ES2337460T3 - Metodos para purificar cannabinoides a partir de material vegetal. - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener un cannabinoide o ácido cannabinoide que tiene una pureza cromatográfica mayor del 95% o un producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado a partir de un material de planta, que comprende: i) obtener un extracto que contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide a partir de un material de planta; ii) someter el extracto de la etapa (i) a una etapa cromatográfica para producir un extracto parcialmente purificado; iii) disolver el extracto parcialmente purificado en un primer disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste y eliminar el disolvente; y iv) disolver el producto obtenido en la etapa iii) en un segundo disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste, y eliminar el disolvente para obtener el cannabinoide o ácido cannabinoide que tiene una pureza cromatográfica mayor del 95% o el producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado, en el que los primeros y segundos disolventes son diferentes, y en el que uno de los primeros o segundos disolventes es un disolvente que es sustancialmente más polar que el cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar, y el otro disolvente es un disolvente que es sustancialmente menos polar que el cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar.
Description
Métodos para purificar cannabinoides a partir de
material vegetal.
La invención se refiere a métodos para preparar
cannabinoides en una forma sustancialmente pura comenzando a partir
del material de planta.
El cannabis ha sido usado con fines médicos
durante muchos años y en los tiempos Victorianos era un componente
extensamente usado como medicamento sujeto a prescripción. Se usó
como sedante hipnótico para el tratamiento de "histeria, delirio,
epilepsia, insomnio nervioso, migraña, dolor y dismenorrea".
Históricamente, el cannabis fue considerado por muchos médicos como
único; por tener la capacidad de contrarrestar el dolor persistente
frente a los analgésicos opioides, en afecciones tales como daño de
la médula espinal, y otras formas de dolor neuropático incluyendo
dolor y espasmos en la esclerosis múltiple.
El uso del cannabis continuó hasta mediados del
siglo veinte, cuando el uso recreativo del cannabis apremió a la
legislación causando la prohibición de su uso. En la actualidad se
está revaluando la utilidad del cannabis como un medicamento sujeto
a prescripción. El descubrimiento de receptores cannabinoides
específicos y los nuevos métodos de administración han hecho
posible ampliar el uso de medicinas basadas en cannabis respecto a
indicaciones históricas y nuevas.
Los componentes cannabinoides principales
presentes en el cannabis herbario son los ácidos cannabinoides
\Delta^{9}, ácido tetrahidrocannabinólico (\Delta^{9} THCA)
y ácido cannabidiólico (CBDA), con pequeñas cantidades de los
cannabinoides neutros correspondientes, el \Delta^{9}
tetrahidrocannabinol (\Delta^{9} THC) y el cannabidiol (CBD),
respectivamente. El cannabidiol fue considerado inicialmente como un
componente inactivo, sin embargo hay pruebas de que tiene actividad
farmacológica, que es diferente de la del \Delta^{9} THC en
varios aspectos.
Además de estos cannabinoides principales, el
cannabis herbario puede contener niveles inferiores de otros
cannabinoides menores. Éstos pueden ser intermedios en la
biosíntesis de los cannabinoides principales y de hecho existen
sólo a niveles bajos en la planta ya que se someten constantemente a
una biotransformación adicional una vez que se forman. Un ejemplo
de tal cannabinoide es el cannabigerol (CBG). Otros cannabinoides
menores pueden representar el punto final de una ruta biosintética
alternativa a la que conduzca la formación de los cannabinoides
principales \Delta^{9} THC y CBD. Estos cannabinoides son, con
frecuencia, relativamente más abundantes en la planta, un ejemplo
de los cuales es el cannabicromeno (CBC).
Un ejemplo especial de un cannabinoide menor,
que es el punto final de una ruta biosintética, es la \Delta^{9}
tetrahidrocannabivarina (\Delta^{9} THCV). Este compuesto es
muy parecido al \Delta^{9} THC, estando la única diferencia en
la estructura con la presencia de una cadena lateral de propilo
(C_{3}H_{7}) en vez de una cadena lateral de pentilo
(C_{5}H_{11}) en el anillo aromático. Este compuesto, por lo
general, acompaña al \Delta^{9} THC a un nivel de
1-2% del THC presente. Sin embargo, en ciertas
variedades del cannabis \Delta^{9} THCV, plantadas
selectivamente, puede haber más del 70% de los cannabinoides
totales, estando reducido el \Delta^{9} THC a un nivel de
componente menor.
Las formas purificadas de algunos de los
cannabinoides presentes en el cannabis herbario son útiles como
agentes farmacéuticos activos. Por ejemplo, se ha aprobado por la
Administración de Drogas y Alimentos (FDA) el \Delta^{9} THC
(también conocido como dronabinol) para el control de las náuseas y
los vómitos asociados con la quimioterapia, y también muestra
actividad farmacológica potencial en el tratamiento del glaucoma,
dolores de de migrañas, ansiedad y como analgésico. El cannabidiol,
anteriormente considerado como un componente inactivo del cannabis,
ha mostrado por sí mismo, como se ha mencionado anteriormente, una
actividad farmacológica promete-
dora.
dora.
En el caso de los cannabinoides menores, las
dificultades en el aislamiento de los cannabinoides menores en
estado puro y la ausencia de estándares comercialmente disponibles
han restringido la investigación de la farmacología de estos
compuestos y su potencial terapéutico verdadero es desconocido. Por
consiguiente, tiene un gran interés aislar muestras suficientemente
puras de estos cannabinoides en las cantidades requeridas para
permitir que se realicen estudios farmacológicos.
Las formas purificadas de los cannabinoides y
ácidos cannabinoides son también potencialmente útiles como
estándares analíticos, en particular en la caracterización de
medicinas derivadas del cannabis basadas en sustancias
farmacéuticas botánicas preparadas a partir del cannabis
herbario.
Por lo tanto, hay todavía necesidad de formas
purificadas de todos los ácidos cannabinoides y cannabinoides
presentes en la hierba del cannabis, incluyendo los cannabinoides
principales \Delta^{9} THC y CBD y los cannabinoides
menores.
Las formas sintéticas de algunos de los
cannabinoides, en particular \Delta^{9} THC, CBD y CBN, están
comercialmente disponibles. Sin embargo, los cannabinoides
sintéticos son muy caros. La atención se ha centrado, por lo tanto,
en la purificación de cannabinoides a partir del material de
planta.
El documento WO 02/32420 describe un
procedimiento para preparar, por ejemplo,
\Delta^{9}-THC a partir del material de planta.
Éste utiliza la extracción con CO_{2} y la precipitación con
etanol para obtener "extractos primarios" que contienen
\Delta^{9}-THC y CBD, con cantidades reducidas
de, por ejemplo, monoterpenos, sesquiterpenos, hidrocarburos,
alcaloides, flavonoides y clorofila. El CBD es convertido entonces a
\Delta^{9}-THC por una reacción de catálisis.
Los cannabinoides comportan sólo aproximadamente dos terceras partes
de la composición y no son, por lo tanto, sustancialmente
puros.
El documento de EE.UU. Nº 6.403.126 describe un
procedimiento en el cual el THC es retirado de un extracto de
cannabis usando cromatografía.
El documento JP 3153625 describe un método para
producir un agente antialérgico. En un ejemplo, las semillas secas
del cannabis son sometidas a múltiples etapas de extracción y
múltiples etapas cromatográficas.
En Biochemical Medicine (1973, volumen 8,
pp. 341-344) se describe un procedimiento de
purificación y extracción en multi-etapas para
producir \Delta^{9}-THC de pureza no
especificada.
En ODCCP Bulletin on Narcotics (1976,
Número 4) se describe un método para aislar CBD, THC y CBN usando
cromatografía de gases preparativa.
El documento de EE.UU. Nº 6.365.416 describe un
método para preparar \Delta^{9} THC a partir del material de
planta que implica extraer el material de planta con un disolvente
orgánico no polar, opcionalmente sometiendo el extracto a una etapa
de cromatografía de columna para producir un eluato de residuo,
someter el extracto o el eluato de residuo a una destilación súbita
a baja presión para producir un destilado, opcionalmente sometiendo
el destilado a una segunda etapa de destilación súbita, y someter el
destilado a cromatografía de columna, HPLC normal o HPLC de fase
inversa. El procedimiento proporciona un producto que contiene
\Delta^{9} THC en una cantidad mayor del 90% en peso.
Se necesitan todavía procedimientos de
purificación alternativos que puedan ser usados para preparar formas
purificadas de todos los componentes cannabinoides y de ácidos
cannabinoides de la hierba del cannabis, incluyendo los ácidos
cannabinoides \Delta^{9} THCA y CBDA, los cannabinoides libres
correspondientes \Delta^{9} THC y CBD, y los cannabinoides
menores. La presente invención se refiere a tal procedimiento de
purificación basado en una combinación simple de etapas de
extracción con disolvente, cromatografía y recristalización. El
procedimiento es simple, eficiente y económico, y es capaz de
producir cannabinoides de una pureza alta, evitando la necesidad
del HPLC
preparativo.
preparativo.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un método para obtener un cannabinoide o ácido cannabinoide que
tiene una pureza cromatográfica mayor del 95% o un producto
enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado que
comprende:
- i)
- obtener un extracto que contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide a partir de un material de planta;
- ii)
- someter el extracto de la etapa (i) a una etapa cromatográfica para producir un extracto parcialmente purificado;
- iii)
- disolver el extracto parcialmente purificado en un primer disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste, y eliminar el disolvente; y
- iv)
- disolver el producto obtenido en la etapa iii) en un segundo disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste, y eliminar el disolvente para obtener el cannabinoide o ácido cannabinoide con una pureza cromatográfica mayor del 95% o el producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado, en el que los primeros y segundos disolventes son diferentes, y en el que uno de los primeros o segundos disolventes es un disolvente que es sustancialmente más polar que el ácido cannabinoide/cannabinoide que se desea purificar, y el otro disolvente es un disolvente que es sustancialmente menos polar que el ácido cannabinoide/cannabinoide que se desea purificar.
\vskip1.000000\baselineskip
El método puede comprender opcionalmente una
etapa adicional v) de cromatografía súbita como una etapa de
purificación adicional opcional. En la realización más preferida, la
etapa de cromatografía súbita puede comprender lo siguiente:
- v)
- cargar el cannabinoide o ácido cannabinoide sustancialmente puro o el producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado en un columna de cartucho de sílice Flash BT 12M de Chromabond, eluyendo con hexano:acetato de etilo (98:2) a un caudal de aproximadamente 5 ml/min.
La invención se refiere a un procedimiento de
purificación para preparar el cannabinoide o ácido cannabinoide
sustancialmente puro o un producto enriquecido en un cannabinoide o
ácido cannabinoide dado a partir del material de planta.
Una preparación "sustancialmente pura" de
cannabinoide o ácido cannabinoide se define como una preparación
que tiene una pureza cromatográfica (del cannabinoide o ácido
cannabinoide deseado) mayor del 95%, más preferiblemente mayor del
96%, más preferiblemente mayor del 97%, más preferiblemente mayor
del 98%, más preferiblemente mayor del 99% y lo más preferiblemente
mayor del 99,5%, según se determina por la normalización del área
de un perfil de HPLC.
La expresión "producto enriquecido en un
cannabinoide o ácido cannabinoide dado" abarca preparaciones que
tienen al menos el 80%, preferible mayor del 85%, más
preferiblemente mayor de una pureza cromatográfica del 90% para el
cannabinoide o ácido cannabinoide deseado. Tal producto contendrá
generalmente una mayor proporción de impurezas, materiales no
objetivo y otros cannabinoides que una preparación
"sustancialmente pura".
El método de la invención puede usarse para
extraer/purificar cannabinoides o ácidos cannabinoides a partir de
cualquier material de planta conocido que contenga tales
cannabinoides o ácidos cannabinoides. Lo más típicamente, pero no
necesariamente, el "material de planta" se derivará de una o
varias plantas de cannabis.
La expresión "material de planta" abarca
una parte de la planta o la planta (p. ej corteza, madera, hojas,
tallos, raíces, flores, frutos, semillas, bayas o sus partes) así
como exudados, e incluye el material que entra dentro de la
definición de "materia prima botánica" en la Guidance for
Industry Botanical Drug Products Draft Guidance, agosto de
2000, Department of Health and Human Services, Food and Drug
Administration Centre for Drug Evaluation and Research de
EE.UU.
La expresión "planta(s) de cannabis"
abarca el Cannabis sativa tipo silvestre y también sus
variantes, incluyendo quimiovares del cannabis (variedades
caracterizadas en virtud de su composición química) que contienen
naturalmente cantidades diferentes de los cannabinoides
individuales, también el Cannabis sativa subespecie
indica incluyendo las variantes var. indica y var.
kafiristanica, Cannabis indica y también plantas que son
el resultado de cruces genéticos, autocruces o sus híbridos. La
expresión "material de planta de cannabis" debe interpretarse
en consecuencia como que abarca el material de planta derivado de
una o varias plantas de cannabis. Para evitar dudas se establece
por este medio que el "material de planta de cannabis" incluye
el cannabis herbario y la biomasa de cannabis seca.
El "material de planta de cannabis
descarboxilado" se refiere al material de planta de cannabis que
se ha sometido a una etapa de descarboxilación a fin de convertir
los ácidos cannabinoides en los cannabinoides libres
correspondientes.
El material de partida para el procedimiento de
purificación es un extracto que contiene un cannabinoide o ácido
cannabinoide obtenido a partir de un material de planta.
En una realización preferida el "extracto que
contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide" puede ser un
extracto de disolvente de un material de planta. Los disolventes de
extracción preferidos para uso en la preparación de este extracto
incluyen disolventes no polares, también alcoholes como el etanol o
el metanol y dióxido de carbono líquido. Preferiblemente, el
extracto se prepara disolviendo el material de planta en un
disolvente de extracción, eliminando el material insoluble de la
disolución resultante (preferiblemente por filtración), y
eliminando el disolvente de extracción de la disolución
(preferiblemente por evaporación rotatoria) para formar un extracto
que contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide.
Los disolventes no polares son, en particular,
preferidos para preparar un extracto inicial del material de planta
inicial. Puede usarse cualquier disolvente no polar capaz de
solubilizar cannabinoides o ácidos cannabinoides. Los disolventes
no polares preferidos incluyen disolventes no polares líquidos que
comprenden alcanos de cadena lineal o cadena ramificada inferiores
C5-C12, preferiblemente de C5 a C8. El disolvente no
polar más preferido para la preparación de cannabinoides libres es
el hexano.
En las realizaciones en las que se usa el método
para el aislamiento de ácidos cannabinoides se prefiere entonces
usar un disolvente de extracción acidificado para preparar el
extracto inicial. El objetivo primario de esta acidificación es
prevenir/reducir al mínimo la ionización del ácido cannabinoide, lo
que podría afectar negativamente, por otra parte, al procedimiento
de purificación. Se prefiere usar disolventes no polares
acidificados de los tipos descritos anteriormente. La acidificación
puede ser conseguida por la adición de un pequeño volumen de ácido
al disolvente. Generalmente es suficiente añadir un ácido
relativamente débil, tal como el ácido acético. Para cualquier
procedimiento de purificación dado, la cantidad óptima y el tipo de
ácido usado puede determinarse empíricamente. Un disolvente
acidificado preferido es el ácido acético al 0,1% en hexano. Este
es el disolvente de extracción de elección para preparar un extracto
inicial a partir del material de planta de partida en la
preparación de ácidos cannabinoides.
En las realizaciones del método en las que se
desea purificar cannabinoides libres, en vez de los ácidos
cannabinoides, el material de planta puede ser sometido a una etapa
de descarboxiíación antes de la etapa (i). El objetivo de la etapa
de descarboxilación es convertir los ácidos cannabinoides presentes
en el material de planta en los cannabinoides libres
correspondientes. La descarboxilación se realiza preferiblemente
calentando el material de planta a una temperatura definida durante
un periodo de tiempo adecuado. La descarboxilación de ácidos
cannabinoides es una función del tiempo y de la temperatura, así a
temperaturas más altas se tomará un período más corto de tiempo
para la descarboxilación completa de una cantidad dada de ácido
cannabinoide. En la selección de las condiciones apropiadas para la
descarboxilación debe considerarse, sin embargo, la reducción al
mínimo de la degradación térmica de los cannabinoides deseables
farmacológicos en productos de degradación indeseables, en
particular la degradación térmica del \Delta^{9} THC en
cannabinol (CBN),
Preferiblemente, la descarboxilación se realiza
en un procedimiento de calentamiento multi-etapas en
el cual el material de planta es:
- i)
- calentado a una primera temperatura durante un primer período de tiempo (relativamente corto) para evaporar el agua retenida y permitir un calentamiento uniforme del material de planta; y
- ii)
- la temperatura se aumenta a una segunda temperatura durante un segundo período de tiempo (típicamente más largo que el primer período de tiempo) hasta que haya ocurrido una conversión de al menos el 95% de los ácidos cannabinoides en su forma neutra.
Preferiblemente, la primera etapa se lleva a
cabo a una temperatura en el intervalo de 100ºC a 110ºC durante
10-20 min. Más preferiblemente, la primera
temperatura es aproximadamente 105ºC y el primer período de tiempo
es aproximadamente 15 minutos.
Los tiempos óptimos y las temperaturas para la
segunda etapa pueden variar según la naturaleza del material de
planta, y más en particular según el cannabinoide que se quiere
aislar a partir del material de planta, y pueden ser fácilmente
determinados por un experimento rutinario. Las condiciones adecuadas
pueden incluir, por ejemplo, una temperatura en el intervalo de
115ºC a 125ºC durante un período de tiempo en el intervalo de 45 a
75 minutos (típicamente 120ºC durante 60 minutos), o una temperatura
en el intervalo de 135ºC a 145ºC, durante un periodo de tiempo en
el intervalo de 15 a 45 minutos.
Si el material de planta se deriva de plantas de
cannabis que tienen un contenido de THC alto (definido como THC
> 90% como un porcentaje del contenido de cannabinoide total), la
segunda temperatura está preferiblemente en el intervalo de 115ºC a
125ºC, típicamente 120ºC, y el segundo período de tiempo está
preferiblemente en el intervalo de 45 minutos a 75 minutos,
típicamente aproximadamente 60 minutos. Más preferiblemente, la
segunda temperatura está en el intervalo de 100ºC a 110ºC,
típicamente 105ºC, y el segundo período de tiempo está en el
intervalo de 60 a 120 minutos. En otra realización, la más preferida
para una masa de material de planta mayor que 4 kilogramos, la
segunda temperatura está en el intervalo de 140ºC a 150ºC,
preferiblemente 145ºC, y el segundo período de tiempo está en el
intervalo de 45 a 55 minutos.
Cuando el "material de planta" de partida
está recientemente cosechado o el material de planta está
"mojado" puede ser sometido a una etapa de secado para
eliminar la humedad en exceso antes de la etapa (i). Por
conveniencia, la descarboxilación y el secado pueden ser combinados
en una etapa de calentamiento sencilla o en un procedimiento de
calentamiento multi-etapas, como se describe
anteriormente.
En una realización particular del método de la
invención, el "extracto que contiene un cannabinoide o ácido
cannabinoide" preparado a partir del material de planta de
partida puede ser una "sustancia farmacéutica botánica"
preparada a partir del material de planta, o una disolución
etanólica de tal sustancia farmacéutica botánica. En el contexto de
esta aplicación una "sustancia farmacéutica botánica" es un
extracto derivado a partir del material de planta, cuyo extracto
cumple la definición de "sustancia farmacéutica botánica"
proporcionada en Guidance for Industry Botanical Drug Products
Draft Guidance, agosto de 2000. Department of Health and Human
Services, Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation
and Research de EE.UU.: "Una sustancia farmacéutica derivada de
una o varias plantas, algas, u hongos macroscópicos se prepara a
partir de materias primas botánicas por uno o varios de los
procedimientos siguientes: pulverización, decocción, expresión,
extracción acuosa, extracción etanólica u otros procedimientos
similares".
Las "sustancias farmacéuticas botánicas"
derivadas a partir de plantas del cannabis incluyen extractos
primarios preparados por procedimientos tales como, por ejemplo,
maceración, filtración y extracción con disolvente. La extracción
con disolvente puede ser realizada usando esencialmente cualquier
disolvente que disuelva ácidos cannabinoides/cannabinoides, tales
como, por ejemplo, alcoholes de C1 a C5 (p. ej etanol, metanol),
aléanos de C5-C12 (p. ej hexano), Norflurano
(HFA134a), HFA227 y dióxido de carbono. Cuando se usan disolventes
tales como los expuestos en la lista anterior, el extracto
resultante contiene típicamente el material soluble en lípidos no
específico. Este puede ser retirado por una variedad de
procedimientos incluyendo la "winterización", que implica
enfriar a -20ºC seguido de la filtración para eliminar el lastre
céreo, la extracción con dióxido de carbono líquido y por
destilación. Los protocolos generales para la preparación de
sustancias farmacéuticas botánicas a partir del material de planta
del cannabis se describen en la solicitud de patente internacional
publicada del solicitante WO 02/064109.
La sustancia farmacéutica botánica se obtiene
preferiblemente por extracción con dióxido de carbono (CO_{2})
seguido de una extracción secundaria, p. ej una precipitación
etanólica, para eliminar una proporción sustancial de materiales no
cannabinoides, p. ej ceras, ésteres céreos y glicéridos, residuos de
ácido graso no saturado, terpenos, carotenos y flavinoides y otros
lastres. Lo más preferible es que la sustancia farmacéutica botánica
sea producida por un procedimiento que comprenda la extracción con
CO_{2} líquido, en condiciones subcríticas o supercríticas, y
luego una extracción adicional, preferiblemente una precipitación
etanólica, para eliminar las cantidades significativas del
lastre.
Si se requiere preparar cannabinoides libres a
partir del material de la planta del cannabis entonces el material
preferiblemente se calienta a una temperatura definida durante un
período definido de tiempo a fin de descarboxilar los ácidos
cannabinoides en cannabinoides libres antes de la extracción de la
sustancia farmacéutica botánica.
En la realización más preferida, la sustancia
farmacéutica botánica se prepara según un procedimiento que
comprende las etapas siguientes:
- i)
- descarboxilación opcional del material de planta,
- ii)
- extracción con CO_{2} líquido (más preferiblemente en condiciones subcríticas), para producir una sustancia farmacéutica botánica cruda,
- iii)
- precipitación con alcohol C1-C5 para reducir la proporción de materiales no objetivo,
- iv)
- retirada del precipitado (preferiblemente por filtración),
- v)
- tratamiento opcional con carbón activo, y
- vi)
- evaporación para eliminar el alcohol C1-C5 y el agua, produciendo así una sustancia farmacéutica botánica final.
Un ejemplo detallado de tal procedimiento es
descrito en los Ejemplos que acompañan.
El "extracto que contiene un cannabinoide o
ácido cannabinoide" se somete a una etapa de purificación
cromatográfica para producir un extracto parcialmente purificado.
El objetivo de esta etapa es reducir la cantidad di material "no
objetivo", es decir el no cannabinoide o no ácido cannabinoide,
en el extracto y también proporcionar un grado de
separación/fraccionamiento de los diversos componentes del
cannabinoide/ácido cannabinoide del extracto de planta crudo
obtenido en la etapa (i). Típicamente, el producto de la etapa
cromatográfica se recoge en fracciones múltiples, que pueden ser
analizadas entonces según la presencia del cannabinoide/ácido
cannabinoide deseado usando cualquier técnica analítica adecuada (p
ej. TLC). Las fracciones enriquecidas en el cannabinoide/ácido
cannabinoide deseado pueden ser seleccionadas entonces para otra
purificación más.
La etapa cromatográfica comprenderá
preferiblemente la cromatografía de columna, y está preferiblemente
basada en la exclusión molecular y la polaridad. Los materiales de
matriz de columna preferidos son materiales lipofílicos hidrófilos,
por ejemplo dextranos reticulados hidroxipropilados tales como
LH-20^{TM} de Sephadex. Pueden usarse diversos
disolventes diferentes en combinación con este tipo de matriz, por
ejemplo, dimetil-sulfóxido, piridina, agua,
dimetilformamida, metanol, solución salina, dicloruro de etileno,
cloroformo, propanol, etanol, isobutanol, formamida, dicloruro de
metileno, butanol, isopropanol, tetrahidrofurano, dioxano,
cloroformo/diclorometano, etc.
En la realización más preferida, la etapa
cromatográfica comprende la cromatografía de columna en una columna
LH-20^{TM} de Sephadex, eluyendo preferiblemente
con una mezcla 2:1 de cloroformo/diclorometano. Sin embargo, puede
usarse cualquier combinación adecuada del material de
empaquetamiento de la columna y del disolvente con características
de separación adecuadas para uso en la separación (fraccionamiento)
de cannabinoides y ácidos cannabinoides con un efecto equivalente.
El eluato de la columna típicamente se recupera en diversas
fracciones. Se analizan las fracciones según la presencia del
cannabinoide/ácido cannabinoide deseado usando una técnica
analítica adecuada, y aquellas fracciones que contienen las
cantidades más altas del cannabinoide o ácido cannabinoide deseado
son seleccionadas para su procesamiento adicional. El disolvente se
retira entonces de las fracciones seleccionadas, preferiblemente
por evaporación rotatoria.
El producto parcialmente purificado obtenido de
la etapa cromatográfica se disuelve de nuevo en un primer
disolvente. Cualquier residuo insoluble (p. ej material en
partículas) se retira de la disolución resultante, típicamente por
filtración. El primer disolvente se retira entonces, preferiblemente
por evaporación rotatoria. El producto de esta etapa se disuelve de
nuevo en un segundo disolvente. Otra vez, se retira cualquier
residuo insoluble (p. ej material en partículas) de la disolución
resultante, típicamente por filtración. El segundo disolvente se
retira entonces, preferiblemente por evaporación rotatoria, para
producir el producto final, que es un cannabinoide o ácido
cannabinoide puro sustancial o un producto enriquecido en un
cannabinoide o ácido cannabinoide dado.
El objetivo de estas dos etapas de
"tratamiento con disolvente" es eliminar contaminantes, dejando
una preparación sustancialmente pura del cannabinoide deseado o del
ácido cannabinoide.
En la realización preferida, los primeros y
segundos disolventes son diferentes. Uno de los primeros o segundos
disolventes es un disolvente que es sustancialmente más polar que el
cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar. El
tratamiento con este disolvente tiene el efecto de eliminar
componentes indeseados que son menos polares que el
cannabinoide/ácido cannabinoide deseado. El otro disolvente es un
disolvente que es sustancialmente menos polar que el
cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar. El
tratamiento con este disolvente tiene el efecto de eliminar
componentes indeseados que son más polares que el cannabinoide/ácido
cannabinoide deseado. El efecto combinado del tratamiento
secuencial con los dos tales disolventes es el de pasar de
"cabeza a cola" el extracto parcialmente purificado para
producir un producto sustancialmente puro. Las dos etapas de
tratamiento con disolvente pueden ser realizadas en cualquier orden.
Es inmaterial a la purificación total si son retirados primero los
contaminantes "menos polares" o los "más polares".
Los primeros y segundos disolventes pueden ser
esencialmente cualquier disolvente que disuelva cannabinoides y/o
ácidos cannabinoides y que tengan la polaridad deseada en
comparación con el cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea
aislar.
Los disolventes preferidos para uso en estas
etapas de tratamiento incluyen alcoholes, en particular alcoholes
C1-C5, siendo el metanol, en particular, el
preferido, y también alcanos C5-C12 de cadena lineal
o ramificada, siendo el más preferido el pentano. Una combinación
particularmente preferida de primeros y segundos disolventes, que
es adecuada para uso en la preparación de la mayoría de
cannabinoides y ácidos cannabinoides, es el metanol y el pentano.
Estos disolventes pueden usarse en cualquier orden.
El procedimiento de la invención generalmente
causa el aislamiento de cannabinoides sustancialmente puros o
ácidos cannabinoides de una pureza cromatográfica alta. Los
cannabinoides sustancialmente puros o los ácidos cannabinoides a
menudo son obtenidos como sólidos cristalinos o soluciones incoloras
claras. Los inventores han determinado que el procedimiento de la
invención puede usarse para preparar preparaciones sustancialmente
puras de cannabinoides o ácidos cannabinoides que tengan un grado
más alto de pureza cromatográfica que las preparaciones antes
conocidas de la técnica anterior. Por lo tanto, en un aspecto muy
importante, el procedimiento de la invención proporciona una
solución al problema de la preparación/el aislamiento de
cannabinoides y ácidos cannabinoides en un grado alto de pureza. El
procedimiento es ventajosamente barato, fácil de escalar y aplicable
a una amplia variedad de diferentes cannabinoides y ácidos
cannabinoides.
El procedimiento de la invención puede usarse
para preparar formas sustancialmente puras, o productos
enriquecidos, esencialmente, en cualesquiera cannabinoides o ácidos
cannabinoides naturales en el material de planta (incluyendo formas
cannabinoides libres de ácidos cannabinoides naturales).
Las características esenciales del procedimiento
son las mismas para la purificación de todos los cannabinoides y
ácidos cannabinoides. Las plantas de cannabis contienen generalmente
mezclas complejas de ácidos cannabinoides y cannabinoides, aunque
según la variedad del cannabis, pueda predominar algún tipo de
cannabinoide. El objetivo de la etapa cromatográfica (ii) es
separar los diversos componentes cannabinoide/ácido cannabinoide del
extracto de planta crudo obtenido en la etapa (i). Típicamente, el
producto de la etapa cromatográfica se recoge en fracciones
múltiples, que pueden analizarse entonces según la presencia del
cannabinoide/ácido cannabinoide deseado usando cualquier técnica
analítica adecuada (p. ej, TLC). Las fracciones enriquecidas en el
cannabinoide/ácido cannabinoide deseado pueden ser seleccionadas
entonces para otra purificación más. A partir de ahí, pueden
adaptarse las mismas etapas de procedimiento simples para la
purificación de esencialmente cualquier cannabinoide o ácido
cannabinoide derivado de la planta.
La selectividad de los diferentes cannabinoides
o ácidos cannabinoides puede ser realzada por la selección del
material de planta de partida apropiado. De forma ilustrativa, si se
desea preparar \Delta^{9} THC o \Delta^{9} THC A
sustancialmente puro entonces deberían seleccionarse preferiblemente
plantas de cannabis con un "THC alto" como material de
partida. Mientras que, si se desea preparar CBD sustancialmente puro
o CBDA entonces deberían seleccionarse preferiblemente plantas de
cannabis con un "CBD alto" como material de partida. Sin
embargo, debe sobrentenderse que el procedimiento de la invención es
de utilidad general y no está limitado al uso de variedades de
cannabis particulares como material de partida.
La operación con plantas de cannabis y
cannabinoides puede requerir un permiso gubernamental en algunos
territorios pero los gobiernos ponen generalmente dichas licencias
a disposición de las partes que lo solicitan con objetivos de
investigación medicinal y desarrollo comercial de medicinas. En el
Reino Unido, puede obtenerse una licencia del Ministerio de Asuntos
Interiores.
El contenido de cannabinoide preciso de
cualquier material de planta de cannabis particular puede
determinarse cualitativamente y cuantitativamente usando técnicas
analíticas conocidas por los expertos en la técnica, tales como
cromatografía de capa fina (TLC) o cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC). Por lo tanto, se puede rastrear una variedad de
plantas de cannabis y seleccionar aquellas con un alto contenido del
cannabinoide o ácido cannabinoide deseado para uso como material de
partida en el procedimiento de la invención.
Con el uso de técnicas de cultivo selectivas
convencionales es posible desarrollar variedades de cannabis
(quimiovares) con una variación del contenido de cannabinoide.
Usando tales técnicas de cultivo selectivas tradicionales, los
inventores han sido capaces de seleccionar variedades de cannabis
(quimiovares) con un contenido relativamente alto de CBD, o de los
cannabinoides menores \Delta^{9} tetrahidrocannabivarina
(\Delta^{9} THCV), cannabigerol (CBG) o cannabicromeno (CBC).
Los protocolos generales para cultivar el cannabis medicinal y para
probar el contenido cannabinoide de plantas del cannabis son
descritos en la solicitud de patente internacional publicada del
solicitante WO 02/064109.
Cuando se desean purificar cannabinoides libres,
en vez de los ácidos cannabinoides correspondientes, entonces el
procedimiento incluirá generalmente una etapa de
"descarboxilación" para descarboxilar los ácidos cannabinoides
libres en el cannabinoide libre correspondiente. Como se menciona
anteriormente, puede incluirse una etapa de descarboxilación antes
de la etapa (i), si se desea, aislar cannabinoides libres, o si se
desea se omite para aislar los ácidos cannabinoides.
El procedimiento de la invención es
particularmente preferido para uso en la preparación del ácido
\Delta^{9} tetrahidrocannabinólico sustancialmente puro
(\Delta^{9} THCA), ácido cannabidiólico (CBDA), \Delta^{9}
tetrahidrocannabinol (\Delta^{9} THC) y \Delta^{9}
tetrahidrocannabivarina (\Delta^{9} THCV) a partir del material
de planta del cannabis, y en la preparación de extractos de material
de planta del cannabis muy enriquecido en cannabigerol (CBG) o
cannabicromeno (CBC).
También se describen en este documento
preparaciones sustancialmente puras de ciertos cannabinoides y
ácidos cannabinoides y productos muy enriquecidos en ciertos
cannabinoides.
En particular, se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura del ácido \Delta^{9}
tetrahidrocannabinólico (\Delta^{9} THCA) con una pureza
cromatográfica mayor del 95%, más preferiblemente mayor del 96%,
más preferiblemente mayor del 97% y lo más preferiblemente mayor del
98% por la normalización del área de un perfil HPLC. La preparación
es típicamente un sólido cristalino amarillo palo a temperatura
ambiente, con un punto de fusión de \sim70ºC.
La preparación comprende preferiblemente:
- menos del 2%, preferiblemente menos del 1,5%, lo más preferiblemente 1% o menos de \Delta^{9} THC (p/p),
- menos del 2%, más preferiblemente menos del 1,5%, más preferiblemente menos del 1% y lo más preferiblemente menos del 0,5% de CBD (p/p),
- menos del 2%, más preferiblemente menos del 1,5%, y lo más preferiblemente menos del 1% de CBN (p/p).
Los inventores son los primeros en aislar
\Delta^{9} THCA a partir del material de planta con este nivel
de pureza en forma cristalina. El \Delta^{9} THCA puro es útil
como material de partida para la preparación de \Delta^{9} THC
puro por descarboxilación, también como un estándar
cromatográfico.
El método preferido para la preparación de
\Delta^{9} THCA sustancialmente puro a partir del material de
planta del cannabis comprende:
- i)
- preparar un extracto a partir del material de planta de cannabis con ácido acético al 0,1% v/v en hexano,
- ii)
- filtrar el extracto resultante y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para formar un extracto enriquecido en \Delta^{9} THCA,
- iii)
- pasar una disolución del extracto enriquecido resultante de \Delta^{9} THCA a través de una columna empaquetada con Sephadex-LH20^{TM}, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- iv)
- recuperar las fracciones ricas en \Delta^{9} THCA eluidas de la columna y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- v)
- disolver de nuevo el producto crudo \Delta^{9} THCA obtenido en la etapa iv) en metanol, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el producto de la etapa v) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para producir cristales de \Delta^{9} THCA.
El material de planta de cannabis
preferiblemente se derivará de plantas de cannabis con un contenido
de \Delta^{9}-THCA relativamente alto, lo más
preferiblemente plantas de cannabis que contienen > 90% de
\Delta^{9} THCA como un porcentaje del contenido de
cannabinoide total.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura de ácido cannabidiólico (CBDA) con
una pureza cromatográfica mayor del 90%, más preferible mayor del
92% y lo más preferiblemente mayor del 94% por la normalización del
área de un perfil HPLC. La preparación es típicamente un sólido
cristalino amarillo palo a temperatura ambiente, con un punto de
fusión en el intervalo de 45-48ºC.
La preparación comprende preferiblemente:
- 5% o menos, preferiblemente 4,5% o menos, más preferiblemente 4% o menos, más preferiblemente 3,5% o menos y lo más preferiblemente 3% o menos de CBD (p/p),
- menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de \Delta^{9} THCA (p/p),
- menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de \Delta^{9} THC (p/p).
De nuevo, los inventores son los primeros en
aislar CBDA a partir del material de planta con este nivel de
pureza en la forma cristalina.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura de ácido cannabidiólico (CBDA) con
una pureza cromatográfica mayor del 94%, más preferiblemente mayor
del 96% y lo más preferiblemente mayor del 98% por la normalización
del área de un perfil HPLC. La preparación es preferiblemente una
disolución incolora clara a temperatura ambiente. La preparación
comprende típicamente:
- 3% o menos, más preferiblemente 2% o menos, más preferiblemente 1% o menos y lo más preferiblemente 1% o menos y lo más preferiblemente menos del 0,1% de CBD (p/p),
- menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0.3% de THCA (p/p),
- menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de \Delta^{9}-THC (p/p).
El CBDA puro es útil como material de partida
para la preparación de CBD puro por descarboxilación, también como
un estándar cromatográfico y también puede tener potencial
farmacéutico. La capacidad de preparar CBDA a un alto nivel de
pureza permitirá otros estudios de utilidad farmacéutica de este
ácido cannabinoide.
El método preferido para la preparación de CBDA
sustancialmente puro a partir del material de planta de cannabis
comprende:
- i)
- preparar un extracto a partir del material de planta del cannabis con ácido acético al 0,1% v/v en hexano,
- ii)
- filtrar el extracto resultante y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para formar un extracto enriquecido en CBDA,
- iii)
- pasar una disolución del extracto enriquecido en CBDA resultante a través de una columna empaquetada con Sephadex-LH2^{TM}, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- iv)
- recuperar las fracciones ricas en CBDA eluidas de la columna y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- v)
- disolver de nuevo el CBDA crudo obtenido en la etapa iv) en metanol, para eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el producto de la etapa v) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para producir cristales de CBDA o una disolución.
El material de planta del cannabis se derivará
preferiblemente a partir de plantas de cannabis que tienen un
contenido de CBDA relativamente alto, lo más preferiblemente plantas
de cannabis que contienen > 90% de CBDA como un porcentaje del
contenido de cannabinoide total.
Cuando el producto del método es una disolución
de CBDA, el método puede incluir opcionalmente una etapa de
purificación adicional de cromatografía súbita. El método puede
incluir opcionalmente una etapa de purificación adicional de
cromatografía súbita que comprende vii) cargar la disolución
sustancialmente pura de CBDA en una columna de cartucho de sílice
Flash BT 12M de Chromabond, eluyendo con hexano:acetato de etilo
(98:2) a un caudal de aproximadamente 5 ml/min.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura de \Delta^{9}
tetrahidrocannabinol (\Delta^{9} THC) con una pureza
cromatográfica mayor del 99% por la normalización del área de un
perfil HPLC. La preparación es un semisólido a temperatura
ambiente.
La preparación preferiblemente comprende menos
del 0,5%, preferiblemente que el 0,4%, más preferiblemente menos
del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de CBD (p/p), menos
del 0,5%, preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos
del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de CBN (P/P).
Lo más preferiblemente, la preparación no
contiene ningún CBD detectable (< 0,1%) y ningún CBN detectable
(< 0,1%), según se analiza por HPLC.
Los inventores son los primeros en aislar
\Delta^{9} THC a partir del material de planta a una pureza
> 99% y en forma semisólida. Se ha descrito previamente el
\Delta^{9} THC en la bibliografía como un aceite amarillo y
nunca se ha obtenido en forma cristalina. El \Delta^{9} THC puro
tiene una utilidad obvia como agente farmacéutico activo, y también
es útil como estándar cromatográfico, en particular como un
estándar relativo en el análisis cualitativo de sustancias
farmacéuticas botánicas derivadas del cannabis. La disponibilidad
de \Delta^{9} THC muy puro también facilitará los estudios de
farmacología de \Delta^{9} THC.
El método preferido para la preparación de
\Delta^{9} THC sustancialmente puro comprende:
- i)
- obtener una disolución etanólica de una sustancia farmacéutica botánica a partir del material de planta del cannabis descarboxilado,
- ii)
- pasar la disolución obtenida en la etapa i) por una columna de carbón activo, y recuperar el eluato,
- iii)
- eliminar el disolvente del eluato por evaporación rotatoria para dar la fracción enriquecida de \Delta^{9} THC,
- iv)
- pasar una disolución del extracto enriquecido de \Delta^{9} THC resultante a través de una columna empaquetada con Sephadex LH20, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- v)
- recuperar las fracciones ricas en \Delta^{9} THC y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el producto crudo \Delta^{9} THC preparado en la etapa v) en metanol, para eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vii)
- disolver de nuevo el producto crudo \Delta^{9} THC preparado en la etapa vi) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para dar una preparación semisólida de \Delta^{9} THC.
En este método, la disolución etanólica de una
sustancia farmacéutica botánica a partir del material de planta del
cannabis descarboxilado preferiblemente se obtiene por un método que
comprende las etapas siguientes:
- i)
- cultivar el material de planta del cannabis,
- ii)
- descarboxilar el material de planta,
- iii)
- extraer con dióxido de carbono líquido (CO_{2}), eliminar el CO_{2} para recuperar el extracto crudo,
- iv)
- disolver el extracto crudo en etanol seguido de enfriamiento de la disolución para precipitar ceras no deseadas,
- v)
- eliminar el material céreo no deseado por filtración en frío.
El material de planta del cannabis
(descarboxilado) se derivará preferiblemente a partir de plantas de
cannabis que tienen un contenido de THC relativamente alto, lo más
preferiblemente plantas de cannabis que contienen > 90% de THC
(\Delta^{9} THCA más \Delta^{9} THC) como un porcentaje del
contenido de cannabinoide total. El material de planta se somete a
la descarboxilación a fin de convertir el \Delta^{9} THCA
natural en \Delta^{9} THC.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura de \Delta^{9}
tetrahidrocannabivarina (\Delta^{9} THCV) con una pureza
cromatográfica mayor del 95%, más preferible mayor del 98%, más
preferible mayor del 97%, más preferible mayor del 98%, y lo más
preferible mayor del 99% por la normalización del área de un perfil
HPLC. La preparación es típicamente un sólido cristalino a
temperatura ambiente.
La preparación comprende preferiblemente menos
del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos
del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente
menos del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% CBD (p/p),
menos del 2,0%, preferiblemente menos del 1,5%, más preferiblemente
menos del 1,0% y lo más preferiblemente el 0,5% o menos de
\Delta^{9} THC (p/p), menos del 1%, preferiblemente menos del
0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos
del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,2% y lo más
preferiblemente menos del 0,1% de CBN (p/p).
De nuevo, los inventores son los primeros en
aislar \Delta^{9} THCV a partir del material de planta con este
nivel de pureza y en forma cristalina. La disponibilidad del
\Delta^{9} THCV puro permitirá estudios de farmacología de este
cannabinoide menor y la evaluación de su potencial farmacéutico. El
\Delta^{9} THCV puro es también útil como estándar
cromatográfico y como material de partida para la preparación de
cannabivarina pura (CBV), por ejemplo por degradación térmica del
\Delta^{9} THCV en aire.
El método preferido para la preparación de
\Delta^{9} THCV sustancialmente puro a partir del material de
planta comprende:
- i)
- obtener una disolución etanólica de una sustancia farmacéutica botánica a partir del material de planta del cannabis,
- ii)
- pasar la disolución obtenida en la etapa i) por una columna de carbón activo y recuperar el eluato,
- iii)
- eliminar el disolvente del eluato por evaporación rotatoria para dar la fracción enriquecida de \Delta^{9} THCV,
- iv)
- pasar una disolución del extracto enriquecido de \Delta^{9} THCV resultante a través de una columna empaquetada con Sephadex LH20, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- v)
- recuperar las fracciones ricas en \Delta^{9} THCV y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el producto crudo \Delta^{9} THCV preparado en la etapa v) en metanol, para eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vii)
- disolver de nuevo el producto crudo \Delta^{9} THCV preparado en la etapa vi) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para dar cristales de \Delta^{9} THCV.
La disolución etanólica de una sustancia
farmacéutica botánica a partir del material de planta del cannabis
se obtiene preferiblemente por un método que comprende las etapas
siguientes:
- i)
- cultivar y descarboxilar el material de planta del cannabis,
- ii)
- extraer con dióxido de carbono líquido (CO_{2}), retirar el CO_{2} para recuperar el extracto crudo,
- iii)
- disolver el extracto crudo en etanol seguido de enfriamiento de la disolución para precipitar las ceras no deseadas,
- iv)
- retirar el material céreo no deseado por filtración en frío.
El material de planta del cannabis se derivará
preferiblemente a partir de plantas de cannabis que tienen un
contenido de \Delta^{9} THCV relativamente alto.
También se describe en este documento un
producto enriquecido en cannabigerol (CBG) con una pureza
cromatográfica mayor del 90%, preferiblemente mayor del 92% por la
normalización del área de un perfil HPLC.
El producto comprende preferiblemente menos del
1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del
0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos
del 0,2% y lo más preferiblemente menos del 0,1% de CBD (p/p),
menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente
menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%, más
preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente el 0,1% o
menos de \Delta^{9} THC (p/p).
El producto, lo más preferiblemente, no contiene
ningún CBN detectable (< 0,1%) o CBD y no más del 0,1% de
\Delta^{9} THC, según se analiza por HPLC.
Otra vez, los inventores son los primeros en
preparar extractos de planta a partir del cannabis que contienen el
CBG cannabinoide menor con este nivel de pureza cromatográfica.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura del cannabigerol (CBG) con una
pureza cromatográfica mayor del 92%, más preferiblemente mayor del
94%, más preferiblemente mayor del 96% y lo más preferiblemente
mayor del 97% por la normalización del área de un perfil HPLC. La
preparación es preferiblemente una disolución incolora clara a
temperatura ambiente.
La preparación comprende típicamente: 4% o
menos, más preferiblemente 3% o menos, y lo más preferiblemente
menos del 2% de CBD (p/p), menos del 1%, preferiblemente menos del
0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos
del 0,4%. más preferiblemente menos del 0,2% y lo más
preferiblemente menos del 0,1% de
\Delta^{9}-THG (p/p), menos del 1%,
preferiblemente menos del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%,
más preferiblemente menos del 0,4%, más preferiblemente menos del
0,2%, y lo más preferiblemente menos del 0,1% de CBN (p/p).
La disponibilidad de tales extractos
enriquecidos o preparaciones sustancialmente puras permitirá una
evaluación más de la farmacología de CBG con el fin de estudiar su
potencial farmacéutico. El extracto/preparación sustancialmente
enriquecida pura es también útil como un estándar de referencia en
la caracterización cromatográfica de medicinas derivadas del
cannabis.
El método preferido para preparar extractos de
CBG enriquecidos o preparaciones sustancialmente puras de CBG a
partir del material de planta del cannabis comprende:
- i)
- descarboxilar el material de planta del cannabis,
- ii)
- preparar un extracto a partir del material de planta del cannabis descarboxilado con hexano,
- iii)
- filtrar el extracto resultante y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para formar un extracto enriquecido en CBG,
- iv)
- pasar una disolución del extracto enriquecido de CBG resultante a través de una columna empaquetada con Sephadex-LH20^{TM}, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- v)
- recuperar las fracciones ricas en CBG eluidas de la columna y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el CBG crudo obtenido en la etapa v) en metanol, para eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vii)
- disolver de nuevo el producto de la etapa vi) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para producir un extracto de CBG muy enriquecido o una preparación sustancialmente pura de CBG.
\vskip1.000000\baselineskip
El material de planta de cannabis se derivará
preferiblemente a partir de plantas del cannabis que tienen un
contenido de CBG relativamente alto.
Opcionalmente, puede llevarse a cabo una etapa
adicional de cromatografía súbita para mejorar más la pureza,
preferiblemente como se dispone en la etapa viii) más abajo. Tal
etapa causa una mejora adicional de la pureza mayor del 99% (p/p).
La persona experta apreciará que podría usarse una etapa equivalente
para mejorar la pureza para cualquiera de los otros
cannabinoides.
Etapa viii) cargar el cannabigerol
sustancialmente puro o el producto enriquecido con cannabigerol en
una columna de cartucho de sílice Flash BT 12M de Chromabond,
eluyendo con hexano:acetato de etilo (98:2) a un caudal de
aproximadamente 5 ml/min.
También se describe en este documento un
producto enriquecido con cannabicromeno (CBC) con una pureza
cromatográfica mayor del 80%, más preferiblemente mayor del 85% por
la normalización del área de un perfil HPLC.
El producto comprende preferiblemente menos del
5%, preferiblemente menos del 4%, más preferiblemente menos del 3%,
más preferiblemente menos del 2% y lo más preferiblemente el 1% o
menos de CBD (p/p), menos del 2%, preferiblemente menos del 1,5%,
más preferiblemente menos del 1,0%, más preferiblemente menos del
0,5% y lo más preferiblemente el 0,3% o menos de \Delta^{9} THC
(p/p), menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más
preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%,
más preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente el 0,1%
o menos de CBN (p/p).
Otra vez, los inventores son los primeros en
preparar extractos de planta de cannabis que contienen el CBC
cannabinoide menor con este nivel de pureza cromatográfica.
También se describe en este documento una
preparación sustancialmente pura del cannabicromeno (CBC) con una
pureza cromatográfica mayor del 85%, más preferiblemente mayor del
90%, más preferiblemente mayor del 95%, más preferiblemente mayor
del 98% y lo más preferiblemente mayor del 99% por la normalización
del área de un perfil HPLC. La preparación es una disolución
incolora clara a temperatura ambiente.
La preparación típicamente comprende: 1% o
menos, más preferiblemente 0,8% o menos, más preferiblemente 0,6% o
menos, más preferiblemente 0.4% o menos y lo más preferiblemente
menos del 0,2% de CBD (p/p), menos del 1%, preferiblemente menos
del 0,8%, más preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente
menos del 0,4%, más preferiblemente menos del 0,2% y lo más
preferiblemente menos del 0,1% de \Delta^{9}-THC
(p/p), menos del 1%, preferiblemente menos del 0,8%, más
preferiblemente menos del 0,6%, más preferiblemente menos del 0,4%,
más preferiblemente menos del 0,2% y lo más preferiblemente menos
del 0,1% de CBN (p/p).
La disponibilidad de tales extractos
enriquecidos/preparaciones sustancialmente puras permitirá una
evaluación adicional de la farmacología de CBC a fin de evaluar su
potencial farmacéutico. El extracto enriquecido/preparación
sustancialmente pura es también útil como un estándar de referencia
en la caracterización cromatográfica de medicinas derivadas del
cannabis.
\newpage
El método preferido para preparar extractos de
CBG enriquecidos o preparaciones sustancialmente puras del CBG a
partir del material de planta del cannabis comprende:
- i)
- descarboxilar el material de planta del cannabis,
- ii)
- preparar un extracto a partir del material de planta del cannabis descarboxilado con hexano,
- iii)
- filtrar el extracto resultante y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para formar un extracto enriquecido en CBG,
- iv)
- pasar una disolución del extracto enriquecido de CBG resultante a través de una columna empaquetada con Sephadex-LH20^{TM}, eluyendo con cloroformo/diclorometano 2:1,
- v)
- recuperar las fracciones ricas en CBG eluidas de la columna y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria,
- vi)
- disolver de nuevo el CBG crudo obtenido en la etapa v) en metanol, para eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria,
- vii)
- disolver de nuevo el producto de la etapa vi) en pentano, eliminar el residuo insoluble por filtración y eliminar el disolvente del filtrado por evaporación rotatoria para producir un extracto o preparación sustancialmente pura de CBG muy enriquecida.
El material de planta del cannabis se derivará
preferiblemente a partir de plantas del cannabis que tiene un
contenido de CBG relativamente alto.
El método puede incluir opcionalmente una etapa
de purificación adicional de cromatografía súbita que comprende
viii) cargar la preparación sustancialmente pura de CBG o el
producto enriquecido en CBG en una columna de cartucho de sílice
Flash BT 12M de Chromabond, eluyendo con hexano:acetato de etilo
(98:2) a un caudal de aproximadamente 5 ml/min.
La invención será explicada en adelante con
referencia a los siguientes ejemplos experimentales, junto con las
Figuras que acompañan, en las que:
La figura 1 muestra un perfil de TLC de
\Delta^{9} THCA cristalino, comparado con el material de partida
(a partir del quimiovar de cannabis G1) y estándares de CBD y
\Delta^{9} THC. Condiciones cromatográficas: SII G/UV_{254},
fase móvil hexano:dietil-éter 80:20, doble desarrollo, Visualización
sal de Fast Blue B al 0,1% en agua. Estándares: 1 mg/ml de CBD (BN
10601/C) en 5 \mul de MeOH aplicado a la placa de TLC, 1 mg/ml de
\Delta^{9} THC (BN 10601/B) en 5 \mul de MeOH aplicado a la
placa de TLC. Muestras: 1 mg/ml de THCA como material de partida en
5 \mul de MeOH aplicado a la placa de TLC, 1 mg/ml de THCA
cristalino en 5 \mul de MeOH aplicado a la placa de TLC.
La figura 2 muestra perfiles de HPLC de
\Delta^{9} THCA purificado (THCA al 98%, THC al 1%), comparado
con el material de partida (a partir del quimiovar de cannabis G1
THCA al 72%, THC al 17%).
La figura 3 muestra el perfil de TLC de CBDA
cristalino, comparado con el material de partida (a partir del
quimiovar del cannabis G5) y estándares de CBD y \Delta^{9} THC.
Condiciones cromatográficas y estándares como para la Figura 1.
Muestras: 1 mg/ml de CBDA como material de partida en 5 \mul de
MeOH aplicados a la placa de TLC, 1 mg/ml de CBDA cristalino en 5
\mul de MeOH aplicados a la placa de TLC.
La figura 4 muestra perfiles de HPLC de CBDA
cristalino (CBDA al 94%, CBD al 3%), comparado con el material de
partida (a partir del quimiovar del cannabis G5; CBDA al 72%, CBD al
14%).
La figura 5 muestra un perfil de HPLC de una
disolución incolora de CBDA (a partir del quimiovar del cannabis
G5).
La figura 6 muestra perfiles de TLC de
\Delta^{9} THC purificado comparados con el material de partida
de BDS y los estándares CBD y \Delta^{9} THC. Condiciones
cromatográficas y estándares como para la Figura 1. Muestras: 1
mg/ml de \Delta^{9} THC como material de partida en 5 \mul de
MeOH aplicados a la placa de TLC, 1 mg/ml de \Delta^{9} THC
purificado en 5 \mul de MeOH aplicados a la placa de TLC.
La figura 7 muestra perfiles de HPLC de
\Delta^{9} THC purificado (THC al 99,6%, CBD al 0%) comparado
con el material de partida (BDS; THC al 89%, CBD al 2%).
La figura 8 muestra perfiles de HPLC relativos
de \Delta^{9} THC purificado y el estándar de \Delta^{9}
THC comercialmente disponible (Sigma; THC al 95%, CBN al 4%).
La figura 9 muestra perfiles de GC de
\Delta^{9} THC purificado y el material de partida (BDS).
La figura 10 muestra perfiles de TLC de
\Delta^{9} THCV purificado y THCV como material de partida (BDS)
comparado con los estándares de CBD y \Delta^{9} THC.
Condiciones cromatográficas y estándares como para la Figura 1.
Muestras: 1 mg/ml de \Delta^{9} THCV como material de partida en
5 \mul de MeOH aplicados a la placa de TLC, 1 mg/ml de
\Delta^{9} THCV cristalino en 5 \mul de MeOH aplicados a la
placa de TLC.
La figura 11 muestra perfiles de HPLC de
\Delta^{9} THCV y el material de partida (BDS).
La figura 12 muestra perfiles de GC de
\Delta^{9} THCV purificado y el material de partida (BDS).
La figura 13 muestra perfiles de TLC del
extracto de CBG enriquecido y el material de partida (BDS del
quimiovar G41-descarboxilado) comparado con los
estándares de CBD y de \Delta^{9} THC. Condiciones
cromatográficas y estándares como para la Figura 1. Muestras: 1
mg/ml de CBG como material de partida en 5 \mul de MeOH aplicados
a la placa de TLC, 1 mg/ml del extracto de CBG enriquecido en 5
\mul de MeOH aplicados a la placa de TLC.
La figura 14 muestra perfiles de HPLC del
extracto de CBG enriquecido y el material de partida (BDS del
quimiovar G41-descarboxilado).
La figura 15 muestra un perfil de HPLC de una
preparación de CBG de una disolución incolora (a partir de
quimiovares del cannabis G41 descarboxilado).
La figura 16 muestra un perfil de HPLC de una
preparación de CBG purificada por cromatografía súbita adicional
comparado con un CBG de mejor pureza (a partir de quimiovares de
cannabis G41 descarboxilado).
La figura 17 muestra perfiles de GC de extracto
de CBG enriquecido y material de partida (BDS a partir del
quimiovar G41-descarboxilado).
La figura 18 muestra perfiles de TLC de extracto
de CBC enriquecido y el material de partida (BDS a partir del
quimiovar G80-descarboxilado) comparado con los
estándares de CBD y \Delta^{9} THC. Condiciones cromatográficas
y estándares como para la Figura 1. Muestras: 1 mg/ml del material
de partida CBC en 5 \mul de MeOH aplicados a la placa de TLC, 1
mg/ml de extracto de CBC enriquecido purificado en 5 \mul de MeOH
aplicados a la placa de TLC.
La figura 19 muestra perfiles de HPLC de
extracto de CBC enriquecido y el material de partida (BDS a partir
del quimiovar G80-descarboxilado).
La figura 20 muestra un perfil de HPLC de una
preparación de CBC de una disolución incolora (a partir de
quimiovares del cannabis G80 descarboxilado).
La figura 21 muestra perfiles GC de extracto de
CBC enriquecido y el material de partida (BDS a partir del
quimiovar G80-descarboxilado).
\vskip1.000000\baselineskip
La compañía GW Pharma Ltd ha desarrollado
distintas variedades de híbridos de planta del cannabis para
maximizar el rendimiento de los componentes químicos específicos,
los cannabinoides. Se usan varios tipos de la planta; un quimiovar,
denominado G1 o quimiovar de "THC alto", produce > 90% de
contenido cannabinoide total como \Delta^{9} THC (natural en la
planta en la forma de \Delta^{9} THCA) y un quimiovar adicional,
denominado G5 o quimiovar de "CBD alto" produce > 90% del
contenido cannabinoide total como CBD (natural en la planta en la
forma de CBDA). Otros quimiovares producen cantidades significativas
de los cannabinoides menores \Delta^{9} THCV (quimiovar G9),
CBG (quimiovar G41) y CBC (quimiovar G80). Pueden obtenerse
variedades alternativas - véase por ejemplo, "Common cannabinoids
phenotypes in 350 stocks of cannabis", Small and
Beckstead, Lloydia vol 36b, 1973 p144-156 - y
técnicas de utilización de crecimiento conocidas por los expertos
para maximizar el contenido de cannabinoides.
Todos los disolventes usados en el aislamiento y
análisis de los cannabinoides; n-pentano, hexano,
cloroformo, diclorometano. éter de di-etilo,
acetonitrilo, agua, metanol y ácido acético glaciar eran, a menos
que se especifique de otro modo, de grado cromatográfico o A.R.
Los materiales de referencia de Sigma se usaron
como estándares en el análisis de extractos, intermedios y
productos finales, éstos eran: \Delta^{9} THC en metanol BN
10601/B (aprox. 1 mg/ml) y CBD en metanol BN 10601/C (aprox. 1
mg/ml).
Para la preparación de muestras de
\Delta^{9} THCA y CBDA del quimiovar G1, cannabis de THC (100 g)
y quimiovar G5, cannabis de CBD (100 g), se extrajeron dos veces
con ácido acético glaciar al 0,1% v/v en hexano (grado A.R.) en una
proporción disolvente:hierba de 15:1. Los extractos resultantes se
filtraron y luego el disolvente se retiró por evaporación rotatoria
para producir extractos crudos enriquecidos en los ácidos
cannabinoides respectivos y adecuados para un procesamiento
adicional.
Para la preparación de muestras de cannabigerol
(CBG) y cannabicromeno (CBC) del quimiovar G41, cannabis de CBG
(100 g) y quimiovar G80, cannabis de CBC (100 g) se descarboxilaron
a 120ºC durante 1 hora y luego se extrajeron dos veces con hexano
en una proporción disolvente:hierba de 15:1. Después de retirar el
disolvente, esto produjo un extracto crudo enriquecido en los
compuestos respectivos CBG y CBC y adecuados para un procesamiento
adicional.
Para la preparación de \Delta^{9} THC y
\Delta^{9} THCV se prepararon soluciones etanólicas de
sustancias farmacéuticas botánicas, respectivamente, a partir de
quimiovares de cannabis con THC alto y THCV alto según el
procedimiento siguiente:
La extracción usando CO_{2} líquido se realiza
en condiciones subcríticas a una temperatura de aproximadamente
10ºC \pm 5ºC usando una presión de aproximadamente 60 bares \pm
10 bares. El material de planta descarboxilado se empaqueta en una
columna sencilla y se expone a CO_{2} líquido bajo presión durante
aproximadamente 8 horas, flujo de masas del CO_{2} 1250 kg/h
\pm 20%.
Después de la despresurización y de la purga de
CO_{2} el extracto de BDS crudo se recoge en recipientes
sellados. El extracto de BDS crudo se mantiene a -20ºC \pm
5ºC,
El extracto de BDS crudo contiene ceras y
moléculas de cadenas largas. La retirada es mediante
"winterización", por medio del cual el extracto de BDS crudo
se calienta a, p. ej, 40ºC \pm 4ºC para licuar el material. El
etanol se añade en la proporción 2:1 de etanol en volumen frente al
peso del extracto de BDS crudo. La disolución etanólica se enfría
entonces a -20ºC \pm 5ºC y se mantiene a esta temperatura durante
aproximadamente 48 horas.
Cuando termina la winterización, el precipitado
se retira por filtración en frío a través de un filtro de 20
\mum, para dar una disolución etanólica del BDS.
La limpieza preliminar con carbón puede
realizarse pasando la disolución de BDS etanólica (500 mg/ml) por
una columna de plástico disponible (130 mm x 27 mm i.d) empaquetada
con carbón activo (grado GDC de decolourcarb DCL, de Carbones
Sutcliffe Speakman, 15,4 g por unidad). Se usó etanol absoluto B.P.
(Hayman) como disolvente.
El etanol y cualquier agua que puedan estar
presentes se retiran por evaporación, p. ej evaporación rotatoria o
evaporación de película fina bajo presión reducida (60ºC \pm 2ºC,
con vapor a 40ºC \pm 2ºC/172 mbar y 72 mbar \pm 4 mbar). El
producto resultante puede aplicarse directamente a la columna de
cromatografía.
Las separaciones de cromatografía de columna a
baja presión se realizaron usando una columna de vidrio (longitud x
diámetro interno = 1560 mm x 24 mm), empaquetadas con
LH-20^{TM} de Sephadex (Fluka). La proporción de
altura:diámetro interno de la columna fue, por lo tanto, 65:1. Una
mezcla 2:1 de cloroformo/diclorometano se usó como eluyente. El
eluato se recuperó como fracciones de 50 ml.
Para la purificación de \Delta^{9} THCA y
CBDA se aplicaron aproximadamente 20 ml del extracto crudo que
contenía el equivalente de 100 g de hierba a una columna de vidrio
(dimensiones: longitud 1560 mm x diámetro interno 24 mm),
empaquetada con 400 g de la fase estacionaria
LH-20^{TM} de Sephadex, como se describe
anteriormente. La composición cualitativa de la fracciones eluidas
fue supervisada por TLC.
Para la purificación de \Delta^{9} THC, se
trataron 2,5 g de extracto de BDS (THC) purificado con carbón por
el susodicho sistema de cromatografía a baja presión, (es decir,
proporción fase estacionaria:muestra de 160:1). Las fracciones
eluidas se analizaron para analizar su contenido de \Delta^{9}
THC por TLC.
Para la purificación de CBG y CBC se aplicaron
aproximadamente 20 ml del extracto crudo que contiene el equivalente
de 100 g de hierba a una columna de vidrio (dimensiones: longitud
1560 mm x diámetro interno 24 mm), empaquetada con 400 g de fase
inmóvil sephadex.
Para la purificación de \Delta^{9} THCV, se
trataron 3 g de extracto de BDS (THCV) purificado con carbón
mediante el susodicho sistema de cromatografía a baja presión, (es
decir, proporción fase estacionaria:muestra de 133:1).
Las etapas de disolver de nuevo extractos en los
primeros y segundos disolventes, filtrar para eliminar el material
insoluble y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria se
realizan según procedimientos de laboratorio estándares, como es
conocido por los expertos en la técnica.
La composición cualitativa de fracciones eluidas
de la columna de cromatografía y otros intermedios fue supervisada
por TLC.
La TLC usa tanto el tiempo de retención como el
color de la mancha característica para identificar con eficacia los
componentes cannabinoide/ácido cannabinoide en una mezcla compleja.
Las soluciones metanólicas de las fracciones eluidas de la columna
cromatográfica se preparan para su análisis por TLC. Una parte
alícuota se mancha en una placa TLC, junto a muestras de referencia
adecuadas (p. ej para al menos \Delta^{9} THC y CBD). Después
de la exposición al reactivo Fast Blue B, el THC y THCA se presentan
como manchas rosadas, mientras que CBD y CBDA son de color naranja.
Los neutros pueden distinguirse de los ácidos por comparación del
valor de Rf con el obtenido para los estándares. La identidad se
confirma por comparación de Rf y el color de la mancha de la
muestra, respecto al obtenido para el estándar apropiado.
\vskip1.000000\baselineskip
Un protocolo de TLC típico es como sigue:
Equipo:
Dispositivo de aplicación capaz de administrar
un volumen exactamente controlado de disolución, es decir, pipeta
capilar de 1 \mul o jeringuilla de microlitro.
Recipiente de desarrollo de TLC con tapa
Soplador de aire caliente
Placas de TLC de gel de sílice G (SIL
N\simHR/UV_{254}), 200 \mum de capa con indicador fluorescente
en soporte de poliéster.
Recipiente de inmersión para el reactivo de
visualización.
- Fase móvil
- Bencina al 80% 60:80/dietil-éter al 20%.
- Reactivo de visualización
- sal BN de Fast Blue B al 0,1% p/v acuosa (Sigma Corp) (100 mg en 100 ml agua desionizada).
- \quad
- Un método opcional es hacer un barrido a UV 254 y 365 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 200 mg de cannabis finamente
granulado y seco se pesan en un matraz volumétrico de 10 ml.
Completar el volumen usando el disolvente de extracción metanol
cloroformo (9:1).
Extraer mediante ultrasonido durante 15 minutos.
Decantar el sobrenadante y usar directamente para la
cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
ii) Las fracciones de columna eluidas y los
extractos intermedios se disuelven en metanol usado entonces
directamente. Las diluciones adecuadas pueden ser determinadas
empíricamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos finales (cannabinoides puros o
extractos enriquecidos) se disuelven en metanol a la concentración
adecuada (que puede ser determinada empíricamente) después se usan
directamente para la cromatografía. Todas las preparaciones de la
muestra deberían producir una concentración final de aproximadamente
0,5 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Exactamente se pesan aproximadamente 50 mg de
sustancia farmacéutica botánica en un matraz volumétrico de 25 ml.
Se disuelven completando el volumen con metanol de grado HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
- 0,1 mg/ml de \Delta^{9}-THC en metanol (Sigma).
- 0,1 mg/ml de CBD en metanol (Sigma).
Las soluciones estándares se almacenan
congeladas a -20ºC entre usos y se usan hasta durante 12 meses
después de la preparación inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
Aplicar a puntos separados por un mínimo de 10
mm.
- i)
- 5 \mul de extracto de hierbas o 1 \mul de cannabinoide puro/disolución de extracto enriquecida o 1 \mul de eluato de columna diluido cuando sea apropiado,
- ii)
- 5 \mul de 0,1 mg/ml de \Delta^{9}-THC en disolución estándar de metanol,
- iii)
- 5 \mul de 0,1 mg/ml de CBD en disolución estándar de metanol.
Secar la placa preparada con un soplador de aire
caliente.
Colocar la base de la placa de TLC en un
recipiente de desarrollo que contiene la fase móvil y saturar con
vapor.
Eluir la placa de TLC a través de una distancia
de 8 cm, luego quitar la placa. Permitir que el disolvente se
evapore de la placa y luego repetir la elución por segunda vez
(doble desarrollo). Quitar la placa y permitir que se seque al
aire.
La placa entera se sumerge brevemente en el
reactivo Fast Blue B hasta que comience a desarrollarse el color
rojo/naranja característico de los cannabinoides. La placa se retira
y se deja secar en condiciones ambientales en la oscuridad.
Los cannabinoides darán un color
naranja-morado:
Los ácidos correspondientes forman rayas del
mismo color que las manchas del componente neutro. Los ácidos
corren a un R_{f} más bajo.
\vskip1.000000\baselineskip
La composición de los productos aislados puede
ser determinada por el análisis HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ensayo de HPLC típico para \Delta^{9}
THC, \Delta^{9} THCA, CBD, CBDA y CBN puede ser realizado como
sigue:
Equipo de Cromatografía y condiciones:
- Equipo
- Sistema HPLC 1100 de Agilent (HP) con detector de UV de longitud de onda variable o detector con dispositivo de diodo.
- Columna de HPLC
- Discovery C8 5 \mum de 15 cm x 0,46cm
- Precolumna
- Kingsorb C18 5 \mum de 3 cm x 0,46cm
- Fase Móvil
- acetonitrilo: metanol:ácido acético al 0,25% p/v (16:7:6 por volumen)
- Temp. columna
- 25ºC
- Caudal
- 1,0 ml minuto^{-1}
- Detección
- 220 nm, 600 mA f.s.d. Segunda longitud de onda 310 nm
- Volumen de Inyección
- 10 \mul
- Tiempo de ejecución
- 20-25 minutos (puede ser ampliado para muestras que contienen una pequeña cantidad de picos que eluyen tarde)
Orden de elución CBD, CBDA, \Delta^{9} THCV,
CBN, \Delta^{9} THC, CBC, \Delta^{9} THCA
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de cannabinoides/ácidos
cannabinoides "puros" y extractos enriquecidos se diluyen en
metanol antes del análisis por HPLC. Las diluciones óptimas pueden
ser determinadas empíricamente.
Las muestras de cannabis herbarias se preparan
tomando una muestra de 100 mg y tratando ésta con 5 ó 10 ml del
metanol/cloroformo (9/1 p/v). La dispersión se sónica en un tubo
sellado durante 10 minutos, se deja enfriar y una parte alícuota se
centrifuga y se diluye apropiadamente con metanol antes de la
cromatografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Las soluciones de estándar de reserva de CBD,
CBN y \Delta^{9} THC en metanol a aproximadamente 1 mg ml^{-1}
se almacenan a -20ºC, Los estándares de trabajo diluidos (0,1 mg/ml
para \Delta^{9} THC y CBD y 0,01 mg/ml para CBN) se preparan en
metanol a partir de los estándares de reserva y se almacenan a -20ºC
(período máximo de doce meses después de la preparación inicial).
Después de la preparación, las soluciones estándares deben ser
separadas en alícuotas en viales para reducir la cantidad de
estándar expuesto a la temperatura ambiente. Antes del uso en un
ensayo de muestra de HPLC, el número requerido de viales estándares
se retira y se deja equilibrar a temperatura ambiente.
La inyección de cada estándar se hace por
triplicado antes de la inyección de cualquier disolución de prueba.
A intervalos adecuados, durante el procesamiento de las soluciones
de prueba, se hacen inyecciones repetidas de estándares. En
ausencia de estándares de CBDA y \Delta^{9} THCA fiables, estos
compuestos se analizan usando respectivamente los factores de
respuesta estándares CBD y \Delta^{9} THC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan soluciones de ensayo diluidas en
metanol y deberían contener analitos en el intervalo de trabajo
lineal de 0,02-0,2 mg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes criterios de aceptación son
aplicados a los resultados de cada secuencia ya que se ha encontrado
que causan una resolución adecuada de todos los analitos
(incluyendo los dos analitos que eluyen más cercanamente CBD y
CBDA)
\vskip1.000000\baselineskip
Los cannabinoides pueden ser subdivididos en
neutros y ácidos - la identificación cualitativa puede ser realizada
usando el modo de longitud de onda dual DAD. Los cannabinoides
ácidos absorben fuertemente en la región de 220
nm-310 nm. Los cannabinoides neutros sólo absorben
fuertemente en la región de 220 nm.
Rutinariamente, sólo los datos registrados a 220
nm son usados para el análisis cuantitativo.
El DAD también puede ser puesto para registrar
las exploraciones espectrales UV de cada pico, que puede ser
almacenado entonces en una biblioteca espectral y usado con
objetivos de identificación.
El tratamiento de datos para la cuantificación
utiliza el software de procesamiento por lotes en la Hewlett
Packard Chemstation.
\vskip1.000000\baselineskip
La pureza cromatográfica de muestras
cannabinoides se calcula como el % del contenido cannabinoide total
por normalización del área.
\vskip1.000000\baselineskip
- Equipo
- Sistema GLC 5890 o 6890 de Agilent (HP) con automuestreador HP7673 y detector FID
- Columna GLC
- SE54(EC5) 30 m x 0,32 mm i.d. (Alltech) espesor de fase 0,25 \mum
- Caudal
- Presión constante (10,3 psi). Caudal inicial normal 34 cm sec (2.0 ml min^{-1})
- Estufa de columna
- inicialmente 70ºC, luego ascenso a 5ºC min a 250ºC.
- \quad
- Mantener a 250ºC durante 15 minutos.
- Temp. inyector
- 250ºC
- Temp. detector
- 325ºC
- Vol. inyección
- 1 \mul, relación de separación 2,5:1
- Tiempo del ciclo
- 45 minutos
- Gases combustibles
- Hidrógeno 40 ml min^{-1} Aire 450 ml min^{-1} Helio 45 ml min^{-1}
\vskip1.000000\baselineskip
Se almacenan a -20ºC soluciones estándar de
reserva de CBD, CBN y \Delta^{9} THC en metanol a
aproximadamente 1 mg ml-1. Los estándares de
trabajo diluidos (0,1 mg/ml para \Delta^{9} THC y CBD y 0,01
mg/ml para CBN) se preparan en metanol a partir de los estándares
de reserva y se almacenan a -20ºC (período máximo de doce meses
después de la preparación inicial). Se pipetea una parte alícuota en
un vial de automuestreo para equilibrar a la temperatura ambiente
antes del uso en un ensayo de GC.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de los productos finales, es decir
los cannabinoides/ácidos cannabinoides "puros" y los extractos
enriquecidos se diluyen en metanol antes del análisis HPLC. Las
diluciones óptimas pueden ser determinadas empíricamente.
Las muestras de material de planta del cannabis
se preparan tomando material secado y cortado de 100 mg y tratando
esto con 5 ó 10 ml de metanol/cloroformo (9:1 v/v). Se extrae la
muestra en un baño ultrasónico durante 15 minutos y se deja reposar
en la oscuridad durante 18 horas.'
\vskip1.000000\baselineskip
Se usan soluciones estándares para proporcionar
datos cuantitativos y de tiempo de retención. Éstas pueden ser
típicamente inyectados por triplicado antes de la inyección de
cualquier disolución de la muestra y luego singularmente en
intervalos adecuados durante el ciclo, con un máximo de 10 muestras
de prueba en medio de los estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Resumen del procedimiento:
\newpage
Resultados:
Rendimiento:
100 g del quimiovar G1 producen aprox. 5 g de
\Delta^{9} THCA purificado
Características:
Sólido cristalino amarillo palo.
Pureza cromatográfica = 98% por normalización
del área.
CBD < 0,5% p/p
THC = 1,0% p/p
CBN < 1,0% p/p
Punto de fusión = 70ºC (con descomposición).
El material se descarboxila lentamente en
disolución
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Resumen del procedimiento:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para i) anterior
Rendimiento:
100 g del quimiovar G5 producen aprox. 5 g del
CBDA purificado.
Características:
Sólido cristalino amarillo palo
Punto de fusión = 45-48ºC
Pureza cromatográfica - CBDA al 94% por
normalización de área respecto a la Figura 4
*CBD al 3%.
- THCA no detectado, es decir < 0,1%
- THC no detectado es decir <0,1%
\vskip1.000000\baselineskip
El material se descarboxila lentamente en
disolución
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* Ya que el CBDA no co-eluye con
el CBD durante el procesamiento del extracto en el método de
cromatografía de columna a baja presión empleado, el CBD detectado
probablemente se formará a partir de la ruptura del CBDA durante el
procesamiento y el análisis. Esta descarboxilación indeseable del
material purificado podría ser reducida al mínimo por la
manipulación de CBDA a temperaturas subambientales.
Para ii) anterior:
Características.
Disolución incolora clara
Pureza cromatográfica = 98,9% de CBDA por
normalización del área respecto a la Figura 5
THCA al 0,28%
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
3
Resumen del procedimiento:
Rendimiento:
3,5 g de BDS de \Delta^{9} THC producen
aprox. 1,5 g de \Delta^{9} THC purificado.
Características.
Semisólido claro que toma rápidamente un color
morado cuando se expone al aire.
(Este cambio de color es reversible cuando el
material se disuelve de nuevo en un disolvente adecuado).
Pureza cromatográfica > 99% de \Delta^{9}
THC por normalización del área.
Pureza cromatográfica superior al estándar de
Sigma de \Delta^{9} THC comercialmente disponible
- CBD no detectado es decir < 0,1%
- CBN no detectado es decir < 0,1%
Identidad confirmada por comportamiento de
retención por HPLC, GC y TLC comparado con el estándar de Sigma de
\Delta^{9} THC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Resumen del procedimiento:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Rendimiento:
4,0 g de BDS de \Delta^{9} THCV producen
aprox. 1,3 g de \Delta^{9} THCV purificado.
Características.
Cristales blanquecinos que toman rápidamente un
color morado cuando se exponen al aire. Este cambio en color es
reversible cuando los cristales son disueltos de nuevo.
\newpage
Pureza cromatográfica > 99% por normalización
del área.
- CBD no detectado es decir < 0,1%
- THC 0,5%
- CBN no detectado es decir < 0,1%
Superior a BDS THCV, que contiene THCV al 75% y
THC al 17% como el % de cannabinoides totales, para estudios de la
química y farmacología de THCV.
Identidad confirmada por los tiempos de
retención en HPLC y GC frente a la fracción de THCV antes
autentificada por GC-MS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Resumen del procedimiento:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Para i) anterior:
Rendimiento:
100 g del quimiovar G41 producen aprox. 300 mg
de la fracción enriquecida en CBG.
Características:
Semisólido naranja/amarillo.
Identificación por índice de retención de GC con
relación a estándares de THC y CBD [ref: Brenneisen, R. & El
Sohly, M.A., "Chromatographic & Spectroscopic Profiles of
Cannabis of Different Origins: Part I", Journal of Forensic
Sciences, JFSCA, volumen 33, No 6, pp.
1385-1404, 1988],
Pureza cromatográfica > 92% por normalización
del área respecto a la Figura 14.
- CBD no detectado es decir < 0,1%
- THC 0,1%
- CBN no detectado es decir < 0,1%
Para ii) anterior:
Características:
Disolución incolora clara
Pureza cromatográfica = 97,2% de CBG por
normalización del área respecto a la Figura 15
- CBD 1,66%
- CBN no detectado es decir < 0,1%
Después de la cromatografía súbita del producto
ii):
Características:
Disolución incolora y clara
Pureza cromatográfica = 99,9% de CBG por
normalización del área respecto a la Figura 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Ejemplo pasa a página
siguiente)
\newpage
Ejemplo
6
Resumen del procedimiento:
Para i) anterior:
Rendimiento:
100 g del quimiovar G80 producen aprox. 300 mg
de la fracción enriquecida de CBC.
Características:
Semisólido naranja/amarillo.
Identificación por índice de retención GC con
relación a los estándares de THC y CBD [ref: Brenneisen, R. &
El Sohly, M.A., "Chromatographic & spectroscopic Profiles of
Cannabis of Different Origins: Part I", Journal of Forensic
Sciences, JFSCA, volumen 33, No 6, pp.
1385-1404, 1988],
Pureza cromatográfica > 85% por normalización
del área respecto a la Figura 19.
- CBD 1,0%
- THC 0,3%
- CBN 0,1%
Para ii) anterior:
Características:
Disolución incolora y clara
Pureza cromatográfica > 99,6% de CBC por
normalización del área respecto a la Figura 20
- CBD 0,12%
- CBN 0,09%
Claims (26)
1. Un método para obtener un cannabinoide o
ácido cannabinoide que tiene una pureza cromatográfica mayor del
95% o un producto enriquecido en un cannabinoide o ácido
cannabinoide dado a partir de un material de planta, que
comprende:
- i)
- obtener un extracto que contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide a partir de un material de planta;
- ii)
- someter el extracto de la etapa (i) a una etapa cromatográfica para producir un extracto parcialmente purificado;
- iii)
- disolver el extracto parcialmente purificado en un primer disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste y eliminar el disolvente; y
- iv)
- disolver el producto obtenido en la etapa iii) en un segundo disolvente, eliminar cualquier material insoluble a partir de éste, y eliminar el disolvente para obtener el cannabinoide o ácido cannabinoide que tiene una pureza cromatográfica mayor del 95% o el producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado, en el que los primeros y segundos disolventes son diferentes, y en el que uno de los primeros o segundos disolventes es un disolvente que es sustancialmente más polar que el cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar, y el otro disolvente es un disolvente que es sustancialmente menos polar que el cannabinoide/ácido cannabinoide que se desea purificar.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que uno de los disolventes es un alcohol.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que uno de los disolventes es el metanol.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que uno de los disolventes es un
alcano C5-C12 de cadena lineal o ramificada.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que uno de los disolventes es el pentano.
6. Un método según la reivindicación 5, en el
que uno de los disolventes es el pentano y el otro disolvente es el
metanol.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el extracto que contiene un
cannabinoide o ácido cannabinoide obtenido en la etapa (i) se
prepara por un procedimiento que comprende la extracción con
disolvente del material de planta.
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que la etapa (i) comprende disolver el material de planta en un
disolvente de extracción, eliminar cualquier material insoluble de
la disolución resultante y eliminar el disolvente para formar un
extracto que contiene un cannabinoide o ácido cannabinoide.
9. Un método según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que el disolvente de extracción es un
disolvente no polar, etanol, metanol o dióxido de carbono.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que el disolvente no polar comprende un alcano
C5-C12 de cadena lineal o ramificada.
11. Un método según la reivindicación 10, en el
que el disolvente no polar es el hexano.
12. Un método según la reivindicación 7 o la
reivindicación 8, en el que el disolvente de extracción es
acidificado.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que el disolvente de extracción es un disolvente no polar
acidificado.
14 Un método según la reivindicación 13, en el
que el disolvente de extracción es un alcano C5-C12
de cadena lineal o ramificada.
15. Un método según la reivindicación 14, en el
que el disolvente de extracción es ácido acético al 0,1% v/v en
hexano.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, que incluye una etapa adicional, antes de
la etapa (i), de descarboxilar el material de planta.
17. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el extracto que contiene un
cannabinoide o ácido cannabinoide obtenido en la etapa (i)
comprende una sustancia farmacéutica botánica derivada a partir del
material de planta.
18. Un método según la reivindicación 17, en el
que la sustancia farmacéutica botánica se prepara por un
procedimiento que comprende la extracción con disolvente del
material de planta.
19. Un método según la reivindicación 18, en el
que la sustancia farmacéutica botánica se prepara por la extracción
con dióxido de carbono.
20. Un método según la reivindicación 19, en el
que la sustancia farmacéutica botánica se prepara por un
procedimiento que comprende la extracción con dióxido de carbono
(CO_{2}), seguido de una etapa de extracción secundaria para
eliminar una proporción de los materiales no objetivo.
21. Un método según la reivindicación 20, en el
que la etapa de extracción secundaria es una precipitación
etanólica.
22. Un método según la reivindicación 20 o la
reivindicación 21, en el que el procedimiento para preparar la
sustancia farmacéutica botánica incluye además una etapa de limpieza
con carbón.
23. Un método según la reivindicación 22, en el
que la sustancia farmacéutica botánica se prepara por un
procedimiento que comprende:
- i)
- descarboxilación opcional del material de planta,
- ii)
- extracción con CO_{2} líquido, para producir una sustancia farmacéutica botánica ordinaria,
- iii)
- precipitación con alcohol C1-C5 para reducir la proporción de materiales no objetivo,
- iv)
- retirada del precipitado,
- v)
- tratamiento con carbón activo, y
- vi)
- evaporación para eliminar el alcohol C1-C5 y agua, produciéndose así una sustancia farmacéutica botánica final.
24. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa cromatográfica
comprende una cromatografía de columna.
25. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la etapa cromatográfica está
basada en la exclusión molecular y la polaridad.
26. Un método según la reivindicación 25, en el
que la etapa cromatográfica se realiza usando una matriz LH
20^{TM} de Sephadex.
27. Un método según la reivindicación 26, en el
que la etapa cromatográfica se realiza usando una mezcla de
cloroformo/diclorometano 2:1 como disolvente.
28 Un método según la reivindicación 1, que
comprende una etapa adicional v) de:
- v)
- cargar el cannabinoide o ácido cannabinoide sustancialmente puro o el producto enriquecido en un cannabinoide o ácido cannabinoide dado en un columna de cartucho de sílice Flash BT 12M de Chromabond, eluyendo con hexano:acetato de etilo (98:2) a un caudal de aproximadamente 5 ml/min.
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