ES2338134T3 - Peptidos antibacterianos y analogos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un péptido antibacteriano constituido por una de las siguientes secuencias de aminoácidos desde el extremo amino al carboxílico: QEKIRVRLSA, QAKIRVRLSA, QKKIRVRLSA, KIRVRLSA, AKKIRVRLSA, QAKIRVRLSA, QKAIRVRLSA, QKKARVRLSA, QKKIAVRLSA, QKKIRARLSA, QKKIRVALSA, QKKIRVRASA, QKKIRVRLAA, QKAIRVRLSA, QRKIRVRLSA, QKRIRVRLSA, QRRIRVRLSA.
Description
Péptidos antibacterianos y análogos de los
mismos.
La presente invención se refiere a péptidos
antibacterianos y a sus análogos multiméricos, con amplio intervalo
de acción y baja actividad hemolítica. En particular, la invención
se refiere a moléculas peptídicas que presentan una alta actividad
antimicrobiana frente a numerosas especies bacterianas, con una
citotoxicidad reducida y un bajo índice de hemólisis. En
particular, la invención se refiere a moléculas peptídicas que
presentan una alta actividad antimicrobiana frente a numerosas
especies bacterianas, con una citotoxicidad reducida y un bajo
índice de hemólisis. Las moléculas de la invención se pueden usar
ventajosamente como agentes terapéuticos y coadyuvantes frente a
infecciones causadas por cepas que son resistentes a antibióticos
comunes.
Los péptidos de la invención están en forma de
péptidos sintéticos y/o recombinantes, lineales y multimerizados en
cualquier forma química, física y/o biológica, que funcionan como
agentes antibacterianos con amplio espectro.
Los péptidos antimicrobianos son un componente
importante de las defensas innatas de muchas especies vivas y
constituyen la primera línea de defensa del sistema inmune frente a
infecciones, incluso antes de que se activen completamente las
respuestas de anticuerpos y/o mediadas por células.
En la actualidad pueden contarse más de 800
péptidos antimicrobianos naturales y se han preparado muchos otros
sintéticamente (puede encontrarse un catálogo en línea en esta
página web:
http://www.bbcm.univ.trieste.it/\simtossi/
antimic.html).
antimic.html).
Algunos péptidos derivados de secuencias
naturales están sometiéndose a desarrollo farmacéutico (1).
Los péptidos antimicrobianos naturales
constituyen un grupo numeroso y heterogéneo tanto en términos de
composición como de longitud de aminoácidos. Los péptidos
antimicrobianos naturales conocidos más ampliamente son cecropina,
magaininas, taquiplesina, protegrina, indolicidina, defensina y
buforina. Su longitud varía generalmente de 12 a 35 aminoácidos y
tienen una amplia diversidad de estructuras secundarias. Basándose
en sus propiedades conformacionales, los péptidos se han clasificado
en cinco categorías (2):
- 1.
- Con conformación de hélice alfa: cecropinas (3).
- 2.
- Constituidos por predominancia de uno o dos restos específicos, tales como triptófano para indolicidina (4) o arginina y prolina para el péptido PR39 (5).
- 3.
- Que contienen un puente disulfuro: bactenicina (6).
- 4.
- Que contienen múltiples puentes disulfuro que conducen a la formación de láminas beta relativamente rígidas: defensinas (7).
- 5.
- Derivados de polipéptidos con mayores dimensiones, conocidos por otras funciones biológicas, tales como péptidos derivados del GIP (péptido inhibidor gástrico) (8).
Independientemente de la estructura secundaria
presentada por los péptidos antimicrobianos, una característica que
comparten es la naturaleza anfipática, debido a la capacidad de
adoptar una conformación en la que grupos de aminoácidos hidrófobos
y de aminoácidos cargados positivamente están organizados
espacialmente en regiones distintas. La naturaleza catiónica así
como hidrófoba de los péptidos antimicrobianos les permite
interaccionar selectivamente con la membrana de células bacterianas,
compuesta principalmente por fosfolípidos cargados
negativamente.
Aunque el mecanismo de acción de los péptidos
antimicrobianos todavía no se ha explicado completamente, se ha
propuesto un modelo que explica la actividad de la mayor parte de
estos compuestos, conocido como el modelo de
Shai-Matsuzaki-Huang (SMH) (9, 10,
11). El modelo propone la interacción del péptido con la membrana
externa (tapizado), seguida de una alteración en la estructura de
la propia membrana debido al desplazamiento de moléculas lipídicas
con la formación de poros toroidales que permiten el paso y, en
algunos casos, la difusión del péptido hacia dianas intracelulares.
Se ha demostrado que cierto número de péptidos son capaces de unirse
al lipopolisacárido (LPS) (12) con cierta afinidad, ejerciendo
tanto un efecto desestabilizante en la membrana externa de bacterias
Gram negativas como un efecto detoxificante.
Por lo tanto, la mayoría de los péptidos con
actividad antimicrobiana actúan aparentemente de acuerdo con un
mecanismo inespecífico, como se confirma por el hecho de que los
enantiómeros D y L de la cecropina permanecen igualmente activos
(13, 14, 15). Este hecho conduciría a excluir la hipótesis de que
pueda haber una interacción estereoespecífica del tipo
ligando-receptor y explicaría el amplio intervalo de
acción de péptidos naturales frente a bacterias Gram negativas y
Gram positivas, levaduras y hongos, células tumorales y algunos
virus (VIH y Herpes Simple).
En general, los péptidos que actúan a nivel de
membrana de acuerdo con el modelo SMH son eficaces contra
microorganismos a concentraciones micromolares (1). Sin embargo,
existen algunas excepciones, tales como nisina, un péptido de 14
aminoácidos producido por las bacterias del género
Lactococcus que se une al Lípido II, un precursor del
peptidoglicano de la membrana bacteriana, con gran afinidad. La
especificidad de esta interacción justificaría el efecto
antimicrobiano de la nisina incluso a concentraciones nanomolares
(16).
Para péptidos antimicrobianos que se emplearán
en el uso clínico, la selectividad del mecanismo de acción es
crucial para evitar que sean tóxicos para el organismo receptor. Los
péptidos antimicrobianos tienen generalmente menos afinidad por la
membrana de las células del organismo huésped, que presentan una
composición fosfolipídica diferente de la de bacterias y hongos. En
particular, las bicapas enriquecidas en los fosfolípidos
zwitteriónicos fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina o
esfingomielina, que se encuentran comúnmente en las membranas
citoplasmáticas de mamíferos, son generalmente neutras en carga
neta (9, 11). Además, la presencia de colesterol en la membrana
diana reduce en general la actividad de péptidos antimicrobianos
debido a la estabilización de la bicapa lipídica o a interacciones
entre el colesterol y el péptido. El interés de los péptidos
antimicrobianos en el uso clínico también está relacionado con su
mecanismo de acción, que posiblemente podría solucionar el problema
urgente de la resistencia a antibióticos. Puesto que la diana de
los péptidos antimicrobianos es la membrana bacteriana, un microbio
tendría que rediseñar su membrana, cambiando la composición y/o la
organización de sus lípidos, lo cual es probablemente una solución
"costosa" para la mayoría de especies microbianas. Por lo
tanto, los péptidos antimicrobianos son los mejores candidatos a
convertirse en una nueva clase de fármacos antibióticos de amplio
intervalo de acción.
Sin embargo, todavía deben resolverse algunos
problemas relacionados con su uso in vivo ya que algunos de
estos péptidos naturales (por ejemplo, melitina) son particularmente
hemolíticos o presentan una semivida corta debido a su baja
estabilidad en la sangre debido a la presencia de proteasas y, en
particular, de peptidasas.
El uso de bibliotecas combinatorias es un
procedimiento moderno eficaz que permite seleccionar nuevos
"compuestos candidatos"con actividad antibiótica,
seleccionándolos de un número extremadamente alto de péptidos
potenciales diferentes. Cuanto mayor sea la complejidad de la
biblioteca de péptidos, mayor será la posibilidad de identificar
compuestos altamente eficaces. Con este fin pueden usarse tres
bibliotecas combinatorias diferentes, pero el experto en la materia
puede identificar otras fuentes de referencia para péptidos:
1. Bibliotecas de péptidos obtenidas por
síntesis química en fase sólida (17).
2. Bibliotecas de péptidos obtenidas por
síntesis química como una mezcla de compuestos libres en solución
(18).
3. Bibliotecas de péptidos expresados en la
superficie de fagos filamentosos (19).
\vskip1.000000\baselineskip
La combinación de la estrategia 3 y la síntesis
química de péptidos en fase sólida ha permitido el descubrimiento de
las moléculas de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores de la invención han identificado
otras secuencias peptídicas capaces de interaccionar con la membrana
bacteriana y por lo tanto de desempeñar potencialmente un efecto
antibiótico de acuerdo con el mecanismo propuesto para péptidos
antimicrobianos naturales.
Por lo tanto, el objeto de la presente invención
es un péptido antibacteriano constituido por una de la siguientes
secuencias de aminoácidos desde el extremo amino al carboxílico:
QEKIRVRLSA, QAKIRVRLSA, QKKIRVRLSA, KIRVRLSA, AKKIRVRLSA,
QAKIRVRLSA, QKAIRVRLSA, QKKARVRLSA, QKKIAVRLSA, QKKIRARLSA,
QKKIRVALSA, QKKIRVRASA, QKKIRVRLAA, QKAIRVRLSA, QRKIRVRLSA,
QKRIRVRLSA,
QRRIRVRLSA.
QRRIRVRLSA.
En una realización el péptido es de forma
lineal, preferentemente multimerizado en un esqueleto de
poliacrilamida, en un esqueleto de unidades de dextrano o en un
esqueleto de unidades de etilenglicol. En una realización
preferida, el péptido está en forma de Péptidos Multiantigénicos
(MAP), que tienen la fórmula siguiente:
en la que R es el péptido de
acuerdo con la reivindicación 1-4; X es una molécula
trifuncional; m = 0 ó 1; n = 0 si m = 0; n = 0 ó 1 si m =
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente X es un aminoácido que tiene al
menos dos grupos amínicos funcionales, más preferentemente X es
lisina, ornitina, nor-lisina o aminoalanina.
Como alternativa X es ácido aspártico o ácido
glutámico.
Como alternativa X es propilenglicol, ácido
succínico, diisocianatos o diaminas.
Los péptidos de la invención se usan como un
fármaco antibacteriano. El experto en la materia seleccionará la
forma apropiada de administración y la dosificación, seleccionando
diluyentes, coadyuvantes y/o excipientes adecuados. Las formas
preferidas son colirios, elixires bucales y soluciones para uso
tópico.
Los péptidos de la invención también se usan
para la preparación de productos desinfectantes y/o detergentes con
actividad antibacteriana.
Los péptidos de la invención también se usan
como conservantes para la preparación de productos alimentarios y/o
de productos cosméticos y/o de productos homeopáticos.
Figura 1. Actividad antibacteriana de L1 y M1 en
E. coli (cepa TG1) en comparación con un MAP no
correlacionado (MNC) usado como control negativo. El efecto sobre el
crecimiento bacteriano se evaluó a diversas concentraciones
(2-0,12 mg/ml). M1 y L1 inhibían significativamente
el crecimiento de E. coli mientras que el MNC, como se
esperaba, no presentaba actividad antibacteriana.
Figura 2. Actividad antibacteriana de (A) los
péptidos lineales monoméricos L1 (\blacksquare), L4
(100 ), L5 (101 ) y L6 (\Box) y (B)
las formas tetrarramificadas MAP4 M1 (\blacksquare), M4
(100 ), M5 (101 ) y M6 (\Box). Se
realizaron experimentos incubando células E. coli TG1 (8 x
10^{7} UFC/ml) con las cantidades de péptido indicadas. El
porcentaje de supervivencia es el número de colonias vivas con
respecto al número de colonias en controles sin péptidos.
Figura 3. Cinética de
tiempo-destrucción de M6 frente a E. coli
ATCC 25922 (A) y P. aeruginosa ATCC 27853 (B). Símbolos:
\blacklozenge, control de crecimiento; \blacksquare,
concentración CIM 2X (16 \mug/ml) para E. coli ATCC 25922 y
8 \mug/ml para P. aeruginosa ATCC 27853); \ding{115}, CIM
4X (32 \mug/ml) para E. coli ATCC 25922 y 16 \mug/ml para
P. aeruginosa ATCC 27853).
Figura 4. Citotoxicidad de M1 sobre células J774
A.1, CHO y SPO. La figura muestra la citotoxicidad del péptido MAP
M1 expresada en términos de porcentaje de supervivencia evaluada en
células macrofágicas murinas (J774 A.1), mieloma murino (SPO) y
células epiteliales de ovario de hámster chino (CHO K1) por medio de
un ensayo colorimétrico (MTT). Se añadió M1 a las diversas líneas
celulares (6 x 10^{4} células/pocillo) a tres concentraciones
diferentes y se incubó durante 24 horas a 37ºC. Después se añadieron
100 \mul de MTT a cada pocillo y se incubaron durante 90 min a
37ºC. Se midieron los valores de absorbancia a 595 y 650 nm.
Figura 5. Toxicidad de los péptidos
dendriméricos M4 (*), M5 (\ding{115}) y M6 (\ding{108}) sobre
(A) la línea celular de macrófagos de ratón J774.A1 y (B)
queratinocitos humanos HaCaT. Se midió la viabilidad celular
mediante un ensayo colorimétrico (MTT). Los puntos de datos
representan medias de tres repeticiones.
\newpage
Figura 6. Estabilidad del péptido M1 en
solución. Evolución temporal de la actividad antibacteriana de M1
sobre E. coli cepa TG1. Se disolvió el péptido MAP M1 en PBS
a una concentración de 0,5 mg/ml y se midió la actividad bactericida
1, 48 y 72 horas después de la resuspensión en PBS.
Figura 7. Perfiles de HPLC de péptidos lineales
(L1) y dendriméricos (M1) en suero. (A) L1 en suero a 0 h. (B) L1
después de la incubación en suero durante 2 h: el péptido ya no es
detectable. (C) M1 en suero a 0 h. (D) M1 después de la incubación
en suero durante 24 h: el péptido está todavía presente. Las barras
verticales indican el tiempo de retención del péptido (min). Los
experimentos realizados en plasma eran comparables.
Figura 8. Estabilidad de los péptidos M4, M5 y
M6 en solución. Evolución temporal de la actividad antibacteriana de
M4, M5 y M6 sobre E. coli cepa TG1. Los péptidos M4, M5 y M6
se disolvieron en PBS a una concentración de 0,5 mg/ml y se midió la
actividad bactericida 1, 48 y 144 horas después de la resuspensión
en PBS.
Figura 9. Efecto de M5 y M6 sobre la hemólisis
de eritrocitos humanos. Las figuras muestran la actividad hemolítica
de los péptidos MAP M5 y M6 sobre eritrocitos humanos evaluada por
medio de la resistencia osmótica eritrocitaria del procedimiento de
Parpart en NaCl. El porcentaje de hemólisis se calcula por medio de
una curva de calibración obtenida por incubación de eritrocitos con
concentraciones crecientes de NaCl. Después de 30 min de incubación,
M5 y M6 (a la concentración máxima ensayada) presentaban sólo una
débil actividad hemolítica (<5%). Después de 19 horas de
incubación, la hemólisis inducida por M6 y M5 a 125 \mug/ml es del
7% y del 19%, respectivamente. El porcentaje de hemólisis de la
sangre sin tratar después de 19 horas (control) es muy limitado
(<1%).
Figura 10. Cinética de la permeabilización de
membrana de E. coli ML-35 por M4 (*), M5
(\ding{115}), M6' (\ding{108}) y de células sin tratar (\Box).
La permeabilización se determinó por registro espectrofotométrico de
la hidrólisis de
p-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido,
un sustrato para la \beta-galactosidasa en el
citosol de las células bacterianas. Las bacterias se trataron con 16
\mug/ml de péptidos dendriméricos.
Figura 11. Análisis de la unión entre el péptido
MAP M6 y LPS en BIACORE. La figura muestra el sensograma obtenido de
la unión de LPS sobre MAP M6 inmovilizado en la matriz de dextrano
de la microplaca detectora BIACORE. En el eje y se muestran las
Unidades de Respuesta obtenidas de la unión entre LPS y M6 en
función del tiempo expresado en segundos (en el eje x).
Figura 12. Ensayo de retardo en gel. La unión se
ensayó por el efecto inhibidor de péptidos sobre la migración del
ADN. Se incubaron diversas cantidades de péptido M6 con 200 ng de
vector plasmídico de E. coli pCEP4 a temperatura ambiente
durante 1 h y las mezclas de reacción se aplicaron a una
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v).
Figura 13. Imagen de MBLC de células E.
coli TG1 tratadas con M6 marcado con rodamina después de (A) 5
min y (B) 240 min de incubación.
Figura 14. Permeación de la membrana bacteriana
interna inducida por M6 y visualizada por fluorescencia del
FITC.
Figura 15. Detección de bacterias de membrana
alterada usando doble tinción con sondas fluorescentes con FITC y
PI. (A) M6 a 5 \mug/ml y (B) M6 a 40 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores han producido y usado una biblioteca
de péptidos en fagos con secuencia aleatoria a alta variabilidad
(\sim10^{10}), en la que cada péptido está formado por 10 restos
aminoacídicos. La selección de los ligandos específicos se realizó
por incubación de toda la biblioteca con una solución de células
enteras de E. coli, cepa TG1 (a la DO_{600} de
aproximadamente 0,1) en PBS. Después de 1 hora de incubación, las
bacterias se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. Se
realizaron varios lavados con PBS-Tween seguidos de
centrifugación y eliminación del sobrenadante para eliminar todos
los fagos que se unen inespecíficamente a la superficie bacteriana
o que exponen péptidos con baja afinidad por la membrana bacteriana.
Se añadió una solución de glicina (0,2 M, pH 2,2) al tubo de ensayo
que contenía bacterias y fagos específicos durante 10 minutos para
determinar el desprendimiento de los fagos unidos a la membrana.
Después de una centrifugación adicional, se recogió el sobrenadante
que contenía los fagos eluídos. Los fagos seleccionados se
amplificaron en células bacterianas y se usaron para dos vueltas
más de selección. Al final del procedimiento, la presencia de fagos
específicos se verificó mediante ensayo ELISA. El análisis de ADN
puso de manifiesto la predominancia de una secuencia con
propiedades anfipáticas potenciales y carga neta positiva:
QEKIRVRLSA (L1). Las letras son las siglas de los aminoácidos de
acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC-IUB.
Debería señalarse que la secuencia aislada tiene
el patrón típico de los péptidos antimicrobianos, que se
caracteriza por restos hidrófobos y restos cargados positivamente
alternos (K y R). El péptido en cuestión se sintetizaba en forma
lineal y en la forma multimérica tetrarramificada MAP (Péptido
Multiantigénico) (20), en la que cuatro péptidos idénticos están
unidos a un núcleo de lisina (Patente de Estados Unidos 5.229.490).
Se ha demostrado que las formas multiméricas MAP, debido a la
presencia de 4 péptidos en la misma molécula, presentaban una
actividad antimicrobiana aumentada. Además, la forma multimérica MAP
constituye péptidos que son más resistentes a la actividad de
peptidasas de la sangre en comparación con sus péptidos lineales
homólogos (22, 23), permitiendo superar el cuello de botella del
desarrollo y uso in vivo de nuevos fármacos peptídicos. La
eficacia de M1 mostraba una caída en la actividad con el tiempo
(Figura 6), una vez resuspendido en solución. El análisis de
espectrometría de masas realizado sobre el péptido a diversos puntos
temporales indicaba que la pérdida de actividad se debía
probablemente a la formación de enlaces amida entre el grupo
carboxílico del ácido glutámico (E) en la posición dos y el grupo
amínico adyacente de la lisina (K), con eliminación de una molécula
de H_{2}O (no se muestra).
Para mejorar potencialmente las características
de la secuencia original QKKIRVRLSA, se sintetizaron tres péptidos,
partiendo de la secuencia original y sustituyendo el ácido glutámico
(E) con un resto hidrófobo tal como alanina (A) o con un resto
cargado positivamente tal como lisina (K), y realizando por último
una deleción de los dos primeros aminoácidos en el extremo
amino-terminal. Las secuencias de los péptidos MAP
modificados de este modo son QAKIRVRLSA (M4), QKKIRVRLSA (M6) y
KIRVRLSA (M5) (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad bactericida de M4, M5 y M6 era
estable en el tiempo (hasta 144 horas después de la solubilización,
Figura 8).
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad antimicrobiana de los péptidos en
forma lineal (L1, L4, L5, L6) y en forma de MAP (M1, M4, M5, M6) se
ensayó en la cepa TG1 de E. coli. Los péptidos se incubaron a
diversas concentraciones
(2-1-0,5-0,25-0,12
mg/ml) con células E. coli (DO_{600} = 0,2) durante
aproximadamente 1 hora a 37ºC. Posteriormente, las células se
sembraron en placas de agar a una dilución tal para permitir el
recuento de colonias individuales. La actividad antimicrobiana de
los péptidos sintetizados L1 y M1 se muestra en la Figura 1 y se
compara con un péptido MAP no correlacionado (MNC) usado como
control negativo. Aunque el péptido MAP no correlacionado no
presenta actividad sobre el crecimiento de colonias bacterianas,
los autores observaron que la actividad inhibidora del péptido M1
en forma dendrimérica es superior a la del péptido lineal L1. Esto
demuestra que la eficacia del péptido antibacteriano depende
exclusivamente de su secuencia primaria.
Se determinó el porcentaje de supervivencia
(número de colonias vivas con respecto al número de colonias en
condiciones de control sin péptido) después del tratamiento con el
péptido original y con los péptidos modificados (Figura 2). Los
autores observaron que en la forma dendrimérica MAP4 los péptidos
M1, M4, M5 y M6 presentaban una mayor actividad que sus homólogos
lineales (L1, L4, L5 y L6) (Figuras 2A y B). Los péptidos
modificados (M4, M5, M6) mostraban buena actividad antibacteriana.
Particularmente, M5 y M6 (que contienen una y dos cargas positivas
adicionales, respectivamente) impedían el crecimiento de colonias de
E. coli TG1 a concentraciones tan bajas como de 6,25
\mug/ml, mientras que M1 y M4 parecían ser menos eficaces a las
mismas concentraciones (Figura 2B).
Se determinaron las concentraciones inhibidoras
mínimas (CIM) de M4, M5 y M6 para las cepas de referencia: S.
aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922,
Chryseobacterium meningosepticum CCUG 4310 y P.
aeruginosa ATCC 27853, así como para varios aislados clínicos
recientes (incluyendo los multirresistentes a fármacos) de diversas
especies (Tabla 2).
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La CIM se define como la menor concentración, en
un intervalo de dilución de antibiótico, que inhibe el crecimiento
bacteriano visible. La importancia del ensayo de sensibilidad de CIM
se basa en el principio de que la sensibilidad in vitro
proporciona una indicación predictiva de la eficacia in vivo
de la terapia antibiótica. Los valores se expresan como
concentración molar y se comparan con los valores de CIM obtenidos
con antibióticos disponibles en el mercado tales como amikacina,
ceftriaxona y levofloxacina (Tabla 3).
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A partir de estos datos, es fácilmente evidente
que los valores de CIM para M4, M5 y M6 son bajos (del orden de
10^{-6}-10^{-7} M) mientras que los mejores
péptidos antimicrobianos conocidos en la bibliografía alcanzan
valores de CIM de aproximadamente 10^{-6} M
(0,25-4 \mug/ml) (25).
Todos los péptidos mostraban una actividad
relativamente escasa frente a S. aureus, pareciendo ser más
activos frente a bacterias Gram negativas, siendo M6 el más activo
frente a todas las especies. M6 presentaba también una buena
actividad inhibidora frente a E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Enterobacter spp. y P. aeruginosa, incluyendo aislados
clínicos que mostraban un fenotipo de multirresistencia a fármacos.
Se observó una actividad algo menor frente a Citrobacter
freundii y Acinetobacter baumannii, y una actividad
todavía menor frente a Proteus mirabilis, Morganella morganii,
Providencia stuartii, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia
cepacia y Chryseobacterium meningosepticum (Tabla 2).
Posteriormente, se evaluó la concentración mínima de los péptidos
M4, M5 y M6 capaz de destruir el 99,9% del inóculo bacteriano
original (CBM). La CBM se calculó en las cepas de E. coli
ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC 27853 y se descubrió que era
igual a los valores de CIM calculados para las mismas cepas. La
equivalencia de los valores de CIM y CBM proporciona la indicación
de que los péptidos M4, M5 y M6 son bactericidas y no
bacteriostáticos.
Los experimentos de
tiempo-destrucción demostraron que M6 presentaba una
actividad bacteriana rápida frente a E. coli ATCC 25922 y
P. aeruginosa ATCC 27853, reduciendo un inóculo mayor de
10^{7} UFC en >99,9% en 4 h, a una concentración de 16
\mug/ml (Figura 3). La actividad bactericida parecía ser
dependiente de la concentración, especialmente con P.
aeruginosa.
Debido a sus bajos valores de CIM, los péptidos
podían administrarse a bajas dosis, mejorando la conformidad del
paciente pero también la relación coste-efecto de
dicha terapia.
\vskip1.000000\baselineskip
La citotoxicidad de los péptidos MAP
antibacterianos se evaluó en diferentes líneas celulares eucariotas
mediante un ensayo colorimétrico (MTT). Este ensayo mide la
capacidad de las células para convertir una sal de tetrazolio
soluble en un precipitado insoluble: formazán. La citotoxicidad de
M1 se evaluó en células macrofágicas murinas (J774 A.1), células de
mieloma murino (SPO) y células epiteliales de ovario de hámster
chino (CHO K1). Como se muestra en la Figura 4, incluso a altas
concentraciones (1 mg/ml) la citotoxicidad de M1 en células CHO K1 y
en células SPO es reducida (el porcentaje de supervivencia es del
80-90%). Por el contrario, se descubrió que las
células macrofágicas murinas J774 A1 eran más sensibles a M1
(porcentaje de supervivencia \sim50%).
La toxicidad de M4, M5 y M6 hacia las células
macrofágicas de ratón J774.A1 también se ensayó mediante MTT y se
muestra en la Figura 5A. El tratamiento de las células durante una
noche con 30 \mug/ml de M4, M5 o M6 no afectaba sustancialmente a
la viabilidad celular, mientras que era evidente una caída en la
viabilidad celular después del tratamiento con péptido M4 a
concentraciones de 250 \mug/ml y superiores, y con los péptidos
M5 y M6 a 125 \mug/ml y superiores. Los mismos péptidos
dendriméricos mostraban baja toxicidad para la línea celular de
queratinocitos humanos HaCaT (Figura 5B) incluso cuando se usaban a
alta concentración (1 mg/ml). Además, se evaluó el efecto de M4, M5
y M6 sobre la levadura Pichia pastoris, cepa X33. El número
de colonias de levadura tratadas con los tres péptidos
antimicrobianos no difería del control negativo, sugiriendo una
ausencia de toxicidad de los péptidos sobre levaduras (no se
muestran los datos).
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que el uso de péptidos como agentes
terapéuticos está seriamente limitado por su semivida in
vivo, se evaluó la estabilidad frente a proteasas séricas
humanas del péptido lineal L1 y de los péptidos MAP M1, M4, M5 y
M6. Los péptidos se incubaron a la concentración de 10 mM con plasma
y con suero humano durante 2 y 24 horas; las muestras se analizaron
posteriormente en HPLC en columna C18 (véanse los materiales y
procedimientos) para evaluar la presencia de péptido lineal y MAP
no digerido por proteasa. Los autores observaron que el péptido
monomérico L1 se degradaba completamente en 2 h en suero, mientras
que la forma dendrimérica del mismo péptido (M1) se detectaba
todavía después de 24 h en plasma y suero (Figura 7, Tabla 4). Se
obtuvieron resultados comparables con los péptidos dendriméricos M4,
M5 y M6 (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
También se evaluó la actividad hemolítica de M5
y M6 y está representada en la Figura 9. Se determinó la hemólisis
de eritrocitos humanos recién obtenidos a concentraciones peptídicas
que variaban de 1 a 125 \mug/ml. A una concentración de 125
\mug/ml todos los péptidos dendriméricos mostraban una actividad
hemolítica muy escasa (menor del 5%) después de una incubación de
30 min. Por el contrario, después de 19 horas de incubación, la
hemólisis inducida por M6 y M5 a 125 \mug/ml es del 7% y 19%,
respectivamente. El porcentaje de hemólisis de sangre sin tratar
después de 19 horas (control) es muy limitado (<1%).
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de péptidos MAP de perforar la
membrana bacteriana se evaluó midiendo la actividad de la
beta-galactosidasa citoplasmática (24) en los
sobrenadantes de E. coli cepa ML-35 incubados
con el péptido y usando
p-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(pNPG) como sustrato. El pNPG se digiere por la
beta-galactosidada, liberando de este modo el
p-nitro-fenolato detectable por lectura
espectrofotométrica a 420 nm (Figura 10). Los ensayos de
permeabilización mostraban que los péptidos M4, M5 y M6
permeabilizan la membrana bacteriana interna, descubriendo a la
\beta-galactosidasa citoplasmática en el mutante
negativo para permeasa de E. coli ML-35. La
actividad de péptidos dendriméricos contra la membrana interna se
evaluó a concentraciones de 16, 32 y 64 \mug/ml. Todos los
péptidos dendriméricos permeabilizaban la membrana bacteriana
interna a 16 \mug/ml (Figura 9). La permeabilización ocurría
después de un lapso de tiempo de menos de 1 minuto y el índice de
permeabilización dependía de la concentración de péptido (no se
muestra).
Además, la capacidad del péptido MAP M6 para
unirse al lipopolisacárido bacteriano (LPS) se ensayó por Resonancia
de Plasmón Superficial en un instrumento Biacore 1000 (Figura 11)
usando un protocolo perfeccionado por los autores (26). El
sensograma muestra la unión rápida de M6 al LPS. Este experimento
sugiere que M6 podría tener una actividad detoxificante.
\vskip1.000000\baselineskip
En un intento por aclarar el mecanismo de acción
molecular, los autores examinaron las propiedades de unión sobre el
ADN ejercidas por el péptido dendrimérico M6 y la magainina 2, un
péptido antimicrobiano que tiene una actividad formadora de poros
en la membrana celular. Las capacidades de unión a ADN de M6 y
magainina 2 se examinaron por análisis de la movilidad
electroforética de bandas de ADN a las diversas proporciones en
peso de péptidos respecto a ADN en un gel de agarosa al 1% (p/v). M6
inhibía la migración del ADN por encima de una proporción en peso
de 0,2 (Figura 12) mientras que la magainina 2 no suprimía la
migración del ADN hasta la proporción en peso de 5. Este resultado
indica que el M6 se une al ADN al menos más de 25 veces más
fuertemente que la magainina 2.
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Los experimentos de MBLC mostraron que el M6
marcado con rodamina era capaz de entrar en las células en 5
minutos y tiende a agruparse en manchas separadas, con frecuencia
situadas en los polos de la célula, en lugar de distribuirse
uniformemente en el interior de la bacteria (Figura 13). Además, no
existen diferencias significativas entre las imágenes de E.
coli tomadas después de 5 (Figura 13A) o 240 min (Figura 13B) de
incubación con M6 20 \mug/ml.
Para visualizar adicionalmente la actividad de
alteración de la membrana de M6, los autores usaron FITC, una sonda
fluorescente verde de baja masa molecular (389,4 Da). El FITC era
incapaz de atravesar la membrana citoplasmática de células intactas
de control. De hecho, cuando se incubaron células E. coli TG1
con la sonda sin tratamiento previo con el péptido no se distinguió
ninguna señal fluorescente apreciable (no se muestran los datos).
Por el contrario, el FITC se acumulaba rápidamente en las bacterias
después de su exposición a M6 20 \mug/ml, sugiriendo que M6
aumenta la permeabilidad de la membrana bacteriana como se evaluó
por análisis de MBLC (Figura 14). Los resultados obtenidos con la
estrategia de doble tinción con FITC-PI se ilustran
en la Figura 15. Las células E. coli se incubaron
respectivamente con 5 \mug/ml (Figura 15A) y 40 \mug/ml de M6
(Figura 15B). Los autores observaron que las células microbianas
tratadas con la mayor concentración de péptido presentan una
permeabilidad de membrana aumentada tanto para FITC como para PI
(Figura 15B). La menor concentración de M6 conducía a una
alteración limitada de la membrana bacteriana (Figura 15A).
Sorprendentemente, la membrana permanecía casi impermeable al
colorante de menor tamaño (FITC, 389,4 Da) pero era permeable al
colorante de mayor tamaño (PI, 668,4 Da). Este descubrimiento podía
explicarse por interacciones electrostáticas del colorante con la
membrana bacteriana externa: el FITC en solución está cargado
negativamente, mientras que el PI tiene dos cargas positivas que
pueden promover su captación. Todas las bacterias tratadas mantienen
una forma de "bastón" típica sin perder su contenido de ácidos
nucleicos, como se manifestó por su clara fluorescencia roja intensa
debida a la unión del yoduro de propidio al ADN.
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Para identificar los restos críticos
responsables de la actividad antibacteriana de M6, la secuencia de
M6 se sometió a "exploración mediante alanina". La
"exploración mediante alanina" es un procedimiento en el que
cada aminoácido del péptido en cuestión se sustituye de forma
secuencial por una alanina. De este modo se sintetizó una
minibiblioteca en forma de MAP de 9 péptidos (Tabla 5).
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\newpage
Para cada péptido MAP, se calculó después la CIM
en tres cepas de referencia: E. coli ATCC 25922, P.
aeruginosa ATCC 27853 (Gram negativa) y ATTC25923 (Gram
positiva) (Tabla 6).
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Los valores de CIM obtenidos para los péptidos
derivados de M6 muestran que la sustitución de alanina con cualquier
resto hidrófobo conducía a un aumento significativo en la CIM,
reflejando (?) una actividad antimicrobiana disminuida.
A partir de la minibiblioteca se identificó el
péptido M33 como particularmente activo frente a las bacterias Gram
negativas E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC
27853 con valores de CIM, expresados en molaridad, de 1,5 x
10^{-6} M para ambas cepas.
Por último, se evaluó el efecto de la
sustitución de las lisinas del péptido M6 con otro aminoácido
cargado positivamente, arginina (R). La arginina tiene una carga
positiva más distribuida que la lisina debido a la presencia del
grupo guanidinio. La amina primaria de la lisina y el grupo
guanidinio de la arginina parecen interaccionar de forma diferente
con los fosfolípidos bacterianos (27). Para este fin, se
sintetizaron 3 péptidos en forma de MAP (Tabla 7).
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para cada péptido se calculó la CIM en tres
cepas de referencia: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa
ATCC 27853 (Gram negativa) y S. aureus ATTC25923 (Gram
positiva). Los valores de CIM obtenidos a partir de la sustitución
de las lisinas de M6 con las argininas muestran que la sustitución
de la lisina en posición 2 con una arginina no influye en la
actividad antimicrobiana de MAP (Tabla 8).
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A partir de esta minibiblioteca se identificó el
péptido M28 como particularmente activo frente a las bacterias Gram
negativas E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC
27853, con valores de CIM, expresados en molaridad, de 3,8 x
10^{-7} y 7,6 x 10^{-7} M, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo, los péptidos MAP
tetrarramificados con la secuencia de aminoácidos: QAKIRVRLSA,
KIRVRLSA, QKKIRVRLSA se usan individualmente en un ensayo de
inhibición del crecimiento de colonias bacterianas. El ensayo se
realiza por incubación de diferentes concentraciones de péptidos
MAP con E. coli (cepa TG1) y siembra de las células
bacterianas en placas de agar a una dilución tal para permitir el
recuento de colonias individuales. Al día siguiente se compara el
número de colonias desarrolladas después del tratamiento con los
tres péptidos MAP. Los péptidos MAP con secuencia KIRVRLSA y
QKKIRVRLSA muestran una actividad bactericida sobre células TG1 a
una concentración tan baja como de 6,25 \mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, se calculó la
concentración inhibidora mínima (CIM) de los péptidos MAP
tetrarramificados que tienen la secuencia: QAKIRVRLSA, KIRVRLSA,
QKKIRVRLSA sobre diferentes cepas bacterianas Gram negativas. Los
valores de CIM de KIRVRLSA y QKKIRVRLSA, expresados en molaridad,
son del orden de 10^{-6}-10^{-7} M para las
bacterias Gram negativas E. coli ATCC 25922 y P.
aeruginosa ATCC 27853.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, se calculó la
concentración inhibidora mínima (CIM) de los péptidos MAP
tetrarramificados que tienen la secuencia: QAKIRVRLSA, KIRVRLSA,
QKKIRVRLSA sobre diferentes cepas bacterianas Gram positivas, tales
como S. aureus ATTC25923. Los valores de CIM calculados para
los tres péptidos MAP son del orden de 10^{-5} M.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro ejemplo, se evaluó la concentración
mínima capaz de destruir el 99,9% de los microorganismos (CBM) de
los péptidos MAP tetrarramificados que tienen la secuencia:
QAKIRVRLSA, KIRVRLSA, QKKIRVRLSA. Las CBM se calcularon en las
cepas de E. coli ATCC 25922 y P. aeruginosa ATCC
27853 y se descubrió que eran iguales que los valores de CIM
correspondientes para las mismas cepas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, se calculó la actividad
hemolítica sobre eritrocitos humanos de los MAP tetrarramificados
que tienen la secuencia: KIRVRLSA, QKKIRVRLSA. El porcentaje de
hemólisis se calcula usando el procedimiento de Parpart por medio
de una curva de calibración obtenida incubando los eritrocitos con
concentraciones crecientes de NaCl. A una concentración de 125
\mug/ml, QKKIRVRLSA y KIRVRLSA mostraban una actividad hemolítica
muy escasa (menor del 5%) después de una incubación de 30 min. Por
el contrario, después de 19 horas de incubación, la hemólisis
inducida por QKKIRVRLSA y KIRVRLSA a 125 \mug/ml es del 7% y del
19%, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro ejemplo, los péptidos MAP
tetrarramificados que tienen la secuencia: QAKIRVRLSA, KIRVRLSA,
QKKIRVRLSA se ensayan en un ensayo in vitro en el que se
determina su citotoxicidad sobre células macrofágicas murinas J774
A.1 y sobre queratinocitos humanos HaCaT mediante un ensayo
colorimétrico (MTT). A medida que aumenta la concentración de
péptidos MAP, disminuye la vitalidad de las células J774 A.1,
mientras que los queratinocitos humanos HaCaT son particularmente
resistentes a los péptidos incluso cuando se administran a una
concentración de 1 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, el péptido MAP M6
(secuencia QKKIRVRLSA) demostró que se une eficazmente al
lipopolisacárido bacteriano cuando se pasa sobre una microplaca
detectora de un instrumento BIACORE previamente sensibilizada con el
mismo péptido MAP M6.
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, se usa cada uno de los
péptidos MAP derivados de la "exploración mediante alanina",
realizada sobre la secuencia del péptido M6 (Tabla 6), para calcular
su concentración inhibidora mínima (CIM) en las cepas bacterianas
E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 y S.
aureus ATTC25923. La exploración mediante alanina, por
sustitución secuencial de cada aminoácido de M6 con una alanina,
permite identificar los restos críticos responsables de la
actividad bactericida del péptido. A partir de esta minibiblioteca
se identificó un péptido (M33) que demostró ser particularmente
activo frente a las bacterias Gram negativas E. coli ATCC
25922 y P. aeruginosa ATCC 27853 con valores de CIM de 1,5 x
10^{-6} M para ambas cepas (Tabla 6).
\vskip1.000000\baselineskip
En un ejemplo adicional, se usa cada uno de los
péptidos MAP obtenidos por sustitución de las lisinas (K) con
argininas (R) del péptido MAP M6 (Tabla 7) para calcular su
concentración inhibidora mínima (CIM) en las cepas bacterianas
E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 y S.
aureus ATTC25923. A partir de esta minibiblioteca se identificó
un péptido (M28) que demostró ser particularmente activo frente a
las bacterias Gram negativas E. coli ATCC 25922 y P.
aeruginosa ATCC 27853 con valores de CIM de 3,8 x 10^{-7} y
7,6 x 10^{-7} M, respectivamente
(Tabla 8).
(Tabla 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos capaces de tener un efecto
antibacteriano se seleccionaron usando una biblioteca de fagos de
péptidos aleatorios de 10 aminoácidos siguiendo protocolos
convencionales para el uso de estas bibliotecas. Los péptidos se
escogieron por medio de tres selecciones. Se centrifugó 1 ml de
células E. coli cepa TG1 a la DO_{600} = 0,1
(aproximadamente 0,8 x 10^{7} células) a 17000 x g durante 3 min.
El sedimento se resuspendió en 1 ml de PBS y se incubó con
agitación lenta para aproximadamente 10^{14} fagos durante 60
minutos a temperatura ambiente. Se recuperaron las células y los
fagos después de una centrifugación a 17000 x g durante 3 min. Se
aspiró el sobrenadante y se lavó el sedimento 10 veces con
PBS-tween al 0,1% para eliminar los fagos no unidos
en la primera vuelta de selección y se lavó con
PBS-tween al 0,5% en las vueltas posteriores. Las
células con los fagos unidos se centrifugaron a 17000 x g durante 3
min y el sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón de elución
[glicina-HCl 0,2 M (pH 2,2)] dejándolo en agitación
lenta durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. La
muestra se centrifugó como se ha realizado anteriormente y el
sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf y se neutralizó con
150 \mul de Tris-HCl 1 M (pH 9,1). Se usaron 100
\mul de fago eluído para infectar 10 ml de E. coli TG1 en
fase de crecimiento exponencial durante 30 min a 37ºC. Después de
la incubación, las bacterias se centrifugaron durante 10 minutos a
3300 x g, se resuspendieron en 1 ml de 2X TY (DESCRIVERE) y se
sembraron en placas de agar que contenían ampicilina (100
\mug/ml)-glucosa (1%). Después de la incubación
durante una noche (o. n.) a 30ºC, las colonias se recuperaron de la
placa por adición de 5-10 ml de 2X TY de tal forma
que se obtuviera una suspensión homogénea. Se inocularon 100 ml de
2X TY-ampicilina (100
\mug/ml)-glucosa (1%) con 100 \mul de una
suspensión bacteriana hasta obtener una DO_{600} =
0,4-0,5, se retiraron 10 ml de cultivo y se
infectaron con 100 \mul del fago auxiliar VCS.M13 (>10^{11}
unidades de transformación (ut)/ml). Las bacterias infectadas se
centrifugaron a 3300 x g durante 10 min, después el sedimento
recuperado se resuspendió en 100 ml de 2X
TY-ampicilina (100
\mul/ml)-kanamicina (25 \mug/ml) y se agitó
durante una noche a 30ºC. Los fagos se purificaron y se concentraron
por precipitación con PEG/NaCl (polietilenglicol 6000 al 20%-NaCl
2,5 M) y se resuspendieron en 2 ml de PBS. Los fagos eluídos se
recuperaron, se amplificaron y se usaron para dos ciclos más de
selección. Al final del procedimiento se verificó la presencia de
fagos específicos para la superficie bacteriana mediante ensayo
ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis en fase sólida de los péptidos
lineales se realizó por medio de un sintetizador de péptidos Syro
MultiSynTech (WittenBochum, D) usando una resina de
p-(2,4-dimetoxifenil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamidonorleucil-(4-metilbenzhidrilamina)
(Rink-MBHA) y la química de
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). La reacción de desprotección se
obtuvo por adición de 40% de piperidina en
N-metilpirrolidona y, para la reacción de ataque se usaron
ésteres de N-hidroxibenzotriazol de
F-moc-aminoácidos preparados in
situ para la reacción de conjugación. Los péptidos se separaron
de la resina y se desprotegieron simultáneamente usando una mezcla
de ácido trifluoroacético/tioanisol/etanoditiol/agua (93/2/3/2)
durante 3 horas a temperatura ambiente. Los péptidos se purificaron
por medio de HPLC de fase inversa en una columna semipreparativa
Vydac C18 usando un gradiente de 30 min de tampón B del 0% al 100%
(tampón A: ácido trifluoroacético al 0,1%/agua; tampón B: ácido
trifluoroacético al 0,1%/metanol).
La síntesis de los péptidos multiantigénicos
(MAP) tetrarramificados se consiguió mediante un procedimiento en
fase sólida sobre resina Wang
Fmoc_{4}-K_{2}-K-A,
usando química de Fmoc. Los péptidos MAP se separaron del soporte
usando técnicas convencionales y se purificaron por medio de HPLC de
fase inversa. Los péptidos se comprobaron mediante espectrometría de
masas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron ensayos antimicrobianos incubando
durante 75 min a 37ºC 25 \mul de E. coli a la DO_{600}
de 0,2 con 25 \mul de péptido MAP disuelto en PBS a diversas
concentraciones. Las diferentes incubaciones se diluyeron
adicionalmente 1:1000 en medio 2X TY y se sembraron en placas 100
\mul en medio 2X TY sólido. Las placas se dejaron durante una
noche a 30ºC y se contaron las colonias desarrolladas individuales y
se compararon con un control, sin tratar con péptido MAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron cepas de referencia (Escherichia
coli ATCC 25922, seudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Staphylococus aureus ATCC 25923 y Chryseobacterium
meningosepticum CCUG 4310) y varios aislados clínicos recientes
(incluyendo los multirresistentes a fármacos) de diversas especies
(Tabla 2) para experimentos de ensayo de susceptibilidad
convencionales. Se determinó la Concentración Inhibidora Mínima
(CIM) mediante un ensayo de microdilución convencional, según se
recomienda por el National Commitee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS) usando caldo Mueller-Hinton (MH)
complementado con cationes (Oxoid Ltd. Basingstoke, Reino Unido) y
un inóculo bacteriano de 5 x 10^{4} UFC por pocillo en un volumen
final de 100 \mul. Los resultados se registraron por inspección
visual después de 24 h de incubación a 37ºC. Se determinó la
Concentración Bactericida Mínima (CBM), definida como la
concentración a la que se destruye \geq99,9% del inóculo
bacteriano, según se recomienda por el NCCLS después del ensayo de
CIM.
\vskip1.000000\baselineskip
La CBM se define como la concentración mínima de
antibiótico capaz de destruir el 99,9% de los microorganismos de la
inoculación original de la especie en cuestión. La CBM se determinó
según se recomienda por el National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS) en las cepas de E. coli ATCC
25922 y P. aeruginosa ATCC 27853.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ensayo de la actividad
bactericida en experimentos de tiempo-destrucción de
la forma siguiente. Se añadió el péptido a la concentración deseada
a cultivos en crecimiento exponencial de la cepa de ensayo en caldo
MH que contenía un inóculo total de 5 x 10^{7} UFC (1 x 10^{7}
UFC/ml) a 37ºC. Se retiraron muestras a diferentes tiempos y se
sembraron en placas de agar MH diluciones adecuadas para obtener el
número residual de UFC. Siempre se cultivó en paralelo como control
un cultivo sin péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayos de citotoxicidad se usaron
diferentes líneas celulares: células de mieloma murino (SPO),
células epiteliales de ovario de hámster CHO K1, células
macrofágicas murinas J774 A.1 y queratinocitos humanos HaCaT. Las
células se sembraron en placas en medio RPMI 1640 (SPO y CHO K1) y
DMEM (J774 A.1 y HaCaT) con antibióticos y suero bovino fetal al
10% en placas de 96 pocillos a la concentración de 6 x 10^{4}
(SPO, CHO K1 y J774 A.1) y 3 x 10^{4} (HaCaT). Se añadieron
péptidos, previamente filtrados con un disco de papel de filtro de
0,2 \mum (Whatman), a diversas concentraciones a las diferentes
líneas celulares y se dejaron en incubación durante una noche a
37ºC. Se determinó la viabilidad celular añadiendo la sal de
tetrazolio MTT a la concentración de 0,5 mg/ml e incubando durante
90 min. Las células se solubilizaron con una solución a pH 4,5 que
contenía SDS al 10% y dimetilformamida al 45% y se leyó a la doble
longitud de onda de 595/650 nm con un lector de placas.
\vskip1.000000\baselineskip
A un volumen de 50 \mul de cultivo de
Pichia pastoris cultivada durante 24 horas a 30ºC en medio
YPD (Extracto de Levadura/Peptona/Dextrosa) se añadieron 50 \mul
de péptidos MAP (2 mg/ml) y se dejaron en incubación 150 min a
37ºC. Posteriormente se sembraron en placas de medio sólido YPD 50
\mul de cada incubación y se dejaron crecer durante 48 horas a
30ºC. El número de colonias desarrolladas se comparó con un control
en el que la levadura no se trató con los MAP.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diversos péptidos en forma de MAP y el
péptido lineal (L1) se disolvieron en H_{2}O a la concentración
10 mM y se incubaron con 10 \mul de plasma y suero humano durante
2 y 24 horas a 37ºC. A cada muestra se añadieron 150 \mul de
metanol para bloquear la reacción proteolítica; después, cada
muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 min y al sobrenadante
se le añadieron 0,75 ml de ácido trifluoroacético al 0,1%. Las
muestras se analizaron en HPLC de fase inversa en una columna
semipreparativa Vydac C18 usando un gradiente de 30 min de tampón B
del 20% al 95% (tampón A: ácido trifluoroacético al 0,1%/agua;
tampón B: ácido trifluoroacético al 0,1%/metanol) para evaluar la
presencia de péptido lineal y MAP después del tratamiento
proteolítico.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad hemolítica de los péptidos KIRVRLSA
(M5) y QKKIRVRLSA (M6) se evaluó mediante el ensayo de resistencia
osmótica eritrocitaria de Parpart en NaCl. El porcentaje de
hemólisis se calculó por medio de una curva de calibración obtenida
incubando los eritrocitos con concentraciones crecientes de NaCl y
midiendo el aumento de absorbancia debido a la hemólisis a 540 nm.
Después se prepararon soluciones de NaCl al 0,9% que contenían los
péptidos MAP a diferentes concentraciones, a las que se añadió
sangre humana en la proporción de 1:100 (v/v). Las muestras se
dejaron a temperatura ambiente durante 30 min y 19 horas;
posteriormente, se retiró una parte de cada incubación, se
centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y se midió la absorbancia del
sobrenadante con el espectrofotómetro a 540 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad de los péptidos MAP
QAKIRVRLSA (M4), KIRVRLSA (M5) y QKKIRVRLSA (M6) para perforar la
membrana bacteriana midiendo la actividad de la
beta-galactosidasa citoplasmática usando como
sustrato
p-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(pNPG) que, digerido por la beta-galactosidasa,
libera el p-nitro-fenolato detectable por
lectura espectrofotométrica a 420 nm. Para realizar esto, se usaron
células E. coli de la cepa ML-35: producen
constitutivamente beta-galactosidasa y su
transportador de lactosa está desactivado. Las células bacterianas
se retiraron durante la fase de crecimiento logarítmico (DO_{600}
= 0,4- 0,5) y se resuspendieron en tampón fosfato (10 mM) que
contenía NaCl 100 mM (pH 7,4) y pNPG 1,5 mM. A tiempo cero, el
péptido en forma de MAP se añadió a la concentración final de 16, 32
y 64 \mug/ml y el cambio de absorbancia se midió a 420 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron experimentos de retardo en gel por
mezcla de 200 ng del vector plasmídico de E. coli pCEP4
(Invitrogen) con cantidades crecientes de péptido M6 en 20 \mul de
tampón de unión (glicerol al 5%, Tris-HCl 10 mM (pH
8,0), EDTA 1 mM, DTT 1 mM, KCl 20 mM y BSA 50 \mug/ml). Las
mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 1
h. Posteriormente, se añadieron 4 \mul de tampón de carga nativo
(sacarosa al 40%, azul de bromofenol al 0,25%) y se aplicó una
alícuota de 12 \mul a una electroforesis en gel de agarosa al 1%
en tampón Tris borato-EDTA 1 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células E. coli TG1 durante
una noche en 2xTY. Después de la dilución 1:10 en medio de células,
se prepararon 5 alícuotas de 1 ml, se lavaron dos veces con tampón
fosfato sódico (PBS) 10 mM pH 7,4 y se incubaron en 200 \mul de
una solución de péptido marcado con tetrametilrodamina (TMR) (20
\mug/ml en PBS) durante 5 min a 37ºC. Después de lavar con PBS,
cada alícuota de las células se resuspendió en 200 \mul de PBS y
se mantuvo en la oscuridad a 37ºC durante 2, 30, 60, 120, 240 min
respectivamente. Después, las células se montaron en un
portaobjetos de vidrio y se observaron con un microscopio de barrido
láser confocal Bio-Rad MRC600 (MBLC). Se obtuvieron
imágenes fluorescentes con un filtro de paso de banda de 568 nm para
la excitación de la TMR. Se llevó a cabo una combinación
informática de las imágenes mediante el uso de un programa
informático COMOS. Se desarrolló un procedimiento de doble tinción
para visualizar, con dos marcadores al mismo tiempo, la actividad
de alteración de la membrana inducida por M6 en bacterias. Se usaron
los siguientes fluorocromos: (i) el yoduro de propidio (PI), un
compuesto fluorescente de tinción del ADN; y (ii) la sonda verde
fluorescente isotiocianato de fluoresceína (FITC), que es incapaz
de atravesar la membrana citoplasmática de células a menos que se
permeabilice por un péptido. Se prepararon células E. coli
como se ha descrito anteriormente y se trataron con 5, 10, 20, 40
\mug/ml de péptido durante 30 min a 37ºC. Después, las células se
lavaron con PBS y se añadió una solución de FITC (6 \mug/ml en
PBS). Después de 30 min a 37ºC, la solución de FITC se retiró y las
células se lavaron de nuevo con PBS. Después se añadió una solución
de DAPI (6 \mug/ml en PBS) a las células. Se obtuvieron imágenes
fluorescentes con un filtro de paso de banda de 568 nm para la
excitación de la TMR y con un filtro de paso de banda de 488 nm para
el FITC.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<120> Péptidos antibacterianos y análogos
de los mismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT 88453
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> RM2004A000349
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-07-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> sintética
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 10
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<223> sintética
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<400> 2
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<210> 3
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<210> 11
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<210> 12
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<400> 12
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<223> sintética
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<400> 15
\hskip1cm
Claims (13)
1. Un péptido antibacteriano constituido por una
de las siguientes secuencias de aminoácidos desde el extremo amino
al carboxílico: QEKIRVRLSA, QAKIRVRLSA, QKKIRVRLSA, KIRVRLSA,
AKKIRVRLSA, QAKIRVRLSA, QKAIRVRLSA, QKKARVRLSA, QKKIAVRLSA,
QKKIRARLSA, QKKIRVALSA, QKKIRVRASA,
QKKIRVRLAA, QKAIRVRLSA, QRKIRVRLSA, QKRIRVRLSA, QRRIRVRLSA.
QKKIRVRLAA, QKAIRVRLSA, QRKIRVRLSA, QKRIRVRLSA, QRRIRVRLSA.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1
que es de forma lineal.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación
2, multimerizado en un esqueleto de poliacrilamida, en un esqueleto
de unidades de dextrano o en un esqueleto de unidades de
etilenglicol.
4. El péptido de acuerdo con la reivindicación
1, que está en forma de Péptidos Multiantigénicos (MAP), que tienen
la fórmula siguiente:
en la que R es el péptido de
acuerdo con la reivindicación 1-4; X es una molécula
trifuncional; m = 0 ó 1; n = 0, si m = 0; n = 0 ó 1, si m =
1.
\vskip1.000000\baselineskip
5. El péptido MAP de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que X es un aminoácido que tiene al menos
dos grupos amínicos funcionales.
6. El péptido MAP de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que X es lisina, ornitina, norlisina o
aminoalanina.
7. El péptido MAP de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que X es ácido aspártico o ácido
glutámico.
8. El péptido MAP de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que X es propilenglicol, ácido succínico,
diisocianatos o diaminas.
9. El péptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para uso médico como un fármaco
antibacteriano.
10. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad farmacéuticamente aceptable y eficaz del péptido de
acuerdo con la reivindicación 9.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 10, en forma de colirio, elixir bucal, pomada o
solución para uso tópico.
12. Una preparación desinfectante y/o detergente
con actividad antibacteriana que comprende el péptido de acuerdo con
la reivindicación 1 a 8.
13. Uso del péptido de acuerdo con la
reivindicación 1 a 8 como conservante para la preparación de
productos alimentarios y/o de productos cosméticos y/o de productos
homeopáticos.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| ITRM04A0349 | 2004-07-13 | ||
| IT000349A ITRM20040349A1 (it) | 2004-07-13 | 2004-07-13 | Peptidi antibatterici e loro analoghi. |
Publications (1)
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|---|---|---|---|
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