ES2336817T3 - Marcadores relacionados con la endometriosis y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino, que comprende las etapas de: - probar una muestra de células endometriales obtenidas de dicho sujeto femenino para el nivel de expresión de al menos un marcador correlacionado con la endometriosis; - comparar el nivel de expresión de dicho marcador relacionado con la endometriosis con un nivel de expresión de línea base establecido probando el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidos de mujeres libres de endometriosis; donde dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis es seleccionado del grupo consistente de i) gen de ARN helicasa listado en la Tabla 1 y que da lugar a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID. 8; ii) ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de: a) ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la SEQ ID. 8; y b) fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y iii) péptidos o proteínas codificados por el gen ARN helicasa dando lugar dicho gen a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID. 8; o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii); siendo el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis indicativo de la probabilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino.
Description
Marcadores relacionados con la endometriosis y
usos de los mismos.
La presente invención se relaciona con
marcadores de endometriosis y más particularmente con métodos para
determinar la probabilidad de endometriosis en sujetos femeninos,
con métodos para clasificar la endometriosis en mujeres que sufren
de endometriosis y en métodos para tratar esta enfermedad. La
invención también se relaciona con polinucleótidos, sondas,
cebadores y kits útiles para reducir en la práctica los métodos
antes mencionados.
La endometriosis es uno de los desordenes
ginecológicos más comunes, que afecta hasta el
10-15% de las mujeres en edad reproductiva. Se
asocia principalmente con dolor pélvico severo y/o infertilidad,
pero también con dismenorrea, dispareunia y otros diversos síntomas
tales como sangrado intraperitoneal, dolor de espalda, constipación
y/o diarrea. La endometriosis se caracteriza por implantación y
crecimiento de células endometriales (las cuales normalmente
constituyen el recubrimiento del útero) en lugares extrauterinos,
más frecuentemente en la cavidad peritoneal. La severidad de la
enfermedad puede ser escalada. De acuerdo con la sociedad Americana
de Medicina Reproductiva (ASRM), la enfermedad se clasifican en
cuatro etapas, a saber, mínima (etapa I), suave (etapa II),
moderada (etapa III), y severa (etapa IV). Aunque la etiología y
patogénesis de la endometriosis permanece todavía sin aclararse, la
teoría de la menstruación retrógrada es la más ampliamente aceptada
para explicar la presencia de células endometriales en sitios
ectópicos. Sin embargo, la menstruación retrógrada ocurre en la
mayoría de las mujeres. Así, un cierto potencial o predisposición
genética, presente en las células endometriales, podría ser
responsable de la presencia de la enfermedad. Inicialmente, este
potencial genético puede relacionarse con mutaciones en el genoma,
pero además, también puede llevar a una expresión genética
subsecuentemente alterada.
En el presente, la visualización directa de las
lesiones endométricas bajo procedimientos quirúrgicos (laparoscopia
o laparotomía) es el único método confiable para diagnosticar la
endometriosis. Sin embargo, este método es altamente invasivo (esto
es, cirugía bajo anestesia general) y costoso. El periodo de tiempo
entre el inicio de los síntomas y el diagnóstico de la enfermedad
puede ser tan largo como 8 a 12 años. Idealmente, el prospecto para
diagnosticar la endometriosis más fácilmente, rápidamente y tan
pronto como sea posible durante el curso de la enfermedad reduciría
definitivamente el número de años durante los cuales los pacientes
soportan el dolor, infertilidad u otros síntomas.
Con base en esta perspectiva, varios
investigadores han buscado identificar marcadores biológicos
(proteínicos y genéticos) que podrían ser utilizados de manera
eficiente como herramientas predictivas para la endometriosis. Sin
embargo, hasta la fecha, ninguno ha sido capaz de hacerlo así.
Por ejemplo, varias proteínas han mostrado
también ser expresadas diferencialmente en la endometriosis. Estas
incluyen el inhibidor de tejidos de la
metaloproteinasa-1 (TIMP-1),
\alpha_{v}\beta_{3} integrina, MCP-1,
aromatasa P450 y activador-receptor e inhibidores de
plasminógeno. Desafortunadamente, la relevancia clínica de estos
marcadores es incierta puesto que los parámetros de diagnóstico
tales como la sensibilidad y especificidad de estos marcadores
candidatos están aún definidos pobremente.
Se ha reportado que la Bcl-2 se
superregula durante la fase proliferativa del ciclo ovárico en el
endometrio eutópico de mujeres enfermas ((Meresman et al.
(2000) Fertil. Steril. 74(4): 760-6) así como
en lecciones endometrióticas en ambas fases del ciclo (Jones et
al. (1998) Hum. Reprod. 13(12): 3496-502)
y en macrófagos de fluido peritoneal de mujeres que tienen
endometriosis (McLaren et al. (1997) Hum. Reprod.
12(1): 146-52). Sin embargo, estos resultados
difieren de nuestros datos presentados aquí en los cuales se
observa una regulación hacia abajo de la Bcl-2 en el
tejido eutópico de mujeres con endometriosis comparados con mujeres
libres de la enfermedad, independientemente de la fase del ciclo
ovárico.
La conexina 43 (Cx43), una proteína involucrada
en uniones espaciadas, ha sido reportada como una expresión
aberrante en el epitelio uterino granular de tejido endometrial
ectópico en mujeres con endometriosis (Regidor et al (1997)
Mol, Hum Reprod. 3:375-381). La meta de este estudio
era únicamente determinar la regulación hormonal de las conexinas
en los tejidos endometrióticos, y consecuentemente, este reporte no
analiza el tejido eutópico en mujeres con endometriosis ni en
mujeres libres de la enfermedad. Así, los hallazgos en este estudio
tienen poca relevancia clínica o diagnóstica.
La ciclooxigenasa-2 humana
(COX-2) está involucrada en la síntesis de la
prostaglandina, y como resultado, ha sido implicada en el
crecimiento y diferenciación de las células estromales endometriales
así como durante el periodo de implantación necesario para
establecer el embarazo (Marions y Danielsson (1999) Mol. Hum,
Reprod, 5:961-5). Debido a su papel en la
implantación durante el embarazo, se ha postulado que la
COX-2 puede estar involucrada en la implantación de
células endometriales en sitios ectópicos, dando lugar a
endometriosis. Sin embargo, hasta la fecha, no ha habido ningún
reporte concluyente que demuestre el papel de la
COX-2 en la endometriosis, ni que una alteración de
su expresión lleve a la enfermedad.
Un incremento en la expresión al nivel de
proteína de la proteína de choque al calor 70 (HSP70) ha sido
descrito en células glandulares endometriales de mujeres que tienen
endometriosis y adenomiosis en comparación con un grupo de control
(Ota et al. (1997) Fertil Steril 68:23-28).
Este resultado fue obtenido por inmunohistoquímica. Los mismos
autores utilizando la misma técnica demostraron que la
oxidonitricosintasa endotelial (eNOS) y la superóxido dismutasa
(SOD) también eran reguladas en el endometrio de pacientes con
endometriosis o adenomiosis (Ota et al. (1998) Fertil Steril
69:303-308; Ota et al. (1999) Fertil Steril
72:129-134). Sin embargo, estos estudios tienen
valor clínico limitado porque algunos de los experimentos no fueron
llevados a cabo siempre en una modalidad técnica exacta, y porque
los marcadores fueron probados en un número pequeño de pacientes
sin producir resultados estadísticamente significativos. Además, en
los estudios de Ota, se encontró que la expresión genética alterada
ocurría en el tejido ectópico, en oposición al endometrio eutópico,
y los resultados presentados no son por lo tanto aplicables
industrialmente.
Otros grupos que estudian la expresión genética
han reportado que el gen de la glutationa
S-transferasa (GST) tenía un más alto grado de
polimorfismo en la endometriosis en comparación con un grupo de
control, y por lo tanto representaba un sistema de destoxificación
global de menor rendimiento que predisponía a las mujeres a la
enfermedad (Baranova et al. (1999) Mol. Hum. Reprodud.
5:636-641). Estos resultados reflejan una
predisposición genética para tener la enfermedad más que la
probabilidad de la endometriosis.
En general, no se ha descrito todavía ningún
método para determinar la probabilidad de la endometriosis en
mujeres, ningún método para identificar eficientemente las mujeres
que sufran de endometriosis, ni métodos para clasificar la
endometriosis en mujeres que sufren de la enfermedad.
Hay por lo tanto una necesidad para una
modalidad alternativa a la laparoscopia o laparotomía para
diagnosticar y determinar el estado de la endometriosis. Más
particularmente, sería altamente deseable proveer métodos donde las
muestras de células endometriales sean probadas en cuanto a los
niveles de expresión de genes específicos relacionados con la
endometriosis (transcriptos de ARN o ADNc o sus correspondientes
proteínas), que sean conocidos por ser expresados de manera
diferencial en las células endometriales de mujeres con
endometriosis (grupo Endo) en comparación con mujeres libres de
endometriosis (grupo de Control).
La presente invención satisface esas necesidades
y también otras necesidades que serán evidentes para los expertos
en la técnica al leer la siguiente especificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un método para determinar la probabilidad de
endometriosis en sujetos femeninos.
La presente invención también busca proveer un
método para clasificar la endometriosis en mujeres que sufren de
esta enfermedad, así como un método para tratar la enfermedad.
La invención también está relacionada con
cebadores, sondas y kits útiles para llevar a la práctica los
métodos antes mencionados.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un método de acuerdo con la reivindicación
1.
Adicionalmente se divulga aquí el uso de los
marcadores OXPHOS relacionados con la endometriosis en un método
para determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto
femenino. Este método comprende las etapas de:
- -
- Obtener una muestra de células endometriales eutópicas, preferiblemente células endometriales epiteliales, del sujeto femenino;
- -
- probar la muestra de células endometriales para el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis involucrado en el camino de la fosforilación oxidativa y/o el camino de los sensores internos de potencial redox (OXPHOS) de las células endometriales;
- -
- determinar la probabilidad de la endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión para el al menos un marcador relacionado con la endometriosis de OXPHOS hasta un nivel de línea base establecido para el al menos marcador OXPHOS relacionado con la endometriosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente se describe aquí la prueba de los
productos de ácido nucleico de los marcadores relacionados con la
endometriosis en métodos para determinar la probabilidad de la
endometriosis en un sujeto femenino. Este método comprende las
etapas de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, del sujeto femenino;
- -
- probar la muestra de células endometriales para el nivel de expresión de al menos un producto de proteína de ácido nucleico de un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de genes que aparecen en la lista de la Tabla 1 para los cuales se da un nombre de gen del GENBANK^{TM};
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionado del grupo consistente de:
- a)
- ácidos nucleicos que dan lugar a los ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 16; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- -
- determinar la probabilidad de la endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión de dicho al menos producto de ácido nucleico hasta un nivel de línea base establecido.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente se describe aquí la prueba para
productos de proteína de marcadores relacionados con la
endometriosis en métodos para determinar la probabilidad de la
endometriosis en un sujetó femenino. Este método comprende las
etapas de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, del sujeto femenino;
- -
- probar la muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión del al menos un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis o de al menos un fragmento de este producto de proteína, siendo el al menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de los genes listados en la tabla 1 para los cuales se da un número de gen del GENBANK^{TM};
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 16; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- -
- determinar la probabilidad de la endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión del al menos un producto de proteína hasta un nivel de línea base establecido.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente se describe aquí un método para
clasificar la endometriosis. Este método comprende las etapas
de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, de un sujeto femenino que sufre de endometriosis; y
- -
- probar dicha muestra de células endometriales para el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de ARN helicasa, NADH deshidrogenasa, hUCCl, AK3, GST, 12S ARNr, CO2, acetonitasa, c-jun, Cx43, GPx4, cox2, hUCCl, Glut-1, TI227H, IL-\beta, HSP90;
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácido ribonucleico que da lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID No: 1, SEQ ID No:6, SEQ ID No:8, SEQ ID No:10 y SEQ ID No:13; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
siendo el nivel de expresión del al menos un
marcador relacionado con la endometriosis indicador del estado de
la endometriosis en el sujeto femenino.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente se describe aquí un kit para
determinar la probabilidad de la endometriosis en un sujeto femenino
o para clasificar la endometriosis en un sujeto femenino que sufre
de endometriosis. El kit comprende al menos una molécula de enlace
para enlazarse con los productos de ácido nucleico ó productos
proteínicos de los marcadores relacionados con la endometriosis. De
acuerdo con una realización preferida, la molécula enlazante es un
ácido nucleico. En otra realización preferida, la molécula
enlazante es un anticuerpo aislado.
Se divulgan aquí adicionalmente polinucleótidos
aislados, cebadores y/o sondas-y sus usos en métodos
para determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto
femenino o para clasificar la endometriosis en un sujeto femenino
que sufre de endometriosis.
Se describe aquí adicionalmente un método para
tratar la endometriosis que comprende la etapa de modular el nivel
de expresión de al menos un marcador seleccionado relacionado con la
endometriosis.
Una ventaja de la presente invención es que es
rápida, no invasiva y significativamente menos complicada y costosa
que llevar a cabo laparoscopia o laparotomía. En contraste a los
métodos disponibles actualmente, es posible, de acuerdo con la
presente invención, medir directamente los niveles de expresión de
los genes relacionados con la endometriosis que se expresan
diferencialmente en células endometriales dependiendo de la
presencia/ausencia de endometriosis y del estado de la enfermedad
con niveles de eficiencia relativamente altos de sensibilidad y
especificidad.
Otros objetivos y ventajas de la presente
invención serán evidentes al leer la siguiente descripción no
restrictiva.
\vskip1.000000\baselineskip
A través del texto las palabras "pares de
bases" se abrevian en general como "bp", las palabras
"ácido desoxirribonucleico" como "ADN", las palabras
"ácido ribonucleico" como "ARN", las palabras "ADN
complementario" como "ADNc", las palabras "reacción en
cadena de polimerasa" como "PCR" y las palabras
"transcripción reversa" como "RT". Las secuencias de
nucleótidos son escritas en la orientación 5' a 3' a menos que se
diga lo contrario.
Con el fin de proveer un entendimiento aún más
claro y más consistente de la especificación y las reivindicaciones,
incluyendo el alcance dado aquí a tales términos, se proporcionan
las siguientes definiciones:
Molécula enlazante: Cualquier molécula
que se adhiere a una molécula objetivo dada de una forma adecuada,
por ejemplo, enzimas a sustratos, anticuerpos antígenos, o una
cadena de ADN a su cadena complementaria.
Derivado de: Tal como se usa aquí, un
ADNc "derivado de" un gen, cuando este ADNc ha sido sintetizado
a partir de un ARN mensajero codificado por este gen. Típicamente,
los ADNc son sintetizados en una reacción in vitro
catalizada por una transcriptasa viral reversa en la cual una cadena
complementaria de ADN es producida a partir de un molde de ARNm
aislado.
Células endometriales: Se refiere a las
células que forman el tejido que recubre el útero (células
estromales y epiteliales). Normalmente, las células endometriales
son desprendidas durante el período menstrual de la mujer, y
después crecen de nuevo y lentamente se engruesan hasta el siguiente
período. Tal como se usa aquí, "células endometriales" abarca
las células endometriales eutópicas así como ectópicas, donde las
células endometriales que usualmente constituyen el recubrimiento
de la cavidad uterina son consideradas eutópicas, y las de fuera
del útero son consideradas ectópicas.
Marcador relacionado con la
endometriosis: Se refiere a cualquier producto de aminoácido o
producto de ácidos nucleicos para el cual el nivel de expresión en
el endometrio de una mujer está correlacionado con la
endometriosis.
Nivel de expresión: Se refiere a la
cantidad de un producto de aminoácidos definida o un producto de
ácidos nucleicos definidos en una célula o tejido dados.
"Expresión" se refiere más particularmente al proceso mediante
el cual una información codificada de un gen es convertida en las
estructuras presentes y operativas en la célula. Tal como se usa
aquí, genes expresados incluyen aquellos que son transcritos en
ARNm y luego traducidos en proteínas y aquellos que son transcritos
en ARN pero no traducidos en proteínas (por ejemplo, ARN de
transferencia y ribosomal). De la misma forma, la expresión "nivel
de expresión de línea base" se refiere al nivel de expresión que
se encuentra bajo condiciones normales y un nivel normal de
funcionamiento (por ejemplo mujeres libres de endometriosis). Los
términos "sobreexpresión" y "subexpresión" se refieren a
una desviación hacia arriba o hacia abajo respectivamente en niveles
probados de expresión en comparación con el nivel de expresión de
línea base.
Sujeto femenino: Se refiere a mujeres
humanas que están en edad reproductiva. De acuerdo con la presente
invención, el sujeto femenino presenta preferiblemente síntomas
clínicos de edometriosis tales como infertilidad y dolor
pélvico.
Fragmento: Se refiere a una sección de
una molécula, tal como una proteína o un ácido nucleico, y con ello
se quiere referir a cualquier porción de la secuencia de aminoácidos
o nucleótidos.
Gen: Se refiere a una secuencia de ADN
relacionada con una cadena polipeptídica individual o proteína, y
tal como se usa aquí incluye las regiones no traducidas 5' y
3'.
Dando lugar a: Tal como se usa aquí, un
ácido ribonucleico "da lugar a" un ADNc cuando sirve como molde
para sintetizar el ADNc. Típicamente los ADNc son sintetizados en
una reacción in vitro catalizada por una transcriptasa
reversa viral en la cuál una cadena complementaria de ADN es
producida a partir de un molde aislado de ARNm.
Probabilidad: Tal como se usa aquí en
combinación con el término "endometriosis", se refiere más
particularmente a una probabilidad existente de un sujeto femenino
de sufrir realmente de endometriosis. No se refiere a una
predisposición a sufrir en el futuro de la enfermedad.
Producto de ácido nucleico: Cualquier
molécula que tiene uno o más nucleótidos derivados de la expresión
del gen. Tal como se usa aquí en combinación con la expresión
"marcador relacionado con la endometriosis", se refiere más
particularmente a ARN y fragmentos del mismo, ADNc y fragmentos del
mismo y etiquetas de secuencia expresadas (EST) cuya expresión está
correlacionada con la expresión de los marcadores relacionados con
la endometriosis (véase más arriba).
OXPHOS: Abreviatura para "fosforilación
oxidativa". Tal como se usa aquí, se refiere a la secuencia de
reacciones enzimáticas acopladas con la cadena respiratoria
mitocondrial donde el ATP es fosforilado, así como los productos de
ácido nucleico y proteínas involucrados en estas reacciones.
Fase de ciclo del estro: Se refiere al
período del estro en el cual ocurren los cambios fisiológicos en las
mujeres como resultado de las influencias hormonales durante el
ciclo menstrual u ovárico. Brevemente, en las mujeres humanas, el
ciclo menstrual está dividido en dos fases, a saber, la "fase
proliferativa" (también llamada la fase folicular, denominada
aquí como fase P) y la "fase secretora" (también llamada la
fase luteal, denominada aquí como fase S). La fase proliferativa
normalmente se extiende desde el día 0 hasta el día 14 del ciclo
menstrual, y la fase secretoria se extiende normalmente desde el día
15 al día 28, cuando ocurre la ovulación 14 de un ciclo menstrual
estándar.
Producto de proteína: Se refiere a
moléculas orgánicas que contienen dos o más aminoácidos que son
ensamblados por la formación de enlaces peptídicos durante la
traducción ribosomal de un ARN mensajero. Tal como se lisa aquí en
combinación con la expresión "marcador relacionado con
endometriosis", se refiere más particularmente a péptidos,
proteínas, glicoproteínas y fragmentos de proteínas cuya expresión
está correlacionada con la expresión de un marcador relacionado con
la endometriosis (véase aquí más arriba).
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se relaciona con la
detección temprana, diagnóstico, prognosis, y clasificación de la
endometriosis de acuerdo con la reivindicación 1. Se divulgan
marcadores adicionales de endometriosis en la forma de secuencias
dé ácidos nucleicos, proteínas y péptidos aislados a partir de
celular endometriales humanas. Los niveles de expresión de estos
"marcadores relacionados con la endometriosis" son indicativos
de la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino y del
estado dé la endometriosis en un sujeto femenino al cual se ha
diagnosticado endometriosis. Los marcadores relacionados con la
endometriosis son los que aparecen listados en la Tabla 1 más
adelante. En la Tabla 2 se listan las secuencias de nucleótidos de
algunos de estos marcadores relacionados con la endometriosis,
también denominadas por los inventores como DD1 a DD16 (SEC ID NOs:
1 a 16).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un aspecto de la invención, los
marcadores relacionados con la endometriosis se utilizan en un
método para determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto
femenino. Este método comprende las
etapas de:
etapas de:
- -
- Obtener una muestra de células endometriales a partir de un sujete femenino (preferiblemente células endometriales eutópicas, y aún más preferiblemente células endometriales eutópicas epiteliales);
- -
- probar la muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión de al menos uno de los marcadores relacionados con endometriosis seleccionados del grupo consistente de:
- i)
- ARN Helicasa listado en la Tabla 1;
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEC ID No: 8; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con este método, el nivel de
expresión de los marcadores relacionados con la endometriosis es
indicativo de la probabilidad de endometriosis en un sujeto
femenino. Preferiblemente, el método comprende adicionalmente la
etapa de comparar el nivel de expresión para el marcador relacionado
con la endometriosis con un nivel de expresión de línea base
establecido. El nivel de línea base para el marcador relacionado con
la endometriosis se establece preferiblemente ensayando el nivel de
expresión para el mismo marcador en un grupo de referencia negativo
de mujeres libres de endometriosis.
De acuerdo con otra realización preferida, la
subexpresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis listado en la Tabla 5 es indicador de una más alta
probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino, y más
particularmente, los siguientes marcadores relacionados con la
endometriosis:
- i)
- genes relacionados del grupo consistente de: ARN helicasa,
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados de grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivado de genes definidos en i); y ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID Nos.: 8, y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores también han encontrado que
algunos marcadores relacionados con la endometriosis son modulados
dependiendo de si las células endometriales son obtenidas en la fase
proliferativa o en la fase secretoria del ciclo del estro del
sujeto, femenino. Las Tablas 6 y 7 más adelante proporcionan una
lista de los marcadores relacionados con endometriosis de la
invención cuyos niveles de expresión se encontraron que eran
modulados en las fases proliferativa y secretoria, respectivamente.
Por lo tanto, en una realización preferida, el método de la
invención comprende adicionalmente las etapas de: i) definir en que
fase del ciclo del estro se obtuvieron las células endometriales; y
ii) seleccionar el marcador relacionado con endometriosis para el
cual se va a probar el nivel de expresión de acuerdo con la fase
definida en i). La fase del ciclo del estro puede ser evaluado
utilizando técnicas bien conocidas en la técnica tales como examen
histológico (preferiblemente de tejidos endometriales), métodos
para evaluar el nivel de expresión de ARN, y métodos para evaluar
los niveles de esteroides sexuales para nombrar unos
pocos.
pocos.
Además, en una realización adicionalmente
preferida, las células endometriales del sujeto femenino son
muestreadas en la fase proliferativa de su ciclo del estro, y el
nivel de su expresión de al menos un marcador relacionado con
endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de: ARN helicasa,
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos nucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivado de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID No 8, y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
\newpage
- y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i) o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii); es indicativo de una más alta probabilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación con un sujeto femenino libre de endometriosis.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida, las células
endoteliales del sujeto femenino son muestreadas en la fase
secretoria de su ciclo de estro, y el nivel de su expresión de al
menos un marcador relacionado con endometriosis seleccionado del
grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de: ARN helicasa;
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID No:8, y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una más alta probabilidad de
endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación con un sujeto
femenino libre de endometriosis.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización preferida de la invención,
el nivel de expresión de al menos dos marcadores relacionados con
la endometriosis se prueba en combinación. Combinando marcadores, en
general es posible incrementar la especificidad y la sensibilidad
de los métodos de la invención. La Tabla 11 contiene algunos
ejemplos de combinación de marcadores relacionados con la
endometriosis. Los métodos para probar los niveles de expresión de
los marcadores genéticos y proteínicos tales como los marcadores
relacionados con la endometriosis de la presente invención son bien
conocidos. Los métodos y materiales para probar los ácidos nucleicos
incluyen: BioChips, membranas y técnicas basadas en disposición de
ADNc sobre vidrio; RT-PCR, hibridización in
situ; estudios de fusión promotor in vitro en líneas
celulares o modelos de cultivo primarios; técnicas de estudio de
rata de transcripción tal como recorrido nuclear; modalidades de
hibridización de membrana por siembra; marcado directo de los
ácidos nucleicos. Los materiales y métodos para probar las proteínas
y los péptidos incluyen: modalidades de hibridización por siembra
en membrana; etiquetado directo de la proteína o péptido;
proteómica; citometría de flujo; inmunoquímica, inmunohistoquímica;
y modalidades basadas en ELISA. Una persona experimentada en
biología molecular e inmunología sabrá como seleccionar, adaptar y
utilizar estos métodos de acuerdo con una necesidad especifica con
el fin de obtener resultados valiosos. Por ejemplo, sería
relativamente fácil desarrollar BioChips que porten marcadores
genéticos considerados como los mejores en términos de especificidad
y sensibilidad para disposiciones de hibridización de ADNc para
seleccionar sujetos
femeninos, y más particularmente sujetos femeninos que tengan síntomas relacionados con la endometriosis.
femeninos, y más particularmente sujetos femeninos que tengan síntomas relacionados con la endometriosis.
En algunos casos, la sobreexpresión de ciertos
marcadores genéticos y proteínicos incluye la producción de
auto-anticuerpos en la sangre de los pacientes. Por
lo tanto, la medición de estos auto-anticuerpos
podría ser otra alternativa, aunque indirecta, para probar los
niveles de expresión de los marcadores genéticos y proteínicos de
acuerdo con la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con el uso de marcadores relacionados con endometriosis
OXPHOS en un método para determinar la probabilidad de endometriosis
en un sujeto femenino. OXPHOS se refiere al camino de fosforilación
oxidativa y/o al camino de censores de potencial redox internos de
las células endomeriales, Este método comprende las etapas de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales eutópicas, preferiblemente células endometriales epiteliales, del sujeto femenino;
- -
- probar la muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis involucrado en OXPHOS;
- -
- determinar la probabilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión para el al menos un marcador relacionado con la endometriosis OXPHOS hasta un nivel de línea base establecido para el al menos un marcador relacionado con endometriosis OXPHOS.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, el
marcador relacionado con endometriosis OXPHOS involucrado en el
camino de fosforilación oxidativa de las células endometriales es un
gen seleccionado del grupo consistente de NADH deshidrogenasa,
proteína de transporte de citrato, HIF1alfa, ARNT, AK3,
Glut-1, MnSOD, GPx, GRP78, catalasa, GST, eNOS,
CO2, aconitasa, ANT-1, ATP sintasa,
Bcl-2, GPx4 y cox2. También puede ser preferible
seleccionar el marcador relacionado con endometriosis OXPHOS que va
a ser probado de acuerdo con la fase del ciclo de estro al cual
pertenecen las células endometriales.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con la prueba de productos de ácidos nucleicos de un
marcador relacionado con endometriosis de acuerdo con métodos para
determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino.
Este método comprende las etapas de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, del sujeto femenino;
- -
- probar la muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión de al menos un producto de ácido nucleico de un marcador relacionado con endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de los genes listados en la Tabla 1 para los cuales se da un nombré de gen según GENBANK^{TM};
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos nucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 16; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- -
- determinar la probabilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión de dicho al menos un producto de ácido nucleico con un nivel de línea base establecido.
De acuerdo con una realización preferida, la
probabilidad de endometriosis en el sujeto femenino es determinada
al probar el nivel de expresión de al menos un producto de ácido
nucleico de un gen seleccionado del grupo consistente de: Cap43,
ARNL helicasa, NADH deshidrogenasa, CO3, FKHR, hUCCl, Paralemmin,
proteína de transporte del citrato, HIF1\alpha, AKNT, AK3, MnSOD,
GPx, aconitasa, ATP sintasa, c-jun,
CUOP-TF, Cx43, HSP70, y GRP78.
De acuerdo con otra realización preferida, la
probabilidad de endometriosis en el sujeto femenino es determinada
al probar el nivel de expresión de un ácido ribonucleico
seleccionado del grupo consistente de: ácidos ribonucleicos que dan
lugar a ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs:
8 a 16 y fragmentos de los mismos.
Más preferiblemente, el nivel de línea base de
los marcadores relacionados con endometriosis seleccionados se
establece probando su nivel de expresión en un grupo de referencia
negativo de mujeres libres de endometriosis. También
preferiblemente, el al menos un producto de ácido nucleico es un
ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y este ARNm sirve como un molde
para la síntesis de ADNc.
El nivel de expresión del al menos un producto
de ácido nucleico puede ser probado utilizando métodos bien
conocidos tales como BioChips, membranas, y métodos basados en
disposición de ADNc en vidrio; RT-PCR; hibridización
in situ; estudios de promotor-fusión en
in vitro en línea celulares o cultivos primarios; métodos de
estudio de ratas de traducción; hibridización por siembra en
membrana; y etiquetado. Aún más preferiblemente, se prueba el nivel
de expresión para al menos dos marcadores relacionados con
endometriosis. También puede ser deseable definir en que fase del
ciclo de estro fueron obtenidas las células endometriales con el fin
de seleccionar apropiadamente el marcador relacionado con
endometriosis para el cual un producto de ácido nucleico que se va
a probar está en concordancia con esta fase.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con la prueba de productos de aminoácido de un marcador
relacionado con endometriosis de acuerdo con métodos para determinar
la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino. Este método
comprende las etapas de:
- -
- obtener una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, del sujeto femenino;
- -
- probar esta muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión de al menos un producto de proteína de un marcador relacionado con endometriosis o de al menos un fragmento de este producto de proteína, siendo seleccionado el al menos un marcador relacionado con la endometriosis a partir del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de los genes listados en la Tabla 1 para los cuales se da un nombre de gen de acuerdo con GENBANK^{TM};
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácido ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivado de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID NOs: 1 a 16;
- y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- -
- determinar la probabilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión del al menos un producto de proteína con un nivel de línea base establecido.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, el
nivel de línea base del producto de proteína seleccionado es
establecido probando su nivel de expresión en un grupo de referencia
negativo de mujeres libres de endometriosis. También
preferiblemente, el al menos un producto de proteína es la proteína
CAP-43 o un fragmento de la misma.
El nivel de expresión del al menos un producto
de proteína puede probarse utilizando métodos bien conocidos tales
como hibridización por siembra en membrana; etiquetado; proteómica;
citometría de flujo; inmunocitoquímica, inmunohistoquímica y ELISA.
Aún más preferiblemente, el nivel de expresión de al menos dos
marcadores relacionados con la endometriosis se prueba en
combinación. También puede ser preferible definir en qué fase del
ciclo de estro fueron obtenidas las células endometriales con el
fin de seleccionar apropiadamente el marcador relacionado con la
endometriosis de manera que el producto de proteína que va a ser
probado esté en concordancia con esta
fase.
fase.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores también han encontrado
que los niveles de expresión de los marcadores específicos
relacionados con la endometriosis eran modulados dependiendo del
estado de la enfermedad. La Tabla 8 más adelante proporciona una
lista de los marcadores relacionados con endometriosis cuyos niveles
de expresión se encontró que eran modulados dependiendo de la etapa
de la enfermedad. Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto, la
presente invención se relaciona con un método para clasificar la
endometriosis. Este método comprende las etapas de:
- -
- obtener una muestra de las células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, a partir de un sujeto femenino que sufre de endometriosis; y
- -
- probar dicha muestra de células endometriales en cuanto al nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de ARN helicasa, NADH deshidrogena, hUCCl, AK3, GST, 12S, ARNr, CO2, aconitasa, c-jun, Cx43, GPx4, cox2, hUCCl, Glut-1, TI227H, y IL-1\beta, HSP90;
- ii)
- ácido ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistentes de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprenden una secuencia seleccionada de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 10 y SEQ ID No: 13; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- iii)
- Péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
\vskip1.000000\baselineskip
Siendo el nivel de expresión del al menos un
marcador relacionado con la endometriosis indicador del estado de
la etapa de la endometriosis en el sujeto femenino.
En una realización preferida, el método se
utiliza de tal manera que el nivel de expresión del al menos un
marcador relacionado con la endometriosis indica si el sujeto
femenino está en la etapa I o II, o en la etapa III o IV de la
endometriosis.
Más particularmente, se ha encontrado que la
sobreexpresión de la NADH deshidrogenasa, c-jun,
Cx43, y/o cox2 es indicativa de si el sujeto femenino está
sustancialmente en la etapa I o II de la endometriosis; y que la
sobreexpresión de hUCCl y/o Glut/1 es indicativa de si el sujeto
femenino está en una etapa III o IV de la endometriosis. También se
encontró que la subexpresión de CO2, SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 6,
aconitasa, GPx4, ARN helicasa, AK3, GST, y/o 12S ARNr es indicativo
de si el sujeto femenino está sustancialmente en la etapa I o II de
la endometriosis; y la subexpresión de TI227H,
EL-1/3, y/o HSP 90 es indicativa de si el sujeto
femenino está en la etapa III o IV de la endometriosis. Si estos
marcadores están subexpresados o sobreexpresados es por lo tanto
una fuerte indicación de la etapa de la enfermedad.
Más preferiblemente, el método comprende
adicionalmente la etapa de comparar el nivel de expresión para el
al menos un marcador relacionado con la endometriosis con un nivel
de línea base establecido. El nivel de línea base puede ser
obtenido mediante:
- -
- probar el nivel de expresión del al menos un marcador relacionado con la endometriosis en una muestra de células endometriales de un primer grupo de referencia positivo de sujetos femeninos de los que se sabe que están en una etapa definida sustancialmente de la endometriosis;
- -
- probar el nivel de expresión del al menos un marcador relacionado con la endometriosis en una muestra de células endometriales de un segundo grupo positivo de referencia de sujetos femeninos de los que se sabe que están sustancialmente en una etapa definida de la endometriosis diferente de la etapa del primer grupo de referencia positiva; y
- -
- comparar el nivel de expresión del al menos un marcador relacionado con la endometriosis con los niveles de expresión del primero y segundo grupos de referencia positivos.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de los niveles de expresión de los
marcadores relacionados con la endometriosis (genética o proteínica)
de la presente invención puede llevarse a cabo como se describe
aquí. También puede ser preferible definir en que fase del ciclo del
estro fueron obtenidas las células endometriales con el fin de
seleccionar apropiadamente el marcador relacionado con la
endometriosis de manera que el producto de proteína que se va a
probar esté en concordancia con esta fase.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención se relaciona con un kit para determinar la probabilidad
de la endometriosis en un sujeto femenino o para clasificar la
endometriosis en un sujeto femenino que sufre de la enfermedad. El
kit de la invención comprende:
- -
- al menos una molécula enlazante para enlazar con un producto de ácido nucleico o un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis, siendo seleccionado el marcador relacionado con la endometriosis del grupo consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de genes listados en la Tabla 1 para los cuales se da un nombre de gen según GENBANK^{TM};
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID Nos.: 1 a 16; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos por ii);
\newpage
- y
- -
- al menos un elemento seleccionado del grupo consistente de: un soporte para la molécula enlazante, tubos de mezcla, reguladores, enzimas y sustancias para la detección de las moléculas enlazantes.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una realización preferida, la
molécula enlazante es un ácido nucleico que hibridiza bajo
condiciones estándar a un ácido nucleico seleccionado del grupo
consistente de:
- a)
- EST y ARNm para los cuales se da un número de acceso GENBANK^{TM} en la Tabla 1;
- b)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla los cuales hibridizan bajo condiciones estándar a ácidos nucleicos de definidos en a);
- c)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla obtenidos por transcripción reversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- ADN y ADNc para los cuales se da un número de acceso GENBANK^{TM} en la Tabla 1;
- e)
- ácidos nucleicos de cadena doble y cadena sencilla los cuales hibridizan bajo condiciones estándar a los ácidos nucleicos definidos en d);
- f)
- ácidos nucleicos de cadena doble y cadena sencilla obtenidos por transcripción reversa de un ácido nucleico definido en d) o e); y
- g)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en a) a f).
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se usa aquí, la hibridización de ácidos
nucleicos se refiere al principio de que dos moléculas de ácidos
nucleicos de cadena simple que tienen secuencias de bases
complementarias reformarán la estructura de cadena doble favorecida
termodinámicamente si son mezclados bajo condiciones apropiadas. Por
ejemplo, una condición de restricción media podría ser provista con
aproximadamente 0.1 a 0.25 M NaCl a temperaturas de aproximadamente
37ºC a 55ºC, mientras que una condición de baja restricción podría
proveerse con aproximadamente 0.15 M a 0.9 M de NaCl, a
temperaturas que varían aproximadamente de 20ºC a 55ºC. Así, las
"condiciones estándar de hibridización" varían dependiendo de
los resultados deseados.
De acuerdo con otra realización preferida, la
molécula enlazante es un anticuerpo aislado dirigido contra al
menos un producto de proteína de un marcador relacionado con la
endometriosis tal como se definió previamente, o dirigido contra un
fragmento del producto de proteína.
Otros tipos de moléculas enlazantes incluyen
moléculas pequeñas tales como azúcares y glicoproteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención se relaciona con polinucleótidos aislados. Los
polinucleótidos de la invención son seleccionados del grupo
consistente de:
- a)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de: SEQ ID Nos.: 1 a 10, SEQ ID Nos.: 12 a 16, y porciones de los mismos;
- y
- b)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a los polinucleótidos definidos en a).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos polinucleótidos tienen muchos usos,
particularmente como marcadores biológicos de acuerdo con los
métodos de la presente invención, como cebadores y/o como sondas
para endometriosis. También pueden ser usados como un molde para
preparar ácidos nucleicos de cadena sencilla o cadena doble útiles
en métodos de terapia genética (antisentido, silenciamiento
genético, ARN de doble cadena, etc.).
La invención también se relaciona con cebadores
y/o sondas para determinar la probabilidad de endometriosis en un
sujeto femenino o para clasificar la endometriosis en un sujeto
femenino que sufre de endometriosis. De acuerdo con la invención,
el cebador o la sonda comprende un ácido nucleico aislado
seleccionado del grupo consistente de:
- a)
- EST y ARNm para el cual se da un número de acceso GENBANK^{TM} en la Tabla 1;
- b)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla que hibridizan bajo condiciones estándar a los ácidos nucleicos definidos en a);
- c)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla obtenidos por transcripción reversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- ADN y ADNc para los cuales se da un número de acceso GENBAK^{TM} en la Tabla 1;
- e)
- ácidos nucleicos de cadena doble y cadena sencilla que hibridizan bajo condiciones estándar a los ácidos nucleicos definidos en d);
- f)
- ácidos nucleicos de cadena doble y cadena sencilla obtenidos por transcripción reversa de un ácido nucleico definido en d) o e); y
- g)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en a) a f).
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también abarca los usos de los
polinucleótidos y ácidos nucleicos aislados antes mencionados en
métodos para determinar la probabilidad de endometriosis en un
sujeto femenino o en métodos para clasificar la endometriosis en un
sujeto femenino que sufra de endometriosis. Estos métodos pueden
incluir el uso de biochips, membranas y técnicas basadas en
disposición de ADNc en vidrio; RT-PCR; hibridización
in situ; estudios de promotor-fusión in
vitro en líneas celulares o cultivos primarios; métodos de
estudio de ratas de transcripción; hibridización por siembra en
membrana; y etiquetado. Por ejemplo, algunos de los ácidos nucleicos
aislados descritos más arriba considerados "los mejores" en
términos de especificidad y sensibilidad para escoger sujetos
femeninos podrían ser acoplados a un biochip para seleccionar
sujetos femeninos para endometriosis y/o para evaluar el estado de
su enfermedad.
La invención también incluye métodos de
diagnóstico para la detección de endometriosis en un sujeto
femenino. El método de diagnóstico de la invención comprende el uso
de uno cualquiera de los métodos antes mencionados para la
determinación de la probabilidad, y/o los kits antes mencionados,
polinucleótidos aislados, ácidos nucleicos, sondas y cebadores.
Dependiendo de los marcadores relacionados con la endometriosis
seleccionados, particularmente si se usan en combinación, es en
efecto posible de acuerdo con la presente invención diagnosticar
sujetos femeninos que tienen endometriosis con una sensibilidad muy
alta y una muy alta especificidad.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención se relaciona con un método para tratar la endometriosis.
Este método comprende la etapa de modular el nivel de expresión de
un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo
consistente de:
- i)
- genes seleccionados del grupo consistente de los genes listados en la Tabla 1 para los cuales se da un nombre de gen según GENBANK^{TM}:
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc seleccionados del grupo consistente de: ADNc derivados de genes definidos en i); y ADNc que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID Nos.: 1 a 16; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a);
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por los genes definidos en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el nivel de
expresión de al menos uno de los marcadores relacionados con la
endometriosis listados en la Tabla 5 se incrementa. En otra
realización preferida, se disminuye el nivel de expresión de al
menos uno de los siguientes marcadores relacionados con la
endometriosis listados en la Tabla 4.
Los métodos y materiales para incrementar o
hacer disminuir los niveles de expresión de los marcadores genéticos
y proteínicos tales como los marcadores relacionados con la
endometriosis de la presente invención son bien conocidos y dentro
de la experiencia de una persona de la técnica. Una lista no
limitativa de métodos y materiales conocidos incluye: dieta,
vitaminas, suplementos dietéticos, métodos de terapia genética,
oligonucleótidos antisentido, fármacos y medicaciones
hormonales.
Por ejemplo, se lanza la hipótesis de que los
compuestos que hacen disminuir los niveles de ROS en células tales
como moléculas consumidoras de ROS comercializadas por METAPHORE
PHARMACEUTICALS^{TM} (www.
methapore.com) no usados realmente para el tratamiento de la endometriosis podrían ser usados de acuerdo con los métodos de tratamiento de la presente invención. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas para tratar la endometriosis y que comprenden sustancias que modulan el nivel de expresión de los marcadores relacionados con la endometriosis antes mencionados también están dentro del alcance de la presente invención.
methapore.com) no usados realmente para el tratamiento de la endometriosis podrían ser usados de acuerdo con los métodos de tratamiento de la presente invención. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas para tratar la endometriosis y que comprenden sustancias que modulan el nivel de expresión de los marcadores relacionados con la endometriosis antes mencionados también están dentro del alcance de la presente invención.
Los siguientes ejemplos ilustran el amplio rango
de aplicaciones potenciales de la presente invención y no pretenden
limitar su alcance. Pueden hacerse modificaciones y variaciones en
los mismos sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
Aunque cualquier método y material similares o equivalentes a los
descritos aquí pueden ser usados en la práctica para probar la
presente invención, se describen los métodos y materiales
preferidos.
En la ausencia de cualquier herramienta de
diagnóstico confiable y no invasiva para la detección de la
endometriosis, se colocó el foco en la identificación de genes
expresados diferencialmente en el endometrio de sujetos femeninos
que sufren de endometriosis (grupo Endo) cuando se comparó con
sujetos libres de endometriosis (grupo Control). Para alcanzar
esto, se utilizaron tres modalidades cuantitativas, a saber
presentación diferencial, hibridización de arreglo de ADNc y
RT-PCR específico. A menos que se especifique otra
cosa, todos los experimentos fueron llevados a cabo utilizando ARN
obtenido a partir de la fracción glandular enriquecida del
endometrio. Además, para algunos análisis, también se obtuvieron
los resultados a partir de ARN aislado de biopsias endometriales no
fraccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes son procedimientos experimentales
y materiales que fueron utilizados para el ejemplo establecido más
arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Los prerrequisitos comunes para los pacientes
que se iban a enrolar en el estudio llevado a cabo con el presente
ejemplo, tanto en los grupos de control libre de endometriosis y
positivos en endometriosis, fueron los siguientes:
- -
- edad premenopáusica;
- -
- sin menstruación en el momento;
- -
- ciclos menstruales entre 21 y 35 días;
- -
- sin salpingitis aguda;
- -
- sin diagnóstico positivo de VIH, hepatitis B o C
- -
- sin embarazo o sin haber estado embarazadas durante los últimos tres meses;
- -
- no estando en periodo de lactancia actualmente;
- -
- sin uso de un compuesto seleccionado del grupo consistente de agonistas de GnRH, Progestinas, Danazol y anticonceptivos orales en los últimos tres meses; y
- -
- sin uso de dispositivos intrauterinos (I.U.D) en los últimos tres meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mujeres reclutadas en el grupo positivo con
endometriosis que proporcionaron biopsias del endometrio fueron
seleccionadas entre mujeres que sufrieron laparoscopia y en las
cuales se confirmó la presencia de endometriosis en el momento del
examen quirúrgico. Las etapas de la enfermedad fueron definidas de
acuerdo con la American Society of Reproductive Medicine (ASRM) en
su clasificación como sigue: etapa I (minima), etapa II (suave),
etapa III (moderada), etapa IV (severa).
Para ser elegible para el grupo de control, las
mujeres que proveyeron las biopsias tenían que satisfacer las
siguientes condiciones:
- -
- sufrir laparoscopia para ligadura de tubos o reanastomosis de tubos;
- -
- sin lesiones por endometriosis detectadas en la cavidad peritoneal en la cirugía;
- -
- sin historia de endometriosis en parientes en primer grado; y
- -
- sin indicación de infertilidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mujeres con endometriosis (Endo) fueron
subdivididas en dos grupos experimentales, a saber EXP 1 (etapas I
y II) y EXP 2 (etapas III y IV). Los grupos experimentales fueron
subdivididos adicionalmente en grupos de fase proliferativa (P) y
fase secretora (S) con base en la fase del ciclo menstrual indicado
por las últimas menstruaciones y confirmado por examen
histológico.
\vskip1.000000\baselineskip
Las biopsias del endometrio fueron obtenidas a
partir de pacientes bajo anestesia antes de la laparoscopia con una
cureta convencional. El tejido recolectado fue mantenido sobre hielo
y utilizado para el experimento dentro de las siguientes cuatro
horas. Los experimentos fueron llevados a cabo bien en fracciones
glandulares enriquecidas o biopsias no fraccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones glandulares del endometrio fueron
enriquecidas por digestión enzimática. El tejido fue. cortado
primero en pequeñas piezas en presencia de medio HBSS (LEFE
TECHNOLOGIES^{TM}). Las piezas fueron entonces digeridas con una
mezcla enzimática que contenía 3.4 mg/ml de pancreatina, 0.1 mg/ml
de hialuronidasa y 1,6 mg/ml de colagenasa (SIGMA^{TM}) durante
50 minutos a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Después de la digestión
enzimática, las células glandulares fueron separadas de la fracción
estromal por exclusión por tamaño. Esto es, la suspensión de
células digeridas fue sometida a rondas sucesivas de filtración a
través de filtros de 41 \mum y 11 \mum. La fracción glandular
consiste de células que fueron retenidas en los filtros.
El ARN total fue aislado de las células
glandulares. La fracción de células glandulares fue pesada, y las
células fueron resuspendidas a una concentración final de 100 mg/ml
de una solución desnaturalizante que contenía: 7 M de tiocianato de
guanidina, 1.3 M de tiocianato de amonio y 0.1 M de acetato de
sodio, pH 4.0. La suspensión fue extraída entonces dos veces con
fenol/cloroformo antes de la precipitación con un volumen de
isopropanol. La pella de ARN fue lavada con etanol al 80%, y
resuspendida en H_{2}O hasta una concentración final de 11
\mug/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN celular total fue,aislado directamente a
partir del tejido de la biopsia endometrial. Rápidamente,
200-300 mg de tejido de la biopsia fueron
homogenizados utilizando un homogenizador eléctrico en presencia de
3 ml de TRIZOL^{TM} (LIFE TECHNOLOGIES) el ARN fue preparado de
acuerdo con el protocolo del fabricante del TRIZOL^{TM}.
Usualmente, dos o tres extracciones adicionales con fenol/cloroformo
fueron necesarias para obtener una interfase clara. El ARN fue
precipitado entonces y resuspendido como se describe más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
La presentación diferencial (DD) fue llevada a
cabo utilizando el ARN total aislado a partir de células glandulares
o biopsias no fraccionadas de acuerdo con Liang and Pardee
(Diferential Display: Methods and Protocols, 1997, Humana Press,
Totowa, N.J. p. 1-11). Las amplificaciones fueron
hechas en un STRATAGENE ROBOCYCLER^{TM} (STRATAGENE^{TM})
involucrando 40 ciclos de 94ºC (1 minuto), 40ºC (2 minutos), 72ºC (1
minuto) con una extensión final de 7 minutos a 72ºC. Se utilizaron
los siguientes reactivos: transcriptasa reversa
M-MLV (LIFE TECHNOLO-
GIES^{TM}), ^{33}P-dATP (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}, 2500 Ci/mmol) y rTaq ADN polimerasa (AMEERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}).
GIES^{TM}), ^{33}P-dATP (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}, 2500 Ci/mmol) y rTaq ADN polimerasa (AMEERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos identificados por la presentación
diferencial fueron clonados utilizando un TA CLONING KIT^{TM}
(INVITROGEN^{TM}) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los clones que contenían los fragmentos deseados fueron
identificados por colonia-PCR como se describe en
Maniatis et al. (Maniatis et al. 1992 Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Cold Spring Harbor, N.Y.) y utilizando los cebadores
lacZ-20 y reverso.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de colonia-PCR
fueron depositados sobre membranas de nylon cargadas positivamente
(BOEHRINGER MANNHEIM^{TM}) e hibridizados con sondas de
presentación diferencial etiquetadas con ^{32}p. Se seleccionaron
varios clones con el patrón diferencial esperado para su
secuenciamiento. Los clones que exhibían secuencias idénticas
fueron aceptados como candidatos.
\vskip1.000000\baselineskip
El secuenciamiento fue llevado a cabo utilizando
el ABI PRISM RHODAMINE CYCLE SEQUENCING KIT^{TM} (PE APPLIED
BIOSYSTEM^{TM}) y se corrió sobre un secuenciador ABI PRISM
310^{TM} (PE APPLIED BIOSYS-
TEM^{TM}),
TEM^{TM}),
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión de los genes fue estudiada
utilizando membranas duplicadas de HUMAN y CANCER ATLAS cDNA
ARRAIS^{TM} (CLONTECH LABORATORIES^{TM}). El ARN glandular (3 \mug) de los individuos de control y los pacientes en la misma fase del ciclo menstrual fueron sometidos a transcripción reversa en presencia de \alpha^{32}P-dATP
(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}, 3000 Ci/mmol). Las hibridizaciones y análisis fueron llevados a cabo de acuerdo con el manual del usuario provisto por el fabricante.
ARRAIS^{TM} (CLONTECH LABORATORIES^{TM}). El ARN glandular (3 \mug) de los individuos de control y los pacientes en la misma fase del ciclo menstrual fueron sometidos a transcripción reversa en presencia de \alpha^{32}P-dATP
(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}, 3000 Ci/mmol). Las hibridizaciones y análisis fueron llevados a cabo de acuerdo con el manual del usuario provisto por el fabricante.
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El ARN celular total, previamente aislado de
células granulares o de biopsias no fraccionadas como se describió
más arriba, fue utilizado como un molde para la producción de ADNc.
Rápidamente, un \mug de ARN fue digerido con un U de ADNasa 1
(LIFE TECHNOLOGIES^{TM}) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. El ARN digerido fue sometido a transcripción reversa en
ADNc utilizando 200 U M-MLV de transcriptasa reversa
en la presencia de 0.4 \muM de cebadores aleatorios (LIFE
TECHNOLOGIES^{TM}), 2 mM de cada uno de dGTP, DATP, dTTP, y dCTP,
y se suministró regulador de la reacción. Después de la incubación a
37ºC durante 1 hora, la reacción fue terminada hirviendo durante 5
minutos. La amplificación por PCR del ADNc fue llevada a cabo de
acuerdo con los protocolos estándar descritos en Maniatis et
al. (Maniatis et al., supra). El ADNc fue
normalizado primero por una serie de amplificaciones por PCR del gen
de control interno, gliceraldeído fosfato deshidrogenasa
(GAPDH).
(GAPDH).
Las reacciones en PCR contenían 5 \mul de ADNc
(estandarizado por GAPDH), 0.5 \muM de cada uno de los dos
cebadores de oligonucleótidos específicos, 0.2 mM de cada uno de
dGTP, dATP, dTTP, y dCTP, 1 U rTaq ADN polimerasa, y se
suministró regulador de reacción. Las amplificaciones fueron
llevadas a cabo en un BIOMETRA UNO II^{TM} o en un T GRADIENT
THERMOCYCLER^{TM} (BIOMETRA^{TM}), involucrando
25-40 ciclos de 94ºC (45 segundos), una temperatura
de fusión específica (45ºC), 72ºC (1 minuto) con una extensión final
de 7 minutos a 72ºC. Las temperaturas de fusión variaron de acuerdo
con los cebadores de oligonucleótidos específicos utilizados,
mientras que el número de ciclos varió de acuerdo con la abundancia
del molde de ADNc en cuestión.
\vskip1.000000\baselineskip
Las transferencias Southern fueron llevadas a
cabo de acuerdo con protocolos estándar descritos en Maniatis et
al. (Maniatis et al., Supra). Rápidamente, después
de la simplificación específica por PCR de los ADNc descritos más
arriba se separaron las muestras en geles de agarosa al 1.5%, y se
transfirieron sobre membranas de BIODYNE^{TM} de 0.45 \mum
(PALL CORPORATION^{TM}) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las membranas fueron fijadas por radiación UV, e
hibridizadas durante la noche a 65ºC con sondas de plásmido
específicas las cuales estaban etiquetadas con ^{32}P utilizando
un kit de etiquetado de cebador aleatorio (sistema de etiquetado de
ADN MEGAPRIME^{TM}, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}). Los
productos fueron visualizados por autorradiografía, sometidos a
barrido y analizados por el software MOLECULAR ANALYST^{TM}
(BIO-RAD^{TM}). Las intensidades de las bandas
fueron ecualizadas con base en la intensidad de un control interno
(GAPDH).
\vskip1.000000\baselineskip
Los alineamientos de secuencias de nucleótidos
fueron llevados a cabo con GENBANK^{TM} a través del software
BLAST disponible en the National Center for Biotechnology
Information (NCBI) en su página web (www.ncbi.nih.
gov). Dado un débil porcentaje de lecturas equivocadas de secuencias en nuestros datos en GENBANK^{TM}, se consideraron homologías del 90% o más como una identidad.
gov). Dado un débil porcentaje de lecturas equivocadas de secuencias en nuestros datos en GENBANK^{TM}, se consideraron homologías del 90% o más como una identidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos fueron analizados utilizando MICROSOFT
EXCEL^{TM}. Para el análisis estadístico, se llevó a cabo la
prueba Student-t y los resultados se consideraron
significativos con un valor p de menos de o igual a 0.05.
La especificidad se define aquí como la
probabilidad de ausencia de un marcador de la enfermedad en el grupo
de control mientras que la sensibilidad es la probabilidad de
presencia del marcador de la enfermedad en el grupo con
endometriosis. Los cálculos para la especificidad y sensibilidad se
llevan a cabo de acuerdo con lo siguiente. Primero, se establece un
valor de corte arbitrario sobre la representación gráfica de la
muestra (ARN, ADNc, proteína u otro) en cuestión. Para muestras que
están sobrerreguladas en el grupo enfermo, la especificidad se
calcula contando el número de pacientes en el grupo de Control que
están por debajo del valor de corte, dividido por el número total
de pacientes en ese grupo y expresado como porcentaje; la
sensibilidad se calcula contando el número de pacientes en el grupo
de Endometriosis que están por encima del mismo valor de corte,
dividido por el número total de pacientes en ese grupo y expresado
como un porcentaje. Para muestras que están subrreguladas en el
grupo de la enfermedad, la especificidad se calcula contando el
número de pacientes en el grupo de control que están por encima del
valor de corte, dividido por el número total de pacientes en ese
grupo y se expresa como un porcentaje. La sensibilidad se calcula
contando el número de pacientes en el grupo con Endometriosis que
están por debajo del mismo valor de corte, dividido por el número
total de pacientes en ese grupo y se expresa como un
porcentaje.
Las células glandulares enriquecidas fueron
aisladas a partir de biopsias endometriales y se extrajo el ARN
total. Los extractos del ARN tanto en los grupos de Control como
Endo fueron divididos en dos subgrupos de acuerdo con la fase del
ciclo menstrual, a saber, fase proliferativa (P) o secretora (S).
Inicialmente, se seleccionaron señales diferenciales con base en su
apariencia en más del 50% de las muestras de un grupo comparado con
el otro. Las señales seleccionadas fueron purificadas del gel y
clonadas en E. coli. Varios plásmidos recombinantes para
cada señal fueron sometidos a la etapa de validación mediante
transferencia Northern reversa como se describe en la presente
solicitud. La secuencia de nucleótidos fue determinada y analizada
para plásmidos distintos de cada serie, y los cebadores específicos
fueron sintetizados para la siguiente etapa.
EL nivel de expresión de los candidatos fue
analizado adicionalmente por RT-PCR semicuantitativo
sobre diferentes grupos de ARN. Los experimentos con base en los
números de ciclo y en las cantidades de ADNc fueron llevados a cabo
para asegurar la linealidad de las reacciones de PCR. El nivel de
expresión de GAPDH fue utilizado como control interno para
normalizar las mediciones. El grupo Endo fue subdividido en dos
grupos experimentales: EXP 1 que incluía etapas mínimas y suave de
la enfermedad (I y II) y EXP 2 consistente de las etapas moderada y
severa (III y IV) de la endometriosis. La Tabla 3 resume los valores
promedios por grupo de todos los marcadores relacionados con la
endometriosis analizados.
Los valores de corte (no mostrados) fueron
seleccionados para estimar los valores clínicos de cada marcador, a
saber, especificidad y sensibilidad. Por lo tanto, para cada
marcador, el valor de corte fue determinado para permitir valores
de especificidad y sensibilidad máximos. La especificidad
corresponde a la probabilidad de la ausencia de un marcador del
grupo de control y la sensibilidad representa la probabilidad de la
presencia del mismo marcador en el grupo de pacientes.
Una lista de los ADNc obtenidos por la modalidad
de presentación diferencial se da aquí. Para cada candidato, el
número de acceso GENBANK^{TM}, de los genes homólogos se da en la
Tabla 1. Los datos de secuencia de nucleótidos y la SEQ IQ NO
correspondientes se listan en la Tabla 2.
El marcador DD1 (SEQ ID NO: 1) muestra 94% de
homología en GENBANK^{TM} con el ADN clonado del tejido de riñón
fetal. Esta secuencia de ADNc también presenta 100% de homología con
una región en el cromosoma 22q11 (AC007064). El análisis de la
expresión mostró un decremento significativo en la fase secretoria
del grupo EXP 1 en comparación con la fase secretoria con el grupo
de control (p = 0.01) (Tabla 3). Con un corte establecido a 0.4, se
obtuvo una especificidad del 75% y una sensibilidad del 90% (Tabla
5).
El marcador DD2 (SEQ ID NO: 2) corresponde a una
etiqueta de secuencia de expresión (EST) que codifica una
fosfoproteína que también ha sido aislada por presentación
diferencial a partir de células de glioma humano. La homología
abarca una región corriente arriba de 40 bp (97%) y una región
corriente abajo de 89 bp (96%). Un espacio de 40 bp está presente
en el medio del alineamiento entre las dos secuencias. El mismo
lineamiento fue obtenido con el homólogo I-myc de
ADNc (HSLMYCH). Esto puede ser debido a la división alternativa de
un gen común en diferentes tejidos, o dos genes distintos en una
familia dada. La presencia de éste ADNc nunca ha sido descrita en
el endometrio. Como se muestra en la Tabla 3, esta transcripción del
gen fue subrregulada en el grupo Endo (p = 0.04). El valor de corte
de 0.13 da 65% de especificidad y 77% de sensibilidad (Tabla 5).
El marcador DD3 (SEQ ID NO: 3) mostró una
homología del 100% con el origen mitocondrial de la replicación
(ori). Hasta la fecha, ningún gen codificador de ARN ha sido mapeado
en esta región del ADN mitocondrial. De acuerdo con los resultados
obtenidos para el presente ejemplo mostrados en la Figura 3, la
expresión está marcadamente disminuido en el grupo Endo (p = 0.01),
Los parámetros de marcador con el valor de corte de 0.7 son 63% de
especificidad y 69% de sensibilidad (Tabla 5).
El marcador DD4 (SEQ ID NO: 4) mostró 98% de
homología con un ADNc aislado a partir de tumores de colon humano.
Hasta la fecha, no se ha asociado ninguna función conocida con este
gen. Como se muestra en la Tabla 3, la expresión está
significativamente disminuida en la fase secretoria del grupo Endo
(p = 0.04). Con un umbral de 1.3, el gen candidato tiene una
especificidad de 83% y una sensibilidad del 85% (Tabla 5).
EL marcador DD5 (SEQ ED NO: 5) corresponde a un
gen que tiene diversos nombres tales como Cap43, Drgl,
TDD-5, rit 42, Ndr 1, Proxy-1 o
RTP, siendo el más común y el usado aquí Cap43. El ARNm del Cap43
tiene una región de 1759 bp 3'-no traducida y su
marco de lectura abierto predicho codifica un residuo de polipéptido
de 394 aminoácidos. Estudios previos han mostrado una expresión
modulada del ARNm del Cap43 en diversos tipos de células, pero no
en células endometriales ni en la endometriosis. Tal como se muestra
en la Tabla 3, se observó una disminución general en la fase
proliferativa de todos los pacientes con endometriosis (p = 0.03).
Un valor de corte de 1.2 resulta en 78% de especificidad y 79% de
sensibilidad (Tabla 5).
La secuencia del marcador DD6 (SEQ ID NO: 6)
coincide con el 97% de homología con un archivo de secuencia
genómica. Además, el segmento ADNc del DD6 contiene una secuencia
alu en el extremo 3'. Como se muestra en la Figura 3, una
disminución significativa fue observada entre el control y EXP 1 en
la fase secretoria (p = 0.018). Un valor de corte de 0.4 produce los
siguientes parámetros: especificidad del 89%, sensibilidad del 100%
para el EXP 1 (Tabla 5).
Varios EST fueron idénticos a la secuencia DD7
(SEQ ID NO: 7). Todas las secuencias clonadas a partir de tejidos
transformados tales como adenocarcinoma de páncreas, neoplasia
epitelial prostática, o un carcinoma endometrial diferenciado
moderadamente. El ADNc DD7 contenía también una secuencia alu. Como
se muestra en la Tabla 3, se observó un decremento severo en la
expresión del gen para este marcador en la fase proliferativa del
grupo Endo (p = 0.019). Se encontraron especificidad del 80% y una
sensibilidad del 70% con un valor de corte de 0.5 (Tabla 5).
Las homologías de secuencia indicaron que la
secuencia de marcador DD8 (SEQ ID NO: 8) era idéntica a un gen
clonado de células Jurkat, cerebro y otros tejidos. En la Tabla 3,
se observó un ligero pero significativo decrecimiento en la
expresión del DD8 en el grupo EXP 1 (p = 0.02), con valores de
especificidad y sensibilidad de 67% y 60% respectivamente, con un
valor de corte de 0.6 (Tabla 5).
El marcador DD9 (SEQ ID NO: 9) corresponde a la
subunidad III de la enzima mitocondrial NADH deshidrogenasa, la
cual está involucrada en el metabolismo del oxígeno celular. Este
gen juega un papel fundamental en la cadena de transporte de
electrones y en la producción de energía. Como se ve en la Tabla 3,
un incremento sustancial en la fase proliferativa del grupo Endo
(EXP 1 y EXP 2) se detecta (p = 0.008). Un valor de corte de 0.2
proporciona una especificidad del 70% y una sensibilidad del 59%
(Tabla 4).
El marcador DD10 (SEQ ID NO: 10) corresponde a
la subunidad II de NADH deshidrogenasa. Tal como con el DD9, este
producto genético es parte del complejo enzimático respiratorio
localizado en las mitoconidrias. La enzima completa está compuesta
de 12 diferentes polipéptidos. En la Tabla 3, la validación de este
marcador mostró un nivel más alto de expresión en la fase
proliferativa del grupo EXP 1 (p = 0.04). El valor de diagnóstico
del gen fue evaluado con un valor de corte de 0.2 dando una
especificidad de 71% y una sensibilidad de 71% (Tabla 4).
El marcador DD11 (SEQ ID NO: 11) corresponde a
la citocromo oxidasa (CO3) (descrita más abajo).
El marcador DD12 (SEQ ID NO: 12) corresponde al
factor de transcripción del dominio de proteína Forkheâd (FKHR). Su
presencia en el endometrio nunca ha sido reportada en la literatura.
En la Tabla 3, el análisis de expresión de este marcador en ARN de
tejido endometrial no fraccionado mostró un descenso de la expresión
en el grupo Endo (p = 0.015). EL marcador fue evaluado con un valor
de corte de 23 con una especificidad de 81% y sensibilidad del 56%
cuando se consideraron ambas fases (Tabla 5). Cuando la expresión
DD12 fue analizada por transferencia Northern sobre muestras de ARN
de una biopsia no fraccionada, se detectó un decrecimiento
significativo en el grupo Endo en comparación con los controles (p
= 0.05) (Tabla 5). Usando un valor de corte de 0.4, la especificidad
fue de 55% y la sensibilidad fue de 68%. Este resultado está en
concordancia con la observación inicial de los inventores
utilizando RT-PCR.
El marcador DD13 (SEQ ID NO: 13) corresponde al
ARN mensajero del gen hUCCl. EL mismo ADNc fue clonado previamente
a partir de cáncer de colon. En la Tabla 3, el análisis de la
expresión de este marcador con ARN de tejido no fraccionado mostró
un nivel más alto de expresión del grupo EXP 2 (p = 0.04).El valor
de diagnóstico del gen fue evaluado con un valor de corte de 0.5
dando una especificidad de 62% y una sensibilidad de 64% en el
grupo EXP 2 (Tabla 4).
La secuencia del marcador DD14 (SEQ ID NO: 14)
es 98% idéntica a un ADNc humano clonado recientemente que codifica
una proteína morforeguladora del enlace de la membrana putativa que
muestra homología con la paralemmina, una proteína morforeguladora
de enlace de membrana. Como se ve en la Tabla 3, un incremento en el
grupo Endo (EXP 1 y EXP 2) se detecta en ARN de una biopsia no
fraccionada (p = 0.04). Un valor de corte de 1.2 proporciona una
especificidad del 78% y una sensibilidad del 58%, solamente cuando
se considera la fase S (Tabla 4).
El marcador DD15 (SEQ ID NO: 15) corresponde a
la porción de transporte de citrato, uno de los marcadores del
síndrome de DiGeorge en la región 22q11. Como se muestra en la Tabla
3, este marcador exhibe en el ARN de una biopsia no fraccionada un
incremento sustancial de expresión en el grupo Endo (p =
6.10^{-4}). Una especificidad de 85% y una sensibilidad del 79%
fueron obtenidas con un valor de corte de 0.18 (Tabla 4).
La secuencia del marcador DD16 (SEQ ID NO: 16)
muestra 90% de homología con algunos EST humanos y 82% de homología
con el gen de ARNr 12S mitocondrial humano. Como se muestra en la
Tabla 3, la expresión de este marcador fue regulada en descenso en
el grupo Endo de un ARN de biopsia no fraccionada (p = 3x10^{-5}).
Con un valor de corte de 2, este marcador mostró una especificidad
de 70% y una sensibilidad de 78 (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente ejemplo, otra técnica
semicuantitativa, a saber transferencia Northern reversa con
disposiciones de ADNc, se utilizó para identificar otros genes que
son expresados de manera diferencial en la endometriosis. El
análisis de la validación final fue hecho por RT-PCR
estandarizado, similar a la modalidad de presentación diferencial.
La Tabla 1 da los números de acceso GENBANK^{TM} para cada gen el
cual fue, de acuerdo con la presente invención identificado como un
marcador relacionado con la endometriosis.
El factor de hipoxia inducida 1\alpha
(HIF-1\alpha) es una de las dos unidades de un
factor de transcripción involucrado en la tensión oxidativa. Como
se ve en la Tabla 3, el análisis estadístico mostró un incremento
significativo del ARNm HIF-1\alpha en el grupo
Endo (p = 0.028). Con un valor de corte de 1.1, se obtuvieron una
especificidad de 65% y una sensibilidad del 72%. Cuando se analizó
la expresión de HIF-1\alpha por transferencia
Northern sobre muestras de ARN de biopsias no fraccionada, se
detectó un incremento significativo en la fase P del grupo Endo en
comparación con la fase de control P (p = 0.019) (Tabla 4).
Utilizando un valor de corte de 0.95, la especificidad fue 83% y la
sensibilidad fue de 80%. Este resultado está en concordancia con la
observación inicial de los inventores sobre el ARN de células
epiteliales.
El translocador nuclear del receptor de aril
hidrocarburo (ARNT) (o HIF-1\beta) es la segunda
subunidad del complejo de transcripción inducido por hipoxia. En
efecto, el ARNT tiene un papel doble: puede ser acoplado con el
HIF-1\alpha en el caso de hipoxia, pero también
puede formar un heterodímero con el receptor de hidrocarburo (aril)
aromático (AhR) para contrarrestar situaciones tóxicas. En la
endometriosis, el gen ARNT es transcrito a una velocidad más alta
que la observada para su socio, HIF-1\alpha. Como
se ve también en la Tabla 3, se registró un incremento
significativo en los pacientes en fase proliferativa del grupo Endo
(p = 0.02). La especificidad de este marcador fue del 67% y la
sensibilidad del 83% con un valor de corte de 0.6 (Tabla 4). Estos
parámetros son comparables con los del HIF-1\alpha
en la fase proliferativa. Los patrones de expresión comparables
para HIF-1\alpha y ARNT son un argumento fuerte en
favor del camino de tensión oxidativa (OXPHOS) involucrado en la
endometriosis.
La adenilato quinasa es una enzima ubicua que
contribuye a la homeóstasis de la composición de adenina y guanina
celular. La isocima adenilato quinasa (AK3) isoforme está localizada
exclusivamente en la membrana interna de las mitocondrias y su
actividad está involucrada en la transferencia de energía. Su
modulación ha sido asociada con la hipoxia y, más específicamente,
con la actividad de HIF-1\alpha. En la Tabla 3, se
observa una severa regulación en descenso de la expresión de AK3 en
el grupo EXP 1 (p = 0.005). El corte de 0.75 produjo una
especificidad del 68% y una sensibilidad del 82% (Tabla 5).
El isoformo transportador de glucosa
(Glut-1) juega un papel importante en el metabolismo
de la energía celular. Como se mencionó más arriba, la expresión
del Glut-1 está regulada por el complejo de factor
de transcripción HIF-1\alpha/ARNT. Además, la
expresión de Glut-1 es inducida en diversas
circunstancias tales como la tensión oxidativa o la transformación
celular. En la Tabla 3, se observó una regulación en aumento
significativa en la expresión de Glut en el grupo EXP 2 en
comparación con el grupo de control (p = 0.037). Además, la
especificidad y. sensibilidad del Glut-1 son 71% y
67% respectivamente, cuando se utiliza un valor de corte de 1 (Tabla
4).
La respiración celular que ocurre en las
mitocondrias se traduce en la producción de especies de oxígeno
reactivas (ROS). La exposición crónica de ROS puede traducirse en
un daño oxidativo permanente a las proteínas, lípidos y ácidos
nucleicos mitocondriales y celulares. Para protegerse contra los
daños oxidativos causados por estos productos tóxicos, las células
de los mamíferos han evolucionado para producir mecanismos
protectores. Las enzimas destoxificantes incluyen manganeso
superóxido dismutasa (MnSOD), gluctatión peroxidasa (GPx), catalasa
(CAT) y glutatión S-transferasa (GST). La MnSOD es
transcripcionalmente regulada en ascenso en las mitocondrias para
destoxificar el anión superóxido (O_{2}^{-}) convirtiéndolo en
peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}).
El análisis de la expresión de MnSOD en la Tabla
3 demuestra una regulación significativa general y significativa en
el grupo Endo completo en comparación con el grupo de control (p =
0.017). Con un corte de 0.9, la especificidad de la MnSOD fue 76% y
su sensibilidad fue 58%. Se obtuvieron resultados similares con ARN
de biopsia no fraccionada y se detectó una elevación significativa
en el grupo Endo (p = 0.003). Con un valor de corte de 0.9, el
marcador exhibió una especificidad de 81% y una sensibilidad de 53%
(Tabla 4).
Como se discutió más arriba, la GPx está
involucrada en el camino de destoxificación de ROS en las
mitocondrias. Más específicamente, la GPx convierte el
H_{2}O_{2} producido por la MnSOD en H_{2}O. El análisis
estadístico mostró un incremento significativo en la expresión de
ARNm de GPx en el grupo Endo en comparación con los
controles
(p = 1.7x10^{-11}), como se muestra en la Tabla 3. Esto resultó en una especificidad del 100% y sensibilidad del 87.5%, cuando se utilizó un valor de corte de 1.2 (Tabla 4).
(p = 1.7x10^{-11}), como se muestra en la Tabla 3. Esto resultó en una especificidad del 100% y sensibilidad del 87.5%, cuando se utilizó un valor de corte de 1.2 (Tabla 4).
En sitios extra mitocondriales, tales como los
peroxisomas, el H_{2}O_{2} producido por la MnSOD es convertido
en H_{2}O mediante la catalasa (CAT). Así la CAT funciona en la
destoxificación de ROS protegiendo las células del H_{2}O_{2}
que se generan dentro de ellas. En el presente ejemplo, se observó
un descenso significativo en la expresión de ARNm de CAT en ARN de
biopsia no fraccionada. En la fase secretora del grupo Endo en
comparación con los controles
(p = 0.001), como se mostró en la Tabla 3. Utilizando un valor de corte de 0.2, la especificidad y sensibilidades CAT es 83% y 78%, respectivamente (Tabla 5).
(p = 0.001), como se mostró en la Tabla 3. Utilizando un valor de corte de 0.2, la especificidad y sensibilidades CAT es 83% y 78%, respectivamente (Tabla 5).
La superfamilia de genes glutatión
S-transferasa (GST) es uno de los principales
sistemas destoxificantes y consumidores de radicales libres en las
células de mamíferos. En el presente ejemplo, se observó una
disminución significativa en la expresión de GST en el grupo EXP 1
en comparación con los controles (p = 0.026), tal como se ilustra
en la Tabla 5. Un análisis directo de la Tabla 3 también muestra un
incremento en la expresión de GST en el grupo EXP 2. De acuerdo con
un valor de corte de 0.21, los parámetros para el grupo EXP 1 serían
una especificidad de 54% y una sensibilidad de 74% (Tabla 5).
La óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)
cataliza la oxidación de L-arginina a óxido nítrico
(NO) y citrulina. Reportes previos han descrito una regulación
hacia arriba en el nivel de proteína en el endometrio de pacientes
con endometriosis durante la fase secretora del ciclo (Ota et
al., Fertility and Sterility (1998)
69:303-308). En el presente ejemplo, se observó una
disminución significativa en la expresión de eNOS cuando se
comparan las fases proliferativas y del grupo de control y las fases
proliferativas de los grupos Endo como un todo (p = 0.027) (véase
Tabla 3), Utilizando un valor de corte de 0.1, se podría definir la
especificidad y sensibilidad del 77% y 65% respectivamente (Tabla
5).
El así llamado gen de la Citocromo oxidasa 3
(CO3) fue publicado con la afirmación de que era regulado en
ascenso en los hepatocitos por H_{2}O_{2} y/o homosisteína. La
secuencia amplificada en el presente ejemplo corresponde a diversos
ADNc en GENBANK^{TM} tales como el gen inducible por hipoxia 14 el
cual en efecto estaba en la región del ARNm 16S del genoma
mitocondrial humano, y con el ADNc TI-227H, un
marcador metastático. Finalmente, la secuencia del gen CO3 es
enteramente homologa con la secuencia de DD11 (aislada por
presentación diferencial). El análisis de la expresión del gen CO3
(y del DD11) reveló una disminución específica para la fase
secretora como se ve en la Tabla 3, cuando se compara con los grupos
de control y Endo (p = 0.002). Cuando se utiliza un valor de corte
de 0.58, la especificidad y la sensibilidad de este marcador fueron
83% y 79%, respectivamente (Tabla 5).
El ARNm 12S es uno de los dos genes de ARNm
codificados por el genoma mitocondrial. En el presente ejemplo, se
observó un descenso significativo en el ARNm 12S en ARN de biopsia
no fraccionada en el grupo EXP 1 en comparación con los controles
(p = 0.02) como se ilustra en la Tabla 3. Utilizando un valor de
corte de 1, la especificidad y sensibilidad del ARNm 12S fueron 77%
y 67%, respectivamente (Tabla 5).
El TI-227H es un gen nuclear que
tiene homologías con CO3, como se describió más arriba. Como
resultado de estas similitudes en la secuencia, los presentes
inventores estaban interesados en determinar si las dos secuencias
eran, en efecto, el mismo gen, o eran tal vez pseudogenes, de manera
interesante, el análisis de la expresión del ARNm de
TI-227H en ARN de biopsia no fraccionada, descrito
en el presente ejemplo, mostró resultados diferentes de los
obtenidos con CO3, sugiriendo que las dos secuencias son de genes
diferentes. A diferencia de la expresión de CO3 la cual disminuyó
en el grupo Endo completo, la expresión de TI-227H
disminuyó significativamente en el grupo EXP 2 en comparación con
los controles (p = 2x10^{-8}), como se muestra en la Tabla 3. La
especificidad y sensibilidad de TI-227H son 81% y
100%, respectivamente, cuando se utiliza un valor de corte de 0.15
(Tabla 5).
La citocromo oxidasa 2 (CO2) es una enzima
mitocondrial codificada que participa en la cadena de transporte de
electrones mitocondriales (ETC) y así, en el proceso de la
fosforilación oxidativa (OXPHOS) que proporciona la energía
esencial a las células. Como se muestra en la Tabla 3, la expresión
del ARNm CO2 en ARN de biopsia no fraccionada se encontró que
disminuía en la fase proliferativa de EXP 1 en comparación con los
controles (p = 0.012). Cuando se utiliza un valor de corte de 0.2,
la especificidad y sensibilidad de CO2 son 64% y 69%,
respectivamente (Tabla 5). Hay evidencia experimental reportada en
la literatura que muestra cambios en el metabolismo del hierro en
respuesta a la tensión oxidativa. Una de las enzimas clave en este
camino es la aconitasa localizada en las mitocondrias.
El análisis de la expresión del gen de aconitasa
(Tabla 3) mostró una disminución en la Fase S del grupo EXP 1 (p =
0.005) y también en la fase P de EXP 2 (p = 0.04). El análisis de
los valores medios de las muestras de la fase P exhibe una
disminución de la fase P de ambos grupos (EXP 1 y EXP 2), pero
solamente el último es significativamente inferior que el grupo de
control. Puesto que el descenso más notable se observó en la fase S
EXP 1, se evaluó el poder de diagnóstico de la aconitasa sobre esta
base. Con un corte de 0.11, se calcularon una especificidad de 80%
y una sensibilidad de 86% (Tabla 5).
Codificado por un gen nuclear, el translocador 1
del nucleótido adenina (ANT-1) se localiza dentro de
la membrana interna mitocondrial. El ANT-1 juega un
papel importante en OXPHOS, intercambiando ATP sintetizado por ADP
utilizado. Hasta la fecha, la modulación de la expresión de
ANT-1 en las biopsias endometriales no ha sido
reportada. En el presente ejemplo, la expresión de ARNm de
ANT-1 analizada por RT-PCR en ARN de
una biopsia no fraccionada se encontró que disminuía en la fase
proliferativa en el grupo Endo en comparación con los controles (p
= 0.007), como se muestra en la Tabla 3. Cuando se utiliza un valor
de corte de 1, el ANT-1 tiene una especificidad de
86% y una sensibilidad de 74% (Tabla 5). Este resultado fue
confirmado por la transferencia Northern (p = 0.016) mediante la
cual los valores de especificidad y sensibilidad fueron 75% y 73%,
respectivamente, cuando se utiliza un valor de corte de 0.042
(Tabla 5).
La ATP sintasa, también conocida como complejo V
del ETC, es codificada por dos genes mitocondriales (ATPasa 6 y
ATPasa 8) y 12 genes nucleares. En concordancia con este papel
crítico en el OXPHOS, las mutaciones en la ATP sintasa han sido
asociadas con enfermedades mitocondriales. Como se muestra en la
Tabla 3, la expresión de la subunidad \beta de la ATP sintasa en
el ARN de biopsia no fraccionada se incrementó en el grupo Endo en
comparación con los controles (p = 1x10^{-3}). De forma
interesante, cuando se considera solamente la fase proliferativa
del grupo Endo, el análisis estadístico llega a ser p= 8x10^{-4}.
Cuando se utiliza un valor de corte de 4, la especificidad y
sensibilidad de la ATP sintasa (subunidad \beta) es 77% y 75%
respectivamente, cuando se compara con el grupo Endo y los
controles. Cuando se analiza la fase P del grupo Endo, la
especificidad es 93% y la sensibilidad es 64% (Tabla 4).
La leucemia/linfoma-2 de células
B (Bcl-2) es una proteína antiapoptópica codificada
en el núcleo que está localizada en la membrana mitocondrial
externa. De manera interesante, la expresión Bcl-2
parece ser guiada por el estradiol en el endometrio a través del
ciclo ovárico, por lo cual se observa una expresión de
Bcl-2 alta en el endometrio proliferativo y
disminuye en la fase secretora (Vaskivuo et al (2000) Mol
Cell Endocrinol 165:75-83). Estudios previos han
analizado la expresión de Bcl-2 en células
glandulares versus células estromales, y en fracciones eutópicas
versus fracciones endometriales (Meresman et al. (2000)
Fertil. Steril. 74(4): 760-6; Jones et
al. (1998) Hum. Reprod. 13(12):
3496-502). En el presente estudio, la expresión de
Bcl-2 en ARN de biopsia endometrial no fraccionada
disminuyó en el grupo Endo en comparación con los controles (p =
0.01), como se muestra en la Tabla 3. La especificidad y
sensibilidad de la expresión Bcl-2 son 54% y 82%,
respectivamente, cuando se utiliza un valor de corte de 4 (Tabla
5).
El proto oncogén humano c-jun
(c-jun) es uno de los factores transcripcionales
ubicuos principales que conforma el complejo API con el
c-fos. En el presente ejemplo, la expresión del
c-jun fue analizada y se observó una regulación
ascendente significativa durante la fase decretora del grupo EXP 1
(p= 0.05) (Véase Tabla 3). Con un valor de corte de 0.7, se
obtuvieron los siguientes parámetros para el grupo EXP 1 de fase S:
especificidad 75%, sensibilidad 67% (Tabla 4). Cuando se probó
sobre ARN de biopsia no fraccionada, la regulación ascendente de la
expresión de c-jun fue significativa para el grupo
Endo en comparación con el grupo de control (p= 0.005). Con un
valor de corte de 1, se determinaron una especificidad de 76% y una
sensibilidad de 65% (Tabla 4).
El factor de transcripción promotor corriente
arriba de la ovalbúmina de pollo (COUP-TF) es un
regulador importante de la aromatasa P450 (P450arom), la cual está
involucrada en la biosíntesis del estrógeno. En células estromales
endometriales eutópicas, el enlace de la COUP-TF a
una región corriente arriba del promotor de la aromatasa intermedia
en la inhibición de la transcripción de la aromatasa, previniendo
así la producción aberrante de estrógeno. Como se muestra en la
Tabla 3, la expresión de ARNm de COUP-TF disminuyó
en la fase secretora de las muestras Endo en comparación con los
controles (p= 0.01) en biopsias de ARN no fraccionadas. Utilizando
un valor de corte de 0.075, la especificidad y sensibilidad de la
COUP-TF es 83% y 78%, respectivamente (Tabla 5).
Las interleucinas están involucradas en los
procesos inflamatorios, tal como se encuentra en enfermedades tales
como la endometriosis. El análisis de transcripción de
IL-1\beta en el presente ejemplo reveló un patrón
impedido totalmente de la expresión en el grupo Endo, mientras que
el nivel es más bien constante en el grupo de control (véase Tabla
3). En particular, se observó una disminución significativa en la
expresión de IL-1\beta en el grupo EXP 2 (p=
0.0002). Con base en una gráfica dispersa (no mostrada, se
determinaron dos valores de corte, uno para un valor medio para el
grupo de control y el otro para su desviación estándar
correspondiente. Los valores por fuera de este rango fueron
identificados como correspondientes a pacientes con una alta
probabilidad de sufrir de endometriosis. Se determinaron una
especificidad de 78% y una sensibilidad de 93% para el valor medio
del grupo de control de 0.98\pm 0.28
(Tabla 5).
(Tabla 5).
Las conexinas están involucradas en las
reacciones celulares y, más específicamente en estructuras tales
como uniones de vacío. Su expresión es regulada en general por
esteroides. La conexina 43 (Cx43) parece ser regulada por el
estradiol. En general en el endometrio, la conexina 43 así como
algunas otras conexinas muestran una expresión más alta por
inmunoquímica en alrededor de 11-15 días del ciclo
menstrual. Se cree que están específicamente involucradas en la
implantación, por ejemplo, durante el embarazo. Una publicación
reportó una expresión aberrante de conexina 43 en todas las
muestras de tejido epitelial ectópico en lesiones endométricas.
Ningún estudio ha medido hasta ahora el nivel de expresión de la
conexina en células endometriales eutópicas. En el presente
ejemplo, se observó una regulación ascendente de ARNm de Cx43 en el
grupo EXP 1 en comparación con los controles (p= 0.048) (Tabla 3),
una diferencia que ha sido aún más significativa cuando solamente la
fase proliferativa del grupo EXP 1 era considerada (p= 0.02). Con
un valor de corte de 1.3, se obtuvo una especificidad de 74% y una
sensibilidad de 48% para el grupo EXP 1 (Tabla 4). Considerando la
fase proliferativa del grupo EXP 1, el marcador es más poderoso,
puesto que la especificidad y sensibilidad son 77% y 64%,
respectivamente (Tabla 4) Las proteínas de choque por calor (HSP)
son inducidas frecuentemente para proteger las células de diversas
tensiones. Más específicamente, la proteína de choque de calor 70
(HSP 70) es inducida en respuesta al desdoblamiento de proteínas,
daño en el ADN, tensión oxidativa metabólica e hipoxia. Se reporta
en el presente ejemplo que la modulación de ARNm de HSP 70 en
mujeres con endometriosis se eleva agudamente en el grupo Endo en
comparación con el grupo de control (p= 0.01) (véase Tabla 3). Como
un marcador para la endometriosis, la especificidad y sensibilidad
de la HSP 70 fueron 73% y 61%, respectivamente, cuando se utiliza un
valor de corte de 0.6 (Tabla 4). En ARN de biopsia no fraccionada,
se detectó también un incremento significativo en la fase
proliferativa (p= 0.014), teniendo así el marcador una especificidad
de 71% y una sensibilidad de 78% con un corte a 0.25 (Tabla 4).
La proteína de choque de calor 90 (HSP 90) es
parte de un sistema de proteína chaperona involucrado en una
señalización inducible por esteroides e inducible por toxinas
exógenas. En el presente ejemplo, el análisis de la HSP 90 con
respecto a la endometriosis reveló un descenso marcado en la
expresión del gen cuando se comparan mujeres en el grupo EXP 2 con
los controles (p= 4.3x10^{-5}) (véase Tabla 3). Cuando se utiliza
un valor de corte de 0.17 en el análisis del grupo EXP 2 en
comparación con el grupo de control, la especificidad y sensibilidad
fueron 75% y 100%, respectivamente (Tabla 5).
La fosfolípido hidroperóxido glutationa
peroxidasa 4 (GPx4 o PHGPx) es responsable de la reducción de los
hidroperóxidos que son producidos en las membranas peroxidadas y
lipoproteínas oxidadas. En ARN de biopsia no fraccionada, mostrada
en la Tabla 3, la expresión de ARNm de GPx4 disminuyó en la fase
secretora del grupo EXP 1 en comparación con los controles (p=
5x10^{-3}) utilizando un corte de 0.1, la especificidad de GPx4
es 83% y la sensibilidad de 75% (Tabla 5). La proteína regulada por
glucosa 78 (GRP 78) es una proteína de respuesta a la tensión
relacionada con la HSP70 que es inducida por agentes o condiciones
que afectan adversamente la función del retículo endoplásmico,
tales como la homocisteína. En el presente ejemplo, la expresión de
GRP78 en ARN de biopsia no fraccionada disminuyó en la fase
secretora del grupo Endo en comparación con los controles (p=
6x10^{-3}), como se muestra en la Tabla 3. La especificidad y
sensibilidad de la GRP 78 son 92% y 78%, respectivamente, cuando se
utiliza un valor de corte de 3.
La ciclooxigenasa-2 (cox2),
también llamada prostaglandina sintasa-2
(PG-2), está involucrada en la síntesis de
prostaglandina. Su posible participación en la endometriosis ha sido
discutida en relación con la actividad incrementada de la aromatasa
en lesiones ectópicas, pero hasta la fecha no hay evidencia de la
desregulación de cox2 en células endometriales eutópicas. En ARN de
biopsia no fraccionada, mostrada en la Tabla 3, la expresión de
ARNm de cox2 se incrementa significativamente en el grupo EXP 1 en
comparación con los controles (p= 0.01). Utilizando un valor de
corte de 6, la especificidad de la COX2 es 69% y la sensibilidad es
62% (Tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo encontrado muchos marcadores genéticos
expresados de manera diferencial en los grupos de control y Endo,
los inventores probaron la hipótesis de que los genes expresados
diferencialmente utilizados en combinación podrían proveer una
herramienta de diagnóstico más poderosa que la evaluación de genes
individuales. Esto es especialmente verdadero dado el alto nivel de
heterogeneidad genética entre los individuos.
La Tabla 11 muestra ejemplos de combinación de
marcadores genéticos. Las especificidades y sensibilidades fueron
calculadas como se describió más arriba (véase el análisis
estadístico). En breve, la especificidad indica la ausencia de un
marcador en el grupo de control y la sensibilidad indica la
presencia de un marcador en el grupo Endo. Todos los tres
marcadores genéticos de interés fueron probados en la misma muestra
de pacientes individuales, permitiendo así hacer combinaciones.
Para cada muestra de paciente, a la presencia de un marcador dado
se asignó una calificación de 1, mientras que la ausencia del mismo
marcador fue asignada con una calificación de 0 (la presencia o
ausencia de un marcador se define de acuerdo con el hecho de estar
por encima o por debajo del valor de corte asignado). Después de la
aplicación de este algoritmo a todos los 3 genes de interés, las
calificaciones de los marcadores fueron combinadas y convertidas en
porcentajes de acuerdo con lo siguiente: para combinaciones de 2
marcadores, 0% representa una calificación de 0 para ambos
marcadores, 50% representa una calificación de 0 para un marcador y
una calificación de 1 para el otro marcador, y 100% representa una
calificación de 1 para ambos marcadores; para combinaciones de 3
marcadores, 0% representa una calificación de 0 para todos los 3
marcadores, 33% representa una calificación de 1 para 1/3 de los
marcadores, 67% representa una calificación de 1 para dos tercios
de los marcadores, y 100% representa una calificación de 1 para
todos los 3 marcadores. Estos porcentajes fueron representados en
una gráfica, y se calcularon nuevos valores de especificidad y
sensibilidad -valores estos que están indicados en la Tabla 11.
Un ejemplo de la potencia de las combinaciones
de marcadores se muestra en la Tabla 11, donde una combinación de
marcadores incrementó la sensibilidad del diagnóstico hasta en un
100%. Una combinación de 3 marcadores incrementó tanto la
especificidad como la sensibilidad. Otras combinaciones de numerosos
marcadores también producirían especificidad y sensibilidad
mejoradas, mejorando por lo tanto los métodos y el kit de acuerdo
con la presente invención.
Los resultados presentados aquí muestran que los
marcadores genéticos listados en la Tabla 1 son todos marcadores
excelentes de la endometriosis. El uso de genes diferencialmente
expresados representa por lo tanto un medio alternativo para
identificar individuos con enfermedad y grados de endometriosis. Al
combinar dos, tres o más de estos marcadores, también es posible
incrementar la especificidad y sensibilidad del diagnóstico.
Muchos de los genes entre los marcadores de la
presente invención están asociados con las mitocondrias. Cinco
entre los dieciséis marcadores DD estaban en esta categoría. Esta
observación llevó a los inventores a investigar adicionalmente en
este campo. En efecto, fisiológicamente un número de reacciones
metabólicas clave, tales como la fosforilación oxidativa (OXPHOS)
implican a las mitocondrias. Por lo tanto, como se muestra en la
Tabla 3, la modulación de los genes relacionados con 22 OXPHOS y/o
mitocondrias, tales como la HIF-1\alpha, ARNT o
NADH deshidrogenaza, se observaron en el tejido endometrial de
pacientes con endometriosis. Esto sugiere fuertemente que el camino
del OXPHOS está involucrado en la endometriosis y que es posible
determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino
probando la muestra de células endometriales en cuanto al nivel de
expresión de al menos uno de los marcadores relacionados con la
endometriosis involucrados en el camino de la fosforilación
oxidativa y/o en el camino de los sensores de potencial redox
internos (OXPHOS) de dichas células endometriales.
De forma interesante, tres ADNc expresados
diferencialmente que contienen secuencias alu fueron aislados e
identificados como marcadores relacionados con la endometriosis. De
la misma forma, otro grupo heterogéneo de marcadores relacionados
con la endometriosis fueron marcadores de la tensión celular
(proteínas de choque de calor, CAP43, Conexina 43, ARN helicasa).
Es por lo tanto tentador especular de que la mayoría de los genes
que contienen una secuencia alu y/o los marcadores de tensión
celular pueden ser utilizados como marcadores relacionados con la
endometriosis de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Habiendo encontrado muchos marcadores genéticos
expresados diferencialmente en grupos de control y Endo de mujeres,
los inventores probaron la hipótesis de que la medición proteínica
de los productos de proteína derivados de estos marcadores
genéticos también podría se runa modalidad adecuada para el
diagnóstico de la endometriosis.
Puesto que el marcador DD5 (a saber Cap43) fue
desregulado al nivel del ARNm en el endometrio de mujeres que
sufren de endometriosis, los presentes inventores han caracterizado
la expresión de la proteína codificada por el mismo gen. Esto fue
llevado a cabo por transferencia Western.
El ARNm Cap43 tiene una región 1759 bp
3'-no traducida y su marco de lectura abierto
predicho codifica una poliproteína con 394 residuos de aminoácidos
con un peso molecular deducido de 43,400 y un punto isoeléctrico de
5.3. Estudios previos han demostrado una expresión modulada del ARNm
del gen de Cap43 en varios tipos de células. Sin embargo la
proteína Cap43 nunca ha sido usada como un marcador en ninguna
enfermedad, incluyendo la endometriosis. En el presente ejemplo,
los extractos proteínicos aislados a partir de biopsias de tejidos
endometriales de poblaciones de control y enfermas fueron
seleccionados en cuanto la expresión de la proteína Cap43 y los
resultados presentados aquí muestran que esta proteína es un
marcador adecuado para la endometriosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Las biopsias de tejido de las poblaciones de
control y positivas en endometriosis fueron obtenidas como se
describió previamente en el ejemplo 1 aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extractos proteínicos celulares totales
fueron aislados directamente de las biopsias de tejido. Rápidamente,
200-300 mg de tejido de biopsia fue homogenizado
utilizando un homogenizador eléctrico en la presencia de 3 ml de
regulador de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 7.5 que
contenía NaCl 0.1 M, 2% de SDS, EDTA 5 Mm y 0,5 \mug/ml de
leupeptina, 2 \mug/ml de aprotinina y 200 \mug/ml de PMSF) a
temperatura ambiente, se lisaron durante 10 minutos a 100ºC y se
centrifugaron durante 20 minutos a 14000 g. La determinación
proteínica de los sobrenadantes fue hecha utilizando la prueba de
proteína DC (BIO-RAD^{TM}) de acuerdo con las
instrucciones del proveedor. Las muestras fueron diluidas en
Tris-HCl 20 mM pH 7.5 y se sembraron sobre membranas
de nitrocelulosa (2.5 y 5 \mug) utilizando un dispositivo de
siembra de 96 pozos GIBCO-BRL^{TM}. Las membranas
fueron bloqueadas durante la noche en leche en polvo seca 2.5% en
regulador TST (Tris-HCl 10 mM pH 7.5 que contenía
NaCl 100 mM y 0.1% de TWEEN-20^{TM}), se incubó
en una dilución de 10 1:2000 de antisuero primario
anti-CAP 43 (SKULDTECH^{TM}, Université
Montpellier II, Francia) o anti-actina (SANTA CRUZ
BIOTECHNOLOGY^{TM}) durante una hora, se lavó dos veces durante 5
minutos con TST y se incubó durante otra hora con un anticuerpo
policlonal específico para inmunoglobulina anticonejo de cabra
conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) (dilución 1:2000 en
leche-TST al 5%), se lavó tres veces durante 10
minutos con TST y se visualizó mediante el reactivo ECL de acuerdo
con el protocolo del fabricante (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}).
Los niveles de Cap43 con respecto a la actina fueron medidas
barriendo los autorradiogramas y densitometría de manchas llevada a
cabo utilizando el programa MOLECULAR ANALYST^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando anticuerpos policlonales antiCap 43,
los presentes inventores seleccionaron extractos de proteínas
aislados a partir de biopsias de tejido endometrial de poblaciones
de control y enfermas. Como se muestra en la Tabla 3, se llevaron a
cabo dos tipos de experimentos. En el primer experimento, todos los
grupos proliferativos y secretores de control y experimentales
fueron incluidos con el fin de comparar la presencia de Cap43 en
ambas fases del ciclo ovárico. En el segundo experimento, solo se
probaron grupos en fase secretora, y de esta forma, el número de
muestras analizadas pudo ser incrementado.
Los resultados del primer experimento muestran
que la proteína Cap43 fue expresada en niveles más altos en la fase
secretora del ciclo ovárico, con una regulación ascendente promedio
en el grupo de control de más de dos veces en la fase secretora en
comparación con la fase proliferativa (1.92 \pm 0.21 CTL S vs.
0.55 \pm 0.06 CTL P). Además, comparando los grupos de control y
Endo, parece que hay una disminución significativa en Cap43 en la
fase secretora del grupo Endo (p= 0.05), con valores de
especificidad y sensibilidad de 71% y 57%, respectivamente, cuando
se utiliza un corte de 1.35 (Tabla 5).
En el segundo experimento en el cual se
analizaron solamente muestras en la fase secretora, también hay un
descenso significativo en la fase secretora del grupo Endo (p=
0.001). Utilizando un corte de 1.1, la especificidad de 77% y la
sensibilidad de 61% (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados confirman que, al igual que el
ARNm de Cap43, la proteína Cap43 se expresa diferencialmente en las
células endometriales de mujeres libres de endometriosis en
comparación con las que tienen endometriosis. Por lo tanto se
justifica creer que es la misma para todos los marcadores genéticos
relacionados con la endometriosis listados en la tabla 1.
El uso de genes expresados diferencialmente o
sus productos proteínicos derivados (tales como proteínas o
péptidos traducidos) representa por lo tanto un medio alternativo
para determinar la probabilidad de endometriosis en individuos
femeninos o para clasificar la enfermedad en los sujetos femeninos
que sufren de ella.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- CTL:
- Grupo de control (mujeres libres de endometriosis)
- ENDO:
- Grupo Endo (mujeres con endometriosis)
- EXP:
- Se refiere al grupo Endo:
- \quad
- EXP 1: Mujeres en las etapas I y II de la enfermedad
- \quad
- EXP 2: Mujeres en las etapas III y IV de la enfermedad
\vskip1.000000\baselineskip
- epi:
- marcador derivado de ARN de la célula epitelial
- biop:
- marcador derivado del ARN de biopsia no fraccionada
- biop PROT^{+}:
- marcador derivado de proteína de biopsia no fraccionada
- *:
- indica una diferencia significativa de acuerdo con la prueba t de Student de los grupos comparados descritos
- NB:
- indica un marcador derivado de ARN de biopsia no fraccionada obtenido por análisis de transferencia northern
- n.a.:
- no disponible
\vskip1.000000\baselineskip
A la vez que diversas realizaciones de la
invención han sido descritas, se entenderá que la presente invención
es capaz de modificaciones adicionales, y esta solicitud pretende
cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención,
siguiendo en general los principios de la invención e incluyendo
tales separaciones de la presente divulgación haciendo parte dentro
del conocimiento o práctica común en la técnica a la cual es
pertinente la invención, y que pueden ser aplicados a los rasgos
esenciales aquí definidos y que cae dentro del alcance de la
invención en los límites de las reivindicaciones anexas.
<110> PROCREA INC.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MARCADORES RELACIONADOS CON
ENDOMETRIOSIS Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 029318-0013
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/185,063
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-02-25
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/225,745
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-08-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(231)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
<213 > Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(123)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(108)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (85)..(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(237)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(184)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(143)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(319)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (259)..(259)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (269)..(269)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (290)..(290)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (302)..(302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (306)..(306)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(277)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(320)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (284)..(284)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (287)..(287)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (311)..(311)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (324)..(324)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(254)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm35
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(218)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido no determinado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(150)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> rasgos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm39
Claims (13)
1. Un método para determinar la probabilidad de
endometriosis en un sujeto femenino, que comprende las
etapas de:
etapas de:
- -
- probar una muestra de células endometriales obtenidas de dicho sujeto femenino para el nivel de expresión de al menos un marcador correlacionado con la endometriosis;
- -
- comparar el nivel de expresión de dicho marcador relacionado con la endometriosis con un nivel de expresión de línea base establecido probando el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidos de mujeres libres de endometriosis;
\vskip1.000000\baselineskip
donde dicho al menos un marcador relacionado con
la endometriosis es seleccionado del grupo consistente de
- i)
- gen de ARN helicasa listado en la Tabla 1 y que da lugar a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID. #8;
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la SEQ ID. #8; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen ARN helicasa dando lugar dicho gen a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID. #8; o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii); siendo el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis indicativo de la probabilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, donde la
sobreexpresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- gen ARN helicasa listado en la Tabla 1 dando lugar a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID. #8;
- ii)
- ácido ribonucleico seleccionado del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleico que dan lugar a un ADN que comprende la secuencia SEQ ID. NO: 8; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen ARN helicasa dando lugar dicho gen a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID #8; o codificado por los ácidos ribonucleicos definidos en ii); es indicativo de una probabilidad más alta de endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación con un sujeto femenino libre de endometriosis.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde
las células endometriales de dicho sujeto femenino fueron obtenidas
en la fase proliferativa de su ciclo estro, y donde el nivel de
subexpresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- gen ARN helicasa listado en la Tabla 1 y que da lugar a un ADN y que comprende la secuencia de SEQ ID. #8;
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADN que comprende la secuencia SEQ ID. NO: 8; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen ARN helicasa, dando lugar dicho gen a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID #8; o codificado por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
Es indicativo de una más alta probabilidad de
endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación con un sujeto
femenino libre de endometriosis.
4. El método de la reivindicación 1, donde las
células endometriales de dicho sujeto femenino fueron obtenidas en
la fase secretora de su ciclo estro, y donde el nivel de
subexpresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis seleccionado del grupo consistente de:
- i)
- gen ARN helicasa listado en la Tabla 1 y que da lugar a un ADN y que comprende la secuencia de SEQ ID. #8;
- ii)
- ácidos ribonucleicos seleccionados del grupo consistente de:
- a)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADN que comprende la secuencia SEQ ID. NO: 8; y
- b)
- fragmentos de los ácidos ribonucleicos definidos en a); y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen ARN helicasa, dando lugar dicho gen a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID #8; o codificado por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
Es indicativo de una probabilidad más alta de
endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación con un sujeto
femenino libre de endometriosis.
5. El método de la reivindicación 1, donde
dichas células endometriales son células endometriales
eutópicas.
6. El método de la reivindicación 1, donde
dichas células endometriales son células endometriales
epiteliales.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el nivel de expresión de dicho al
menos un marcador relacionado con la endometriosis es probado
utilizando un método seleccionado del grupo consistente de
biochips, membranas, y métodos basados en disposición de ADNc en
vidrio; RT-PCR, hibridización in situ,
estudios promotor-fusión in vitro en líneas
celulares o cultivos primarios; métodos de estudio de velocidad de
transcripción; hibridización por siembra en membrana; etiquetado;
proteómica; citometría de flujo; inmunocitoquímica;
inmunohistoquímica y ELISA.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, donde el nivel de expresión para al menos
dos marcadores relacionados con endometriosis es probado en
combinación.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente las etapas
de:
- i)
- definir en que fase del ciclo estro se obtuvieron dichas células endometriales; y
- ii)
- seleccionar dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis para el cual el nivel de expresión va a ser probado de acuerdo con la fase definida en i).
\vskip1.000000\baselineskip
10. El método de la reivindicación 9, donde la
fase del ciclo estro en el cual dichas células endometriales fueron
obtenidas se evalúa utilizando al menos un método seleccionado del
grupo consistente de: examen histológico, métodos para evaluar el
nivel de expresión de ARN, y métodos para evaluar niveles de
esteroides sexuales.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde dicho al menos un marcador
relacionado con la endometriosis es un ácido ribonucleico mensajero
(ARNm).
12. El método de la reivindicación 11, donde
dicho ácido ribonucleico mensajero (ARNm) sirve como un molde para
la síntesis del ADNc.
13. Uso de un ácido nucleico aislado
seleccionado del grupo consistente de:
- a)
- ARNm de ARN helicasa, listado en la Tabla 1 y que da lugar a un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 8
- b)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla que hibridizan bajo condiciones estándar en ácidos nucleicos definidos en a);
- c)
- ácidos nucleicos de cadena sencilla obtenidos por transcripción reversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en a) a c);
Para determinar la probabilidad de endometriosis
a partir de una muestra de células endometriales de un sujeto
femenino o para clasificar la endometriosis de una muestra de
células endometriales a partir de un sujeto femenino que sufre de
endometriosis.
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