestrante (SR-BI) o CD36, que son proteínas de la superficie celular que median en la adhesión de células a, y endocitosis de, diversas sustancias nativas y patológicamente modificadas y participan en señalización intracelular, metabolismo de lípidos y defensa de huéspedes contra patógenos bacterianos.

Las adzimas colagenolíticas pueden prepararse, por ejemplo, usando dominios catalíticos de colagenasa a partir de hidrobiontes, policolagenasa K o fermencol para producir la hidrólisis profunda de sustratos de polipéptidos (tipos de colágeno nativos o parcialmente desnaturalizados, elastina, fibrina, hemoglobina y caseína). Tales adzimas tienen uso en aplicaciones tanto médicas como cosmetológicas.

En ciertas realizaciones, un ligando (o porción de unión del mismo) de un receptor u otra molécula de la superficie celular puede emplearse como resto de dirección. En ciertas realizaciones, la adzima puede asociarse a uno o más ligandos eficaces para unirse a proteínas de la superficie o de la matriz celular específicas en la célula diana facilitándose así el secuestro de la adzima por células diana. Por ejemplo, la adzima puede ser una proteína de fusión que también incluye el ligando. Simplemente para ilustrar, ejemplos de ligandos adecuados para uso en la elección como diana de adzimas de la presente invención para tipos de células específicos se enumeran a continuación en la Tabla V.

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TABLA V Adzimas específicas para diversos tipos de células

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En ciertas realizaciones de adzimas previstas para ser antagonistas de un ligando de receptor, la adzima alterará el receptor de un modo que reduzca el nivel de transducción de señales inducidas por ligando, pero no alterará sustancialmente la capacidad del receptor para unirse a su ligando afín. De este modo, la adzima antagoniza el ligando no sólo como consecuencia de la generación de receptores de pérdida de función con respecto a la transducción de señales, sino también porque el receptor por lo demás inactivado puede actuar de agente de unión competitivo para secuestrar el ligando de receptores todavía funcionales. Alternativamente, la adzima puede seleccionarse para generar un producto de receptor que es constitutivamente activo, por ejemplo, en cuyo caso la adzima puede actuar de agonista del ligando inductivo del receptor.

En ciertas realizaciones, el sustrato previsto de la adzima será un complejo de receptores heteroméricos, por ejemplo, complejos de receptores que implican dos o más subunidades de receptores diferentes. Por ejemplo, los receptores para la mayoría de las interleucinas y citocinas que regulan sistemas inmunitarios y hematopoyéticos pertenecen a la familia de los receptores de citocinas de clase I. Estas moléculas forman complejos de receptores de multicadenas con el fin de presentar unión de alta afinidad con, y mediar en las funciones biológicas de, sus citocinas respectivas. En la mayoría de los casos, estos complejos de receptores funcionales comparten componentes de receptores de transducción de señales comunes que también están en la familia de los receptores de citocinas de clase I tal como la proteína gp130. Las adzimas que son específicamente reactivas con la(s) única(s) subunidad(es) de receptores, pero que no alteran sustancialmente la función de la subunidad común, pueden usarse para potenciar la selectividad de la adzima como antagonista de un ligando particular.

Alternativamente, las adzimas que inactivan selectivamente las únicas subunidades de receptores de otros complejos ligando-receptor, por ejemplo, aquellos que compiten con la formación de complejos de receptores por el ligando de interés, pueden ser agonistas del ligando de interés.

En otras realizaciones adicionales, una adzima es elegida como diana para una molécula extracelular que es parte de una acumulación biomolecular. Una acumulación biomolecular es cualquier ensamblaje no deseado de biomoléculas, normalmente uno que reúne componentes que normalmente no se encuentran en un ensamblaje juntos, normalmente uno que ha crecido con el tiempo por la adición sucesiva de material. Las acumulaciones son generalmente suficientemente grandes como para no ser difusibles (aunque los coágulos son acumulaciones que pueden difundir en el sistema circulatorio) y son generalmente mayores que el tamaño de una célula huésped típica. Las acumulaciones biomoleculares contendrán frecuentemente células muertas y vivas, además de matriz extracelular. Ejemplos de acumulaciones biomoleculares incluyen depósitos amiloides, por ejemplo, un depósito de péptidos \beta-amiloides característico de enfermedad de Alzheimer o un depósito amiloide de diabetes tipo II, un depósito de colágeno, un depósito de proteínas, una placa aterosclerótica, una masa de grasa no deseable, una masa ósea no deseable, un coágulo de sangre o un quiste. En ciertas realizaciones, una adzima está diseñada para elegir como diana una o más moléculas extracelulares de una acumulación biomolecular y actuar sobre tales dianas de forma que se produzca la disolución parcial o completa de la acumulación. Ejemplos de proteínas que están frecuentemente presentes en los depósitos amiloides asociados a enfermedad de Alzheimer incluyen \beta-péptido amiloide [A\beta(1-42)] y transtiretina. La agregación de proteínas se ha ligado a varias enfermedades humanas que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y amiloidosis sistémica. La mayoría de estas enfermedades está asociada a la formación de agregados sumamente ordenados y ricos en hojas beta denominados en lo sucesivo fibrillas amiloides. La formación de fibrillas por transtiretina natural (TTR) o variantes de TTR se ha ligado a amiloidosis sistémica y polineuropatía amiloide familiar, respectivamente. La formación de fibrillas amiloides por \alpha-sinucleína (\alpha-sin) se ha ligado a la neurodegeneración en enfermedad de Parkinson. La placa aterosclerótica puede contener una variedad de componentes diferentes. Ejemplos de ciertos componentes incluyen: sustancias calcificadas (por ejemplo, hidroxiapatita), cristales de colesterol, matriz de colágeno, macrófagos-células espumosas, células de tejido liso, material ateromatoso rico en lípidos (particularmente rico en colesterol y ésteres del mismo), mastocitos, metaloproteinasas de matriz (por ejemplo, colagenasa MMP-1, gelatinasas MMP-2 y -9). Dado que la rotura de placas ateroscleróticas está asociada a acontecimientos trombóticos peligrosos, puede desearse diseñar una adzima que estabilice las placas (por ejemplo, eligiendo como diana metaloproteinasas en la placa) o emplear una adzima disolvente de placas en combinación con un agente antitrombótico tal como heparina.

Frecuentemente, una acumulación biomolecular combina diversas biomoléculas que tienen funciones apropiadas en otras partes de un organismo; por consiguiente, puede desearse elegir selectivamente como diana moléculas que están principalmente presentes en la acumulación o proporcionar una adzima con múltiples restos de dirección diferentes que potencian la concentración de adzimas en la proximidad de la acumulación.

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(b) Dianas intracelulares

En ciertas realizaciones, una adzima puede dirigirse contra una diana intracelular. Ejemplos de dianas intracelulares incluyen receptores intracelulares (por ejemplo, muchos receptores de hormonas esteroideas), enzimas que se sobreexpresan o por lo demás participan en una afección no deseable, proteínas de señalización intracelulares que participan en una afección no deseable (por ejemplo, oncoproteínas, proteínas proinflamatorias) y factores de transcripción.

En una realización a modo de ejemplo, la adzima altera un receptor nuclear. Muchos receptores nucleares pueden verse como factores de transcripción dependientes de ligando. Estos receptores proporcionan un enlace directo entre señales extracelulares, principalmente hormonas, y respuestas de transcripción. Su función de activación de la transcripción está regulada por moléculas pequeñas endógenas tales como hormonas esteroideas, vitamina D, ecdisona, ácidos retinoicos y hormonas tiroideas que pasan fácilmente por la membrana plasmática y se unen a sus receptores dentro de la célula. Las adzimas objeto pueden usarse, por ejemplo, para alterar la receptividad de una célula a una hormona particular u otro ligando de receptor nuclear tal como degradando complejos de receptores para inhibir la respuesta a una hormona de interés o degradando subunidades para otros dímeros receptores que por lo demás compiten con la formación de complejos de receptores por la hormona de interés (de forma que la adzima sea un agonista de esa hormona).

Ejemplos de ciertas dianas intracelulares se proporcionan en la Tabla VI, junto con afecciones asociadas que pueden tratarse con una adzima elegida apropiadamente como diana.

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TABLA VI Ejemplos de dianas intracelulares

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En realizaciones que implican una diana intracelular, generalmente se deseará tener una adzima que se produzca dentro de células o se diseñe para entrar en células. En ciertas realizaciones, la adzima puede incluir una o más funcionalidades que promueven la captación por células diana, por ejemplo, promueven la etapa inicial de captación del entorno extracelular. En una realización, una adzima objeto incluye un "péptido de internalización" que acciona la translocalización de la adzima a través de una membrana celular con el fin de facilitar la localización intracelular. El péptido de internalización puede cruzar por sí mismo una membrana celular por, por ejemplo, transcitosis, a una velocidad relativamente alta. El péptido de internalización está conjugado, por ejemplo, a una adzima. En ciertas realizaciones, la adzima puede expresarse a partir de un ácido nucleico que se introduce en una célula tal como un vector viral o vector de ácido nucleico desnudo o encapsulado. Los ácidos nucleicos para las producciones intracelulares de adzimas se describen en la sección titulada "Composiciones de ácidos nucleicos", más adelante.

En una realización, un péptido de internalización se deriva de la proteína Drosophila antennapedia u homólogos de la misma. Se ha demostrado que el homeodominio de 60 aminoácidos de longitud de la homeo-proteína Antennapedia se transloca por membranas biológicas y puede facilitar la translocalización de péptidos heterólogos y compuestos orgánicos a los que se acopla. Véanse, por ejemplo, Derossi y col. (1994) J Biol Chem 269: 10444-10450; y Perez y col. (1992) J Cell Sci 102: 717-722. Recientemente se ha demostrado que fragmentos tan pequeños como de 16 aminoácidos de longitud de esta proteína son suficientes para accionar la internalización. Véase Derossi y col. (1996) J Biol Chem 271: 18188-18193. La presente invención contempla una adzima que incluye al menos una parte de la proteína Antennapedia (u homólogo de la misma) suficiente para aumentar el transporte transmembrana.

Otro ejemplo de un péptido de internalización es la proteína del transactivador de VIH (TAT). Parece que esta proteína se divide en cuatro dominios (Kuppuswamy y col. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 3551-3561). La proteína TAT purificada es absorbida por células en cultivo de tejido (Frankel y Pabo, (1989) Cell 55: 1189-1193) y los péptidos tales como el fragmento correspondiente a los residuos 37-62 de TAT son rápidamente absorbidos por la célula in vitro (Green y Loewenstein, (1989) Cell 55: 1179-1188). La región sumamente básica media en la internalización y elección como diana del resto de internalización al núcleo (Ruben y col., (1989) J. Virol. 63: 1-8). Los péptidos o análogos que incluyen una secuencia presente en la región sumamente básica tal como CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGS (SEQ ID NO: 7) pueden usarse en la adzima para ayudar en la internalización.

Otra adzima a modo de ejemplo puede generarse para incluir una porción suficiente de mastoparano (T. Higashijima y col., (1990) J. Biol. Chem. 265: 14176) para aumentar el transporte transmembrana de la adzima.

Aunque no se desea quedar ligado a ninguna teoría particular, se observa que polipéptidos hidrófilos y moléculas orgánicas también pueden transportarse fisiológicamente a través de las barreras de membrana acoplando o conjugando el polipéptido a un péptido transportable que puede atravesar la membrana por transcitosis mediada por receptor. Los péptidos de internalización adecuados de este tipo pueden generarse usando toda o una parte de, por ejemplo, una histona, insulina, transferrina, albúmina básica, prolactina y factor de crecimiento I similar a insulina (IGF-I), factor de crecimiento II similar a insulina (IGF-II) u otros factores de crecimiento. Por ejemplo, se ha encontrado que un fragmento de insulina que muestra afinidad por el receptor de insulina en células capilares, y que es menos eficaz que la insulina en la reducción de la azúcar en sangre, puede hacer el transporte transmembrana por transcitosis mediada por receptor y, por tanto, puede servir de péptido de internalización para la adzima objeto. Los péptidos de internalización derivados de factores de crecimiento preferidos incluyen péptidos derivados de EGF (factor de crecimiento epidérmico) tales como CMHIESLDSYTC (SEQ ID NO: 8) y CMYIEALDKYAC (SEQ ID NO: 9); péptidos derivados de TGF-beta (factor de crecimiento transformante beta); péptidos derivados de PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) o PDGF-2; péptidos derivados de IGF-I (factor de crecimiento similar a insulina) o IGF-II; y péptidos derivados de FGF (factor de crecimiento de fibroblastos).

Otra clase de péptidos de translocación/internalización presenta unión a membrana dependiente de pH. Para un péptido de internalización que asume una conformación helicoidal a un pH ácido, el péptido de internalización adquiere la propiedad de anfifilia, por ejemplo, tiene superficies de separación tanto hidrófobas como hidrófilas. Más específicamente, dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5,0-5,5, un péptido de internalización forma una hélice alfa, estructura anfifílica que facilita la inserción del resto en una membrana diana. Un entorno de pH ácido inductor de hélice alfa puede encontrarse, por ejemplo, en el entorno de bajo pH presente dentro de endosomas celulares. Tales péptidos de internalización pueden usarse para facilitar el transporte de la adzima objeto, absorbida por un mecanismo endocítico, de compartimentos endosómicos al citoplasma.

Un péptido de internalización de unión a membrana dependiente de pH preferido incluye un alto porcentaje de residuos formadores de hélices tales como glutamato, metionina, alanina y leucina. Además, una secuencia de péptidos de internalización preferida incluye residuos ionizables que tienen pKa dentro del intervalo de pH 5-7, de manera que un dominio de unión a membrana no cargado suficiente estará presente dentro del péptido a pH 5 para permitir la inserción en la membrana de células diana.

Un péptido de internalización de unión a membrana dependiente de pH particularmente preferido a este respecto es Xaa1-Xaa2-Xaa3-EAALA(EALA)4-EALEALAA-amida (SEQ ID NO: 10) que representa una modificación de la secuencia de péptidos de Subbarao y col. (Biochemistry 26: 2964, 1987). Dentro de esta secuencia de péptidos, el primer residuo de aminoácido (Xaa1) es preferentemente un único residuo tal como cisteína o lisina que facilita la conjugación química del péptido de internalización a un conjugado de proteínas que elige diana. Los residuos de aminoácidos Xaa2-Xaa3 pueden seleccionarse para modular la afinidad del péptido de internalización para diferentes membranas. Por ejemplo, si los dos residuos 2 y 3 son Lys o Arg, el péptido de internalización tendrá la capacidad de unirse a membranas o parches de lípidos que tienen una carga superficial negativa. Si los residuos 2-3 son aminoácidos neutros, el péptido de internalización se insertará en membranas neutras.

Otros péptidos de internalización adicionales preferidos incluyen péptidos de apolipoproteína A-1 y B; toxinas de péptido tales como melitina, bombolitina, delta hemolisina y las pardaxinas; péptidos antibióticos tales como alameticina; hormonas de péptidos tales como calcitonina, factor de liberación de corticotropina, beta-endorfina, glucagón, hormona paratiroidea, polipéptido pancreático; y péptidos correspondientes a secuencias señal de numerosas proteínas secretadas. Además, los péptidos de internalización a modo de ejemplo pueden modificarse mediante unión de sustituyentes que potencian el carácter alfa-helicoidal del péptido de internalización a pH ácido.

Las proteínas o péptidos formadores de poros también pueden servir de péptidos de internalización en el presente documento. Las proteínas o péptidos formadores de poros pueden obtenerse o derivarse de, por ejemplo, proteína del complemento C9, moléculas de células T citolíticas o moléculas de células NK. Estos restos pueden formar estructuras similares a anillos en membranas, permitiendo así el transporte de la enzima unida por la membrana y en el interior de la célula.

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(c) Dianas infectivas o extrañas

Una categoría adicional de dianas para una adzima son dianas que están asociadas a un agente extraño infectivo o por lo demás no deseable tal como protistas, levaduras, bacterias, virus y priones y diversos complejos. En ciertas realizaciones, una adzima es elegida como diana contra un factor de virulencia que se expone sobre la superficie de una bacteria tal como una pilina u otra proteína adhesiva, una flagelina u otra proteína de motilidad, una proteína que facilita la entrada de la célula bacteriana en el citoplasma de la célula huésped. En ciertas realizaciones, una adzima es elegida como diana de manera que perturba un componente estructural de una pared o membrana de célula bacteriana, suficiente para producir la lisis de células. En ciertas realizaciones, una adzima es elegida como diana contra una proteína u otro componente de un virus que se requiere para la viabilidad de partículas víricos o entra en una célula huésped, por ejemplo, una proteína de un recubrimiento o cubierta viral. En otro ejemplo, una adzima puede elegirse como diana contra una toxina, un veneno, un producto químico extraño no deseable o un metal pesado.

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(d) Moléculas elegidas como diana por agentes terapéuticos desarrollados

Una solución novedosa para diseñar adzimas eficaces es identificar moléculas que son elegidas como diana por agentes terapéuticamente activos que actúan uniéndose a las moléculas elegidas como diana tales como anticuerpos monoclonales y porciones de receptores solubles. En una realización preferida, la molécula diana es una diana para un agente de unión terapéutico comercialmente disponible autorizado por la FDA. Se espera que una molécula que pueda ser elegida eficazmente como diana por un agente de unión también pueda ser elegida como diana por una adzima que proporciona un aumento de eficacia con respecto al agente de unión.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de CD52. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para linfoma linfocítico crónico de células B (LLC). La CD52 es una glicoproteína de 21-28 kD expresada sobre la superficie de linfocitos B y T normales y malignos, células NK, monocitos, macrófagos y tejidos del aparato reproductor masculino. Campath® (alemtuzumab) es un anticuerpo monoclonal de CD52 humanizado derivado de ADN recombinante (Campath-1H). Un problema asociado al uso de Campath es la toxicidad hematológica que tiende a producirse cuando se administran dosis únicas de más de 30 mg o dosis acumuladas superiores a 90 mg por semana. Por tanto, se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) como es generalmente el caso en el tratamiento con adzimas de otras enfermedades descritas más adelante. Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente CD52.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de TNF-alfa. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (EII) que incluye enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. El TNF-alfa humano es una proteína no glicosilada de 17 kDa, mientras que el TNF-alfa murino está N-glicosilado. El TNF-alfa muestra un amplio espectro de actividades biológicas y se encuentra que es una parte importante del problema de EII completo. Enbrel (etanercept; Immunex) y Remicade (infliximab; Centocor) son anticuerpos de TNF-alfa que se usan para casos graves de artritis reumatoide y enfermedad de Crohn. Los dos fármacos tienen un mecanismo muy similar, como Humira (adalimumab; Abbott), un anticuerpo de TNF muy recientemente aprobado que es mucho más fiel a la estructura del anticuerpo humano. Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente TNF.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista del receptor HER2/neu. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para cáncer de mama metastásico y/o carcinoma peritoneal ovárico o primario recurrente o refractario con sobreexpresión de HER2. El protooncogén HER2 (o c-erbB2) codifica una proteína de receptores transmembrana de 185 kDa que está estructuralmente relacionada con el receptor 1 del factor de crecimiento epidérmico (EGFR1). La sobreexpresión de proteína HER2 se observa en el 25%-30% de cánceres de mama primarios. La HERCEPTINA (trastuzumab) es una anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente con alta afinidad en un ensayo basado en células (K_{d} = 5 nM) al dominio extracelular de HER2. El anticuerpo es una IgG1 kappa murina humanizada. Un problema asociado al uso de administración de HERCEPTINA son reacciones de hipersensibilidad graves (incluyendo anafilaxia), reacciones por infusión y acontecimientos pulmonares. Por tanto, se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente HER2.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de CD33. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para leucemia mieloide aguda (LMA), el tipo más común de leucemia aguda en adultos. El antígeno CD33 es una proteína de adhesión dependiente de ácido siálico encontrada sobre la superficie de blastos leucémicos y células normales inmaduras de linaje mielomonocítico, pero no sobre células madre hematopoyéticas normales. "Milotarg" (ozogamicina gemtuzumab para inyección) es un agente quimioterápico compuesto por un anticuerpo IgG4 kappa humanizado recombinante conjugado con un antibiótico antitumoral citotóxico, caliqueamicina, aislado de la fermentación de una bacteria, Micromonospora echinospora ssp. calichensis. La porción de anticuerpo de Milotarg se une específicamente al antígeno CD33. Los efectos secundarios asociados al uso de Milotarg incluyen reacciones de hipersensibilidad que incluyen anafilaxia, reacciones por infusión, acontecimientos pulmonares y hepatotoxicidad. Por tanto, se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente CD33.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de CD3. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para rechazo de trasplante tal como rechazo de aloinjerto renal agudo, cardiaco resistente a esteroides o hepático resistente a esteroides. OKT3 (o "muromonab-CD3") es un anticuerpo monoclonal murino para el antígeno CD3 de células T humanas que actúa de inmunodepresor. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgG2a bioquímicamente purificada. Está dirigido a la glicoproteína CD3 en la superficie de células T humanas que es esencial para las funciones de células T. Se ha mostrado que las células moduladas, que reversiblemente pierden la expresión del complejo molecular de receptores de células T de CD3, pero que todavía comparten los antígenos CD4 y CD8, son funcionalmente inmunoincompetentes. Por tanto, se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente CD3.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de gpIIb/IIIa. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para infarto de miocardio agudo/angina inestable. Abciximab (ReoPro®), es el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal humano-murino quimérico 7E3. Abciximab se une al receptor de glicoproteína (GP) IIb/IIIa (\alpha_{IIb}\beta_{3}) de plaquetas humanas e inhibe la agregación plaquetaria. Abciximab también se une al receptor de vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3}) encontrado sobre plaquetas y células endoteliales de la pared de vasos y de tejido liso. Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de Fab o scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente gpIIb/IIIa.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de CD20. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para linfoma no Hodgkin (LNH) tal como linfoma no Hodgkin folicular positivo para CD20. El antígeno CD20 se encuentra sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos. El anticuerpo RITUXAN® (Rituximab) es un anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico genéticamente manipulado dirigido contra el antígeno CD20 encontrado sobre la superficie de linfocitos B normales y malignos. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgG1 kappa que contiene secuencias de región variable de cadena ligera y pesada murinas y secuencias de región constante humanas. Rituximab tiene una afinidad de unión por el antígeno CD20 de aproximadamente 8,0 nM. Un segundo fármaco aprobado, ZEVALIN (ibritumomab Tiuxetan), es el inmunoconjugado resultante de un enlace covalente de tiourea estable entre el anticuerpo monoclonal ibritumomab y el ligador-quelador tiuxetano [N-[2-bis(carboximetil)amino]-3-(p-isotiocianatofenil)-propil]-[N-[2-bis(carboximetil)amino]-2-(metil)-etil]glicina. Este ligador-quelador proporciona un sitio de quelación de alta afinidad conformacionalmente restringido para indio 111 o itrio 90. El resto de anticuerpo de ZEVALIN es ibritumomab, un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antígeno CD20. Un tercer fármaco, Bexxar (tositumomab y tositumomab con yodo 131), es otro fármaco aprobado para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin folicular positivo para CD20 con y sin transformación cuya enfermedad es resistente a Rituxan y ha recaído tras quimioterapia. Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de Fab o scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente CD20.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de la proteína F del RSV. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para infección por RSV. SYNAGIS® (PALIVIZUMAB) es un anticuerpo monoclonal humanizado (IgG1k) producido por tecnología de ADN recombinante dirigido a un epítope en el sitio antigénico A de la proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV). Palivizumab es un material compuesto de secuencias de anticuerpos humanas (95%) y murinas (5%). Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de Fab o scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente la proteína F del RSV.

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En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de CD25. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para rechazo de trasplante. Zenapax® (daclizumab) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado inmunodepresor producido por tecnología de ADN recombinante que se une específicamente a la subunidad alfa (subunidad p55 alfa, CD25 o Tac) del receptor de IL-2 de alta afinidad humano que se expresa sobre la superficie de linfocitos activados (pero no en reposo). El fármaco se une al receptor de IL-2 de alta afinidad inhibiendo así la unión de Tac por IL-2, y la activación de linfocitos. Por tanto, el anticuerpo monoclonal actúa de de puro inhibidor del agente de unión. Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de Fab o scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente CD25.

En ciertas realizaciones, la adzima es un antagonista de IL-1. Tales adzimas pueden usarse como parte de un tratamiento para artritis reumatoide. La patogénesis de AR es un procedimiento complejo que conduce a inflamación de articulaciones significativa y crónica. La interleucina 1 (IL-1) es un mediator central en AR y es una procitocina inflamatoria crítica que se ha encontrado que está en abundancia en el fluido sinovial de pacientes con AR. Kineret® (anakinra) es una forma no glicosilada recombinante del antagonista del receptor de interleucina 1 humana (IL-1Ra). Kineret® se diferencia de la IL-1Ra humana nativa en que tiene la adición de un único residuo de metionina en su extremo amino. Kineret® bloquea la actividad biológica de IL-1 inhibiendo competitivamente la unión de IL-1 al receptor de tipo I de interleucina 1 (IL-1RI) que se expresa en una amplia variedad de tejidos y órganos. Por tanto, Kineret® actúa de puro inhibidor del agente de unión. Se espera que la adzima objeto, que puede administrarse a una dosis mucho más baja debido a su naturaleza catalítica, sea una mejor alternativa terapéutica. El dominio de dirección de adzimas puede usar el mismo anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de Fab o scFv como en la presente solicitud). Como dominio catalítico puede usarse un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente IL-1.

En ciertas realizaciones, la IgE (inmunoglobulina E) puede ser la diana de una adzima. IgE es una clase de anticuerpos que protege al huésped de la invasión de parásitos. La IgE interactúa con mastocitos y eosinófilos para proteger al huésped de la invasión de parásitos. El complejo IgE-células inmunitarias también es responsable de muchas reacciones alérgicas o hipersensibilidad tales como fiebre del heno, asma, urticaria y anafilaxia. Hay dos tipos principales de receptor para la porción Fc de las IgE en células. Un receptor de alta afinidad se encuentra principalmente en mastocitos y basófilos. Un receptor de baja afinidad se encuentra en células CD23. La IgE se une a éstas y actúa de receptor de antígeno. Xolair^{TM} es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a la porción Fc de IgE y eficaz en el tratamiento de asma. Para tratar asma puede usarse una adzima elegida como diana y que reduce la actividad de IgEs (generalmente eligiendo la porción Fc como diana). El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o una porción de unión a ligando soluble de un receptor de IgE. Como dominio catalítico puede usarse una o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente IgE.

En ciertas realizaciones, el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) puede ser la diana de una adzima. El VEGF desempeña una función crítica en angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos), particularmente en tumores, y también participa en el mantenimiento de vasos sanguíneos tumorales establecidos. El VEGF es homodímero y está ligado por disulfuro. Se han identificado cuatro variantes de corte y empalme humanas de VEGF que codifican, en la forma madura, monómeros de polipéptido de 121, 165, 189 ó 206 aminoácidos. Dos tirosina cinasas receptoras (RTK), Flt-1 y FIk-1 se unen a VEGF con alta afinidad. Avastin^{TM} es un anticuerpo humanizado recombinante en investigación para VEGF y muestra eficacia en la mejora de la supervivencia de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Una adzima elegida como diana para y que reduce la actividad de VEGF puede usarse para tratar una variedad de cánceres, particularmente cáncer colorrectal. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o una porción de unión a ligando soluble de un receptor de VEGF. Como dominio catalítico pueden usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente VEGF.

En ciertas realizaciones, el EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) puede ser la diana para una adzima. El EGFR se expresa en un alto porcentaje de muchos tipos de cáncer que incluyen cánceres de cabeza y cuello, colorrectal, pancreático, de pulmón, de esófago, de células renales, de próstata, vejiga, cervical/de útero, de ovario y de mama. ERBITUX^{TM} (anteriormente conocido como IMC-C225) es un anticuerpo monoclonal quimerizado sumamente específico que se une a EGFR y bloquea la capacidad de EGF parar iniciar la activación de receptores y señalización para el tumor. Este bloqueo da como resultado una inhibición del crecimiento tumoral interfiriendo con los efectos de la activación de EGFR que incluyen invasión tumoral y metástasis, reparación y angiogénesis de células. ERBITUX^{TM} se ha usado en combinación con quimioterapia y radiación en modelos animales de cánceres humanos. Estos hallazgos preclínicos indican que cuando se combina con quimioterapia o radiación, el tratamiento con ERBITUX^{TM} proporciona un efecto antitumoral potenciado dando como resultado la eliminación de tumores y la supervivencia a largo plazo de los animales. Una adzima elegida como diana para y que reduce la presencia de la unión a ligandos o capacidad de señalización de EGFR puede usarse para tratar o prevenir una variedad de cánceres, particularmente cáncer colorrectal, y particularmente cuando se usa en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o un ligando soluble (tal como EGF) para EGFR. Como dominio catalítico pueden usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente porciones extracelulares de EGFR.

En ciertas realizaciones, una o más integrinas alfa-4 tales como beta-1 y beta-7 pueden ser la(s) diana(s) para una adzima. Las integrinas son proteínas transmembrana, y las integrinas alfa-4-beta 1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 ayudan a los glóbulos blancos sanguíneos, particularmente linfocitos T y eosinófilos, a moverse por las paredes de los vasos sanguíneos en los tejidos del cuerpo a sitios de inflamación en los que estas células participan entonces en el proceso inflamatorio. Antegren® es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a y bloquea tanto las integrinas beta-1 como beta-7 previniendo la contribución de muchos tipos de células a la inflamación; Antegren® muestra eficacia para el tratamiento de enfermedad de Crohn. Una adzima elegida como diana para y que reduce la presencia o capacidad de unión a ligandos de estas integrinas puede usarse para tratar o prevenir una variedad de enfermedades inflamatorias, particularmente enfermedad de Crohn. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o un ligando soluble para las integrinas alfa-4 elegidas como diana. Como dominio catalítico pueden usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente porciones extracelulares de las integrinas elegidas como diana.

En ciertas realizaciones, CCR-5 puede ser la diana de una adzima. El receptor de quimiocinas CCR5 humano es un miembro de la superfamilia de la rodopsina de receptores ligados a G que tienen siete dominios transmembrana hidrófobos. CCR5 se une a RANTES, MIP-1\beta y MIP-1\alpha. Raport, C.J. y col. (1996) J. Biol. Chem. 271: 17161. CCR5 facilita la infección por el virus VIH-1 trópico de macrófagos, RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta pueden suprimir la infección de células susceptibles por cepas aisladas de VIH-1 trópico de macrófagos. Choe, H. y col. (1996) Cell 85: 1135. Cocchi, F. y col. (1995) Science 270: 1811. Aunque no se ha aprobado ningún agente de afinidad que elige CCR-5 como diana, CCR-5 participa en la infección por VIH, y una adzima elegida como diana para y que reduce la presencia o capacidad de unión a VIH de CCR-5 puede usarse para tratar o prevenir asma y otras reacciones alérgicas. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o un ligando soluble para CCR-5. Como dominio catalítico pueden usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente porciones extracelulares
de CCR-5.

En ciertas realizaciones, la interleucina 4 puede ser la diana de una adzima. La IL-4 humana es una citocina pleiotrópica producida por células T activadas, mastocitos y basófilos. Los efectos biológicos de IL-4 están mediados por la unión de IL-4 a receptores de superficie celular específica. El receptor de alta afinidad funcional para IL-4 incluye una subunidad de unión a ligando (IL-4 R) y una segunda subunidad (cadena \beta) que puede modular la afinidad de unión a ligando del complejo receptor. La cadena gamma del complejo receptor de IL-2 también puede ser una cadena \beta funcional del complejo receptor de IL-4. La IL-4 madura es una proteína de 129 aminoácidos Yokota, T. y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5894. La actividad de IL-4 puede medirse, por ejemplo, en un ensayo de proliferación celular que emplea una línea celular dependiente de factor humano, TF-1. Kitamura y col., 1989 J. Cell Physiol. 140: 323. Aunque no se ha aprobado ningún agente de afinidad que elige IL-4 como diana, la IL-4 participa en alergias y asma, y una adzima elegida como diana para y que reduce la actividad de IL-4 puede usarse para tratar o prevenir asma y otras reacciones alérgicas. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o una porción de unión a ligando soluble de un receptor de IL-4. Como dominio catalítico pueden usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente IL-4.

En ciertas realizaciones, IL-13 puede ser la diana de una adzima. Aunque no se ha aprobado ningún agente de afinidad que elige IL-13 como diana, la IL-13 es ampliamente reconocida como una citocina que participa en asma y diversas alergias. La IL-13 humana madura es un polipéptido de 112 aminoácidos que tiene una secuencia como se describe en el número de registro de GenBank P35225. McKenzie y col. 1993, PNAS USA 90: 3735-3739. La actividad de IL-13 puede medirse, por ejemplo, en un ensayo de proliferación celular que emplea una línea celular dependiente de factor humano, TF-1. Kitamura y col., 1989 J. Cell Physiol. 140: 323. Una adzima elegida como diana para y que reduce la actividad de IL-13 puede usarse para tratar o prevenir asma y otras reacciones alérgicas. El dominio de dirección de adzimas puede usar un anticuerpo monoclonal o derivado funcional del mismo (tal como un derivado de scFv como en la presente solicitud) o una porción de unión a ligando soluble de un receptor de IL-13. Como dominio catalítico puede usarse uno o más de un panel de proteasas que pueden digerir eficazmente IL-13.

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(i) Antagonistas de TNF\alpha

En ciertas realizaciones, la adzima objeto es un antagonista de TNF\alpha, por ejemplo, una "adzima de antagonista de TNF\alpha". El TNF\alpha es un homotrímero soluble de 17 kD subunidades de proteína. También existe una forma de precursor de 26 kD unido a membrana de TNF\alpha. Las actividades pleiotrópicas del potente TNF inflamatorio de procitocina están mediadas por dos receptores estructuralmente relacionados, pero funcionalmente distintos, p55 y p75, que se coexpresan en la mayoría de los tipos de células. Para ejercer su actividad biológica, el TNF\alpha (una molécula homotrimérica) deber unirse a al menos 2 receptores de la superficie celular produciendo la reticulación y señalización de células. La mayoría de las respuestas biológicas clásicamente atribuidas a TNF\alpha están mediadas por p55. A diferencia, p75 se ha propuesto para actuar tanto de antagonista de TNF neutralizando TNF\alpha como de agonista de TNF\alpha facilitando la interacción entre TNF\alpha y p55 en la superficie celular. Las funciones de p55 y p75 en la mediación y modulación de la actividad de TNF\alpha in vivo se han examinado en ratones genéticamente deficientes en estos receptores. Las carencias selectivas en varias respuestas de defensa e inflamatorias en huéspedes se observan en ratones que carecen de p55 o tanto de p55 como de p75, pero no en ratones que carecen de p75. En estos modelos, la actividad de p55 no está alterada por la ausencia de p75, que argumenta en contra de una función fisiológica para p75 como un elemento esencial de la señalización mediada por p55. A diferencia, la inflamación pulmonar exacerbada y niveles de TNF\alpha en suero inducidos por endotoxina espectacularmente aumentados en ratones que carecían de p75 sugieren una función dominante para p75 en la supresión de respuestas inflamatorias mediadas por TNF\alpha.

El receptor p55 (también llamado TNF-R55, TNF-RI o TNFR\alpha) es una glicoproteína de 55 kd que se muestra que transduce señales dando como resultado actividades citotóxicas, antivíricos y proliferativas de TNF\alpha. El receptor p75 (también llamado TNF-R75, TNF-RII o TNFR\alpha) es una glicoproteína de 75 kDa que también se muestra que transduce señales citotóxicas y proliferativas, además de señales que dan como resultado la secreción de GM-CSF. Los dominios extracelulares de los dos receptores tienen el 28% de homología y tienen en común un conjunto de cuatro subdominios definidos por numerosos residuos de cisteína conservados. Sin embargo, el receptor p75 se diferencia en que tiene una región adyacente al dominio transmembrana que es rica en residuos de prolina y contiene sitios para glicosilación ligada en O. De manera interesante, los dominios citoplásmicos de los dos receptores no comparten homología aparente que sea coherente con observaciones que pueden transducir diferentes señales al interior de la célula.

Para ilustrar adicionalmente, un antagonista de adzima de TNF\alpha puede dirigirse a TNF\alpha, por ejemplo, en fluidos biológicos, a modo de uno o más restos de TNF\alpha que eligen diana. Restos de TNF\alpha a modo de ejemplo que eligen diana incluyen, pero no se limitan a, los dominios extracelulares de receptores de TNF\alpha (o porciones apropiadas de los mismos), anticuerpos anti-TNF\alpha o fragmentos de unión a antígeno de los mismos o péptidos o moléculas pequeñas que se unen (selectivamente) a TNF\alpha.

En ciertas realizaciones preferidas, el resto que elige diana se deriva del dominio de unión a ligando extracelular del receptor p75 o p55, por ejemplo, una parte suficiente para unirse específicamente a TNF-\alpha. Por ejemplo, el resto que elige diana puede incluir un fragmento de unión a ligando de p75 tal como de Leu23-Asp257 de la proteína p75 humana (registro de Swiss-Prot P20333) o un fragmento de unión a ligando de p55 tal como de Ile22-Thr211 de la proteína p55 humana (registro de Swiss-Prot P19438). En ciertas realizaciones, el resto que elige diana de las adzimas objeto puede generarse a partir de Onercept (un fragmento soluble completamente humano de p55) o Etanercept (Enbrel®, un constructo dimérico en el que dos fragmentos extracelulares de p75 están ligados a la porción Fc de IgG1 humana).

En otras realizaciones preferidas, el resto que elige diana se deriva de un anticuerpo que se une a TNF\alpha, o un dominio de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, las adzimas objeto pueden generarse usando el anticuerpo anti-TNF\alpha monoclonal infliximab (Remicade®) o los dominios variables de una o ambas de las cadenas pesadas y ligeras de los mismos tales como el fragmento Fv. Infliximab es un anticuerpo anti-TNF\alpha monoclonal humano/de ratón quimérico compuesto por las regiones constantes de IgG1\kappa humana (Hu) acopladas a la región Fv de un anticuerpo anti-HuTNFa murino neutralizante de alta afinidad. Asimismo, la adzima objeto puede incluir un resto que elige diana derivado del anticuerpo anti-TNF humano D2E7, también conocido como adalumimab.

En otras realizaciones adicionales, el resto de TNF\alpha que elige diana es un péptido. Por ejemplo, Guo y col. (2002) Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 22(7): 597 describen el cribado de péptidos de unión a TNF\alpha por expresión en fago cuya referencia enseña varios péptidos cortos que podrían usarse para generar adzimas que eligen TNF\alpha como diana. Simplemente para ilustrar, el resto que elige TNF\alpha como diana puede ser un péptido que tiene la secuencia ALWHWWH (SEQ ID NO: 11) o (T/S)WLHWWA (SEQ ID NO: 12).

La capacidad de cualquier adzima particular para actuar alterando la actividad de TNF\alpha puede ensayarse usando cualquiera de una variedad de sistemas de ensayo basados en células y sin células muy conocidos en la técnica. Ensayos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, ensayo de L929, ensayos de procoagulación endotelial, ensayos de deposición de fibrina tumoral, ensayo de citotoxicidad, ensayos de regresión tumoral, ensayos de unión a receptor, ensayos de índice artrítico en sistemas de modelo de ratón y similares. En ciertas realizaciones preferidas de adzimas de antagonistas TNF\alpha, sus actividades biológicas incluirán una o más de: inhibición de citotoxicidad de TNF-\alpha en células L929; bloqueo de la producción de prostaglandina E2 y expresión de IL-1 asociada a células por fibroblastos dérmicos humanos; bloqueo de la unión de TNF-\alpha a la línea celular promonocítica U937; bloqueo del estallido respiratorio inducido por TNF-\alpha en neutrófilos humanos; bloqueo de la respuesta de quimioluminiscencia dependiente de lucigenina estimulada por TNF y formación de superóxidos; reducción significativa de la capacidad de cebado de TNF-\alpha para una respuesta al péptido quimiotáctico fMLP; bloqueo de la expresión de antígenos de clase I en la línea celular tumoral Colo 205 humana; afectación de la sinergia de TNF-\alpha con expresión del antígeno HLA-DR inducida por IFN-\gamma (que preferentemente todavía no tiene efecto sobre la actividad de IFN-\gamma).

En ciertas realizaciones, la adzima de antagonista de TNF\alpha modificará la proteína TNF\alpha de sustrato de un modo que produzca un producto que es por sí mismo un antagonista de TNF\alpha. Por ejemplo, la adzima puede incluir un dominio catalítico que escinde un sitio en el polipéptido de TNF\alpha para producir un producto que conserva la capacidad de unirse, por ejemplo, al receptor p55 pero con una capacidad enormemente reducida para activar el receptor (por ejemplo, tiene una capacidad alterada para inducir una respuesta citotóxica) de manera que sea un antagonista de TNF\alpha nativo. Por ejemplo, el producto de escisión puede conservar la capacidad de interacción con TNF\alpha nativo para formar trímeros mixtos estables que se unen a receptores pero que no pueden activar la señalización de receptores. Para ilustrar adicionalmente, los sitios dentro de la molécula de TNF-\alpha humana que pueden elegirse como diana para la escisión por una adzima pueden localizarse en o cerca de los residuos 29 a 34, 71-73, 86 y 143-146. Por ejemplo, un dominio catalítico que tiene una especificidad similar a tripsina puede usarse en una adzima que escinde selectivamente Arg^{44} de TNF\alpha humano. Asimismo, una adzima que incluye el dominio catalítico de la granzima B puede usarse para elegir como diana Asp^{143}. Se cree que los residuos dentro de estas regiones son importantes para la actividad citotóxica de TNF-\alpha. Los productos de escisión de adzimas que tienen la combinación de actividad de antagonista y citotoxicidad reducida pueden identificarse por los ensayos de cribado anteriormente descritos.

Las adzimas de antagonistas de TNF\alpha objeto pueden usarse para tratar diversos trastornos asociados con TNF, por ejemplo, trastornos o enfermedades que están asociados a, resultan de y/o se producen en respuesta a niveles elevados de TNF\alpha. Tales trastornos pueden asociarse a niveles elevados episódicos o crónicos de actividad de TNF\alpha y/o a un aumento local o sistémico en la actividad de TNF\alpha. Tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias tales como artritis y enfermedad inflamatoria del intestino, e insuficiencia cardiaca congestiva.

El TNF\alpha produce acciones proinflamatorias que dan como resultado lesión de tejidos tales como degradación de cartílago y hueso, inducción de moléculas de adhesión, inducción de actividad procoagulante en células endoteliales vasculares, aumento de la adherencia de neutrófilos y linfocitos y estimulación de la liberación del factor activador de plaquetas a partir de macrófagos, neutrófilos y células endoteliales vasculares. En ciertas realizaciones preferidas, la adzima de antagonista de TNF\alpha reduce la actividad inflamatoria de TNF\alpha.

La evidencia reciente también asocia TNF\alpha a infecciones, trastornos inmunitarios, patologías neoplásicas, patologías autoinmunitarias y patologías de injerto frente a huésped. Por ejemplo, se entiende que el TNF\alpha desempeña una función primordial en septicemia gram-negativa y choque endotóxico que incluye fiebre, malestar, anorexia y caquexia. La endotoxina activa fuertemente la producción de monocitos/macrófagos y la secreción de TNF\alpha y otras citocinas (Kombluth y col., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)). Los niveles de TNF\alpha en circulación aumentan en pacientes que padecen septicemia gram-negativa. Por tanto, las adzimas de antagonistas de TNF\alpha objeto pueden usarse como parte de un protocolo de tratamiento para enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, infecciones víricos, bacterianas y parasíticas, tumores malignos y enfermedades neurogenerativas tales como para terapia en artritis reumatoide y enfermedad de Crohn.

Hay pruebas de que el TNF\alpha también participa en caquexia, en cáncer, patología infecciosa y otros estados catabólicos. Por consiguiente, las adzimas de antagonistas de TNF\alpha también pueden usarse para reducir la atrofia muscular progresiva asociada a tales trastornos, o cualquier otro en el que la caquexia es un asunto en el tratamiento de pacientes.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una adzima de la presente invención para uso en procedimientos en los que las adzimas objeto pueden usarse como parte de tratamientos para modular o reducir la gravedad de al menos una enfermedad inmunitaria relacionada en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil de aparición sistémica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías seronegativas, osteoartritis, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolípido, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, sarcoidosis, orquitis/procesos inversos de vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eccema, dermatitis alérgica de contacto, conjuntivitis alérgica, neumonitis por hipersensibilidad, trasplantes, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad de injerto frente a huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de septicemia, septicemia gram-positiva, septicemia gram-negativa, septicemia negativa en cultivo, septicemia fúngica, fiebre neutropénica, urosepticemia, meningococcemia, traumatismo/hemorragia, quemaduras, exposición a radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome disneico del adulto, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia de células falciformes, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafilaxia sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de trasplante de riñón, rechazo de trasplante de corazón, rechazo de trasplante de hígado, rechazo de trasplante de páncreas, rechazo de trasplante de pulmón, rechazo de trasplante de médula ósea (TMO), rechazo de aloinjerto de piel, rechazo de trasplante de cartílago, rechazo de injerto de hueso, rechazo de trasplante de intestino delgado, rechazo de implante de timo fetal, rechazo de trasplante de paratiroides, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, enfermedad de Graves, enfermedad de Raynaud, diabetes resistente a insulina tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidad mediada por anticuerpos, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, lupus eritematoso sistémico, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios en la piel), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal, síndrome de cambios en la piel, síndrome antifosfolípido, pénfigo, esclerodermia, enfermedad de tejido conjuntivo mixto, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitiligo, vasculitis, síndrome de cardiotomía posterior a IM, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis de contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a fármacos, metabólico/idiopático, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de alfa-1-antitripsina, retinopatía diabética; tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal, cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar crónica neonatal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), linfohistiocitosis hemofagocítica familiar, afecciones dermatológicas, psoriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, fallo renal agudo, hemodiálisis, uremia, toxicidad, preeclampsia, terapia con okt3, terapia anti-cd3, terapia con citocinas, quimioterapia, radioterapia (por ejemplo, que incluye pero no se limita a, astenia, anemia, caquexia y similares), intoxicación crónica por salicilatos y similares.

En una realización, una adzima de TNF\alpha es para uso para tratar hipergastrinemia tal como gastritis inducida por Helicobacter pylori.

La presente invención también proporciona las adzimas de antagonistas de TNF\alpha objeto para uso en la modulación o tratamiento de al menos una enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de síndrome de aturdimiento cardiaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico, hemorragia, arteriosclerosis, aterosclerosis, reestenosis, enfermedad arteriosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, choque, sífilis del sistema cardiovascular, insuficiencia cardiaca, corazón pulmonar, hipertensión pulmonar primaria, arritmias cardiacas, latidos ectópicos atriales, aleteo auricular, fibrilación atrial (sostenida o paroxística), síndrome pos-perfusión, respuesta a inflamación por derivación cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica o multifocal, taquicardia con QRS estrecha regular, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias del fascículo de His, bloqueo auriculoventricular, bloqueo de rama, trastornos isquémicos miocárdicos, enfermedad de las arterias coronarias, angina de pecho, infarto de miocardio, cardiomiopatía, cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía restrictiva, enfermedades cardiacas valvulares, endocarditis, enfermedad pericárdica, tumores cardiacos, aneurismas aórticas y periféricas, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad ateriosclerótica periférica, tromboangeítis obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno y enfermedad de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, síndrome pos-bomba, lesión por isquemia-reperfusión y similares.

La presente invención también proporciona las adzimas de antagonistas de TNF\alpha objeto para uso en la modulación o el tratamiento de al menos una enfermedad infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de: infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasíticos o infecciosos agudos y crónicos que incluyen infecciones bacterianas, víricos y fúngicas, infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis (A, B o C, o similares), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, infección por E. coli, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, fiebre hemorrágica de dengue, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, neumonia por Pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, gripe a, virus de Epstein-barr, síndrome hemafagocítico asociado a virus, encefalitis viral/meningitis aséptica y similares.

La presente invención también proporciona las adzimas de la invención para uso en la modulación o el tratamiento de al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), célula B, célula T o FAB ALL, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielocítica crónica (LMC), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (SMD), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de tumor maligno, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, cáncer relacionado con resorción ósea, cáncer relacionado con dolor óseo y similares.

La presente invención también proporciona adzimas de antagonistas de TNF\alpha para uso en la modulación o el tratamiento de al menos una enfermedad neurológica en una célula, tejido, órgano, animal o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de: enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, migraña, cefalea, complejo SIDA-demencia, enfermedades desmielinizantes tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios basales o trastornos cerebelosos; trastornos del movimiento hipercinéticos tales como enfermedad de Huntington y enfermedad senil; trastornos del movimientos inducidos por fármacos tales como aquellos inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC; trastornos del movimiento hipocinéticos tales como enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones corticales cerebelosas, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia y trastorno multisistémico mitocondrial); trastornos centrales desmielinizantes tales como esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración de células del asta anterior tal como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la madurez; enfermedad difusa de cuerpos de Lewy; demencia senil de tipo cuerpos de Lewy; síndrome de Wemicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallervorden-Spatz; y demencia pugilística, y similares.

Las adzimas de antagonistas de TNF\alpha pueden administrarse antes, simultáneamente y/o después de (denominado este documento "concomitantemente con") otros fármacos tales como al menos uno seleccionado de un antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antifúngico, un antiparasítico, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una fluoroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un agente alimenticio, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarréico, un antitusivo, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, leucina), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunodepresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de sustitución de hormonas, un modulador de receptores de estrógeno, un midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un antidepresivo, agente antimaníaco, un antipsicótico, un anxiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezilo, tacrina, una medicación contra el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocinas.

Las adzimas objeto también pueden administrarse concomitantemente con compuestos que previenen y/o inhiben la señalización de receptores de TNF tales como inhibidores de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben la escisión de TNF de membrana tales como inhibidores de metaloproteinasas; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF tales como inhibidores de enzimas conversoras de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o síntesis de TNF tales como inhibidores de cinasas MAP.

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(ii) Antagonistas de IL-1b

En ciertas realizaciones, la adzima objeto es un antagonista de interleucina 1, por ejemplo, una "adzima de antagonistas de IL-1". La interleucina 1 es una citocina proinflamatoria multifuncional que media respuestas inmunitarias innatas y adaptivas en múltiples tipos de células. Se cree que desempeñan una función en numerosas enfermedades que incluyen artritis, asma/alergia, osteoporosis y accidente cerebrovascular (para la revisión véase Dinarello (1998) Int. Rev. Immunol. 16, 457-499). La familia de IL-1 está constituida en realidad por dos proteínas con actividad biológica similar, IL-1\alpha y IL-1\beta, además de un ligando de no señalización llamado el antagonista de receptores de IL-1 (IL-1ra). Las tres proteínas presentan una estructura terciaria similar que comprende hebras 12\beta que representan un \beta-trébol con forma de barril con seudosimetría de 3 pliegues. Se cree que la IL-1 \beta es la citocina circulante primaria que media en los efectos sistémicos de IL-1.

La IL-1 ejerce su acción biológica uniéndose a y activando la IL1R-I asociada a membrana. Un segundo receptor, llamado la proteína accesoria de IL-1R (AcP), no participa en la unión a ligando directa pero se requiere para la transducción de señales de IL-1 complejándose con IL-1 y IL1R-I. IL1R-I y AcP contienen ambas porciones extracelulares con tres dominios similares a Ig y porciones citoplásmicas que contienen motivos de señalización conservados. Existe un tercer receptor de IL-1 llamado la IL-1R de tipo II (IL1R-II) que tiene una estructura extracelular similar a la de IL1R-I y AcP pero que contiene una cola citoplásmica truncada que no puede señalizar. Este receptor actúa de señuelo uniéndose a IL-1 con alta afinidad y neutralizando su actividad. La IL1R-II también puede escindirse proteolíticamente, que libera el dominio extracelular de la superficie celular. Esto crea una forma soluble del receptor (sIL1R-II) que posee alta afinidad por IL-1\beta, pero sólo baja afinidad por IL-1\alpha, y prácticamente ninguna afinidad por IL-1ra.

En ciertas realizaciones preferidas, las adzimas objeto son adzimas de antagonistas de IL-1 que actúan sobre IL-1, particularmente IL-1\beta, presente en fluidos biológicos. Restos que eligen IL-1 como diana a modo de ejemplo que se adaptan para uso en tales adzimas incluyen, pero no se limitan a, los dominios extracelulares de receptores de IL-1 o porciones apropiadas de los mismos, IL1R-II o una parte de la misma, anticuerpos anti-IL-1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos o péptidos o moléculas pequeñas que se unen (selectivamente) a IL-1.

En ciertas realizaciones preferidas, el resto que elige diana se deriva de IL1R-II, por ejemplo, una parte suficiente para unirse específicamente a IL-1\beta. Por ejemplo, el resto que elige diana puede incluir un dominio de unión a ligando de IL1R-II de la proteína IL1R-II humana (registro de GI 640248, registro de PRI 2IRT_A).

La actividad inhibitoria de una adzima de antagonistas de IL-1 puede ensayarse usando cualquiera de una variedad de sistemas de ensayo basados en células y sin células muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, las adzimas de antagonistas de IL-1 pueden identificarse usando el ensayo de respuesta de linfocitos mixtos (MLR) y de fitohemaglutinina A (PHA) que es útil para identificar moléculas supresoras inmunitarias in vitro que puede usarse para tratar enfermedad de injerto frente a huésped. Los resultados obtenidos de estos ensayos son generalmente predictivos en sus eficacias in vivo.

Otro ensayo que se usa para evaluar la adzima con respecto a la inhibición de receptividad inmunitaria implica la estimulación mitogénica de linfocitos con sustancias mitogénicas de origen vegetal. La molécula vegetal más ampliamente usada es PHA. Aunque la PHA estimula la síntesis de ADN no específicamente en un gran número de linfocitos, a diferencia de la estimulación antigénica real que produce la mitogénesis de subpoblaciones de linfocitos, se ha mostrado que la susceptibilidad de los linfocitos de un paciente a la estimulación por PHA guarda relación con la receptividad inmunitaria global del paciente.

Por tanto, se apreciará que tanto el ensayo de linfocitos mixtos como de PHA son valiosos para identificar adzimas de antagonistas de IL-1 supresoras inmunitarias.

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Además de los ensayos inmunodepresores anteriores también puede usarse un ensayo de reacción de linfocitos mixtos secundarios. Los ensayos de linfocitos mixtos secundarios se diferencian de los ensayos de reacción de linfocitos mixtos primarios en que emplean muchas más células que responden a cebadores que son sensibles a las células estimulantes primarias. La presencia de tales células sensibles es una reflexión de la memoria inmunológica en una respuesta inmunológica en marcha. El protocolo para llevar a cabo un ensayo de linfocitos mixtos secundarios implica realizar un ensayo de linfocitos primarios como se describe anteriormente y la recuperación de células viables aproximadamente 9-10 días después de la reacción de linfocitos mixtos primarios presenta poca o ninguna proliferación celular. Generalmente se recuperan entre el 10% y el 50% de las células de entrada originales en condición viable. Entonces, estas células se usan en la reacción de linfocitos mixtos secundarios.

Las adzimas objeto también pueden evaluarse para su capacidad para bloquear la producción de citocinas mediadas por IL-1. Los ensayos para la producción y/o proliferación de citocinas de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o timocitos son muy conocidos en la técnica.

En otras realizaciones adicionales, las adzimas objeto pueden evaluarse para su efecto sobre la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas.

En ciertas realizaciones, la adzima de antagonistas de IL-1 modificará la proteína IL-1\beta de sustrato de un modo que se produzca un producto que por sí mismo es un antagonista de IL-1\beta. Por ejemplo, la adzima puede incluir un dominio catalítico que escinde un sitio del polipéptido de IL-1\beta para producir un producto que conserva la capacidad para unirse, por ejemplo, al receptor de IL-1, pero con una capacidad enormemente reducida para activar el receptor de manera que sea un antagonista de IL-1\beta nativa. Para ilustrar adicionalmente, el residuo Arg^{127} de IL-1\beta humana puede elegirse como diana para la escisión por una adzima que tiene un dominio catalítico con especificidad similar a tripsina. Se ha mostrado que la mutación de Arg^{127} reduce enormemente la bioactividad de IL-1\beta, mientras que sólo tiene un ligero efecto sobre la afinidad de unión a receptor.

Las enfermedades mediadas por IL-1 que pueden tratarse o prevenirse por las adzimas de antagonistas de IL-1 de esta invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas y enfermedades degenerativas. Las enfermedades mediadas por apoptosis que pueden tratarse o prevenirse por las adzimas de antagonistas de IL-1 de esta invención incluyen enfermedades degenerativas.

Las enfermedades inflamatorias que pueden tratarse o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, osteoartritis, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma y síndrome disneico del adulto. Preferentemente, la enfermedad inflamatoria es osteoartritis o pancreatitis aguda.

Las enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves, gastritis autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de insulina (tipo I), anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, trombocitopenia, hepatitis activa crónica, miastenia grave, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, psoriasis y enfermedad de injerto frente a huésped. Preferentemente, la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o psoriasis.

Los trastornos óseos destructivos que pueden tratarse o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis y trastorno óseo relacionado con mieloma múltiple.

Las enfermedades proliferativas que pueden tratarse o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, melanoma metastásico, sarcoma de Kaposi y mieloma múltiple.

Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse incluyen, pero no se limitan a, septicemia, choque séptico y shigelosis.

Las enfermedades degenerativas o necróticas mediadas por IL-1 que pueden tratarse o prevenirse por las adzimas de antagonistas de IL-1 de esta invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia cerebral e isquemia miocárdica. Preferentemente, la enfermedad degenerativa es enfermedad de Alzheimer.

Las enfermedades degenerativas mediadas por apoptosis que pueden tratarse o prevenirse por las adzimas de antagonistas de IL-1 de esta invención incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia cerebral, isquemia miocárdica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, encefalitis relacionada con el SIDA, encefalitis relacionada con el VIH, envejecimiento, alopecia y lesión neurológica debida a accidente cerebrovascular.

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(e) Dianas biomoleculares en contextos no terapéuticos

Las adzimas pueden usarse en varias aplicaciones no médicas que incluyen, pero no se limitan a, agricultura, protección del medioambiente, alimentos, etc., y, por tanto, tales adzimas se elegirán como diana.

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Las adzimas pueden usarse para elevar la calidad nutricional y eliminar factores antinutricionales de componentes de piensos tales como piensos basados en cebada y trigo. Las dianas para tales adzimas pueden incluir harina de gluten, fibra, priones (por ejemplo, PrP, el agente causante de la encefalopatía espongiforme bovina), dioxina, pesticidas, herbicidas, almidones, lípidos, celulosa, pectina, ciertos azúcares (por ejemplo, lactosa, maltosa) y polisacáridos.

La adzima puede usarse en procedimientos industriales tales como el procesamiento de residuos, fabricación textil o producción de papel, o esencialmente cualquier otro procedimiento que emplee una enzima en el que la enzima puede sustituirse por una adzima con eficacia mejorada. Ejemplos de dianas para tales aplicaciones incluyen celulosa, hemicelulosa, pectina, lignina, almidón, peróxidos, fosfatos y nitratos.

La adzima puede usarse en detergentes u otros agentes de limpieza proporcionando la eliminación elegida como diana de suciedades o manchas seleccionadas. Las dianas para tales adzimas pueden incluir clorofila, hemoglobina, grupos hemo, hidrocarburos, avidina, albúmina de huevo y diversos pigmentos y colorantes.

Las adzimas pueden usarse para la limpieza de diversos contaminantes medioambientales como aceite, pesticidas, herbicidas y productos de desecho de la fabricación química. Las dianas para tales adzimas incluyen hidrocarburos, hidrocarburos halogenados (particularmente hidrocarburos halogenados que contienen restos aromáticos), cianuros, monóxido de carbono, óxidos nitrosos, metales pesados, compuestos organometálicos, organofosfatos y carbamatos.

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B. Dominios catalíticos a modo de ejemplo

La presente invención proporciona un dominio catalítico de mesotripsina y diversos fragmentos funcionales y derivados del mismo. Tales fragmentos y derivados funcionales naturales o modificados/mutados/manipulados pueden o permanecer solos o actuar en el contexto de adzima.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio catalítico" incluye cualquier resto de mesotripsina que puede actuar sobre una diana para inducir un cambio químico modulando así su actividad, es decir, cualquier resto de mesotripsina que pueda catalizar una reacción dentro de una diana. El dominio catalítico de mesotripsina puede ser una mesotripsina que se produce naturalmente (a partir de todas y cada una de las especies), un fragmento catalíticamente activo de la misma o una enzima manipulada, por ejemplo, una proteína manipulada para tener una actividad enzimática adicional o potenciada tal como una mesotripsina diseñada para contener cambios de secuencias de aminoácidos que dan como resultado la adición o mejora de una o más funciones deseables de la enzima natural (por ejemplo, estabilidad potenciada). Un dominio catalítico sólo necesita comprender, como mínimo, la disposición de aminoácidos que son eficaces para inducir el cambio químico deseado en la diana. Pueden ser versiones truncadas del extremo N o extremo C de enzimas naturales, versiones mutadas, zimógenos o dominios globulares completos.

El dominio catalítico de mesotripsina puede comprender un sitio enzimáticamente activo que solo es promiscuo, uniéndose a un sitio vulnerable que reconoce de muchas biomoléculas diferentes, y puede tener una cinética de reacción relativamente pobre. Estos dos rasgos son normalmente antitéticos para el desarrollo de fármacos tanteados, pero frecuentemente son deseables en constructos de adzimas en los que la dirección especifica preferencia por la biomolécula elegida como diana deseada, y sus propiedades de unión dominan frecuentemente la cinética, es decir, aseguran la colisión preferencial entre el sitio catalíticamente activo y la diana.

El dominio catalítico de mesotripsina también puede ser una proteína que modifica la diana de manera que sea reconocida y accionada por otra enzima (por ejemplo, una enzima que ya está presente en un sujeto). En otra realización, el dominio catalítico de mesotripsina puede ser un resto que altera la estructura de la diana de manera que su actividad se inhibe o se regula por incremento. Muchas enzimas que se producen naturalmente activan otras enzimas, y éstas pueden explotarse según la invención.

Se han identificado muchas mesotripsinas de diferentes especies/organismos y pueden encontrarse en bases de datos públicas, por ejemplo, SwissProt, PIR, PRF, o las bases de datos mantenidas por los Centros nacionales para la información biotecnológica (NCBI).

Se reproducen a continuación el ADNc de la mesotripsina humana y las secuencias de proteínas (nº de registro de NCBI RefSeq NM_002771 & NP_002762, respectivamente):

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La mesotripsina es un tripsinógeno que es miembro de la familia de la tripsina de las serina proteasas. Esta enzima se expresa en el cerebro y el páncreas, y es resistente a los inhibidores de tripsina comunes. Es activa en enlaces peptídicos implicando el grupo carboxilo de lisina o arginina. Se han descrito variantes de transcritos adicionales para este gen, pero no se han determinado sus secuencias de longitud completa.

La secuencia del ADNc correspondiente se describe a continuación:

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A continuación se describen ciertas secuencias variantes de mesotripsina humana con los siguientes números de registro de bases de datos públicas (las secuencias asociadas se incorporan en el presente documento por referencia): CAI39655.1; CAA33527.1; AAH30238.1; CAB58178.1; S33496; CAH69873.1; I38363; AAL14243.1; AAC80208.1; 1H4W_A; y CAA50484.1. Todas las variantes humanas son generalmente aproximadamente del 95 a aproximadamente el 100% de idénticas con la secuencia de consulta humana.

Ciertas secuencias de mesotripsina de primate o relacionadas (tales como aquellas de Macaca mulatta (mono rhesus) o Pan troglodytes (chimpancé)) son generalmente aproximadamente el 90% de idénticas con la secuencia de consulta humana. Pueden recuperarse de, por ejemplo, bases de datos públicas (o privadas) usando la secuencia de mesotripsina humana y cualquier algoritmo de comparación de secuencias tal como NCBI BLAST.

Similarmente, ciertas otras mesotripsinas de mamífero tales como aquellas de rata, ratón, perro o bovino son generalmente aproximadamente el 75-80% de idénticas con la secuencia de consulta humana. Y otros homólogos vertebrados son generalmente aproximadamente el 65-70% de idénticos con la secuencia de consulta humana.

Por tanto, la mesotripsina de la presente invención incluye mesotripsinas que se producen naturalmente, fragmentos funcionales y secuencias variantes de las mismas que son al menos aproximadamente el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más de idénticas con la secuencia de consulta humana descrita anteriormente. Los fragmentos funcionales pueden determinarse por su capacidad para digerir un sustrato de mesotripsina tal como TNF usando cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento.

El término "se corresponde con" se usa en el presente documento para significar que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente evolutivamente relacionada) a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia. En contradicción, el término "complementaria a" se usa en el presente documento para significar que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" se corresponde con una secuencia "TATAC" de referencia y es complementaria a una secuencia "GTATA" de referencia.

Los siguientes términos se usan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencias", "porcentaje de identidad de secuencias" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" o "secuencia de consulta" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia de genes dada en una lista de secuencias tales como un polipéptido de mesotripsina humano o secuencia de polinucleótidos descritos anteriormente, o puede comprender un ADNc completo o secuencia de genes. Debido a que los dos polinucleótidos puede cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) puede comprender adicionalmente una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan normalmente comparando secuencias de los dos polinucleótidos con respecto a una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencias. Una "ventana de comparación" como se usa en el presente documento se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en el que una secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en el que la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, por la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis. o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología respecto a la ventana de comparación) generado por los diversos procedimientos. El término "identidad de secuencias" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido) respecto a la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencias" se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas respecto a la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) se produce en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencias. Los términos "identidad sustancial" como se usa en el presente documento denota una característica de una secuencia de polinucleótidos en la que el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos el 85 por ciento de identidad de secuencias, preferentemente al menos del 90 al 95 por ciento de identidad de secuencias, más normalmente al menos el 99 por ciento de identidad de secuencias con respecto a una secuencia de referencia respecto a una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente respecto a una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencias se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótidos que puede incluir deleciones o adiciones que asciende al 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia respecto a la ventana de comparación.

Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están óptimamente alineadas, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos por defecto, comparten al menos el 80 por ciento de identidad de secuencias, preferentemente al menos el 90 por ciento de identidad de secuencias, más preferentemente al menos el 95 por ciento de identidad de secuencias o más (por ejemplo, el 99 por ciento de identidad de secuencias). Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones de aminoácidos conservativos. Sustituciones de aminoácidos conservativos se refiere a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

El término "proteína nativa" y "proteína de longitud completa" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que se produce naturalmente que se corresponde con la secuencia de aminoácidos deducida de un ADNc de longitud completa afín.

El término "fragmento" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción del extremo amino y/o extremo carboxi, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia natural deducida a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos que sustancialmente conserva (al menos aproximadamente el 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%) la función de proteína natural es un fragmento funcional.

El término "afín" u "homólogo" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de genes que está evolutivamente y funcionalmente relacionada entre especies. Por ejemplo, pero no limitación, en el genoma humano, el gen de mesotripsina humano es el gen afín/homólogo al gen de mesotripsina de ratón debido a que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son sumamente homólogos y ambos genes codifican una proteína que funciona similarmente. Por tanto, el gen murino afín al gen humano codifica una proteína expresada que tiene el mayor grado de identidad de secuencias con respecto a la proteína de mesotripsina humana y que puede presentar un patrón de expresión similar al de la proteína huma. Los genes de mesotripsina afines/homólogos preferidos en primates, mamíferos y otros vertebrados se describen anteriormente.

Además de los polipéptidos de mesotripsina que sólo están constituidos por aminoácidos que se producen naturalmente, también se proporcionan peptidomiméticos de mesotripsina. Los análogos de péptidos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las de aquellos del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se llaman "peptidomiméticos" (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15: 29; Veber y Freidinger (1985) TINS pag. 392; y Evans y col. (1987) J. Med. Chem 30: 1229) y normalmente se desarrollan con la ayuda de modelación molecular computerizada. Los peptidomiméticos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido modelo (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) tal como la mesotripsina humana, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que está constituido por -CH_{2}-NH-, -CH_{2}-S-, -CH_{2} -CH_{2}, -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2} - y -CH_{2} SO-, mediante procedimientos conocidos en la técnica y adicionalmente descritos en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983); Szatola, A. F., Vega Data (marzo de 1983), vol. 1, tema 3, "Peptide Backbone Modifications" (revisión general); Morley, J. S., Trends Pharm Sci (1980) pág. 463-468 (revisión general); Hudson, D. y col., Int J Pent Prot Res (1979) 14: 177-185 (-CH2 NH-, CH2 CH2-); Spatola, A. F. y col., Life Sci (1986) 38: 1243-1249 (-CH2-S); Hann, M. M., J Chem Soc Perkin Trans I (1982) 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. y col., J Med Chem (1980) 23: 1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C. y col., Tetrahedron Lett (1982) 23: 2533 (-COCH2-); Szelke, M. y col., solicitud europea EP 45665 (1982) CA: 97: 39405 (1982) (-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. y col., Tetrahedron Lett (1983) 24: 4401-4404 (-C(OH)CH2-); y Hruby, V. J., Life Sci (1982) 31: 189-199 (-CH2-S-). Un enlace no peptídico particularmente preferido es -CH22 NH-. Tales peptidomiméticos pueden tener ventajas significativas con respecto a las realizaciones de polipéptidos que incluyen, por ejemplo: producción más económica, estabilidad química superior, propiedades farmacológicas potenciadas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y otras. El marcado de peptidomiméticos implica normalmente la unión covalente de una o más marcas, directamente o mediante un separador (por ejemplo, un grupo amida) a posición(ones) no interferente(s) en el peptidomimético que están predichas por datos de estructura-actividad cuantitativos y/o modelado molecular. Tales posiciones no interferentes son generalmente posiciones que no forman contactos directos con la(s) macromoléculas(s) (por ejemplo, moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas) a la(s) que se une el peptidomimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (por ejemplo, marcado) de peptidomiméticos no debe interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. Los peptidomiméticos de mesotripsina pueden usarse como agonistas o antagonistas competitivos o no competitivos de función natural.

La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos constreñidos (incluyendo péptidos ciclados) que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61: 387); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de mesotripsina identificados en el presente documento permitirán a aquellos expertos en la materia producir polipéptidos correspondientes a cualquiera de las secuencias de péptidos de mesotripsina y variantes de secuencias de las mismas. Tales polipéptidos pueden producirse en células huésped procariotas o eucariotas mediante expresión de polinucleótidos que codifican una secuencia de péptidos de mesotripsina, frecuentemente como parte de un polipéptido mayor. Alternativamente, tales péptidos pueden sintetizarse por procedimientos químicos. Los procedimientos para la expresión de proteínas heterólogas en huéspedes recombinantes, síntesis de polipéptidos químicos y traducción in vitro son muy conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger y Kimmel, Methods in Enzymology, volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc. 91: 501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255; Kaiser y col.(1989) Science 243: 187; Merrifield, B. (1986) Science 232: 342; Kent, S. B. H. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957; y Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing).

Una secuencia de péptidos "invertida" o "retro" como se desvela en el presente documento se refiere a esa parte de una secuencia global de residuos de aminoácidos covalentemente ligados (o análogos o miméticos de los mismos) en la que la dirección normal carboxilo a amino de la formación de enlaces peptídicos en el esqueleto de aminoácidos se ha invertido de forma que, leyendo en la dirección convencional de izquierda a derecha, la porción amino del enlace peptídico precede (en vez de sigue) a la porción carbonilo. Véase, generalmente, Goodman, M. y Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423.

Los péptidos de orientación invertida descritos en el presente documento incluyen (a) aquellos en los que uno o más residuos del extremo amino se convierten en un orientación invertida ("rev") (por tanto, dando un segundo "extremo carboxilo" en la porción más a la izquierda de la molécula), y (b) aquellos en los que uno o más residuos del extremo carboxilo se convierten en una orientación invertida ("rev") (dando un segundo "extremo amino" en la porción más a la derecha de la molécula). Un enlace peptídico (amida) no puede formarse en la superficie de separación entre un residuo de orientación normal y un residuo de orientación inversa.

Por tanto, ciertos compuestos de péptidos invertidos de la invención pueden formarse utilizando un resto de mimético de aminoácido apropiado para ligar las dos porciones adyacentes de las secuencias representadas anteriormente utilizando un enlace peptídico invertido (de amida invertida). En el caso (a) anterior, un residuo central de un compuesto diceto puede utilizarse convenientemente para ligar estructuras con dos enlaces amida para lograr una estructura de peptidomimético. En el caso (b) anterior, un residuo central de un compuesto diamino será asimismo útil para ligar estructuras con dos enlaces amida para formar una estructura de peptidomimético.

La dirección invertida de enlace en tales compuestos requerirá generalmente además la inversión de la configuración enantiomérica de los residuos de aminoácidos invertidos con el fin de mantener una orientación espacial de cadenas laterales que es similar a la del péptido no invertido. La configuración de aminoácidos en la porción invertida de los péptidos es preferentemente (D), y la configuración de la porción no invertida es preferentemente (L). Las configuraciones opuestas o mixtas son aceptables cuando corresponda para optimizar una actividad de unión.

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos anteriores también están dentro del alcance de la invención.

La invención también contempla cualquier polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de alta rigurosidad a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos anteriores, y cuyas secuencias de polinucleótidos codifican un polipéptido que conserva sustancialmente la función de mesotripsina. Una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridarse a la otra molécula de ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica en disolución (véase Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para el cribado preliminar de ácidos nucleicos homólogos pueden usarse condiciones de hibridación de baja rigurosidad correspondientes a una T_{m} (temperatura de fusión) de 55ºC, por ejemplo, 5xSSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25% y sin formamida; o formamida al 30%, 5xSSC, SDS al 0,5%).

A menos que se especifique, el término "condiciones de hibridación estándar" se refiere a una T_{m} de aproximadamente 55ºC y utiliza condiciones como se exponen anteriormente. En una realización preferida, la T_{m} es 60ºC; en una realización más preferida, la T_{m} es 65ºC. En una realización específica, "alta rigurosidad" se refiere a condiciones de hibridación y/o de lavado a 68ºC en 0,2xSSC, o a 42ºC en formamida al 50%, 4xSSC, o en condiciones que permiten niveles de hibridación equivalentes a los observados bajo cualquiera de estas dos condiciones.

Además, las coordenadas estructurales tridimensionales de alta resolución para muchas enzimas pueden encontrarse en las bases de datos mantenidas por el Colaboratorio de investigación para bioinformática estructural (RCSB). Las estructuras sin resolver de proteínas pueden predecirse frecuentemente usando una técnica conocida como plegamiento. Los algoritmos de plegamiento se describen en la bibliografía y pueden encontrarse en Alexandrov N.N., y col., (1998) Bioinformatics 14: 206-11, Labesse G, y col. (1997) Proteins 1: 38-42, Xu, Y. y col. (1999). Protein Eng., 12: 899-907, Russel A. J., y col. (2002) Proteins 47: 496-505, y Reva, B., y col. (2002) Proteins 47: 180-93.

En una realización preferida, el dominio catalítico es una mesotripsina manipulada con estabilidad potenciada.

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C. Generación de adzimas quiméricas

El resto catalítico de mesotripsina puede ligarse al resto que elige diana de varias formas que incluyen cotraducción de un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, proteínas de fusión) o, en realizaciones menos preferidas, acoplamiento químico.

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(i) Generadas como proteínas de fusión recombinantes

Las adzimas de esta invención pueden construirse como una proteína de fusión que contiene el resto catalítico y el resto que elige diana como una cadena de polipéptidos contigua. En la preparación de la proteína de fusión se construye un gen de fusión que comprende ADN que codifica las secuencias para el resto que elige diana, el resto catalítico y, opcionalmente, una secuencia de ligador de péptido para extender los dos fragmentos. Para hacer esta proteína de fusión, una enzima completa puede clonarse y expresarse como parte de la proteína, o alternativamente puede usarse un fragmento adecuado que contiene el resto catalítico. Asimismo, puede usarse la secuencia codificante clonada completa de un resto que elige diana tal como un receptor o anticuerpo o, alternativamente, un fragmento de la molécula que puede unirse al componente de superficie del patógeno. El uso de técnicas de ADN recombinante para crear un gen de fusión, siendo el producto de traducción la proteína de fusión deseada, es muy conocido en la técnica. Tanto la secuencia codificante de un gen como sus regiones reguladoras pueden rediseñarse para cambiar las propiedades funcionales del producto de proteína, la cantidad de proteína preparada o el tipo de célula en el que se produce la proteína. La secuencia codificante de un gen puede alterarse ampliamente - por ejemplo, fusionando parte de ella a la secuencia codificante de un gen diferente para producir un gen híbrido novedoso que codifica una proteína de fusión. Ejemplos de procedimientos para producir proteínas de fusión se describen en las solicitudes PCT PCT/US87/02968, PCT/US89/03587 y PCT/US90/07335, además de Traunecker y col. (1989) Nature 339: 68.

Los péptidos señal facilitan la secreción de proteínas de las células. Un péptido señal a modo de ejemplo es el extremo amino de 25 aminoácidos de la secuencia conductora de interleucina 7 murina (IL-7; Namen y col., Nature 333: 571; 1988).También pueden emplearse otros péptidos señal. Además, ciertos nucleótidos en la secuencia conductora de IL-7 pueden alterarse sin alterar la secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, pueden hacerse cambios de aminoácidos que no afectan la capacidad de la secuencia de IL-7 para actuar de secuencia conductora. Un péptido señal puede añadirse al dominio diana o dominio catalítico de adzimas de fusión de forma que cuando estos dominios se sintetizan por células a partir de ácidos nucleicos transfectados, la adzima diana secretada y los dominios catalíticos se oligomerizarán para formar adzimas maduras que actúan sobre dianas extracelulares, tales como citocinas.

En algunos casos puede ser necesario introducir una región de ligador de polipéptidos entre porciones de la proteína quimérica derivada de diferentes proteínas. Este ligador puede facilitar la flexibilidad potenciada de la proteína de fusión permitiendo que diversas porciones interactúen libremente y (opcionalmente) simultáneamente con una diana reduciendo el impedimento estérico entre las porciones, además de permitir que se produzcan pliegues apropiados de cada porción. El ligador puede ser de origen natural tal como una secuencia que se determina que existe en enrollamiento aleatorio entre dos dominios de una proteína. Alternativamente, el ligador puede ser de origen sintético. Por ejemplo, una o más repeticiones de Ser_{4}Gly (SEQ ID NO: 41), SerGly_{4} (SEQ ID NO: 42), Gly_{4}Ser (SEQ ID NO: 43), GlySer_{4} (SEQ ID NO: 44) o GS pueden usarse como ligadores no estructurados sintéticos. Los ligadores de este tipo se describen en Huston y col. (1988) PNAS 85: 4879; y las patentes de EE.UU. nº 5.091.513 y 5.258.498. Se prefieren ligadores no estructurados que se producen naturalmente de origen humano ya que reducen el riesgo de inmunogenicidad.

Puede optimizarse la longitud y composición del ligador que conecta el dominio de dirección y catalítico. Aunque se aprecia ampliamente que ligadores cortos pueden introducir impedimento estérico que puede ser perjudicial, frecuentemente puede pasarse por alto que ligadores muy largos sufren efectos entrópicos negativos porque la entropía conformacional disminuye adicionalmente con la unión del sustrato por la enzima amarrada cuando se usan ligadores más largos. La geometría del ligador debe determinarse para optimizar la actividad de adzima. Por ejemplo, Zhou (J. Mol. Biol. 329: 1-8, 2003) describe en detalle una teoría cuantitativa para potenciar la afinidad por una primera molécula ligando una segunda y una tercera molécula (tal como dos scFvs), cada uno de las cuales tiene afinidad por la primera molécula. Se encuentra que la potenciación de afinidad predicha se aproxima en realidad a la de un anticuerpo biespecífico contra lisozima de huevo de gallina que está constituida por fragmentos cFv de D1.3 y HyHEL-10. La amplia aplicabilidad de la teoría se demuestra por diversos ejemplos de interacciones proteína-proteína constreñidas por ligadores flexibles, y la teoría proporciona una región estructural general para el entendimiento de interacciones proteína-proteína constreñidas por ligadores flexibles.

En el caso más simple de la teoría, el ligador es flexible de forma que su único efecto es proporcionar una correa que constriñe las distancias entre los dos fragmentos de anticuerpos. Entonces se mostró:

(Ec. a)Cef = p(d0)

en la que p(r) es la densidad de probabilidad para el vector extremo a extremo del ligador flexible con residuos L que tiene una distancia r, y d_{0} es la distancia extremo a extremo real cuando los fragmentos ligados se unen al antígeno. Un ligador de péptidos flexible constituido por residuos L pueden modelarse como una cadena tipo gusano de forma que:

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en la que b=3,8 \ring{A} es la distancia C_{\alpha}-C_{\alpha} más cercana, y l_{c}=bL y l_{p}=3 \ring{A} son la longitud de contorno y la longitud persistente, respectivamente, del ligador de péptidos. Normalmente, p(d_{0}) está en el intervalo milimolar o superior y de ahí que se espera que la estrategia de ligación dé como resultado una potenciación de la afinidad significativa ya que las constantes de asociación de fragmentos de anticuerpos son muy superiores a 10^{3} M^{-1}. Se ha encontrado que la Ecuación (a) predice bien la potenciación de afinidad de dominios de unión a ADN ligadores (Zhou, Biochemistry 40, pág. 15069-15073, 2001).

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Basándose en este modelo teórico, la Figura 2 de Zhou describe la relación de L y p(d_{0}) a varios valores de d_{0} dados tales como 10 \ring{A}, 20 A, 30 \ring{A}, 40 \ring{A}, 50 \ring{A} y 60 \ring{A}. La teoría del ligador incorpora dos aspectos realistas importantes. Primero, en el estado de unión, la distancia extremo a extremo del ligador se mantiene a aproximadamente un valor específico (d_{0}) determinado por la estructura del complejo unido. Segundo, en el estado sin unir, la distribución p(r) de la distancia extremo a extremo no es uniforme, pero es la apropiada para una cadena de polímeros semiflexible tal como un cadena de polipéptidos. Por razones entrópicas, una cadena de polímeros muestra muy raramente conformaciones con distancias extremo a extremo que se aproximan tanto a cero como a la longitud del contorno completo l_{c}, por tanto, p(r) tiene un máximo a un valor intermedio de r. A una distancia extremo a extremo dada d_{0}, también es un valor de l_{c} (o L) al que p(d_{0}) es máximo (véase la Figura 2 de Zhou). Por tanto, la longitud de cadena de un ligador de péptidos puede optimizarse para lograr la máxima potenciación de la afinidad.

En el contexto del diseño de ligadores de adzimas, una vez se elige el dominio de dirección y catalítico puede obtenerse el modelo molecular del ávido complejo diana-adzima. d_{0}, la distancia entre el punto en el que el ligador conecta con la dirección y el punto en el que el ligador conecta con la enzima, mientras que tanto el dominio de dirección como de enzima están en el complejo ávido, puede determinarse fácilmente a partir de, por ejemplo, la estructura 3-D del complejo diana-adzima. Se resuelven muchas estructuras de citocinas (véase la página web de citocinas en http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytweb/cyt_strucs/index.html). La estructura de aquellas otras citocinas con homología de secuencias a citocinas de estructuras conocidas, además del complejo diana-adzima, puede obtenerse rutinariamente mediante modelado molecular.

Una vez se obtiene el valor d_{0}, puede usarse la Figura 2 de Zhou para encontrar la L óptima para el mayor valor de p(d_{0}) posible. Por ejemplo, si se determina que d_{0} es aproximadamente 20 \ring{A}, la Figura 2 de Zhou indica que a este valor d_{0}, el mayor valor de p(d_{0}) posible es aproximadamente 20 mM, y cuyo valor de p(d_{0}) se corresponde con una longitud de ligador de aproximadamente 10-15 aminoácidos. Obsérvese que a valor de d_{0} superior a 20 \ring{A}, el valor de p(d_{0}) máximo se alcanza rápidamente y disminuye muy gradualmente, permitiendo así bastante flexibilidad en la elección de una longitud de ligador apropiada. Además, el procedimiento aquí es bastante tolerante con una estimación relativamente imprecisa del valor de d_{0} ya que en la Figura 2 de Zhou, curvas para diferentes valores de d_{0} tienden a converger, especialmente en longitud de ligador larga (por ejemplo, superior a 40 aminoácidos) y valores de d_{0} grandes (30-60 \ring{A}). Por ejemplo, si d_{0} es 30 \ring{A}, el valor de p(d_{0}) pico es aproximadamente 3-4 mM. Si d_{0} es 40 \ring{A}, el p(d_{0}) pico sólo disminuye a aproximadamente 1,5 mM, a aproximadamente la misma longitud de ligador de aproximadamente 35-40 residuos.

Esta técnica es particularmente útil cuando se diseñan adzimas con un equilibrio optimizado entre su selectividad y potencia (véase anteriormente) ya que la geometría y la longitud del ligador tienen impacto directo sobre la [S]_{ef} de la adzima. Sin embargo, los solicitantes observan que en algunos casos la longitud del ligador puede ser relativamente poco importante. Como se muestra en los ejemplos, una adzima de mesotripsina elegida como diana para TNF-alfa funcionó apropiadamente sin pensar en la longitud del ligador.

Las técnicas para preparar genes de fusión son muy conocidas. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza según técnicas convencionales que emplean extremos romos o terminados en bisel para la ligación, digestión de enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, relleno de los extremos cohesivos como tratamiento con fosfatasa alcalina apropiado para evitar la unión no deseable y la ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a nucleótidos protuberantes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden hibridarse para generar una secuencia de genes de fusión (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col. John Wiley & Sons: 1992).

Las proteínas de fusión pueden comprender secuencias adicionales que incluyen una secuencia conductora (o péptido señal), una parte de una inmunoglobulina (por ejemplo, una porción de Fc, véase más adelante) u otras secuencias formadoras de oligómeros, además de secuencias que codifican restos sumamente antigénicos, restos de hexahistidina u otros elementos que proporcionan un medio para la purificación superficial o la rápida detección de una proteína de fusión.

Para expresar la molécula de proteínas de fusión puede desearse incluir elementos reguladores de la transcripción y la traducción y otras secuencias no codificantes para el constructo de genes de fusión. Por ejemplo, pueden incorporarse elementos reguladores que incluyen promotores constitutivos e inducibles, potenciadores o inhibidores.

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(ii) Uso de agentes de acoplamiento químicos

Hay un gran número de agentes de reticulación químicos que son conocidos de aquellos expertos en la materia. Para la presente invención, los agentes de reticulación preferidos son reticuladores heterobifuncionales que pueden usarse para ligar proteínas de un modo escalonado. Los reticuladores heterobifuncionales proporcionan la capacidad de diseñar procedimientos de acoplamiento más específicos para conjugar proteínas reduciéndose así las apariciones de reacciones secundarias no deseadas tales como polímeros de homo-proteínas. En la técnica se conoce una amplia variedad de reticuladores heterobifuncionales. Éstos incluyen: 1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano (SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS); aminobenzoato de N-succinimidil(4-yodoacetilo) (SIAB), butirato de succinimidil-4-(p-maleimidofenilo) (SMPB), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC); 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), hexanoato de succinimidil-6-[(3-(2-piridilditio)propionato] (LC-SPDP). Aquellos agentes de reticulación que tienen restos N-hidroxisuccinimida pueden obtenerse como los análogos de N-hidroxisulfosuccinimida que generalmente tienen superior solubilidad en agua. Además, aquellos agentes de reticulación que tienen puentes disulfuro dentro de la cadena ligadora pueden sintetizarse en lugar de los derivados de alquilo de manera que se reduzca la cantidad de escisión de ligador in vivo.

Además de los reticuladores heterobifuncionales existen varios otros agentes de reticulación que incluyen reticuladores homobifuncionales y fotoreactivos. El suberato de disuccinimidilo (DSS), bismaleimidohexano (BMH) y dimetilpimelimidato-2 HCl (DMP) son ejemplos de agentes de reticulación homobifuncionales útiles, y el disulfuro de bis-[.beta.-(4-azidosalicilamido)etilo] (BASED) y el N-succinimidil-6(4'-azido-2'-nitrofenil-amino)hexanoato (SANPAH) son ejemplos de reticuladores fotoreactivos útiles para uso en esta invención. Para una revisión de técnicas de acoplamiento de proteínas véase Means y col. (1990) Bioconjugate Chemistry 1: 2-12. Una clase particularmente útil de reticuladores heterobifuncionales incluida anteriormente contiene el grupo reactivo con amina primaria N-hidroxisuccinimida (NHS) o su análogo soluble en agua N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS). Las aminas primarias (grupos de lisina epsilon) a pH alcalino están sin protonar y reaccionan por ataque nucleófilo en ésteres NHS o sulfo-NHS. Esta reacción da como resultado la formación de un enlace amida y la liberación de NHS o sulfo-NHS como subproducto.

Otros grupos útiles reactivos como parte de un reticulador heterobifuncional es un grupo reactivo con tiol. Los grupos reactivos con tiol comunes incluyen maleimidas, halógenos y disulfuros de piridilo. Las maleimidas reaccionan específicamente con sulfhidrilos libres (residuos de cisteína) en minutos bajo condiciones de ligeramente ácidas a neutras (pH 6,5-7,5). Los halógenos (funciones de yodoacetilo) reaccionan con el grupo -SH a pH fisiológico. Ambos grupos reactivos dan como resultado la formación de enlaces tioéter estables.

El tercer componente del reticulador heterobifuncional es el brazo espaciador o puente. El puente es la estructura que conecta los dos extremos reactivos. El atributo más aparente del puente es su efecto sobre el impedimento estérico. En algunos casos, un puente más largo puede extender más fácilmente la distancia necesaria para ligar dos biomoléculas complejas.

La preparación de conjugados proteína-proteína usando reactivos heterobifuncionales es un procedimiento de dos etapas que implica la reacción de aminas y la reacción de sulfhidrilo, y tales procedimientos son, en vista de esta memoria descriptiva, generalmente muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Partis y col. (1983) J. Pro. Chem. 2: 263); Ellman y col. (1958) Arch. Biochem. Biophys. 74: 443; Riddles y col. (1979) Anal. Biochem. 94: 75); Blattler y col. (1985) Biochem 24: 1517).

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(iii) Constructos multiméricos

En ciertas realizaciones de la invención, la adzima objeto es un complejo multimérico en el que el dominio catalítico y el dominio que elige diana están en cadenas de polipéptidos separadas. Estos dos dominios, cuando se sintetizan, pueden reunirse juntos para formar la adzima madura.

Por ejemplo, en una realización, la adzima toma la forma de un anticuerpo (por ejemplo, fusión de Fc) en el que las regiones variables de la cadena pesada (V_{H}) y ligera (V_{L}) se han sustituido con los dominios que eligen diana y catalíticos (tanto el dominio que elige diana como el catalítico pueden sustituir tanto la región de V_{H} como de V_{L}). Por ejemplo, las proteínas solubles que comprenden un dominio extracelular a partir de una proteína unida a membrana y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se describió por Fanslow y col., J. Immunol. 149: 65, 1992 y por Noelle y col., Proc. Nad. Acad. Sci. U.S.A. 89: 6550, 1992.

En ciertas realizaciones, una adzima comprende una primera porción Fc que está conectada a las cadenas pesada y ligera apropiadas que pueden actuar de resto que elige diana, y una segunda porción de Fc que se fusiona a un dominio catalítico.

Las proteínas de fusión que comprenden un dominio catalítico o un dominio que elige diana pueden prepararse usando ácidos nucleicos que codifican polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi y col., (PNAS USA 88: 10535, 1991) y Byrn y col., (Nature 344: 677, 1990). En una realización de la invención, una adzima se crea fusionando un dominio catalítico a una primera región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) y un dominio que elige diana a una segunda región Fc de un anticuerpo. El polipéptido de Fc se fusiona preferentemente al extremo C de un dominio catalítico o que elige diana. Una fusión de genes que codifica cada proteína de fusión de Fc se introduce en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión de Fc se expresan en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y se permite que se ensamblen como moléculas de anticuerpo, por lo que se forman enlaces disulfuro entre cadenas entre polipéptidos Fc, dando las adzimas deseadas. Si las proteínas de fusión se preparan tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo es posible formar una adzima con múltiples dominios catalíticos y que eligen dianas.

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En ciertas realizaciones, una adzima que comprende una o más proteínas de fusión de inmunoglobulinas puede emplear una región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina en asociación con al menos un dominio de región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina. En otra realización, una región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina está asociada a al menos un dominio de región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina unido a una región horquilla de inmunoglobulinas. En un conjunto de realizaciones, una región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina está unida en marco con una cadena de polipéptidos de un polipéptido de no inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio catalítico o dominio que elige polipéptidos como diana) y está asociada a al menos un región constante de cadena pesada. En un conjunto preferido de realizaciones, una región variable está unida aguas arriba de y en el marco de lectura apropiado a al menos una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En otro conjunto de realizaciones, una cadena pesada de inmunoglobulina está unida en marco a una cadena de polipéptido de un polipéptido de no inmunoglobulina y está asociada a una región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina. En todavía otro conjunto de realizaciones, una cadena de polipéptido de un polipéptido dímero de no inmunoglobulina o receptor análogo está unida a al menos una región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina que está unida a una región horquilla de inmunoglobulinas y está asociada a una región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina. En un conjunto preferido de realizaciones, una región variable de inmunoglobulina está unida aguas arriba de y en el marco de lectura apropiado en la región constante de cadenas ligeras de inmunoglobulina.

El término "polipéptido de Fc" como se usa en el presente documento incluye formas nativas y alteradas de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También están incluidas formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región horquilla que promueve la dimerización. Un polipéptido de Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región horquilla del extremo N hasta el extremo C nativo. Puede desearse usar formas alteradas de polipéptidos de Fc que tienen semivida en suero mejorada, orientación espacial alterada y similares. Los dominios de región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina incluyen C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3 y C_{H}4 de cualquier clase de cadena pesada de inmunoglobulina que incluye clases gamma, alfa, epsilon, mu y delta. Un dominio de región constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina particularmente preferido es C_{H}1 humano. Las regiones variables de inmunoglobulina que incluyen secuencias de ADN V_{H}, V_{kappa}, o V_{lambda} que codifican inmunoglobulinas pueden clonarse a partir de una variedad de bibliotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica. Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN usando procedimientos basados en sondas son técnicas convencionales y son muy conocidas para aquellos expertos en la materia. Las sondas para aislar tales secuencias de ADN pueden basarse en secuencias de ADN publicadas (véase, por ejemplo, Hieter y col., Cell 22: 197-207, 1980). Alternativamente puede usarse el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desvelado por Mullis y col. (patente de EE.UU. nº 4.683.195) y Mullis (patente de EE.UU. nº 4.683.202). La elección de biblioteca y la selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN están dentro del nivel del experto en la materia.

Las células huésped para uso en la preparación de fusiones de inmunoglobulinas incluyen células eucariotas que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y cultivarse en cultivo tales como células de mamífero y fúngicas cultivadas. Las células fúngicas, que incluyen especies de levadura (por ejemplo, Saccharomyces spp., Schizosaccharomyces spp.) u hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus spp., Neurospora spp.) pueden usarse como células huésped dentro de la presente invención. Se prefieren particularmente cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

En cada una de las realizaciones anteriores, un ligador molecular puede interponerse opcionalmente entre, y unido covalentemente, el resto del constructo de adzimas y el dominio de dimerización.

En otra realización pueden emplearse diversos dominios de oligomerización para reunir juntos los dominios que eligen diana y catalíticos sintetizados por separado.

Una clase de tal dominio de oligomerización es la cremallera de leucina. El documento WO 94/10308 A1 y su patente de EE.UU. relacionada nº 5.716.805 (todas incorporadas en el presente documento por referencia) describen el uso de dominios de oligomerización de cremallera de leucina para dimerizar/oligomerizar dos polipéptidos heterólogos separados. Cada uno de los dos polipéptidos heterólogos separados se sintetiza como una proteína de fusión con un dominio de oligomerización de cremallera de leucina. En una realización, el dominio de cremallera de leucina puede eliminarse de la proteína de fusión por escisión con una enzima proteolítica específica. En otra realización, una proteína hetero-oligomérica se prepara utilizando dominios de cremallera de leucina que forman preferencialmente hetero-oligómeros.

Los dominios de cremallera de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). El dominio de cremallera de leucina es un término usado para referirse a un dominio de péptido conservado presente en estas (y otras) proteínas que es responsable de la dimerización de las proteínas. El dominio de cremallera de leucina (también denominado este documento dominio oligomerizante o formador de oligómeros) comprende una repetición de héptadas repetitiva con cuatro o cinco residuos de leucina intercalados con otros aminoácidos.

Ejemplos de dominios de cremallera de leucina son aquellos encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y una proteína de unión a ADN estable al calor encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz y col., Science 243: 1681, 1989). Dos proteínas de transformación nuclear, fos y jun, también presentan dominios de cremallera de leucina, como el producto génico del protooncogén murino, c-myc (Landschulz y col., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cremallera de leucina que forman preferencialmente un heterodímero (O'Shea y col., Science 245: 646, 1989; Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1989). El dominio de cremallera de leucina es necesario para la actividad biológica (unión a ADN) en estas proteínas.

Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, que incluyen paramixovirus, coronavirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, también poseen dominios de cremallera de leucina (Buckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cremallera de leucina en estas proteínas víricos fusogénicas están próximos a la región transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera de leucina podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de proteínas víricos fusogénicas participa en la formación de poros de fusión (Spruce y col., PNAS 88: 3523, 1991). También se ha notificado recientemente que los dominios de cremallera de leucina desempeñan una función en la oligomerización de factores de transcripción de choque térmico (Rabindran y col., Science 259: 230, 1993).

Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los dominios de dimerización de los componentes de adzimas comprenden dominios de dimerización de superhélices tales como dominios de cremallera de leucina. Preferentemente, los dominios de cremallera de leucina incluyen al menos cuatro héptadas de leucina. En una realización preferida, el dominio de cremallera de leucina es un dominio de cremallera de leucina Fos o Jun.

Existen muchos otros llamados "dominios de formación de haces" que realizan esencialmente la misma función que los dominios de cremallera de leucina anteriormente descritos para reunir juntos los dominios catalíticos y diana. Por ejemplo, el documento WO 99/10510 A2 describe dominios de formación de haces que incluyen cualquier dominio que induzca proteínas que lo contienen para formar multímeros ("haces") mediante interacciones proteína-proteína entre sí o con otras proteínas que contienen el dominio de formación de haces. Ejemplos de estos dominios de formación de haces incluyen dominios tales como el dominio de tetramerización represor lac, el dominio de tetramerización p53, el dominio de cremallera de leucina y dominios derivados de los mismos que conservan actividad de formación de haces observable. Las proteínas que contienen un dominio de formación de haces pueden complejarse entre sí para formar un haz de las moléculas de proteína individuales. Tal formación de haces es "constitutiva" en el sentido que no requiere la presencia de un agente de reticulación (es decir, un agente de reticulación que no contiene por sí mismo un dominio de formación de haces pertinaz) para ligar las moléculas de proteína.

Como se describe anteriormente, los dominios de formación de haces interactúan con dominios similares mediante interacciones proteína-proteína para inducir la formación de "haces" de proteínas. Pueden formarse oligómeros de diverso orden (dímeros, trímeros, tetrámeros, etc.) de proteínas que contienen un dominio de formación de haces dependiendo de la elección del dominio de formación de haces.

En una realización, la incorporación de un dominio de tetramerización dentro de una proteína de fusión conduce al ensamblaje constitutivo de conjuntos o haces tetraméricos. El dominio de tetramerización represor de lactosa de E. coli (aminoácidos 46-360; Chakerian y col. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1371; Alberti y col. (1993) EMBO J. 12: 3227; y Lewis y col. (1996) Nature 271: 1247) ilustra esta clase. Otros dominios de tetramerización ilustrativos incluyen aquellos derivados de los residuos 322-355 de p53 (Wang y col. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 5182; Clore y col. (1994) Science 265: 386) véase también la patente de EE.UU. nº 5.573.925 de Halazonetis.

En otra realización adicional, el dominio catalítico y el dominio diana pueden fusionarse entre sí a un "dominio de unión a ligando" que, con la unión a una molécula pequeña, reunirán juntos el dominio catalítico y el dominio diana ("oligomerización mediada por moléculas pequeñas").

Las proteínas de fusión que contienen un dominio de unión a ligando para uso en la práctica de esta invención pueden desempeñar sus funciones mediante una variedad de mecanismos moleculares.

En ciertas realizaciones, el dominio de unión a ligando permite la reticulación mediada por el ligando de las moléculas de proteína de fusión que llevan dominios de unión a ligando apropiados. En estos casos, el ligando es al menos divalente y actúa de agente dimerizante mediante la unión a las dos proteínas de fusión y formando un complejo heterodimérico reticulado que activa la expresión génica de dianas. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 94/18317, WO 96/20951, WO 96/06097, WO 97/31898 y WO 96/41865.

En los sistemas de dimerización basados en reticulación, las proteínas de fusión pueden contener uno o más dominios de unión a ligando (que en algunos casos contienen dos, tres, cuatro o más de tales dominios) y pueden contener adicionalmente uno o más dominios adicionales heterólogos con respecto al dominio de unión a ligando que incluyen, por ejemplo, un dominio catalítico o diana de la adzima objeto.

En general puede usarse en tales sistemas cualquier par de ligando/dominio de unión a ligando. Por ejemplo, los dominios de unión a ligando pueden derivarse de una inmunofilina tal como una FKBP, ciclofilina, dominio FRB, proteína de receptor de hormonas, anticuerpo, etc., mientras que un ligando sea conocido o pueda identificarse por el dominio de unión a ligando.

En general, los dominios de receptor tendrán al menos aproximadamente 50 aminoácidos, y menos de aproximadamente 350 aminoácidos, normalmente menos de 200 aminoácidos, tanto como el dominio natural como la porción activa truncada del mismo. Preferentemente, el dominio de unión será pequeño (<25 kDa, para permitir la transfección eficaz en vectores víricos), monomérico, no inmunogénico y debe tener ligandos no tóxicos permeables a células sintéticamente accesibles como se describe anteriormente.

Preferentemente, el dominio de unión a ligando es para (es decir, se une a) un ligando que por sí mismo no es un producto génico (es decir, no es una proteína), tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y preferentemente menos de aproximadamente 2,5 kD, y opcionalmente es permeable a células. En muchos casos se preferirá que el ligando no tenga una actividad o toxicidad farmacológica intrínseca que interfiera con su uso como regulador de la oligomerización.

La secuencia de ADN que codifica el dominio de unión a ligando puede someterse a mutagénesis por una variedad de razones. El dominio de unión a ligando mutagenizado puede proporcionar mayor afinidad de unión, permitir discriminación por un ligando entre las formas mutantes y que se producen naturalmente del dominio de unión a ligando, proporcionar oportunidad para diseñar pares de ligando-dominio de unión a ligando, o similares. El cambio en el dominio de unión a ligando puede implicar cambios dirigidos en aminoácidos conocidos por participar en la unión a ligando o con cambios conformacionales dependientes de ligando. Alternativamente puede emplearse mutagénesis aleatoria usando técnicas combinatorias. En cualquier acontecimiento, el dominio de unión a ligando mutante puede expresarse en un huésped procariota o eucariota apropiado y luego se criba para la unión a ligando deseada o propiedades conformacionales.

La capacidad de emplear mutagénesis in vitro o modificaciones combinatorias de secuencias que codifican proteínas permite la producción de bibliotecas de proteínas que pueden cribarse para afinidad de unión por diferentes ligandos. Por ejemplo, puede aleatorizarse una secuencia de 1 a 5, 5 a 10, o 10 o más codones en uno o más sitios en una secuencia de ADN que codifica una proteína de unión, prepararse un constructo de expresión e introducir el constructo de expresión en un microorganismo unicelular y desarrollar una biblioteca de secuencias modificadas. Entonces puede cribarse la biblioteca para afinidad de unión de los polipéptidos codificados para uno o más ligandos. Entonces, las mejores secuencias de afinidad que son compatibles con las células en las que se introducirían pueden usarse como dominio de unión a ligando para un ligando dado. El ligando puede evaluarse con las células huésped deseadas para determinar el nivel de unión del ligando a proteínas endógenas. Puede determinarse un perfil de unión para cada uno de tales ligandos que compara la afinidad de unión a ligando por el dominio de unión a ligando modificado con la afinidad por proteínas endógenas. Entonces, aquellos ligandos que tienen el mayor perfil de unión podrían usarse como ligando. Las técnicas de expresión en fago, como un ejemplo no limitante, pueden usarse para llevar a cabo lo anterior.

En otras realizaciones, las subunidades de anticuerpos, por ejemplo cadena pesada o ligera, particularmente fragmentos, más particularmente toda o una parte de la región variable, o anticuerpos de una única cadena, pueden usarse como el dominio de unión a ligando. Los anticuerpos pueden prepararse contra haptenos que son farmacéuticamente aceptables y las subunidades de anticuerpos individuales cribarse para afinidad de unión. El ADNc que codifica las subunidades de anticuerpos puede aislarse y modificarse por deleción de la región constante, porciones de la región variable, mutagénesis de la región variable o similares para obtener una unión al dominio de proteína que tiene la afinidad por el ligando apropiada. De esta forma, casi cualquier hapteno fisiológicamente aceptable puede emplearse como ligando. En lugar de unidades de anticuerpos pueden emplearse receptores naturales, especialmente en los que se conoce el dominio de unión. En algunas realizaciones de la invención, una proteína de fusión comprende más de un dominio de unión a ligando. Por ejemplo, un dominio de unión a ADN puede ligarse a 2, 3 ó 4 o más dominios de unión a ligando. La presencia de múltiples dominios de unión a ligando significa que la reticulación mediada por ligando puede reclutar múltiples proteínas de fusión que contienen dominios de activación de la transcripción para la proteína de fusión que contiene dominios de unión a ADN.

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iv. Metodologías generales

En aplicaciones de la invención que implican la manipulación genética de células dentro de (o para uso dentro de) animales completos se prefiere el uso de secuencias de péptidos derivadas de esas especies, cuando sea posible. Por ejemplo, para aplicaciones que implican terapia humana, el uso de dominios catalíticos o que eligen diana derivados de proteínas humanas puede minimizar el riesgo de reacciones inmunogénicas. Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario que va a usarse como resto que elige diana puede ser preferentemente un anticuerpo monocatenario humanizado o derivado de humano. Asimismo, otras porciones de adzimas tales como porciones de Fc o dominios de oligomerización pueden acoplarse a las especies en las que va a usarse la adzima.

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E. Rasgos variados para las adzimas (i) Semivida en suero

En ciertas realizaciones de la invención, la adzima objeto puede diseñarse o modificarse para presentar una semivida en suero potenciada o disminuida. La semivida en suero potenciada puede desearse para reducir la frecuencia de dosificación que se requiere para lograr eficacia terapéutica. La semivida en suero potenciada de adzima puede ser adicionalmente deseable ya que las ventajas de las adzimas con respecto a agentes de unión puros pueden no realizarse inmediatamente, pero serán mayores y más aparentes con el tiempo. Por ejemplo, la velocidad de reacción entre una adzima y un sustrato de baja abundancia (por ejemplo, fempto- o pico-molar) tal como ciertas moléculas de señalización extracelulares puede producirse en una escala de tiempo de días a semanas; por consiguiente, sería deseable una semivida en suero que permitiera que la adzima persistiera en el cuerpo durante días o semanas y aumentara la frecuencia de dosificación que se necesita. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la semivida en suero de una adzima es al menos un día, y preferentemente dos, tres, cinco, diez, veinte o cincuenta días o más. Por otra parte, la semivida en suero de adzimas reducida puede ser deseable en, por ejemplo, situaciones agudas en las que la alteración del desplazamiento de un sustrato realizará generalmente el efecto terapéutico deseado, con poco beneficio añadido resultante de la actividad de adzima prolongada. En realidad, puede ser posible administrar niveles muy altos de una adzima con una semivida corta de forma que rápidamente se logre un alto nivel de eficacia terapéutica, pero la adzima se elimina rápidamente del cuerpo de manera que se reducen los efectos secundarios que pueden asociarse a altas dosificaciones. Ejemplos de situaciones agudas incluyen envenenamientos con diversas toxinas en los que la adzima se neutraliza o por lo demás se elimina la toxina, además de septicemia u otras fiebres graves, en las que la eliminación de pirógenos endógenos tales como IL-1 o TNF-\alpha, o pirógenos exógenos tales como lipopolisacáridos bacterianos, pueden realizar el fin terapéutico.

La semivida en suero puede determinarse mediante una variedad de factores que incluyen degradación, modificación a una forma inactiva y eliminación por los riñones. Por ejemplo, una solución eficaz para conferir resistencia a peptidasas que actúan en los residuos del extremo N o extremo C de un polipéptido es añadir grupos químicos a los extremos del polipéptido de forma que el polipéptido modificado ya no es un sustrato para la peptidasa. Una modificación química tal es la glicosilación de los polipéptidos en uno o ambos extremos. Se ha mostrado que ciertas modificaciones químicas, en particular polietilenglicoles ("pegilación") y glicosilación del extremo N, aumentan la semivida de polipéptidos en suero humano (Molineux (2003), Pharmacoterapia 8 Pt 2: 3S-8S. Powell y col. (1993), Pharma. Res. 10: 1268-1273). Otras modificaciones químicas que potencian la estabilidad en suero incluyen, pero no se limitan a, la adición de un grupo alquilo al extremo N que está constituido por un alquilo inferior de 1 a 20 carbonos tales como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida del extremo C o grupo amida sustituido.

En ciertas realizaciones, una adzima puede modificarse de manera que aumente el volumen hidrodinámico de la adzima reduciéndose así, entre otras cosas, la eliminación por los riñones. Por ejemplo, la modificación con un polímero inerte, tal como polietilenglicol, tiende a disminuir la eliminación por los riñones. Un polímero puede ser de cualquier peso molecular eficaz y puede ser ramificado o sin ramificar. Para el polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido) para facilitar la manipulación y la fabricación. Pueden usarse otros tamaños dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si hay alguno, sobre la actividad biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína terapéutica o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 1000, 5000, 15.000, 30.000 50.000 o 100.000 kDa o más. El polietilenglicol puede tener una estructura ramificada. Los polietilenglicoles ramificados se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.643.575; Morpurgo y col., Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 59-72 (1996); Vorobjev y col., Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750 (1999); y Caliceti y col., Bioconjug. Chem. 10: 638-646 (1999). Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) pueden unirse a la adzima con consideración de los efectos sobre las porciones catalíticas o que eligen diana. Hay varios procedimientos de unión disponibles para aquellos expertos en la materia, por ejemplo, el documento EP 0 401 384, (acoplar PEG a G-CSF), véase también Malik y col., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (que notifica la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente mediante residuos de aminoácidos mediante un grupo reactivo tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los que puede unirse una molécula de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y los residuos de aminoácidos del extremo N; aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácidos del extremo C. Los grupos sulfhidrilo también pueden usarse como grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Para fines terapéuticos se prefiere la unión a un grupo amino, tal como la unión al extremo N o grupo de lisina.

Las adzimas pueden diseñarse para tener un peso molecular de aproximadamente 50 kilodaltons o superior de manera que se reduzca la eliminación por los riñones.

La presencia de un D-aminoácido del extremo N también aumenta la estabilidad en suero de un polipéptido que por lo demás contiene L-aminoácidos debido a que las exopeptidasas que actúan sobre el residuo del extremo N no pueden utilizar un D-aminoácido como sustrato. Similarmente, la presencia de un D-aminoácido del extremo C también estabiliza un polipéptido debido a que las exopeptidasas en suero que actúan sobre el residuo del extremo C no pueden utilizar un D-aminoácido como sustrato. Con la excepción de estas modificaciones del extremo, las secuencias de aminoácidos de polipéptidos con D-aminoácidos del extremo N y/o extremo C son normalmente idénticas a las secuencias del polipéptido de L-aminoácidos parental.

La sustitución de aminoácidos no naturales por aminoácidos naturales en una subsecuencia de un polipéptido puede conferir o potenciar atributos deseables que incluyen la actividad biológica. Una sustitución tal puede conferir, por ejemplo, resistencia a proteolisis por exopeptidasas que actúan sobre el extremo N. La síntesis de polipéptidos con aminoácidos no naturales es rutina y conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Coller, y col. (1993), citado anteriormente).

En otra realización, los péptidos de adzimas se fusionan a ciertos polipéptidos para lograr estabilidad en suero o semivida potenciada/aumentada. Por ejemplo, el documento WO 97/34631 A1 describe vectores recombinantes que codifican dominios similares a inmunoglobulina y porciones de los mismos tales como fragmentos de horquilla Fc de anticuerpos, subfragmentos y dominios mutantes con semividas biológicas prolongadas. Tales vectores pueden usarse para generar grandes cantidades de fusiones con tales dominios tras la expresión por células huésped. Estos dominios Fc y de horquilla Fc de anticuerpos tienen la misma estabilidad in vivo que los anticuerpos intactos. La solicitud también desvela dominios manipulados para tener semividas in vivo aumentadas. Estos constructos de ADN y dominios de proteínas pueden adaptarse para uso en la presente invención tal como para la producción de adzimas recombinantes (o componentes de adzimas) con estabilidad y longevidad aumentadas para usos terapéuticos y diagnósticos.

Específicamente, el documento WO 97/34631 A1 describe vectores recombinantes que codifican dominios similares a inmunoglobulina y porciones de los mismos tales como fragmentos Fc de anticuerpos y subfragmentos y dominios de horquilla Fc con semividas in vivo prolongadas. Como la invención se ejemplifica por la producción de una variedad de dominios similares a inmunoglobulina que incluyen dominios de horquilla Fc de anticuerpos, Fc, horquilla de CH2 y CH3; y dominios de horquilla Fc manipulados con semividas in vivo prolongadas tales como, por ejemplo, el mutante llamado LSF. Además, otros dominios similares a inmunoglobulina pueden expresarse empleando los procedimientos descritos en el presente documento.

Los estudios previos indican que el dominio CH2 puede desempeñar una función importante en el control del catabolismo de anticuerpos y pueden participar secuencias en el dominio CH3 (Ellerson y col., 1976, Mueller y col., 1990; Pollock y col., 1990; Kim y col., 1994a: Medesan y col., 1997). La presencia de residuos de carbohidrato en el dominio CH2 parece tener un menor efecto, si significativo, sobre la estabilidad, y el grado del efecto depende del isotipo (Tao y Morrison, 1989).

Los fragmentos de horquilla de CH2, CH3, Fc y horquilla de Fc recombinantes derivados de las regiones constantes de IgG1 murina y humana se han expresado a partir de células huésped. Se encontró que el dominio CH3, fragmento Fc y fragmento de horquilla de Fc eran todos proteínas homodiméricas. Para el dominio Fc y CH3, los dímeros no están covalentemente ligados y supuestamente se estabilizan por interacciones no covalentes. Para el polímero de horquilla de Fc, los fragmentos están covalentemente ligados por puentes -S-S- entre las cisteínas de la región horquilla. Estos dominios también pueden usarse para dimerizar los dominios diana y catalíticos de adzimas.

Los fragmentos de horquilla de Fc y Fc de inmunoglobulina, purificados tras la expresión en células huésped, tienen la misma estabilidad in vivo que una molécula de anticuerpo nativa. Los resultados de estudios previos demostraron que los fragmentos de horquilla de Fc o Fc aglicosilados recombinantes tienen estabilidad in vivo similar a la de la molécula de IgG1 glicosilada completa. Se encontró que el fragmento de horquilla de Fc aglicosilado recombinante tenía una fase 0 similar a la de una molécula de inmunoglobulina IgG1 glicosilada completa. De hecho, la eliminación de la horquilla de Fc dio como resultado una ligera disminución en la semivida (Kim y col., 1995). Estos resultados indican que para el isotipo de IgG1 murino la presencia de residuos de carbohidrato no parece ser necesaria para la estabilidad in vivo, aunque todavía pueden desempeñar una función menor. Los datos previos obtenidos usando química de proteínas sugirieron que el dominio CH2 es responsable de la estabilidad in vivo (Ellerson y col., 1976), aunque un estudio reciente indicó que los residuos en el dominio CH3 también pueden participar en el control del catabolismo de los isotipos de IgG2a y IgG2b murinos (Pollock y col., 1990).

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(ii) Frecuencia de dosificación

En muchos casos, una adzima puede administrarse mediante inyección u otra vía de administración que pueda producir alguna molestia a un paciente, o la adzima puede requerir la asistencia de un médico u otro profesional médico para la administración segura. En tales casos puede desearse diseñar una adzima que es terapéuticamente eficaz a frecuencias de dosificación de una vez por día o menos, y preferentemente la adzima es eficaz cuando se administra una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada ocho semanas o menos frecuentemente.

El intervalo de frecuencias de dosificación eficaces para una adzima puede depender de una variedad de características de la adzima. Por ejemplo, una adzima con una semivida en suero más corta tenderá a ser eficaz durante un periodo de tiempo más corto conduciendo a un programa de dosificación más frecuente. Anteriormente se describen diversas características de adzimas que pueden prolongar o reducir la semivida en suero.

Los depósitos de fármaco en el cuerpo pueden alargar el tiempo durante el que una adzima es eficaz. Con la dosificación, muchos fármacos se acumulan en compartimentos corporales tales como las reservas de grasas o diversos fluidos transcelulares de los que el fármaco se libera entonces lentamente durante un largo periodo de tiempo. Similarmente, un fármaco puede unirse fuertemente mediante una proteína en suero tal como albúmina o alfa1-glicoproteína y, por tanto, se retiene en el suero en una forma unida protegida inactiva de la que puede liberarse lentamente con el tiempo. Por consiguiente, una adzima puede diseñarse para fomentar la formación de depósitos que proporcionan periodos prolongados de eficacia de la adzima. En tales realizaciones, la adzima puede administrarse en una mayor dosis inicial (una "dosis de carga"), seguido de dosis más pequeñas ocasionales ("dosis de mantenimiento").

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Una adzima también puede formularse y administrarse de manera que tenga un periodo de efecto prolongado. Por ejemplo, una adzima puede formularse y administrarse para formar un "depósito" en el paciente que libera lentamente la adzima con el tiempo. Una formulación de depósito puede ser una en la que la adzima está encapsulada y se libera lentamente de microesferas hechas de polímeros biodegradables (por ejemplo, ácido poliláctico, alginato). Otros materiales de depósito incluyen esponjas de Gelfoam y el sistema ProLease® (Alkermes, Inc.,
Cambridge, MA).

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(iii) Selectividad

En muchos casos, una adzima se diseñará para la administración en un medio particular. Por ejemplo, muchas adzimas para uso en seres humanos se diseñarán para administración a y/o actividad en la circulación sanguínea. Como se describe en el presente documento, las adzimas pueden diseñarse para otras situaciones tales como para uso en un entorno industrial o medioambiental. En general, será deseable diseñar una adzima de manera que disminuya las interacciones con moléculas no diana que inhiben la eficacia de la adzima contra la diana o, en otras palabras, será deseable diseñar una adzima que sea activa contra diana en presencia de niveles esperados de otros componentes del medio en el que se usará la adzima.

En ciertas realizaciones, una adzima está diseñada para ser eficaz contra un sustrato localizado en la sangre tal como, por ejemplo, muchas moléculas de señalización extracelulares. Una adzima tal puede diseñarse para minimizar interacciones con otros componentes de la sangre que interferirían con la capacidad de la adzima para afectar la diana. La adzima puede diseñarse de forma que se base en el entendimiento teórico o basándose en estudios empíricos, o ambos. En ciertas realizaciones, una adzima conserva eficacia contra una diana en presencia de uno o más componentes de la sangre relativamente abundantes. Una adzima puede probarse para la actividad contra diana en presencia de uno o más componentes de la sangre, y componentes de la sangre particularmente abundantes. Por ejemplo, una adzima puede probarse para la actividad contra diana en presencia de una o más proteínas del suero abundantes tales como albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humana u otra albúmina específica de organismo), transtiretina ("proteína de unión a retinol"), \alpha-1 globulinas (por ejemplo, inhibidor de a-1 proteasa [\alpha-1 antitripsina], \alpha-1 glicoproteína, lipoproteína de alta densidad [HDL]), \alpha-2 globulinas (\alpha-2 macroglobulina, antitrombina III, ceruloplasmina, haptoglobina), \beta-globulinas (por ejemplo, lipoproteínas beta y pre-beta [LDL y VLDL], C3, proteína C reactiva, hemoglobina libre, plasminógeno y transferrina), \gamma-globulinas (principalmente inmunoglobulinas). En ciertas realizaciones, una adzima de la invención es activa contra diana en presencia de concentraciones esperadas (es decir, fisiológicas, dependiendo del estado fisiológico del paciente) de uno o más componentes de la sangre tales como una o más proteínas del suero abundantes. Opcionalmente, la adzima es activa contra diana en presencia de concentraciones esperadas de una proteína en suero abundante, y opcionalmente no está significativamente afectada por concentraciones de una proteína en suero abundante que es un cuarto, un medio, dos, cinco o diez o más veces superior a la concentración esperada de una proteína en suero abundante. En una realización preferida, la adzima comprende un dominio catalítico que interactúa con un polipéptido diana que se espera se encuentre en la sangre, y opcionalmente el dominio catalítico tiene actividad de proteasa. Otros componentes de la sangre abundantes incluyen cualquiera de los diversos tipos de células y moléculas encontradas sobre las superficies de las mismas. Los tipos de células sanguíneas comunes incluyen glóbulos rojos, plaquetas, neutrófilos, linfocitos, basófilos, eosinófilos y
monocitos.

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(vi) Resistencia a autocatálisis

En ciertas realizaciones, el dominio catalítico de una adzima puede catalizar una reacción con la propia adzima dando como resultado la alteración de la adzima. Este tipo de reacción, llamada "autocatálisis", puede ser entre un dominio catalítico y alguna otra porción de la misma adzima (por ejemplo, un ligador, resto que elige diana u otra parte) o entre un dominio catalítico de una adzima y una parte de una segunda adzima (por ejemplo, el dominio catalítico, ligador, resto que elige diana). El primero tenderá a ser más significativo con respecto al último a concentraciones de adzima muy bajas tal como puede esperarse que se produzca después de que una adzima se haya desplegado en un paciente u otros entornos. La forma de inter-adzima de autocatálisis es la más probable que se produzca a mayores concentraciones tales como durante la preparación de adzima (por ejemplo, purificación a partir de cultivos celulares y posterior concentración), almacenamiento y en cualquier mezcla preparada para administración a un sujeto (por ejemplo, una dosis de adzima mezclada con solución salina para administración intravenosa).

Para la mayoría de los tipos de dominios catalíticos, la autocatálisis será un fenómeno relativamente poco importante, si se produce en absoluto. Por ejemplo, los dominios catalíticos que median la glicosilación, isomerización o fosforilación pueden no afectar la actividad de una adzima, incluso si no se somete a autocatálisis. Sin embargo, en ciertas situaciones, una modificación de una adzima podría alterar la capacidad de la adzima para actuar eficazmente sobre su diana, particularmente una modificación que se produce en la porción de unión de un resto de dirección o en la porción activa de un dominio catalítico. Muchas tipos de dominios catalíticos requieren algún tipo de co-factor (por ejemplo, ATP para una cinasa, un azúcar para una glicotransferasa) y, por tanto, la autocatálisis no se producirá en ausencia de tales co-factores. En estas circunstancias, la autocatálisis puede evitarse durante la preparación o almacenamiento asegurando que hay poco o ningún co-factor presente en la preparación de adzima.

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Los dominios catalíticos que tienen actividad de proteasa o por lo demás pueden degradar la adzima son de particular preocupación. Las proteasas no requieren frecuentemente ningún co-factor y, por tanto, la actividad autoproteolítica puede producirse bien en cualquier fase de la generación o uso de adzimas. Puede tomarse una variedad de soluciones para evitar la autoproteolisis.

En una realización, una adzima puede diseñarse o seleccionarse un dominio de proteasa de forma que la proteasa sea activa a bajos niveles en ausencia de la diana. Véase, por ejemplo, la descripción de adzimas contingentes proporcionadas en el presente documento.

En ciertas realizaciones, los sitios vulnerables a proteasa pueden manipularse fuera de las diversas porciones de una adzima, tal como cualquier dominio de dirección de polipéptidos, dominio catalítico o ligador. Esto puede lograrse bien alterando la secuencia de los componentes seleccionados o bien seleccionando componentes en primer lugar que muestran resistencia a la escisión con el dominio de proteasa deseado. La tripsina tiene un sitio vulnerable a tripsina interno y es susceptible a la acción de tripsina por inactivación, pero pueden generarse mutantes de tripsina resistentes a tripsina. Frecuentemente, los sitios sensibles a proteasa teóricos están presentes en diversos dominios, pero en la práctica no son sustratos de proteasa viables quizás debido a plegamientos u otros impedimento estéricos. Por ejemplo, los solicitantes han encontrado que una adzima de proteínas de fusión de p55(TNFR)-trombina no se somete a proteolisis autocatalítica a pesar de la presencia de un sitio de escisión de trombina dentro del polipéptido p55(TNFR). Tal plegamiento puede ajustarse por la presencia o ausencia de agentes tales como cationes monovalentes o divalentes (por ejemplo, potasio, calcio, cinc, hierro) o aniones (por ejemplo, fosfatos, cloruro, yodo), además de detergentes no iónicos, de ión bipolar e iónicos.

En ciertas realizaciones, un dominio de dirección, tal como un anticuerpo monocatenario u otro dominio de dirección basado en andamiaje, puede alcanzarse por selección de ARN in vitro. La selección in vitro permite la selección para dominios de dirección insensibles a proteasa y así forman un dominio de dirección que no se escindirá por el dominio de enzima. Pueden usarse soluciones similares para ligadores, porciones de inmunoglobulina u otros polipéptidos que van a incorporarse en una adzima.

Otro medio para limitar la autoproteolisis es producir el dominio catalítico como un zimógeno y activar la adzima justo antes de uso (por ejemplo, administración a un paciente). Una porción de zimógeno o de pro-proteína también puede diseñarse para escindirse con el uso (por ejemplo, mediante una proteasa activa en suero conocida). La escisión de ciertos zimógenos se produce en la dirección del extremo N desde el dominio de proteasa que significa que después de la activación el dominio de proteasa se separará de la porción del polipéptido que es el extremo N para el sitio de escisión. La escisión de un zimógeno que se produce en la dirección del extremo N desde el dominio de proteasa significa que después de la activación el dominio de proteasa se separará de la porción del polipéptido que es el extremo N para el sitio de escisión. La escisión de ciertos zimógenos se produce en la dirección del extremo C desde el dominio de proteasa que significa que después de la activación el dominio de proteasa se separará de la porción del polipéptido que es el extremo C para el sitio de escisión. Por consiguiente, una proteína de fusión que comprende un zimógeno deberá diseñarse de forma que el dominio de proteasa no se separe (a menos que ese sea el propósito) de la otra porción relevante de la proteína de fusión con la activación.

En realizaciones adicionales pueden emplearse inhibidores competitivos reversibles. Tales inhibidores se seleccionan preferentemente de manera que sean fácilmente extraíbles. Un inhibidor para uso en una preparación farmacéutica puede seleccionarse para tener una Ki que permita la inhibición eficaz en las altas concentraciones de almacenamiento y pre-administración, pero que libere fácilmente la proteasa con la dilución en el sitio de acción (por ejemplo, en el cuerpo del paciente). Preferentemente, el inhibidor se elige para ser no tóxico o por lo demás clínicamente aprobado. Los inhibidores también pueden usarse durante la producción y purificación de adzimas. Muchas proteasas requieren un cofactor de metal, y tales proteasas puede frecuentemente inhibirse reversiblemente por la formulación con un quelador tal como EDTA, EGTA, BHT o un polianión (por ejemplo, polifosfato).

En otras realizaciones, los sitios vulnerables a proteasa pueden modificarse pos-traducción. Los sitios vulnerables a proteasa podrían modificarse por fosforilación o metilación o glicosilación o químicamente (in vitro, a diferencia de modificaciones pos-traducción durante la producción) de forma que el dominio de proteasa no pueda unirse.

Como un simple ejemplo ilustrativo, el inhibidor competitivo benzamidina se ha usado para bloquear la acción de tripsina en las adzimas de tripsinógeno-p55 anti-TNF. La benzamidina ha aumentado el rendimiento de adzima en la expresión de transfección transitoria de la adzima tripsinógeno. La benzamidina, el ácido borónico u otros inhibidores de proteasa pueden ser útiles para preparar adzimas. Con respecto al dominio catalítico de MMP7 pueden emplearse inhibidores tales como tiorfan, ilomastat, FN 439, galardin o marimastat.

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F. Procedimientos a modo de ejemplo para diseñar adzimas

Una ventaja significativa de las adzimas es que admiten una solución de manipulación y diseño que permite al ingeniero biomolecular resolver varios de los múltiples desafíos de manipulación inherentes en el diseño de fármacos seriadamente en vez de simultáneamente. Un fármaco no sólo debe unirse a la diana con alta potencia, sino que también debe tener una o una combinación de propiedades médicas. En un ejercicio de descubrimiento/diseño de fármacos dado, la molécula candidata debe presentar diversas combinaciones de las siguientes propiedades: una adecuada solubilidad en sangre, inhibición no significativa de diana imprevistas (cuanto mayor especificidad mejor), lograr una concentración eficaz en la diana, pasar barreras biológicas tales como la piel, intestino, paredes celulares o barrera hematoencefálica, no tener metabolitos tóxicos, excretarse a una velocidad que permita lograr la biodisponibilidad necesaria sin lesión renal o hepática, no interferir con medicaciones comúnmente prescritas, evitar la complejación con albúmina u otras biomoléculas o secuestro en compartimentos de tejido, y ser sintéticamente manejable. Es muy difícil encontrar o diseñar una única entidad molecular que muestre simultáneamente todas las combinaciones necesarias de estas propiedades.

A diferencia, los restos moleculares individuales que comprenden la adzima, por ejemplo, el dominio de dirección y catalítico, pueden cribarse individualmente para la capacidad de unirse a o modificar la diana de interés, respectivamente. Estructuras candidatas para estas partes pueden tomarse del conocimiento público cada vez mayor de nuevas moléculas biológicas y esfuerzos de manipulación soportados por el aumento de entendimiento de su biología molecular y farmacología. Las enzimas activas existentes pueden mutarse para dar una dirección que conferirá una nueva especificidad. Nixon y col., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Biochemistry vol. 94, pág. 1069, 1997, han validado la solución de construir una enzima activa a partir de partes funcionales distintas de otras enzimas. Buenos candidatos para cada función puede ligarse juntos usando diversos tipos de estrategias de ligación. Por ejemplo, pueden introducirse en bucles, unirse mediante secuencia de aminoácidos flexible o estructurada u otros enlaces covalentes. Los constructos candidatos se preparan eligiendo secuencia de aminoácidos u otra estructura separada de la porción de unión o catalítica de cada dominio por su capacidad para complejar no covalentemente, o mediante proteínas chaperonas candidatas que se complejan a ambos dominios. Se contempla que se prepararán muchos constructos experimentales en paralelo, y que la biblioteca de constructos puede cribarse para la actividad deseada, y las especies activas desarrolladas por mutagénesis o por lo demás alteradas para explorar el espacio químico adyacente para propiedades
mejoradas.

Los dominios de dirección pueden seleccionarse usando ensayos in vivo o in vitro. La dirección puede probarse para la capacidad para unirse a la diana de interés usando ensayos para unión directa o ensayos que miden la actividad de la molécula diana. Los procedimientos que pueden usarse para medir la unión de la dirección a la molécula diana incluyen técnicas biofísicas y bioquímicas. Por ejemplo, los procedimientos biofísicos incluyen técnicas de fluorescencia que se basan en fluorescencia intrínseca o que se basan en la adición de una marca extrínseca, por ejemplo, transferencia de energía de fluorescencia, anisotropía de de fluorescencia, cambios en la fluorescencia intrínseca de la molécula diana o dominio de dirección con la unión (véanse Lakowitz, J. R. (1983) Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, Nueva York). La resonancia de plasmón superficial (Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo y col. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705) puede usarse para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial pueden usarse como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Las técnicas bioquímicas que pueden usarse para probar la capacidad del dominio de dirección para unirse a la molécula diana incluyen técnicas tales como inmunoprecipitación y cromatografía de afinidad.

Además, una de ambas moléculas puede marcarse usando un radioisótopo, por ejemplo, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{3}H u otra marca detectable, por ejemplo, una enzima, y la interacción entre las dos moléculas puede medirse aislando específicamente una molécula y midiendo la cantidad de la segunda molécula que está asociada a la primera molécula. En el caso de una radiomarca, la cantidad de proteína radiomarcada que se aísla puede medirse contando la radioemisión o mediante recuento por centelleo. Alternativamente, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca enzimática detectada por determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.

Los dominios de dirección (por ejemplo, un péptido específico de diana, anticuerpo monocatenario específico de diana) pueden tomarse a partir de ejemplos conocidos en la bibliografía, preferentemente de ejemplos de proteínas humanas. Alternativamente, los dominios de dirección pueden identificarse por cualquiera de varias técnicas de expresión recombinantes que incluye, pero no se limitan a, expresión en fago, expresión en levadura, expresión en ribosoma y expresión bacteriana. Los procedimientos para preparar y cribar bibliotecas de dominios de dirección, por ejemplo, bibliotecas de péptidos o anticuerpos, son muy conocidos en la técnica e incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. nº 6.156.511; 5.733.731; 5.580.717; 5.498.530; 5.922.545; 5.830.721; 5.811.238; 5.605.793; 5.571.698; 5.223.409; 5.198.346; 5.096.815; 5.403.484; 6.180.336; 5.994.519; 6.172.197; 6.140.471; 5.969.108; 5.872.215;
5.871.907; 5.858.657; 5.837.242; 5.733.743; 5.962.255; 5.565.332; y 5.514.548. Las bibliotecas pueden seleccionarse o cribarse funcionalmente para identificar dominios de dirección específicos que presentan las propiedades deseadas (por ejemplo, afinidad por una diana, relación señal respecto a ruido, etc.). Una técnica de expresión recombinante también puede usarse para identificar dominios de dirección candidatos. Las técnicas de expresión recombinante útiles incluyen, pero no se limitan a, expresión en fago (véase Hoogenboom y col., Immunol Today 2000 Aug; 21(8): 371-8), expresión en anticuerpos monocatenarios (véase Daugherty y col. (1999) Protein Eng 12(7): 613-21; Makeyev y col., FBBS Lett 1999 Feb 12; 444(2-3): 177-80), expresión retroviral (véase Kayman y col., J Virol 1999 Mar; 73(3): 1802-8), expresión en superficie bacteriana (véase Earhart, Methods Enzymol 2000; 326: 506-16), expresión en superficie de levadura (véase Shusta y col., Curr Opin Biotechnol 1999 Apr; 10(2): 117-22), expresión en ribosoma (véase Schaffitzel y col., J Immunol Methods 1999 Dec 10; 231(1-2): 119-35), tecnología de Profusion^{TM} (complejos covalentes de ácido nucleico:proteína, véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.207.446; 6.214.553; 6.258.558; 6.261.804; 6.281.344; 6.518.018, que permite la generación y el cribado de bibliotecas de polipéptidos sumamente diversas, que incluyen bibliotecas de, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios o bibliotecas de V_{H} o V_{L}), sistemas de dos híbridos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.580.736 y 5.955.280), sistemas de tres híbridos y derivados de los mismos. Las técnicas de expresión recombinante identifican dominios de dirección que pueden unirse a dianas, por ejemplo, proteínas (véanse, por ejemplo, Bara y col., Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Sep 16; 94(19): 10063-8; Katz, Biomol Eng 1999 Dec 31; 16(1-4): 57-65; Han y col., J Biol Chem 2000 May 19; 275(20): 1 4979-84; Whaley y col., Nature 2000 Jun 8; 405(6787): 665-8; Fuh y col., J Biol Chem 2000 Jul 14; 275(28): 21486-91; Joung y col., Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Jun 20,97(13): 7382-7; Giannattasio y col., Antimicrob Agents Chemother 2000 Jul; 44(7): 1961-3).

Los dominios catalíticos pueden cribarse basándose en su actividad. Dependiendo de la actividad específica de cada molécula que va aprobarse puede usarse un ensayo apropiado para esa molécula. Por ejemplo, el ensayo usado para cribar la actividad de proteasa del dominio catalítico de mesotripsina puede ser un ensayo para detectar productos de escisión generados por la proteasa, por ejemplo, un ensayo basado en cromatografía o electroforesis en gel. En un ejemplo alternativo, el sustrato elegido como diana puede marcarse y la escisión del producto marcado puede producir un producto detectable por, por ejemplo, un cambio en la fluorescencia del sustrato elegido como diana con la
escisión.

Debe observarse que la farmacodinámica (propiedades de unión y cinética) de las interacciones entre los dominios de dirección moleculares, dianas, sustratos, inhibidores y sitios enzimáticamente activos serán frecuentemente propiedades importantes de constructos candidatos que realizan la invención. Por tanto, las propiedades de asociación y disociación, velocidades de asociación, disociación y de reacción catalítica interaccionan en los diversos constructos para lograr el resultado deseado. Estas propiedades se manipulan en las moléculas por una combinación de diseño y fabricación racional basado en la estructura de una multiplicidad de constructos candidatos, o subpartes de los mismos, que se criban para actividad apropiada, como se desvela en el presente documento.

Los procedimientos para preparar y cribar dominios catalíticos para la actividad deseada son muy conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.383.775 y la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº de serie 60/414.688.

Una vez el dominio de dirección y el dominio catalítico se han incorporado en una única molécula, entonces puede crearse una biblioteca de adzimas. La biblioteca resultante puede cribarse para la capacidad para modificar la diana específica de interés. Un ensayo para la función biológica apropiada puede usarse para cuantificar la cantidad de modificación que realiza el dominio catalítico. En una realización preferida, el dominio catalítico es una proteasa y el ensayo es uno que mide la cantidad de producto de escisión generada por la escisión de la molécula diana. También puede ser eficaz para medir parámetros biofísicos, por ejemplo, k_{cat} o K_{M}, de los miembros de bibliotecas seleccionados. En otra realización, el ensayo para cribar la biblioteca de adzimas puede ser uno que mida la actividad biológica de la molécula diana o una molécula aguas abajo que está regulada por la molécula diana.

Una vez se ha identificado una adzima, o grupo de adzimas, en una selección o cribado, sus propiedades pueden potenciarse adicionalmente por una o más rondas de mutagénesis y selección/cribado adicional según procedimientos conocidos en la técnica. Además, un dominio catalítico de utilidad general, tal como una proteasa, puede usarse en constructos diseñados para fines muy diferentes.

Una biblioteca de adzimas que comprende combinaciones de dominios de dirección, ligadores y enzimas puede generarse usando un protocolo de biología molecular estándar. Tanto el dominio de dirección como el dominio de enzima pueden estar en el extremo N de la adzima. El tamaño/longitud, composición (secuencia de aminoácidos) puede ser variado. Los ácidos nucleicos que codifican el dominio de dirección, el ligador y el dominio de enzima pueden fusionarse recombinantemente y clonarse en vectores de expresión adecuados bajo el control de promotores operativamente ligados y reguladores de la transcripción. El constructo también puede incluir marcas de epítopes para facilitar la purificación de los productos recombinantes.

La combinación deseada de diferente dominio de dirección, ligador y dominio de enzima puede generarse, por ejemplo, mediante construcción a la fuerza bruta de un número deseado de adzimas candidatas. Cada una de estas adzimas puede entonces probarse individualmente y compararse en uno o más ensayos funcionales in vivo y/o in vitro, tanto para la propia adzima como para la diana de la adzima, o ambas.

Una vez se ha identificado una adzima o grupo de adzimas en una selección o cribado, sus propiedades pueden potenciarse adicionalmente por una o más rondas de mutagénesis y selección/cribado adicional según procedimientos conocidos en la técnica. Además, puede usarse un dominio catalítico de utilidad general tal como una proteasa en constructos diseñados para fines muy diferentes.

Para ilustrar, la patente de EE.UU. nº 6.171.820 describe un procedimiento rápido y facilitado de producción a partir de un polinucleótido molde parental, un conjunto de polinucleótidos progenie mutagenizados por el cual en cada posición de codón original se produce al menos un codón sustituto que codifica cada uno de los 20 aminoácidos naturalmente codificados. Por consiguiente, la patente también proporciona un procedimiento de producción a partir de un polipéptido molde parental, un conjunto de polipéptidos progenie mutagenizados en el que cada uno de los 20 aminoácidos naturalmente codificados se representa en cada posición de aminoácido original. El procedimiento proporcionado se llama "mutagénesis de saturación en sitio" o simplemente "mutagénesis de saturación" y puede usarse en combinación con otros procedimientos de mutagenización anteriormente descritos. Este procedimiento puede adaptarse para ajustar finamente/optimizar la combinación elegida final de dominio de dirección, ligador y dominio de enzima de manera que la adzima presente la propiedad biológica deseada.

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G. Adzimas contingentes

En una clase importante de adzimas, la actividad del dominio catalítico se modula por la unión de la dirección a un sitio de unión de dirección (sobre la diana o molécula asociada a diana). Por tanto, la actividad del dominio catalítico puede modularse por la propia diana, por una molécula asociada a diana o por parte de la propia molécula de adzima. En esta clase de constructos, el propio dominio catalítico está "enmascarado" o impedido estéricamente, por tanto, la mayoría de las veces inactivo, cuando la dirección no está unida por un sitio de unión de dirección. Una vez se reconoce la dirección y se une al sitio de unión de dirección (por ejemplo, cuando la adzima alcanza su diana), tal impedimento se libera exponiendo el dominio catalítico activo para que actúe sobre la diana. Podría haber muchas realizaciones de este tipo de llamadas "adzimas contingentes". Véase la Figura 3.

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H. Adzimas para uso en tratamiento

La presente invención también proporciona las adzimas de la invención para uso en un procedimiento para tratar un sujeto que padece una enfermedad tal como una enfermedad asociada a una molécula soluble o accesible a disolvente. El procedimiento incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente, profilácticamente o analgésicamente eficaz de una adzima de la invención tratándose así un sujeto que padece una enfermedad. Generalmente, las adzimas pueden diseñarse y usarse para tratar cualquier enfermedad mediada por un factor de señalización accesible a disolvente en fluido corporal extracelular o sobre una superficie celular.

Una enfermedad asociada a una molécula soluble incluye una enfermedad, trastorno o afección que se produce por o se asocia (por ejemplo, directamente o indirectamente) a una biomolécula soluble o unida a membrana tal como una citocina o un factor de crecimiento o un GPCR. Ejemplos de tales enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias tales como asma, psoriasis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), septicemia, vasculitis y bursitis; enfermedades autoinmunitarias tales como lupus, polimialgia reumática, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, arteritis temporal, crioglobulinemia y esclerosis múltiple; rechazo de trasplante; osteoporosis; cáncer que incluye tumores sólidos (por ejemplo, pulmón, SNC, colon, riñón y páncreas); enfermedad de Alzheimer y otras neurodegenerativas; aterosclerosis; infecciones víricos (por ejemplo, VIH o gripe); infección viral crónica (por ejemplo, Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple); y ataxia telangiectasia.

Las adzimas pueden usarse en terapias anti-TNF en lugar de anticuerpos, constructos artificiales o moléculas pequeñas. Pueden usarse para tratar vasculitis de Wegener, psoriasis, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn y otras EII, y artritis reumatoide. También puede usarse para intervención rutinaria o rápida en enfermedad infecciosa causada por bacterias y virus, atacando al agente infeccioso directamente mediante proteínas de la superficie celular o toxinas circulantes o complejos inmunitarios. Ejemplos de dianas solubles particularmente prometedoras, además de TNF, incluyen IgE, C5, TGF\beta, VEGF e interleucinas tales como IL-1.

Las adzimas pueden usarse en animales de sangre caliente, preferentemente mamíferos, que incluyen seres humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización incluso más preferida, el primate es un ser humano.

Como se usa en el presente documento, el término "administrar" a un sujeto incluye dispensar, liberar o aplicar una adzima de la invención, por ejemplo, una adzima en una formulación farmacéutica a un sujeto por cualquier ruta adecuada para administración de la composición a la localización deseada en el sujeto que incluye administrar por cualquiera de ruta parenteral u oral, inyección intramuscular, inyección subcutánea/intradérmica, inyección intravenosa, administración por vía oral, administración transdérmica y administración por la vía rectal, colónica, vaginal, intranasal o al tracto respiratorio. Las máquinas catalíticas de la invención también pueden administrarse por soluciones de terapia génica en las que los nucleótidos que codifican los constructos se administran a un paciente, migran o se transportan a células diana, entran en las células y se expresan para proporcionar las células con una máquina inteligente manipulada terapéutica.

Las adzimas de la presente invención pueden proporcionarse solas o en combinación con otros agentes que modulan un procedimiento patológico particular. Por ejemplo, una adzima de la presente invención puede administrarse en combinación con otros agentes conocidos útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas a o producidas por una molécula soluble. Los agentes conocidos que pueden usarse en los procedimientos de la invención pueden encontrarse en Harrison's Principles of Internal Medicine, decimotercera edición, Eds. T.R. Harrison y col. McGraw-Hill N.Y., NY; y Physicians Desk Reference 50ª edición 1997, Oradell Nueva Jersey, Medical Economics Co. Las adzimas de la invención y los agentes adicionales pueden administrarse al sujeto en la misma composición farmacéutica o en diferentes composiciones farmacéuticas (al mismo tiempo o a tiempos diferentes). En una realización, una o más adzimas que son específicas para una o más dianas se administran a un sujeto simultáneamente. En otra realización, los dominios separados de las adzimas (es decir, el dominio de dirección y el dominio catalítico) pueden administrarse a un sujeto por separado. En una realización tal, el dominio de dirección y el dominio catalítico se ensamblan in vivo para formar la adzima.

La presente invención también proporciona las adzimas de la invención para uso en un procedimiento para tratar un sujeto que padece una enfermedad tal como una enfermedad asociada a un antígeno que deja de provocar respuesta inmunitaria del huésped apropiada que incluye ciertos antígenos tumorales. El procedimiento incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente, profilácticamente o analgésicamente eficaz de una adzima de la invención, modificar dicha adzima selectivamente una proteína diana asociada a la enfermedad de forma que la proteína diana modificada llegue a ser más antigénica y provoque una fuerte respuesta inmunitaria del huésped conduciendo a la destrucción de la proteína diana modificada o células asociadas a la misma tratándose así un sujeto que padece una enfermedad tal.

Por ejemplo, ciertos antígenos débiles puede tener epítopes enmascarados, por tanto, tales antígenos dejan normalmente de provocar una respuesta inmunitaria del huésped suficiente. Mediante la escisión del antígeno intacto usando la adzima, los epítopes previamente enmascarados se expondrán dando como resultado una mayor respuesta inmunitaria contra el antígeno.

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L. Uso no médico de adzimas

La presente invención también proporciona diversos usos de adzimas en varias aplicaciones no médicas que incluyen, pero no se limitan a, agricultura, protección medioambiental, alimento, etc.

Por ejemplo, las adzimas objeto pueden encontrar un amplio intervalo de usos en la agricultura que incluyen producir pienso animal/alimento para mascotas, molienda de grano, producción de etanol y procesamiento de alimentos.

Pienso animal/alimento para mascotas Las adzimas pueden usarse para elevar la calidad nutricional y eliminar factores antinutricionales de componentes de piensos tales como piensos basados en cebada y trigo. Los coproductos del procesamiento del maíz tales como harina de gluten y fibra también pueden mejorarse usando la adzima objeto. En realidad, varias crisis de seguridad alimentaria en la historia reciente (BSE, crisis de la dioxina, etc.) han hecho evidente que el pienso animal tiene que considerarse un peligro para la salud pública y que puede conducir a disminuir la confianza del público en la seguridad de los alimentos de origen animal.

En una realización, una proteasa puede ligarse a una dirección específica del factor nutricional no deseable presente en componentes de pienso conduciendo así a la degradación/eliminación de tal componente. Un beneficio añadido de tal digestión asistida por adzimas es que el factor de proteína degradado (inactivo) es ahora una fuente nutritiva de proteína (fragmentos de péptidos). Por ejemplo, Caughey y col. (J. Virol. 2135-2141, vol. 68, nº 4, abril 1994) notificó que el precursor aparente de PrP resistente a proteasa (responsable de la enfermedad por priones BSE), la PrP sensible a proteasa, se une a rojo Congo y heparina, un glicosaminoglicano sumamente sulfatado. Por tanto, las adzimas que comprenden un dominio de dirección de rojo Congo o ciertos glicanos sulfatados, y un dominio catalítico de una proteasa que puede degradar la PrP sensible a proteasa, pueden usarse para pretratar ciertos piensos animales para reducir el riesgo de transmisión de enfermedad por priones.

En una realización relacionada, las adzimas de la presente invención pueden usarse con otra enzima como aditivos de piensos para mejorar la nutrición y digestibilidad, reducir los residuos y reducir los costes de alimentación aumentando la solubilidad de fibras o proteínas de granos tales como maíz, trigo, cebada y soja usados en piensos típicos. Las otras enzimas que pueden usarse con adzima incluyen: proteasa (enzima digestora de proteína), amilasa (enzimas digestoras de carbohidratos), lipasa (enzima digestora de grasa), celulasa (enzima digestora de fibra), lactasa (enzima digestora de azúcar de la leche), invertasa, maltasa (enzima digestora de azúcar) y/o alfa-galactosidasa (enzima digestora de alubias).

Etanol combustible El interés en el etanol como un combustible limpio es ahora más fuerte que nunca. Los combustibles fósiles son finitos, no renovables y producen daño al entorno mediante la contaminación y el calentamiento global, siguen suministrando más del 80 por ciento de las necesidades energéticas mundiales. A la presente velocidad de consumo se espera que las reservas de petróleo del mundo se agoten en los próximos 50 a 100 años. El explosivo crecimiento de población y la mejora de los estándares de vida pueden acortar el marco temporal. El etanol, un destilado químico de cosechas de almidón como trigo, cebada, sorgo y trigo, es un combustible mucho más eficaz y mucho menos contaminante que la gasolina. La industria agrícola sólo produce aproximadamente cien mil millones de toneladas de biomasa (cosechas sin utilizar, árboles, pastos y otros "residuos" agrícolas) mundialmente cada año con un valor energético cinco veces al de la energía consumida globalmente. El almidón de estos granos se convierte en azúcares fermentables que luego se convierten en alcohol mediante levadura.

Aunque la celulasa se ha usado en la producción de biocombustible, los cálculos aproximados actuales para el coste de celulasa oscilan de 30 a 50 céntimos por galón de etanol producido. Para ser más competitivos en precio, el objetivo en la producción de biocombustible es reducir el coste de celulasa a menos de 5 céntimos por galón de etanol. Esto requiere un aumento de diez veces la actividad específica o eficiencia de producción o combinación de las mismas. Por tanto, incluso un aumento de unas pocas veces en la actividad específica de celulasa (con respecto al sistema de Trichoderma reesei) sería un progreso importante en esta dirección.

Por tanto, en esta realización, las adzimas con celulasa y otras enzimas que pueden digerir biomasa en restos de azúcar más simples más adecuados para la fermentación pueden usarse para facilitar la producción de etanol combustible. El dominio de dirección puede contener más de un dominio de unión tal como los dominios de unión de celulosa putativos de \approx100 aminoácidos codificados por el gen cbpA de la proteína de unión a celulosa de Clostridium cellulovorans (CbpA). Como se menciona anteriormente, el K_{d} efectivo de una adzima con dos dominios de dirección idénticos con K_{d} de aproximadamente 1 nM tendría un valor mucho más ajustado de aproximadamente 10^{-15} M, y puede aumentar la eficiencia catalítica de la digestión de celulosa.

Procesamiento de alimentos Las adzimas pueden usarse en la industria alimentaria para fines tales como mejorar el horneado, procesar proteínas más eficientemente, preservar alimentos, tratar pieles de animales en la industria del cuero, recuperar residuo de plata en el procesamiento de películas fotográficas y mejorar el procesamiento de la pulpa y el papel. El uso de adzimas ofrece alternativas de tratamiento que son menos rigurosas que los procedimientos químicos tradicionales. El beneficio primario ofrecido son tratamientos en condiciones suaves de temperatura y pH. Algunas adzimas útiles para estos fines se usan para la hidrólisis de proteínas y en la modificación de celulosa y hemicelulosa, otras son útiles para descomponer peróxido de hidrógeno en corrientes residuales o para la eliminación de oxígeno y glucosa en aplicaciones alimentarias.

Todas estas adzimas pueden manipularse, como mínimo, incluyendo múltiples dominios de dirección que pueden potenciar la especificidad y/o afinidad de unión aumentando así la actividad global.

Por ejemplo, las adzimas pueden usarse para mejorar la calidad del gluten en productos horneados, potenciar las características sensoriales y físicas de panes y facilitar la solubilidad, funcionalidad y nutrición de proteínas de la carne o vegetales en una diversa gama de productos desde leche de inicio hasta bebidas deportivas. Las adzimas también pueden usarse para convertir más eficazmente el almidón en jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS), el edulcorante ampliamente usado en muchos alimentos y especialmente refrescos.

Industria de la pulpa y el papel La adzima que comprende xilanasas pueden usarse para el refuerzo del blanqueo, la adzima que comprende celulasas puede usarse para refinar pulpa y reciclar papel y la adzima que comprende amilasa pueden usarse para la eliminación y modificación de almidón.

En el procedimiento de fabricación de cerveza Las adzimas pueden usarse para mejorar la eficiencia del procedimiento y los productos finales. Por ejemplo, las adzimas que comprenden alfa amilasas pueden usarse en la cocción de complementos de cereales, las adzimas que comprenden betaglucanasas pueden usarse para mejorar filtración en el macerado y añejamiento y las adzimas que comprenden glucoamilasa pueden usarse para producir cervezas bajas en calorías. Además, las adzimas que comprenden alfa amilasa y glucomilasa pueden usarse en la producción de alcohol potable.

Industria textil Las adzimas son útiles en una variedad de aplicaciones dentro de las industrias de limpieza y cuidado de tejidos. El uso de adzimas es beneficioso porque frecuentemente sustituyen productos químicos o procedimientos que presentan cuestiones medioambientales. Pero las enzimas que se producen naturalmente no están frecuentemente disponibles en cantidades suficientes o actividad/eficiencia enzimática para uso industrial.

El aspecto descolorido o gastado de la tela vaquera que tiene un alto contraste "lavado a la piedra" se conseguía originalmente lavando la tela vaquera con piedra pómez en grandes lavadoras industriales. En un procedimiento de ese tipo, la falta de control de la abrasión, el daño al tejido y el rasgado y la rotura en las lavadoras es considerable. Los mismos efectos pueden lograrse eficazmente usando adzimas en un modo más respetuoso con el medioambiente. Las adzimas pueden ser útiles en el desapresto (amilasas), acabado de la tela vaquera (celulasas), bioacabado del algodón y fibras celulósicas (celulasas) y eliminación de peróxido de hidrógeno (catalasas).

Productos de cuidado personal Las proteasas realizan diversas funciones de maduración macromolecular o hidrolítica dentro del cuerpo. Estas funciones pueden potenciarse o modificarse por la aplicación de adzimas exógenamente suministradas. Por ejemplo, la aplicación de adzimas a la superficie de la piel puede ayudar en la descomposición de aceites superficiales y la eliminación de piel muerta. Por tanto, con el uso de adzimas en la piel, el pelo y las aplicaciones de cuidado oral es posible complementar los procedimientos naturales del cuerpo que darán como resultado una piel de aspecto más joven, pelo más bonito y dientes y encías más sanos.

Detergente/productos de limpieza En otras realizaciones particularmente preferidas, las adzimas objeto pueden usarse para elegir como diana y destruir moléculas preseleccionadas particulares tanto si tienen como si no una actividad biológica. Por tanto, por ejemplo, los componentes de diversas suciedades o manchas (por ejemplo, leche, sangre, huevos, manchas de hierba, manchas de aceite, etc.) pueden elegirse específicamente como diana. Por ejemplo, la avidina/proteína de huevo puede elegirse específicamente como diana usando una biotina como resto que elige diana para dirigirse específicamente, por ejemplo, al sitio de una proteasa. La mancha se degrada/digiere y así se libera del sustrato subyacente. Tales adzimas son particularmente útiles en diversas formulaciones de limpieza.

El término "suciedad" o "mancha" se refiere a la acumulación de material extraño sobre un sustrato de interés (por ejemplo, un textil). La "suciedad" o "mancha" puede no tener actividad biológica, pero puede servir para decolorar y/o degradar el sustrato subyacente. La "suciedad" no necesita ser visible a simple vista. La deposición de materiales extraños que, aunque no son visibles a simple vista, crean olores o ayudan al crecimiento bacteriano, también se consideran "suciedades" en el contexto de esta solicitud. Las manchas o suciedades típicas incluyen, pero no se limitan a, manchas de hierba, manchas de sangre, manchas de leche, huevo, clara de huevo y similares.

Las adzimas de esta invención son útiles en una amplia variedad de contextos en los que se desea degradar una molécula diana y/o inhibir la actividad de esa molécula diana. Por tanto, por ejemplo, en aplicaciones ex vivo, los antagonistas catalíticos pueden usarse para elegir específicamente como diana y degradar una molécula particular. Por tanto, por ejemplo, en operaciones de limpieza, las moléculas quiméricas de esta invención pueden utilizarse para elegir específicamente como diana y degradar un componente de una suciedad (por ejemplo, un componente de proteína, un componente de lípido, etc.) en procedimientos sintéticos químicos o procedimientos sintéticos bioquímicos (por ejemplo, en preparaciones analíticas o industriales, en biorreactores, etc.) para degradar específicamente moléculas preseleccionadas particulares. Por tanto, por ejemplo, si se desea eliminar una actividad enzimática particular en un biorreactor (por ejemplo, una glicosilación), el antagonista catalítico de esta invención comprende como resto que elige diana un sustrato para la enzima que media en la actividad (por ejemplo, una glicosiltransferasa). La enzima (receptor) en el reactor se une al resto que elige diana y el componente enzimático de la quimera (por ejemplo, una hidrolasa) degrada la enzima reduciendo o eliminando su actividad y también liberándose del sitio de unión a enzima por lo que es libre para atacar otra enzima diana.

Biotecnología de la silicona En sistemas biológicos, las moléculas orgánicas ejercen un nivel notable de control respecto a la nucleación y la fase mineral de materiales inorgánicos tales como carbonato cálcico y sílice, y respecto al ensamblaje de cristales y otros bloques de formación a escala nanométrica en estructuras complejas requeridas para la función biológica (Belcher y col., Nature 381, 56-58, 1996; Falini y col., Science 271: 67-69, 1996; Cha, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 361-365, 1999; Meldrum y col., Proc. R. Soc. Lond. B 251: 238-242, 1993). Esta capacidad para dirigir el ensamblaje de componentes a escala nanométrica en estructuras controladas y sofisticadas ha motivado intensos esfuerzos para desarrollar procedimientos de ensamblaje que imitan o explotan las capacidades de interacciones de reconocimiento encontradas en sistemas biológicos (Colvin y col., J. Am. Chem. Soc. 144: 5221-5230, 1992; Brust y col., Adv. Mater. 7: 795-797, 1995; Li y col., Chem. Mater. 11: 23-26, 1999; Alivisatos y col., Nature 382: 609-611, 1996; Mirkin y col., Nature 382: 607-609, 1996; Brown, Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 8651-8655, 1992). Brown (Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 8651-8655, 1992; y Nature Biotechnol. 15: 269-272, 1997) describe la selección satisfactoria de péptidos con selectividad limitada para unirse a superficies metálicas y superficies de óxido metálico. En otro estudio, usando bibliotecas de expresión en fago combinatorias, Whaley y col. (Nature 405: 665-668, 2000) extienden esta solución y cribaron y seleccionaron satisfactoriamente numerosos péptidos que se unen a una gama de superficies de semiconductor con alta especificidad dependiendo de la orientación y composición cristalográfica de los materiales estructuralmente similares usados. Whaley y col. han extendido este reconocimiento y especificidad de péptido de cristales inorgánicos a otros sustratos que incluyen GaN, ZnS, CdS, Fe_{3}O_{4} y CaCO_{3}. Tales péptidos pueden usarse como dominios de dirección de las adzimas objeto y colocar/reunir específicamente una variedad de macromoléculas funcionales (tales como polipéptidos) para regiones predeterminadas de microchips (tales como matrices de proteínas, etc.).

Tales adzimas elegidas como diana pueden usarse para el ensamblaje/síntesis secuencial dirigida de nanomateriales, tanto materiales híbridos inorgánicos como orgánicos/inorgánicos. En una realización, una primera adzima puede colocarse sobre la superficie de una primera región de una línea/recipiente de nano-ensamblaje (tanque, tubo de flujo continuo y otros diseños apropiados) de forma que el dominio funcional -el dominio catalítico- en la adzima pueda llevar a cabo una primera etapa de una serie de procedimientos sobre un reactivo/sustrato. Entonces, el reactivo puede pasarse a una segunda adzima colocada sobre la superficie de una segunda región de una línea/recipiente de nano-ensamblaje para permitir que se acabe la siguiente etapa del procedimiento. Este procedimiento puede repetirse en etapas posteriores de los procedimientos hasta que se hagan todas las reacciones y se produzca el producto final.

La proteína silicateína que se aísla de la esponja marina Tetia aurantia cataliza la polimerización in vitro de sílice y silsesquioxanos de tetraetoxisilano y trietóxidos de sílice, respectivamente. Cuando se une a una región específica de la línea de nano-ensamblaje, la proteína puede usarse para llevar a cabo una etapa específica de un nano-ensamblaje particular.

Alternativamente, diferentes adzimas pueden estar unidas a diferentes chips que pueden cargarse automáticamente sobre o sacarse de un recipiente de reacción para llevar a cabo la etapa catalítica secuencial.

Tales adzimas elegidas como diana también pueden usarse para construir matrices de moléculas (idénticas o diferentes) sobre chips de silicona. A este respecto, la tecnología de adzimas objeto puede combinarse con ensamblaje químico planeado de arquitecturas a escala nanométrica orgánicas/inorgánicas tridimensionales (3-D). Esta solución se basa en procedimientos de derivatización química de superficies y el autoensamblaje controlado tiene lugar sobre andamiajes orgánicos de plantilla producidos mediante una estrategia de autoensamblaje capa a capa jerárquica. Por ejemplo, pueden generarse patrones 2-D arbitrarios usando un novedoso procedimiento de nano-modelado denominado en lo sucesivo "Nanolitografía constructiva" [1] por el que pulsos eléctricos administrados por una punta de AFM (microscopio de fuerza atómica) conductora inducen transformaciones electroquímicas locales que afectan selectivamente a las funciones principales de ciertas monocapas de organosilanos sumamente ordenadas o películas más gruesas autoensambladas sobre silicona. En este procedimiento de modelado, la punta de AFM desempeña la función de un "lapicero" nano-electroquímico con el que la información química se transcribe en un modo no destructivo sobre la superficie de la película orgánica seleccionada. La película o el producto modelado de su modificación química adicional se utiliza entonces adicionalmente como molde que puede guiar el posterior autoensamblaje superficial de diversas adzimas elegidas como diana creando así un sistema de autoensamblaje gradualmente desarrollado en el que cada etapa de autoensamblaje se somete al control proporcionado por una estructura molde previamente ensamblada. Esta solución de autoensamblaje jerárquico ofrece opciones para el ensamblaje planeado de nuevos tipos de arquitecturas de materiales nanocompuestos orgánicos-inorgánicos con dimensionalidad variable, de estructuras de 0-D (puntos individuales) y 1-D (alambres) a 3-D (superredes cristalinas).

Por ejemplo, la superficie de una matriz puede comprender un primer material que no puede unirse por las direcciones de cualquiera de varias adzimas que van a unirse posteriormente. Usando la tecnología anteriormente descrita, una primera área de la superficie puede alterarse de forma que un primer dominio de dirección de una adzima pueda ahora unirse a la región alterada. Si la unión es saturante, después de eliminar toda la primera adzima, el mismo procedimiento puede repetirse para una segunda región sobre la superficie que se expone a una segunda región de forma que ahora puede unirse una segunda adzima (puede ser con un dominio catalítico diferente). Debido a que la punta del ATM está controlando la exposición de la superficie, diversos patrones pueden grabarse secuencialmente sobre la superficie de forma que selectivamente pueden unirse diferentes adzimas con diferentes funciones a diferentes áreas de la superficie en distintos patrones, si es necesario.

Los motivos de ADN se han usado para producir patrones a escala nanométrica en 2D que incluyen una red cristalina 2D de un empalme con extremos pegajosos (véase Seeman y Belcher, Proc Natl Acad Sci U S A. 99 Suppl 2: 6451-5; Apr. 30, 2002; Epub 2002 Mar 05). Por tanto, en otras realizaciones, las adzimas con dominios de dirección que reconocen secuencias de ADN específicas pueden estar unidas a tales redes cristalinas de ADN para crear matrices de enzimas patrón. El dominio de dirección pueden ser dominios de unión a ADN naturalmente existentes o pueden seleccionarse de unión a ADN específica usando, por ejemplo, expresión en fago u otras técnicas similares.

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J. Composiciones que contienen adzimas (i) Preparaciones de proteínas

Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen las adzimas de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden normalmente una adzima de la invención o nucleótidos que codifican la misma para transfección en un tejido diana y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. El tipo de vehículo puede seleccionarse basándose en la vía de administración prevista. En diversas realizaciones, el vehículo es adecuada para administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, transdérmica o por vía oral.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención se contempla. Los compuestos activos complementarios también pueden incorporarse en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una disolución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerina, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, las adzimas pueden administrarse en una formulación de liberación con el tiempo, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Las adzimas pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto de la rápida liberación tales como una formulación de liberación controlada que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como acetato de etileno-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros de poliláctico-poliglicólico (PLG). Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones son generalmente conocidos para aquellos expertos en la materia.

Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando la adzima en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados anteriormente según se requiera seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando la adzima en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.

Dependiendo de la vía de administración, la adzima puede recubrirse con un material para protegerla de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el agente. Por ejemplo, la adzima puede administrarse a un sujeto en un vehículo o diluyente apropiado coadministrado con inhibidores de enzimas o en un vehículo apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y disoluciones acuosas de tampón. Los inhibidores de enzimas incluyen inhibidor de tripsina pancreático, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones agua en aceite en agua además de liposomas convencionales (Strejan, y col., (1984) J. Neuroimmunol 7:27). Las dispersiones también pueden prepararse en glicerina, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

El agente activo en la composición (es decir, una adzima de la invención) se formula preferentemente en la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico deseado tal como la modulación de la actividad de una diana para así influir el curso terapéutico de un estado de enfermedad particular. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una adzima puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la adzima para provocar una respuesta deseada en el individuo. Las pautas de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la adzima es mayor que los efectos terapéuticamente beneficiosos. En otra realización, la adzima se formula en la composición en una cantidad profilácticamente eficaz. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado, por ejemplo, modulación de la actividad de una diana (por ejemplo, TNF\alpha o TNF\beta) para fines profilácticos. Normalmente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menos que la cantidad terapéuticamente eficaz.

La cantidad de una adzima en la composición puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y el peso del individuo. Las pautas de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante un tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que van a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está impuesta por y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a lograrse y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinación de un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Otro aspecto de la invención proporciona aerosoles para la administración de adzimas al tracto respiratorio. El tracto respiratorio incluye las vías respiratorias superiores que incluyen la orofaringe y laringe, seguido de las vías respiratorias inferiores que incluyen la tráquea seguida de bifurcaciones en los bronquios y bronquiolos. Las vías respiratorias superiores e inferiores se llaman las vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen entonces
en los bronquiolos respiratorios que luego conducen a la última zona respiratoria, los alveolos o el pulmón profundo.

En el presente documento, la administración por inhalación puede ser oral y/o nasal. Ejemplos de dispositivos farmacéuticos para administración por aerosol incluyen inhaladores de dosis dosificadas (MDI), inhaladores de polvo seco (DPIs) y nebulizadores de chorro de aire. Los sistemas de administración de ácidos nucleicos a modo de ejemplo por inhalación que pueden adaptarse fácilmente para la administración de las adzimas objeto se describen en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.756.353; 5.858.784; y las solicitudes PCT WO98/31346; WO98/10796; WO00/27359; WO01/54664; WO02/060412. Otras formulaciones en aerosol que pueden usarse se describen en las patentes de EE.UU. 6.294.153; 6.344.194; 6.071.497 y las solicitudes PCT WO02/066078; WO02/053190; WO01/60420;
WO00/66206.

Los pulmones humanos pueden eliminar o degradar rápidamente aerosoles depositados hidrolíticamente escindibles en periodos que oscilan de minutos a horas. En las vías respiratorias superiores, los epitelios ciliados contribuyen al "movimiento mucociliar" por lo que las partículas son barridas de las vías respiratorias hacia la boca. Pavia, D., "LungMucociliary Clearance," en Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. y Pavia, D., Eds., Butterworths, Londres, 1984. En los pulmones profundos, los macrófagos alveolares pueden fagocitar partículas poco después de su deposición. Warheit y col. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); y Brain, J. D., "Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages", en The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard y J. Filkins, Eds., Plenum, Nueva York, pág. 315-327, 1985. El pulmón profundo, o los alveolos, son la diana primaria de los aerosoles terapéuticos inhalados para administración sistémica de adzimas.

En realizaciones preferidas, particularmente cuando se desea la dosificación sistémica con la adzima, las adzimas aerosolizadas se formulan como micropartículas. Las micropartículas que tienen un diámetro de entre 0,5 y diez micrómetros pueden penetrar en los pulmones pasando a trasvés de la mayoría de las barreras naturales. Para sortear la garganta se requiere un diámetro de menos de diez micrómetros; se requiere un diámetro de 0,5 micrómetros o superior para evitar que sea exhalado.

Una adzima de la invención puede formularse en una composición farmacéutica en la que el compuesto es el único agente activo en ella. Alternativamente, la composición farmacéutica puede contener agentes activos adicionales. Por ejemplo, dos o más adzimas de la invención puede usarse en combinación.

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(ii) Composiciones de ácidos nucleicos

Otro aspecto de la invención proporciona vectores de expresión para expresar las entidades de adzimas objeto. Por ejemplo, se contempla que los vectores de expresión incluyan una secuencia de nucleótidos que codifica una adzima de polipéptido, secuencia codificante que está operativamente ligada a al menos una secuencia reguladora de la transcripción. Las secuencias reguladoras para dirigir la expresión de la presente adzima de polipéptido son reconocidas en la técnica y se seleccionan por varios criterios bien entendidos. Las secuencias reguladoras a modo de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión que controla la expresión de una secuencia de ADN cuando está operativamente ligada puede usarse en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican las adzimas de polipéptidos de esta invención. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40, adenovirus o promotor temprano inmediato de citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por T7 ARN polimerasa, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5 y los promotores de los factores de \alpha-apareamiento de levaduras y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped diana que va a transformarse. Además, también debe considerarse el número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias y la expresión de muchas otras proteínas codificadas por el vector tales como marcadores de antibióticos.

Como será evidente, los constructos de genes objeto pueden usarse para producir la expresión de las adzimas de polipéptidos objeto en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas o polipéptidos que incluyen adzimas de polipéptidos por purificación.

Esta invención también se refiere a una célula huésped transfectada con un gen recombinante con el fin de expresar uno de los polipéptidos objeto. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una adzima de polipéptido de la presente invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (baculovirus), levadura o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas son conocidas para aquellos expertos en la materia.

Por consiguiente, la presente invención se refiere adicionalmente a procedimientos de producción de adzimas de polipéptidos objeto. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica una proteína de interés puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión de la proteína. La proteína puede secretarse, por inclusión de una secuencia señal de la secreción, y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene la proteína. Alternativamente, la proteína puede retenerse citoplásmicamente y las células recogerse, lisarse y aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para cultivo celular son muy conocidos en la técnica. Las proteínas pueden aislarse de medio de cultivo celular, células huésped o ambos usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopes particulares de la proteína.

Por tanto, una secuencia codificante para una adzima de polipéptido de la presente invención puede usarse para producir una forma recombinante de la proteína mediante procedimientos celulares microbianos o eucariotas. La ligación de la secuencia de polinucleótidos en un constructo de genes tal como un vector de expresión y la transformación o transfección en huéspedes tanto eucariotas (células de levadura, aviares, de insecto o de mamífero) como procariotas (células bacterianas) son procedimientos estándar.

Los vehículos de expresión para la producción de una proteína recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados para la expresión de adzimas de polipéptidos incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas tales como E. coli.

Existen varios vectores para la expresión de proteínas recombinantes en levadura. Por ejemplo, YEp24, YIp5, YEp51, YEp52, pYES2 y YRp17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de constructos genéticos en S. cerevisiae (véase, por ejemplo, Broach y col., (1983) en Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye Academic Press, pág. 83). Estos vectores pueden replicar en E. coli debido a la presencia de pBR322 ori y en S. cerevisiae debido al determinante de replicación del plásmido de 2 micrómetros de levadura. La selección autotrófica o la contraselección se usa frecuentemente en levadura. Además, los marcadores de resistencia a fármaco tales como ampicilina pueden usarse en bacterias.

Los vectores de expresión de mamífero preferidos contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2 gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores están modificados con secuencias de plásmidos bacterianos tales como pBR322 para facilitar la replicación y la selección de resistencia a fármaco en células tanto procariotas como eucariotas. Alternativamente, los derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (derivado de pHEBo, pREP y p205) pueden usarse para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (que incluyen retrovíricos) pueden encontrarse más adelante en la descripción de los sistemas de administración de terapia génica. Los diversos procedimientos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de organismos huésped son muy conocidos en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, además de los procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) capítulos 16 y 17. En algunos casos puede desearse expresar las adzimas de polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión en baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresión en baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como el beta-gal que contiene pBlueBac III).

En otras realizaciones adicionales, los constructos de expresión objeto se derivan mediante inserción del gen objeto en vectores víricos que incluyen retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adenoasociados y virus 1 del herpes simple, o plásmidos bacterianos o eucariotas recombinantes. Como se describe anteriormente en mayor detalle, tales realizaciones de constructos de expresión objeto están específicamente contempladas para uso en diversos protocolos de terapia génica in vivo y ex vivo.

Generalmente se entiende que los vectores de retrovirus y vectores de virus adenoasociados son el sistema de administración de genes recombinantes de elección para la transferencia de genes exógenos in vivo, particularmente en seres humanos. Estos vectores proporcionan la administración eficaz de genes en células y los ácidos nucleicos transferidos están establemente integrados en el ADN cromosómico del huésped. Un requisito previo importante para el uso de retrovirus es garantizar la seguridad de su uso, particularmente con respecto a la posibilidad de la propagación de virus naturales en la población celular. El desarrollo de líneas celulares especializadas (llamadas "células de encapsidación") que sólo produce retrovirus defectivos en la replicación ha aumentado la utilidad de retrovirus para terapia génica, y los retrovirus defectivos están bien caracterizados para uso en transferencia de genes para fines de terapia génica (para una revisión véase Miller, A.D. (1990) Blood 76: 271). Por tanto, el retrovirus recombinante puede construirse en la parte de la secuencia codificante retroviral (gag, pol, env) que ha sido sustituida por ácido nucleico que codifica una adzima de polipéptido de la presente invención, haciendo que la replicación de retrovirus sea defectuosa. El retrovirus defectivo en la replicación se encapsida entonces en viriones que pueden usarse para infectar una célula diana mediante el uso de un virus auxiliar por técnicas estándar. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. y col., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes que incluyen células neurales, células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos, células de la médula ósea, in vitro y/o in vivo (véanse, por ejemplo, Eglitis y col., (1985) Science 230: 1395-1398; Danos y Mulligan, (1988) PNAS USA 85: 6460-6464; Wilson y col., (1988) PNAS USA 85: 3014-3018; Armentano y col., (1990) PNAS USA 87: 6141-6145; Huber y col., (1991) PNAS USA 88: 8039-8043; Ferry y col., (1991) PNAS USA 88: 8377-8381; Chowdhury y col., (1991) Science 254: 1802-1805; van Beusechem y col., (1992) PNAS USA 89: 7640-7644; Kay y col., (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai y col., (1992) PNAS USA 89: 10892-10895; Hwu y col., (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115; la patente de EE.UU. nº 4.868.116; la patente de EE.UU. nº 4.980.286; la solicitud PCT WO 89/07136; la solicitud PCT documento WO 89/02468; la solicitud PCT WO 89/05345; y la solicitud PCT WO 92/07573).

Además, se ha mostrado que es posible limitar el espectro de infección por retrovirus y por consiguiente de vectores basados en retrovirus modificando las proteínas de encapsidación víricos sobre la superficie de la partícula viral (véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO93/25234, WO94/06920 y WO94/11524). Por ejemplo, las estrategias para la modificación del espectro de infección de vectores retrovíricos incluyen: acoplar anticuerpos específicos para los antígenos de la superficie celular para la proteína viral env (Roux y col., (1989) PNAS USA 86: 9079-9083; Julan y col., (1992) J. Gen Virol 73: 3251-3255; y Goud y col., (1983) Virology 163: 251-254); o acoplar ligandos de la superficie celular a las proteínas víricos env (Neda y col., (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143-14146). El acoplamiento puede estar en forma de la reticulación química con una proteína u otra variedad (por ejemplo, lactosa para convertir la proteína env en una asialoglicoproteína), además de generando adzimas de polipéptidos (por ejemplo, anticuerpo monocatenario/adzimas de polipéptidos env). Esta técnica, a la vez que es útil para limitar o por lo demás dirigir la infección a ciertos tipos de tejido, también puede usarse para convertir un vector ecotrópico en un vector anfotrópico.

Otro sistema de administración de genes víricos útil en la presente invención utiliza vectores derivados de adenovirus. El genoma de un adenovirus pueden manipularse de forma que codifique un producto génico de interés, pero es inactivo en términos de su capacidad para replicar en un ciclo de vida viral lítico normal (véase, por ejemplo, Berkner y col., (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld y col., (1991) Science 252: 431-434; y Rosenfeld y col., (1992) Cell 68: 143-155). Los vectores adenovíricos adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7 etc.) son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Los adenovirus recombinantes pueden ser ventajosos en ciertas circunstancias porque no pueden infectar células no divisorias y puede usarse para infectar una amplia variedad de tipos de células que incluyen epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld y col., (1992) citado anteriormente), células endoteliales (Lemarchand y col., (1992) PNAS USA 89: 6482-6486), hepatocitos (Herz y Gerard, (1993) PNAS USA 90: 2812-2816) y células musculares (Quantin y col., (1992) PNAS USA 89: 2581-2584). Además, la partícula de virus es relativamente estable y susceptible a la purificación y concentración, y como antes, puede modificarse de manera que afecte al espectro de infectividad. Adicionalmente, el ADN adenoviral introducido (y ADN extraño contenido dentro) no se integra en el genoma de una célula huésped sino que queda episomal, evitándose así posibles problemas que puedan producirse como resultado de mutagénesis de inserción en situaciones en las que el ADN introducido llega a integrarse en el genoma del huésped (por ejemplo, ADN retroviral). Además, la capacidad de carga del genoma adenoviral para el ADN extraño es grande (hasta 8 kilobases) con respecto a otros vectores de administración de gen (Berkner y col., anteriormente; Haj-Ahmand y Graham (1986) J. Virol. 57: 267). La mayoría de los vectores adenovíricos defectivos en la replicación actualmente en uso y por tanto favorecidos por la presente invención se delecionan para todos o partes de los genes víricos E1 y E3 pero conservan como mucho el 80% del material genético adenoviral (véase, por ejemplo, Jones y col., (1979) Cell 16: 683; Berkner y col., anteriormente; y Graham y col., en Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pág. 109-127). La expresión del gen quimérico insertado puede estar bajo el control de, por ejemplo, el promotor E1A, el promotor tardío principal (MLP) y secuencias conductoras asociadas, el promotor viral E3 o secuencias promotoras exógenamente añadidas.

Todavía otro sistema de vector viral útil para la administración de genes quiméricos objeto es el virus adenoasociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus defectivo que se produce naturalmente que requiere otro virus tal como un adenovirus o un virus del herpes como virus auxiliar para la replicación eficaz y un ciclo de vida productivo. (Para una revisión véase Muzyczka y col., Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158: 97-129). También es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células no divisorias y presenta una alta frecuencia de integración estable (véase, por ejemplo, Flotte y col., (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356; Samulski y col., (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McLaughlin y col., (1989) J. Virol. 62: 1963-1973). Los vectores que contienen tan sólo 300 pares de bases de AAV puede encapsidarse y pueden integrarse. El espacio para el ADN exógeno está limitado a aproximadamente 4,5 kb. Un vector AAV tal como el descrito en Tratschin y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260 puede usarse para introducir ADN en células. Se ha introducido una variedad de ácidos nucleicos en diferentes tipos de células usando vectores AAV (véanse, por ejemplo, Hermonat y col., (1984) PNAS USA 81: 6466-6470; Tratschin y col., (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Wondisford y col., (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin y col., (1984) J. Virol. 51: 611-619; y Flotte y col., (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790).

Otros sistemas de vectores víricos que pueden tener aplicación en terapia génica se han derivado de virus del herpes, virus de la variolovacuna y varios virus de ARN. En particular, los vectores del virus del herpes pueden proporcionar una única estrategia para la persistencia del gen recombinante en células del sistema nervioso central y tejido ocular (Pepose y col., (1994) Invest Oftalmol Vis Sci 35: 2662-2666).

Además de procedimientos de transferencia viral, tales como aquellos ilustrados anteriormente, también pueden emplearse procedimientos no víricos para producir la expresión de una proteína en el tejido de un animal. La mayoría de los procedimientos no víricos de transferencia de genes se basan en mecanismos normales usados por células de mamífero para la captación y el transporte intracelular de macromoléculas. En realizaciones preferidas, los sistemas de administración de genes no víricos de la presente invención se basan en rutas endocíticas para la captación del gen por la célula elegida como diana. Los sistemas de administración de genes a modo de ejemplo de este tipo incluyen sistemas derivados de liposomas, conjugados de poli-lisina y envueltas víricos artificiales.

En una realización representativa, un gen que codifica un polipéptido que contiene una adzima puede atraparse en liposomas que llevan cargas positivas sobre su superficie (por ejemplo, lipofectinas) y que (opcionalmente) están marcadas con anticuerpos contra antígenos de la superficie celular del tejido diana (Mizuno y col., (1992) No Shinkei Geka 20: 547-551; publicación PCT WO91/06309; patente japonesa 1047381; y publicación de patente europea EP-A-43075). Por ejemplo, la lipofección de células de neuroglioma puede llevarse a cabo usando liposomas marcados con anticuerpos monoclonales contra antígeno asociado a glioma (Mizuno y col., (1992) Neurol. Med. Chir. 32: 873-876).

En otra realización adicional ilustrativa, el sistema de administración de genes comprende un anticuerpo o ligando de la superficie celular que está reticulado con un resto que elige genes como diana tal como poli-lisina (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT WO93/04701, WO92/22635, WO92/20316, WO92/19749 y WO92/06180). Por ejemplo, cualquiera de los constructos de genes objeto puede usarse para transfectar células específicas in vivo usando un vehículo de polinucleótidos soluble que comprende un anticuerpo conjugado a un policatión, por ejemplo poli-lisina (véase la patente de EE.UU. 5.166.320). También se apreciará que la administración eficaz de los constructos de ácido nucleico objeto mediante endocitosis mediada puede mejorarse usando agentes que potencian el escape del gen de las estructuras endosómicas. Por ejemplo, los adenovirus complejos o péptidos fusogénicos del producto génico HA de la gripe pueden usarse como parte del sistema de administración para inducir la alteración eficaz de endosomas que contienen ADN (Mulligan y col., (1993) Science 260-926; Wagner y col., (1992) PNAS USA 89: 7934; y Christiano y col., (1993) PNAS USA 90: 2122).

En la práctica clínica, los sistemas de administración de genes pueden introducirse en un paciente por cualquiera de varios procedimientos, cada uno de los cuales es familiar en la técnica.

Por ejemplo, una preparación farmacéutica del sistema de administración de genes puede introducirse sistémicamente, por ejemplo por inyección intravenosa, y la transducción específica del constructo en las células diana se produce predominantemente a partir de la especificidad de transfección proporcionada por la expresión del vehículo de administración del gen, de tipos de células o de tipos de tejido debido a las secuencias reguladoras de la transcripción que controlan la expresión del gen, o una combinación de los mismos. En otras realizaciones, la administración inicial del gen recombinante está más limitada con la introducción en el animal que está bastante localizado. Por ejemplo, el vehículo de administración de genes puede introducirse por catéter (véase la patente de EE.UU. 5.328.470) o por inyección estereotáctica (por ejemplo Chen y col., (1994) PNAS USA 91: 3054-3057).

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos sólo son para fines ilustrativos y no deben considerarse limitantes en ningún respecto.

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Ejemplo 1 Reticulación química de dominios de dirección y de enzima

En general, una adzima puede crearse en al menos dos formas: (A) por reticulación química y (B) por tecnología de ADN recombinante.

La reticulación puede realizarse usando técnicas muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, en una realización, los extremos N (o lisinas accesibles a la superficie) de un dominio de proteína pueden hacerse reaccionar con SPDP, mientras que los extremos N (o lisinas accesibles a la superficie) del otro dominio de proteína pueden hacerse reaccionar con SMCC. Posteriormente, los dos dominios se dejan reaccionar formándose así puentes disulfuro que unen los do-
minios. Cuando se ligan de la forma anterior, la distancia estimada entre los dos dominios es aproximadamente 14 A.

El glutaraldehído también puede usarse para reticular el extremo N de una proteína con el extremo C de la otra proteína.

Estos procedimientos y similares muy conocidos en la técnica de la reticulación química puede usarse para ligar el dominio de dirección (tal como el Ab scFv mencionado más adelante) con uno catalítico de mesotripsina (tal como una mesotripsina activa, su zimógeno o su mutación estabilizante).

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Ejemplo 2 Un sistema experimental de adzimas modelo

Con el fin de crear una adzima (por ejemplo, una proteína bifuncional) que preserve las funciones de ambos dominios (dominio de dirección y dominio catalítico) y confiera especificidad de diana superior, los solicitantes diseñaron el siguiente sistema experimental de adzimas modelo usando pretrombina como dominio de enzima y un anticuerpo monocatenario específico para el péptido de hemaglutinina del virus de la gripe (HA) [18] como el dominio de dirección. Una adzima tal tiene actividad proteolítica acentuada en sustratos unidos por el dominio de dirección en comparación con la actividad proteolítica del dominio de enzima solo. Aunque la pretrombina se usó en el ejemplo como el dominio catalítico, la mesotripsina (y sus fragmentos funcionales, derivados, variantes, mutaciones estabilizantes, homólogos, etc.) puede usar los mismos dominios de dirección de anticuerpos monocatenarios o similares como se muestra en algunos ejemplos más adelante. Además, los mismos sistemas de vector/huésped y procedimientos de construcción pueden adaptarse fácilmente para uso con adzimas con un dominio catalítico de mesotripsina (o cualquier otro dominio catalítico).

Las adzimas proteolíticas se expresan y se purifican como zimógenos inactivos. Frecuentemente, el zimógeno tiene una secuencia del extremo amino que bloquea el sitio catalítico. La escisión a un sitio de activación específico elimina el péptido de bloqueo y conduce a la activación de proteasas. Para garantizar que la activación no desacopla los dos dominios de la adzima, el dominio de enzima se posiciona preferentemente en el extremo N respecto al dominio de dirección. Los siguientes ejemplos describen la construcción, expresión y purificación (véase más adelante, Figs. 4 y 5) de componentes que incluyen el dominio de dirección solo, el dominio de enzima solo y la ADZIMA que se acopló a los dominios de dirección y de enzima mediante un ligador de polipéptido flexible. Tras una purificación de una etapa parcial, estas proteínas recombinantes se activaron y se probaron para la actividad proteolítica contra sustratos que tanto contenían como carecían de un sitio de unión para el dominio de dirección. La adzima modelo esquemática y los componentes individuales se muestran en la Fig. 4.

En la Figura 4, todos los componentes se ensamblaron en el sistema de vector pSecTag2A (Invitrogen, Carlsbad, CA) que incluía un péptido conductor del extremo N diseñado para permitir la secreción de un sistema de expresión heterólogo y las marcas myc y His_{6} en tándem del extremo C para permitir la inmunodetección y purificación. El dominio de dirección era un anticuerpo monocatenario (scFv\alphaHA) derivado del anticuerpo monoclonal mAb26/9 que reconocía un epítope de hemaglutinina del virus de la gripe (HA) DVPDYA (SEQ ID NO: 13) [18]. El dominio de enzima era pretrombina (residuos 315 a 622 de protrombina humana; nº de registro AAC63054) - un zimógeno de trombina que podría activarse usando el factor Xa. Los dominios de dirección y de enzima se conectaron con un ligador de 15 aminoácidos ([GGGGS]_{3}, SEQ ID NO: 14). Cuando se probaron contra una diana que contenía DVPDYA (SEQ ID NO: 13) y un sitio de escisión de trombina subóptimo (por ejemplo, GGVR, SEQ ID NO: 15), el dominio de trombina en la adzima demuestra escisión acelerada debido a la mayor concentración local de péptido lograda mediante la unión a DVPDYA (SEQ ID NO: 13) por el dominio scFv (el dominio de dirección).

Tanto las fusiones del extremo N como del extremo C de adzimas se crean con una variedad de marcas (myc, His_{6}, V5). Se usan diferentes composiciones y longitudes del ligador. Por ejemplo, pueden crearse los siguientes constructos: trombina-marca-COOH; scFv\alphaHA-marca-COOH; N-trombina-ligador-scFv \alphaHA-marca-COOH; N-scFv\alphaHA-ligador-trombina-marca-COOH; N-scFv\alphaHA-ligador-trombina-ligador-scFv\alphaHA-marca-COOH; o constructos con dos unidades de trombina en tándem junto con scFv anti-HA.

La pretrombina y el anticuerpo monocatenario dirigidos contra el epítope de HA se clonan individualmente en los sitios HindIII y XhoI del vector pSecTag2A de Invitrogen para generar proteínas que se secretarán en el medio para la posterior caracterización bioquímica. La pretrombina es la forma inactiva que se activa por el factor Xa o ecarina. La pretrombina-(G_{4}S)_{3}-scHA y scHA-(G_{4}S)_{3}-pretrombina se ensamblan por solapamiento/PCR recombinante (usando los oligos descritos en la Tabla X a continuación) y se clonan en el vector pSecTag2A como fragmentos de HindIII y XhoI. Contendrán myc y His_{6} como marcas en el extremo C. La barra oblicua muestra dónde se produce la escisión en el péptido señal. La secuencia de aminoácidos para pretrombina-(G_{4}S)_{3} scFv\alphaHA es:

19

La secuencia de aminoácidos para scHA(G_{4}S)_{3} pretrombina como se prepara a partir de pSecTag2 es:

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22

Los sustratos probados incluyen: S1, un epítope de alta afinidad (DVPDYA, SEQ ID NO: 13) reconocido por scFv\alphaHA ligado al sitio diana proteolítico (HAE-PT: NH_{2}-YPYDVPDYA-(SGSGS)_{4}-GGVR-p-nitroanilida, SEQ ID NO: 26); y S2, la diana proteolítica sola (PT: NH_{2}-GGVR-p-nitroanilida, SEQ ID NO: 15). Otros sustratos de péptidos sintéticos también se prepararon con secuencias de sustrato de unión y escisión variables. Los sitios de escisión de trombina se eligieron basándose en las enseñanzas de Backes y col. (2000) Nature Biotechnology 18: 187-193. Las elecciones alternativas incluyen Ile-Thr-Pro-Arg (SEQ ID NO: 27) como el mejor sitio de escisión y Ile-Thr-Leu-Arg (SEQ ID NO: 28) como una diana pobre.

La escisión del enlace peptídico entre el residuo Arg en los sustratos y la p-nitroanilida por la actividad de trombina libera p-nitroanilina libre (pNA) que tiene un color amarillo visible por monitorización espectrofotométrica a 405 nm.

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2.1. Producción de componentes de adzimas modelo: construcción, expresión, purificación y activación

Los componentes se construyeron en el vector pSecTag2A, se expresaron transitoriamente en células de mamífero y se purificaron a partir de medios acondicionados como se describe más adelante.

Brevemente, el vector de expresión de mamífero pSecTag2A (nº de cat. V90020; Invitrogen, Carlsbad, CA) se usó como el esqueleto para todos los constructos. Aguas arriba del poliligador está un péptido señal V-J2-C de la cadena de Ig \kappa murina y aguas abajo están las marcas myc y His_{6}, un codón de terminación TAA y una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. Otros rasgos notables del vector son un promotor de citomegalovirus (CMV) para accionar la expresión de la secuencia codificante insertada y los marcadores de selección zeocina y ampicilina. Los ADNc correspondientes a componentes individuales se generaron por PCR y se clonaron direccionalmente en el poliligador para mantener el marco de lectura usando HindIII en el extremo 5' y XhoI en el extremo 3'. El componente de dirección (scFv\alphaHA) se amplificó a partir de un molde de plásmido que contenía la secuencia codificante de scFv\alphaHA (engeneOS, Waltham, MA); la pretrombina se amplificó a partir del clon de ADNc humano de longitud completa (ResGen; nº de cat. FL1001) y la adzima se creó por PCR de solapamiento diseñada para insertar un ligador de 15 aminoácidos (GGGGS)_{3} (SEQ ID NO: 14) entre el dominio de pretrombina del extremo N y el dominio de dirección del extremo C. Todos los constructos se confirmaron por secuencias.

Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo con 2 x 10^{6} células 293T cultivadas en matraces T175 usando Fugene (Roche, Indianápolis, IN). Los medios acondicionados de 6 matraces que contenían los componentes secretados se recogieron cuando la expresión alcanzó niveles máximos (día 4, 5 ó 7- dependiendo del constructo), se aclararon y se dializaron contra NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM (tampón A) durante la noche a 4ºC con un cambio de tampón. Para la purificación, los sobrenadantes dializados se incubaron durante 16 h a 4ºC con resina Ni-NTA (Qiagen, CA) (0,4 ml de resina o 0,8 ml de suspensión por 200 ml del sobrenadante dializado). La suspensión resultante se centrifugó a 600 g durante 10 min a 4ºC y el sobrenadante se eliminó y se guardó como una muestra de "flujo continuo". Entonces, la resina que contenía proteínas unidas se resuspendió en 10 ml de tampón A, se lavó 3 veces (10 minutos cada vez a 4ºC) y las perlas se cargaron manualmente sobre un jeringa de 3 ml ajustada con papel de filtro Whatman de 3 mm. Se realizaron tres eluciones (0,5-1 ml cada una) con NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 1 M. El material eluido se dializó en solución salina tamponada con fosfato durante la noche para el almacenamiento o en solución salina de Tris tamponada + tampón CaCl_{2} 1 mM para la activación con factor Xa.

Como se muestra en la Figura 5, la adzima modelo pretrombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA se expresó transitoriamente en células 293T y el medio de acondicionamiento se recogió en el día 7. El material se procesó y se purificó como se describe anteriormente. Las muestras que representaban porciones equivalentes de cada fracción se cargaron sobre geles de poliacrilamida al 4-20% y se sometieron a electroforesis en tampón Tris-glicina-SDS (Novex). Panel A. Transferencia de Western tras la electroforesis. El gel se sometió a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa que se tiñeron con un anticuerpo anti-myc (Invitrogen, Carlsbad, CA). Carril (1) Carga; (2) Flujo continuo; (3) Lavado 1; (4) Lavado 3; (5) Elución 1; (6) Elución 2; (7) Elución 3; (8) Resina hervida en el tampón de carga de muestra; (9) Marcador de peso molecular Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Panel B: Gel teñido con plata. Carril (1) Material de partida; (2) Flujo continuo; (3) Lavado 1; (4) Lavado 3; (5) Patrón de peso molecular SeeBlue Plus 2; (6) Elución 1; (7) Elución 2; (8) Elución 3; (9) Resina hervida en el tampón de carga de muestra; (10) Patrón de peso molecular SeeBlue Plus 2.

Un ejemplo de un análisis electroforético de la preparación de adzima modelo se muestra en la Fig. 5. La adzima de longitud completa secretada se detectó con un anticuerpo anti-myc a \sim70 kDa (panel A) como cabía esperar. Basándose en el gel teñido con plata en este análisis (panel B), la pureza estimada de la adzima es aproximadamente el 10-20%. La dirección individual y los componentes de enzimas producidos en paralelo tenían rendimientos y pureza similar a la adzima modelo (datos no mostrados).

Los componentes purificados de adzimas que contenían dominios de enzimas se activaron usando el factor Xa que escinde pretrombina a Arg 320 liberando así una cadena ligera de 49 aminoácidos a partir del extremo N y generando la cadena pesada de trombina activa de 259 aminoácidos. En el ejemplo mostrado en la Fig. 6, el procedimiento de activación por transferencia de Western indicó que la activación usando el factor Xa redujo el peso molecular de la adzima modelo a \sim6 kDa como cabía esperar.

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Específicamente, la pretrombina purificada y los componentes de adzimas se dializaron a 4ºC durante la noche contra Tris 50 mM, pH 8, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} 1 mM, luego se determinaron las concentraciones de proteína. La activación se realizó usando el factor Xa biotinilado (Roche). El solicitante adaptó el protocolo para tener en cuenta la pureza estimada (\sim10%) de la pretrombina que iba a activarse, por tanto, se usó 1 \mug de factor Xa biotinilado por 4,44 \mug de proteína total durante 3 h a temperatura ambiente. Tras la activación, el factor Xa biotinilado se eliminó usando perlas de estreptavidina suministradas con el kit y los componentes activados se analizaron por transferencia de Western y se usaron para estudios bioquímicos (véase más adelante).

Como se muestra en la Figura 6, una preparación de la adzima modelo de los inventores (véase Fig. 5) se analizó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-myc antes de y después de la activación usando el factor Xa: adzima modelo parcialmente purificada dializada en TBS (Carril 1); reacción de activación del factor Xa (Carril 2); reacción de activación tras la eliminación del factor Xa (Carril 3); perlas de estreptavidina usadas para la eliminación (Carril 4); y patrones de peso molecular Cruz (Carril 5, Santa Cruz Biotechnology, CA).

Estos ejemplos demuestran que los solicitantes han desarrollado procedimientos de producción fidedignos para preparar y activar componentes de adzimas recombinantes. Una preparación típica de 2 a 6 matraces T175 dio 2-3 mg de material de proteína recombinante. Estos materiales fueron suficientes para todos los estudios analíticos sobre la función bioquímica descrita más adelante.

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2.2. Caracterización de la actividad de unión y enzimática de adzimas

Para garantizar una comparación significativa del dominio de dirección, dominio de enzima y propiedades de adzimas (véase la Tabla 1), los solicitantes completaron una serie de experimentos de control diseñados para: 1) medir la unión a un epítope diana; 2) comparar las actividades con patrones bien caracterizados y; 3) normalizar la actividad proteolítica contra sustratos de control.

Unión a un epítope diana. Este experimento evaluó las características de unión del dominio de dirección de adzimas. Los solicitantes evaluaron la actividad de unión de diversos componentes usando péptidos biotinilados en una forma de ELISA tipo sándwich. Los componentes purificados se dializaron contra PBS, se capturaron sobre placas recubiertas con anticuerpo anti-myc (mAb 9E10; Sigma), luego se analizaron por ELISA para unirse al péptido diana biotinilado (NH_{2}-YPYDVPDYAGSGDYKAFD, SEQ ID NO: 29) que contenía el epítope de alta afinidad (subrayado). Los péptidos unidos se cuantificaron usando un sistema de detección de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Quantablue; Pierce, Rockford, IL). El dominio de dirección solo y tanto las formas activadas como de zimógeno de la adzima delimitan niveles comparables del péptido por mol. Sin embargo, el dominio de enzima solo dejó de unirse a cantidades medibles del péptido, como cabía esperar.

Actividad trombolítica de adzimas modelo. La caracterización de la actividad proteolítica de la adzima modelo ayuda a determinar si tanto el dominio de dirección como el ligador de polipéptido afectaron sus propiedades enzimáticas.

Los solicitantes compararon las actividades de la adzima modelo con una preparación de trombina comercialmente disponible (Sigma, St Louis, Mo) en derivados de flúor o colorimétricos estándar del tripéptido de trombina sustrato-tosil-gly-pro-arg-(p-nitroanilina, pNA o aminometilcumarina AMC, Sigma). La actividad se monitorizó durante un periodo de tiempo de 5 min en un ensayo fluorimétrico basado en cubeta que midió el fluoróforo liberado AMC (excitación a 383 nm, emisión a 455 nm) en un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin Elmer LS55. Basándose en una curva patrón para la AMC libre, los datos obtenidos en términos de unidades de fluorescencia arbitrarias frente al tiempo se convirtieron en moléculas de sustrato hidrolizadas por unidad de tiempo. Las velocidades de reacción se determinaron durante un intervalo de concentraciones de sustrato (0-50 \muM) y valores de K_{M} para el sustrato de tripéptidos y se determinaron usando una representación de Lineweaver-Burke. A partir de estos estudios se confirmó que la trombina humana comercialmente disponible y la adzima modelo activada tenían valores de K_{M} comparables para este sustrato patrón, 4,2 \muM y 3,9 \muM, respectivamente, que coincidían bien con los valores bibliográficos.

Segundo, los solicitantes determinaron las constantes de especificidad (k_{cat}/K_{M}) de trombina para los sustratos S1 y S2. Ambos sustratos contienen un sitio de escisión de trombina y el sustrato S1 también incluye el epítope de alta afinidad reconocido por el anticuerpo monocatenario anti-HA. Una diferencia significativa en la selectividad de trombina tanto para S1 (HAE-PT) como S2 (PT) requeriría la selección de un sustrato de control alternativo. Los solicitantes midieron la actividad proteolítica de una preparación de trombina humana patrón (Sigma) a dos concentraciones diferentes (0,0033 unidades de NIH/ml y 0,01 unidades de NIH/ml) contra un intervalo de concentración entre 3 \muM y 25 \muM de derivados fluorimétricos de los sustratos S1 y S2. Los solicitantes siguieron el mismo protocolo que se utilizó para determinar valores de K_{M} para el sustrato de tosil-GPR-AMC (véase anteriormente). Los valores para K_{M} y V_{máx} se calcularon a partir de las representaciones de Lineweaver-Burke. La concentración de enzima activa y total (E_{total}) se determinó a partir de la valoración del sitio activo con D-Phe-Pro-Arg-CloroMetilCetona (D-FPR-CMK), un inhibidor de sitio activo irreversible. Estos experimentos proporcionaron los datos para un cálculo de la concentración de enzima absoluta (E_{total}) en 0,0033 unidades de NIH/ml y 0,01 unidades de NIH/ml de actividad proteolítica de trombina Sigma. A partir de estos datos, los solicitantes calcularon k_{cat} = V_{máx}/E_{total}, luego se derivaron las constantes de especificidad k_{cat}/K_{M} para los sustratos como 8,9 \muM^{-1}s^{-1} y 10,3 \muM^{-1}s^{-1} para S1 y S2, respectivamente. El próximo emparejamiento de estos valores indicó que la trombina estaba actuando en cualquier sustrato con especificidad equivalente y actividad proteolítica. Por tanto, el epítope de alta afinidad no tiene efecto sobre la actividad de trombina.

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Normalización de la actividad proteolítica. Los solicitantes necesitaron cuantificar la actividad enzimática de la adzima modelo trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA con referencia a la trombina humana patrón. Como sustrato se usó el tripéptido comercialmente disponible tosil-GPR-pNA (Sigma) que carecía de sitio de unión a HA de alta afinidad. La escisión del enlace peptídico tras las liberaciones del residuo de Arg liberaron la p-nitroanilina (pNA) cromófora que es visible a 405 nm. Los solicitantes determinaron la actividad proteolítica relativa en unidades de actividad de trombina por ml de componentes de adzimas antes de y después de la activación con el factor Xa. El factor Xa no tiene actividad sobre el sustrato comercial. Los datos de un experimento tal se muestran a continuación en la Fig. 7. Esto permitió la normalización basándose en la actividad enzimática de la preparación de adzima y la comparación de actividades equivalentes para adzima y trombina comercial nativa contra el sustrato S1 y S2.

Específicamente, como se muestra en la Figura 7, la actividad proteolítica se determinó en una forma de placa usando cantidades variables de componentes de prueba contra un patrón de enzima comercialmente disponible (alfa trombina humana 3,3 nM, Sigma) monitorizando la liberación de la absorbancia de pNA a 405 nm en un lector de placas Spectramax (Molecular Devices). Basándose en una curva patrón para la p-nitroanilina libre, los datos obtenidos en términos de unidades de absorbancia frente al tiempo se convirtieron en moléculas de sustrato hidrolizadas por molécula de enzima por unidad de tiempo.

Los resultados de este experimento mostraron que esta preparación de adzima modelo trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA: 1) no tenía actividad detectable antes de la activación y; 2) podría normalizarse contra una preparación de trombina patrón -en este caso 5 \mul/ml de la adzima modelo activada eran equivalentes a 3,3 nM (0,1 U de NIH/ml) de trombina. La valoración del sitio activo de muestras activadas con D-FPR-CMK proporcionó la verificación independiente de la normalización. De ahí que la actividad proteolítica para preparaciones de adzimas se normalizara con respecto al patrón de trombina.

En resumen, estos experimentos de control han mostrado que: 1) la unión mediada por el dominio de dirección al epítope de alta afinidad y el enlace de un dominio de enzima no interfirieron con la actividad de unión; 2) la adzima modelo activada trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA tenía un valor de K_{M} comparable a la trombina para un sustrato de trombina estándar; 3) la trombina tenía especificidad equivalente por los sustratos S1 y S2; 4) la activación usando el factor Xa se requirió para obtener actividad proteolítica detectable; y 5) los solicitantes pudieron normalizar las actividades proteolíticas de preparaciones de adzimas con respecto a un patrón de trombina comercial. Esta serie de experimentos de control ha proporcionado la base para probar y comparar la adzima y componentes aislados sobre sustratos que contenían o carecían de un epítope de alta afinidad para el dominio de dirección.

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2.3. Prueba de la función de adzimas

Los solicitantes han diseñado una adzima, trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA, que comprende un dominio de enzima pretrombina ligado por un polipéptido de 15 aminoácidos a un anticuerpo monocatenario al epítope HA como el dominio de dirección. La trombina no se une o escinde el epítope de HA, pero se une a su sitio del sustrato elegido como diana GGVR (SEQ ID NO: 15), tanto en el contexto de S1 como de S2, con la misma afinidad. El componente de trombina activado de la adzima trombina-scFv\alphaHA también se une a GGVR (SEQ ID NO: 15) de S1 con la misma afinidad; sin embargo, el concepto de adzima predice que la trombina acoplada al anticuerpo anti-HA se unirá a sustratos que contienen el epítope de HA con las mayores afinidades típicas de anticuerpos y puede afectar a la velocidad de reacción de la adzima. Se predice que la adzima podría tener una actividad enzimática destacada en comparación con la trombina.

En los experimentos de velocidad de reacción usando los sustratos S1 y S2 con tanto trombina como adzima trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA se predice que: 1) el dominio de dirección solo (A) será inactivo (-) en ambos sustratos; 2) la enzima sola (B) y la adzima (D) tendrían actividad proteolítica equivalente (+) en el sustrato S2, el sitio de escisión de trombina solo; 3) la adzima sería más activa (+++) contra el sustrato S1 (S1 tiene tanto el epítope de alta afinidad como el sitio de escisión de trombina) que contra el sustrato S2 o la enzima sola contra cualquier sustrato (+); y 5) una mezcla estequiométrica (C) del dominio de dirección sin ligar y el dominio de enzima sería equivalente al dominio de enzima solo en ambos sustratos (+) (véase la Tabla 1) y menos que la adzima.

TABLA 1 Adzima modelo trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA y componentes probados contra sustratos de péptidos lineales

23

La actividad de adzima es accionada por el dominio de dirección. Las actividades proteolíticas de la adzima modelo (D) respecto a la trombina sola (B) se compararon para sustratos que bien contenían (sobre S1) o carecían (sobre S2) de un epítope de alta afinidad para el dominio de dirección. Los resultados de este experimento se muestran más adelante en la Fig. 8.

Específicamente, en la Figura 8, la liberación proteolítica de pNA a partir de los sustratos S1 y S2 se siguió monitorizando la absorbancia a 405 nm respecto a un periodo de tiempo de dos minutos en una cubeta de cuarzo. Las reacciones se llevaron a cabo en tampón de ejecución de trombina (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 0,1 M, polietilenglicol 8000 al 0,1%) que contenía concentraciones de enzima activa apareadas (3,3 nM) como se determinó en los experimentos de normalización (véase la Fig. 6). Las reacciones se iniciaron con la adición de sustrato
a 25 \muM.

Las actividades equivalentes de la adzima activada trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA y la trombina comercial activada, como se determina por el sustrato de tosil-GPR-pNA y de ahí normalizado, se probaron contra S1 y S2. Como se muestra en la Figura 8, la velocidad de reacción para tanto la adzima como trombina son la misma sobre el sustrato S2 que contiene sólo el sitio de escisión de trombina como cabía esperar ya que ambas preparaciones de adzimas habían sido normalizadas a trombina. Sin embargo, como se predice, la adzima modelo mostró un aumento de la actividad hacia el sustrato S1 que contenía un epítope de alta afinidad además del sitio de escisión de trombina. Hay un aumento 2X en la velocidad de reacción. La presencia de este epítope de alta afinidad sobre el sustrato no alteró la actividad de la trombina sola. En ausencia de activación, la adzima no mostró actividad proteolítica detectable. Por tanto, la actividad potenciada de la adzima trombina-(GGGGS)_{3}-scFv\alphaHA es accionada por la presencia de un dominio de dirección que dirige la actividad de enzima al sustrato mediante la unión a un epítope de alta
afinidad.

La actividad de adzima potenciada requiere el enlace de los dominios de dirección y de enzima. Para determinar si la actividad de adzima potenciada requiere el enlace del dominio de dirección y de enzima en la misma cadena de polipéptidos (D), o si una mezcla estequiométrica del dominio de dirección y trombina (C) se lleva a cabo igualmente de bien, los solicitantes compararon estas dos actividades proteolíticas sobre el sustrato S1, que contenía un epítope de alta afinidad por el dominio de dirección. Los datos de esta comparación se muestran en la Fig. 9.

Específicamente, en la Figura 9, el dominio de dirección purificado scFv\alphaHA se usó a 3,3 nM (concentración estimada basándose en el ensayo de Bradford y pureza en porcentaje estimada a partir de gel teñido con azul de Coomassie).

Los resultados del experimento muestran claramente que mezclar el dominio de dirección individual y la enzima trombina juntas no produjo la velocidad acelerada de proteolisis observada con la adzima modelo. De manera interesante, los solicitantes observaron que la mezcla era ligeramente menos activa que la trombina. Quizás el dominio de dirección no ligado interfirió ligeramente con el acceso al sitio de proteolisis por trombina. Además, el dominio de dirección solo mostró actividad no detectable. Por tanto, el enlace de los dominios de dirección y de enzima produjeron un beneficio cooperativo en la velocidad proteolítica con respecto a una mezcla estequiométrica de los dominios separados.

Estos estudios han soportado y validado la función de adzimas predicha. El diseño de adzima modelo ha preservado las funciones de los componentes individuales Y ha producido una ventaja cooperativa con respecto a la mezcla estequiométrica. La tecnología puede aplicarse igualmente para producir una adzima específica proteolítica para una proteína diana clínicamente relevante tal como TNF-\alpha o IL-1 usando, por ejemplo, una de las mesotripsinas descritas en el presente documento como dominio catalítico.

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Ejemplo 3 Adzimas que inactivan selectivamente la bioactividad de TNF-\alpha

Este ejemplo describe la construcción y optimización de adzimas que inactivan selectivamente la bioactividad de TNF\alpha. Aunque la mesotripsina no es uno de los dominios catalíticos descritos en este ejemplo, los mismos principios de diseño (espacialmente para ligadores y dominios de dirección), los diversos bioensayos y el mismo vector/sistemas de expresión pueden usarse con una adaptación mínima para las adzimas basadas en mesotripsina.

Para ilustrar, noventa y seis (96) estructuras de adzima para la inactivación catalítica selectiva de TNF\alpha se diseñan y al menos la mitad se construyen usando técnicas de biología molecular estándar. Estas estructuras de adzimas incluyen combinaciones de sólo dos dominios de enzimas catalíticos, tres dominios de dirección y dieciséis ligadores (incluyendo el ligador cero).

Específicamente, las enzimas son: tripsina catiónica y MMP7; las direcciones son: Sp55, Sp55_2.6 y scFv; los ligadores son: ligadores con 0, 10, 20, 30, 40 ó 50 aminoácidos (correspondientes a unidades de repetición de GGGGS), FcIgG1 (mutación de nudo), FcIgG1 (mutación de orificio), FcIgG2 (mutación de nudo), FcIgG2 (mutación de orificio), FcIgG3 (mutación de nudo), FcIgG3 (mutación de orificio), mutación de orificio FcIgG2-(G_{4}S)_{2}, mutación de orificio FcIgG2-(G_{4}S)_{4}, mutación de orificio FcIgG2-(G_{4}S)_{3}, mutación de orificio FcIgG2-(G_{4}S)_{4}. Las mutaciones de nudo y de orificio se refieren a las mutaciones por parejas (S354C:T366'W/Y349C:T366S:L368'A:Y407'V) en dominios CH3 que habían sido identificadas como que daban lugar a anticuerpos biespecíficos predominantemente heterodiméricos (Merchant y col. Nature Biotechnology, 1998, 16, pág. 677-681).

Posteriormente se producen seis de las adzimas, se purifican y se prueban para bioactividad. Una o más de estas adzimas cumplen los criterios esenciales de una adzima útil -preservar la función de los componentes individuales y seguir produciendo una ventaja cooperativa mediante un enlace de polipéptido de los dos dominios-. Específicamente, la(s) adzima(s) inactiva(n) TNF\alpha más eficazmente que tanto la dirección como la enzima sola, o una mezcla estequiométrica de los dominios individuales.

Los solicitantes han construido, expresado y realizado la caracterización inicial de una serie de tres proteasas de adzimas que eligen TNF\alpha como diana que están constituidas por dominio de dirección seleccionado de receptor(es)
soluble(s) de TNF ligado(s) al dominio catalítico de tripsina catiónica humana. Las adzimas producidas se han analizado para cuantificar las actividades de unión y proteolíticas.

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3.1. Diseño de adzimas específicas de TNF\alpha

Tres componentes - la enzima, el ligador y el dominio de dirección -trabajan juntos eficazmente para producir un antagonista catalítico de TNF\alpha. Los dominios de enzimas están preferentemente posicionados en el extremo N en este ejemplo particular, aunque en otros diseños de adzimas el dominio de enzima puede ser el extremo C o incluso interno a la proteína de fusión. El dominio de enzima está codificado aquí como un zimógeno y tiene actividad proteolítica que puede inactivar TNF\alpha. Los dominios de dirección se unirán a TNF\alpha con un alto grado de selectividad y los ligadores producirán acoplamiento funcional de dominios de enzima y dirección para soportar la cooperatividad en la inactivación catalítica de TNF\alpha.

a. Selección de dominios de enzimas Un estudio de la bibliografía y de las bases de datos de dominio público (MEROPS: http://www.merops.sanger.ac.uk) para proteasas que están comercialmente disponibles, expresables como zimógenos y que se espera se escindan e inactiven TNF\alpha [19-24] condujo a la selección de veinte proteasas candidatas que luego se probaron para la inactivación de TNF\alpha usando un ensayo de citotoxicidad de TNF. Específicamente, la activación de TNF de receptor de TNF\alpha funcional TNFR-1 [10, 25] condujo a muerte celular apoptótica que puede cuantificarse en ensayo basado en células [26]. Este ensayo sirvió de base para cribar las 20 proteasas para la inactivación de la bioactividad de TNF\alpha (véase más adelante, Fig. 10, Tabla 2).

Específicamente, en la Figura 10, se usaron fibroblastos de tejido conjuntivo de ratón L929 (nº de catálogo de ATCC CCL-1) para bioensayar la muerte celular inducida por TNF\alpha con el sistema de ensayo de proliferación celular de una disolución acuosa CellTiter 96® de Promega (Madison, WI). Este sistema proporciona un procedimiento de ensayo colorimétrico para determinar el número de células viables. Brevemente, para cada proteasa de prueba, una disolución de TNF\alpha 5 \muM se digirió durante la noche a 37ºC, luego se determinó la bioactividad durante ocho diluciones seriadas de la disolución de digestión. Los datos son valores medios de determinaciones por triplicado a cada dilución de TNF\alpha. Ejemplos de inactivación de TNF\alpha por tripsina y MMP7 se muestran en la figura. Los resultados de estas pruebas en las veinte proteasas se resumen en la Tabla 2.

Más específicamente, se sembraron 10.000 células L929 por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron en DMEM + 10% de SBF durante la noche en un incubador de CO_{2} humidificado. Se añadió actinomicina D a todos los pocillos (concentración final 1 \mug/ml) y se generó una curva de supervivencia de TNF\alpha patrón añadiendo TNF\alpha humano (RDI, Flanders, NJ) para lograr concentraciones finales en los pocillos que oscilaban de 100 pg/ml - 1 \mug/ml. Las muestras de digestión con proteasa de TNF\alpha se diluyeron similarmente y se añadieron a filas paralelas de pocillos. Las determinaciones por triplicado se hicieron para cada dilución de TNF\alpha. Tras una incubación durante la noche en un incubador de CO_{2} humidificado se añadieron 20 \mul de MTS/PES premezclado a cada pocillo y la incubación continuó durante 2 - 4 horas a 37ºC. Las células viables metabólicamente activas redujeron el reactivo de ensayo (MTS/PES incluye un compuesto de tetrazolio) a un producto de formazano que era soluble en medio de cultivo de tejido. La absorbancia se leyó a 490 nm en un lector de placas después de 4 h para determinar el número de células viables. Los detalles completos del protocolo se proporcionaron en el boletín técnico de Promega nº 245.

TABLA 2 Proteasas probadas para la inactivación de TNF\alpha

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El TNF\alpha se digirió con proteasas de prueba en incubaciones durante la noche a 37ºC, luego se analizó para la bioactividad como se describe en la Fig. 10. Doce proteasas no tenían actividad contra TNF\alpha; ocho tenían niveles de actividad variables. Los números en paréntesis reflejan la reducción del logaritmo en la actividad de TNF\alpha calculada al 50% de nivel de supervivencia a partir de curvas de inactivación similares a las mostradas en la Fig. 10.

La curva de supervivencia para el TNF\alpha patrón muestra una reducción considerable en la supervivencia de 100 pg/ml a 10 ng/ml (Fig. 10). En presencia de \sim600 pg/ml de patrón de referencia de TNF\alpha sólo sobrevivieron el 10% de las células. Esto es a diferencia de la supervivencia del 40% y el 70% para la dilución equivalente de TNF\alpha digerido con MMP7 o tripsina, respectivamente. La curva para las diluciones de TNF\alpha digerido con tripsina mostró un desplazamiento consistente hacia la derecha que indica que la bioactividad de TNF\alpha se redujo más de dos logaritmos en comparación con el patrón de referencia de TNF\alpha. Se hicieron estudios similares con todas las enzimas enumeradas en la Tabla 2 que incluyen MMP7 (Fig. 10). La quimotripsina era la proteasa más activa contra TNF\alpha (reducción de 2,74 logaritmos en la bioactividad de TNF\alpha). Sin embargo, también mostró una autodegradación significativa (no mostrada) que puede mejorarse eliminando sitios de autoescisión en la enzima (véase anteriormente). Todas estas enzimas son candidatos para el componente de enzima de adzimas anti-TNF.

b. Selección de los dominios de dirección. Los dominios de dirección se unirán preferentemente a TNF\alpha con alta especificidad, alta afinidad y serán preferentemente resistentes a escisión proteolítica por el dominio catalítico. Los modelos cuantitativos de cómo los dominios de unión cooperan [27] y la experiencia de los inventores con la adzima modelo de trombina (anteriormente) sugirió un intervalo de afinidades de unión adecuadas para adzimas específicas de TNF\alpha. Los dominios de dirección se derivarán de dos fuentes independientes que unen TNF\alpha con valores de K_{afinidad} en el intervalo de nM - el dominio extracelular p55 de TNFR-1 y un anticuerpo monocatenario para TNF\alpha obtenido de Genetastix (San Jose, CA) o generado en casa a partir de tecnologías de expresión estándar.

Los dominios de dirección sp55 se construyeron a partir del ectodominio humano de longitud completa de TNFR-1 y se caracterizó su unión a TNF\alpha. Brevemente, el TNFR-1 humano codificado por el gen CD120A (nº de registro NM_001065; clon IMAGE 4131360, Invitrogen, Carlsbad, CA) se usó como molde para amplificar los residuos 30-211 en el ectodominio de TNFR-1 (nº de registro de proteínas P19438) [28] para construir un sp55 de longitud completa. Los dominios de dirección alternativa que pueden evaluarse pueden incluir subdominios de sTNFR-1 tales como sp55\Delta4 (residuos 22-167) [29] o dominio sp55 2.6 (residuos 41-150) [30]. Estos subdominios son más pequeños que el ectodominio completo y de ahí que puedan tener sensibilidad reducida a la degradación proteolítica. Debido a que una función significativa del dominio de dirección es unir la diana con alta afinidad, la unión de sp55 a TNF\alpha se cuanti-
ficó usando una forma de ELISA indirecto para validar la presencia de un dominio de dirección funcional (Fig. 11).

Brevemente, en la Figura 11, los dominios de dirección se expresaron transitoriamente en células 293T y se capturaron sobre pocillos recubiertos con Ni-NTA. La unión a TNF\alpha se cuantificó usando el sistema S-Tag^{TM} (Novagen, Madison, WI). El sistema S-Tag^{TM} es una marca de proteína y el sistema de detección basado en la interacción del péptido S-Tag de 15 aminoácidos con la S-proteína ribonucleasa que está conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP). Los solicitantes construyeron, expresaron y purificaron una proteína de fusión de TNF\alpha humana que incluía un extremo N S-Tag^{TM}, luego se usó este reactivo (S-TNF) para cuantificar la actividad de unión de los dominios de dirección
sp55 (rayas verticales). La unión del fondo (control) de TNF\alpha que carece de S-tag se muestra en las áreas rayadas.

Más específicamente en la Figura 11, el medio acondicionado, recogido y clarificado por centrifugación se diluyó 1:10 en tampón (fracción V de BSA al 0,5%, Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS, pH 7,4). Las proteínas expresadas se capturaron sobre pocillos recubiertos de Ni-NTA (placas HisSorb, nº de catálogo 35061, Qiagen) durante 1 h a temperatura ambiente con agitación y se lavaron cuatro veces en Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS para eliminar los materiales sin unir. La unión a TNF\alpha se determinó añadiendo 100 \mul de S-TNF (o TNF\alpha de control) a 1 \mug/ml en tampón de ensayo por pocillo, seguido de la incubación durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron 4 veces en Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS, luego se añadió S-proteína HRP (1:2000 en tampón de ensayo a 100 \mul/pocillo, Novagen, Madison, WI) y se incubaron durante 1 h adicionalmente a temperatura ambiente con agitación. Se hizo una etapa de lavado final en Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS 4 veces para eliminar la S-proteína-HRP, luego se añadieron 100 \mul de tetrametilbencidina en sustrato HRP (TMB; Sigma T 4444, St. Louis, MO) por pocillo. Se dejó que el color se revelara durante 5-45 minutos, luego se leyó la absorbancia a 370 nm en un lector de placas Spectromax (Molecular Devices).

La Figura 11 muestra una elevación de tres veces en la unión de S-TNF (rayas verticales) en comparación con unión no específica en muestras de control (control: S-TNF; medio acondicionado de células transfectadas de muestra). Pareció que la unión saturó el 6-12% de medio acondicionado en el ensayo, y las series de dilución mostraron que la unión fuera proporcional a la cantidad de sp55 expresado añadido. El TNF\alpha que carecía de S-Tag no se detectó con S-proteína-HRP (áreas rayadas). Estos resultados mostraron que el dominio de dirección sp55 expresado puede unirse a TNF\alpha.

Como alternativa al uso de sp55 como dominio de dirección, se seleccionará un anticuerpo scFV anti-TNF\alpha de un conjunto de dieciocho que se obtuvieron de Genetastix (San Jose, CA). Estos anticuerpos scFV se identificaron por Genetastix mediante el uso de su tecnología patentada (www.genetastix.com) como que tenían actividad de unión a TNF\alpha. Brevemente, una biblioteca de ADNc de scFv humana se produjo a partir de poliA ARN de bazo humano, ganglios linfáticos y linfocitos de sangre periférica mediante la amplificación de secuencias V_{H} y V_{L} que se ensamblaron en marco con un dominio de activación GAL4 (AD). Los 18 scFvs se identificaron como dominio de unión a ADN TNF\alpha-lexA humano de unión cuando se coexpresaron intracelularmente en levadura. Los vectores de expresión scFvs de Genetastix se obtuvieron en forma de vector de expresión periplásmico bacteriano pET25B (Novagen, Madison, WI). Los procedimientos de ADN recombinante estándar se usaron para subclonar las secuencias codificantes scFv en el vector pSecTag2A. Los constructos se secuenciaron entonces para verificar las estructuras. Estos anticuerpos anti-TNF\alpha scFv se expresan y se purifican como se describe para los componentes de adzimas previos, luego se analizaron para la unión a TNF\alpha. Se usa un ELISA indirecto para TNF\alpha basado en el sistema S-Tag^{TM} (véase anteriormente, Fig. 11) para identificar uno de los 18 scFvs que muestran alta afinidad de unión a TNF\alpha para uso como un dominio de dirección. La selección de un scFv específico se basa en una clasificación de sus concentraciones de unión relativas de las diversas estructuras. Adicionalmente, las determinaciones cuantitativas de afinidades de unión para TNF\alpha pueden incluirse una vez se ha identificado una adzima prototipo.

c. Selección de los ligadores. Una función significativa de un ligador es conectar un dominio catalítico y un dominio de dirección en una proteína de fusión para dar función cooperativa. Las longitudes del ligador pueden investigarse experimentalmente. Los solicitantes encontraron que una repetición triple (o "repetición 3") del pentapéptido flexible GGGGS (SEQ ID NO: 43) permitió un enlace funcional de los dominios de enzima y de dirección. Este ligador puede oscilar en longitud de 23,60 \ring{A} en la conformación de hélice \alpha a 50,72 \ring{A} como una cadena extendida. Las adzimas iniciales se han construido con 0 aminoácidos como ligador (para minimizar la digestión intramolecular, 3 aminoácidos (AAA) y 20 aminoácidos (4 repeticiones de G_{4}S). Las longitudes del ligador adicional pueden incluir 2 repeticiones de G_{4}S (10 aminoácidos), 6 repeticiones de G_{4}S (30 aminoácidos), 8 repeticiones de G_{4}S (40 aminoácidos) y 10 repeticiones de G_{4}S (50 aminoácidos), etc. El efecto de diversas longitudes del ligador (0-60 aminoácidos) sobre una actividad de adzima basada en mesotripsina se demuestra en un ejemplo a continuación.

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d. Estructuras de adzimas Actualmente no hay informes en la bibliografía para la expresión heteróloga de tripsina en células de mamífero. Por tanto, puede ser prudente expresar la forma de zimógeno que podría activarse por enterocinasa. Por tanto, el tripsinógeno se clonó para estar en marco con la secuencia conductora y el extremo N al ligador y el dominio de dirección y en marco con las marcas de myc-His_{6} en tándem en el extremo C.

Secuencia conductora de Igk murina en N-tripsinógeno-0aa-sp55-myc-His 6	tgn-0-sp55
Secuencia conductora de Igk murina en N-tripsinógeno-AAA-sp55-myc-His 6	tgn-3-sp55
Secuencia conductora de Igk murina en N-(G_{4}S)_{4}-tripsinógeno-20aa-sp55-myc-His 6	tgn-20-sp55

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e. Autoproteolisis de la adzima por el dominio catalítico Para aquellas adzimas que emplean una proteasa como dominio catalítico se preferirá generalmente generar una adzima que es resistente a la autoproteolisis que puede afectar la integridad y la actividad del dominio de dirección, el dominio catalítico o el ligador.

Por consiguiente, los posibles dominios de dirección pueden probarse para su susceptibilidad al ataque de proteasas. Si el conjunto de posibles proteasas y dominios de dirección es suficientemente grande, entonces hay probabilidad de que sean combinaciones en las que la proteasa ataca la diana, pero no el dominio de dirección. Por tanto, puede ser ventajoso generar una biblioteca relativamente grande de posibles adzimas y cribar entre estas adzimas candidatas para la combinación óptima de dominio de dirección, ligador y dominio de enzima. Los anticuerpos monocatenarios, debido a su estructura de hoja beta, pueden ser más resistentes por naturaleza a la acción de proteasas. Una vez seleccionado, la disposición del enlace del dominio de dirección y de enzima puede usarse para minimizar la autoproteolisis. Es posible aumentar la rigidez del ligador, limitar los grados de libertad de cada dominio de adzima o aplicar un dominio de ligador que orienta la dirección y la enzima hacia la diana, pero lejos entre sí. Adicionalmente, los dominios de dirección pueden diseñarse basándose en andamiajes de proteína desarrollados tales como aquellos del anticuerpo monocatenario, y tales andamiajes pueden remanipularse en posiciones conservadas vulnerables para eliminar sitios sensibles a proteasas por mutagénesis. Alternativamente o en combinación, los sitios de proteasa dentro de una región de dirección o ligador pueden seleccionarse usando, por ejemplo, técnicas evolutivas de expresión.

Adicionalmente, ciertas enzimas pueden someterse a autolisis dentro del dominio de enzima. Por ejemplo, la tripsina se somete a autolisis en R122. El sitio de autolisis puede mutarse para prevenir la autolisis (por ejemplo, R122H es una mutación en el gen de tripsina humana I que conduce a la inactivación de la ruta de autolisis y, por tanto, la sobreexpresión de tripsina activa que conduce a pancreatitis hereditaria [31]). Los dominios de proteasas pueden expresarse como zimógenos para minimizar el nivel de autoproteolisis y mantener la adzima en una forma inactiva. Las adzimas se activarán inmediatamente antes de la aplicación, o las adzimas podrían guardarse con un inhibidor que bloquea el sitio catalítico que puede eliminarse por dilución para convertir la adzima en activa.

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3.2. Producción de adzimas

Las adzimas recombinantes pueden generarse usando el sistema de vector pSecTag2A o cualquier otro sistema equivalentemente funcional para la expresión transitoria en células de mamífero. Las adzimas pueden purificarse, por ejemplo, a partir de medios acondicionados mediante unión de las marcas de His_{6} a una resina de níquel. Los detalles adicionales de técnicas se describen en la sección de ejemplos 3.1.a., anteriormente. Todos los constructos de adzimas generados en esta sección se han confirmado por secuencias.

a. Construcción de adzimas En este ejemplo particular, el dominio de enzima es un zimógeno de tripsina humana, aunque también se obtienen constructos similares usando MMP7 humano. La tripsina I humana (tripsina catiónica) está codificada por el gen PRSS1 (nº de registro NM_002769). El dominio catalítico y parte del propéptido de tripsinógeno I se amplifican (residuos 16-247) a partir de clones IMAGE 3950350 y 394971 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se clonan en pSecTag2A. Los residuos 18-267 de MMP7 humano (nº de registro BC003635), que codifica el péptido de activación (18-94) y el dominio catalítico (95-267), se amplifican a partir del clon IMAGE 3545760 (Open Biosystems, Huntsville, AL) y se clonan en pSecTag2A (datos no mostrados).

También en este ejemplo particular, el dominio de dirección usado es sp55, aunque también puede usarse otros dominios de dirección tal como el anticuerpo anti-TNF\alpha scFV (ambos seleccionados de un conjunto de 18 posibles candidatos). Todos estos constructos, cuando se completaron, se verifican por secuenciación de ADN.

La secuencia de aminoácidos de tripsinógeno (tgn) es:

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La secuencia de aminoácidos de tripsinógeno-0aa-sp55 (tgn-0-sp55) como se expresa a partir de pSecTag2A es:

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La secuencia de aminoácidos de tripsinógeno-3aa-sp55 (tgn-3-sp55) como se expresa a partir de pSecTag2A es:

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La secuencia de aminoácidos de tripsinógeno-20aa-sp55 (tgn-20-sp55) como se expresa a partir de pSecTag2A:

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Además, sp55 también se clonó en pSecTag de modo similar. La secuencia de aminoácidos de sp55 como se expresa a partir de pSecTag2A es:

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Las adzimas se construyen a partir de los dominios de enzima y de dirección individuales conectados mediante tres ligadores diferentes usando un procedimiento de PCR de solapamiento como se hizo para la adzima de trombina modelo (véanse los ejemplos previos). Los constructos se han verificado por secuenciación de ADN.

b. Expresión de adzimas La expresión transitoria en células 293T se lleva a cabo en matraces T175. La benzamidina, un inhibidor competitivo de moléculas pequeñas de actividad de tripsina con una K_{i} de 18 \muM, se añade a una concentración final de 1 mM para estabilizar el tripsinógeno y la expresión de adzima tripsinógeno. El medio acondicionado se recoge a intervalos de 24 horas o se deja que se acumule hasta 72 h.

Un ejemplo de expresión representativa como se analiza por transferencia de Western con anticuerpo anti-myc se muestra más adelante en la Figura 12. El aumento de la intensidad de la señal anti-myc en el carril 2 demuestra el efecto estabilizante del inhibidor de tripsina de moléculas pequeñas, benzamidina. Las adzimas que contienen 0, 3 y 20 aminoácidos como el ligador se expresan a niveles similares (Carriles 3-5) y también se estabilizan por la presencia de benzamidina. La banda reactiva con myc es del tamaño esperado de aproximadamente 51 kDa. Finalmente, sp55 también se produce en cantidades comparables al tripsinógeno y la expresión no está afectada por la presencia de benzamidina.

En resumen, volúmenes iguales de medio acondicionado después de la acumulación de proteína secretada durante 24 horas pos-transfección se sometieron a electroforesis sobre geles de TGS al 4-20% (Novex), se electrotransfirieron a membrana de nitrocelulosa y se tiñeron con anticuerpo anti-myc.

c. Purificación de adzimas En una realización, la metodología de His_{6}-níquel es el procedimiento preferido de purificación. Este procedimiento es rápido, simple y está disponible en cualquier forma de columna para lotes grandes o en una forma de 96 pocillos para probar en ensayo paralelo. Sin embargo, pueden usarse muchos otros procedimientos alternativos de purificación (véase el Ejemplo 2, sección 2.1). Por ejemplo, una opción sería cromatografía en columna de benzamidina-Sepharose (Pharmacia, NJ), que incorpora un inhibidor de proteasa en la resina. La caracterización estándar de proteínas purificadas incluirá análisis de Western con anticuerpos anti-myc y geles teñidos con plata para evaluar la pureza y la recuperación de las preparaciones de adzimas. Las adzimas producidas pueden analizarse adicionalmente para cuantificar las actividades de unión y proteolíticas.

El siguiente protocolo es simplemente uno de los procedimientos de purificación preferidos para la purificación de adzimas/enzimas.

Brevemente, el medio acondicionado recogido (CM) se ajusta a pH a \sim 2 unidades de pH por encima del pI de la proteína de interés y se filtra a través de un filtro de 0,2 \muM antes de cargarlo sobre una columna Q Sephrarose Fast Flow HiTrap (Amersham Biosciences, parte nº 17-5156-01). La cromatografía de intercambio aniónico puede usarse como una etapa de intercambio de concentración/tampón para eliminar componentes de medios que pueden interferir con la posterior cromatografía de afinidad. La columna se equilibra con Tris 20 mM, NaCl 5 mM, pH (de CM ajustado) + benzamidina 1 mM, cargado a 5 ml/min, y se lava con Tris 20 mM, pH 8,0 + benzamidina 1 mM, seguido de Tris 20 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0 + benzamidina 1 mM.

Las proteínas unidas pueden eluirse con Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0 + benzamidina 1 mM. La columna puede someterse a arrastre con Tris 20 mM, NaCl 1,0 M, pH 8,0 + benzamidina 1 mM para uso posterior.

Las fracciones eluidas pueden reunirse para la columna HisTrap.

Para purificar la proteína marcada con His_{6}, una HisTrap HP Ni Sepharose (Amersham Biosciences, parte nº 17-5247-01) se carga con el eluato de la columna Q a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La columna se equilibra con PBS, pH 7,4 + benzamidina 1 mM antes de la carga. Tras los lavados de rigurosidad creciente (lavado 2: PBS + NaCl 0,5 M, pH 7,4 + benzamidina 1 mM, lavado 3: PBS, NaCl 0,475 M, imidazol 50 mM, pH 7,4 + benzamidina 1 mM), la proteína marcada con His_{6} se eluye con PBS, NaCl 0,25 M, imidazol 500 mM, pH 7,4 + benzamidina 1 mM.

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Escala de columnas determinadas por volumen de medio acondicionado que se procesa. Generalmente puede usarse una columna Q de 15 ml (3 X 5 ml de HiTrap) durante 2,0 l de CM. Para la cromatografía en HisTrap puede usarse una columna de 1-2 ml dependiendo del volumen de CM procesado en la etapa de la columna Q. El rendimiento típico para adzimas purificadas usando este protocolo es aproximadamente 0,8 - 1,2 mg/l de CM.

d. Determinación de proteínas recombinantes. En una realización, las adzimas se construyen con marcas de myc-His_{6} en tándem en el extremo carboxi. Se desarrolla un procedimiento de ELISA para detectar la marca de c-myc para cuantificar proteínas recombinantes unidas a Ni-NTA sobre superficies. Esto ayuda a normalizar la cantidad de adzima usada en cualquier análisis y bioensayo bioquímicos.

El siguiente procedimiento puede usarse para cuantificar proteínas heterólogamente expresadas que contienen las marcas de myc y His_{6} en tándem usando una solución de ELISA tipo sándwich. En resumen, el medio acondicionado diluido que contiene proteínas recombinantes se incuba en pocillos de placas de microvaloración HisSorb recubiertas con Ni-NTA (nº de catálogo 35061 Qiagen, Valencia, CA) y luego se hace reaccionar con anti-myc-HRP (nº de catálogo R951-25, Invitrogen, Carlsbad, CA). Entonces, el material recombinante se detecta por incubación con un sustrato cromogénico. Se estableció una curva patrón en paralelo con el sp55 recombinante purificado (cuantificado independientemente usando un ELISA comercialmente disponible (nº de catálogo QLA98, Oncogene Research Products, Madison, WI) que contiene la marca de myc His_{6} en tándem permitiendo la cuantificación del material capturado. El medio acondicionado de células transfectadas de prueba sirvió de control negativo.

En resumen, el medio acondicionado procedente de las transfecciones se diluyó directamente en tampón de ensayo (fracción V de BSA al 0,5%, Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS, pH 7,4) a un volumen final de 100 \mul/pocillo. Las cantidades conocidas del patrón, sp55, se diluyeron seriadamente de forma similar en tampón de ensayo. La unión de la marca de His_{6} de las proteínas recombinantes a la superficie de Ni-NTA se dejó proceder a temperatura ambiente durante medio hora con agitación lenta. Entonces se añadió anti-myc-HRP a todos los pocillos a una dilución final de 1:1500 de forma que el volumen final en los pocillos fue 150 \mul. La unión se dejó proceder durante dos horas a temperatura ambiente con agitación lenta. Tras la unión de anti-myc a las proteínas capturadas con His_{6}, los pocillos se lavaron 6 veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%) y se transfirieron en seco. Entonces, el sustrato cromogénico TMB (Sigma, catálogo nº T-4444) se añadió a cada uno de los pocillos a un volumen final de 100 \mul. El aumento en la absorbancia a 370 nm se monitorizó por un lector UV/VIS de placas de microvaloración (Molecular Devices SPECTRAmax 384 Plus). Todas las muestras se ensayan por duplicado.

Usando este procedimiento de cuantificación, el rendimiento promedio de adzimas de tripsinógeno se estimó a 1 \mug/ml.

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3.3. Análisis bioquímico de adzimas específicas de TNF\alpha

Esta sección describe procedimientos para cuantificar las actividades de unión y proteolíticas de adzimas preparadas contra TNF\alpha.

a. Unión de adzimas. La funcionalidad del dominio de dirección de adzimas, por ejemplo, unión a TNF\alpha, se cuantifica por el ensayo de unión a TNF\alpha descrito anteriormente y por la capacidad del dominio de dirección para inhibir independientemente la actividad de TNF\alpha en el ensayo de L929 antes de la activación. Las adzimas con el ectodominio de p55 se han probado con p55 recombinante como controles paralelos. Las proteínas de adzimas presentan características de unión específicas (cantidad de TNF unido por mol proteína) y afinidades de unión similares a los dominios de dirección solos.

Alternativamente, el siguiente procedimiento puede usarse para establecer la presencia de un dominio de dirección de TNF\alpha funcional dentro de adzimas recombinantemente expresadas por medio de un ensayo similar a ELISA modificado. En resumen, pocillos de una placa de microvaloración se recubren previamente con TNF\alpha y luego se hacen reaccionar con el medio acondicionado diluido que contiene adzimas candidatas. La detección de adzimas que expresan un dominio de unión a TNF\alpha de alta afinidad funcional (y, por tanto, se retienen sobre la placa de microvaloración tras el lavado de la placa de microvaloración) se efectúa por captura posterior de una enzima cromogénica conjugada que es específica para una marca de detección dentro de los constructos de adzimas y de control, seguido de la adición de un sustrato cromogénico. La inclusión de pocillos de control en los que no se espera que esté presente la captura y la detección de adzimas y la evaluación en paralelo de constructos similares que no codifican la marca de detección o dominio de dirección específico de TNF\alpha proporciona pruebas de que las adzimas expresadas contienen un dominio de dirección específico de TNF\alpha funcional que se une específicamente al TNF\alpha inmovilizado. Normalmente, también pueden incluirse en tampones de ensayo uno o más inhibidores de proteasas reversibles o irreversibles para prevenir la autocatálisis o actividad proteolítica de la adzima restringiendo así la degradación de la adzima y/o reactivos de ensayo.

En un ejemplo ilustrativo se describe un ensayo para las adzimas que contienen tripsinógeno humano específicas para TNF\alpha. Los pocillos de una placa de microvaloración (Nunc-ImmunoModule, MaxiSorp Surface) se recubrieron previamente con 100 \mul/pocillo de TNF\alpha humano recombinante (nº de catálogo de RDI RDI-301X) a una concentración de 1 \mug/ml diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2. Un número igual de pocillos recibió 100 \mul de PBS solo. Entonces, la placa de microvaloración se incubó a 4ºC durante la noche (aproximadamente 16 horas). El líquido de los pocillos se eliminó y la placa de microvaloración se lavó dos veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%). Todos los pocillos de la placa de microvaloración se bloquearon mediante la adición de 200 \mul/pocillo de tampón de bloqueo/diluyente (PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y albúmina de suero bovino al 0,05% [BSA; fracción V, calidad para RIA & ELISA, nº de catálogo de Calbiochem 125593]). La placa de microvaloración se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación lenta. La disolución de bloqueo se eliminó de los pocillos y se añadieron 100 \mul/pocillo de medio acondicionado de transfecciones de adzimas transitorias en células 293T diluidas 1:10 en tampón de bloqueo/diluyente que contenía benzamidina 1 mM (nº de catálogo de Sigma B-6506) a pocillos que contenían TNF\alpha y a pocillos que no contenían TNF\alpha. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación lenta. Tras la eliminación del líquido, los pocillos de la placa de microvaloración se lavaron cuatro veces con tampón de lavado. Entonces, los pocillos recibieron anticuerpo anti-myc conjugado con peroxidasa de rábano picante (anti-myc-HRP; nº de catálogo de Invitrogen 46-0709) diluido 1:2000 en tampón de bloqueo/diluyente que contenía benzamidina 1 mM. La placa de microvaloración se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación lenta. Tras la eliminación del líquido y el lavado como antes, a cada uno de los pocillos se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato (TMB, nº de catálogo Sigma T-4444). El aumento en la absorbancia a 370 nm
se monitorizó por un lector UV/VIS de placas de microvaloración (Molecular Devices SPECTRAmax 384 Plus).

Los resultados mostrados en la Figura 15 son de un experimento representativo y revelan la DO media y la desviación estándar para muestras y controles experimentales evaluados por triplicado sobre una única placa de microvaloración. Como se ilustra, sólo los constructos de adzimas y una proteína de control que puede unirse a TNF\alpha inmovilizado y que también contiene la secuencia de anticuerpos c-myc generan una señal positiva por encima del fondo a 370 nm. Incluido en esta categoría están las adzimas tripsinógeno-p55FL que no contienen ligador (Tgn-0-p55FL), además de aquellas que contienen ligadores de 3 aminoácidos (Tgn-3-p55FL) y 20 aminoácidos (Tgn-20-p55FL). Como cabía esperar, una muestra de control positivo que contiene el constructo p55FL-myc-his (p55L) también se une y produce una señal positiva por encima del fondo. Un constructo que está constituido por tripsinógeno-myc-his no se unió por encima del fondo probablemente debido a una afinidad significativamente menor por TNF\alpha en ausencia de un dominio de dirección de alta afinidad (p55FL). Similarmente, el medio acondicionado a partir de un control por vector de transfección (pSECTAG2A) no mostró una señal positiva por encima del fondo. La unión no específica del fondo del anticuerpo anti-myc a pocillos que contienen o no contienen TNF\alpha era insignificante como se revela por el "control de tampón".

Debe entenderse que, aunque el presente ejemplo ilustrativo detecta la unión a TNF\alpha, esta forma de ensayo es genérica para cualquiera de las moléculas diana. Una ventaja del ensayo aquí descrito es la inclusión de un inhibidor de proteasas reversible en el cultivo celular durante la expresión de las adzimas y en tampones de ensayo para prevenir la autoactivación/rotura proteolítica involuntaria de la adzima y/o activación por proteasas endógenas. Esto puede usarse como una solución general para la expresión de zimógenos y/o proteasas activas. Y, lo que es más importante, uno o más inhibidores de proteasas también pueden incluirse en tampones de ensayo con los objetivos de cuantificación de proteínas y confirmación de especificidad de dianas (como se muestra en este ejemplo). Esta solución general alivia cuestiones respecto a la manipulación de adzimas autocatalíticamente propensas y/o activas.

b. Activación de adzimas. La activación del dominio enzima de adzimas se lleva a cabo incubando a 37ºC según las recomendaciones del fabricante. El progreso puede monitorizarse por SDS-PAGE y transferencia Western (por ejemplo, véase la Fig. 7). Se usó enterocinasa (Novagen, Madison, WI) para la activación de tripsinógeno. Para un ensayo de TNF\alpha in vitro, la enterocinasa no necesita eliminarse pos-activación ya que se ha determinado que la enterocinasa no tiene actividad proteolítica hacia TNF\alpha y no tiene efecto en el bioensayo de L929.

Los solicitantes han desarrollado un procedimiento para llevar a cabo la captura en placa, activación y ensayos proteolíticos para enzimas o adzimas recombinantemente producidas que contienen una marca de His_{6}. En resumen, el medio acondicionado diluido que contiene proteínas recombinantes se incuba en pocillos de placas de microvaloración HisSorb recubiertas con Ni-NTA, luego se tratan con enterocinasa y se presentan con sustratos de péptidos adecuados. El sustrato de péptido usado en el presente ejemplo es tosil-GPR-AMC (nº de catálogo 444228, Sigma, St. Louis, MO) que se ha descrito previamente. La proteolisis del enlace peptídico entre el residuo de Arg en el sustrato y la AMC conduce a la liberación de AMC fluorescente libre (excitación 383 nm, emisión 455 nm). La inclusión de medio acondicionado de sp55 o transfecciones de vectores proporcionan importantes controles negativos para los niveles de expresión de proteasa adventicias en células transfectadas y fondo de sustrato e hidrólisis en condiciones de ensayo.

En resumen, el medio acondicionado que contiene proteínas recombinantes se diluyó directamente en tampón de ensayo (fracción V de BSA al 0,5%, Tween-20 al 0,05% en 1 X PBS pH 7,4) a un volumen final de 100 \mul/pocillo. Normalmente, 5-25% de medio acondicionado por pocillo dio buena respuesta lineal. La unión de la marca de His_{6} de las proteínas recombinantes a la superficie de Ni-NTA se dejó proceder a temperatura ambiente durante dos horas con agitación lenta. Tras la unión de anti-myc a las proteínas capturadas de His_{6}, los pocillos se lavaron 6 veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05% o PBST, 200 \mul por lavado) y se transfirieron en seco. Esta etapa también realiza la eliminación de benzamidina que por lo demás interferiría con etapas posteriores en el ensayo. La activación de zimógeno se logra mediante la adición de 1 U de enterocinasa (EC, nº de catálogo 69066, Novagen, Madison, WI) en un volumen final de 100 ul de PBST. La activación se llevó a cabo durante 1 hora a 37ºC. Un conjunto paralelo de muestras no recibió enterocinasa, pero se sometió a incubación similar. Finalmente, los pocillos se lavaron 6 veces con PBST antes de la adición de tampón de digestión de tripsina (Tris 100 mM, pH 8, CaCl_{2} 5 mM) que contenía tosil-GPR-AMC 10 \muM. La actividad proteolítica siguió monitorizando la fluorescencia a 455 nm tras la exci-
tación a 383 nm usando un espectrofluorímetro de placas de microvaloración Gemini EM (Molecular Devices, CA).

La Figura 13 muestra una instantánea de experimentos representativos en los que la fluorescencia detectada al final de 2 horas de incubación se compara para las diferentes proteínas recombinantes. Hay actividad proteolítica insignificante en ausencia de activación de enterocinasa de tripsinógeno recombinante capturado y adzimas de tripsinógeno (áreas rayadas). En esta forma de ensayo, el medio acondicionado de sp55 y las transfecciones de vectores no contienen cantidades detectables de proteasas que darían lugar a artefactos como se prueba por los niveles de fondo de fluorescencia. Sin embargo, tras el tratamiento de enterocinasa, el tripsinógeno y las adzimas (tgn-0-p55, tgn-20-p55, tgn-3-p55) presentan cantidades significativas de proteolisis como se prueba por los niveles de 4-7 veces superiores de fluorescencia con respecto a los controles de no activación.

Por otra parte, MMP7 se activa con el compuesto organomercúrico acetato p-aminofenilmercúrico (APMA, Calbiochem 164610) y APMA puede eliminarse (y se eliminará) según instrucciones proporcionadas por el proveedor.

c. Ensayo de proteolisis usando sustratos de péptidos sintéticos. La actividad proteolítica del dominio catalítico de adzimas tras la activación se determinó con sustratos de péptidos lineales sintéticos como se describe anteriormente. La actividad proteolítica se determinó en una forma de placa como se describe anteriormente usando cantidades variables de adzimas y sustratos contra un patrón de enzima comercialmente disponible. La escisión del sustrato (tosil-GPR-AMC) se monitorizó por la liberación del fluorógeno AMC. Los datos de un experimento representativo se muestran más adelante en la Figura 14 en el que el medio acondicionado de transfecciones (24 horas pos-transfección) se unió a placas de Ni-NTA, se activó en placa y se ensayó para la actividad proteolítica con una concentración fija (10 \muM) de sustrato (tosil-GPR-AMC).

El ensayo de la actividad proteolítica de MMP7 puede usar un sustrato fluorogénico (dinitrofenil-RPLALWRS; nº de catálogo de Calbiochem 444228).

Los datos de los análisis químicos de adzimas pueden usarse para normalizar la concentración y la actividad proteolítica de preparaciones de adzimas para la evaluación de bioactividad.

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3.4. Ensayo de adzimas para bioactividad

Para determinar la bioactividad y la selectividad de adzimas contra TNF\alpha, se usarán las adzimas para inactivar TNF\alpha y la bioactividad se cuantificará en un bioensayo de muerte de células L929 inducida por TNF\alpha. La selectividad puede determinarse comparando la inactivación de adzimas de TNF\alpha solo y mezclado con albúmina de suero humano (HSA). El receptor de TNF\alpha soluble p55 puede servir de bloqueador estequiométrico de TNF\alpha.

El bioensayo de L929 es un ensayo riguroso para TNF\alpha biológicamente activo. Los ensayos se hacen usando preparaciones de las doce adzimas, más los cuatro dominios de dirección y de enzima individuales por separado y en combinaciones. En cada caso, cantidades normalizadas de adzimas purificadas (como se evalúa anteriormente) se mezclarán con TNF\alpha solo o TNF\alpha más HSA y se incubarán a 37ºC durante 4 h y durante la noche. La digestión durante la noche representa el protocolo estándar. Los resultados preliminares pueden seguirse por estudios de evoluciones de tiempo según se necesite. La actividad residual puede ensayarse por el bioensayo de L929.

Se espera que el dominio de enzima sólo inactive TNF\alpha y desplace la curva de supervivencia a la derecha 2 unidades logarítmicas para el dominio de tripsina (Fig. 10, Tabla 2). A diferencia, se espera que una adzima eficaz efectúe un mayor desplazamiento hacia la derecha y/o lo hace a concentraciones mucho más bajas o más rápidamente (por ejemplo, 4 h a diferencia de durante la noche). Una potenciación de 10 veces en la inactivación de TNF\alpha (un desplazamiento en la curva de inactivación de una unidad de logaritmo hacia la derecha) es una demostración convincente del potencial de las adzimas como antagonistas de proteínas catalíticos. Además, los dominios de dirección solos sólo inactivarán mínimamente (por unión estequiométrica) TNF\alpha, y a las mezclas de los dominios de dirección y de enzima no debe irles mejor que a los dominios de enzimas solos. La bioactividad de todas las adzimas puede clasificarse a concentraciones molares iguales y puede analizarse la selectividad de aquellas que inactivan TNF\alpha.

La selectividad puede demostrarse en un experimento de mezcla (por ejemplo, véase Davis y col., 2003). Las adzimas se usarán para digerir TNF\alpha sólo y TNF\alpha más HSA, y los digestos se analizarán en el bioensayo (véase la Fig. 10). La albúmina de suero humana es la elección más lógica para este experimento de mezcla. Está presente en suero a alta concentración y lo más probable es que represente un reto para la acción selectiva de una adzima específica de TNF\alpha. Las pruebas iniciales de todas las adzimas pueden hacerse usando un exceso molar de 10 veces de HSA respecto a TNF\alpha. Se espera que las adzimas que no son selectivas muestren una bioactividad reducida en presencia del sustrato competente. Sin embargo, las enzimas selectivas deben retener la bioactividad completa en presencia de HSA en exceso. Las adzimas que pasan esta primera prueba pueden compararse adicionalmente repitiendo el análisis en presencia de una mayor concentración de HSA en la mezcla. De nuevo, las adzimas pueden clasificarse según cuánta bioactividad se retiene en presencia de HSA. Varias rondas de competición deben revelar estructuras que son antagonistas catalíticos tanto bioactivos como selectivos de TNF\alpha.

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Ejemplo 4 Uso de modelado cinético para estudiar el sistema de adzimas

La teoría cinética se aplicó a la red de reacciones de una adzima directa, mostrada en la (Ec-2), para desarrollar un modelo matemático de realización de adzimas. Un modelo tal puede usarse para diseñar y optimizar los parámetros de una adzima y para predecir importantes propiedades funcionales de la adzima tal como la cantidad de sustrato que puede inactivar.

En este ejemplo se realizó una simulación de la cantidad total de inactivación de un sustrato por tres fármacos diferentes con el objetivo de comparar la potencia de la adzima con la potencia de sus dominios constituyentes individualmente. Los tres fármacos fueron:

1. Una dirección con k_{on} = 10^{6} M^{-1}s^{-1} y k_{off} = 10^{-3} s^{-1} (K_{D} = 1 nM)

2. Una enzima con k_{on} = 10^{3} M^{-1}s^{-1}, k_{off} = 10^{-3} s^{-1}, y k_{cat} = 1 s^{-1} (K_{M} = 10^{-3} M)

3. Una adzima directa con las propiedades de la dirección y enzima anteriores y [S]_{ef} = 10^{-6} M.

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Las concentraciones iniciales de los fármacos fueron 50 pM y la concentración inicial de sustrato diana fue 5 pM. La cantidad total de sustrato inactivado por cada uno de estos tres fármacos se muestra en la Figura 16.

Específicamente, la Figura 16 ilustra resultados de modelos cinéticos que comparan la realización de una adzima, una dirección y una enzima. Los resultados indican que la adzima inactiva significativamente más sustrato que cualquiera de la dirección o la enzima solas.

Por ejemplo, la enzima es demasiado débil por sí misma para inactivar un sustrato a tales concentraciones bajas (pM). Por consiguiente, la cantidad total de inactivación de sustrato por la enzima no es significativamente diferente de cero. La dirección se une rápidamente e inactiva algún sustrato pero, debido a que la concentración de sustrato es muy inferior a la K_{D} de la dirección, la unión se limita rápidamente por el equilibrio y la dirección sólo puede inactivar aproximadamente 0,25 pM, o el 5%, del sustrato total. La adzima puede unirse rápidamente e inactivar el sustrato como la dirección, pero también puede convertir el complejo adzima-sustrato en producto, eliminando la limitación del equilibrio.

Este ejemplo muestra que la adzima modelo combina funcionalidad de dirección y enzima en una forma sinérgica. Su potencia es significativaente superior a la suma de la dirección y la enzima sola.

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Ejemplo 5 Construcción, expresión y purificación de receptor I de mesotripsina-TNF

Para proporcionar un ejemplo ilustrativo de una adzima de trabajo, un fragmento activo de mesotripsina se ligó mediante una secuencia de ligador corta al fragmento sp55 del receptor I de TNF I para crear una adzima funcional.

La mesotripsina (nº de registro NM_002771 & NP_002762) se expresó con su secuencia conductora nativa y se marcó en su extremo C con las marcas de myc y His_{6}. La secuencia codificante de mesotripsina se clonó en el vector de expresión, pDEST40 (Invitrogen, Carlsbad, CA), de forma que la expresión se accionó por el promotor de CMV. La mesotripsina_(G_{4}S)_{7}_p55_2.6 se ensambló por PCR de solapamiento de forma que un ligador flexible de 35 aminoácidos (Gly_{4}Ser repetido 7 veces) se introdujo entre la mesotripsina del extremo N (residuos 1-247) y el sp55 truncado del extremo C (residuos 41-150) o receptor I de TNF (esta truncación se denomina en lo sucesivo sp55_2.6 y se ha descrito previamente en la solicitud). Finalmente, la secuencia codificante de la adzima también se marcó en el extremo C con las marcas de myc y His6, seguido de un codón de terminación TGA y la señal de poliadenilación BGH. Todos los constructos se confirmaron por secuencias. La mesotripsina se expresa en ambos constructos como un zimógeno
inactivo. El propéptido se elimina por escisión de enterocinasa, conduciendo a la formación de mesotripsina activa.

La secuencia de aminoácidos para el mesotripsinógeno como se prepara a partir de pDEST40 es:

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La secuencia de aminoácidos para mesotripsinógeno_35aa_p55_2.6 como se prepara a partir de pDEST40 es:

32

La barra oblicua ("/") muestra el sitio de escisión de enterocinasa.

Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células 293T (Genhunter, Nashville, TN) usando lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Aproximadamente 1,2 \times 10^{6} células por matraz T175 se transfectaron con 6,6 \mug de ADN como por las instrucciones del fabricante. El día después de la transfección, el medio se complementó con benzamidina (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración final de 1 mM. La benzamidina es un inhibidor de moléculas pequeñas reversible de serina proteasas con Ki micromolar. En particular, la Ki de la benzamidina para la mesotripsina es 0,22 \muM (Szmola y col., Human mesotrypsin is a unique digestive protease specialized for the degradation of trypsin inhibitors. J Biol Chem. 278(49): 48580-9, 2003). La recogida de la adzima del medio acondicionado (CM) de células transitoriamente transfectadas se llevó a cabo cada 48-72 horas durante un total de 6 recogidas por transfección. El CM recogido (normalmente 600 ml) se clarificó por centrifugación y se concentró mediante dispositivos centrífugos Amicon 80 (Millipore, Bedford, MA) y luego se dializó durante la noche a 4ºC contra PBS, pH 7,4, que contenía benzamidina 1 mM con dos cambios de tampón. El CM dializado concentrado se carga sobre una columna quelante HiTrap de 5 ml (Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS con NaCl 1 M y benzamidina 1 mM, luego con 10 volúmenes de columna de PBS con NaCl 1 M, imidazol 20 mM y benzamidina 1 mM. La proteína recombinante se eluyó con 5 volúmenes de columna de PBS con NaCl 1 M, imidazol 0,5 M, benzamidina 1 mM. El eluato de la columna de níquel se dializó durante la noche a 4ºC contra Tris 20 mM, pH 8,0, con benzamidina 1 mM y luego se cargó sobre una columna de intercambio aniónico de 1 ml HiTrap-Q. Entonces, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8,0, con benzamidina 1 mM. La proteína unida se eluyó en un gradiente de 50 ml de NaCl 0-500 mM en Tris 20 mM, pH 8,0, que contenía benzamidina 1 mM.

Para cribar fracciones para la actividad de proteasa, 2 \mul de cada fracción se añadieron a 98 \mul de tampón de digestión de tripsina (Tris 100 mM, pH 8,0, CaCl_{2} 5 mM, Tween-20 al 0,05%) y se activaron con 0,1 \mul de EC (1,7 U/\mul) de Novagen (Madison, WI) durante 1 h a 37ºC. Entonces, el sustrato (tosil-GPR-AMC o t-GPR-AMC) se añadió a una concentración final de 50 \muM y la actividad proteolítica se monitorizó por la generación de fluorescencia de AMC libre (excitación 350 nm, emisión 450 nm) usando un lector de placas Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las fracciones que presentaban alto nivel de actividad proteolítica se cribaron por transferencia de Western con anti-myc y cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (SEC-HPLC) para monitorizar el comportamiento de fases de disolución. Las fracciones con alta actividad proteolítica y comportamiento monomérico en disolución se reunieron y se comprobaron para la unión a TNF por SEC-HPLC.

La valoración de sitios activos se realizó sobre mesotripsina activada y mesotripsina_35aa_p55_2.6 con un sustrato no fluorescente p-guanidinobenzoato de 4-metilumbeliferilo (MUGB). Este compuesto se une al centro activo de serina proteasas y el ataque nucleófilo del residuo de Ser catalítico libera el producto sumamente fluorescente 4-metilumbeliferona (MU, excitación 350 nm, emisión 450 nm). Se determinó que la concentración de mesotripsina era 500 nM y se determinó que la concentración de mesotripsina_35aa_p55_2.6 era 86 nM.

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Ejemplo 6 Comparación de actividades de adzimas (receptor I de mesotripsina-TNF) y enzimas (mesotripsina)

La mesotripsina es una proteasa relativamente débil en comparación con otras isoformas de tripsina. Se ha demostrado que se necesita un exceso molar de mesotripsina para inactivar TNF en el bioensayo de L929 como se muestra en la Figura 18.

Específicamente, en este conjunto de experimentos, el mesotripsinógeno se activó con enterocinasa (EC) a una concentración final de tanto 100 como 500 nM. El TNF de sustrato (diana) se incluyó en las reacciones a una concentración final de 100 nM. Como controles, la concentración idéntica de TNF se incubó en tampón de digestión de tripsina (Tris 100 mM, pH 8,0, CaCl_{2} 5 mM, Tween-20 al 0,05%) con o sin la enterocinasa activante (1,1 U de EC/100 \mul de TNF 100 nM). Todas las reacciones se dejaron proceder durante la noche a 37ºC. Se eliminaron alícuotas para verificar la actividad proteolítica pos-activación usando el sustrato sintético t-GPR-AMC como se describe anteriormente. Las reacciones de digestión de TNF se diluyeron seriadamente y se aplicaron a células L929 en una serie de dilución de 4 puntos simplificada durante la noche. El TNF bioactivo conserva la capacidad para inducir apoptosis en células L929, mientras que el TNF escindido pierde esa actividad. Por tanto, la supervivencia de células L929, como se mide por la formación de un producto de formazano al día siguiente (como se describe previamente), puede usarse para cuantificar la cantidad de bioactividad de TNF restante en cada reacción.

La Figura 18 indicó que, a relaciones equimolares, la mesotripsina sólo logró la inactivación marginal de TNF en disolución. Se requiere un exceso molar de mesotripsina para lograr la inactivación sustancial (más de 1 logaritmo) de TNF.

A diferencia, la siguiente serie de experimentos demostró que la adzima correspondiente presentó especificidad superior a la de la enzima y, por tanto, pudo inactivar TNF a relaciones molares menores a las requeridas por la enzima mesotripsina. La adzima activada también fue más potente que el agente de unión estequiométrico, sp55-2,6, que está presente en la adzima inactivada.

En primer lugar, para generar enzima y adzima activas, la activación de EC se llevó a cabo durante una hora usando tanto mesotripsina diluida a 86 nM como mesotripsina_35aa-p55_2.6 a 86 nM (1,7 U de EC por 100 pl de especie enzimática). Las reacciones de activación de prueba (sin activación de EC) para tanto la enzima como la adzima a concentraciones similares también se realizó como controles. Después de una hora de activación (o activación de prueba), la enzima y la adzima se diluyeron seriadamente 1:2 y 1:4 antes de que el TNF se añadiera a cada reacción a una concentración final de 100 nM. Entonces, la digestión de TNF se dejó proceder durante la noche a 37ºC. Se incubaron cantidades idénticas de TNF (100 nM) en ausencia de enzima y adzima con o sin EC para servir de controles negativos para las reacciones de enzima y adzima. Las actividades proteolíticas de todas las reacciones hacia el sustrato sintético t-GPR-AMC se monitorizaron al principio y al final de la digestión de TNF. Durante la noche, las reacciones de digestión de TNF se diluyeron y se aplicaron a células L929. Las digestiones también se sometieron a análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-TNF (Abcam, UK) y un anticuerpo anti-tripsina (Abcam, UK).

La Figura 19 muestra actividades proteolíticas en gran parte bien normalizadas de enzima y adzima hacia el péptido sintético t-GPR-AMC (que se ajusta en el sitio activo de la proteasa). Esto demostró que las propiedades catalíticas inherentes de mesotripsina se preservan en el contexto de la adzima mesotripsina_35aa_p55 ya que la enzima y la adzima tienen actividades muy similares. A las tres concentraciones experimentales de adzima/enzima probadas, la enzima y la adzima tienen actividades muy normalizadas. Las reacciones de activación de prueba no mostraron actividad proteolítica ni para la enzima ni la adzima (datos no mostrados).

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La adzima es más selectiva que la enzima

En comparación con concentración idéntica de enzima (mesotripsina), la adzima (meso_35aa_p55_2.6) logra una inactivación de más 1 logaritmo (superior a 10 veces) de la bioactividad de la proteína diana TNF a las 3 concentraciones probadas (compárense los símbolos abiertos con los símbolos sólidos correspondientes en la Figura 20). A diferencia, a estas concentraciones, la enzima mesotripsina es tanto inactiva como marginalmente activa hacia TNF. Esta diferencia en la actividad entre adzima y enzima no es debida a las diferencias inherentes en las actividades proteolíticas como ya se ha demostrado en la Figura 19. Aunque no se desea quedar ligado a ninguna teoría particular, es probable que la adzima pueda unirse preferencialmente a TNF en virtud de su dominio de dirección, sp55_2.6, por tanto, llevando el enlace TNF en estrecha proximidad al dominio catalítico de mesotripsina y permitiendo que la proteolisis avance eficazmente. La proteolisis por mesotripsina solo es ineficaz a estas condiciones experimentales (la concentración de TNF es inferior a K_{M}). El TNF incubado durante la noche con EC sirve de control experimental para la bioactividad de TNF bajo las condiciones experimentales de los inventores.

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La adzima es más potente que el agente de unión estequiométrico

Es posible que la pérdida en la bioactividad en la reacciones adzima-TNF provenga de la neutralización de TNF en vez de la proteolítica escisión de TNF. Sin embargo, esto es poco probable ya que los inventores han establecido previamente que se requiere un exceso de 3 logaritmos (1000 veces) de agente de unión estequiométrico para neutralizar la bioactividad de TNF.

Para excluir concluyentemente la neutralización de TNF, los inventores examinaron la bioactividad de TNF en reacciones de adzimas inactivadas. Como se describe anteriormente, la adzima inactivada actúa en gran parte de agente de unión estequiométrico en virtud de la presencia de su dominio sp55. Como se muestra en la Figura 21, en ausencia de activación de EC, el TNF incubado con adzima queda completamente bioactivo como se observa en la superposición completa próxima de las dos curvas que representan adzimas inactivadas (símbolos cerrados) con la de control negativo (TNF incubado con EC solo, "TNF+EC" en la Figura 21). Mientras tanto, ambas concentraciones de adzimas activadas (símbolos abiertos) son muy eficaces en la destrucción de la bioactividad de TNF. Por tanto, la pérdida de bioactividad de TNF en las reacciones de adzimas activadas proviene de la escisión proteolítica de TNF por la adzima, no de unión estequiométrica pura de adzima a TNF.

La Figura 22 es una imagen de transferencia de Western usando anticuerpo anti-TNF que muestra la escisión de TNF por diferentes concentraciones de adzimas activadas después de incubación durante la noche, pero no por enzima (mesotripsina) a un grado apreciable.

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Ejemplo 7 Construcción de adzimas adicionales basadas en mesotripsina

Más adelante se describen varias adzimas adicionales basadas en mesotripsina. Aunque en este ejemplo tienen que usarse combinaciones de mesotripsina-ligador-dominio de dirección específicas debe entenderse que, en ausencia de asuntos obvios, todas las versiones de mesotripsina pueden combinarse libremente con cualquier otro ligador y cualquier otro dominio de dirección de la invención. Por tanto, los siguientes ejemplos específicos son simplemente sólo para fin ilustrativo y ni mucho menos limitantes en ningún respecto.

La mesotripsina_sc7 comprende un dominio catalítico de mesotripsina ligado (mediante un ligador) a un anticuerpo monoclonal de ratón monocatenario modificado como dominio de dirección. Se ensambló mediante PCR de solapamiento de forma que un ligador flexible de 35 aminoácidos (siete repeticiones de la secuencia Gly4Ser), seguido de la secuencia de aminoácidos PGSTGD (SEQ ID NO: 47) se introdujeron entre la mesotripsina del extremo N (residuos 1- 247) y la secuencia codificante de la monocadena se amplificó a partir del ARNm del hibridoma de anticuerpo monoclonal de ratón (6402-3). En sus diversas formas, la secuencia codificante de esta adzima también puede contener marcas de His6, lumio y myc en tándem del extremo C; o marcas de myc-His6; o marca de His6 sola. Las marcas van seguidas de un codón de terminación TGA y la señal de poliadenilación BGH.

Todos los constructos se confirmaron por secuencias y la alteración de las marcas no pareció afectar la función de adzimas (datos no mostrados). El dominio catalítico de mesotripsina se expresó como un zimógeno inactivo. El propéptido puede escindirse por enterocinasa conduciendo a la formación de mesotripsina activa. En las siguientes secuencias, "/" muestra el sitio de escisión de enterocinasa. El péptido señal se muestra subrayado.

La secuencia de aminoácidos para mesotripsina_sc7 (pCT0138) como se prepara a partir de pDEST40 es:

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La secuencia de aminoácidos para mesotripsina_sc7 (pCT216) como se prepara a partir de pDEST40 es

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La secuencia de aminoácidos para meso0sc7 (pCT298) como se prepara a partir de pDEST40 es

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La secuencia de aminoácidos para meso30sc7 (pCT299) como se prepara a partir de pDEST40 es

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La secuencia de aminoácidos para meso60sc7 (pCT292) como se prepara a partir de pDEST40 es

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Activación de adzimas

En general, los zimógenos se diluyeron a 1-2 \muM antes de la activación. En un protocolo, aproximadamente 1000 pmoles de zimógeno se activan con 0,02 U de enterocinasa porcina (EC, Sigma) durante 2 horas a 37ºC, seguido de valoración de sitios activos para determinar la cantidad de especies enzimáticas activadas. Entonces, éstos se diluyeron en reacciones que contenían TNF (100 nM) en las condiciones especificadas.

El mesotripsinógeno y meso_Sc7 (pCT138) se activaron en condiciones idénticas. Tras la valoración de sitios activos, la enzima y la adzima se diluyeron a 10 nM en reacciones que contenían TNF 100 nM (enzima/sustrato: \sim1:10). Las reacciones similares se ajustaron con enzima inactivada y meso_Sc7. Las cantidades idénticas de TNF (100 nM) se incubaron con y sin EC para servir de controles para las reacciones de enzima y adzima. Un control adicional era mesotripsina activada coincubada con una cantidad equivalente de Sc7 y TNF 100 nM. La digestión se dejó proceder durante la noche a 37ºC. Las alícuotas de las reacciones al principio y al final de la digestión de TNF se analizaron con sustratos de péptidos sintéticos como se describe previamente (datos no mostrados).

La bioactividad de TNF después de las digestiones durante la noche se ensayó usando la viabilidad de células L929 (como se describe previamente) y los datos se muestran en la Figura 23.

La Figura 23 muestra que Meso_Sc7 es una adzima potente lográndose la inactivación de TNF durante 2 logaritmos cuando se incubó con TNF a la relación subestequiométrica 1:10 (línea discontinua). Coherente con las observaciones previas, la mesotripsina no puede inactivar TNF a relaciones subestequiométricas (línea continua). El dominio de enzima y el dominio de dirección necesitan estar presentes como una fusión de cotraducción ya que la mezcla de los dos componentes juntos no conduce a la inactivación de TNF (símbolos cuadrados). La falta de actividad de la enzima y la mezcla equimolar de la enzima y el dominio de dirección monocatenario es evidente de la superposición de las curvas de bioensayo con aquellas de TNF solo (símbolos circulares). La EC, la proteasa usada para activar TNF, no afecta la bioactividad de TNF bajo las condiciones de reacción de los inventores (triángulos).

La Figura 24 ilustra el requisito de la activación de EC para Meso_Sc7 para presentar el comportamiento de adzima, es decir, inactivación de TNF a la relación subestequiométrica de 1:10. La pérdida de TNF bioactiva observada en la Figura 23 no puede provenir de la neutralización de TNF por el dominio de dirección solo ya que ni la adzima inactivada ni Sc7 solo tienen ningún efecto sobre TNF.

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Ejemplo 8 Efecto de la longitud del ligador sobre las actividades de adzimas basadas en mesotripsina

Para probar el efecto de variar la longitud de las secuencias de ligador sobre la actividad de estas adzimas basadas en mesotripsina se prepararon cuatro constructos de adzimas con longitudes del ligador variables de 0 aminoácidos (sin ligador) a 60 aminoácidos, y sus actividades se midieron en el ensayo de inactivación de TNF descrito anteriormente.

Específicamente, la longitud del ligador se varió de 0 aminoácidos (es decir, una fusión directa de mesotripsina con la secuencia Sc7) a 60 aminoácidos usando el dipéptido GS como repetición. pCT298, pCT299, pCT216 y pCT292 se activaron bajo condiciones estándar y se incubaron con TNF 100 nM a una relación 1:10 durante la noche. Como se muestra en la Fig 25, las cuatro adzimas (incluyendo meso_Sc7 o pCT216 mostradas aquí en símbolos cuadrados) demuestran una inactivación de 2 logaritmos de TNF bajo estas condiciones.

Este ejemplo indica que en adzimas basadas en mesotripsina, la longitud del ligador no parece ser crítica para la función de adzimas. Las adzimas con dominios catalíticos y de dirección idénticos, pero una amplia variación de longitudes del ligador (de sin ligador a ligador de 60 residuos) poseen sustancialmente la misma actividad de adzima como se mide en el ensayo de inactivación de TNF.

Por tanto, en una realización, la adzima basada en mesotripsina tiene un dominio catalítico directamente ligado a un dominio de dirección sin ligador.

En otra realización, la adzima basada en mesotripsina tiene una secuencia de ligador que liga el dominio catalítico y el dominio de dirección, en el que el ligador tiene al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 o más aminoácidos.

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Ejemplo 9 Estabilización de adzimas

La estabilidad de adzimas puede comprometerse parcialmente debido a la autoproteolisis, especialmente cuando el dominio catalítico es una proteasa. Por tanto, se espera que la eliminación de uno o más de los posibles sitios autoproteolíticos, especialmente aquellos sitios que no parecen ser esenciales para la función catalítica del dominio catalítico, mejore sustancialmente la estabilidad global de la adzima, mientras que conserva sustancialmente la actividad catalítica deseada. En ciertas circunstancias puede ser deseable una relación entre actividad catalítica y estabilidad global. Esta solución no sólo se aplica a la adzima que comprende tal versión estabilizada del dominio catalítico, sino que también quedan solas enzimas que comprenden el mismo dominio catalítico.

El siguiente ejemplo demuestra el concepto de mejorar la estabilidad de adzimas/enzimas en general. La mesotripsina se usó como un ejemplo tal.

Una forma para identificar sitios potencialmente autoproteolíticos es analizar productos de degradación autoproteolítica. Los inventores realizaron análisis del extremo N de productos de degradación de adzimas basadas en mesotripsina tras su activación. Esto condujo a la identificación de Lys193 como un sitio vulnerable importante en el dominio catalítico de mesotripsina. Se espera que la sustitución del residuo de Lys por un residuo de no Lys y no Arg tal como alanina elimine la posibilidad de autoproteolisis. Ala se probó como un ejemplo. El ensayo empírico puede usarse para otras sustituciones para determinar si el mutante resultante estaba todavía proteolíticamente activo.

Además, los inventores compararon las secuencias de aminoácidos de mesotripsina y tripsina catiónica para identificar residuos de Lys o Arg no conservados en mesotripsina. Los inventores identificaron Lys 98 y Lys 159 en mesotripsina, que estaban ambos sustituidos por Gln en tripsina catiónica. Se esperó que estas dos mutaciones en mesotripsina fueran toleradas (sin interferir con la función catalítica). La Arg 122 conservada también puede ser un posible sitio de autoproteolisis.

Para probar el efecto de eliminar estos residuos potencialmente desestabilizantes, K98Q, R122H, K159Q y K193A se introdujeron por mutagénesis por PCR en el dominio de mesotripsina de la adzima meso_Sc7 (pCT216). Adicionalmente, la mutagénesis se hizo para convertir las marcas his-lumio-myc en tándem en una única marca de His6.

La secuencia de aminoácidos de esta versión estabilizada de meso_Sc7 es:

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La Figura 26 muestra la secuencia codificante de mesotripsina con las mutaciones estabilizantes. La actividad de esta versión estabilizada de meso_Sc7 se comparó con la adzima original Adyme pCT138 mediante activación durante la noche bajo condiciones idénticas. Basándose en la masa de partida, las adzimas se diluyeron a 1:25 con respecto a TNF 100 nM y la proteolisis de TNF se dejó proceder durante la noche.

Como se muestra en la Figura 27, la adzima estable (línea continua) presentó propiedades significativamente superiores como se muestra por la inactivación superior a 2 logaritmos de TNF. Bajo estas condiciones, pCT138 (triángulos rellenos) era considerablemente menos potente, probablemente debido a que la autoproteolisis había conducido a una pérdida significativa de actividad que condujo a proteolisis insuficiente de TNF.

La adzima estable también se evaluó realizando valoración de sitios activos durante un periodo de 10 días. Los resultados se mostraron a continuación:

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Bibliografía citada

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Equivalentes

Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar usando simplemente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Tales equivalentes pretenden estar englobados por las siguientes reivindicaciones.

Claims (33)

1. Una proteína de fusión que comprende:

(a)

un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la proteolisis de un sustrato diana; y

(b)

un resto que elige diana que se une al sustrato diana.

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2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión es una proteína de fusión de cotraducción codificada por un ácido nucleico recombinante.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana está directamente ligado al dominio catalítico de mesotripsina sin ligador.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana está ligado al dominio catalítico de mesotripsina por un péptido sin estructurar.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que el péptido sin estructurar comprende una pluralidad de aminoácidos de glicina y serina y tiene una longitud de entre 15 y 50 aminoácidos.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en la que el péptido sin estructurar comprende una o más repeticiones de ligador de polipéptido flexible Ser_{4}Gly o SerGly_{4} o GlySer_{4} o Gly_{4}Ser.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio catalítico de mesotripsina está posicionado en el extremo N respecto al resto que elige diana.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio catalítico de mesotripsina comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 85% idéntica a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de mesotripsina humano.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 8, en la que el dominio catalítico de mesotripsina comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45.

10. La proteína de fusión de la reivindicación 8, en la que el dominio catalítico de mesotripsina comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la SEQ ID NO: 45 sólo en uno o más cambios de aminoácidos conservativos.

11. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana comprende un anticuerpo o un sitio de unión a antígeno del mismo.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana se selecciona del grupo que está constituido por un anticuerpo monoclonal, un Fab y F(ab)_{2}, un scFv, un diacuerpo, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera.

13. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana comprende un andamiaje similar a inmunoglobulina.

14. La proteína de fusión de la reivindicación 13, en la que el andamiaje similar a inmunoglobulina es un andamiaje FN3.

15. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto que elige diana comprende un andamiaje seleccionado del grupo que está constituido por: anticalinas, Affibodies, knottinas, tendamistat, GST P1-1/A1-1, lectinas, transferrina, tetranectinas y proteínas de unión triméricas.

16. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión es resistente a proteolisis autocatalizada.

17. La proteína de fusión de la reivindicación 16, en la que la proteína de fusión es resistente a proteolisis autocatalizada a una concentración que es aproximadamente igual a la concentración de la proteína de fusión en una disolución que va a administrarse a un sujeto.

18. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicho sustrato es un ligando de receptor, y dicho resto que elige diana incluye un dominio de unión a ligando de un receptor afín de dicho ligando.

19. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicho sustrato es una hormona de polipéptido, un factor de crecimiento y/o una citocina.

20. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio catalítico de mesotripsina se deriva de una mesotripsina estabilizada, dicha mesotripsina estabilizada comprende uno o más cambios de secuencias de aminoácidos en sitios potencialmente autoproteolíticos, en la que dicho cambios no disminuyen la actividad catalítica de dicha mesotripsina.

21. La proteína de fusión de la reivindicación 20, en la que dichos sitios potencialmente autoproteolíticos comprenden Arg o Lys.

22. La proteína de fusión de la reivindicación 21, en la que dichos sitios potencialmente autoproteolíticos comprenden uno o más de: K98, R122, K159 y K193.

23. La proteína de fusión de la reivindicación 22, en la que dichos cambios comprenden uno o más de: K98Q, R122H, K159Q y K193A.

24. La proteína de fusión de la reivindicación 20, en la que la actividad aparente de la mesotripsina estabilizada es al menos aproximadamente 3 veces superior a la de la mesotripsina natural.

25. La proteína de fusión de la reivindicación 20 que conserva sustancialmente la misma actividad durante un periodo de al menos aproximadamente 2 días, preferentemente aproximadamente 3, 4, 5, 6, 10 o más días.

26. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el resto que elige diana se basa en un andamiaje FN3.

27. Una proteína de fusión para inhibir la actividad de un polipéptido sustrato, siendo la proteína de fusión una fusión de complejo de inmunoglobulina que comprende: una primera proteína de fusión unida a una segunda proteína de fusión, en la que la primera proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio catalítico de mesotripsina que cataliza la escisión proteolítica de al menos un enlace peptídico del polipéptido sustrato, y en la que la segunda proteína de fusión comprende una porción constante de una cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio que elige diana que se une a un sitio de dirección sobre dicho polipéptido sustrato, en la que dicho dominio que elige diana y dicho dominio de proteasa son discretos y heterólogos entre sí.

28. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

29. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 28.

30. Una célula huésped que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, el polinucleótido de la reivindicación 28 o el vector de la reivindicación 29.

31. Una preparación farmacéutica que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 y un vehículo farmacéuticamente eficaz.

32. La preparación farmacéutica de la reivindicación 31 formulada de forma que se inhibe la proteolisis autocatalítica de la proteína de fusión.

33. La preparación farmacéutica de la reivindicación 32 que comprende además un inhibidor reversible de dicho dominio de proteasa.