ES2287100T3 - Marcadores relacionados con la endometrosis y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar la posibilidad de endometriosis en un sujeto femenino, que comprende las etapas de: - someter a ensayo una muestra de células endometriales obtenidas de dicho sujeto femenino para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis, - comparar el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis con un nivel de expresión inicial, establecido sometiendo a ensayo el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidas de mujeres sin endometriosis; en el que dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis se selecciona del grupo que consiste en: i) el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1; ii) ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y iii) péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicosdefinidos en ii); siendo indicativo el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis de la posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino.
Description
Marcadores relacionados con la endometriosis y
usos de los mismos.
La presente invención se refiere a marcadores de
endometriosis y más particularmente a métodos para determinar la
posibilidad de endometriosis en sujetos femeninos, a métodos para
clasificar la endometriosis en mujeres que padecen endometriosis y
a métodos para tratar esta enfermedad. La invención también se
refiere a polinucleótidos, sondas, cebadores y kits útiles para
poner en práctica los métodos mencionados anteriormente.
La endometriosis es uno de los trastornos
ginecológicos más comunes, que afectan hasta el
10-15% de las mujeres en edad de procrear. Se
asocia principalmente con dolor pélvico intenso y/o esterilidad,
pero también con dismenorrea, dispareunia, y otros síntomas
diversos tales como hemorragia intraperitoneal, dolor de espalda,
estreñimiento y/o diarrea. La endometriosis se caracteriza por la
implantación y el crecimiento de las células endometriales (que
normalmente constituyen el revestimiento del útero) en sitios
extrauterinos, lo más frecuentemente en la cavidad peritoneal.
Puede clasificarse la gravedad de la enfermedad. Según la American
Society of Reproductive Medicine (ASRM), la enfermedad se clasifica
en cuatro estadios, concretamente, mínimo (estadio I), leve (estadio
II), moderado (estadio III) y grave (estadio IV). Aunque la
etiología y la patogénesis de la endometriosis siguen sin estar
claras, la teoría de la menstruación retrógrada es la aceptada más
ampliamente para explicar la presencia de células endometriales en
sitios ectópicos. Sin embargo, la menstruación retrógrada se produce
en la mayoría de las mujeres. Por tanto, una cierta predisposición
o potencial genéticos, presente en las células endometriales,
podría ser responsable de la presencia de la enfermedad.
Inicialmente, este potencial genético podría estar relacionado con
mutaciones en el genoma, pero además, también puede conducir a la
posterior expresión génica alterada.
En la actualidad, la visualización directa de
las lesiones endometriósicas con procedimientos quirúrgicos
(lapa-
roscopia o laparotomía) es el único método fidedigno para diagnosticar la endometriosis. Sin embargo, este método es sumamente invasivo (es decir, cirugía bajo anestesia general) y costoso. El periodo de tiempo entre el comienzo de los síntomas y el diagnóstico de la enfermedad puede ser de hasta 8 a 12 años. Idealmente, la perspectiva para diagnosticar la endometriosis más fácil, rápidamente y tan pronto como sea posible durante el transcurso de la enfermedad reduciría definitivamente el número de años durante los cuales las pacientes soportan el dolor, la esterilidad u otros
síntomas.
roscopia o laparotomía) es el único método fidedigno para diagnosticar la endometriosis. Sin embargo, este método es sumamente invasivo (es decir, cirugía bajo anestesia general) y costoso. El periodo de tiempo entre el comienzo de los síntomas y el diagnóstico de la enfermedad puede ser de hasta 8 a 12 años. Idealmente, la perspectiva para diagnosticar la endometriosis más fácil, rápidamente y tan pronto como sea posible durante el transcurso de la enfermedad reduciría definitivamente el número de años durante los cuales las pacientes soportan el dolor, la esterilidad u otros
síntomas.
Basándose en esta perspectiva, varios
investigadores han buscado identificar marcadores biológicos
(proteicos y genéticos) que pueden usarse eficazmente como
herramientas de predicción para la endometriosis. Sin embargo,
hasta la fecha, ninguno ha sido capaz de hacerlo.
Por ejemplo, también se ha demostrado que varias
proteínas se expresan de manera diferenciada en la endometriosis.
Éstas incluyen el inhibidor tisular de la
metaloproteinasa-1 (TIMP-1),
\alpha_{v}\beta_{3} integrina, MCP-1,
aromatasa P450 e inhibidores y receptor del activador del
plasminógeno. Desgraciadamente, la importancia clínica de estos
marcadores es incierta puesto que los parámetros de diagnóstico,
tales como la sensibilidad y la especificidad de estos marcadores
candidatos todavía se han definido sólo escasamente.
Se ha notificado que Bcl-2 se
regula por incremento durante la fase proliferativa del ciclo
ovárico en el endometrio eutópico de las mujeres enfermas (Meresman
et al. (2000) Fertil. Steril. 74(4):
760-6) así como en las lesiones endometriósicas en
ambas fases del ciclo (Jones et al. (1998) Hum. Reprod.
13(12): 3496-502) y en macrófagos del fluido
peritoneal de mujeres que tienen endometriosis (McLaren et
al. (1997) Hum. Reprod. 12(1): 146-52).
Sin embargo, estos resultados difieren de los datos presentados en
el presente documento en los que se observa la regulación por
disminución de Bcl-2 en el tejido eutópico de las
mujeres con endometriosis, en comparación las mujeres sin la
enfermedad, independientemente de la fase del ciclo ovárico.
Se ha notificado que la conexina 43 (Cx43), una
proteína implicada en uniones de huecos, se expresa de manera
aberrante en el epitelio uterino glandular del tejido endometrial
ectópico en las mujeres con endometriosis (Regidor et al
(1997) Mol. Hum. Reprod. 3:375-381). El objetivo de
este estudio fue únicamente determinar la regulación hormonal de
las conexinas en los tejidos endometriósicos y, en consecuencia,
este informe no analizó el tejido eutópico ni en las mujeres con
endometriosis ni en las mujeres sin la enfermedad. Por tanto, los
hallazgos en este estudio han tenido poca relevancia clínica o
diagnóstica.
La ciclooxigenasa-2 humana
(COX-2) está implicada en la síntesis de
prostaglandina y, como resultado, se ha implicado en el crecimiento
y la diferenciación de las células del estroma endometrial, así como
durante el periodo de implantación necesario para estabilizar el
embarazo (Marions y Danielsson (1999) Mol. Hum. Reprod.
5:961-5). Debido a su papel en la implantación
durante el embarazo, se ha postulado que COX-2 puede
estar implicada en la implantación de las células endometriales en
sitios ectópicos, dando lugar a la endometriosis. Sin embargo,
hasta la fecha, no ha habido ningún informe concluyente que
demuestre el papel de COX-2 en la endometriosis, ni
que una alteración de su expresión conduzca a la enfermedad.
Se ha descrito un aumento en la expresión en el
nivel de proteínas de la proteína de choque térmico 70 (HSP70) en
las células glandulares endometriales de las mujeres que tienen
endometriosis y adenomiosis, en comparación con un grupo control
(Ota et al. (1997) Fertil Steril 68: 23-28).
Este resultado se obtuvo mediante inmunohistoquímica. Los mismos
autores, usando la misma técnica, demostraron que la óxido nítrico
sintasa endotelial (ONSe) y la superóxido dismutasa (SOD) también
se regulaban por incremento en el endometrio de pacientes con
endometriosis o adenomiosis (Ota et al. (1998) Fertil Steril
69: 303-308; Ota et al. (1999) Fertil Steril
72: 129-134). Sin embargo, estos estudios tienen un
valor clínico limitado porque algunos de los experimentos no siempre
se llevaron a cabo con un enfoque técnico preciso, y porque los
marcadores se probaron en un pequeño número de pacientes, no
produciendo resultados estadísticamente significativos. Además, en
los estudios de Ota, se encontró que se producía expresión génica
alterada en el tejido ectópico, en oposición a en el endometrio
eutópico y, por tanto, los resultados presentados no son aplicables
industrialmente.
Otros grupos que estudiaron la expresión génica
han informado de que el gen de la glutatión
S-transferasa (GST) tenía un grado mayor de
polimorfismo en la endometriosis en comparación con un grupo control
y, por tanto, representaba un sistema de detoxificación del
rendimiento menos global que las mujeres predispuestas a la
enfermedad (Baranova et al., (1999) Mol. Hum. Reprod.
5:636-641). Estos resultados reflejan una
predisposición genética para tener la enfermedad, en lugar de la
posibilidad de endometriosis.
La solicitud internacional PCT WO99/63116
muestra que la protimosina, el precursor nuclear sumamente ácido de
la timosina, se sobreexpresa en el tejido endometrial humano normal
imitando a la endometriosis cuando se injerta en un modelo de ratón
de endometriosis. La importancia clínica de este marcador no se ha
demostrado porque dicha solicitud internacional PCT no demuestra
que la sobreexpresión de protimosina es indicativa eficazmente de
la posibilidad de endometriosis.
En general, nadie ha descrito nunca ningún
método para determinar la posibilidad de endometriosis en mujeres,
ningún método para identificar eficazmente a las mujeres que padecen
endometriosis, ni ningún método para clasificar la endometriosis en
mujeres que padecen la enfermedad.
Por tanto, existe la necesidad de un enfoque
alternativo a la laparoscopia o la laparotomía para diagnosticar y
determinar el estadio de la endometriosis. Más particularmente,
sería sumamente deseable proporcionar métodos en los que se
sometieran a ensayo muestras de células endometriales para
determinar los niveles de expresión de genes específicos
relacionados con la endometriosis (transcritos de ADNc o ARN o sus
proteínas correspondientes), que se sabe que se expresan de manera
diferenciada en las células endometriales de las mujeres con
endometriosis (grupo Endo) en comparación con las mujeres sin
endometriosis (grupo Control).
La presente invención cumple estas necesidades y
también otras necesidades que serán evidentes para los expertos en
la técnica al leer la siguiente memoria descriptiva.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un método para determinar la posibilidad de
endometriosis en sujetos femeninos.
La presente invención también tiene como
objetivo proporcionar un método para clasificar la endometriosis en
mujeres que padecen esta enfermedad, así como un método para tratar
esta enfermedad.
La invención también se refiere a cebadores,
sondas y kits útiles para poner en práctica los métodos mencionados
anteriormente.
El gen FKHR (forkhead in
rabdomyosarcoma, cabeza de horquilla en rabdomiosarcoma) en
el cromosoma 13q14 (número de registro de Genbank AF032885)
codifica para un factor de transcripción eucariota de la familia de
los forkhead (cabeza de horquilla). Los miembros de esta familia
comparten una región conservada responsable de la especificidad de
unión al ADN, denominada domino "forkhead" ("cabeza de
horquilla") o "winged-helix" ("hélice
alada". Los miembros de esta familia desempeñan un papen durante
el desarrollo normal y están asociados con la progresión
tumorigénica. El gen FKHR (forkhead in rabdomyosarcoma, cabeza de
horquilla en rabdomiosarcoma) en el cromosoma 13q14 (número de
registro de Genbank AF032885) está implicado en el rabdomiosarcoma
alveolar. ANDERSON et al. (1998) han clonado y caracterizado
tres genes FKHRP1, FKHRL1 y FKHRL1P1, que comparten similitudes con
FKHR, y que forman con él una subfamilia de genes similares a FKHR.
Aunque FKHR y FKHRL1 representan genes funcionales, FKHRP1 y
FKHRL1P1 probablemente son pseudogenes procesados. BIGGS et
al. han estudiado la regulación de FKHR1, un miembro de la
subclase de FKHR de las proteínas relacionadas con la cabeza de
horquilla, y han demostrado que la fosforilación mediante PKB/Akt
regula negativamente FKHR1 potenciando la exportación desde el
núcleo.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para determinar la posibilidad de
endometriosis en sujetos femeninos por el que se someten a ensayo
los niveles de expresión de uno o más marcador(es)
relacionado(s) con la endometriosis seleccionado(s),
y el nivel de expresión del marcador es indicativo de la posibilidad
de endometriosis en el sujeto. En una realización preferida, el/los
marcador(es) relacionado(s) con la endometriosis se
selecciona del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR definido en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al ensayo del/de los producto(s) de ácido
nucleico del/de los marcador(es) relacionado(s) con la
endometriosis en métodos para determinar la posibilidad de
endometriosis en un sujeto femenino. Este método comprende las
etapas de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, obtenidas de dicho sujeto femenino, para determinar el nivel de expresión de al menos un producto de ácido nucleico de un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1
- ii)
- ácidos nucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- -
- determinar la posibilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión de dicho al menos un producto de ácido nucleico con un nivel inicial, establecido sometiendo a ensayo el nivel de expresión de dicho al menos un producto de ácido nucleico de un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidas de mujeres sin endometriosis.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al ensayo de producto(s) de proteína del/de los
marcador(es) relacionado(s) con la endometriosis en
métodos para determinar la posibilidad de endometriosis en un sujeto
femenino. Este método comprende las etapas de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, obtenidas de dicho sujeto femenino, para determinar el nivel de expresión de al menos un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis o al menos un fragmento de este producto de proteína, seleccionándose el al menos un marcador relacionado con la endometriosis del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- -
- determinar la posibilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión del al menos un producto de proteína con un nivel inicial, establecido sometiendo a ensayo el nivel de expresión de dicho al menos un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidas de mujeres sin endometriosis.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a un kit para determinar la posibilidad de endometriosis en
un sujeto femenino o para clasificar la endometriosis en un sujeto
femenino que padece endometriosis. El kit comprende al menos una
molécula de unión para unirse al/a los producto(s) de ácido
nucleico o al/a los producto(s) de proteína del/de los
marcador(es) relacionado(s) con la endometriosis.
Según una realización preferida, la molécula de unión es un ácido
nucleico. En otra realización preferida, la molécula de unión es un
anticuerpo aislado.
Según un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a polinucleótidos aislados, cebadores y/o
sondas y a sus usos en métodos para determinar la posibilidad de
endometriosis en un sujeto femenino o para clasificar la
endometriosis en un sujeto femenino que padece endometriosis.
La presente invención también se refiere a un
método para tratar la endometriosis que comprende la etapa de
modular el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado
con la endometriosis seleccionado.
Una ventaja de la presente invención es que es
rápida, no invasiva y significativamente menos complicada y costosa
que la laparoscopia o la laparotomía realizadas en la actualidad. A
diferencia de los métodos disponibles actualmente, es posible,
según la presente invención, medir directamente los niveles de
expresión de los genes relacionados con la endometriosis que se
expresan de manera diferenciada en las células endometriales
dependiendo de la presencia/ausencia de la endometriosis y del
estadio de la enfermedad con niveles relativamente altos de
sensibilidad y especificidad.
Otros objetos y ventajas de la presente
invención serán evidentes al leer la siguiente descripción no
limitativa.
Durante la totalidad del texto, las palabras
"pares de bases" se abrevian generalmente como "pb", las
palabras "ácido desoxirribonucleico" como "ADN", las
palabras "ácido ribonucleico" como "ARN", las palabras
"ADN complementario" como "ADNc", las palabras
"reacción en cadena de la polimerasa" como "PCR", y las
palabras "transcripción inversa" como "RT". Las
secuencias de nucleótidos se escriben en la orientación 5' a 3', a
menos que se establezca lo contrario.
Con el fin de proporcionar una comprensión
incluso más clara y más consecuente de la memoria descriptiva y de
las reivindicaciones, incluyendo el alcance dado en el presente
documento a tales términos, se proporcionan las definiciones
siguientes:
Molécula de unión: Cualquier molécula que
se adhiere a una molécula diana dada de una manera adecuada, por
ejemplo, enzimas a sustratos, anticuerpos a antígenos, o una cadena
de ADN a su cadena complementaria.
Derivado de: Tal como se usa en el
presente documento, un ADNc "derivado de" un gen cuando este
ADNc se ha sintetizado a partir de un ARN mensajero codificado por
este gen. Normalmente, los ADNc se sintetizan en una reacción in
vitro catalizada por una transcriptasa inversa viral en la que
una cadena complementaria de ADN se produce a partir de un molde de
ARNm aislado.
Células endometriales: Se refieren a las
células que forman el tejido que reviste al útero (células
estromales y epiteliales). Normalmente, las células endometriales
se eliminan durante el periodo menstrual de la mujer, y después
vuelven a crecer y se engrosan lentamente hasta el siguiente
periodo. Tal como se usa en el presente documento, "células
endometriales" engloba células endometriales eutópicas así como
ectópicas, en las que las células endometriales que normalmente
constituyen el revestimiento de la cavidad uterina se consideran
eutópicas y las exteriores al útero se consideran ectópicas.
Marcador relacionado con la
endometriosis: Se refiere a cualquier producto de aminoácido o
producto de ácido nucleico para el que el nivel de expresión en el
endometrio de una mujer se correlaciona con la endometriosis.
Nivel de expresión: Se refiere a la
cantidad de un producto de aminoácido definido o de un producto de
ácido nucleico definido en una célula o tejido dados. La
"expresión" se refiere más particularmente al proceso por el
que la información codificada por un gen se convierte en las
estructuras presentes y que operan en la célula. Tal como se usa en
el presente documento, los genes expresados incluyen los que se
transcriben en el ARNm y después se traducen en proteínas y los que
se transcriben en ARN pero no se traducen en proteínas (por ejemplo,
ARN de transferencia y ribosómico). De manera similar, la expresión
"nivel de expresión inicial" se refiere al nivel de
expresión que se encuentra en condiciones normales y al nivel normal
de funcionamiento (por ejemplo, mujeres sin endometriosis). Los
términos "sobreexpresión" y "subexpresión"
se refieren a una desviación hacia arriba o hacia abajo,
respectivamente en los niveles sometidos a ensayo de expresión en
comparación con el nivel de expresión inicial.
Sujeto femenino: Se refiere a hembras
humanas que están en edad de procrear. Según la presente invención,
el sujeto femenino presentaría preferiblemente síntomas clínicos de
endometriosis, tales como esterilidad y dolor pélvico.
Fragmento: Se refiere a una sección de
una molécula, tal como una proteína o un ácido nucleico, y pretende
referirse a cualquier parte de la secuencia de aminoácidos o
nucleótido.
Gen: Se refiere a una secuencia de ADN
relacionada con una única cadena polipeptídica o proteína, y tal
como se usa en el presente documento incluye las regiones no
traducidas en 5' y 3'.
Que da lugar a: Tal como se usa en el
presente documento, un ácido ribonucleico "da lugar a" un ADNc
cuando sirve como molde para sintetizar el ADNc. Normalmente, los
ADNc se sintetizan en una reacción in vitro catalizada por
una transcriptasa inversa viral en la que se produce una cadena
complementaria del ADN a partir de un molde de ARNm aislado.
Posibilidad: Tal como se usa en el
presente documento en combinación con el término
"endometriosis", se refiere más particularmente a una
probabilidad existente de que un sujeto femenino padezca realmente
endometriosis. No se refiere a una predisposición de padecer en el
futuro la enfermedad.
Producto de ácido nucleico: Cualquier
molécula que tiene uno o más nucleótido(s) derivado(s)
de la expresión del gen. Tal como se usa en el presente documento
en combinación con la expresión "marcador relacionado con la
endometriosis", se refiere más particularmente a un ARN y
fragmentos del mismo, ADNc y fragmentos de los mismos, y etiquetas
de secuencia expresada (EST) cuya expresión se correlaciona con la
expresión de un marcador relacionado con la endometriosis (véase
anteriormente en el presente documento).
OXPHOS: Abreviatura de "fosforilación
oxidativa". Tal como se usa en el presente documento, se refiere
a la secuencia de reacciones enzimáticas acopladas a la cadena
respiratoria mitocondrial por la que se fosforila el ATP, así como
a los productos de ácido nucleico y de proteína implicados en estas
reacciones.
Fase del ciclo estrual: se refiere al
periodo del estro en el que se producen cambios fisiológicos en las
mujeres como resultado de las influencias hormonales durante el
ciclo menstrual o el ovárico. En resumen, en las hembras humanas,
el ciclo menstrual está dividido en dos fases, concretamente, la
"fase proliferativa" (también denominada fase folicular,
denominada en el presente documento fase P) y la "fase
secretora" (también denominada fase lútea, denominada en el
presente documento fase S). La fase proliferativa normalmente se
extiende desde el día 0 hasta el día 14 del ciclo menstrual, y la
fase secretora normalmente se extiende desde el día 15 hasta el día
28, produciéndose la ovulación en el día 14 de un ciclo menstrual
normal.
Producto de proteína: se refiere a
moléculas orgánicas que contienen dos o más aminoácidos que están
unidos mediante la formación de enlaces peptídicos durante la
traducción ribosómica de un ARN mensajero. Tal como se usa en el
presente documento en combinación con la expresión "marcador
relacionado con la endometriosis", se refiere más
particularmente a péptidos, proteínas, glucoproteínas, y fragmentos
de proteínas cuya expresión se correlaciona con la expresión de un
marcador relacionado con la endometriosis (véase anteriormente en el
presente documento).
La presente invención se refiere a la detección,
diagnóstico, pronóstico, clasificación y tratamiento tempranos de
la endometriosis. Se describen marcadores de endometriosis en la
forma de secuencias de ácido nucleico, proteínas y péptidos
aislados de células endometriales humanas. Los niveles de expresión
de estos "marcadores relacionados con la endometriosis" son
indicativos de la posibilidad de endometriosis en un sujeto femenino
y del estadio de la endometriosis en un sujeto femenino al que ha
diagnosticado que tiene endometriosis. El marcador relacionado con
la endometriosis de la invención se selecciona del grupo que
consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
La tabla 2 enumera las secuencias de nucleótidos
de algunos de estos marcadores relacionados con la endometriosis,
también denominados por los inventores DD1 a DD16 (SEQ ID NO: 1 a
16).
Según un aspecto de la invención, los marcadores
relacionados con la endometriosis se usan en un método para
determinar la posibilidad de endometriosis en un sujeto femenino.
Este método comprende las etapas de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, e incluso más preferiblemente células endometriales epiteliales eutópicas, obtenidas de dicho sujeto femenino, para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR definido en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
Según este método, el nivel de expresión del/de
los marcador(es) relacionado(s) con la endometriosis
es indicativo de la posibilidad de endometriosis en el sujeto
femenino. El método comprende además la etapa de comparar el nivel
de expresión para el marcador relacionado con la endometriosis con
un nivel establecido de expresión inicial. El nivel inicial para
el/los marcador(es) relacionado(s) con la
endometriosis se establece sometiendo a ensayo el nivel de expresión
para el/los mismo(s) marcador(es) en un grupo de
referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidas
de mujeres sin endometriosis.
Según una realización preferida, la subexpresión
de al menos un marcador relacionado con la endometriosis es
indicativa de una mayor posibilidad de endometriosis en el sujeto
femenino, seleccionándose dicho al menos un marcador relacionado
con la endometriosis del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR tal como se define en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii).
Los inventores también han encontrado que
algunos marcadores relacionados con la endometriosis se modulan
dependiendo de si las células endometriales se obtienen en la fase
proliferativa o en la fase secretora del ciclo estrual del sujeto
femenino. Las tablas 6 y 7 más adelante en el presente documento
proporcionan una lista de los marcadores relacionados con la
endometriosis cuyos niveles de expresión se encontró que estaban
modulados en las fases proliferativa y secretora, respectivamente.
Por tanto, en una realización preferida, el método de la invención
comprende además las etapas de: i) definir en qué fase del ciclo
estrual se obtuvieron las células endometriales; y ii) seleccionar
el marcador relacionado con la endometriosis, para el que debe
someterse a ensayo el nivel de expresión según la fase definida en
i). La fase del ciclo estrual puede evaluarse mediante el uso de
técnicas bien conocidas en la técnica, tales como examen
histológico (preferiblemente de tejidos endometriales), métodos para
evaluar el nivel de expresión del ARN, y métodos para evaluar los
niveles de esteroides sexuales, por nombrar algunos.
En una realización preferida, las células
endometriales del sujeto femenino se toman como muestra en la fase
proliferativa de su ciclo estrual, y el nivel de subexpresión de al
menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del
grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR tal como se define en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una mayor
posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en
comparación con un sujeto femenino sin
endometriosis.
En otra realización preferida, las células
endometriales del sujeto femenino se toman como muestra en la fase
secretora de su ciclo estrual, y el nivel de subexpresión de al
menos un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del
grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR tal como se define en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una mayor
posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en
comparación con un sujeto femenino sin
endometriosis.
En otra realización preferida de la invención,
se somete a ensayo en combinación el nivel de expresión de al menos
dos marcadores relacionados con la endometriosis. Mediante la
combinación de los marcadores, generalmente es posible aumentar la
especificidad y la sensibilidad de los métodos de la invención. La
tabla 11 contiene algunos ejemplos de combinación de marcadores
relacionados con la endometriosis. Se conocen bien los métodos para
someter a ensayo los niveles de expresión de los marcadores
genéticos y proteicos, tales como los marcadores relacionados con
la endometriosis de la presente invención. Los métodos y materiales
para someter a ensayo ácidos nucleicos incluyen: técnicas basadas
en BioChips, membranas y matriz de vidrio de ADNc;
RT-PCR, hibridación in situ; estudios de
fusión del promotor in vitro en líneas celulares o modelos de
cultivo primario; técnicas de estudio de la tasa de transcripción,
tales como "nuclear run-on" (núcleos aislados);
enfoques de hibridación por inmunotransferencia sobre membrana;
marcaje directo de los ácidos nucleicos. Los métodos y materiales
para someter a ensayo proteínas y péptidos incluyen: enfoques de
hibridación por inmunotransferencia sobre membrana; marcaje directo
de la proteína o péptido; proteómica; citometría de flujo;
inmunocitoquímica; inmunohistoquímica; y enfoques basados en ELISA.
Un experto en biología molecular e inmunología sabrá cómo
seleccionar, adaptar y utilizar estos métodos según su necesidad
específica con el fin de obtener resultados valiosos. Por ejemplo,
puede ser relativamente fácil desarrollar biochips que porten
marcadores genéticos considerados los mejores en lo que se refiere
a la especificidad y la sensibilidad para las matrices de
hibridación de ADNc para detectar mujeres, y más particularmente
mujeres que tienen síntomas relacionados con la endometriosis.
En algunos casos, la sobreexpresión de ciertos
marcadores genéticos y proteicos induce a la producción de
auto-anticuerpos en la sangre de las pacientes. Por
tanto, la medición de estos auto-anticuerpos puede
ser otra alternativa, aunque indirecta, para someter a ensayo los
niveles de expresión de los marcadores genéticos y proteicos según
la invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a someter a ensayo productos de ácido nucleico de un
marcador relacionado con la endometriosis según los métodos para
determinar la probabilidad de endometriosis en un sujeto femenino.
Este método comprende las etapas de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, obtenidas de dicho sujeto femenino, para determinar el nivel de expresión de al menos un producto de ácido nucleico de un marcador relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- -
- determinar la posibilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión de dicho al menos un producto de ácido nucleico con un nivel inicial establecido.
La posibilidad de endometriosis en el sujeto
femenino se determina sometiendo a ensayo el nivel de expresión de
al menos un producto de ácido nucleico del gen FKHR.
Según otra realización preferida, la posibilidad
de endometriosis en el sujeto femenino se determina sometiendo a
ensayo el nivel de expresión de un ácido ribonucleico que da lugar a
un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12.
El nivel inicial del/de los marcador(es)
relacionado(s) con la endometriosis seleccionado(s) se
establece sometiendo a ensayo su nivel de expresión en un grupo de
referencia negativo de dicho al menos un marcador relacionado con
la endometriosis que se selecciona del grupo que consiste en:
mujeres sin endometriosis. Preferiblemente, el al menos un producto
de ácido nucleico es un ácido ribonucleico mensajero (ARNm) y este
ARNm sirve como molde para la síntesis de un ADNc.
El nivel de expresión del al menos un producto
de ácido nucleico puede someterse a ensayo usando métodos bien
conocidos tales como biochips, membranas, y métodos basados en
matriz de vidrio de ADNc; RT-PCR; hibridación in
situ; estudios de promoterfusion in vitro en líneas
celulares o cultivos primarios; métodos de estudio de la tasa de
transcripción; hibridación por inmunotransferencia sobre membrana; y
marcaje. Incluso más preferiblemente, se somete a ensayo el nivel
de expresión para al menos dos marcadores relacionados con la
endometriosis. También puede ser deseable definir en qué fase del
ciclo estrual se obtuvieron las células endometriales con el fin de
seleccionar apropiadamente el marcador relacionado con la
endometriosis para el que va a someterse a ensayo un producto de
ácido nucleico según esta fase.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a someter a ensayo productos de aminoácido de un marcador
relacionado con la endometriosis según los métodos para determinar
la posibilidad de endometriosis en un sujeto femenino. Este método
comprende las etapas de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales, preferiblemente células endometriales eutópicas, obtenidas de dicho sujeto femenino, para determinar el nivel de expresión de al menos un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis, seleccionándose el al menos un marcador relacionado con la endometriosis del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- -
- determinar la posibilidad de endometriosis en el sujeto femenino comparando el nivel de expresión del al menos un producto de proteína con un nivel inicial establecido.
El nivel inicial del/de los producto(s)
de proteína seleccionado(s) se establece sometiendo a ensayo
su nivel de expresión en un grupo de referencia negativo de mujeres
sin endometriosis.
El nivel de expresión del al menos un producto
de proteína puede someterse a ensayo usando métodos bien conocidos
tales como hibridación por inmunotransferencia sobre membrana;
marcaje; proteómica; citometría de flujo; inmunocitoquímica;
inmunohistoquímica y ELISA. Incluso más preferiblemente, se somete a
ensayo en combinación el nivel de expresión de al menos dos
marcadores relacionados con la endometriosis. También puede ser
preferible definir en qué fase del ciclo estrual se obtuvieron las
células endometriales con el fin de seleccionar apropiadamente el
marcador relacionado con la endometriosis, de modo que el producto
de proteína se someta a ensayo según esta fase.
Los presentes inventores también encuentran que
los niveles de expresión de los marcadores relacionados con la
endometriosis específicos se modulaban dependiendo del estadio de la
enfermedad. La tabla 8 más adelante en el presente documento
proporciona una lista de los marcadores relacionados con la
endometriosis cuyos niveles de expresión se encontraron que estaban
modulados dependiendo del estadio de la enfermedad.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a un kit para determinar la posibilidad de endometriosis en
un sujeto femenino o para clasificar la endometriosis en un sujeto
femenino que padece la enfermedad. El kit de la invención
comprende:
- -
- al menos una molécula de unión para unirse a un producto de ácido nucleico o a un producto de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis, seleccionándose el marcador relacionado con la endometriosis del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR definido en i), o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii); y
- -
- al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: un soporte para la(s) molécula(s) de unión, tubos de mezclado, tampones, enzimas y sustancias para la detección de la(s) molécula(s) de unión.
Según una realización preferida, la molécula de
unión es un ácido nucleico que hibrida en condiciones convencionales
con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:
- a)
- ARNm de FKHR para el que un número de registro de GENBANK^{TM} es AF 032885;
- b)
- ácidos nucleicos monocatenarios que hibridan en condiciones convencionales con el ácido nucleico definido en a);
- c)
- ácidos nucleicos monocatenarios obtenidos mediante transcripción inversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en de a) a c).
Tal como se usa en el presente documento,
hibridación de ácido nucleico se refiere al principio de que dos
moléculas de ácido nucleico monocatenario que tienen secuencias de
bases complementarias volverán a formar la estructura bicatenaria
favorecida termodinámicamente si se mezclan en condiciones
apropiadas. Por ejemplo, puede proporcionarse una condición de
rigurosidad media mediante NaCl aproximadamente de 0,1 a 0,25 M a
temperaturas de aproximadamente 37ºC a 55ºC, mientras que puede
proporcionarse una condición de rigurosidad baja mediante NaCl
aproximadamente de 0,15 M a 0,9 M, a temperaturas que oscilan desde
aproximadamente 20ºC hasta 55ºC. Por tanto, las "condiciones de
hibridación convencionales" varían dependiendo de los resultados
deseados.
Según otra realización preferida, la molécula de
unión es un anticuerpo aislado dirigido contra al menos un producto
de proteína de un marcador relacionado con la endometriosis, tal
como se definió anteriormente, o dirigido contra un fragmento
del/de los producto(s) de proteína.
Otros tipos de moléculas de unión incluyen
pequeñas moléculas tales como azúcares y glucoproteínas.
Los polinucleótidos seleccionados del grupo que
consiste en:
- a)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 a 10, SEQ ID NO: 12 a 16, y parte de las mismas; y
- b)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria a los polinucleótidos definidos en a),
tienen muchos usos, particularmente
como marcadores biológicos según los métodos de la presente
invención, como cebadores y/o como sondas para endometriosis.
También podrían usarse como molde para preparar ácidos nucleicos
monocatenarios o bicatenarios útiles en los métodos de terapia
génica (antisentido, silenciación de genes, ARN bicatenario,
etc.).
La invención también se refiere al uso de
cebadores y/o sondas para determinar la posibilidad de endometriosis
en un sujeto femenino o para clasificar la endometriosis en un
sujeto femenino que padece endometriosis. Según la invención, el
cebador o la sonda comprende un ácido nucleico aislado seleccionado
del grupo que consiste en:
- a)
- ARNm de FKHR para el que un número de registro de GENBANK^{TM} es AF032885;
- b)
- ácidos nucleicos monocatenarios que hibridan en condiciones convencionales con los ácidos nucleicos definidos en a);
- c)
- ácidos nucleicos monocatenarios obtenidos mediante transcripción inversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en de a) a c).
La invención también engloba los usos de los
polinucleótidos y ácidos nucleicos aislados mencionados
anteriormente en los métodos para determinar la posibilidad de
endometriosis en un sujeto femenino o en los métodos para
clasificar la endometriosis en un sujeto femenino que padece
endometriosis. Estos métodos pueden incluir el uso de técnicas
basadas en biochips, membranas y matriz de vidrio de ADNc;
RT-PCR; hibridación in situ; estudios de
fusión del promotor in vitro en líneas celulares o cultivos
primarios; métodos de estudio de la tasa de transcripción;
hibridación por inmunotransferencia sobre membrana; y marcaje. Por
ejemplo, algunos de los ácidos nucleicos aislados descritos
anteriormente considerados "los mejores" en lo que se refiere
a la especificidad y la sensibilidad para detectar mujeres, podrían
acoplarse a un biochip para detectar mujeres con endometriosis y/o
para evaluar el estadio de su enfermedad.
El método diagnóstico para la detección de la
endometriosis en un sujeto femenino puede comprender el uso de
cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para la
determinación de la posibilidad, y/o los kits, polinucleótidos
aislados, sondas de ácidos nucleicos y cebadores mencionados
anteriormente. Dependiendo de los marcadores relacionados con la
endometriosis seleccionados, particularmente si se usan en
combinación, es posible, de hecho, según la presente invención,
diagnosticar a mujeres que tienen endometriosis con una
sensibilidad muy alta y una especificidad muy alta.
Los siguientes ejemplos ilustran la amplia
variedad de aplicaciones potenciales de la presente invención y no
pretenden limitar su alcance. Pueden realizarse en ellos
modificaciones y variaciones sin apartarse del espíritu y el
alcance de la invención. Aunque puede usarse cualquier método y
materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente
documento en la puesta en práctica para someter a prueba a la
presente invención, se describen los métodos y materiales
preferidos.
Ejemplo
1
En ausencia de cualquier herramienta de
diagnóstico fidedigna y no invasiva para la detección de la
endometriosis, el centro de atención se situó en la identificación
de genes expresados de manera diferencial en el endometrio de
sujetos femeninos que padecen endometriosis (grupo Endo) cuando se
comparaba con sujetos sin endometriosis (grupo Control). Para
lograr esto, se utilizaron tres enfoques cuantitativos,
concretamente presentación diferencial, hibridación en matriz de
ADNc, y RT-PCR específica. A menos que se
especifique lo contrario, todos los experimentos se han llevado a
cabo utilizando ARN obtenido de la fracción glandular enriquecida
del endometrio. Además, para algunos análisis, los resultados
también se obtuvieron a partir de ARN aislado de biopsias de
endometrio no
fraccionadas.
fraccionadas.
A continuación se exponen los materiales y
procedimientos experimentales que se usaron para el ejemplo
explicado a continuación.
Los prerrequisitos comunes para que las
pacientes se incluyeran en el estudio llevado a cabo para el
presente ejemplo, tanto en el grupo control sin endometriosis como
en el grupo positivo para endometriosis, fueron los siguientes:
- -
- edad premenopáusica;
- -
- sin menstruar en la actualidad;
- -
- ciclos menstruales entre 21 y 35 días;
- -
- sin salpingitis aguda;
- -
- sin VIH, diagnóstico positivo para hepatitis B o C;
- -
- no embarazada o habiéndose quedado embarazada en los últimos tres meses;
- -
- no está en el periodo de lactancia en la actualidad;
- -
- no ha utilizado un compuesto seleccionado del grupo que consiste en agonistas de GnRH, Progestinas, Danazol y anticonceptivos orales en los últimos tres meses; y
- -
- no ha utilizado un dispositivo intrauterino (D.I.U.) en los últimos tres meses.
Las mujeres incluidas en el grupo positivo para
endometriosis que proporcionaron biopsias del endometrio se
seleccionaron entre las mujeres que se sometieron a laparoscopia y
para las que se confirmó la presencia de endometriosis en el
momento del examen quirúrgico. Se definieron los estadios de la
enfermedad según la clasificación de la American Society of
Reproductive Medicine (ASRM), tal como sigue: estadio I (mínimo),
estadio II (leve), estadio III (moderado), y estadio IV (grave).
Para ser elegible en el grupo control, las
mujeres que proporcionaron biopsias tuvieron que cumplir las
condiciones siguientes:
- -
- someterse a laparoscopia para ligadura de trompas o repermeabilización tubárica;
- -
- sin lesión por endometriosis detectada en la cavidad peritoneal en la cirugía;
- -
- sin historia de endometriosis en los parientes de primer grado; y
- -
- sin indicación de esterilidad.
Las mujeres con endometriosis (Endo) se
subdividieron en dos grupos experimentales, concretamente, EXP 1
(estadios I y II) y EXP 2 (estadios III y IV). Los grupos
experimentales se subdividieron adicionalmente en los grupos de
fase proliferativa (P) y de fase secretora (S), basándose en la
fase del ciclo menstrual indicada por las últimas menstruaciones y
confirmada por el examen histológico.
Se obtuvieron biopsias del endometrio de las
pacientes bajo anestesia antes de la laparoscopia con una legra
convencional. El tejido recogido se mantuvo en hielo y se utilizó
para el experimento en el plazo de cuatro horas. Los experimentos
se realizaron o bien en fracciones glandulares enriquecidas o en
biopsias no fraccionadas.
Se enriquecieron las fracciones glandulares
procedentes del endometrio mediante digestión enzimática. Se cortó
el tejido en primer lugar en pequeños trozos en presencia de medio
HBSS (LIFE TECHNOLOGIES^{TM}). Se digirieron entonces los trozos
con una mezcla enzimática que contenía pancreatina 3,4 mg/ml,
hialuronidasa 0,1 mg/ml y colagenasa 1,6 mg/ml (SIGMA^{TM})
durante 50 minutos a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Tras la digestión
enzimática, se separaron las células glandulares de la fracción
estromal mediante exclusión por tamaños. Es decir, la suspensión de
células digeridas se sometió a rondas sucesivas de filtración a
través de filtros de 41 \mum y 11 \mum. La fracción glandular
consiste en las células que quedaron retenidas en los filtros.
Se aisló El ARN total de las células glandulares
endometriales. La fracción de células glandulares se pesó y las
células se resuspendieron a una concentración de 100 mg/ml de una
disolución desnaturalizante que contenía tiocianato de guanidina
2,7 M, tiocianato de amonio 1,3 M y acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0.
Se extrajo entonces la suspensión dos veces con fenol/cloroformo
antes de su precipitación con 1 volumen de isopropanol. El
sedimento de ARN se lavó con etanol al 80% y se resuspendió en
H_{2}O a una concentración final de 1 \mug/\mul.
Se aisló el ARN celular total directamente del
tejido de biopsia de endometrio. En resumen, se homogeneizaron
200-300 mg de tejido de biopsia usando un
homogeneizador eléctrico en presencia de 3 ml de TRIZOL^{TM} (LIFE
TECHNOLOGIES^{TM}). Se preparó el ARN según el protocolo del
fabricante de TRIZOL^{TM}. Normalmente fueron necesarias 2 ó 3
extracciones adicionales con fenol/cloroformo para obtener una
superficie de contacto clara. Se precipitó entonces el ARN y se
resuspendió tal como se describió anteriormente.
Se realizó la presentación diferencial (PD)
utilizando el ARN total aislado de células glandulares o biopsias
no fraccionadas según Liang y Pardee (Differential Display: Methods
and Protocols, 1997, Humana Press, Totowa, N.J. págs.
1-11). Se realizaron las amplificaciones en un
STRATAGENE ROBOCYCLER^{TM} (STRATAGENE^{TM}) que implicaba 40
ciclos de 94ºC (1 min), 40ºC (2 min), 72ºC (1 min) con una extensión
final de 7 minutos a 72ºC. Se utilizaron los reactivos siguientes:
Transcriptasa inversa de VLMM (virus de la leucemia murina de
Moloney) (LIFE TECHNOLOGIES^{TM}), ^{33}P-dATP
(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}, 2500 Ci/ mmol), y rTaq
ADN polimerasa (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}).
Los fragmentos identificados mediante la
presentación diferencial se clonaron utilizando TA CLONING
KIT^{TM} (INVITROGEN^{TM}) según las instrucciones del
fabricante. Se identificaron los clones que contenían los
fragmentos deseados mediante PCR de colonia, tal como se describe en
Maniatis et al. (Maniatis et al., 1992, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y.) y utilizando el gen
lacZ-20 y cebadores inversos.
Los productos de la PCR de colonia se
depositaron en membranas de nylon cargadas positivamente (BOEHRINGER
MANNHEIM^{TM}) y se hibridaron con sondas de presentación
diferencial marcadas con ^{32}P. Se seleccionaron varios clones
con el patrón diferencial esperado para su secuenciación. Los clones
que mostraron secuencias idénticas se aceptaron como
candidatos.
Se llevó a cabo la secuenciación utilizando el
ABI PRISM RHODAMINE CYCLE SEQUENCING KIT^{TM}
(PE APPLIED BIOSYSTEMS^{TM}) y se ejecutó en un secuenciador automático ABI PRISM 310^{TM} (PE APPLIED
BIOSYSTEMS^{TM}).
(PE APPLIED BIOSYSTEMS^{TM}) y se ejecutó en un secuenciador automático ABI PRISM 310^{TM} (PE APPLIED
BIOSYSTEMS^{TM}).
Se estudio la expresión de los genes utilizando
membranas por duplicado de HUMAN and CANCER ATLAS cDNA ARRAYS^{TM}
(CLONTECH LABORATORIES^{TM}). Se sometieron a transcripción
inversa el ARN glandular (3 \mug) de los individuos control y las
pacientes en la misma fase del ciclo menstrual en presencia de
\alpha^{32}P-dATP (AMERSHAM PHARMACIA
BIOTECH^{TM}, 3000 Ci/mmol). Se llevaron a cabo las hibridaciones
y los análisis según el manual del usuario proporcionado por el
fabricante.
El ARN celular total, aislado previamente de
células glandulares o biopsias no fraccionadas tal como se describió
anteriormente, se usó como molde para la producción de ADNc. En
resumen, se digirió 1 \mug del ARN con 1 U de ADNasa 1 (LIFE
TECHNOLOGIES^{TM}) según las instrucciones del fabricante. El ARN
digerido se sometió entonces a transcripción inversa en ADNc usando
200 U de transcriptasa inversa del VLMM en presencia de 0,4 \muM
de cebadores aleatorios (LIFE TECHNOLOGIES^{TM}), 2 mM de cada uno
de dGTP, dATP, dTTP y dCTP, y tampón de reacción suministrado. Tras
la incubación a 37ºC durante 1 hora, la reacción se terminó
sometiendo a ebullición durante 5 minutos. Se llevó a cabo la
amplificación por PCR del ADNc según los protocolos convencionales
descritos en Maniatis et al. (Maniatis et al., citado
anteriormente). Los ADNc se normalizaron en primer lugar mediante
una serie de amplificaciones por PCR del gen control interno, la
gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Las reacciones de PCR contenían 5 \mul de ADNc
(normalizado mediante GAPDH), 0,5 \muM de cada uno de dos
cebadores oligonucleotídicos específicos, 0,2 mM de cada uno de
dGTP, dATP, dTTP y dCTP, 1 U de rTaq ADN Polimerasa, y
tampón de reacción suministrados. Las amplificaciones se llevaron a
cabo en un BIOMETRA UNO II^{TM} o T GRADIENT THERMOCYCLER^{TM}
(BIOMETRA^{TM}) que implicaron 25-40 ciclos de
94ºC (45 segundos), una temperatura de hibridación específica (45
segundos), 72ºC (1 minuto) con una extensión final de 7 minutos a
72ºC. Las temperaturas de hibridación variaron según los cebadores
oligonucleotídicos específicos utilizados, mientras que el número
de ciclos varió según la abundancia del molde de ADNc en
cuestión.
Las transferencias de tipo Southern se
realizaron según los protocolos convencionales descritos en Maniatis
et al. (Maniatis et al., citado anteriormente). En
resumen, tras la amplificación por PCR específica de los ADNc
descrita anteriormente, se separaron las muestras en geles de
agarosa al 1,5% y se transfirieron a membranas de 0,45 \mum
BIODYNE^{TM} (PALL CORPORATION^{TM}) según las instrucciones del
fabricante. Las membranas se fijaron mediante radiación IV y se
hibridaron durante la noche a 65ºC con sondas de plásmido
específicas que se marcaron con ^{32}P usando un kit de marcaje de
cebador aleatorio (sistema de marcaje de ADN MEGAPRIME^{TM},
AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}). Los productos se visualizaron
mediante autorradiografía, se exploraron y se analizaron mediante
el software MOLECULAR ANALYST^{TM}
(BIO-RAD^{TM}). Se ecualizaron las intensidades
de banda basándose en la intensidad de un control interno
(GAPDH).
Se llevaron a cabo alineaciones de la secuencia
de nucleótidos con GENBANK^{TM} a través del software BLAST
disponible en el sitio web de National Center for Biotechnology
Information (NCBI) (www.ncbi.nih.gov). Dado un débil porcentaje de
lecturas erróneas en la secuencia en los datos y en GENBANK^{TM},
las homologías del 90% o más se consideraron como una
identidad.
Los datos se analizaron usando MICROSOFT
EXCEL^{TM}. Para el análisis estadístico, se llevó a cabo la
prueba de la t de Student y los resultaron se consideraron
significativos con un valor de p inferior o igual a
0,05.
La especificidad se define en el presente
documento como la probabilidad de ausencia de un marcador de
enfermedad en el grupo control, mientras que la sensibilidad es la
probabilidad de presencia del marcador de enfermedad en el grupo de
endometriosis. Los cálculos para la especificidad y la sensibilidad
se realizaron de la siguiente forma. En primer lugar, se establece
un valor arbitrario de punto de corte en la representación gráfica
de la muestra (ARN, ADNc, proteína u otros) en cuestión. Para las
muestras que se regulan por incremento en el grupo de enfermedad,
la especificidad se calcula contando el número de pacientes en el
grupo control que están por debajo del valor de punto de corte,
dividido por el número total de pacientes en ese grupo y expresado
como un porcentaje; la sensibilidad se calcula contando el número de
pacientes en el grupo de endometriosis que está por encima del
mismo valor de punto de corte, dividido por el número total de
pacientes en ese grupo y expresado como un porcentaje. Para las
muestras que se regulan por disminución en el grupo de enfermedad,
la especificidad se calcula contando el número de pacientes en el
grupo control que están por encima del valor de punto de corte,
dividido por el número total de pacientes en ese grupo y expresado
como un porcentaje; la sensibilidad se calcula contando el número
total de pacientes en el grupo de endometriosis que están por
debajo del mismo valor de punto de corte, dividido por el número
total de pacientes en ese grupo y expresado como un porcentaje.
Las células glandulares enriquecidas se aislaron
de las biopsias endometriales y se extrajo el ARN total. Se
dividieron los extractos de ARN en los grupos tanto Control como
Endo en dos subgrupos según la fase del ciclo menstrual,
concretamente, la fase proliferativa (P) o secretora (S).
Inicialmente, se seleccionaron las señales diferenciales basándose
en su aspecto en más del 50% de las de muestras de un grupo, en
comparación con el otro. Las señales seleccionadas se purificaron
del gel y se clonaron en E. coli. Varios plásmidos
recombinantes para cada señal se sometieron a la etapa de validación
mediante transferencia de tipo Northern inversa, tal como se
describe en la presente solicitud. Se determinó la secuencia de
nucleótidos y se analizó para distintos plásmidos de cada serie, y
se sintetizaron cebadores específicos para la etapa siguiente.
El nivel de expresión de los candidatos se
analizó adicionalmente mediante RT-PCR
semicuantitativa en los diferentes grupos del ARN. Se llevaron a
cabo experimentos basados en el número de ciclo y en las cantidades
de ADNc para garantizar la linealidad de las reacciones de PCR. Se
usó el nivel de expresión de GAPDH como control interno para
normalizar las mediciones. El grupo Endo se subdividió en dos grupos
experimentales: EXP 1 que incluía los estados mínimo y leve (I y
II) de la enfermedad y EXP 2 que consistía en los estadios moderado
y grave (III y IV) de la endometriosis. La tabla 3 resume los
valores promedio por grupo para todos los marcadores relacionados
con la endometriosis analizados.
Los valores de punto de corte (no mostrados) se
seleccionaron para estimar el valor clínico de cada marcador,
concretamente, la especificidad y la sensibilidad. Por tanto, para
cada marcador, se determinó el valor de punto de corte para
permitir los valores máximos de especificidad y sensibilidad. La
especificidad corresponde a la probabilidad de la ausencia de un
marcador en el grupo control y la sensibilidad representa la
probabilidad de la presencia del mismo marcador en el grupo de
pacientes.
En el presente documento se facilita una lista
de todos los ADNc identificados mediante el enfoque de presentación
diferencial. Para cada candidato, se facilita el número de registro
de GENBANK^{TM} de los genes homólogos en la tabla 1. Los datos
de la secuencia de nucleótidos y la SEQ ID NO correspondiente se
enumeran en la tabla 2.
El marcador DD1 (SEQ ID NO: 1) muestra un 94% de
homología en GENBANK^{TM} con un ADNc clonado de tejido de riñón
fetal. Esta secuencia de ADNc también muestra un 100% de homología
con una región en el cromosoma 22q11 (AC007064). El análisis de la
expresión mostró una disminución significativa en la fase secretora
del grupo EXP 1, en comparación con la fase secretora del grupo
control (p = 0,01) (tabla 3). Con un punto de corte
establecido en 0,4, se obtuvieron una especificidad del 75% y una
sensibilidad del 90% (tabla 5).
\newpage
El marcador DD2 (SEQ ID NO: 2) corresponde a una
etiqueta de secuencia de expresión (EST) que codifica para una
fosfoproteína que también se ha aislado mediante presentación
diferencial de células de glioma humano. La homología engloba una
región en el sentido de 5' de 40 pb (97%) y una región en el sentido
de 3' de 89 pb (96%). Un hueco de 40 pb está presente en el medio
de la alineación entre las dos secuencias. Se obtuvo la misma
alineación con el ADNc homólogo de I-myc (HSLMYCH).
Esto puede deberse a un corte y empalme alterno de un gen común en
tejidos diferentes o a dos genes distintos de una familia dada. La
presencia de este ADNc no se ha descrito nunca en el endometrio.
Tal como se muestra en la tabla 3, esta transcripción del gen estaba
regulada por disminución en el grupo endo (p = 0,04). El
valor de punto de corte de 0,13 proporciona un 65% de especificidad
y un 77% de sensibilidad (tabla 5).
El marcador DD3 (SEQ ID NO: 3) mostró un 100% de
homología con el origen mitocondrial de la replicación (ori). Hasta
la fecha, no se ha mapeado ningún gen que codifique para ARNm en
esta región del ADN mitocondrial. Según los resultados obtenidos
para el presente ejemplo mostrados en la tabla 3, la expresión está
notablemente disminuida en el grupo Endo (p = 0,01). Los
parámetros del marcador con un valor de punto de corte de 0,7 son
un 63% de especificidad y un 69% de sensibilidad (tabla 5).
El marcador DD4 (SEQ ID NO: 4) mostró un 98% de
homología con un ADNc aislado de tumores de colon humanos. Hasta la
fecha, no se ha asociado ninguna función conocida con este gen. Tal
como se muestra en la tabla 3, la expresión está significativamente
disminuida en la fase secretora del grupo Endo (p = 0,04).
Con un umbral de 1,3, el gen candidato tiene una especificidad del
83% y una sensibilidad del 85% (tabla 5).
El marcador DD5 (SEQ ID NO: 5) corresponde a un
gen que tiene diversos nombres, tales como Cap43, Drg1,
TDD-5, rit 42, Ndr 1, Proxy-1 o
RTP, siendo Cap43 el más común y el utilizado en el presente
documento. El ARNm de Cap43 tiene una región de 1759 pb en 3' sin
traducir y su marco de lectura abierto previsto codifica para un
polipéptido de 394 residuos de aminoácidos. Los estudios anteriores
han demostrado una expresión modulada del ARNm de Cap43 en diversos
tipos de células, pero no en las células endometriales ni en la
endometriosis. Tal como se muestra en la tabla 3, se observó una
disminución general en la fase proliferativa de todas las pacientes
con endometriosis (p = 0,03). Un valor de punto de corte de
1,2 da como resultado un 78% de especificidad y un 79% de
sensibilidad (tabla 5).
La secuencia del marcador DD6 (SEQ ID NO: 6)
coincide en un 97% de homología con un archivo de secuencia
genómica. Además, el segmento de ADNc de DD6 contiene una secuencia
alu en el extremo 3'. Tal como se muestra en la tabla 3, se observó
una disminución significativa entre el Control y EXP 1 en la fase
secretora (p = 0,018). Un valor de punto de corte de 0,4 da
los parámetros siguientes: especificidad del 89%, sensibilidad del
100% para EXP 1 (tabla 5).
Varias EST fueron idénticas a la secuencia DD7
(SEQ ID NO: 7). Todas las secuencias conocidas clonadas de tejidos
transformados tales como adenocarcinoma de páncreas, neoplasia
intraepitelial prostática o un carcinoma endometrial moderadamente
diferenciado. El ADNc de DD7 también contiene una secuencia alu. Tal
como se muestra en la tabla 3, se observó una grave disminución en
la expresión génica para este marcador en la fase proliferativa del
grupo Endo (p = 0,019). Se encontró una especificidad del 80%
y una sensibilidad del 70% con un valor de punto de corte de 0,5
(tabla 5).
Las homologías de secuencia indicaron que la
secuencia del marcador DD8 (SEQ ID NO: 8) era idéntica a un gen
clonado de células Jurkat, cerebro y otros tejidos. En la tabla 3,
se observó una ligera disminución, aunque significativa, en la
expresión de DD8 en el grupo EXP 1 (p = 0,02), con valores de
especificidad y sensibilidad del 67% y el 60% respectivamente, en
un valor de punto de corte de 0,6 (tabla 5).
El marcador DD9 (SEQ ID NO: 9) corresponde a la
subunidad III de la enzima mitocondrial, NADH deshidrogenasa, que
está implicada en el metabolismo del oxígeno celular. Este gen
desempeña un papel clave en la cadena de transporte de electrones y
producción de energía. Tal como se observa en la tabla 3, se detecta
un aumento sustancial en la fase proliferativa del grupo Endo (EXP
1 y EXP 2) (p = 0,008). Un valor de punto de corte de 0,2
proporciona una especificidad del 70% y una sensibilidad del 59%
(tabla 4).
El marcador DD10 (SEQ ID NO: 10) corresponde a
la subunidad II de la NADH deshidrogenasa. Como con DD9, este
producto génico es parte del complejo enzimático respiratorio
situado en la mitocondria. La totalidad de la enzima se compone de
12 polipéptidos diferentes. En la tabla 3, la validación de este
marcador mostró un nivel de expresión mayor en la fase
proliferativa del grupo EXP 1 (p = 0,04). Se evaluó el valor
diagnóstico el gen con un valor de punto de corte de 0,2 dando una
especificidad del 71% y una sensibilidad del 71% (tabla 4).
El marcador DD11 (SEQ ID NO: 11) corresponde a
la citocromo oxidasa (CO3) (descrita más adelante).
El marcador DD12 (SEQ ID NO: 12) corresponde al
dominio de proteína Forkhead (FKHR) del factor de transcripción. Su
presencia en el endometrio no se ha notificado nunca en la
bibliografía. En la tabla 3, el análisis de la expresión de este
marcador en ARN de tejido endometrial no fraccionado mostró una
disminución de expresión en el grupo Endo (p = 0,015). Se
evaluó el marcador con un valor de punto de corte de 23 con una
especificidad del 81% y una sensibilidad del 56% cuando se
consideraron ambas fases (tabla 5). Cuando se analizó la expresión
de DD12 mediante transferencia de tipo Northern en muestras de ARN
de biopsia no fraccionada, se detectó una disminución significativa
en el grupo en comparación con los controles (p = 0,05)
(tabla 5). Usando un valor de punto de corte de 0,4, la
especificidad fue del 55% y la sensibilidad fue del 68%. Este
resultado está de acuerdo con la observación inicial del inventor
al usar RT-PCR.
El marcador DD13 (SEQ ID NO: 13) corresponde a
un ARN mensajero del gen hUCC1. El mismo ADNc se clonó previamente
a partir de cáncer de colon. En la tabla 3, el análisis de la
expresión de este marcador con ARN de tejido no fraccionado mostró
un nivel de expresión mayor en el grupo EXP 2 (p = 0,04). Se
evaluó el valor diagnóstico del gen con un valor de punto de corte
de 0,5 dando una especificidad del 62% y una sensibilidad del 64% en
el grupo EXP 2 (tabla 4).
La secuencia del marcador DD14 (SEQ ID NO: 14)
es idéntica en un 98% a un ADNc humano clonado recientemente que
codifica para una supuesta proteína morforreguladora unida a la
membrana que muestra homología con paralemmina, una proteína
morforreguladora unida a la membrana. Tal como se observa en la
tabla 3, se detecta un aumento en el grupo Endo (EXP 1 y EXP 2) con
ARN de biopsia no fraccionada (p = 0,04). Un valor de punto
de corte de 1,2 proporciona una especificidad del 78% y una
sensibilidad del 58%, cuando sólo se considera la fase S (tabla
4).
El marcador DD15 (SEQ ID NO: 15) corresponde a
la proteína de transporte de citrato, uno de los marcadores del
síndrome de DiGeorge en la región de 22q11. Tal como se muestra en
la tabla 3, este marcador muestra en el ARN de biopsia no
fraccionada un aumento sustancial de la expresión en el grupo Endo
(p = 6,10^{-4}). Se obtuvieron una especificidad del 85% y
una sensibilidad del 79% con un valor de punto de corte de 0,18
(tabla 4).
La secuencia del marcador DD16 (SEQ ID NO: 16)
muestra un 90% de homología con algunas EST humanas y un 82% de
homología con el gen de ARNr 12S mitocondrial humano. Tal como se
muestra en la tabla 3, la expresión de este marcador estaba
regulado por disminución en el grupo Endo del ARN de biopsia no
fraccionada (p = 3 x 10^{-5}). Con un valor de punto de
corte de 2, este marcador mostró una especificidad del 70% y una
sensibilidad del 78% (tabla 5).
En el presente ejemplo, se usó otra técnica
semicuantitativa, concretamente transferencia de tipo Northern
inversa con matrices de ADNc, para identificar a otros genes que se
expresaban de manera diferenciada en la endometriosis. El análisis
de validación final se realizó mediante RT-PCR
normalizada, de manera similar al enfoque de presentación
diferencial. La tabla 1 facilita el número de registro de
GENBANK^{TM} conocido para cada gen que se identificara, según la
presente invención, como un marcador relacionado con la
endometriosis.
El factor 1\alpha inducido por hipoxia
(HIF-1\alpha) es una de las dos subunidades de un
factor de transcripción implicado en el estrés oxidativo. Tal como
se observa en la tabla 3, el análisis estadístico mostró un aumento
significativo del ARNm de HIF-1\alpha en el grupo
Endo (p = 0,028). Con un valor de punto de corte de 1,1, se
obtuvieron una especificidad del 65% y una sensibilidad del 72%.
Cuando se analizó la expresión de HIF-1\alpha
mediante transferencia de tipo Northern en muestras de ARN de
biopsia no fraccionada, se detectó un aumento significativo en la
fase P del grupo Endo, en comparación con la fase P control
(p = 0,019) (tabla 4). Usando un valor de punto de corte de
0,95, la especificidad fue del 83% y la sensibilidad fue del 80%.
Este resultado está de acuerdo con la observación inicial de los
inventores en el ARN de las células epiteliales.
El translocador nuclear del receptor del
hidrocarburo de arilo (ARNT) (o HIF-1\beta) es la
segunda subunidad del complejo de transcripción inducido por
hipoxia. De hecho, el ARNT tiene un doble papel: puede acoplarse a
HIF-1\alpha como en el caso de la hipoxia, pero
también puede formar un heterodímero con el receptor de
hidrocarburo aromático (arilo) (AhR) para contrarrestar situaciones
tóxicas. En la endometriosis, el gen de ARNT se transcribe a una
tasa mayor que la observada para su pareja,
HIF-1\alpha. Tal como se observa también en la
tabla 3, se registró un aumento significativo en las pacientes en
fase proliferativa del grupo Endo (p = 0,02). La
especificidad de este marcador fue del 67% y la sensibilidad del 83%
con un valor de punto de corte de 0,6 (tabla 4). Estos parámetros
son comparables con los de HIF-1\alpha en la fase
proliferativa. Los patrones de expresión comparables para
HIF-1\alpha y ARNT es un fuerte argumento en favor
de la implicación de la ruta de estrés oxidativo (OXPHOS) en la
endometriosis.
La adenilato cinasa es una enzima ubicua que
contribuye a la homeostasis de la composición de adenina y guanina
celular. La isoforma de isoenzima 3 de adenilato cinasa (AK3) se
ubica exclusivamente en la membrana interna de la mitocondria y su
actividad está implicada en la transferencia de energía. Su
modulación se ha asociado con la hipoxia y, más específicamente,
con la actividad de HIF1\alpha. En la tabla 3, se observó una
intensa regulación por disminución de la expresión de AK3 en el
grupo EXP 1 (p = 0,005). El punto de corte de 0,75 produjo
una especificidad del 68% y una sensibilidad del 82% (tabla 5).
La isoforma 1 del transportador de la glucosa
(Glut-1) desempeña un papel importante en el
metabolismo de la energía celular. Tal como se mencionó
anteriormente, la expresión de Glut-1 está regulada
por el complejo de factor de transcripción
HIF-1\alpha/ARNT. Además, la expresión de
Glut-1 se induce en diversas circunstancias, tales
como estrés oxidativo o transformación celular. En la tabla 3, se
observó una regulación por incremento significativa en la expresión
de Glut-1 en el grupo EXP 2, en comparación con el
grupo control (p = 0,037). Además, la especificidad y la
sensibilidad de Glut-1 son del 71% y del 67%
respectivamente, cuando se usa un valor de punto de corte de 1
(tabla 4).
La respiración celular que se produce en la
mitocondria da como resultado la producción de especies de oxígeno
reactivas (ROS). La exposición crónica a ROS puede dar como
resultado la lesión oxidativa permanente a las proteínas, lípidos y
ácidos nucleicos celulares y mitocondriales. Para protegerse frente
a la lesión oxidativa producida por estos productos tóxicos, las
células de mamífero han desarrollado mecanismos protectores. Las
enzimas detoxificantes incluyen manganeso superóxido dismutasa
(MnSOD), glutatión peroxidase (GPx), catalasa (CAT) y glutatión
S-transferasa (GST). MnSOD se regula por incremento
en la transcripción en la mitocondria para detoxificar en anión
superóxido (O_{2}^{-}) convirtiéndolo en peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}).
El análisis de la expresión de MnSOD en la tabla
3 demuestra una regulación por incremento general y significativa
en la totalidad del grupo Endo, en comparación con el grupo control
(p = 0,017). Con un punto de corte de 0,9, la especificidad
de MnSOD fue del 76% y su sensibilidad fue del 58%. Se obtuvieron
resultados similares con ARN de biopsia no fraccionada, y se
detectó una elevación significativa en todo el grupo Endo (p
= 0,003). Con un valor de punto de corte de 0,9, el marcador mostró
una especificidad del 81% y una sensibilidad del 53% (tabla 4).
Tal como se trató anteriormente, GPx está
implicado en la ruta de detoxificación de ROS en la mitocondria.
Más específicamente, GPx convierte el H_{2}O_{2} producido por
MnSOD en H_{2}O. El análisis estadístico mostró un aumento
significativo en la expresión del ARNm de en el grupo Endo, en
comparación con los controles (p = 1,7 x 10^{-11}), tal
como se muestra en la tabla 3. Esto dio como resultado una
especificidad del 100% y una sensibilidad del 87,5%, cuando se usa
un valor de punto de corte de 1,2 (tabla 4).
En los sitios
extra-mitocondriales, tales como peroxisomas, el
H_{2}O_{2} producido por MnSOD se convierte en H_{2}O por la
catalasa (CAT). Por tanto, CAT funciona en la detoxificación de ROS
protegiendo a las células del H_{2}O_{2} que se genera dentro
de ellas. En el presente ejemplo, se observó una disminución
significativa en la expresión de ARNm de CAT en el ARN de biopsia
no fraccionada en la fase secretora del grupo Endo, en comparación
con los controles (p = 0,001), tal como se muestra en la
tabla 3. Usando un valor de punto de corte de 0,2, la especificidad
y la sensibilidad de CAT es del 83% y del 78%, respectivamente
(tabla 5).
La superfamilia de genes de la glutatión
S-transferasa (GST) es uno de los principales
sistemas de eliminación de radicales libres y detoxificación en
células de mamífero. En el presente ejemplo, se observó una
disminución significativa en la expresión de GST en el grupo EXP 1,
en comparación con los controles (p = 0,026), tal como se
ilustra en la tabla 5. Un análisis directo de la tabla 3 también
muestra un aumento en la expresión de GST en el grupo EXP 2. Según
un valor de punto de corte de 0,21, los parámetros para el grupo EXP
1 serían una especificidad del 54% y una sensibilidad del 74%
(tabla 5).
La óxido nítrico sintasa endotelial (ONSe)
cataliza la oxidación de la L-arginina para dar
óxido nítrico (ON) y citrulina. Los informes previos han descrito
una regulación por incremento en el nivel de proteína en el
endometrio de las pacientes con endometriosis durante la fase
secretora del ciclo (Ota et al., Fertility and Sterility
(1998) 69:303-308). En el presente ejemplo, se
observó una disminución significativa en la expresión de ONSe
cuando se compararon las fases proliferativas del grupo control y
las fases proliferativas del grupo Endo como un todo (p =
0,027) (véase la tabla 3). Usando un valor de punto de corte de 0,1,
podría definirse una especificidad y una sensibilidad del 77% y del
65%, respectivamente (tabla 5).
Se publicó que el gen de la denominada citocromo
oxidasa 3 (CO3) estaba regulado por incremento en los hepatocitos
mediante H_{2}O_{2} y/u homocisteína. La secuencia amplificada
en el presente ejemplo correspondió a varios ADNc en
GENBANK^{TM}, tales como el gen 14 inducible por hipoxia que, de
hecho, estaba en la región del ARNr 16S del genoma mitocondrial
humano, y con el ADNc de TI-227H, un marcador
metastásico. Finalmente, la secuencia del gen de CO3 es
completamente homóloga a la secuencia de DD11 (aislada mediante
presentación diferencial). El análisis de la expresión génica de
CO3 (y de DD11) reveló una disminución específica de la fase
secretora, tal como se observa en la tabla 3, cuando se comparan
los grupos control y Endo (p = 0,002). Cuando se usa un
valor de punto de corte de 0.58, la especificidad y la sensibilidad
de este marcador fueron del 83% y del 79%, respectivamente (tabla
5).
El ARNr 12S es uno de los dos genes del ARNr
codificados por el genoma mitocondrial. En el presente ejemplo, se
observó una disminución significativa en el ARNr 12S en ARN de
biopsia no fraccionada en el grupo EXP 1, en comparación con los
controles (p = 0,02), tal como se ilustra en la tabla 3.
Usando un valor de punto de corte de 1, la especificidad y la
sensibilidad del ARNr 12S son del 77% y del 67%, respectivamente
(tabla 5).
TI-227H es un gen nuclear que
tiene homologías con CO3, tal como se describió anteriormente. Como
resultado de estas similitudes de secuencia, los presentes
inventores se interesaron en determinar si las dos secuencias eran,
de hecho, el mismo gen, o quizá pseudogenes. Resulta interesante que
el análisis de la expresión del ARNm de TI-227H en
ARN de biopsia no fraccionada, descrito en el presente ejemplo,
demostró resultados diferentes de los obtenidos con CO3, lo que
sugiere que las dos secuencias proceden de genes diferentes. A
diferencia de la expresión de CO3 que disminuía en la totalidad del
grupo Endo, la expresión de TI-227H disminuía
significativamente en el grupo EXP 2, en comparación con los
controles (p = 2 x 10^{-8}), tal como se muestra en la
tabla 3. La especificidad y la sensibilidad de
TI-227H son del 81% y del 100%, respectivamente,
cuando se usa un valor de punto de corte de 0,15 (tabla 5).
La citocromo oxidasa 2 (CO2) es una enzima
codificada en la mitocondria que participa en la cadena de
transporte de electrones (ETC) mitocondrial y, por tanto, en el
proceso de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) que proporciona
energía esencial a las células. Tal como se muestra en la tabla 3,
se encontró que la expresión de ARNm de CO2 en ARN de biopsia no
fraccionada disminuía en la fase proliferativa de EXP 1, en
comparación con los controles (p = 0,02). Cuando se usa un
valor de punto de corte de 0,2, la especificidad y la sensibilidad
de CO2 son del 64% y del 69%, respectivamente (tabla 5). Hay
pruebas experimentales notificadas en la bibliografía que
demuestran cambios en el metabolismo del hierro en respuesta al
estrés oxidativo. Una de las enzimas clave en esta ruta es la
aconitasa situada en la mitocondria.
El análisis de la expresión génica de la
aconitasa (tabla 3) demostró una disminución en la fase S del grupo
EXP 1 (p = 0,005) y también en la fase P de EXP 2 (p =
0,04). El análisis de los valores medios de las muestras de la fase
P muestra una disminución de la fase P de ambos grupos (EXP 1 y EXP
2), pero sólo el último es significativamente inferior que el grupo
control. Dado que la disminución más notable se observó en la fase
S de EXP 1, se evaluó el poder diagnóstico de la aconitasa partiendo
de esta base. Con un punto de corte de 0,11 se calcularon una
especificidad del 80% y una sensibilidad del 86% (tabla 5).
Codificado por un gen nuclear, el translocador
del nucleótido de adenina 1 (ANT-1) se sitúa dentro
de la membrana interna mitocondrial. ANT-1
desempeña un importante papel en OXPHOS, intercambiando ATP recién
sintetizado por ADP consumido. Hasta la fecha, no se ha notificado
la modulación de la expresión de ANT-1 en las
biopsias de endometrio. En el presente ejemplo, se encontró que la
expresión del ARNm de ANT-1 analizada mediante
RT-PCR en ARN de biopsia no fraccionada disminuía
en la fase proliferativa del grupo Endo, en comparación con los
controles (p = 0,007), tal como se muestra en la tabla 3.
Cuando se usa un valor de punto de corte de 1,
ANT-1 tiene una especificidad del 86% y una
sensibilidad del 74% (tabla 5). Este resultado se confirmó mediante
transferencia de tipo Northern (p = 0,016) por la que los
valores de la especificidad y la sensibilidad fueron del 75% y del
73%, respectivamente, cuando se usó un valor de punto de corte de
0,042 (tabla 5).
La ATP sintasa, también conocida como Complejo V
de la ETC, está codificada por dos genes mitocondriales (ATPasa 6 y
ATPasa 8) y 12 genes nucleares. De acuerdo con su papel crítico en
OXPHOS, las mutaciones en la ATP sintasa se han asociado con
enfermedades mitocondriales. Tal como se muestra en la tabla 3, la
expresión la subunidad \beta de la ATP sintasa en ARN de biopsia
no fraccionada aumentó en el grupo Endo, en comparación con los
controles (p = 1 x 10^{-3}). Resulta interesante que cuando
se considera sólo la fase proliferativa del grupo Endo, el análisis
estadístico llega a ser p = 8 x 10^{-4}. Cuando se usa un
valor de punto de corte de 4, la especificidad y la sensibilidad de
la ATP sintasa (subunidad \beta) es del 77% y del 75%,
respectivamente, cuando se comparan el grupo Endo y los controles.
Cuando se analiza la fase P del grupo Endo, la especificidad es del
93% y la sensibilidad es del 64% (tabla 4).
La leucemia/linfoma-2 de células
B (Bcl-2) es una proteína
anti-apoptótica codificada en el núcleo que se
sitúa en la membrana externa de la mitocondrial. Resulta interesante
que la expresión de Bcl-2 parece estar dirigida por
el estradiol en el endometrio durante la totalidad del ciclo
ovárico, por lo que se observa una alta expresión de
Bcl-2 en el endometrio proliferativo y está
disminuida en la fase secretora (Vaskivuo et al (2000) Mol
Cell Endocrinol 165:75-83). Estudios anteriores han
analizado la expresión de Bcl-2 en las células
glandulares frente a las estromales, y en las fracciones
endometriales eutópicas frente a las ectópicas (Meresman et
al. (2000) Fertil. Steril. 74(4): 760-6;
Jones et al. (1998) Hum. Reprod. 13(12):
3496-502). En el presente estudio, la expresión de
Bcl-2 en el ARN de biopsia de endometrio no
fraccionada disminuyó en el grupo Endo, en comparación con los
controles (p = 0,01), tal como se muestra en la tabla 3. La
especificidad y la sensibilidad de la expresión de
Bcl-2 son del 54% y del 82%, respectivamente, cuando
se usa un valor de punto de corte de 4 (tabla 5).
El protooncogén humano c-jun
(c-jun) es uno de los principales factores de
transcripción ubicuos que forma el complejo AP1 con
c-fos. En el presente ejemplo, se analizó la
expresión de c-jun y se observó una regulación por
incremento significativa durante la fase secretora del grupo EXP 1
(p = 0,05) (véase la tabla 3). Con un valor de punto de
corte de 0,7, se obtuvieron los siguientes parámetros para el grupo
en fase S de EXP 1: especificidad del 75%, sensibilidad 67% (tabla
4). Cuando se probó en ARN de biopsia no fraccionada, la regulación
por incremento de c-jun fue significativa para el
grupo Endo, en comparación con el grupo control (p = 0,005).
Con un valor de punto de corte en 1, se determinaron una
especificidad del 76% y una sensibilidad del 65% (tabla 4).
El factor de transcripción del promotor en el
sentido de 5' de la ovoalbúmina de pollo (COUP-TF)
es un importante regulador de la P450 aromatasa (P450arom), que
participa en la biosíntesis de estrógenos. En las células estromales
del endometrio eutópico, la unión de COUP-TF a una
región en el sentido de 5' del promotor de la aromatasa media la
inhibición de la transcripción de la aromatasa, evitando así la
producción aberrante de estrógenos. Tal como se muestra en la tabla
3, la expresión del ARNm de COUP-TF disminuyó en la
fase secretora de las muestras de Endo, en comparación con los
controles (p = 0,01) en biopsias de ARN no fraccionadas.
Usando un valor de punto de corte de 0,075, la especificidad y la
sensibilidad de COUP-TF son del 83% y del 78%,
respectivamente (tabla 5).
Las interleucinas participan en el proceso
inflamatorio, tal como se encuentra en enfermedades como la
endometriosis. El análisis de la transcripción de la
IL-1\beta en el presente ejemplo reveló un patrón
de expresión totalmente afectado en el grupo Endo, mientras que el
nivel es bastante constante en el grupo control (véase la tabla 3).
En particular, se observó una disminución significativa en la
expresión de IL-1\beta en el grupo EXP 2
(p = 0,0002). Basándose en un gráfico de dispersión (no
mostrado) se determinaron dos valores de punto de corte, uno para
un valor medio para el grupo control y el otro para su desviación
estándar correspondiente. Los valores fuera de este intervalo se
identificaron como que correspondían a pacientes con una alta
posibilidad de padecer endometriosis. Se determinaron una
especificidad del 78% y una sensibilidad del 93% para el valor
medio del grupo control de 0,98 \pm 0,28 (tabla 5).
Las conexinas participan en las interacciones
celulares y, más específicamente, en estructuras tales como uniones
de huecos. Su expresión está regulada generalmente por esteroides.
La conexina 43 (Cx43) parece estar regulada por el estradiol.
Generalmente en el endometrio, la conexina 43, así como algunas
otras conexinas, muestran una mayor expresión mediante
inmunohistoquímica en aproximadamente 11-15 días del
ciclo menstrual. Se cree que participan específicamente en la
implantación, por ejemplo durante el embarazo. Una publicación
notificó una expresión aberrante de la conexina 43 en todas las
muestras de tejido epitelial ectópico en lesiones de endometrio.
Ningún estudio ha medido nunca el nivel de expresión de la conexina
43 en células endometriales eutópicas. En el presente ejemplo, se
observó una regulación por incremento del ARNm de Cx43 en el grupo
EXP 1, en comparación con los controles (p = 0,048) (tabla
3), una diferencia que fue incluso más significativa cuando sólo se
consideró la fase proliferativa del grupo EXP 1 (p = 0,02).
Con un valor de punto de corte de 1,3, se obtuvieron una
especificidad del 74% y una sensibilidad del 48% para el grupo EXP 1
(tabla 4). Considerando la fase proliferativa del grupo EXP 1, el
marcador es más potente, puesto que la especificidad y la
sensibilidad son del 77% y del 64%, respectivamente (tabla 4). Las
proteínas de choque térmico (HSP) a menudo se inducen para proteger
a las células frente a diversos estreses. Más específicamente, la
proteína de choque térmico 70 (HSP 70) se induce en respuesta al
plegamiento erróneo de proteínas, al daño en el ADN, al estrés
oxidativo metabólico y la hipoxia. En el presente ejemplo se informa
de que la modulación del ARNm de HSP 70 en mujeres con
endometriosis está tremendamente elevado en el grupo Endo, en
comparación con el grupo control (p = 0,01) (véase la tabla
3). Como marcador para la endometriosis, la especificidad y la
sensibilidad de HSP 70 fueron del 73% y del 61%, respectivamente,
cuando se usa un valor de punto de corte de 0,6 (tabla 4). Con ARN
de biopsia no fraccionada, también se detectó un aumento
significativo en la fase proliferativa (p = 0,014), teniendo
por tanto el marcador una especificidad del 71% y una sensibilidad
del 78% con un punto de corte en 0,25 (tabla 4).
La proteína de choque térmico 90 (HSP 90) es
parte de un sistema de proteína chaperona que participa en la
señalización inducible por esteroides e inducible por toxinas
exógenas. En el presente ejemplo, el análisis de HSP 90 con
respecto a la endometriosis reveló una marcada disminución en la
expresión génica cuando se compararon mujeres en el grupo EXP 2 con
los controles (p = 4,3 x 10^{-5}) (véase la tabla 3).
Cuando se usó un valor de punto de corte de 0,17 en el análisis del
grupo EXP 2 en comparación con el grupo control, la especificidad y
la sensibilidad fueron del 75% y del 100%, respectivamente (tabla
5).
La fosfolípido hidroperóxido glutatión
peroxidasa 4 (GPx4 o PHGPx) es responsable de reducir los
hidroperóxidos que se producen en las membranas peroxidadas y en
las lipoproteínas oxidadas. En el ARN de biopsia no fraccionada,
mostrado en la tabla 3, la expresión del ARNm de GPx4 disminuyó en
la fase secretora del grupo EXP 1, en comparación con los controles
(p = 5 x 10^{-3}). Utilizando un punto de corte de 0,1, la
especificidad de GPx4 es del 83% y la sensibilidad es del 75%
(tabla 5).
La proteína regulada por glucosa 78 (GRP 78) es
una proteína de respuesta al estrés relacionada con HSP70 que está
inducida por agentes o estados que afectan adversamente a la función
del retículo endoplasmático, tal como la homocisteína. En el
presente ejemplo, la expresión de GRP 78 en ARN de biopsia no
fraccionada disminuyó en la fase secretora del grupo Endo, en
comparación con los controles (p = 6 x 10^{-3}), tal como
se muestra en la tabla 3. La especificidad y la sensibilidad de GRP
78 son del 92% y del 78%, respectivamente, cuando se usa un valor
de punto de corte de 3.
La ciclooxigenasa-2 (cox2),
también denominada prostaglandina sintasa-2
(PG-2), participa en la síntesis de
prostaglandinas. Se ha tratado su posible implicación en la
endometriosis en relación con el aumento de la actividad de la
aromatasa en las lesiones ectópicas pero, hasta la fecha, no hay
pruebas de regulación errónea de cox2 en las células endometriales
eutópicas. En ARN de biopsia no fraccionada, mostrado en la tabla 3,
la expresión del ARNm de cox2 aumentó significativamente en el
grupo EXP 1, en comparación con los controles (p = 0,01).
Usando un valor de punto de corte de 6, la especificidad de COX2 es
del 69% y la sensibilidad es del 62% (tabla 4).
Habiendo encontrado muchos marcadores genéticos
expresados de manera diferencial en los grupos control y Endo, los
inventores probaron la hipótesis de que los genes expresados de
manera diferencial usados en combinación podrían proporcionar una
herramienta diagnóstica más poderosa que la evaluación de los genes
individuales. Esto es especialmente cierto dado el alto nivel de
heterogeneidad genética entre los individuos.
La tabla 11 muestra ejemplos de combinaciones de
marcadores genéticos. La especificidad y la sensibilidad se
calcularon tal como se describió anteriormente (véase el análisis
estadístico). En resumen, la especificidad indica la ausencia de un
marcador en el grupo control y la sensibilidad indica la presencia
de un marcador en el grupo ENDO. Los 3 marcadores genéticos de
interés se sometieron a prueba en las mismas muestras de paciente
individual, permitiendo de esta forma que se realizaran
combinaciones. Para cada muestra de paciente, a la presencia de un
marcador dado se le asignó una puntuación de 1, mientras que a la
ausencia del mismo marcador se le asignó una puntuación de 0 (la
presencia y la ausencia de un marcador se definen según esté por
encima o por debajo del valor de punto de corte asignado). Tras la
aplicación de este algoritmo a los 3 genes de interés, las
puntuaciones del marcador se combinaron y se convirtieron en
porcentajes según lo siguiente: para las combinaciones de 2
marcadores, 0% representa una puntación de 0 para ambos marcadores,
50% representa una puntuación de 0 para 1 marcador y una puntuación
de 1 para el otro marcador, y 100% representa una puntuación de 1
para ambos marcadores; para las combinaciones de 3 marcadores, 0%
representa una puntuación de 0 para los 3 marcadores, 33%
representa una puntuación de 1 para 1/3 de los marcadores, 67%
representa una puntuación de 1 para 2/3 de los marcadores, y 100%
representa una puntuación de 1 para los 3 marcadores. Estos
porcentajes se representaron entonces en gráficos y se calcularon
nuevos valores de especificidad y sensibilidad (estos valores se
indican en la tabla 11).
Un ejemplo de la potencia de las combinaciones
de los marcadores se muestra en la tabla 11, en el que una
combinación de dos marcadores aumentó la sensibilidad del
diagnóstico hasta el 100%. Una combinación de tres marcadores
aumentó tanto la especificidad como la sensibilidad. Otras
combinaciones de numerosos marcadores también producirán una
especificidad y sensibilidad aumentadas, mejorando así los métodos y
el kit según la presente invención.
Los resultados presentados en el presente
documento muestran que los marcadores genéticos enumerados en la
tabla 1 son todos excelentes marcadores de la endometriosis. El uso
de genes expresados de manera diferencia representa, por tanto, un
medio alternativo para identificar individuos enfermos y clasificar
la endometriosis. Mediante la combinación de dos, tres y más de
estos marcadores, también es posible aumentar la especificidad y la
sensibilidad del diagnóstico.
Muchos de los genes entre los marcadores de la
presente invención están asociados con las mitocondrias. Cinco de
dieciséis marcadores DD estaban en esta categoría. Esta observación
condujo a los inventores a investigar adicionalmente en este campo.
De hecho, fisiológicamente varias reacciones metabólicas clave, tal
como la fosforilación oxidativa (OXPHOS) implican a la mitocondria.
Por tanto, tal como se muestra en la tabla 3, se observó la
modulación de 22 genes relacionados con OXPHOS y/o con la
mitocondria, tales como HIF-1\alpha, ARNT o NADH
deshidrogenasa, en el tejido endometrial de pacientes con
endometriosis. Esto sugiere fuertemente que la ruta de OXPHOS está
implicada en la endometriosis y que es posible determinar la
posibilidad de endometriosis en un sujeto femenino sometiendo a
ensayo una muestra de células endometriales para determinar el nivel
de expresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis implicado en la ruta de fosforilación oxidativa y/o
la ruta de sensores de potenciales redox (OXPHOS) interna de dichas
células endometriales.
Resulta interesante que tres ADNc que se
expresaban de manera diferenciada que contenían secuencias alu se
aislaron y se identificaron como marcadores relacionados con la
endometriosis. De manera similar, otro grupo heterogéneo de
marcadores relacionados con la endometriosis fueron los marcadores
del estrés celular (proteínas de choque térmico, CAP43, Conexina
43, ARN helicasa). Por tanto, es tentador especular que la mayoría
de los genes que contienen una secuencia alu y/o marcadores de
estrés celular podrían usarse como marcadores relacionados con la
endometriosis según la presente invención.
Ejemplo
2
Habiendo encontrado muchos marcadores genéticos
que se expresan de manera diferenciada en los grupos control y Endo
de mujeres, los inventores probaron la hipótesis de la medición de
proteínas de producto(s) de proteína
derivado(s) de estos marcadores genéticos también podría ser un enfoque adecuado para el diagnóstico de la endometriosis.
derivado(s) de estos marcadores genéticos también podría ser un enfoque adecuado para el diagnóstico de la endometriosis.
Dado que el marcador DD5 (concretamente Cap43)
estaba mal regulado en el nivel del ARNm en el endometrio de las
mujeres que padecen endometriosis, los presentes inventores han
caracterizado la expresión de la proteína codificada por el mismo
gen. Esto se llevó a cabo mediante inmunotransferencia tipo
Western.
El ARNm de Cap43 tiene una región de 1759 pb en
3' sin traducir y su marco de lectura abierto previsto codifica
para una poliproteína de 394 residuos de aminoácidos con un peso
molecular deducido de 43.400 Dalton y un punto isoeléctrico de 5,3.
Estudios anteriores han demostrado una expresión modulada del ARNm
del gen de Cap43 en diversos tipos de células. Sin embargo, la
proteína Cap43 nunca se ha usado como un marcador en ninguna
enfermedad, incluyendo la endometriosis. En el presente ejemplo, los
extractos de proteína aislados de biopsias de tejido endometrial
procedentes de poblaciones control y enfermas se exploraron para
determinar la expresión de la proteína Cap43 y los resultados
presentados en el presente documento muestran que esta proteína es
un marcador adecuado para la endometriosis.
Se obtuvieron biopsias de tejido procedentes de
poblaciones control y positivas para endometriosis, tal como se
describió anteriormente en el ejemplo 1 en el presente
documento.
Se aislaron extractos de proteínas celulares
totales directamente de las biopsias de tejido. En resumen, se
homogeneizaron 200-300 mg de tejido de biopsia
usando un homogeneizador eléctrico en presencia de 3 ml de tampón
de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 7,5 que contiene NaCl
0,1 M, SDS al 2%, EDTA 5 mM y leupeptina 0,5 \mug/ml, aprotinina
2 \mug/ml y PMSF 200 \mug/ml) a temperatura ambiente, se lisaron
durante 10 minutos a 100ºC y se centrifugaron durante 20 minutos a
14000 g. La determinación de proteínas de los sobrenadantes se
realizó utilizando el ensayo de proteínas DC
(BIO-RAD^{TM}) según las instrucciones del
proveedor. Las muestras se diluyeron en Tris-HCl 20
mM pH 7,5 y se transfirieron en manchas sobre membranas de
nitrocelulosa (2,5 y 5 \mug) usando un dispositivo de
transferencia de manchas de 96 pocillos
GIBCO-BRL^{TM}. Las membranas se bloquearon
durante la noche en leche en polvo seca al 2,5% en tampón TST
(Tris-HCl 10 mM pH 7,5 que contenía NaCl 100 mM y
TWEEN-20^{TM} al 0,1%), se incubaron en una
disolución de o bien 1:2000 de antisuero primario
anti-CAP 43 (SKULDTECH^{TM}, Université Montpelier
II, Francia) o bien anti-actina (SANTA CRUZ
BIOTECHNOLOGY^{TM}) durante una hora, se lavaron dos veces
durante 5 min con TST y se incubaron durante otra hora con un
anticuerpo policlonal específico de inmunoglobulina de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasas del rábano
(HRP) (dilución 1:2000 en leche-TST al 5%), se
lavaron 3 veces durante 10 min con TST y se visualizaron con
reactivo de ECL (electroquimioluminiscencia) según el protocolo del
proveedor (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH^{TM}). Los niveles de Cap43
con respecto a la actina se midieron explorando los autorradiogramas
y se llevó a cabo la densitometría de puntos utilizando el programa
MOLECULAR ANALYST^{TM}.
Utilizando anticuerpos policlonales
anti-CAP 43, los presentes inventores exploraron
extractos de proteínas aislados de biopsias de tejido endometrial
procedentes de poblaciones control y enferma. Tal como se muestra
en la tabla 3, se realizaron dos tipos de experimentos. En el primer
experimento, se incluyeron todos los grupos control y experimental,
proliferativo y secretor, con el fin de comparar la presencia de
Cap43 en ambas fases del ciclo ovárico. En el segundo experimento,
sólo se sometieron a prueba los grupos de fase secretora y, de esta
forma, pudo aumentarse el número de muestras analizadas.
Los resultados del primer experimento muestran
que la proteína Cap43 se expresaba en niveles superiores en la fase
secretora del ciclo ovárico, con una regulación por incremento media
en el grupo control de más del doble en la fase secretora en
comparación con la fase proliferativa (1,92 \pm 0,21 CTL S frente
a 0,55 \pm 0,06 CTL P). Además, mediante la comparación de los
grupos control y Endo, parece que hay una disminución significativa
en Cap43 en la fase secretora del grupo Endo (p = 0,05), con
valores de especificidad y sensibilidad del 71% y del 57%,
respectivamente, cuando se usa un punto de corte de 1,35 (tabla
5).
En el segundo experimento en el que sólo se
analizaron muestras en la fase secretora, también hay una
disminución significativa en la fase secretora del grupo Endo
(p = 0,001). Utilizando un punto de corte de 1,1, la
especificidad es del 77% y la sensibilidad es del 61% (tabla 5).
Estos resultados confirman que, a igual que el
ARNm de Cap43, la proteína Cap43 se expresa de manera diferenciada
en las células endometriales de mujeres sin endometriosis en
comparación con mujeres que tienen endometriosis. Por tanto, está
justificado creer que es lo mismo para todos los marcadores
genéticos relacionados con la endometriosis enumerados en la tabla
1.
El uso de genes expresados de manera
diferenciada o sus productos de proteína derivados (tales como
proteínas o péptidos traducidos) representa, por tanto, un medio
alternativo para determinar la probabilidad de endometriosis en
mujeres y para clasificar esta enfermedad en mujeres que la
padecen.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
CTL: grupo control (mujeres sin
endometriosis)
ENDO: grupo Endo (mujeres que tienen
endometriosis)
EXP: Se refiere al grupo Endo: EXP1: mujeres en
los estadios I y II de la enfermedad EXP2: mujeres en los estadios
III y IV de la enfermedad
epit: marcador derivado de ARN de célula
epitelial
biop: marcador derivado de ARN de biopsia no
fraccionada
PROT^{+} biop: marcador derivado de proteína
de biopsia no fraccionada
*: indica una diferencia significativa según la
prueba de la t de Student de los grupos comparados descritos
¤S: fase secretora
¤¤ P: fase proliferativa
NB: indica el marcador derivado de ARN de
biopsia no fraccionada obtenidos mediante análisis de transferencia
de tipo Northern
n.d.: no disponible
<110> PROCREA INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MARCADORES RELACIONADOS CON LA
ENDOMETRIOSIS Y USOS DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 029318-0013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/185.063
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
25-02-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/225.745
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-08-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(231)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(174)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(123)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(108)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (85)..(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (237)..(237)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(184)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (55)..(55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (63)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(143)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(319)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (259)..(259)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (269)..(269)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (290)..(290)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (302)..(302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (306)..(306)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(277)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(320)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (284)..(284)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (287)..(287)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (311)..(311)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (324)..(324)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(254)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 295
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(218)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = nucleótido indeterminado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(150)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Método para determinar la posibilidad de
endometriosis en un sujeto femenino, que comprende las etapas
de:
- -
- someter a ensayo una muestra de células endometriales obtenidas de dicho sujeto femenino para determinar el nivel de expresión de al menos un marcador relacionado con la endometriosis,
- -
- comparar el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis con un nivel de expresión inicial, establecido sometiendo a ensayo el nivel de expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis en un grupo de referencia negativo de muestras de células endometriales obtenidas de mujeres sin endometriosis;
en el que dicho al menos un
marcador relacionado con la endometriosis se selecciona del grupo
que consiste
en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
siendo indicativo el nivel de
expresión de dicho al menos un marcador relacionado con la
endometriosis de la posibilidad de endometriosis en dicho sujeto
femenino.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el nivel de subexpresión de al menos un marcador relacionado con la
endometriosis seleccionado del grupo que consiste en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a un ADNc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una mayor
posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación
con un sujeto femenino sin
endometriosis.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que las células endometriales de dicha muestra de dicho sujeto
femenino se obtuvieron en la fase proliferativa de su ciclo estrual,
y en el que el nivel de subexpresión de al menos un marcador
relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo que consiste
en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprenden la secuencia SEQ ID NO: 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una mayor
posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación
con un sujeto femenino sin
endometriosis.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que las células endometriales de dicha muestra de dicho sujeto
femenino se obtuvieron en la fase secretora de su ciclo estrual, y
en el que el nivel de subexpresión de al menos un marcador
relacionado con la endometriosis seleccionado del grupo que consiste
en:
- i)
- el gen FKHR tal como se enumera en la tabla 1;
- ii)
- ácidos ribonucleicos que dan lugar a ADNc que comprenden la secuencia SEQ ID NO 12; y
- iii)
- péptidos o proteínas codificados por el gen FKHR, o codificados por los ácidos ribonucleicos definidos en ii);
es indicativo de una mayor
posibilidad de endometriosis en dicho sujeto femenino en comparación
con un sujeto femenino sin
endometriosis.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células endometriales son
células endometriales eutópicas.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dichas células endometriales son
células endometriales epiteliales.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el nivel de expresión de dicho al
menos un marcador relacionado con la endometriosis se somete a
ensayo usando un método seleccionado del grupo que consiste en
biochips, membranas, y métodos basados en matriz de vidrio de ADNc;
RT-PCR; hibridación in situ; estudios de
fusión del promotor in vitro en líneas celulares o cultivos
primarios; métodos de estudio de la tasa de transcripción;
hibridación por inmunotransferencia sobre membrana; marcaje;
proteómica; citometría de flujo; inmunocitoquímica;
inmunohistoquímica y ELISA.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el nivel de expresión para al
menos dos marcadores relacionados con la endometriosis se somete a
ensayo en combinación.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, que comprende además las etapas de:
- i)
- definir en qué fase del ciclo estrual se obtuvieron dichas células endometriales; y
- ii)
- seleccionar dicho al menos un marcador relacionado con la endometriosis, para el que debe someterse a ensayo el nivel de expresión según la fase definida en i).
10. Método según la reivindicación 9, en el que
la fase del ciclo estrual en la que se obtienen dichas células
endometriales se evalúa usando al menos un método seleccionado del
grupo que consiste en: examen histológico, métodos para evaluar el
nivel de expresión del ARN, y métodos para evaluar los niveles de
esteroides sexuales.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho al menos un marcador
relacionado con la endometriosis es un ácido ribonucleico mensajero
(ARNm).
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicho ácido ribonucleico mensajero (ARNm) sirve como molde para la
síntesis de un ADNc.
13. Uso de un ácido nucleico aislado
seleccionado del grupo que consiste en:
- a)
- ARNm de FKHR, para el que el número de registro de GENBANK^{TM} es AF032885;
- b)
- ácidos nucleicos monocatenarios que hibridan en condiciones convencionales con los ácidos nucleicos definidos en a);
- c)
- ácidos nucleicos monocatenarios obtenidos mediante transcripción inversa de un ácido nucleico definido en a) o b);
- d)
- fragmentos de los ácidos nucleicos definidos en a) a c);
para determinar la posibilidad de
endometriosis de una muestra de células endometriales de un sujeto
femenino o para clasificar la endometriosis de una muestra de
células endometriales de un sujeto femenino que padece
endometriosis.
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