ES2338220T3 - Endoglucanasa egviii y acidos nucleicos que la codifican. - Google Patents

Abstract

Polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido EGVIII que tiene la actividad biológica de una endoglucanasa, que tiene por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2 o en la SEQ ID NO: 2 en toda la longitud de la secuencia de la Figura 2 o SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 4, o su complemento; y (c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida, bajo condiciones de alta estringencia a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 4, o el complemento o un fragmento de la misma, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una endoglucanasa.

Description

Endoglucanasa EGVIII y ácidos nucleicos que la codifican.

La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico egl8 aisladas que codifican polipéptidos con actividad endoglucanasa. La invención también se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden secuencias de ácido nucleico, así como procedimientos para la producción de polipéptidos EGVIII recombinantes.

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Antecedentes de la invención

La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes producidos mediante fotosíntesis. Pueden degradarse y utilizarse como fuente de energía por parte de numerosos microorganismos, incluidos bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrólisis de los sustratos poliméricos de azúcares monoméricas (Aro et al, 2001). Como los límites de los recursos no renovables se acercan, el potencial de la celulosa para convertirse en un importante recurso de energía renovable es enorme (Krishna et al, 2001). La utilización eficaz de la celulosa a través de procesos biológicos, es un camino para superar la escasez de alimentos, forrajes y combustibles (Ohmiya et al, 1997).

Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1, 4-glucano y beta-D glucosídicos), resultando en la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Las celulasas han sido tradicionalmente divididas en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta]-D-glucósido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles et al., 1987; Shulein, 1988). Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas también son capaces de degradar la celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila, 1995). Así, la presencia de un celobiohidrolasa en un sistema de celulasa es necesaria para la solubilización eficiente de la celulosa cristalina (Suumakki, et al. 2000). La beta-glucosidasa actúa para liberar a unidades de D-glucosa a partir de celobiosa, celooligosacáridos, y otros glucósidos (Freer, 1993).

Las celulasas se sabe que son producidas por un gran número de bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasas completo capaces de degradar las formas cristalinas de la celulosa, de manera que las celulasas se producen fácilmente en grandes cantidades a través de la fermentación. Los hongos filamentosos desempeñan un papel especial, ya que muchas de levadura, como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar la celulosa. Ver, por ejemplo, Aro et al. 2001; Aubert et al. 1988; Wood et al, 1988, y Coughlan, et al.

Las clasificaciones de la celulasa fúngica de CBH, EG y BG pueden ampliarse para incluir múltiples componentes dentro de cada clasificación. Por ejemplo, CBHs múltiple, EGs y BGs han sido aisladas de una variedad de fuentes fúngicas incluyendo Trichoderma reesei que contiene genes conocidos para 2 CBHS, es decir, CBH I y CBH II, por lo menos 5 EGs, es decir, EG I, por ejemplo II, EG III, EGIV y EGV, y al menos 2 BGs, es decir, BG1 y BG2.

Con el fin de convertir eficientemente la celulosa en glucosa cristalina es necesario el sistema celulasa completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrólisis de la celulosa cristalina (Filho et al, 1996). Se ha observado una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa de distintas clasificaciones. En particular, las celulasas tipo EG y las celulasas tipo CBH interactúan de manera sinérgica para degradar más eficientemente la celulosa. Ver, por ejemplo, Wood, 1985.

Las celulasas se conocen en la técnica por ser útiles en el tratamiento de textiles con el fin de mejorar la capacidad de limpieza de las composiciones de detergente, por su uso como un agente suavizante, por mejorar el tacto y la apariencia de los tejidos de algodón y similares (Kumar et al, 1997).

Se han descrito composiciones de celulasa que contienen detergentes de limpieza con un rendimiento mejorado (patente US 4.435.307; solicitudes GB 2.095.275 y 2.094.826) y por su uso en el tratamiento de la tela para mejorar el tacto y la apariencia de la industria textil (patentes US 5.648.263, 5.691.178, Y 5.776.757; solicitud GB 1.358.599; The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, vol. 24, pp. 54-61, 1986).

Por lo tanto, las celulasas producidas en hongos y bacterias han recibido una atención considerable. En particular, la fermentación de la Trichoderma spp. (por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma reesei) se ha demostrado que produce un sistema completo de celulasas capaces de degradar formas cristalinas de la celulosa. La patente US 5.475.101 describe la purificación y la clonación molecular de una enzima especialmente útil designada como EGIII que se deriva de la Trichoderma longibrachiatum.

Aunque composiciones de celulasa han sido descritas anteriormente, sigue habiendo una necesidad de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa para su uso en detergentes domésticos, composiciones de lavado a la piedra o detergentes para ropa, etc. Las celulasas que muestran resistencia a los agentes tensioactivos (por ejemplo, sulfonatos de alquilo lineales, LAS), un mejor rendimiento bajo condiciones de estrés térmico, el aumento o disminución de la capacidad celulolíticas, y/o de alto nivel de expresión in vitro, son de particular interés.

Descripción de la invención

La invención se refiere a una proteína celulasa aislada, identificada aquí como EGVIII, y ácidos nucleicos que codifican EGVIII. Los polipéptidos o las proteínas EGVIII aquí descritas pueden incluir una secuencia que tenga al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más de identidad de secuencia a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 2. En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un polipéptido EGVIII aislado con la actividad biológica de una endoglucanasa, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos el 85%, al menos el 90%, al menos 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2 o SEQ ID NO: 2 en toda la longitud de la Figura 2 o secuencia SEQ ID NO: 2, y (b) un fragmento biológicamente activo sustancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2.

También se describen: (i) fragmentos de EGVIII, preferiblemente al menos acerca de 20-100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de unos 100-200 aminoácidos de longitud, y (ii) una composición farmacéutica que comprende EGVIII. El fragmento puede corresponder al dominio N-terminal de EGVIII o al dominio C-terminal de EGVIII.

En otro aspecto aquí descrito, hay un polinucleótido aislado que tiene una secuencia que codifica EGVIII, una secuencia complementaria a la secuencia de codificación egl8, y una composición que comprende el polinucleótido. El polinucleótido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico, o un análogo de antisentido del mismo.

Un polinucleótido egl8 puede comprender una molécula aislada de ácido nucleico que se hibrida con el complemento de los ácidos nucleicos presentados como SEQ ID NO: 1, bajo condiciones de rigurosidad moderada a alta, donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido EGVIII que muestra una actividad endoglucanasa.

El polinucleótido puede codificar una proteína EGVIII que tiene al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o más de identidad de secuencia a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 1. En una realización concreta, el polinucleótido comprende una secuencia sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 1. La invención también contempla fragmentos de polinucleótidos, de preferencia, de al menos aproximadamente 15-30 nucleótidos de longitud.

En consecuencia, la invención en un aspecto proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo consistente en: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementario a una secuencia que codifica un polipéptido EGVIII con la actividad biológica de la endoglucanasa y que tenga al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2 o en la SEQ ID NO: 2 en toda la longitud de la Figura 2 o la secuencia SEQ ID NO: 2 (b) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 4, o el complemento del mismo, y (c) una secuencia de ácido nucleico que se híbrida, en condiciones de alta rigurosidad a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 4, o el complemento o un fragmento de la misma, en la que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tienen la actividad biológica de una endoglucanasa.

Se describen aquí vectores de expresión recombinante que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII o un fragmento o variante de empalme de la misma, unido operativamente a los elementos reguladores eficaces para la expresión de la proteína en un huésped seleccionado, y una célula huésped que contiene el vector.

En consecuencia, la invención proporciona además una construcción de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1. También se ofrece un vector que contiene la construcción de expresión y un vector que comprende un polinucleótido de la invención como en la reivindicación 1, unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector, y una célula hospedadora transformada con un vector de este tipo, así como una célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido de la invención tal como se establece en la reivindicación 1.

La invención también incluye un procedimiento para producir EGVIII mediante técnicas recombinantes, mediante el cultivo de células huésped procariotas o eucariotas recombinantes que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII bajo condiciones eficaces para promover la expresión de la proteína, y la posterior recuperación de la proteína de la célula huésped o el medio de cultivo celular.

En consecuencia, la invención también proporciona un procedimiento para expresar EGVIII en una célula, comprendiendo el procedimiento: (i) proporcionar células huésped que han sido transducidas, transformadas o transfectadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de codificación de EGVIII según la reivindicación 1, (ii) el cultivo de las células.

También se describe aquí un anticuerpo específicamente inmunorreactivo con EGVIII, y los procedimientos analíticos para la detección de ácidos nucleicos egl8 y proteínas EGVIII.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende una supresión o inserción u otra modificación en un gen egl8 con una secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 1, cuya eliminación, inserción u otra modificación que inactiva el gen e impide la producción de polipéptido EGVIII, así como un oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido EGVIII teniendo la secuencia presentada como SEQ ID NO: 2, donde a la exposición a una célula huésped productora de endoglucanasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de endoglucanasa por dicha célula huésped. La invención también proporciona una composición de detergente, comprendiendo dicha composición un polipéptido según la invención. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición enzimática útil en la conversión de la celulosa en azúcares y/o etanol, comprendiendo la composición enzimática EGVIII. La composición puede comprender además enzimas celulasas adicionales, tales como otras endoglucanasas, beta-glucosidasas y/o celbiohidrolasas. La composición puede ser enriquecida en EGVIII. Así, en otro aspecto la invención proporciona un procedimiento de conversión de celulosa en etanol, comprendiendo el procedimiento el uso de una composición enzimática que comprende un polipéptido EGVIII según la invención para hidrolizar la celulosa en sus componentes azúcar.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación única en cadena de la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 1), de la T. reesei egl8 ADNc, donde la secuencia de no codificación se indica en negrita.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos predicha de (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de señal (SEQ ID NO: 3) sobre la base de la secuencia de nucleótidos proporcionada en la figura 1, donde la secuencia de señal se indica en negrita.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Salvo indicación en contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la técnica de la presente invención. Los profesionales son especialmente dirigidos a Sambrook et al., 1989, y Ausubel FM et al., 1993, para las definiciones y los términos de la técnica. Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos, ya que estos pueden variar.

Todas las publicaciones aquí citadas se incorporan expresamente aquí como referencia con el fin de describir y divulgar composiciones y metodologías que pueden utilizarse en relación con la invención. El término "polipéptido" como se usa aquí se refiere a un compuesto formado por una sola cadena de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. El término "proteína" como se utiliza aquí puede ser sinónimo del término "polipéptido" o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos.

El término "molécula de ácido nucleico" incluye ARN, ADN y moléculas de ADNc. Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, puede ser producida una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína dada, tal como EGVIII. La presente invención contempla todas las posibles variantes de secuencias de nucleótidos, que codifique al EGVIII, todos los cuales son posibles debido a la degeneración del código genético.

Una construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" tiene una porción de la secuencia que no es nativa de la célula en la que se expresa. Heteróloga, con respecto a una secuencia de control se refiere a una secuencia de control (es decir promotor o potenciador), que no funciona en la naturaleza para regular el mismo gen cuya expresión esta regulando actualmente. En general, las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas no son endógenas a la célula o parte del genoma en el que están presentes, y se han añadido a la célula, mediante infección, transfección, transformación, microinyección, electroporación, o similar. Una construcción de ácido nucleico "heteróloga" puede contener una combinación de secuencia de control/secuencia de codificación de ADN que es la misma o diferente de una combinación secuencia de control/secuencia codificante del ADN encontrado en la célula de origen.

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Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una construcción de un ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar los fragmentos de ADN heterólogo en una célula extraña. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están comercialmente disponibles. La selección de los vectores de expresión adecuada está dentro del conocimiento de los que tienen habilidad en la materia.

En consecuencia, un "casete de expresión" o "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico generada de forma recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El casete de expresión recombinante puede ser incorporado en un plásmido, cromosomas, ADN mitocondrial, ADN de plastidios, virus, o un fragmento de ácido nucleico. Normalmente, la parte de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico a transcribir y un promotor.

Como se usa aquí, el término "plásmido" se refiere a una construcción de ADN de doble cadena (ds) circular que se usa como vector de clonación, y que forma un elemento genético auto-replicante extracromosómico en muchas bacterias y algunos eucariotas.

Como se usa aquí, el término "secuencia de nucleótidos de codificación de marcador seleccionable" se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de expresión en las células y donde la expresión del marcador seleccionable confiere a las células que contienen el gen expresa la capacidad de crecer en la presencia de un correspondiente agente selectivo, o bajo condiciones de crecimiento selectivo correspondientes.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción un gen downstream. El promotor generalmente será adecuado para la célula huésped en la que se expresa el gen de interés. El promotor, junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y de traducción (también llamadas "secuencias de control") es necesario para expresar un gen determinado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y translación incluyen, pero no están limitadas a, las secuencias de promotor, los sitios de unión del ribosoma, secuencias de inicio y de detención de la transcripción, secuencias de inicio y de detención de traducción y secuencias potenciadoras o activadoras.

"Gen quimérico" o "construcción de ácido nucleico heterólogo", tal como se define aquí se refiere a un gen no nativo (es decir, uno que se ha introducido en un huésped) que puede estar compuesto de partes de genes diferentes, incluidos los elementos regulatorios. Una construcción de un gen quimérico para la transformación de una célula huésped está típicamente compuesto de una región reguladora de la transcripción (promotor) operativamente unida a una secuencia de codificación de proteínas heterólogas, o, en un gen quimérico marcador seleccionable, a un gen marcador de selección que codifica una proteína que confiere resistencia a los antibióticos a las células transformadas. Un gen quimérico típico de la presente invención, para transformación en una célula huésped, incluye una región reguladora de la transcripción que es constitutiva o inducible, una secuencia de codificación de proteína, y una secuencia de terminación. Una construcción de gen quimérico puede incluir también una segunda secuencia de ADN que codifica un péptido señal si se desea la secreción de la proteína objetivo.

Un ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica un líder de secreción unido operativamente a un ADN para un polipéptido si éste se expresa como un preproteína que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la de secuencia, o un sitio de unión del ribosoma está unido operativamente a una secuencia de codificación si se coloca con el fin de facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están vinculadas son contiguas, y, en el caso de un líder de secreción, contiguo y en el marco de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. La vinculación es realizada por ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos, enlaces o cebadores para PCR se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa aquí, el término "gen", indica el segmento de ADN que participa en la producción de una cadena de polipéptidos, que puede o no incluir las regiones anterior y posterior a la región de codificación, por ejemplo 5' no traducido (5' UTR) o secuencias "líder" y 3' UTR o secuencias "remolque", así como secuencias que intervienen (intrones) entre los distintos segmentos de codificación (exones).

En general, las moléculas de ácido nucleico que codifican EGVIII o un análogo u homólogo del mismo se hibridarán, bajo condiciones de moderada a alta rigurosidad a la secuencia aquí proporcionada como SEQ ID NO: 1. Sin embargo, en algunos casos se emplea una secuencia de nucleótidos que codifica EGVIII que posee un uso de codón sustancialmente diferente, mientras que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos que codifica EGVIII tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Por ejemplo, la secuencia de codificación puede ser modificada para facilitar la expresión más rápida de EGVIII en un sistema particular de expresión procariota o eucariota, de conformidad con la frecuencia con que un codón particular es utilizado por el huésped. Te'o, et al. (2000), por ejemplo, describe la optimización de la expresión de genes en hongos filamentosos.

Una secuencia de ácido nucleico se considera "selectivamente hibridable" a una secuencia de ácido nucleico de referencia, si las dos secuencias específicamente se hibridan entre sí bajo condiciones de hibridación y de lavado de rigor moderado a alto. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) de los complejos de unión de ácidos nucleicos o de la sonda. Por ejemplo, "un rigor máximo" normalmente se produce alrededor de Tm-5ºC (5º por debajo de la Tm de la sonda), "alto rigor", aproximadamente a 5-10º por debajo de la Tm; "rigor intermedio", aproximadamente a 10-20º por debajo de la Tm de la sonda, y "rigor bajo", aproximadamente a 20-25º por debajo de la Tm. Funcionalmente, las condiciones de un máximo de rigor se pueden utilizar para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi-estricta con la sonda de hibridación, mientras que las condiciones de rigor alto se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente el 80% o más de identidad de secuencia con la sonda.

Condiciones de hibridación de rigor moderado y alto son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, capítulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M., et al, 1993,. Un ejemplo de las condiciones de rigor alto incluye hibridación a aproximadamente 42ºC en 50% formamida, 5X SSC, solución Denhardt 5X, 0,5% SDS y 100 \mug/ml de ADN portador desnaturalizado seguido de un lavado en dos veces en 2X SSC y 0,5% de SDS a la temperatura ambiente y dos veces más en 0,1X SSC y 0,5% SDS a 42ºC.

Como se usa aquí, "recombinante" hace referencia a una célula o un vector, que ha sido modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heteróloga o que la célula se deriva de una célula así modificada. Así, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, se sub-expresan o no se expresan en absoluto como consecuencia de intervención humana deliberada.

Como se usa aquí, los términos "transformado", "establemente transformado" o "transgénicos", con referencia a una célula significa que la célula tiene una secuencia de ácidos nucleicos no-nativos (heteróloga) integrada en su genoma o como plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

Tal como se usa aquí, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un polipéptido se produce sobre la base de la secuencia del ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.

El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección" o "transformación" o "transducción", e incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertida en una de réplica autónoma, o expresado de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

A continuación el término "expresión EGVIII" se refiere a la transcripción y traducción del gen egl8, cuyos productos incluyen precursores de ARNm, ARNm, polipéptido, polipéptidos procesados de manera post-translacional, y sus derivados, incluidos EGVIII de especies relacionadas, tal como Trichoderma longibrachiatum (reeset), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Hypocrea jecorina y Hypocrea schweinitzii. A modo de ejemplo, los ensayos de expresión EGVIII incluyen Western blot para proteínas EGVIII, análisis de Northern blot y ensayos de reacción en cadena de polimerasa transciptasa inversa (RT-PCR) para ARNm EGVIII, y ensayos de actividad de endoglucanasa tal como se describe en Schoemaker S.P. y Brown R.D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978, 523:133-146) y Schulein (1988).

El término "empalme alternativo" se refiere al proceso mediante con el cual se generan varias isoformas del polipéptido a partir de un solo gen, y consiste en el empalme de exones no consecutivos juntos durante el procesamiento de algunas, pero no todas, de las transcripciones de los genes. Así, un exón particular puede conectarse a uno cualquiera de varios exones alternativos para formar ARN mensajero. Los ARNm empalmados alternativamente producen polipéptidos ("variantes de empalme") en el que algunas partes son comunes, mientras que otras partes son diferentes.

El término "secuencia de señal" se refiere a una secuencia de aminoácidos en la porción terminal N de una proteína que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal que se separa durante el proceso de secreción.

Mediante el término "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o la transcripción o la transcripción y la traducción (expresión) de la construcción de expresión. Las células huésped para su uso en la presente invención pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas, tales como levadura, planta, insecto, anfibio, o células de mamífero. En general, las células huésped son hongos filamentosos.

El término "hongos filamentosos" significa cualquiera y todos los hongos filamentosos reconocidos por los expertos en la materia. Un hongo preferido se selecciona del grupo formado por Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora, o formas sexuales alternativas de los mismos, tal como Emericella, Hypocrea.

El término "celooligosacárido" se refiere a grupos de oligosacáridos que contienen 2-8 unidades de glucosa y tienen enlaces \beta-1,4, por ejemplo, celobiosa.

El término "celulasa" se refiere a una categoría de enzimas capaces de hidrolizar polímeros de celulosa para acortar oligómeros celo-oligosacáridos, celobiosa y/o glucosa. Numerosos ejemplos de celulasas, tal como exoglucanasas, exocelobiohidrolasas, endoglucanasas, y glucosidasas se han obtenido a partir de organismos celulolíticos, incluyendo particularmente hongos, plantas y bacterias.

El término "dominio de unión de celulosa" tal como se usa aquí se refiere a la parte de la secuencia de aminoácidos de una celulasa o de una región de la enzima que interviene en la actividad de unión de la celulosa de una celulasa o derivada de la misma. Los dominios de unión de celulosa generalmente funcionan mediante la unión no covalente de la celulasa a la celulosa, un derivado de la celulosa u otro polisacárido equivalente del mismo. Los dominios de unión de celulosa permiten o facilitan la hidrólisis de las fibras de celulosa de la región del núcleo catalítico estructuralmente distinto, y típicamente funcionan independientes del núcleo catalítico. Así, un dominio de unión de celulosa no tendrá la actividad hidrolítica significativa atribuible a un núcleo catalítico. En otras palabras, un dominio de unión de celulosa es un elemento estructural de la estructura terciaria de la proteína enzimática de celulasa que es distinto del elemento estructural que posee la actividad catalítica.

Tal como se usa aquí, el término "surfactante" se refiere a cualquier compuesto generalmente reconocido en la técnica como que tiene calidades activas de superficie. Así, por ejemplo, los surfactantes contienen surfactantes aniónicos, catiónicos y no iónicos, tal como los que se encuentran comúnmente en detergentes. Los surfactantes aniónicos incluyen alquilbenzenosulfonatos lineales o ramificados, sulfatos de éter de alquilo o alquenilo que tienen grupos alquilo lineales o ramificados o grupos alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos y alcanosulfonatos. Los surfactantes amfolíticos incluyen sulfonatos de sal de amonio cuaternario, y surfactantes amfolíticos de tipo betaína. Estos surfactantes amfolíticos tienen tanto grupos de carga positiva como negativa en la misma molécula. Los surfactantes no iónicos pueden comprender éteres de polioxialquileno, así como alcanolamidas de ácidos grasos mayores o aductos de óxido de alqueno de las mismas, monoésteres de glicerina de ácidos grasos, y similares.

Tal como se usa aquí, el término "tejido que contiene celulosa" se refiere a cualquier tejido cosido o de sin coser, hilos o fibras de algodón o no de algodón que contienen celulosa o mezclas de celulosa que contienen algodón o no algodón, incluyendo celulósicos naturales y celulósicos artificiales (tal como yute, lino, ramio, rayón, y liocel).

Tal como se usa aquí, el término "tejido que contiene algodón" se refiere a tejidos cosidos o sin coser, hilos o fibras de algodón puro o mezclas de algodón con inclusión de algodón en tejidos tejidos de algodón, ropa vaquera de algodón, hilos de algodón, algodón en bruto y similares.

Tal como se usa aquí, el término "composición de lavado a la piedra" se refiere a una formulación para uso en tejidos que contienen celulosa de lavado a la piedra. Las composiciones de lavado a la piedra se utilizan para modificar los tejidos que contienen celulosa antes de su venta, es decir, durante el proceso de fabricación. Por el contrario, las composiciones detergentes están pensadas para la limpieza de la ropa sucia y no se utilizan durante el proceso de fabricación.

Tal como se usa aquí, el término "composición detergente" se refiere a una mezcla que está destinada para su uso en un medio de lavado para el lavado de tejidos que contienen celulosa sucia. En el contexto de la presente invención, las composiciones pueden incluir, además de celulasas y surfactantes, enzimas hidrolíticas adicionales, constructores, agentes blanqueadores, activadores de blanqueo, agentes azulante y tintes fluorescentes, inhibidores de aglomeración, agentes de enmascaramiento, activadores de celulasas, antioxidantes y solubilizantes.

Tal como se usa aquí, el término "reducción o eliminación de la expresión del gen egl8" significa que el egl8 gen ha sido eliminado del genoma y, por tanto no puede ser expresado por el microorganismo huésped recombinante, o que el gen egl8 ha sido modificado de tal manera que una enzima EGVIII funcional no es producida por el microorganismo huésped recombinante.

El término "egl8 alterado" o "gen egl8 modificado" significa que la secuencia de ácido nucleico del gen ha sido alterada mediante la eliminación, adición y/o manipulación de la secuencia de codificación o que la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada ha sido modificada.

Tal como se usa aquí, el término "purificar" generalmente se refiere a someter a los ácidos nucleicos o a las proteínas transgénicas que contienen células a purificación bioquímica y/o a cromatografía de columna.

Tal como se usa aquí, los términos "activo" y "biológicamente activo" se refieren a una actividad biológica asociada a una determinada proteína, tal como la actividad enzimática asociada con una proteasa. De ello se deduce que la actividad biológica de una proteína se refiere a cualquier actividad biológica que suele atribuirse a esa proteína por parte de los expertos en la materia.

Tal como se usa aquí, el término "enriquecido" significa que el EGVIII se encuentra en una concentración que es mayor en relación a la concentración de EGVIII encontrada en un tipo salvaje, o en la composición de celulasa fúngica que se produce de manera natural. Los términos enriquecida, elevada y reforzada pueden utilizarse indistintamente aquí.

Un tipo de composición de celulasa fúngica salvaje es una producida por una fuente fúngica de origen natural y que comprende uno o más componentes BGL, CBH y EG, donde cada uno de estos componentes se encuentra en la proporción producida por la fuente fúngica. Así, una composición EGVIII enriquecida tendría EGVIII en una relación alterada, en donde la proporción de EGVIII respecto a otros componentes de celulasa (es decir, CBHs, beta-glucosidasas y otras endoglucanasas) es elevada. Esta proporción puede incrementarse ya sea aumentando EGVIII o disminuyendo (o eliminando) por lo menos uno de los otros componentes mediante cualquier medio conocido en la técnica.

Así, como ilustración, un sistema de celulasa de origen natural puede ser purificado en componentes sustancialmente puros mediante técnicas de separación publicadas en la literatura, tal como cromatografía de intercambio iónico con un pH adecuado, cromatografía de afinidad, exclusión de tamaño y similares. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico (generalmente cromatografía de intercambio aniónico), es posible separar los componentes de celulasa por elución con un gradiente de pH, o un gradiente de sal, o ambos, un gradiente de pH y un gradiente de sal. La EGVIII purificada se puede agregar a la solución enzimática, resultando en una solución EGVIII enriquecida. También es posible elevar la cantidad de EGVIII producida mediante un microbio usando procedimientos de genética molecular que sobreexpresan el gen que codifica EGVIII, posiblemente en conjunción con la supresión de uno o más genes que codifican otras celulasas.

Las celulasas fúngicas pueden contener más de un componente EG. Los diferentes componentes generalmente tienen diferentes puntos isoeléctricos que permiten su separación mediante cromatografía de intercambio iónico y similares. Se puede utilizar un único componente EG, o una combinación de componentes EG, en una solución enzimática.

Cuando se utiliza en soluciones enzimáticas, el componente EG se añade generalmente en una cantidad suficiente para permitir el mayor índice de liberación de azúcares solubles de la biomasa. La cantidad de componente EG añadido depende del tipo de biomasa que se sacarifica que puede determinarse fácilmente por parte del experto en la materia. Sin embargo, cuando se utiliza, el porcentaje en peso del componente EGVIII respecto a cualquier tipo de componente CBH presente en la composición de celulasa es de aproximadamente 1 preferentemente, preferentemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 10, preferentemente aproximadamente 15 o, preferiblemente, aproximadamente el 20 por ciento en peso a preferentemente el 25 aproximadamente, preferentemente 30 aproximadamente, preferentemente aproximadamente 35, preferentemente aproximadamente 40, preferentemente aproximadamente 45 o, preferentemente, aproximadamente el 50 por ciento en peso. Además, los intervalos preferidos puede ser de aproximadamente 0,5 a aproximadamente el 15 por ciento en peso, de 0,5 a aproximadamente el 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a 20 por ciento en peso, de 1 a aproximadamente el 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 35 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 40 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a 50 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 20 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 25 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a un 35 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 30 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 45 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a 50 por ciento en peso.

II. Organismos objetivo A. Hongos filamentosos

Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por tener un micelio vegetativo que tiene una pared celular compuesta de quitina, glucano, chitosan, manano y otros polisacáridos complejos, con un crecimiento vegetativo por la elongación hifal y catabolismo de carbono que es obligadamente aeróbico.

En la presente invención, la célula madre de los hongos filamentosos puede ser una célula de una especie de, pero no limitado a, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma longibrachiatum (reesei), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum, Penicillium sp.; Humicola sp., incluyendo Humicola insolens; Chrysosporium sp., incluyendo lucknowense C.; Sp catenulatum.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp. Sp Hypocrea., y Emericella sp. Como se usa aquí, el término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." se refiere a cualquier cepa de hongos que han sido previamente clasificada como Trichoderma o está actualmente clasificada como Trichoderma.

En una realización preferida, la célula madre de los hongos filamentosos es una célula Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, o Aspergillus nidulans.

En otra realización preferida, la célula madre de los hongos filamentosos es una célula Trichoderma reesei.

III. Celulasas

Las celulasas se conocen en la técnica como enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1,4-glucano y beta D-glucosídicos), resultando en la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares. Como se indica anteriormente, las celulasas tradicionalmente se han dividido en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas (CE 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles, et al., 1987; Schulein, 1988).

Algunos hongos producen sistemas de celulasas completos que incluyen exocelobiohidrolasas o celulasas de tipo CBH, endoglucanasas o, celulasas de tipo EG y beta-glucosidasas o celulasas de tipo BG (Schulein, 1988). Sin embargo, a veces estos sistemas carecen de celulasas de tipo CBH y las celulasas bacterianas también incluyen típicamente pocas o ningunas celulasas de tipo CBH. Además, se ha demostrado que los componentes EG y los componentes CBH interactúan de manera sinérgica para degradar de manera más eficiente la celulosa. Ver, por ejemplo, Wood, 1985. Los diferentes componentes, es decir, las diferentes endoglucanasas y exocelobiohidrolasas en un sistema de celulasa multicomponente o completo, generalmente tienen propiedades diferentes, tal como punto isoeléctrico, peso molecular, grado de glucosilación, especificidad de sustrato y patrones de acción enzimática.

Se cree que las celulasas de tipo endoglucanasa hidrolizan las uniones internas beta-1,4-glucosídicas en regiones de baja cristalinidad de la celulosa y que las celulasas de tipo exo-celobiohidrolasa hidrolizan celobiosa a partir del extremo de reducción o de no reducción de la celulosa. De ello se deduce que la acción de los componentes de endoglucanasa puede facilitar enormemente la acción de las exocelobiohidrolasas mediante la creación de nuevos extremos de cadena que son reconocidos mediante componentes de exo-celobiohidrolasa. Además, las celulasas de tipo beta-glucosidasa se han demostrado que catalizan la hidrólisis de \beta-D-glucósidos alquilo o arilo, tal como \beta-D-glucósido metilo y glucósido p-nitrofenil, así como glucósidos que contienen únicamente residuos de carbohidratos, tales como celobiosa. Esto hace la glucosa como el único producto para los microorganismos y reduce o elimina la celobiosa que inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas.

Por consiguiente, las celulasas de tipo \beta-glucosidasa se consideran una parte integrante del sistema de celulasa, porque activan la reacción global a la glucosa. Una mayor expresión de BG en T. reesei se ha demostrado que mejora la degradación de la celulosa en glucosa. Ver la patente EP0562003. Además, las \beta-glucosidasas pueden catalizar la hidrólisis de una serie de diferentes sustratos, y por lo tanto,son de utilidad en una gran variedad de aplicaciones diferentes. Algunas \beta-glucosidasas se pueden añadir a la uva durante la producción de vino para mejorar el potencial aromático del producto de vino terminado. Sin embargo, otra aplicación puede ser el uso de \beta-glucosidasa en la fruta para mejorar el aroma de la misma. Alternativamente, la \beta-glucosidasa puede utilizarse directamente en aditivos alimentarios o en la transformación del vino para realzar el sabor y el aroma.

Las celulasas también encuentran una serie de usos en composiciones de detergente incluyendo mejorar la capacidad de limpieza, como agente suavizante y mejorar el tacto de los tejidos de algodón (Hemmpel, 1991; Tyndall, 1992; Kumar et al, 1997). Aunque el mecanismo no es parte de la invención, se han atribuido propiedades suavizantes y de restauración del color de la celulasa a los componentes de endoglucanasa alcalina en composiciones de celulasas, como lo demuestra las patentes 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757, que describen que las composiciones de detergente que contienen una composición de celulasa enriquecida en un determinado componente alcalino de endoglucanasa imparten una restauración del color y suavizan mejor las prendas de vestir tratadas en comparación con composiciones de celulasa no enriquecidas con este componente. Además, el uso de estos componentes de endoglucanasa en las composiciones de detergente alcalino se ha demostrado que completan los requisitos de pH de la composición de detergentes (por ejemplo, exhibiendo su actividad máxima en un pH alcalino de 7,5 a 10, tal como se describe en las patentes 5.648.263, 5.691.178, y 5.776.757).

Las composiciones de celulasa también se han mostrado que degradan tejidos que contienen algodón, resultando en la pérdida de resistencia reducida en el tejido (patente US 4.822.516), contribuyendo a la resistencia al uso de composiciones de celulasas en aplicaciones comerciales de detergente. Las composiciones de celulasa con componentes de endoglucanasa se ha sugerido que presentan una pérdida de resistencia reducida para los tejidos que contienen algodón, en comparación con las composiciones que comprenden un sistema completo de celulasa.

Las celulasas también se han mostrado útiles en la degradación de biomasa de celulasa en etanol (en el que la celulosa se degrada la celulosa en glucosa y levadura u otros microbios que también fermentan la glucosa en etanol), en el tratamiento de pasta mecánica (Pere et al, 1996), para su uso como aditivo alimenticio (WO 91/04673) y molido en grano húmedo.

La mayoría de CBHs y EGs tienen una estructura multidominio que consiste en un dominio de núcleo separado de un dominio de unión de celulosa (CDB) mediante un péptido de enlace (Suumakki et al, 2000). El dominio de núcleo contiene el sitio activo mientras que el CDB interactúa con celulosa mediante la unión de la enzima al mismo (van Tilbeurgh et al., 1986; Tomme et al, 1988). Las CBDs son particularmente importantes en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Se ha demostrado que la capacidad de las celobiohidrolasas de degradar la celulosa cristalina disminuye claramente cuando la CDB está ausente (Linder y Teeri, 1997). Sin embargo, la función exacta y el mecanismo de acción de las CBDs siguen siendo un tema de especulación. Se ha sugerido que la CDB mejora la actividad enzimática meramente mediante el aumento de la concentración de la enzima efectiva en la superficie de celulosa (Stahlberg et al, 1991), y/o mediante el aflojamiento de cadenas de celulosa simples de la superficie de celulosa (Tormo, et al, 1996). La mayoría de estudios sobre los efectos de los dominios de celulasa en diferentes sustratos se han realizado con proteínas de núcleo de celobiohidrolasas, ya que sus proteínas de núcleo pueden producirse fácilmente mediante proteólisis limitadas con papaína (Tomme et al, 1988). Numerosas celulasas han sido descritas en la literatura científica, ejemplos de los cuales incluyen: de Trichoderma reesei: Shoemaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, que describe CBHI; Teeri, T. et al., Gene, 51:43-52, 1987, que describe CBHII; Penttila, M. et al., Gene, 45:253-263, 1986, que describe EGI; Saloheimo, M. et al., Gene, 63:11-22, 1988, que describe EGII; Okada, M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:555-563, 1988, que describe EGIII; Saloheimo, M. et al., EUR. J. Biochem., 249:584-591, 1997, que describe EGIV; Saloheimo, A. et al., Molecular Microbiology, 13:219-228, 1994, que describe EGV; Barnett, CC, et al., Bio/Technology, 9:562-567, 1991, que describe BGL1, y Takashima, S. et al., J. Biochem., 125:728-736, 1999, que describe BGL2. Las celulasas de especies diferentes de Trichoderma también se han descrito por ejemplo, Ooi et al, 1990, que describe la secuencia de ADN que codifica endoglucanasa F1-CMC producida mediante Aspergillus aculeatus, T Kawaguchi et al., 1996, que describe la clonación y la secuenciación de ADN que codifica la beta-glucosidasa 1 de Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al, 1995, que describe la secuencia de ADN que codifica endoglucanasa CMCase-1 de Kawachii Aspergillus IFO 4308; Saarilahti et al., 1990, que describe endoglucanasa de Carotovara amylovora; Spilliaert R, et al., 1994, que describe la clonación y la secuenciación de bglA, que codifica una beta-glucanasa termoestable de Marinu Rhodothermus; y Halldorsdottir S et al., 1998, que describe la clonación, la secuenciación y la sobreexpresión de un gen de Marinus Rhodothermus que codifica una celulasa termoestable de la familia de hidrolasa glicosil 12. Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de identificación y caracterización de nuevas celulasas, con propiedades mejoradas, tal como un rendimiento mejorado bajo condiciones de tensión térmica o en presencia de surfactantes, una actividad específica aumentada, una alteración del patrón de división de sustrato y/o la expresión de alto nivel in vitro.

El desarrollo de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que incluyen cantidades variables de celulasa de tipo CBH, de tipo EG y de tipo BG es de interés para su uso: (1) en composiciones de detergentes que presentan una capacidad de limpieza mejorada, que funciona como un agente suavizante y/o mejorar el tacto de los tejidos de algodón (por ejemplo, "lavado a la piedra" o "biopulido"); (2) en composiciones para degradar pasta de madera u otra biomasa en azúcares (por ejemplo, para la producción de bioetanol), y/o (3) en en composiciones de alimen-
tación.

IV. Procedimientos de identificación de nuevas secuencias

Marcos de lectura abierta (ORF) se analizaron siguiendo un secuenciado total o parcial del genoma de T. reesei o de clones de librerías de ADNc derivados de ARNm de T. reesei y también se analizan utilizando un software de análisis de secuencias, y mediante la determinación de la homología con secuencias conocidas en bases de datos (públicas/privadas).

V. Ácidos nucleicos egl8 y polipéptidos EGVIII A. Ácidos nucleicos egl8

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen la secuencia de codificación nativa para egl8. En una realización, la secuencia es la secuencia de ADNc para egl8 presentada aquí como SEQ. ID. NO:1 o SEQ. ID. NO:4, y homólogos de los mismos en otras especies, variantes alélicas que se producen naturalmente y de empalme, fragmentos de ácido nucleico, y derivados biológicamente activos (funcionales) de los mismos, tales como variantes de secuencia de aminoácidos de la molécula nativa y secuencias que codifican proteínas de fusión. Las secuencias se denominan aquí como "secuencias de ácido nucleico que codifica EGVIII".

Una búsqueda BLASTN Básica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) de la base de datos de secuencias de ácido nucleico no redundante se realizó el 12 de septiembre de 2001, con la secuencia del gen egl8 se presenta en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), indicó que solamente las secuencias que producen alineaciones significativas (es decir, con un valor E menor de 10^{-5}) fueron el número de acceso GenBank S45137 (CMC1, carboximetilcelulasa de Cryptococcus flavus).

Una secuencia de ácido nucleico egl8 de la presente invención puede ser una secuencia de ADN o ARN, derivado de ADN genómico, ADNc, ARNm, o se puede sintetizar en su totalidad o en parte. El ADN puede ser de cadena doble o de cadena simple, y si la cadena simple puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido, complementaria). La secuencia de ácido nucleico puede clonarse, por ejemplo, mediante el aislamiento de ADN genómico de una fuente apropiada, y amplificando y clonando la secuencia de interés usando una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede sintetizarse, ya sea totalmente o parcialmente, sobre todo cuando es conveniente proporcionar secuencias huésped preferidas para la expresión óptima. Así, la totalidad o una parte del gen estructural deseado (la parte del gen que codifica para un polipéptido o una proteína) puede sintetizarse usando codones preferidos mediante un huésped seleccionado.

Debido a la inherente degeneración del código genético, las secuencias de ácido nucleico diferentes de la forma nativa que codifican sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos equivalente funcional pueden utilizarse para clonar y/o expresar secuencias de ácido nucleico que codifican EGVIII. Así, para una determinada secuencia de ácidos nucleicos que codifica EGVIII, se aprecia que, como consecuencia de la degeneración del código genético, se pueden producir una serie de secuencias de codificación que codifican una proteína que tiene la misma secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el triplete CGT codifica el aminoácido arginina. La arginina es, alternativamente, codificada mediante CGA, CGC, CGG, AGA, y AGG. Por lo tanto, se aprecia que tales sustituciones en la región de codificación incluyen las variantes de secuencias de ácido nucleico cubiertas por la presente invención. Todas y cada una de estas variantes de la secuencia se pueden utilizar de la misma manera tal como se describe aquí para la forma nativa de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica EGVIII.

Una secuencia del ácido nucleico que codifica EGVIII "variante" puede codificar una secuencia de aminoácidos EGVIII "variante" que se altera mediante uno o más aminoácidos de la secuencia de polipéptido natural o se puede truncar mediante la eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos de la secuencia de polipéptido, los cuales están incluidos en el ámbito de la invención. Del mismo modo, el término "forma modificada de", en relación con EGVIII, significa una forma derivada o variante de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína EGVIII nativa o la secuencia de aminoácidos EGVIII nativa.

De manera similar, los polinucleótidos para su uso en la práctica de la invención incluyen secuencias que codifican proteínas nativas EGVIII y variantes de empalme de las mismas, secuencias complementarias a la secuencia de codificación de proteínas nativas, y nuevos fragmentos de polinucleótidos que codifican EGVIII. Una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII puede contener una o más secuencias de intrones si es una secuencia de ADN genómico.

En una realización general, una secuencia de nucleótidos que codifica EGVIII tiene por lo menos un 70%, preferentemente un 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o más de identidad de secuencia con la secuencia de codificación egl8 presentada aquí como SEQ ID NO: 1.

En otra realización, una secuencia de nucleótido que codifica EGVIII se hibrida en condiciones de moderada a alta estringencia a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína EGVIII. En una realización relacionada, la secuencia de nucleótidos que codifica EGVIII se hibrida en condiciones de moderada a alta estringencia a la secuencia de nucleótidos presentada como SEQ ID NO: 1.

Se apreciará que algunas variantes de secuencias de ácido nucleico que codifican EGVIII pueden o no hibridar de manera selectiva la secuencia pariente. A modo de ejemplo, en situaciones en las que la secuencia de codificación se ha optimizado sobre la base de la degeneración del código genético, la secuencia de codificación variante se puede producir de manera que codifica una proteína EGVIII, pero no se hibrida a una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII nativo bajo condiciones de moderada a alta estringencia. Esto ocurriría, por ejemplo, cuando la variante de la secuencia incluye un codón diferente para cada uno de los aminoácidos codificados mediante el nucleótido pariente.

Tal como también se entiende por parte de los expertos en la materia, en algunos casos puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que poseen codones que se producen de manera no natural, por ejemplo inosina u otro nucleótido análogo que se produce de manera no natural. Codones preferidos por un huésped eucariótico particular se pueden seleccionar, por ejemplo, para aumentar el índice de expresión de la proteína EGVIII o para producir transcripciones recombinantes de ARN con propiedades deseables, tales como una vida media más larga, que las transcripciones producidas a partir de la secuencia natural. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica EGVIII nativa puede diseñarse con el fin de alterar la secuencia de codificación por una serie de razones, incluyendo pero no limitado a, alteraciones que modifiquen la clonación, el procesamiento y/o la expresión de la proteína EGVIII mediante una célula.

Particularmente preferidas son las sustituciones, adiciones y supresiones de ácido nucleico que son silenciosas, de manera que no alteren las propiedades o las actividades del polinucleótido o polipéptido nativo.

Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis mediada con oligonucleótido (dirigida al sitio), y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al, 1986; Zoller et al, 1987), la mutagénesis de casete (Wells, et al, 1985), la mutagénesis de selección de restricción (Wells, et al, 1986) u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir la variante de ADN que codifica el polipéptido EGVIII.

Sin embargo, en algunos casos puede ser ventajoso expresar las variantes de egl8 que carecen de las propiedades o las actividades del polipéptido EGVIII o el polinucleótido egl8 nativo. En tales casos, las formas mutantes o modificadas de la secuencia de ácido nucleico de codificación de EGVIII nativa se pueden generar utilizando las técnicas habitualmente empleadas por los expertos en la materia.

B. Polipéptidos EGVIII

En una realización preferida, la invención proporciona un polipéptido EGVIII, que tiene una secuencia de polipéptido EGVIII madura o de longitud completa que comprende la secuencia presentada en la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Un polipéptido EGVIII de la invención puede ser el polipéptido EGVIII maduro, como parte de una proteína de fusión o un fragmento o variante de la secuencia del polipéptido EGVIII presentada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2).

De manera ordinaria, un polipéptido EGVIII puede tener por lo menos un 80% de identidad con una secuencia de aminoácidos EGVIII en toda su longitud. Más preferiblemente, son secuencias de polipéptido EGVIII que comprenden una región que tiene por lo menos un 85, 90, 95, 98% o más de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido EGVIII de la figura 2 (SEQ ID NO: 2), utilizando un programa de alineación de secuencias, tal como se detalla
aquí.

Típicamente, una "forma modificada de" una proteína EGVIII nativa o una "variante" de proteína EGVIII tiene una secuencia de derivados que contienen por lo menos una sustitución, adición, supresión o inserción de un aminoácido, respectivamente.

Es bien conocido en la técnica que algunas sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en secuencias de proteína sin afectar a la función de la proteína. Generalmente, se toleran sustituciones conservativas de aminoácidos o sustituciones de aminoácidos similares sin afectar la función de la proteína. Aminoácidos similares pueden ser los que son similares en tamaño y/o propiedades de carga, por ejemplo, aspartato y glutamato, e isoleucina y valina, son dos pares de aminoácidos similares. La similitud entre los pares de aminoácidos se ha evaluado en la técnica de una serie de maneras. Por ejemplo, Dayhoff et al. (1978) proporciona las tablas de frecuencia de sustituciones de aminoácidos que pueden ser empleados como una medida de similitud de los aminoácidos. Las tablas de frecuencia de Dayhoff et al. se basan en la comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas que tienen la misma función de una variedad de fuentes evolutivamente diferentes.

Fragmentos y variantes de la secuencia de polipéptido EGVIII de la figura 2 (SEQ ID NO: 2) se consideran una parte de la invención. Un fragmento es un polipéptido variante que tiene una secuencia de aminoácidos que es totalmente lo mismo como parte, pero no toda la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos anteriormente. Los fragmentos pueden ser "libres" o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande, del cual el fragmento forma una parte o una región, más preferiblemente como una región única continua. Los fragmentos son fragmentos biológicamente activos, que son los fragmentos que median actividades de los polipéptidos de la invención, incluso aquellos con una actividad similar o una mejor actividad o con una disminución de la actividad. Se describen también fragmentos que son antigénicos o inmunogénicos en un animal, especialmente un ser humano. En este aspecto, se describen (i) fragmentos de EGVIII, preferiblemente por lo menos acerca de 20-100 aminoácidos de longitud, más preferiblemente aproximadamente 100-200 aminoácidos de longitud, y (ii) una composición farmacéutica que comprende EGVIII. En varias realizaciones, el fragmento corresponde al dominio N-terminal de EGVIII o el dominio C-terminal de EGVIII.

Los polipéptidos EGVIII de la invención también incluyen polipéptidos que varían de la secuencia de polipéptido EGVIII de la figura 2 (SEQ ID NO: 2). Estas variantes pueden ser de sustitución, inserción o supresión. Las variantes típicamente presentan la misma actividad biológica cualitativa como el análogo de origen natural, aunque también se pueden seleccionar variantes que tienen características modificadas, tal como se describe a continuación.

Una "sustitución" resulta de la sustitución de uno o más nucleótidos o aminoácidos mediante diferentes nucleótidos o aminoácidos, respectivamente.

Una "inserción" o "adición" es ese cambio en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que ha resultado en la adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, en comparación con la secuencia natural.

Una "supresión" se define como un cambio en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos en la que uno o más nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, están ausentes.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos simples; las inserciones usualmente serán del orden de entre 1 a 20 aminoácidos, aunque considerablemente se pueden tolerar inserciones mayores. Las supresiones van de 1 a 20 residuos, aunque en algunos casos, las supresiones pueden ser mucho mayores.

Las sustituciones, supresiones, inserciones o cualquier combinación de éstas pueden utilizarse para llegar a un derivado final. Generalmente, estos cambios se hacen en algunos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, cambios mayores pueden tolerarse en ciertas circunstancias.

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una isoleucina con una valina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente entre 1 y 5 aminoácidos.

Las sustituciones se hacen generalmente según "sustituciones conservativas" conocidas. Una "sustitución conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase por un aminoácido en la misma clase, donde una clase se define mediante las propiedades físicoquímicas comunes de la cadena lateral de aminoácidos y frecuencias de alta sustitución en proteínas homólogas que se encuentran en la naturaleza (tal como se determina, por ejemplo, mediante una matriz de intercambio de frecuencia Dayhoff o matriz BLOSUM). (Ver generalmente, Doolittle, R.F., 1986).

Una "sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en una clase con un aminoácido de otra clase.

Variantes de polipéptidos EGVIII típicamente presentan la misma actividad biológica cualitativa que el análogo de origen natural, aunque las variantes también son seleccionadas para modificar las características del polipéptido EGVIII, según sea necesario. Por ejemplo, los sitios de glicosilación, y más particularmente uno o más sitios de glicosilación O-enlazados o N-enlazados se pueden alterar o eliminar. Los expertos en la materia podrán apreciar que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos posteriores a la traducción del polipéptido EGVIII, tal como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de la membrana o las características de secreción u otras características de localización celular.

También se incluyen en la definición de polipéptidos EGVIII otros polipéptidos EGVIII relacionados. Por lo tanto, las secuencias de cebadores de sonda o de reacción de cadena de polimerasa (PCR) degenerado se pueden utilizar para encontrar otros polipéptidos relacionados. Secuencias de sonda o cebadoras pueden diseñarse para: la totalidad o parte de la secuencia de polipéptido EGVIII, o secuencias fuera de la región de codificación. Como es generalmente conocido en la técnica, los cebadores PCR tienen de 15 a 35 nucleótidos de longitud aproximadamente, prefiriéndose entre 20 y 30 aproximadamente, y pueden contener inosina según sea necesario. Las condiciones para la reacción de PCR son generalmente conocidas en la técnica.

Las modificaciones covalentes de polipéptidos EGVIII también se incluyen dentro del ámbito de aplicación de esta invención. Por ejemplo, la invención proporciona polipéptidos EGVIII que son una proteína madura y pueden incluir otros aminoácidos amino o carboxilo terminal, o aminoácidos en el polipéptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura de la proteína tiene más de una cadena de polipéptidos). Estas secuencias pueden, por ejemplo, desempeñan un papel en el procesamiento de la proteína desde un precursor a una forma madura, permiten el transporte de proteínas, acortar o alargar la vida media de las proteínas, o facilitar la manipulación de la proteína en ensayos o producción.

También se contemplan modificaciones dirigidas a la alteración de un sitio activo, la alteración del pH óptimo, la temperatura óptima, y/o la afinidad del sustrato de la enzima EGVIII.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 2) de un polipéptido EGVIII de ejemplo basado en la secuencia de nucleótidos proporcionada en la Figura 1. El peso molecular previsto del polipéptido EGVIII codificado es 46,9 kDa. Un péptido de señal previsto de 19 aminoácidos precede el extremo amino terminal maduro de EGVIII tal como se proporciona en la figura, lo que sugiere que el polipéptido EGVIII se segrega (Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., von Heijne, G., Protein Engineering, 10:1-6, 1997). La proteína también se predice que se fija a la membrana a través de glucosilfosfatidilinositol (Hartmenn, T A., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:5786-).

Una búsqueda básica BLASTP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) de la base de datos de proteínas no redundantes, realizada el 12 de septiembre de 2001 con la secuencia de aminoácidos EGVIII indicó un 52% de identidad con el número de acceso GenBank AB021657 (endoglucanasa II de Trichoderma viride), un 51% de identidad de secuencia con el número de acceso GenBank M19373 (endoglucanasa EG-II de precursores de Trichoderma reesei), un 50% de identidad de secuencia con el número de acceso GenBank X89564 (endoglucanasa 2 de Janthinellum Penicillium), y un 52% de identidad de secuencia con el número de acceso GenBank U13914 (endo-beta-1,4-glucanasa de Macrophomina phaseolina). Estas similitudes de secuencia indican que EGVIII es un miembro de la familia de hidrolasa glicosilo 5 (Henrissat, B. y Bairoch, A. (1993) Biochem. J. 293:781-788).

C. Anticuerpos anti-EGVIII

También se describen aquí anticuerpos anti-EGVIII. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales humanizados, biespecíficos o heteroconjugados.

Procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la materia. El agente de inmunización puede ser un polipéptido EGVIII o una proteína de fusión de la misma. Puede ser útil conjugar el antígeno a una proteína que se sabe que ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. El protocolo de inmunización puede ser determinado por parte de un experto en la materia basado en protocolos estándar o experimentación de rutina.

Alternativamente, los anticuerpos anti-EGVIII puede ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por células de inmunización en un animal o usando de procedimientos de ADN recombinante. (Véase, por ejemplo, Kohler, et al, 1975; Patente US 4.816.567).

Un anticuerpo anti-EGVIII también puede comprender un anticuerpo humanizado o humano. El término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murinos) que son anticuerpos quiméricos, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras secuencias parciales de unión a antígenos de anticuerpos), que contienen una parte de la secuencia derivada de un anticuerpo no humano. Procedimientos para la humanización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica, tal como se detalla en Jones et al, 1986; Riechmann et al, 1988, y Verhoeyen et al, 1988. Procedimientos para la producción de anticuerpos humanos también son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Jakobovits, A, et al, 1995 y Jakobovits, A, 1995.

VI. Expresión de EGVIII recombinante

Los procedimientos de la invención se basan en el uso de células para expresar EGVIII, sin ningún procedimiento particular de expresión EGVIII necesario.

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La invención proporciona células huésped que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico de codificación de EGVIII. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, etc., son las utilizadas anteriormente por la célula huésped parental antes de la transducción, transformación o transfección y será evidente para los expertos en la materia.

En una aproximación, una célula de hongos filamentosos o célula de levadura se transfecta con un vector de expresión que tiene un promotor o fragmento de promotor biológicamente activo o uno o más (por ejemplo, una serie) de potenciadores que funcionan en la línea de la célula huésped, unido operativamente a un segmento de ADN que codifica EGVIII, de manera que EGVIII se expresa en la línea celular.

A. Construcciones de Ácido Nucleico/Vectores de Expresión

Fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican EGVIII ("secuencias de ácido nucleico de codificación de EGVIII") pueden incorporarse en construcciones o vectores de ácido nucleico heterólogo, capaces de introducción y replicación en un hongo filamentoso o célula de levadura. Los vectores y los procedimientos aquí descritos son adecuados para su uso en células huésped para la expresión de EGVIII. Cualquier vector puede utilizarse siempre que sea replicable y viable en las células en las que se introduce. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos para los expertos en la materia, y están disponibles comercialmente. Los vectores de clonación y expresión también se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel FM et al, 1989, y Strathem et al, 1981.

Vectores de expresión apropiados para los hongos se describen en van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) En: Bennett, J.W. y Lasure, L.L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428. La secuencia de ADN adecuada puede insertarse en un plásmido o vector (denominados en lo sucesivo como "vectores") mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante procedimientos estándar. Estos procedimientos y los procedimientos de subclonación relacionados se consideran dentro del ámbito de aplicación de los conocimientos de los expertos en la materia.

Los hongos filamentosos recombinantes que comprenden la secuencia de codificación para EGVIII pueden producirse mediante la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia de codificación EGVIII en las células de una cepa seleccionada de los hongos filamentosos.

Una vez que se obtiene la forma deseada de una secuencia de ácido nucleico egl8, homólogo, variante o fragmento de la misma, puede modificarse en una variedad de maneras. Cuando la secuencia implica regiones no codificantes de flanqueo, las regiones de flanqueo podrán someterse a resección, mutagénesis, etc. De este modo, pueden realizarse transiciones, transversiones, supresiones e inserciones en la secuencia natural.

Una secuencia de codificación egl8 seleccionada puede insertarse en un vector adecuado de acuerdo con técnicas recombinantes bien conocidas y utilizada para transformar los hongos filamentosos capaces de expresión EGVIII. Debido a la inherente degeneración del código genético, otras secuencias de ácido nucleico que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una equivalente funcional pueden utilizarse para clonar y expresar EGVIII. Por lo tanto, se aprecia que tales sustituciones en la región de codificación están en las variantes de la secuencia objeto de la presente invención. Todas y cada una de estas variantes de la secuencia se puede utilizar de la misma manera tal como se describe en este documento para una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII.

La presente invención también incluye construcciones de ácido nucleico recombinante que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico de codificación EGVIII, tal como se describe anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el que se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia delante o hacia atrás.

Las construcciones de ácido nucleico heterólogo pueden incluir la secuencia de codificación para egl8, o una variante, fragmento o variante de empalme de las mismas: (i) en aislamiento, (ii) en combinación con secuencias de codificación adicionales, tales como proteína de fusión o secuencias de codificación de péptido señal, donde la secuencia de codificación egl8 es la secuencia de codificación dominante; (iii) en combinación con secuencias no codificantes, tal como intrones y elementos de control, tales como promotor y otros elementos de terminación o regiones 5' y/o 3'' no traducidas, eficaces para la expresión de la secuencia de codificación en un huésped apropiado, y/o (iv) en un vector o entorno huésped en el que la secuencia de codificación egl8 es un gen heterólogo.

En un aspecto de la presente invención, una construcción de ácido nucleico heterólogo se utiliza para transferir una secuencia de ácido nucleico de codificación EGVIII en una célula in vitro, con hongos filamentosos establecidos y líneas de levadura preferidas. A largo plazo, se prefiere la producción de expresión estable de alto rendimiento de EGVIII. De ello se deduce que cualquier procedimiento eficaz para generar transformantes estables puede ser utilizado en la práctica de la invención.

Los vectores apropiados están típicamente equipados con una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable, sitios de inserción, y elementos de control adecuados, tales como secuencias de promotor y de terminación. El vector puede comprender secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, secuencias no codificantes, tal como intrones y elementos de control, es decir, elementos promotores y de terminación o regiones 5' y/o 3'' no traducidas, efectivas para la expresión de la secuencia de codificación en las células huésped (y/o en un vector o ambiente de células huésped en la que una secuencia de codificación de antígeno de proteína soluble modificada no se expresa normalmente), unida operativamente a la secuencia de codificación. Un gran número de vectores adecuados y promotores son conocidos para los expertos en la técnica, muchos de los cuales están disponibles comercialmente y/o se describen en Sambrook, et al, (supra).

Promotores de ejemplo incluyen promotores constituyentes y promotores inducibles, ejemplos de los cuales incluyen un promotor CMV, un promotor SV40 temprano, un promotor RSV, un promotor EF-1\alpha, un promotor que contiene el elemento de respuesta tet (TRE) en el sistema tet-on, o tet-off tal como se describe (ClonTech y BASF), el promotor actina beta y el promotor metalotionina que puede estimularse mediante la adición de sales de metales determinados. Una secuencia promotora es una secuencia de ADN que es reconocido por el hongo filamentoso particular para propósitos de expresión. Está unido operativamente a la secuencia de ADN que codifica un polipéptido EGVIII. Esa conexión comprende la posición del promotor en relación con el codón de iniciación de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido EGVIII en los vectores de expresión descritos. La secuencia promotora contiene la transcripción y la secuencia de control de la traducción que median en la expresión del polipéptido EGVIII. Ejemplos incluyen los promotores de Aspergillus niger, A awamori o A. oryzae glucoamilasa, alfa-amilasa, o genes que codifican la alfa-glucosidasa, los genes de A. nidulans GPDA o trpC, los genes de Neurospora crassa cbh1 o los genes TRP1, los genes que codifican A. niger o Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, los genes T. reesei cbh1, cbh2, egl1, egl2, u otros genes que codifican celulasa.

La elección del marcador seleccionable adecuado dependerá de la célula huésped, y los marcadores adecuados para los diferentes huéspedes son bien conocidos en la técnica. Genes marcadores seleccionables típicos incluyen argB de A. nidulans o T. reesei, amdS de A. nidulans, pyr4 de Neurospora crassa o T. reesei, pyrG de Aspergillus niger y A. nidulans. Marcadores seleccionables de ejemplo adicionales incluyen, pero no se limitan a trpc, trp1, oliC31, niaD o leu2, que se incluyen en construcciones de ácido nucleico heterólogo utilizadas para transformar una cepa mutante tal como trp-, pyr-, leu-, y similares.

Estos marcadores seleccionables confieren a los transformantes la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos. Por ejemplo, el gen amdS de T. reesei que codifica la enzima acetamidasa que permite que las células transformantes crezcan en acetamida como fuente de nitrógeno. El marcador de selección (pyrG por ejemplo) puede restaurar la capacidad de una cepa mutante auxotrófica a crecer en un medio mínimo selectivo o el marcador seleccionable (por ejemplo, olic31) puede conferir a los transformantes la capacidad de crecer en presencia de un fármaco inhibidor o antibiótico.

La secuencia de codificación de marcador seleccionable se clona en cualquier plásmido adecuado utilizando procedimientos generalmente utilizados en la técnica. Plásmidos de ejemplo incluyen pUC18, pBR322, y pUC100.

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican con detalle en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al, 1989; Freshney, 1987; Ausubel, et al, 1993, y Coligan et al, 1991.

B. Células huésped y condiciones de cultivo para una producción de EGVIII mejorada (i) Hongos filamentosos

Así, la presente invención proporciona hongos filamentosos que comprenden células que han sido modificadas, seleccionadas y cultivadas de una manera efectiva para resultar en una producción de EGVIII mejorada o expresión respecto a los correspondientes hongos parenterales no transformados.

Ejemplos de especies de hongos filamentosos parenterales que pueden ser tratados y/o modificados para la expresión de EGVIII mejorada incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, longibrachiatum Trichoderma, Trichoderma viride, Trichoderma koningii; Penicillium sp. Sp Humicola., incluyendo Humicola insolens; Aspergillus sp., Sp Chrysosporium., Fusarium sp., Hypocrea sp., y Emericella sp.

Las células que expresan EGVIII se cultivan en condiciones que habitualmente se emplean para el cultivo de la línea fúngica parenteral. Generalmente, las células son cultivadas en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes, tal como se describe en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 y Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997. Las condiciones de cultivo son también estándar, por ejemplo, los cultivos se incuban a 28ºC en cultivos agitadores o fermentadores hasta que se alcanzan los niveles deseados de expresión de EGVIII.

Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso determinado se pueden encontrar en la literatura científica y/o de la fuente de los hongos tal como la American Type Culture Collection (ATCC; "http://www.atcc.org/"). Después de establecer un crecimiento fúngico, las células están expuestas a condiciones efectivas para causar o permitir la sobre-expresión de EGVIII.

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En los casos en los que una secuencia que codifica EGVIII está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azúcar, sal de metal o antibióticos, se añade al medio en una concentración efectiva para inducir un alto nivel de expresión EGVIII.

(ii) Levadura

La presente invención también contempla el uso de la levadura como célula huésped para la producción de EGVIII. Varios otros genes que codifican las enzimas hidrolíticas se han expresado en diversas cepas de la levadura S. cerevisiae. Estos incluyen secuencias que codifican dos endoglucanasas (Penttila et al. 1987), dos celobiohidrolasas (Penttila et al. 1988) y una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei (Cummings y Fowler, 1996), una xilanasa de Pullulans Aureobasidlium (Li y Ljungdahl, 1996), un alfa-amilasa de trigo (Rothstein, et al. 1987), etc. Además, un casete de genes de celulasa que codifica la Fibrisolvens Butyrivibrio endo-[beta]-1,4-glucanasa (END1), Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBH1), Flavefaciens Ruminococcus cellodextrinase (CEL1) y Fibrilizer Endomyces Celobiasa (Bgl1) fue expresado con éxito en una cepa de laboratorio de S. cerevisiae (Van Rensburg et al. 1998).

C. Introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII en células huésped

La invención también proporciona células y composiciones celulares que han sido genéticamente modificadas para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII proporciona de manera exógena. Una célula parental o línea celular puede modificarse genéticamente (es decir, transducirse, transformarse o transfectarse) con un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede ser, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc., tal como se describe anteriormente.

Varios procedimientos pueden utilizarse para suministrar un vector de expresión en células in vitro. Después de construir un vector adecuado, se utiliza para transformar las cepas de hongos o levaduras. Procedimientos generales para la introducción de ácidos nucleicos en células de expresión heterólogas de secuencias de ácidos nucleicos son conocidas para los expertos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, electroporación, microinyección nuclear o microinyección directa en las células individuales, fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, uso de policationes, por ejemplo, polibreno o poliornitina; fusión de membrana con liposomas, lipofectamina o transfección mediada con lipofección; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN; incubación con precipitado de fosfato de calcio-ADN; transfección mediada con DEAE-dextrano, infección con ácidos nucleicos virales modificado, y similares.

Los procedimientos preferidos para la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo (vector de expresión) en hongos filamentosos (por ejemplo, T. reesei) incluyen, pero no se limitan a, la utilización de una pistola de partículas o genes, permeabilización de las paredes celulares de hongos filamentosos antes del proceso de transformación (por ejemplo, por el uso de altas concentraciones de álcali, por ejemplo, 0,05 M a 0,4 M CACl_{2} o acetato de litio), fusión de protoplastos o transformación mediada por agrobacterias. Un procedimiento de ejemplo para la transformación de hongos filamentosos mediante el tratamiento de protoplastos o esferoplastos con polietileno glicol y CaCl_{2} se describe en Campbell, E.I. et al. Curr. Genet. 16:53-56, 1989 y Penttila, M. et al., Gene, 63:11-22, 1988.

Además, las construcciones de ácido nucleico heterólogo que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII se pueden transcribir in vitro, y el ARN resultante introducido en la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, por ejemplo, mediante inyección.

Después de la introducción de una construcción de ácido nucleico heterólogo que comprende la secuencia de codificación para egl8, las células modificadas genéticamente pueden ser cultivadas en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para la activación de los promotores, seleccionando transformantes o amplificando la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica EGVIII. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas anteriormente para la célula huésped seleccionada para la expresión, y será evidente para los expertos en la materia.

La progenie de las células en las que estas construcciones de ácidos nucleicos heterólogos se han introducido generalmente se considera que comprenden la la secuencia de ácidos nucleicos que codifican EGVIII en la construcción de ácido nucleico heterólogo.

La invención también incluye nuevos y útiles transformantes de hongos filamentosos tales como Trichoderma reesei para su uso en la producción de composiciones de celulasa fúngicas. La invención incluye transformantes de hongos filamentosos, especialmente hongos que comprenden la secuencia de codificación egl8, que comprende una forma modificada de la secuencia de codificación egl8 o la supresión de la secuencia de codificación egl8.

Los transformantes estables de hongos filamentosos pueden distinguirse generalmente de los transformantes inestables por su índice de crecimiento más rápido y la formación de colonias circulares con un contorno liso más que irregular en un medio de cultivo sólido. Además, en algunos casos, una prueba adicional de la estabilidad se puede hacer mediante el crecimiento de los transformantes sobre un medio sólido no selectivo, cosechando las esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que posteriormente germinarán y crecerán en medio selectivo.

VII. Análisis de secuencias de codificación de ácido nucleico EGVIII y/o expresión de proteína

Para evaluar la expresión de EGVIII mediante una línea celular que ha sido transformada con una construcción de ácido nucleico que codifica EGVIII, los ensayos pueden realizarse a nivel de proteínas, a nivel de ARN o mediante el uso de bioensayos funcionales particulares de la actividad y/o la producción de endoglucanasa.

En una aplicación de ejemplo de las secuencias de ácido nucleico egl8 y de proteínas aquí descritas, una cepa modificada genéticamente de hongos filamentosos, por ejemplo, Trichoderma reesei, está diseñada para producir una mayor cantidad de EGVIII. Estos hongos filamentosos genéticamente modificados serían útiles para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica. En una aproximación, esto se logra mediante la introducción de la secuencia de codificación para egl8 en un huésped adecuado, por ejemplo, un hongo filamentoso tal como Trichoderma reesei.

En consecuencia, la invención incluye procedimientos para expresar EGVIII en un hongo filamentos u otro huésped adecuado mediante la introducción de un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN que codifica EGVIII en las células de hongos filamentosos u otro huésped adecuado.

En otro aspecto, la invención incluye procedimientos para modificar la expresión de EGVIII en un hongo filamentos u otro huésped adecuado. Dicha modificación incluye una reducción o eliminación de la expresión, o la expresión de una forma alterada de EGVIII. Una forma alterada de EGVIII puede tener una secuencia de aminoácidos alterada o una secuencia de ácidos nucleicos alterada.

En general, los ensayos utilizados para analizar la expresión de EGVIII incluyen Northern blotting, dot blotting (análisis de ADN o ARN), RT-PCR (reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa), o hibridación in situ, utilizando una sonda debidamente marcada (basada en la secuencia de codificación de ácido nucleico) y Southern blotting y autorradiografía convencionales.

Además, la producción y/o la expresión de EGVIII se pueden medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos para la actividad, expresión y/o producción de la endoglucanasa. Estas determinaciones se describen, por ejemplo, en Shoemaker, S.P. y Brown, R.D. Jr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978, 523:133-146; Schulein (1988) y patente US 5.246.853 y 5.475.101. La capacidad de EGVIII para hidrolizar sustratos aislados solubles e insolubles se puede medir mediante los ensayos descritos en Suurnakki et al. (2000) y Ortega et al. (2001). Los sustratos útiles para ensayar las actividades de celobiohidrolasa, endoglucanasa o \beta-glucosidasa, incluyen celulosa cristalina, papel de filtro, celulosa hinchada con ácido fosfórico, hidroxietil celulosa, carboximetilcelulosa, celooligosacáridos, lactosido metilumbeliferil, celobiosido metilumbeliferil, lactosido ortonitrofenil, lactosido paranitrofenil, celobiosido ortonitrofenil, celobiosido paranitrofenil, glucósido ortonitrofenil, glucósido paranitrofenil, metilumbeliferil glucósido.

Además, la expresión de proteínas se puede evaluar mediante procedimientos inmunológicos, tal como tinción inmunohistoquímica de células, cortes de tejido o inmunoensayo del medio de cultivo de tejidos, por ejemplo, mediante Western blot o ELISA. Los inmunoensayos pueden utilizarse para evaluar cualitativa y cuantitativamente la expresión de EGVIII. Los detalles de estos procedimientos son conocidos por los expertos en la técnica y los reactivos para la práctica de muchos procedimientos están disponibles comercialmente.

Una forma purificada de EGVIII puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales o policlonales o específicos para la proteína expresada para su uso en inmunoensayos diferentes. (Véase, por ejemplo, Hu et al, 1991). Ensayos de ejemplo incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, Western blot, ensayos de inmunofluorescencia indirecta y similares. En general, se pueden utilizar anticuerpos y/o equipos disponibles comercialmente para el inmunoensayo cuantitativo del nivel de expresión de las proteínas de endoglucanasa.

VIII. Aislamiento y purificación de proteínas recombinantes EGVIII

En general, una proteína EGVIII producida en cultivo celular es secretada en el medio y se puede purificar o aislar, por ejemplo, eliminando los componentes no deseados del medio de cultivo celular. Sin embargo, en algunos casos, una proteína EGVIII pueden producirse en una forma celular que requiere la recuperación de un lisado celular. En tales casos, la proteína EGVIII se purifica de las células en las que se producen utilizando técnicas habitualmente empleadas por los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no limitados a, cromatografía de afinidad (Tilbeurgh et al. 1984), procedimientos cromatográficos de intercambio de iones (Goyal et al, 1991; Fliess et al, 1983; Bhikhabhai et al. 1984; Ellouz et al. 1987), incluido el intercambio iónico utilizando materiales con alto poder de resolución (Medve et al, 1998), cromatografía de interacción hidrofóbica (Tomaz y Queiroz, 1999), y partición de dos fases (Brumbauer, et al. 1999).

Típicamente, la proteína EGVIII se fracciona para separar las proteínas que tienen propiedades seleccionadas, tales como la afinidad de unión a agentes de unión particulares, por ejemplo, anticuerpos o receptores, o que tienen un intervalo de peso molecular seleccionado, o un intervalo de puntos isoeléctricos.

Una vez que se consigue la expresión de una proteína EGVIII determinada, la proteína EGVIII así producida se purifica a partir de células o cultivo celular. Procedimientos de ejemplo adecuados para esta purificación incluyen los siguientes: cromatografía de columna de afinidad de anticuerpos, cromatografía de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC, cromatografía de sílice o en una resina de intercambio catiónico, como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Varios procedimientos de purificación de proteínas pueden utilizarse y estos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, 1990; Scopes, 1982. La(s) fase(s) de purificación seleccionada(s) dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y de la proteína particular producida.

IX. Utilidad de egl8 y EGVIII

Se puede apreciar que el nucleótido egl8, la proteína EGVIII y las composiciones que comprenden actividad de la proteína EGVIII encuentran utilidad en aplicaciones de gran variedad, algunas de las cuales se describen a continuación.

Las nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que comprenden cantidades variables de celulasas de tipo CBH, tipo EG y tipo BG encuentran utilidad en composiciones detergentes que presentan una capacidad de limpieza mejorada, función como agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodón (por ejemplo, "lavado de piedra" o "biopulido"), en las composiciones para degradar la pasta de madera en azúcares (por ejemplo, para la producción de bioetanol), y/o en composiciones de alimentación. El aislamiento y la caracterización de la celulasa de cada tipo proporcionan la capacidad de controlar los aspectos de estas composiciones.

En una aproximación preferida, la celulasa de la invención encuentra utilidad en las composiciones de detergente o en el tratamiento de tejidos para mejorar el tacto y la apariencia.

Como el índice de hidrólisis de los productos celulósicos podrá incrementarse mediante el uso de un transformante que tenga por lo menos una copia adicional del gen egl8 insertado en el genoma, los productos que contienen celulosa o heteroglicanos pueden degradarse a un ritmo más rápido y en mayor medida. Los productos hechos a base de celulosa, tal como papel, algodón, pañales de celulosa y similares se puede degradar de manera más eficiente en un vertedero. Así, el producto de la fermentación que se puede obtener a partir de los transformantes o los transformantes en solitario pueden utilizarse en composiciones para acelerar la descomposición mediante licuefacción de una gran variedad de productos de celulosa que se añaden a los vertederos de hacinamiento.

La sacarificación y la fermentación separada es un proceso mediante el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, residuos de maíz, se convierte en glucosa y, posteriormente, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. La sacarificación y fermentación simultánea es un proceso mediante el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, residuos de maíz, se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. Por lo tanto, en otra aproximación preferida, el tipo de celulasa glucosidasa de la invención encuentra utilidad en la degradación de la biomasa en etanol. La producción de etanol a partir de fuentes fácilmente disponibles de celulosa proporciona una fuente de combustible renovable estable.

La materia prima con base de celulosa comprende residuos agrícolas, pastos y bosques y otra biomasa de bajo valor, tal como residuos municipales (por ejemplo, reciclado de papel, recortes de jardín, etc.). El etanol puede ser producido a partir de la fermentación de cualquiera de estas materias primas celulósicas. Sin embargo, la celulosa debe convertirse primero en azúcares, antes de que pueda haber la conversión en etanol.

Una gran variedad de materias primas se pueden utilizar con la endoglucanasa inventiva y la seleccionada para su uso puede depender de la región en la que la conversión se está haciendo. Por ejemplo, en el medio oeste de Estados Unidos los residuos agrícolas tales como paja del trigo, rastrojos de maíz y bagazo pueden predominar, mientras que en California puede predominar la paja de arroz de. Sin embargo, debe entenderse que cualquier biomasa disponible de celulosa se puede utilizar en cualquier región.

Una composición de celulasa que contenga una cantidad mayor de endoglucanasa encuentra utilidad en la producción de etanol. El etanol a partir de este proceso también se puede utilizar como potenciador de octanaje o directamente como combustible en lugar de la gasolina, lo que es ventajoso porque el etanol como fuente de combustible es más ecológico que los productos derivados del petróleo. Es sabido que el uso de etanol mejorará la calidad del aire y posiblemente reducirá los niveles locales de ozono y de contaminación. Por otra parte, la utilización de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia estratégica en la amortiguación del impacto de los cambios repentinos en las energías no renovables y los suministros petroquímicos.

El etanol puede producirse a través de procesos de sacarificación y fermentación de biomasa de celulosa, tal como árboles, plantas herbáceas, residuos sólidos municipales y residuos agrícolas y forestales. Sin embargo, la proporción de las enzimas de celulasa individuales con una mezcla celulasa producida de manera natural mediante un microbio puede no ser la más eficaz para la rápida conversión de la celulosa de la biomasa en glucosa. Se sabe que las endoglucanasas actúan para producir nuevos extremos en la cadena de celulosa que por sí mismos son sustratos para la acción de celobiohidrolasas y mejorar así la eficiencia de la hidrólisis del sistema de celulasa entero. Por lo tanto, la utilización una actividad de endoglucanasa aumentada u optimizada mejoraría considerablemente la producción de etanol.

Así, la endoglucanasa inventiva encuentra uso en la hidrólisis de la celulosa en sus componentes de azúcar. En una realización, la endoglucanasa se añade a la biomasa antes de la adición de un organismo de fermentación. En una segunda realización, la endoglucanasa se añade a la biomasa al mismo tiempo como un organismo de fermentación. Opcionalmente, puede haber otros componentes de celulasa presentes en cualquier realización.

En otra realización, la materia prima de celulosa se puede tratar previamente. El tratamiento previo puede ser por la temperatura elevada y la adición de cualquiera de una solución de ácido diluido, ácido concentrado o solución álcali diluida. La solución de tratamiento previo se añade durante un tiempo suficiente para, por lo menos parcialmente, hidrolizar los componentes de la hemicelulosa y luego neutralizalos.

En una aproximación alternativa, una composición de celulasa que es deficiente o libre de endoglucanasa puede utilizarse. La supresión del gen de la endoglucanasa de esta invención sería particularmente útil en la preparación de composiciones de celulasa para su uso en detergentes. Además, estas composiciones son útiles para la producción de celooligosacáridos. La supresión de los genes egl8 de las cepas T. reesei sería particularmente útil en la preparación de composiciones de celulasa para su uso en detergentes y en celooligosacáridos de aislamiento. Las enzimas de celulasa se han utilizado en una variedad de composiciones de detergente para lavar ropa enzimáticamente. Sin embargo, se sabe en esta técnica que el uso de enzimas celulasas puede impartir degradación a las fibras de celulosa en la ropa. Una posibilidad para disminuir el efecto de la degradación es producir un detergente que no contenga endoglucanasa. Por lo tanto, la supresión de esta proteína haría que el sistema de celulasa inhiba los otros componentes a través de la acumulación de celobiosa. Los microorganismos modificados de la presente invención son especialmente adecuados para la preparación de estas composiciones, porque el gen egl8 se puede eliminar dejando a los restantes componentes CBH y EG, resultado en la limpieza y mejora de los beneficios de ablandamiento en la composición, sin efectos de degradación.

Las composiciones de detergente aquí descritas pueden emplear, además de la composición de celulasa (independientemente del contenido de endoglucanasa, es decir, endoglucanasa libres, endoglucanasa sustancialmente libre, o endoglucanasa mejorada), un tensioactivo, tal como como sulfactantes aniónicos, no iónicos y amfolíticos, una hidrolasa, agentes de construcción, agentes blanqueadores, agentes de tintado azul y tintes fluorescentes, inhibidores de la aglomeración, solubilizantes, sulfactantes catiónicos y similares. Todos estos componentes son conocidos en la técnica de los detergentes. La composición de celulasa tal como se describe anteriormente se puede añadir a la composición de detergente, ya sea en un diluyente líquido, en gránulos, en emulsiones, en geles, en pastas, y similares. Estas formas son bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Cuando se utiliza una composición de detergente sólido, la composición de celulasa se formula preferentemente como gránulos. Preferentemente, los gránulos pueden formularse de manera que contengan un agente protector de celulasa. Para una descripción más completa, véase la patente US 6162782, titulada "Composiciones de detergentes que contienen compuestos de celulasa deficientes en componentes CBH de tipo I".

En otra realización, las composiciones de detergentes también pueden contener mayores niveles de endoglucanasa o endoglucanasa alterada. En este sentido, realmente depende del tipo de producto que se desea utilizar en composiciones detergentes para dar los efectos adecuados.

Preferiblemente, las composiciones de celulasas se utilizan entre aproximadamente un 0,00005 por ciento en peso y aproximadamente un 5 por ciento en peso en relación a la composición total de detergente. Más preferentemente, las composiciones de celulasas se utilizan entre aproximadamente un 0,0002 por ciento en peso y aproximadamente un 2 por ciento en peso en relación al total de la composición del detergente.

Las porciones de la secuencia de ácido nucleico egl8 que son capaces de unirse a la celulosa pueden utilizarse para generar proteínas de superficie quimérica bacteriana, lo que permite la inmovilización de la célula completa en filtros de celulosa u otros soportes sólidos fibrosos, tal como se describe en Lehtio et al. 2001.

Además, la secuencia de ácidos nucleicos egl8 encuentra utilidad en la identificación y caracterización de las secuencias de ácido nucleico relacionadas. Una serie de técnicas útiles para determinar (predecir o confirmar) la función de genes relacionados o productos génicos incluyen, pero no están limitados a: (A) análisis de ADN/ARN, tal como (1) sobreexpresión, expresión ectópica y expresión en otras especies, (2) "knock-out" génico (genética inversa, knock-out dirigido, silenciado génico inducido viral (VIGS, ver Baulcombe, 1999), (3) análisis del estado de metilación del gen, especialmente flanqueo de regiones reguladoras, y (4) hibridación in situ; (B) análisis de productos génicos tales como (1) expresión de proteína recombinante, (2) producción de antisueros, (3) inmunolocalización; (4) ensayos bioquímicos para la actividad catalítica o de otra índole; (5) estado de fosforilación; y (6) interacción con otras proteínas de levadura a través de análisis de dos híbridos; (C) análisis de vías, tal como la colocación de un gen o producto génico dentro de un producto bioquímico particular o vía de señalización basado en su fenotipo o su fenotipo de sobreexpresión o mediante homología de secuencia con los genes relacionados; y (D) otros análisis que también se pueden realizar para determinar o confirmar la participación del gen aislado y de su producto en una vía metabólicas o de señalización particular, y ayudar a determinar la función del gen.

Endoglucanasas y beta-glucosidasas pueden ser responsables de la producción de los disacáridos, tal como soforosa, de cellooligosacáridos y glucosa mediante reacciones de transglicosilación. La soforosa se sabe que es un inductor muy potente de expresión de los genes de las celulasas (Ilmen, M. et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306 y sus referencias). De esta manera, EGs y BGLs pueden desempeñar un papel importante en el proceso de inducción de la expresión génica de las celulasas. La sobreexpresión de determinados EGs o BGLs en una cepa fúngica puede provocar a una mayor productividad general de celulasa mediante esa cepa.

A. Homología con secuencias conocidas

La función de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica EGVIII puede determinarse mediante homología con genes conocidos que tienen una función particular. Por ejemplo, una comparación de la secuencia de codificación de una molécula de ácido nucleico identificada con bases de datos públicas de secuencias de ácidos nucleicos se utiliza para confirmar la función por homología con genes conocidos o por extensión de la secuencia de ácido nucleico identificada.

El término "% homología" se utiliza aquí de manera intercambiable con el término "% identidad" y se refiere al nivel de ácido nucleico o identidad de secuencia de ácido amino entre la secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII o la secuencia de aminoácidos EGVIII, cuando son alineados mediante un programa de alineación de secuencias.

Por ejemplo, tal como aquí se utiliza, el 80% de homología significa lo mismo que el 80% de identidad de secuencia determinada mediante un algoritmo definido, y en consecuencia un homólogo de una secuencia dada tiene más de 80% de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Los niveles de ejemplo de la secuencia de identidad incluyen, pero no están limitados a, 80, 85, 90, 95, 98% o más de identidad de secuencia de una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia de codificación para egl8, tal como se describe aquí.

Los programas de ordenador ejemplar que se pueden utilizar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el conjunto de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, a disposición del público en Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Véase también, Altschul, et al, 1990 y Altschul, et al. 1997.

Las búsquedas de secuencias se realizan típicamente utilizando el programa BLASTN cuando se evalúa una determinada secuencia de ácido nucleico en relación con las secuencias de ácido nucleico en las secuencias de ADN GenBank y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX se prefiere para la búsqueda de secuencias de ácidos nucleicos que se han traducido en todos los marcos de lectura en contra de las secuencias de aminoácidos en las secuencias de proteínas GenBank y otras bases de datos públicas. BLASTN y BLASTX se ejecutan utilizando los parámetros por defecto de una sanción de separación abierta 11,0, y una sanción de separación ampliada de 1.0, y utilizan matriz BLOSUM-62. (Véase, por ejemplo, Altschul, et al., 1997).

Una alineación preferida de secuencias seleccionadas para determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, se realiza utilizando, por ejemplo, el programa de CLUSTAL-W en MacVector versión 6.5, que funciona con los parámetros por defecto, incluyendo una sanción de separación abierta de 10,0, una sanción de separación extendida de 0,1, y una matriz de similitud 30 BLOSUM.

En una aproximación de ejemplo, la extensión de secuencia de ácido nucleico que codifica egl8 se puede realizar utilizando procedimientos convencionales de extensión tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores egl8 y sustancias intermedias de procesamiento de ARNm que pueden no haber sido transcritas de manera inversa en ADN y/o identificar ORFs que codifican una proteína de longitud completa.

En otro aspecto, la presente invención incluye la secuencia de nucleótidos total o parcial de la secuencia del ácido nucleico de egl8 para su uso como sonda. Esta sonda puede utilizarse para identificar y clonar secuencias homólogas de ácido nucleico de los organismos relacionados.

El cribado de una librería de ADNc o genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al. (1989). Las condiciones de hibridación, incluyendo una estringencia moderada y una estringencia alta, se proporcionan en Sambrook et al., supra.

Las sondas o porciones de las mismas también se pueden utilizar en técnicas PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de las secuencias egl8 muy relacionadas. Cuando las secuencias egl8 están destinadas para utilizarse como sondas, se puede utilizar una porción particular de una secuencia que codifica EGVIII, por ejemplo, una porción muy conservada de la secuencia de codificación.

Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos egl8 puede utilizarse como sonda de hibridación para una librería de ADNc para aislar los genes, por ejemplo, los que codifican variantes de origen natural de EGVIII de otras especies de hongos, bacterias o plantas, que tienen un nivel deseado de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos egl8 descrita en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). Las sondas de ejemplo tienen una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases.

B. Análisis de dos híbridos

Las proteínas identificadas mediante la presente invención pueden utilizarse en el sistema de dos híbridos de levadura para "capturar" la proteína que se une a proteínas que son proteínas de vía de señal putativa. El sistema de dos híbridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989). En resumen, en un sistema de dos híbridos, se construye una fusión de un dominio egl8 de unión de ADN (por ejemplo, fusión GAL4-egl8) y se transfecta en células de levadura. Todo el gen egl8, o subregiones del gen egl8, pueden utilizarse. Una segunda construcción que contiene la librería de potenciales socios de unión fusionados con el dominio de activación de ADN se co-transfecta. Las proteínas que albergan co-transformantes de levadura que se unen a la proteína EGVIII se identifican mediante, por ejemplo, la producción de beta-galactosidasa o luciferasa (un cribado), o mediante la supervivencia en placas a las que les falta de un nutriente esencial (una selección), como sea apropiado para los vectores usados.

C. Análisis de Microarray

Además, el análisis de microarrays, también conocido como perfil de expresión o perfil de transcripción, se puede utilizar para evaluar simultáneamente la presencia o la expresión de secuencias de ADN determinadas, o cambios en la expresión de muchos genes diferentes. En una aproximación, un gran conjunto de secuencias de ADN (sondas), usualmente una amplia gama de etiquetas de secuencias expresadas, ADNc, fragmentos de ADNc, o oligonucleótidos de secuencia específica, se colocan sobre un soporte sólido tal como una lámina de vidrio o membrana de nylon. El objetivo etiquetado para la hibridación con las sondas se genera mediante el aislamiento de ARNm de control y el tejido inducido, a continuación, cada grupo de ARNm se etiqueta, ya sea directamente o a través de un ADNc o ARNc intermedio, con un marcador distinto, por lo general un tinte fluorescente. El chip se hibrida con las sondas complejas, y la relativa intensidad de la señal de hibridación asociada a cada ubicación en la matriz puede ser cuantificada para cada tinte marcador. Se pueden medir las diferencias en la expresión entre los estados de control e inducido como proporción de la señal entre los dos tintes marcadores. (Véase Baldwin, D et al, 1999.)

Pueden realizarse análisis de microchips del organismo fuente del cual se derivó egl8, para facilitar la comprensión de la función de los genes mediante la identificación de otros genes que son regulados de forma coordinada, como consecuencia de la sobreexpresión de egl8. La identidad de los genes regulados de forma coordinada puede ayudar a colocar el gen egl8 en una ruta particular. Alternativamente, este análisis puede ser usado para identificar otros genes implicados en la misma ruta utilizando el análisis de microchips.

Aunque la invención ha sido descrita con referencia a procedimientos y realizaciones específicas, se aprecia que varias modificaciones y los cambios pueden realizarse sin apartarse de la invención.

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Ejemplo 1

En una aproximación de ejemplo, un fragmento de ADNc para su uso como sonda se aísla mediante la extracción de ARN total de micelios de una cepa de T. reesei cultivadas en condiciones conocidas que inducen la producción de celulasa y la obtención de la fracción poliadenilada (poliA) de la misma. El ARN poliA se utiliza para producir un conjunto de ADNc que luego es amplificado utilizando cebadores específicos basados en la secuencia de ácido nucleico egl8 aquí proporcionada.

El ARN total se aísla de los micelios utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en Timberlake et al., 1981; Maniatis, et al., 1989; Ausubel, et al. 1993 y Sambrook et al, 1989, cada uno de los cuales ha sido expresamente incorporado por referencia en este documento. Una vez aislados, se realizan Northern blots para confirmar la expresión de la celulasa y seleccionar un tiempo óptimo para la inducción de la expresión de la celulasa y el aislamiento del ARN correspondiente.

El ARN mensajero (ARNm), que tiene una cola poli (A) en el extremo 3', se puede purificar a partir de ARN total, utilizando procedimientos conocidos en la técnica.

El ARN T. reesei se utiliza como plantilla para RT-PCR, utilizando los procedimientos conocidos en la técnica (Loftus, J. et al., Science, 249:915-918, 1990). Durante este procedimiento, el ARNm se transcribe inverso para producir una primera cepa de ADNc. El ADNc sirve posteriormente como plantilla para la amplificación mediante PCR de secuencias de ADNc egl8 utilizando cebadores específicos de olionucleótidos diseñados según SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 4.

TABLA 1 Secuencias proporcionadas en soporte de la invención

1

3

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US 5475101 A [0010] [0153]

\bullet GB 2095275 A [0009]

\bullet EP 0562003 A [0073]

\bullet GB 2094826 A [0009]

\bullet US 4822516 A [0075]

\bullet US 5648263 A [0009] [0074]

\bullet WO 9104673 A [0076]

\bullet US 5691178 A [0009] [0074]

\bullet US 4816567 A [0115]

\bullet US 5776757 A [0009] [0074]

\bullet US 5246853 A [0153]

\bullet GB 1358599 A [0009]

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Claims (30)

1. Polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido EGVIII que tiene la actividad biológica de una endoglucanasa, que tiene por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2 o en la SEQ ID NO: 2 en toda la longitud de la secuencia de la Figura 2 o SEQ ID NO: 2;

(b) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO: 4, o su complemento; y

(c) una secuencia de ácido nucleico que hibrida, bajo condiciones de alta estringencia a la secuencia presentada como SEQ ID NO: 4, o el complemento o un fragmento de la misma, en el que dicho polinucleótido aislado codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de una endoglucanasa.

2. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1(a) o (b).

3. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polinucleótido es una molécula de ARN.

4. Polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, que codifica una enzima que tiene actividad de endoglucanasa, en donde la enzima se deriva de una fuente de Trichoderma.

5. Polinucleótido aislado según la reivindicación 4, en el que la enzima se deriva de Trichoderma reesei.

6. Construcción de expresión que incluye una secuencia de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1 ó 2.

7. Vector que incluye la construcción de expresión de la reivindicación 6.

8. Vector que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 1 ó 2, enlazado de manera operativa con secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

9. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 7 o la reivindicación 8.

10. Célula huésped recombinante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2.

11. Célula huésped según la reivindicación 9 ó 10, que es una célula procariota o una célula eucariota.

12. Polipéptido EGVIII aislado con la actividad biológica de una endoglucanasa, que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 2 o SEQ ID NO: 2 en toda la longitud de la secuencia de la Figura 2 o SEQ ID NO: 2; y

(b) un fragmento biológicamente activo substancialmente purificado de la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO: 2.

13. Polipéptido EGVIII aislado según la reivindicación 12(a).

14. Célula huésped recombinante que comprende una supresión o inserción u otra alteración en un gen egl8 que tiene una secuencia de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 1, cuya eliminación, inserción u otra alteración inactiva el gen y evita la producción de polipéptido EGVIII.

15. Oligonucleótido antisentido complementario a un ARN mensajero que codifica un polipéptido EGVIII que tiene la secuencia presentada como SEQ ID NO: 2, donde bajo la exposición a una célula huésped productora de endoglucanasa, dicho oligonucleótido disminuye o inhibe la producción de endoglucanasa por parte de dicha célula huésped.

16. Oligonucleótido antisentido según la reivindicación 15, en el que la célula huésped es un hongo filamentoso.

17. Composición detergente, comprendiendo dicha composición un polipéptido según la reivindicación 12 ó 13.

18. Procedimiento para expresar EGVIII en una celda, comprendiendo el procedimiento:

(i) proporcionar células del huésped que han sido transducidas, transformadas o transfectadas con un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII según la reivindicación 1 ó 2;

(ii) cultivar las células.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, donde la secuencia de ácido nucleico que codifica EGVIII incluye una secuencia de codificación de un péptido de señal adicional.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que las células huésped son Aspergillus sp.

21. Procedimiento según la reivindicación 18, que también comprende:

(a) transformar de manera estable las células huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2 para proporcionar las células huésped en (i), y

(b) recuperar dicha endoglucanasa de las células cultivadas en (ii).

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en donde la célula huésped es un hongo filamentoso o célula de levadura.

23. Procedimiento para convertir celulosa en etanol, comprendiendo el procedimiento la utilización de una composición enzimática que comprende un polipéptido EGVIII según la reivindicación 12 ó 13 para hidrolizar la celulosa en sus componentes de azúcar.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en donde la composición se enriquece en EGVIII.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que la composición que comprende EGVIII se añade a la biomasa de celulosa antes de la adición de un organismo de fermentación.

26. Procedimiento según la reivindicación 23 ó 24, en el que la composición que comprende EGVIII se añade a la biomasa de celulosa al mismo tiempo como un organismo de fermentación.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, que comprende una sacarificación y fermentación simultáneas mediante las cuales la celulosa presente en la biomasa se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, en el que la composición también comprende además enzimas celulasas adicionales seleccionados entre: otras endoglucanasas; beta-glucosidasas y/o celobiohidrolasas.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, en el que la celulosa se proporciona mediante: pulpa de madera, papel, algodón, pañales de celulosa, residuos de maíz, árboles, plantas herbáceas, residuos sólidos urbanos o residuos agrícolas y forestales.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, en el que la celulosa se proporciona mediante una materia prima celulósica que se trata previamente mediante un tratamiento previo seleccionado entre: temperatura elevada; la adición de un ácido diluido, ácido concentrado o solución álcali diluida.