ES2336286T3 - Ensayos aglutrimetricos en sangre. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para determinar la presencia o el efecto de un componente en una muestra, utilizando un sistema de agregación que comprende partículas a las que se unen un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben la luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento: combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo; irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo; en donde el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia del componente en dicha muestra.

Description

Ensayos aglutrimétricos en sangre.

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Introducción Antecedentes

La industria médica se ha convertido cada vez más dependiente de técnicas de medición de diversas entidades en los fluidos fisiológicos con el fin de poder determinar el estado de salud de un individuo, el nivel de dosis de fármacos, el uso de drogas ilegales, las secuencias genómicas, etc. Por lo tanto, la capacidad de tomar una muestra fisiológica y analizar rápidamente la presencia de un componente particular ha hecho tratamientos médicos más eficaces y cada vez más exitosos.

En muchos casos, se desea utilizar sangre entera como fuente para el diagnóstico de la salud de un paciente o para controlar la eficacia de los fármacos que se han administrado al paciente. Sin embargo, la sangre como fuente para la determinación de estos parámetros tiene muchas deficiencias. Entre las deficiencias cuando se utiliza directamente, o incluso cuando se diluye con tampón, son: la sangre se coagula rápidamente, la sangre contiene una gran cantidad de sustancias que absorben luz y fluorescentes, la sangre muestra variaciones en su composición, sus características pueden cambiar en relación con los reactivos utilizados en los ensayos; y la sangre muestra variaciones en presencia o ausencia de oxígeno. Aunque estas propiedades complican el uso de la sangre como muestra para fines de diagnóstico, se han empleado diversas técnicas para reducir o eliminar estos problemas, como, por ejemplo, alta dilución, la adición de anticoagulantes, la separación de la sangre del plasma y sus componentes celulares, y similares. Durante estas manipulaciones, sin embargo, debe tenerse un gran cuidado para evitar la lisis de las células rojas de la sangre para evitar la liberación de la hemoglobina, que puede interferir con los ensayos de diagnóstico. A pesar de los problemas asociados con el uso de sangre como medio de la muestra, en muchos casos, la sangre es la única fuente que proporciona la información de interés. Por lo tanto, es muy deseable la identificación de formas de utilización de sangre completa, mientras se disminuye la interferencia de sus componentes.

Hay, por tanto, un interés sustancial en la elaboración de nuevos enfoques para el uso y la manipulación de la sangre con fines de diagnóstico. Un área que es de particular interés es el uso de la sangre para la evaluación de la función de las plaquetas. El papel de las plaquetas en la fisiología de los mamíferos es extraordinariamente diverso, pero su papel principal es promover la formación de trombos. En muchas situaciones, se desea evaluar la capacidad de coagulación de la sangre, un parámetro que está con frecuencia mediado por la capacidad de las plaquetas a adherirse y/o agregarse. Así, se podrían evaluar las funciones adhesivas de las plaquetas. Por ejemplo, uno podría saber si la administración de fármacos bloquea o promueve la formación de coágulos, o que uno pueda necesitar detectar deficiencias en la función de las plaquetas antes de procedimientos quirúrgicos. En otros casos, uno puede estar interesado en evaluar la eficacia de un inhibidor de plaquetas que se está probando, como un nuevo medicamento, o se utiliza como tratamiento clínico aprobado en un paciente. Nuevas pruebas de diagnóstico para la realización de lo anterior, por lo tanto, serían útiles.

Literatura relevante

La patente US 5.455.228 y la solicitud PCT WO96/10749 describen un ligando resistente a péptidos y un ensayo de bloqueo de plaquetas, respectivamente. Véase también, Coller, B.S. Platelets in cardiovascular thrombosis and thrombolysis. En: Fozzard et al., Eds. The Heart and Cardiovascular System, 2a ed., New York, NY: Raven Press, 1992:219-273. Para una descripción de los tintes de absorción de infrarrojos, consulte Fabian et al., Chem. Rev. 92:1196-1226 (1992).

Otras técnicas que han sido descritas para la determinación de plaquetas y/o de la función de las plaquetas son: Las solicitudes PCT WO94/12664; WO94/22018; WO92/08982; WO89/00200; las patentes US 5.427.913; 5.306.632; 5.523.238; 5.266.462; 5.246.832; 5.114.842 y EP-A-0165 68. Artículos de interés incluyen: Beer et al., Immobilized Arg-Gly-Asp (RGD) peptides of variyng lengths as structural probes of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor. Blood 79:117-128 (1992). Coller et al., Collagen-platelet interactions: Evidence for a direct interaction of collagen with platelet GPIa/IIa and an indirect interaction with platelet GPIIb-IIIa mediated by adhesive proteins. Blood 74:182-192 (1989); Coller et al., Studies of activated GPIIb-IIIa receptor son the luminal surface of adherent platelets. J. Clin Invest. 92:2796-2806 (1993), y Pfueller et al., Role of plasma proteins in the interaction of human platelets with particles. Thrombosis Research 12:979-990 (1978).

US 497 3669 describe ensayos de aglutinación de partículas que utilizan técnicas de absorción limitada.

Descripción de la invención

Se describe un ensayo aglutimétrico que emplea partículas que absorben luz en la región infrarroja. La agregación de las partículas se detecta por los cambios en la absorción de infrarrojos de los medios de la muestra. El ensayo se puede utilizar para determinar la presencia de un componente de interés, la función de dicho componente, o para determinar la cantidad del componente. La metodología permite el uso de sangre completa o de sangre ligeramente diluida, en lugar de plasma. El procedimiento consiste en mezclar los reactivos de las partículas, los reactivos adicionales, según proceda, y la muestra y luego medir el cambio en la absorción de la luz infrarroja del medio. El resultado puede ser comparado con controles para la determinación cuantitativa.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que representa el efecto de la oxigenación de la sangre en los índices de referencia obtenidos con las partículas que absorben en el intervalo visible, o en el intervalo infrarrojo. Debido a que la oxigenación de la sangre cambia el perfil de absorción de la hemoglobina, lo que altera la absorción de la sangre en el intervalo visible, no hay interferencia en el ensayo. Por lo tanto, con cuentas azules la oxigenación de la sangre provoca un aumento artificial en los índices de aglutinación observados. En cambio, utilizando partículas que absorben la luz en la gama de infrarrojos, la oxigenación de la sangre no tiene ningún efecto. Por lo tanto, los índices que se indican son independientes de la oxigenación de la sangre.

La figura 2 es un gráfico de los resultados de un rápido análisis de la función de las plaquetas (RPFA) del compuesto Searle 54701B. El RPFA se llevó a cabo y la actividad máxima se determinó según lo descrito en la sección experimental. Los resultados individuales de media y de seis donantes por separado se muestran en la misma y en la figura siguiente.

La figura 3 es una gráfica de los resultados de la prueba de agregación óptica de las plaquetas del compuesto Searle 54701B utilizando agonista ADP 20\muM. La agregación óptica de las plaquetas se realizó como se describe en la sección experimental. Los resultados que se muestran son los datos de pendiente máxima (% de variación de agregación/minuto) y no son valores normalizados.

La figura 4 es un gráfico que compara los resultados de la agregación de las plaquetas obtenidos mediante un sistema disponible comercialmente (agregometría de plaquetas) trazada respecto a la actividad de las plaquetas obtenida con RPFA. Se muestran dos paneles, cada uno representando la RPFA realizada con un conjunto diferente de las partículas de teñido. En el panel superior, las partículas se absorben en el intervalo de infrarrojos. En el panel de abajo, las partículas se absorben en el intervalo visible. Los datos en el gráfico superior son el error estándar de la media y el obtenido de la curva dosis-respuesta realizado en los valores de seis sujetos durante tres días. El coeficiente de correlación es del 0,99 y no hay sesgo mínimo (0,4%). Los datos en el gráfico de fondo son de un experimento realizado en la misma forma con cuentas teñidas con un tinte azul. El coeficiente de correlación es de 0,94 y hay un sesgo significativo (10,7%).

La figura 5 es un gráfico que muestra la neutralización de los compuestos inhibidores GP IIb/IIIa, compuestos Searle 54701B y compuestas Searle 57101A, de antisuero de conejo que crecen en contra de los compuestos. Los resultados que se muestran son los datos de la pendiente normalizada (índice de referencia % cuando no se añade ningún fármaco ni antisueros).

La figura 6 es una gráfica que muestra la inversión de la inhibición de GP IIb/IIIa mediante Gel de filtración de muestras de sangre, tratados con inhibidores del GPIIb/IIIa. Los resultados de la muestra son los datos de la pendiente normalizados (% del índice de referencia de la muestra de sangre sin tratar). Leyenda del eje X: 1 - sangre no tratada, 2 - sangre sin tratar después de filtración en gel, 3 - sangre tratada con Compuesto Searle 54701B 100 nM, 4 - sangre tratada con Compuesto Searle 54701B 100 nM después de filtración en gel, 5 - sangre tratada con Compuesto Searle 57101B 500 nM, 6 - sangre tratada con Compuesto Searle 57101B 500 nM después de filtración en gel.

La figura 7 es una gráfica que muestra una curva de respuesta de dosis de aglutinación inducida por trombina. Una alícuota de 160 ul de una mezcla que contenga una concentración conocida de trombina en un medio de dispersión de luz (1% de sólidos en suspensión de 0,5 um de microesferas de poliestireno de 10 mm HEPES 150 mM NaCl, 2 mg/ml de BSA 0,05% de Tween 20) para simular las características de dispersión de luz de la sangre completa, se agregó a una cubeta de plástico con la norma iso-TRAP y micropartículas. El ciclo de mezclado mecánico fue activado durante 1 minuto con la lectura óptica de la muestra con un índice de 16 por segundo. La microaglutinación fue determinada por el índice de cambio de la densidad óptica de la solución en un intervalo fijo. Los datos se indican como la pendiente de la trombina inducida por aglutinación en mV/seg frente a la concentración de trombina en el ensayo.

La figura 8 muestra la inhibición de la trombina inducida por aglutinación de cuentas de IR mediante un péptido Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP).

Descripción de realizaciones específicas

De acuerdo con la invención objeto, el carácter de una muestra se determina mediante la combinación de la muestra con partículas que se absorben en infrarrojos, donde el índice y/o el grado de agregación de las partículas se modula mediante el carácter de la muestra. Normalmente, el carácter de la muestra se asocia con la presencia y la cantidad de un componente de interés. En otras situaciones, el carácter puede estar asociado con la actividad de la muestra con relación a su efecto sobre un evento, por ejemplo, la coagulación. Los otros reactivos también pueden estar presentes, dependiendo de la naturaleza de los componentes y del protocolo del ensayo. Después de un tiempo suficiente para que se produzcan todas las agregaciones, la mezcla de ensayo se ilumina con luz infrarroja y se determina el cambio en la absorción. El valor obtenido se puede comparar con un estándar para la determinación cuantitativa de la cantidad de componente en la muestra.

El procedimiento es flexible y puede ser utilizado para evaluar varios parámetros, incluyendo la presencia de un componente en la muestra, el carácter de la muestra, o incluso el efecto combinado de varios componentes de la muestra en la penúltima reacción aglutimétrica. Sin embargo, a los fines de la descripción, la descripción se refiere al componente de interés y su actividad funcional, más que al carácter de la muestra.

Cualquier muestra se puede utilizar en el procedimiento objeto. El procedimiento es particularmente ventajoso para aquellas muestras que contengan entidades que podrían interferir con la determinación espectrofotométrica en otras longitudes de onda de infrarrojos. La muestra puede ser cualquier fluido fisiológico, líquido ambiental, fluido de procesamiento, efluente o de afluencia. La metodología objeto encuentra una aplicación inmediata con fluidos fisiológicos, en particular en sangre completa o plasma. Mediante el uso de la metodología objeto, es necesario menos cuidado en la preparación del plasma, ya liberado de la hemoglobina y de otras porfirinas de metal o no metal tendrán una interferencia reducida en la metodología debido a su absorción reducida en el intervalo infrarrojo.

Las muestras particulares que encuentran uso en el procedimiento objeto pueden incluir, según se indica, sangre, plasma, líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, etc., más concretamente, las muestras que tengan una sustancia de interferencia que absorbe o emite luz en el intervalo de 300 nm aproximadamente a 700 nm aproximadamente. Por lo tanto, la metodología objeto encuentra uso, en especial con sangre completa, mediante el empleo de luz infrarroja, donde la señal de la muestra no está significativamente afectada por las variaciones en la absorción resultantes de los cambios en la oxigenación de la muestra.

La muestra empleada en el procedimiento puede estar sujeta a un tratamiento previo, dependiendo de la naturaleza de la muestra. En general, la muestra puede ser utilizada sin manipulación significativa, sin embargo, las muestras también pueden diluirse, concentrarse, extraerse, someterse a cromatografía, electroforesis, y similares. De manera conveniente, habrá una manipulación mínima de la muestra. Según el objeto de la invención, se puede usar sangre completa, que se diluye menos de 10 veces aproximadamente, generalmente se diluye menos de 5 veces aproximadamente, preferentemente menos de 1 vez, y, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,5 veces. La sangre generalmente será modificada para evitar la coagulación, utilizando varios anti-coagulantes. Los anti-coagulantes que encuentran aquí uso incluyen citrato, heparina, inhibidores de la trombina, como hirudina, hirulog, p-pack, argatrobán, y similares. Convenientemente, el citrato se emplea en un pequeño volumen en relación con el volumen de la muestra de sangre completa, generalmente menos de un 25% v/v, generalmente menos de un 10% v/v, y puede ser menos de 1% v/v aproximadamente. En caso de que uno o más componentes del sistema sean sensibles al citrato, sin embargo, uno puede emplear convenientemente heparina o uno o más de los inhibidores directos de la trombina.

Se puede usar cualquier compuesto de interés que puede servir para inhibir o aumentar la agregación de las partículas. Así, el compuesto de interés puede ser cualquier compuesto que interactúa, ya sea directa o indirectamente, con un compuesto en la superficie de las partículas, a fin de mejorar o inhibir la agregación, donde indirectamente se propone que el compuesto de interés reaccione en forma directa o indirecta con el reactivo que sirve para potenciar o inhibir la agregación. Para la reacción indirecta, uno puede considerar inhibidores de enzimas. Por ejemplo, un inhibidor de la trombina reaccionaría con la trombina para inhibir la reacción de la trombina con fibrinógeno. Cuando las partículas están recubiertas de fibrinógeno, el inhibidor reduciría la cantidad de agregación mediante la reducción de la extensión de la reacción de la trombina con el fibrinógeno en las partículas. Los inhibidores de la sangre de otros factores que en última instancia afectarían a la transformación del fibrinógeno en fibrina actuarían de forma similar de una manera indirecta.

Así, los compuestos de interés pueden ser pequeñas moléculas, generalmente de alrededor de 100-5000 Dal, más generalmente de alrededor de 100- 2000 Dal, como fármacos sintéticos, biocidas, por ejemplo, pesticidas, herbicidas, etc., antibióticos, ligandos que se producen naturalmente o fragmentos de compuestos naturales, aminoácidos, glúcidos, lípidos, nucleósidos y nucleótidos, y de sus oligómeros, en particular, oligopéptidos, oligosacáridos u oligonucleótidos, y sus combinaciones.

Compuestos ilustrativos de interés son las drogas de abuso, tales como tetrahidrocannabinol, morfina, heroína, cocaína y metanfetaminas, barbitúricos, tranquilizantes y antidepresivos, por ejemplo, Librium, diazepams, y los tricíclicos, difenilhidantoína, inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A y FK506, medicamentos cardiovasculares, por ejemplo, digitonina, nitroglicerina, etc, los inhibidores de la coagulación, por ejemplo, warfarina, heparina, heparina de bajo peso molecular, activadores de la agregación, por ejemplo, TRAP o iso-TAP, que será útil para determinar, por ejemplo, la pérdida de plaquetas durante la cirugía y para la selección de paquetes de plaquetas antes de la administración, analgésicos, anestésicos, reactivos antihipertensivos, por ejemplo, inhibidores de la renina, lípido A, toxinas, antagonistas IIb-IIIa incluyendo compuestos tales como péptidos basados en RGD y KGD y peptidomiméticos, un subconjunto de estos compuestos incluye compuesto Searle 54701, compuesto Searle 57101, ReoPro (Centacor), Integrilin (CoR), Roche Ro440-3888, Hoechst S 1197, Merck L-738, 167, TAK 029 (Toque Holdings), Boehringer Ingelheim BIBU 52ZW, ADP útil para medir la sensibilidad a la aspirina y monitorizar y en concentraciones más altas para determinar, por ejemplo, la pérdida de plaquetas durante la cirugía y para la detección de paquetes de plaquetas antes de la administración, colágeno, ácido araquidónico, y similares.

Los compuestos de interés pueden ser compuestos macromoleculares, que tendrán un peso molecular de al menos 5kD aproximadamente, más generalmente, al menos, 10kD y, en general, menos de 1 millón kD, más usualmente menos de unos 600.000 kD. Estos compuestos pueden incluir diversos polímeros naturales o sintéticos, como polipéptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, ligninas, polilípidos, combinaciones, como mucopolisacáridos, glicoproteínas, polisacáridos sulfonados, lipopolisacáridos, y similares.

Compuestos macromoleculares ilustrativos incluyen insulina, factores sanguíneos, por ejemplo, Factor V, VI, VII, VIIIc, VIII vw, IX, X, X, XI y XII, antígenos de histocompatibilidad solubles, por ejemplo, sHLA, \beta-amiloide, VIH gp120 y p41, CD3, CD28, B7, deshidrogenasa de ácido glutámico, activador tisular de plasminógeno, factores estimulantes de colonias: G, M, y GM, perforinas, proteínas de complemento, proteínas bacterianas y fúngicas, proteínas de protistas, proteínas virales, y similares.

Finalmente, el compuesto de interés puede ser una combinación de una o varias categorías diferentes de compuestos, tales como virus, orgánulos, como mitocondrias, procariotas y eucariotas, como bacterias, hongos, protistas, clamidia, células de mamíferos, como plaquetas, células cancerosas, por ejemplo, leucemia y linfoma, y similares. Los virus de interés incluyen VIH, HTLV, virus de papiloma, virus de herpes, virus de hepatitis, adenovirus, rinovirus, y similares.

Las partículas que se emplean en el procedimiento de objeto serán menores generalmente de aproximadamente 50 \mu, más usualmente menores de aproximadamente 25 \mu, siendo usualmente de al menos 0,1 \mu, preferiblemente de aproximadamente 1-10 \mu, más preferiblemente de 2-8 \mu aproximadamente. La composición de las partículas puede ser cualquier composición conveniente, como biovidrio, polímeros orgánicos sintéticos, por ejemplo, poliacrilonitrilo de poliestireno, policarbonato, poliacrilato, polimetacrilato, basado en carbono, combinaciones de los mismos, o similares, o cualquier otro material que se absorbe en el infrarrojo o puede ser que lo haga con tintes de absorción de infrarrojos. Para biovidrio y basados en polímeros orgánicos basados en partículas, la composición de las partículas sin el tinte de absorción de infrarrojos no va se a absorber de manera significativa en un amplio rango en la región infrarroja de interés, por lo general absorben menos del 25% del total de luz absorbida en la región comparada con la partícula dopada con el tinte de absorción de infrarrojos. Además, habrá muchas regiones en la región visual en las que la composición de las partículas será sustancialmente transparente. Usualmente, al menos el 50% en peso, preferiblemente al menos el 75% en peso, será de un tamaño o diámetro en el intervalo indicado.

En una realización particularmente preferida, las partículas empleadas son partículas de carbono que entran en el tamaño de los intervalos indicados anteriormente y que pueden ser porosas o no porosas. Las partículas de carbono que encuentran uso pueden ser esféricas o no esféricas, preferentemente esféricas, y en general absorben sobre una amplia gama en la región infrarroja sin estar dopadas con un tinte de absorción de infrarrojos. Al igual que las partículas descritas anteriormente, las partículas de carbono pueden modificarse en una variedad de formas para permitir la unión covalente o no covalente de los distintos componentes del sistema, por ejemplo, proteínas, a las mismas. Las partículas de carbono que encuentran uso aquí pueden prepararse usando la metodología conocida en la técnica o se pueden obtener comercialmente (Sigma Aldrich Supelco, Bellefonte, PA). En otra realización, las partículas no son partículas de carbono.

Las partículas que se encuentran uso aquí pueden modificarse en una variedad de maneras. Las partículas pueden ser químicamente activas o activarse químicamente para tener grupos funcionales presentes en la superficie de las partículas, o estar recubiertas con un compuesto, por ejemplo, proteínas, que pueden servir para unirse de manera irreversible (en las condiciones de tratamiento y de ensayo) a un tiene absorbente de infrarrojos si se utiliza uno y/o para participar en la agregación de las partículas. El compuesto de recubrimiento puede ser un componente obligatorio, que estará involucrado en la agregación de las partículas, u otro compuesto, siendo usualmente una proteína. Para el revestimiento de la superficie de la partícula con un compuesto de interés, en el caso de que las partículas tengan las mismas funcionalidades químicamente reactivas en su superficie o sitios que pueden ser fácilmente convertidos en funcionalidades químicamente reactivas, uno puede fijar directamente de manera covalente el compuesto a la superficie de las partículas por unión covalente a través de estos sitios químicamente reactivos (véase, por ejemplo, la patente US 5.503.933, de Afeyan et al.). Uno puede también recubrir la superficie de las partículas con una composición de látex o funcionalizada o funcionalizable que ofrece sitios químicamente reactivos a través de los cuales el compuesto puede fijarse covalentemente. Los procedimientos para la preparación de composiciones de látex y revestimientos de la superficie de las partículas con estas composiciones son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, la patente US 5.324.752). Alternativamente, dependiendo de la naturaleza de las partículas, las partículas pueden no tener o hacerse grupos químicamente activos, sino más bien ofrecer una unión no covalente del compuesto por adsorción pasiva. Además, los tintes de absorción de infrarrojos que son estables bajo las condiciones de formación de las partículas, por ejemplo, extrusión, pueden mezclarse con el polímero antes de la formación de las partículas y las partículas formadas con el tinte distribuidas a lo largo de la partícula.

Un componente de unión puede estar unido a la superficie de la partícula que proporciona la agregación de las partículas. La agregación de partículas puede ser el resultado de la interacción de los componentes de unión con la misma o un componente diferente en otra partícula o con un agente en el medio, cuyo agente puede ser el compuesto de interés, un elemento de un par de unión específico, o un agente catalizador, por ejemplo, una enzima, que interactúa, usualmente reacciona, con el componente de unión para modificar el componente de unión que causa la agregación. El par de unión específico usualmente consiste en el componente de unión y el compuesto de interés, un reactivo que compite con el compuesto de interés para la unión al componente de unión, o de un reactivo que se une al compuesto de interés. Esto puede ser ilustrado mediante, por ejemplo, (1) un antígeno y anticuerpos del antígeno como componente de unión, (2) un dímero del compuesto de interés que se une a Fab como componente de unión, y (3) fibrinógeno y trombina. El componente de unión unido a la superficie de las partículas variará ampliamente en cuanto a su naturaleza, según el compuesto de interés y el protocolo que se emplea.

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El componente de unión puede ser una molécula pequeña, como las pequeñas moléculas que se han descrito anteriormente, o una molécula de alto peso molecular, o incluso en algunos casos, combinaciones como virus o fragmentos de células o virus o células intactas. Cualquiera de los compuestos anteriores puede servir como elemento de unión. En un grupo de análisis que emplea pares de unión específicos para agregación, donde uno está interesado en unirse a los componentes de interés de origen natural o sintético, se pueden usar receptores específicos, como receptores de origen natural, por ejemplo, enzimas, lectinas, proteínas de la membrana de superficie, etc., o anticuerpos, ya sea antisueros o anticuerpos monoclonales. En otros ensayos, uno puede emplear un elemento de un par de unión específico natural, como fibrina (preparada en el medio de prueba de fibrinógeno), que pueden unirse a proteínas diferentes. El uso de fibrinógeno, en relación con la proteína de las plaquetas GP IIb/IIIa se discutirá con más detalle posteriormente. En otras realizaciones, el componente de unión puede ser cualquiera de una serie de oligopéptidos diferentes que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KGD o peptidomiméticos de los mismos, y que tengan especificidad para la unión a GP IIb/IIIa o factor de von Willebrand o fragmentos de los mismos que son capaces de unirse a moléculas receptoras específicas. Se pueden utilizar integrinas diferentes en relación con diferentes proteínas de adhesión, y viceversa. Los anticuerpos se puede ensayar, donde uno podría tener el epítope que se une al anticuerpo unido a la partícula. El epítope puede estar presente como una molécula pequeña, como una molécula orgánica sintética o un oligopéptido, o podría ser una molécula poliepitópica, donde uno o más anticuerpos en el medio se unen a diferentes epítopes del antígeno. Cuando el componente de interés es monoepitópico, se puede emplear como reactivo de una orden de dímero o mayor de los compuestos monoepitópicos, cuyo reactivo servirá para su enlace cruzado. Los anticuerpos anti-idiotipo también encuentran uso. Cuando se trate de ácidos nucleicos, se pueden prever oligonucleótidos unidos a las partículas que se unen a sitios diferentes en el compuesto de interés. Alternativamente, se puede preparar una cadena que tiene repeticiones de la misma secuencia como un reactivo que puede competir con un compuesto de ácido nucleico de interés, para el enlace cruzado de las partículas. Además, como se indicó anteriormente, se pueden usar combinaciones de pares de unión específicos que se producen naturalmente, tales como CD4 y gp120, P-selectina y L-selectina y sus receptores correlativos de dirección, CD3 y MHC, receptores de adhesión de las integrinas y sus ligandos de adherencia, receptores de crecimiento y factores de crecimiento, citocinas y sus receptores de superficie celular.

En otra realización de la presente invención, la superficie de la partícula no está específicamente cubierta con un componente de unión antes del ensayo, sino más bien el fibrinógeno presente en una muestra de sangre llevado en contacto con la misma puede absorber naturalmente la superficie de la partícula para proporcionar un elemento de unión.

Si se desea el uso de un tinte absorbente, las partículas se cargan con un tinte que absorbe en el infrarrojo. Los tintes que encuentran uso aquí presentan preferentemente la capacidad de absorción de aproximadamente 800 nm, tendrán altos coeficientes de absorción y/o presentarán anchos espectros de absorción. Varios tintes han sido reportados como que tienen estas propiedades. Véase, por ejemplo, Fabián et al., Chem. Rev. 92:1197-1226 (1992). Estos tintes son, por ejemplo, bacterioclorina, bacterioclorofitina, tintes de meropolimetina, benzoanulenos, vinílogos de porfirinas, tintes de polimetina, cianinas y merocianinas, y similares. El tinte particular que se ha seleccionado es uno de conveniencia, disponibilidad, estabilidad, compatibilidad con la partícula, y similares. Los tintes específicos de interés incluyen los tintes de la clase de ptalocianinas, naptalocianinas, tintes de naftalocianina metalizados, y bacterioclorinas naturales modificadas. Ejemplos de tintes específicos que encuentran uso aquí incluyen IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4, 4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocyanina, Vanadil 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1,8,15,22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H, ftalocianina IRA800 (de Excitón), ProJet 830NP (de Zeneca), 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-tioxantenilio perclorato, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno] 1-ciclohexen-1-il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno]-N,N-perclorato dimetilamonio, N, N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] yoduro de quinolinio y 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio. Estos tintes pueden ser incorporados directamente en la propia partícula, a través de la polimerización, se unen de manera covalente a la partícula, ya sea mediante unión covalente directa a la superficie de la partícula o por medio de un látex depositado en la superficie de la partícula o por adsorción pasiva. Alternativamente, los tintes pueden estar vinculados a la cuenta en combinación con el componente de unión, de manera que no se filtran desde la superficie. Los tintes que encuentran uso aquí puede ser opcionalmente más hidrofóbicos, es decir, para su incorporación en un látex, por sustitución de uno o más de grupos de metilo y/o de etilo del tinte con cadenas de alquilo, que pueden comprender hasta 20 o más átomos de carbono, a menudo hasta 100 o más átomos de carbono, en el que estas sustituciones no se espera que afecten adversamente de manera significativa el perfil de absorción de infrarrojos del tinte.

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En otra realización de la invención, el tinte puede ser una naftalocianina con la siguiente fórmula:

1

Donde

M se selecciona entre el grupo formado por Si, Al, Sn, Ge, V y Ti;

R_{1} a R_{12} se seleccionan del grupo formado por hidrógeno, alquilo, y alcoxi con 1 a 20 átomos de carbono, y

X e Y puede ser el mismo o diferentes, en donde uno o ambos pueden estar ausentes, y se seleccionan del grupo que consiste en O, OAr y OSi(R)_{3}, donde R tiene la definición de R_{1} a R_{20}.

Preferiblemente, cuando M es Al, Y sólo debería estar unida a M y X está ausente, en la que R es un grupo alquilo o alcoxi con 1 a 20 átomos de carbono unidos directamente o a través de otros heteroátomos. X e Y servirán para reducir el apilamiento del sistema de anillos aromáticos al tiempo que mejora la solubilidad del tinte. R_{1} a R_{12} pueden estar vinculados directamente o a través de otros heteroátomos y pueden estar presentes en su totalidad o sólo en parte.

Los tintes absorberán la luz en el intervalo de 750-900 nm aproximadamente, en particular en el intervalo de 750-850 nm aproximadamente. Para las muestras con niveles altos de glóbulos rojos, la luz será de 800 nm \pm 10 nm aproximadamente, que es el punto isobéstico para la oxihemoglobina y la hemoglobina reducida. La cantidad de tinte empleado con las partículas puede variar con el coeficiente de extinción del tinte en el intervalo de luz de interés, la sensibilidad necesaria de la prueba, el tamaño de las partículas, el modo de unión del tinte a las partículas, la compatibilidad de la tintura con la matriz de partículas, etc. Por lo general, la carga estará entre el 1 al 20 por ciento de peso, más usualmente del 5 al 15 por ciento en peso.

Como ya se ha aludido, pueden estar presentes otros reactivos. En particular, cuando un compuesto monoepitópico es el compuesto de interés. Con un compuesto monoepitópico, donde los pares específicos de unión están implicados en la reticulación con el fin de obtener reticulación, se necesitará al menos un dímero de ese componente o un análogo mimético del mismo. Normalmente, el reactivo tendrá no más de unos 5 epítopes de reticulación presentes. Con este reactivo poliepitópico, en ausencia del compuesto de interés, habrá agregación. El aumento de las cantidades de la sustancia de interés reducirá la cantidad y el tipo de agregación. Alternativamente, se pueden usar receptores de unión múltiple que reaccionan transversalmente con el componente de unión y el compuesto de interés. El compuesto de interés llenará los sitios de unión de los receptores, evitando la reticulación, y reduciendo otra vez la cantidad y el tipo de agregación. De esta manera, se pueden detectar compuestos monoepitópicos.

Se pueden ensayar compuestos que puedan activar o inhibir los catalizadores, tanto de origen natural como sintético, en particular las enzimas que pueden activar el componente de unión a causa de la agregación, por ejemplo, trombina y fibrinógeno, caseína o fibronectina y transamidasas, etc.

Los otros reactivos que pueden estar presentes son sustancias que pueden modificar el compuesto de interés, como la activación de una función celular particular, aumentando o disminuyendo la expresión de una determinada proteína de la superficie de la membrana, compitiendo con el compuesto de interés por el componente de unión de la partícula, bloqueando la unión mediante una sustancia que compite con el compuesto de interés para la unión al actual componente de unión de la partícula, por ejemplo, alelos, isotipos, etc., a fin de evitar falsos positivos asociados con la sustancia competitiva, y similares. Estos reactivos adicionales serán seleccionados de acuerdo con la naturaleza del compuesto de interés, el protocolo del ensayo, y similares.

En cada caso, la cantidad de los otros reactivos se determinó de manera empírica. Si se utiliza un reactivo poliepitópico para competir con un compuesto monoepitópico de interés, el reactivo será seleccionado para proporcionar la máxima sensibilidad en el intervalo dinámico de interés. Esto puede variar de menos a más estequiométrico y puede determinarse fácilmente. Uno varía la concentración de los reactivos con la concentración más baja prevista de los compuestos de interés y la mayor concentración prevista de los compuestos de interés. Uno puede escoger uno o dos puntos intermedios para determinar la mayor sensibilidad en estos puntos intermedios. Al representar gráficamente los resultados, se puede determinar la concentración de los reactivos que proporcionen el resultado más sensible en el intervalo dinámico, requiriéndose una mayor respuesta en la parte inferior del intervalo que en la parte alta del intervalo.

Para llevar a cabo el procedimiento del objeto, la muestra, que puede haber sido objeto de una preparación previa, se combina con los reactivos necesarios con agitación suave. Varios procedimientos convencionales para la preparación de la muestra pueden emplearse. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, la muestra puede protegerse de la atmósfera, o estar en contacto con la atmósfera. La protección de la atmósfera se puede lograr mediante el empleo de recipientes cerrados, donde los contenedores están sellados con un tabique, y la muestra se introduce por medio de una aguja a través del tabique, con el recipiente receptor evacuando o conteniendo un gas inerte. Opcionalmente, se puede usar un indicador de humedad en los recipientes cerrados herméticamente a fin de proporcionar información en cuanto a la humedad en la cámara (véase, por ejemplo, la patente US 4.793.180). Estos indicadores también están comercialmente disponibles a través de Humidial Corp, Colton, CA.

Convenientemente, se pueden tomar muestras relativamente grandes o pequeñas, y usarse sólo pequeñas partes alícuotas en los ensayos. Así, el volumen de ensayo puede ser de 5 \mul a 500 \mul aproximadamente, usualmente de 25 \mul a 250 \mul aproximadamente, y convenientemente de 25 \mul a 150 \mul aproximadamente.

La muestra se combina con las partículas y otros reactivos en condiciones en las que las partículas se dispersan rápidamente en toda la muestra. Las partículas y otros reactivos pueden estar presentes como una composición seca o dispersas con una pequeña cantidad de líquido. Normalmente, el volumen de las partículas y de los reactivos no será mayor que un volumen igual a la muestra, preferiblemente menor de un 50% del volumen de la muestra, más preferentemente inferior a aproximadamente el 25% del volumen de la muestra.

Una lectura se toma en 0, o en un intervalo de tiempo conveniente para obtener un valor 0, que es el valor de ausencia de agregación significativa. Se pueden tomar lecturas de vez en cuando. Se puede usar instrumentación automática para mezclar la muestra con las partículas y otros reactivos, calentar la mezcla de ensayo a la temperatura deseada, realizar las operaciones necesarias durante el ensayo, monitorizar la mezcla de ensayo para tomar la primera lectura, por ejemplo, cuando la muestra ha alcanzado la temperatura deseada, tomar lecturas adicionales, según corresponda, y, a continuación, calcular el resultado del ensayo para la muestra, con cualquier otra información descriptiva asociada a la muestra.

La concentración de partículas en el medio será optimizada de acuerdo con la naturaleza del compuesto de interés, el intervalo dinámico del compuesto de interés, la naturaleza del medio de la muestra, y similares. La cantidad de partículas puede determinarse empíricamente. En general, el coeficiente de absorción de la agregación del medio debe ser de al menos el doble del coeficiente de absorción de la muestra, preferentemente al menos tres veces, más preferiblemente al menos cuatro veces, y puede ser diez veces o más. En ausencia de cualquier fondo importante en el infrarrojo, no existe una relación eficaz.

El tiempo para la mezcla puede variar ampliamente, siendo usualmente de al menos 1 segundo, y no más de unos 5 minutos, generalmente no más de unos 2 minutos y, preferiblemente, durante unos 5 segundos a 1 min. La forma particular de agitación no es crítica para la presente invención, en tanto que se prevé la mezcla completa, sin impedir la formación de agregados. Si se desea, una agitación leve puede mantenerse en el transcurso del ensayo, una vez más asegurando que existe una distribución homogénea de las partículas y de todas las demás partículas, mientras se asegura que la agregación no se vea obstaculizada.

La temperatura del ensayo puede variar ampliamente, dependiendo de la naturaleza del compuesto de interés. Convenientemente, puede usarse a temperatura ambiente, aunque se prefieren temperaturas elevadas que se pueden controlar y mantener. Cuando se trata de ácidos nucleicos, la temperatura puede ser elevada, a fin de aumentar el grado de astringencia de la hibridación. Así, la temperatura puede variar entre 15-90ºC, donde con distintos ácidos nucleicos, la temperatura generalmente variará entre 25-40ºC. Usualmente, con ácidos nucleicos la temperatura generalmente estará entre 20-90ºC aproximadamente, más frecuentemente entre 30-85ºC.

Con los ácidos nucleicos, la astringencia se puede lograr mediante el uso de sales, disolventes orgánicos, etc. Sin embargo, con distintos a los ácidos nucleicos, normalmente la incorporación sólo será un tampón, en todo caso, cuando el tampón variará entre 5-10 en pH aproximadamente, más generalmente entre 6-9, y en una concentración de 10-500 mm aproximadamente, más frecuentemente de 25-250 mm aproximadamente.

El tiempo para el ensayo variará dependiendo de la forma en que se toma la medida. Cuando el tiempo cero se controla cuidadosamente, se pueden tomar una o dos mediciones en diferentes intervalos de tiempo para determinar la transmisión por infrarrojos absoluta en los intervalos de tiempo o para determinar la velocidad de formación de la agregación. Alternativamente, se pueden realizar una pluralidad de mediciones en el transcurso del tiempo del ensayo y analizar la pendiente que comienza en el momento fijado desde el momento de la mezcla. Los datos pueden analizarse mediante cualesquiera medios convenientes, en particular mediante un algoritmo que pueda manipular los datos con relación a calibradores y/o controles. El tiempo total de las lecturas de tiempo cero (tiempo de mezcla), puede variar de 10 seg. a 5 min. aproximadamente, más generalmente de 30 seg. a 5 min. aproximadamente, y, preferentemente, de 30 seg. a 2 min. aproximadamente.

Usualmente, el resultado será comparado con un calibrador, que puede realizarse de forma concomitante o se ha realizado con anterioridad o que pueda establecerse como una curva estándar. Los calibradores variarán dependiendo de la naturaleza del compuesto de interés. Se pueden preparar muestras con cantidades conocidas del compuesto de interés y en el ensayo, y los resultados representados para poder traducir la medición obtenida con la muestra al estándar. En algunos casos, se utilizarán controles, cuando el valor de base pueda variar dependiendo de la fuente de la muestra. El control se hará especialmente asociado con la muestra y con el compuesto de interés.

La invención del objeto encuentra aplicación en particular en relación con la determinación de las plaquetas y con la función de las plaquetas. La función de adhesión de las plaquetas es una prueba extrema de la metodología del objeto en la sensibilidad en diversos factores de las plaquetas. En primer lugar, las plaquetas pueden ser activadas en diversos grados mediante la manipulación física de la sangre y mediante la liberación de factores que se producen cuando los vasos sanguíneos se dañan en la punción venosa. En segundo lugar, es el efecto del tiempo entre la retirada de la sangre y las pruebas: para las técnicas que requieren de plasma este momento es necesariamente más largo, y por lo tanto, menos deseable. Además, la acción mecánica necesaria para separar el plasma de los glóbulos rojos puede activar las plaquetas en diversos grados y también dar lugar a la recuperación variable de células. Al medir la eficacia de los inhibidores de la función de adhesión de las plaquetas, se plantea la cuestión de la relativamente rápida relación externa. La rápida relación externa de un inhibidor significa que su efecto se debe subestimar, si la muestra se diluye antes del ensayo, y en algunos casos, incluso si la dilución se produce durante el ensayo. Además, dado que la agregación de las plaquetas, el fibrinógeno vinculante y, en algunos casos, la unión del inhibidor de calcio son dependientes, la elección de los anticoagulantes puede ser importante para determinar con exactitud los niveles de la función de las plaquetas. La variabilidad en la absorción, el metabolismo, etc., de las drogas anti-IIb/IIIa pueden dar lugar a grandes diferencias en la farmacocinética. La metodología permite a los sujetos una determinación rápida del nivel efectivo de la inhibición de la función de adhesión de las plaquetas y/o la capacidad de agregación de las plaquetas. Esta información permite la toma de decisiones precisas sobre el calendario y la frecuencia de la dosificación con antiagregantes plaquetarios, encaminadas a inhibir la formación de coágulos.

Cuando se mide la agregación de las plaquetas, debido al interés del estado de las plaquetas de un individuo, que puede ser el estado natural o la situación resultante de la administración de un fármaco, la muestra estará en vigor en la sangre completa, que ha sido objeto de menos del 50% aproximadamente, preferiblemente menos del 20% de la dilución.

La sangre se extrae deseablemente en ausencia sustancial de aire. Convenientemente, se usa un Vacutainer para capturar y mantener la muestra de sangre. El Vacutainer deseable incluye un pequeño volumen de una solución de citrato de sodio (u otro anticoagulante) generalmente entre un 3-5% de citrato de sodio con un volumen entre 0,05-0,5 ml aproximadamente. La muestra de sangre debe ser obtenida de una extremidad libre de infusión venosa periférica. Convenientemente, la aguja debe ser de al menos 21 de calibre aproximadamente.

El primer tubo que se retira se descarta, se utiliza el segundo tubo o tubos posteriores. Se emplea una agitación leve, simplemente suave, invirtiendo el Vacutainer para asegurar la mezcla del anticoagulante con la muestra. La muestra en cada contenedor puede variar entre aproximadamente 1-10 ml, más generalmente de 1- 8 ml aproximadamente, más convenientemente de 1-5 ml aproximadamente. La muestra no debe ser almacenada durante un período excesivamente largo, generalmente el almacenamiento antes del ensayo no debe exceder de 1 hora.

Una pequeña porción de la muestra se puede transferir a continuación a una cubeta para su medición. Generalmente, el volumen puede variar en 25-500 \mul aproximadamente, más generalmente en 75-250 \mul aproximadamente. Convenientemente, la cubeta contiene las partículas que han sido recubiertas con fibrinógeno u otros compuestos de unión. Las plaquetas pueden ser activadas mediante la adición de diversos agentes, que sirven para activar las plaquetas. Agentes ilustrativos incluyen ISO-TRAP (véase la patente US 5.455.228), TRAP, ADP, colágeno, trombina, ristocetina, ácido araquidónico, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier activador conveniente puede ser utilizado. Iso-TRAP se utiliza en una operación de concentración entre 1 y 5, preferentemente de 2 mmol/L aproximadamente. ADP puede ser empleado en el intervalo de aproximadamente 20 \muM como antagonista GP IIb/IIIa o concentraciones más bajas para la monitorización de aspirina, ticlopidina y/o clopridogrel. El agente activador puede ser incorporado con el reactivo de cuentas al que se añade la muestra de sangre. Las cuentas y otros reactivos pueden ser secas, con el fin de no diluir la muestra, aunque en algunos casos puede estar presente una pequeña cantidad de líquido, de manera ideal menos de un 25% del volumen de la muestra.

Las partículas son convenientemente partículas de poliestireno de un tamaño de 2 a 8 micras, que han sido recubiertas con fibrinógeno por absorción pasiva o por unión covalente según las formas convencionales, y como se describe anteriormente. En general, el peso del fibrinógeno respecto al peso de las partículas será entre 1:1000 y 1:10 aproximadamente.

La cantidad de cuentas debe proporcionar una relación entre el coeficiente de absorción de los medios de aglutinación y el coeficiente de absorción en la sangre completa mayor de aproximadamente 4:1 a 800nm, generalmente no mayor de aproximadamente 10:1 a 800nm. La velocidad de absorción óptima se puede lograr mediante la configuración de las características de absorción de luz de los medios de aglutinación y la concentración de los medios de aglutinación en la muestra de ensayo.

La mezcla de sangre anticoagulada, partículas y agente activador se agita suavemente para asegurar la homogeneidad, y la agitación suave se continúa con el fin de mantener la homogeneidad, sin obstaculizar la formación de agregaciones. La temperatura para el medio se mantiene a una temperatura constante. Después de un tiempo corto, generalmente de menos de 30 segundos, generalmente 10 segundos aproximadamente, se inician las lecturas, por ejemplo, de la iluminación con luz de 800 nm aproximadamente. El tiempo total para la lectura generalmente será menor de 5 minutos aproximadamente, generalmente menor de 3 minutos, en el que, cuando uno se determina el tipo de velocidad para determinar el cambio en la pendiente con el tiempo, el número de puntos de datos por segundo puede variar de unos 0,01 a 100, más generalmente de 1 a 50 aproximadamente. Así, se pueden tomar lecturas a intervalos constantes de 0,01 segundos a 1,5 segundos aproximadamente, generalmente de 0,02 segundos a 1 segundo aproximadamente. De lo contrario, puntos de datos pueden tomarse como convenientes, habiendo al menos un punto de datos, más generalmente al menos dos puntos de datos, con frecuencia no menos de 1 por minuto. El cambio en la transmisibilidad con el tiempo se determina mediante una técnica conveniente, convenientemente provista de un detector espectrofotométrico convencional para el infrarrojo.

Como control, la sangre que contiene un inhibidor de la coagulación es tratada con un reactivo, convenientemente un anticuerpo o fragmento del mismo, que neutraliza totalmente el inhibidor. Se encuentra que la línea de base para la actividad de las plaquetas puede variar considerablemente con el tiempo para un paciente y entre pacientes, de manera que mediante la neutralización de un inhibidor se puede obtener el valor de referencia para la actividad de las plaquetas de la muestra en particular. Esto puede ser utilizado para la comparación con los resultados obtenidos con la muestra para determinar la actividad de las plaquetas en presencia del inhibidor. Compuestos ilustrativos que encuentran uso como inhibidores incluyen los compuestos de Searle 54701B y 57101A, que son potentes fármacos IIb/IIIa que bloquean la función. Antisueros o anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión se pueden utilizar para bloquear la acción del inhibidor y la muestra sin inhibiciones resultantes utilizada para el control. El control se utiliza en la misma forma que la muestra y se puede ejecutar al mismo tiempo para que las mismas condiciones que se emplean para el control sean utilizadas para la muestra.

La cantidad de agente inhibidor de la neutralización que se emplea proporcionará una neutralización completa del inhibidor y se pueden utilizar excesos, usualmente no más de cinco veces superior a la máxima concentración del inhibidor, como se había previsto en la dosis administrada al paciente, sin dilución significativa de la muestra, usualmente menos de un 50% de dilución, usualmente menos de un 25% de dilución. Cuando se utiliza antisuero o fragmentos del mismo, se deben utilizar títulos de alta afinidad, de manera deseable un 50% de la unión máximo debe ser en un título que varía desde, al menos 1:10.000 a 1:100.000 aproximadamente, o quizás más, preferentemente, al menos, aproximadamente 1:25.000. Mediante la utilización de esta técnica se puede establecer un índice de referencia, o de cualquier otro parámetro funcional de referencia de prueba IIb/IIIa.

Las partículas del objeto, sin fibrinógeno, que actúan como sustituto o controlador de las plaquetas de control, se pueden combinar con trombina y/o Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP, un péptido inhibidor de la polimerización de fibrina) en un medio de tampón apropiado. Estos reactivos se pueden combinar con las partículas recubiertas de fibrinógeno en la misma forma que la muestra. Si se desea, el medio de tampón puede ampliarse con componentes sanguíneos, como glóbulos rojos, albúmina, inmunoglobulinas, u otros componentes sanguíneos significativos, que no participan en la agregación de las partículas. Un medio conveniente es un tampón HEPES de cloruro de sodio que incluye 1-5 mg/ml de proteínas, por ejemplo, BSA.

En otras realizaciones, pueden usarse calibradores o controladores adicionales. Por ejemplo, mientras se puede proporcionar una línea de base (100% del índice máximo de ensayo) de nivel de control mediante la combinación de partículas de fibrinógeno recubiertas con aproximadamente 0,5 a 10 unidades de NIH/ml, preferentemente 0,6 unidades de NIH/ml aproximadamente, de trombina humana en un medio de tampón apropiado tal como el descrito anteriormente, se proporciona un nivel de control de aproximadamente el 50% (aproximadamente el 50% del índice máximo de ensayo) en el que las partículas de fibrinógeno recubiertas se combinan con aproximadamente 0,5 a 10 unidades de NIH/ml, preferentemente 0,6 unidades de NIH/ml aproximadamente, de trombina humana en un medio tamponado adecuado, tal como el descrito anteriormente y de 15 a 30 aproximadamente, preferentemente de 23 mg/ml de oligopéptido GPRP aproximadamente, un péptido inhibidor de la polimerización de fibrina. Preferiblemente, el nivel de control del 100% contiene aproximadamente 0,6 unidades de NIH/ml de trombina en 10 mM de solución salina amortiguadora HEPES, 2 mg/ml de BSA, 0,2% de trehalosa, 0,4% de Tween 20, y 0,9% de látex de poliestireno de 0,5 micras.

Controles adicionales pueden emplear el anticuerpo monoclonal de ratón 4A5 (G. Matsueda, Universidad de Princeton), que se ha generado en contra de un péptido inmunógeno para imitar el sitio de reticulación intermolecular en la cadena de fibrina humana y que reacciona con el fibrinógeno y los oligopéptidos sintéticos de base de fibrinógeno. En concreto, cuando 4A5 está cubierto con una superficie de látex de poliestireno de 2-3 micras, el complejo es capaz de la aglutinación de partículas de fibrinógeno recubiertas con látex, de una manera en donde existe una correlación directa entre la cantidad de látex recubierto 4A5 añadido y el índice de aglutinación.

Controles adicionales también pueden usar las membranas plasmáticas de plaquetas aisladas que están cubiertas en la superficie de las partículas con látex de poliestireno. Estas partículas recubiertas de la membrana son capaces de aglutinar el fibrinógeno recubierto con partículas de un modo en el que existe una correlación directa entre la cantidad de las partículas de membrana recubiertas añadidas y el índice de aglutinación. Si se desea, también puede utilizarse GIIb/IIIa en diferentes concentraciones.

Los controles mencionados anteriormente se pueden realizar independientemente de los ensayos del objeto o pueden realizarse conjuntamente con los ensayos del objeto. Cuando el control se lleva a cabo en relación con el ensayo del objeto, se puede realizar en un aparato que sea separado y distinto del que se emplea para el ensayo del objeto, o se puede realizar en el mismo aparato que se utiliza para el ensayo del objeto, con la condición de que ese aparato comprenda al menos dos cámaras distintas que puedan utilizarse para la prueba y los ensayos de control.

Si se quiere, esta técnica modificada también se puede utilizar en la evaluación de la actividad de varias proteínas en la sangre, que se asocian con la activación y la agregación de la trombina. Estas proteínas son FV, FVIIIc, FIX, y otros factores descritos anteriormente. Así, mediante la adición de una muestra de sangre a una mezcla preparada, que puede ser seca y requiere una nueva formación o una solución concentrada, que contiene los factores necesarios para la coagulación de la sangre, con excepción del factor a medir, y las partículas recubiertas de fibrinógeno, un cambio en el índice de agregación estará relacionado con la actividad del factor de interés en la muestra. El resultado de esto puede estar relacionado con los calibradores que tienen cantidades conocidas del factor de interés.

Después de que la muestra se haya combinado con los reactivos, deseablemente se calienta a una temperatura superior a la temperatura ambiente, pero por debajo de la interferencia con el ensayo, a fin de asegurar que la temperatura puede ser controlada sin afectar negativamente el resultado del ensayo. Preferiblemente, la temperatura debe ser de al menos 25ºC, preferentemente en el intervalo de 30-40ºC, más preferentemente 37ºC aproximadamente. Aunque no es esencial, es preferible que la muestra se agite suavemente durante la incubación y la medición de la agregación. Para la agitación, se pueden mover cuentas de metal de arriba abajo, oscilando las cuentas magnéticas a un ritmo lento o cualquier otro medio empleado para la agitación leve.

El volumen de muestra puede ser muy pequeño, usualmente no inferior a aproximadamente 10 \mul, más usualmente no inferior a 25 \mul aproximadamente, y deseablemente, no más de 1 ml aproximadamente, preferentemente no mayor de 500 \mul aproximadamente, más preferiblemente no mayor de 250 \mul aproximadamente.

Para mayor comodidad, se pueden proporcionar equipos que comprenden todos o algunos de los reactivos que se encuentran uso en la invención del objeto. El equipo tiene las partículas para su uso con el componente de interés. Además, pueden preverse inmunoglobulinas neutralizantes para la eliminación de inhibidores en una muestra para servir como control. Se pueden prever calibradores que proporcionan partículas con el componente de unión adecuado mezclado con otros reactivos relacionados con el ensayo y, si se desea, con una fuente del componente de interés, ya sea en cantidades medidas o a granel. Para la agregación de las plaquetas, puede preverse la combinación de trombina y/o GPRP y partículas sin recubrimiento. Además, convenientemente, pueden ser Vacutainers que comprenden 0,1-1 ml de anticoagulante 1-5 M, por ejemplo, citrato de sodio, un inhibidor de trombina. De particular interés para el equipo es un contenedor que contenga uno o más de los reactivos apropiados a fin de reducir las etapas de manipulación para el ensayo. Por ejemplo, se puede proporcionar un contenedor, tal como una cubeta, que contiene las partículas y, en su caso, otros reactivos para la prueba.

Otra realización de la presente invención está dirigida a ensayos y equipos útiles que son capaces de detectar la sensibilidad y la medición cuantitativa de la presencia de moléculas de interés que existen en bajas concentraciones en una muestra, tal como, por ejemplo, troponina I cardiaca y P-selectina. En estos ensayos, se puede conectar una molécula receptora a la superficie de una partícula, primero utilizando la metodología estándar, preferentemente un anticuerpo o fragmento de unión del antígeno, que esté dirigido contra una molécula de interés que está presente en la muestra en bajas concentraciones, donde la molécula de interés es preferiblemente una proteína o un péptido. La unión de la molécula de interés con la superficie de la primera partícula recubierta con el receptor no afecta significativamente a la capacidad de la primera partícula de absorber o emitir en el intervalo infrarrojo. Sin embargo, se añade una segunda partícula, preferentemente una partícula que tiene poca o ninguna absorción inherente en el infrarrojo y/o capacidad de emisión, tal como una partícula de látex blanco, y que está recubierta con una molécula receptora, preferentemente un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que se dirige en contra de un sitio diferente de la molécula de interés. La segunda partícula está disponible para unirse a la molécula de interés que ya está unida o se une a la primera partícula, lo que altera la absorción en el infrarrojo y/o las características de emisión de la primera partícula, en el que esta alteración en la absorción y/o la emisión de infrarrojos se puede detectar y cuantificar en el tiempo. La muestra puede combinarse con la primera partícula antes, al mismo tiempo o después de que la segunda partícula se añada a la muestra, en la cual el orden de combinación no será fundamental para la invención. Las partículas que encuentran aquí uso son las descritas anteriormente.

Sin embargo, otra forma de realización de la presente invención está dirigida a ensayos y equipos útiles para detectar y medir cuantitativamente el número total de receptores de plaquetas en una muestra de interés como una medida de recuento de plaquetas. En concreto, las partículas están recubiertas tal como se describe anteriormente con las moléculas del receptor, preferentemente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, dirigidos contra una proteína asociada a las plaquetas, tales como, por ejemplo, GPIB, GP IIb/IIIa, y similares, y combinándose con una muestra de interés. Las alteraciones en la capacidad del sistema para absorber en el intervalo infrarrojo a lo largo del tiempo aportarán información sobre el número total de receptores de plaquetas en la muestra, que podrá estar relacionada con el recuento de plaquetas.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Experimental

Las cuentas utilizadas en los experimentos posteriores se preparan como sigue:

Preparación de cuentas de látex recubiertas con fibrinógeno humano

A 8,369 ml de agua desionizada en un tubo cónico de 15 ml de polipropileno, se añadirán 0,208 ml de fosfato sódico 0,96 M a pH 7,2 con 0,02% de azido de sodio. Cuatrocientos veintitrés microlitros de fibrinógeno humano (de Enzime Research Laboratories, South Bend, Indiana; # cat Fib 3) a 7,8 mg/ml se añaden y se mezclan suavemente. Por último, 1 mL de cuentas de látex de 5,5 micras (de Bangs Laboratories, de poliestireno con DVB 5,5% y 5% de ácido metacrílico) en 10% se añaden la mezcla y se incuban a temperatura ambiente en un oscilador durante 2 horas. A continuación se centrifuga a 1540 g durante 5 minutos en un cubo de rotor oscilante. El sobrenadante se decanta y 10 ml de solución tampón C (10 mM HEPES con 1 mg/mL de BSA y 0,02% de azido sódico con un pH de 7,5) se añaden para volver a suspender las cuentas. Se centrifuga la mezcla y el procedimiento anterior se realiza de nuevo. Después de la centrifugación, el sobrenadante se decanta y 6,67 ml de solución tampón A se añadirán para volver a suspender las cuentas. La concentración de las cuentas es usualmente 1,38 x 10^{8} cuentas por ml. Una modificación del ensayo de ácido bicincónico (BCA) (Pierce, Rockford, IL) se utiliza para determinar la cantidad de fibrinógeno recubierto en las cuentas. La preparación de fibrinógeno humano recubierto con cuentas de látex azul se hace de manera idéntica, excepto que se usan 6 micras de cuentas de látex azul (de PolySciences, poliestireno con grupos carboxilato).

Preparación una solución de tinte IR-140

Cuarenta y cinco miligramos de IR-140 se disuelven en 9 ml de cloruro de metileno en un tubo de vidrio. Luego se mezclan con 38 ml de 2-propanol, seguidos por 53 ml de solución de tampón B (20 mM fosfato sódico al 0,02% de azido de sodio con pH 7,5) en un frasco de vidrio. La mezcla se mezcla vigorosamente con un agitador ColePalmer Modelo 50002-30 durante 15 minutos para hacer una solución de tinte homogénea.

Preparación de cuentas de látex recubiertas teñidas con IR-140

A una bola de fibrinógeno humano recubierta con cuentas de látex (1 x 10^{9} cuentas), se añaden 10 ml de solución de tinte IR140 anterior, seguido de agitación. La mezcla se incubó a RT en un oscilador durante 5 minutos y luego se transfiere a un tubo cónico de 50 ml de polipropileno y QS'd a 50 ml con tampón A. Después de 5 minutos de girar a 1540 g, y de la eliminación del sobrenadante, el proceso de carga de tinte anterior se realiza una segunda vez. Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, se añaden 9,75 ml de solución tampón B y son sometidos a turbulencias de vórtice, seguido por la adición de 0,25 ml a 7,8 mg/ml de fibrinógeno humano, mezclándose suavemente. La mezcla se sonica durante 45 segundos. Se realiza la purificación (uso de tampón C y centrifugación) de la misma manera que en la Sección de Preparación de cuentas de fibrinógeno humano recubiertas de látex.

En el siguiente experimento, se utilizó la metodología del objeto, en relación con el compuesto Searle 54701B, un compuesto que tiene la capacidad de inhibición de la agregación de las plaquetas. El procedimiento empleado fue el siguiente.

Enfoque general

Se añade sangre con citrato a un cartucho que contiene micropartículas propietarias y el receptor péptido activador de la trombina (ISO-TRAP). La microaglutinación se supervisa ópticamente en la mezcla mientras se mezcla mecánicamente. La actividad de las plaquetas se determina por el índice de cambio de la densidad óptica de la solución. Los resultados de este ensayo se comparan con los resultados de la agregometría de plaquetas óptica realizada en plasma rico en plaquetas (PRP).

Procedimientos Recogida y preparación

Se recogió sangre humana (40,5 ml) de seis voluntarios libres de aspirinas no fumadores en 5,0 ml de citrato (3,8%) usando un sistema de tubos Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con una aguja de calibre 21. El primer tubo fue descartado y el resto fue agrupado en un contenedor de polipropileno y se mantuvo a una temperatura ambiente. Alícuotas de 5 ml de sangre acumulada fueron trasladadas a tubos de polipropileno de 12 x 75 mm, y 250 ml de sangre extraída y descartada. Compuesto Searle 54701 B se diluyó con HEPES 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4 y se añaden 50 \mul a cada tubo, resultando en una agregación final de 10, 25, 35, 50 y 75 nm. Se preparó una muestra de agregación mínima en 1000 nm para todas las muestras. Las muestras de control para evaluar la agregación máxima se prepararon de forma simultánea con 250 ml de HEPES/tampón salino añadido en lugar del antagonista.

Alícuotas de sangre total con inhibidor (2,0 ml) fueron retiradas y se colocaron en tubos separados de polipropileno para el desempeño de la función de las plaquetas Determinación rápida (RPFA). El resto de la sangre en los tubos se centrifuga a 110 x G durante 12 minutos y se recoge el plasma rico en plaquetas (PRP) en tubos de polipropileno por separado. Se preparó plasma pobre en plaquetas (PPP) mediante centrifugación de una parte alícuota separada de la sangre a 1540 x G durante 15 minutos. Se iniciaron ensayos para la función de las plaquetas dentro de 1 hora después de la recogida de sangre.

En un estudio similar que se muestra en la Figura 4, la sangre se recogió y fue tratada como la anterior, excepto que se establecieron seis donantes en tres días consecutivos. Por lo tanto, los resultados se indican como la media de los datos obtenidos en esos tres días.

Agregometría de plaquetas

Fue inoculado PRP (400 \mulitros) en una cubeta de silicona con una barra de agitación de teflón. La cubeta se coloca en un modelo de agregómetro de registro Chrono-490D de plaquetas óptico y se estableció un trazado basal durante 30 segundos. Se añadió ADP (44 \mul) a 200 \muM para una concentración final de ADP de 20 \muM. La agregación fue monitoreada durante dos minutos y la suma máxima fue registrada.

Determinación rápida de la función de las plaquetas

Una alícuota de 160 \mul de sangre completa o con un inhibidor de tampón preparado anteriormente para RPFA se añadió a una cubeta de plástico que contenía ISO-TRAP liofilizado y micropartículas. El ciclo de mezclado mecánico fue activado durante 70 segundos con la lectura óptica de la muestra en un índice de 16 por segundo. La microaglutinación fue determinada mediante el índice de cambio de la densidad óptica de la solución en un intervalo fijo.

El monitor RPFA utiliza un diodo IR con longitud de onda máxima de 805 nm, un ancho de banda espectral de 50 nm, y una potencia de salida de radiación de 15 mW. La señal transmitida es detectada mediante un amplificador detector óptico híbrido de alta ganancia de gran ancho de banda con una responsividad a 805 nm de 0,6 A/W. Tras la adición de la muestra de 160 \muL de sangre completa para el cartucho de ensayo, se acciona un mezclador a motor con una duración de 70 segundos a 240 ciclos/min. Durante este período de mezcla, en la salida de la señal del detector se realiza un muestreo con una velocidad de 16 Hz. Al término de la mezcla, los datos de dominio de tiempo en bruto se procesan para obtener una medida de la inhibición de las plaquetas.

Resultados

Como puede verse en la Figura 1, el índice de aglutinación de las cuentas de látex azul recubierto con fibrinógeno de 6 micras se monitoriza como en el sistema que utiliza una fuente de luz LED de 650 nm aproximadamente se mostró casi dos veces mayor al total de la oxigenación venosa de la sangre en total oscuridad, mientras que las cuentas de látex recubiertas con fibrinógeno teñido con IR-140 de 5,5 micrones que se monitorizan en el sistema que utiliza una fuente de luz LED de 817 nm aproximadamente se mantuvo constante.

Aunque la invención anterior se ha descrito en detalle a modo de ilustración y de ejemplo para fines de la claridad de su comprensión, será evidente para los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas de esta invención que pueden realizarse algunos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5455228 A [0004] [0047]

\bullet WO 9610749 A [0004]

\bullet WO 9412664 A [0005]

\bullet WO 9422018 A [0005]

\bullet WO 9208982 A [0005]

\bullet WO 8900200 A [0005]

\bullet US 5427913 A [0005]

\bullet US 5306632 A [0005]

\bullet US 5523238 A [0005]

\bullet US 5266462 A [0005]

\bullet US 5246832 A [0005]

\bullet US 5114842 A [0005]

\bullet EP 016568 A [0005]

\bullet US 4973669 A [0006]

\bullet US 5503933 A, Afeyan [0022]

\bullet US 5324752 A [0022]

\bullet US 4793180 A [0033]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bullet Platelets in cardiovascular thrombosis and thrombolysis. Coller, B.S. et al. The Heart and Cardiovascular System. Raven Press, 1992, 219-273 [0004]

\bulletFabian et al. Chem. Rev, 1992, vol. 92, 1196-1226 [0004]

\bulletBeer et al. Immobilized Arg-Gly-Asp (RGD) peptides of varying lengths as structural probes of the platelet glycoprotein IIb/IIIa receptor. Blood, 1992, vol. 79, 117-128 [0005]

\bulletColler et al. Collagen-platelet interactions: Evidence for a direct interaction of collagen with platelet GPIa/IIa and an indirect interaction with platelet GPIIb-IIIa mediated by adhesive proteins. Blood, 1989, vol. 74, 182-192 [0005]

\bulletColler et al. Studies of activated GPIIb-IIIa receptors on the luminal surface of adherent platelets. J. Clin Invest., 1993, vol. 92, 2796-2806 [0005]

\bulletPfueller et al. Role of plasma proteins in the interaction of human platelets with particles. Trombosis Research, 1978, vol. 12, 979-990 [0005]

\bulletFabian et al. Chem. Rev., 1992, vol. 92, 1197-1226 [0026]

Claims (43)

1. Procedimiento para determinar la presencia o el efecto de un componente en una muestra, utilizando un sistema de agregación que comprende partículas a las que se unen un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben la luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en donde el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia del componente en dicha muestra.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha muestra es sangre completa y dicha mezcla de ensayo tiene menos de aproximadamente 5 veces la dilución de dicha muestra de sangre.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha sangre completa comprende un anticoagulante que no interfiere con una actividad intrínseca de un componente de dicha muestra.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la luz infrarroja es de aproximadamente 800 nm.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de la irradiación se realiza en una longitud de onda que es igual a un punto isobéstico de dos componentes de dicha mezcla de ensayo.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las partículas son de un diámetro entre 0,1 y 50 \mu.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas partículas están recubiertas de una proteína o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KDG.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha proteína es fibrinógeno o factor de von Willebrands.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, donde las partículas son partículas de carbono.

10. Procedimiento para determinar la actividad adhesiva de las plaquetas en una muestra, utilizando un sistema de agregación que comprende las partículas que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y luz que se absorbe en el infrarrojo y a las cuales está unido fibrinógeno, y cualesquiera reactivos adicionales, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra de sangre que comprende de plaquetas con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de dicha luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo está relacionado con la actividad de las plaquetas en dicha muestra.

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11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho sistema de agregación comprende un compuesto activador de plaquetas.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende las etapas adicionales para un valor de control de:

combinar (1) una composición que comprende trombina, (2) partículas sin recubrimiento, y (3) partículas recubiertas de fibrinógeno, que se absorben en el infrarrojo, donde la concentración de partículas recubiertos es comparable a la concentración en dicha mezcla de ensayo, en la que se produce la agregación de dichas partículas recubiertas;

irradiar dicha mezcla de control con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión es indicativo del valor de base, sin la participación de las plaquetas.

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13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha composición que comprende trombina comprende un oligopéptido que tiene la secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Pro.

14. Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende las etapas adicionales para un valor de control de:

combinar (1) partículas recubiertas con membranas de plasma de plaquetas o un anticuerpo anti-fibrinógeno, (2) partículas sin recubrimiento, y (3) partículas recubiertas con fibrinógeno que se absorben en el infrarrojo, donde la concentración de las partículas recubiertas es comparable con la concentración en dicha mezcla de ensayo, con lo cual se produce la agregación de dichas partículas recubiertas:

irradiar dicha mezcla de control con luz en la región infrarroja, y

determinar la transmisión de luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión es indicativo del valor de base, sin la participación de las plaquetas.

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15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo anti-fibrinógeno es 4A5 que se genera en contra de un péptido inmunógeno para imitar el sitio de reticulación intermolecular en la cadena y de fibrina humana y reacciona con el fibrinógeno y oligopéptidos basados en fibrinógeno sintético.

16. Procedimiento para determinar la presencia de un ligando de interés, empleando un sistema de agregación que comprende partículas a las que están unidas un componente de unión, cuyas partículas comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y absorben luz en el infrarrojo, y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas, en donde dicho ligando modula la agregación de dichas partículas resultantes de dicho componente de unión, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de la luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia de dicho ligando de interés en dicha muestra.

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17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho ligando es una molécula de menos de 5kD.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho ligando es una molécula de más de 10kD.

19. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dichas partículas son de un tamaño entre 0,1 y 50 \mu.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dichas partículas son de un tamaño entre 2 y 8 \mu.

21. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha muestra de sangre completa diluida por menos 5 veces y dicha luz infrarroja es de 800 \pm 10 nm.

22. Procedimiento para determinar la presencia de un inhibidor de catalizador, utilizando un sistema de agregación que comprende partículas, que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y que absorben luz en el infrarrojo, a las que se une un componente de unión y cualquier reactivo adicional necesario para la agregación de dichas partículas como resultado de la acción catalítica sobre un sustrato de dicho catalizador inhibido mediante dicho inhibidor de catalizador,

en el que dicho sustrato o el producto catalítico de dicho sustrato, en conjunción con dicho componente de unión modula la agregación de dichas partículas, comprendiendo dicho procedimiento:

combinar una muestra que comprende dicho catalizador con dicho sistema de agregación para formar una mezcla de ensayo;

irradiar dicha mezcla de ensayo con luz en la región infrarroja; y

determinar la transmisión de dicha luz infrarroja desde dicha mezcla de ensayo;

en el que el nivel de transmisión o un cambio en dicho nivel de transmisión a través del tiempo se relaciona con la presencia de dicho inhibidor de catalizador de interés en dicha muestra.

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23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno]-N, N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímeros orgánicos.

26. Equipo para su uso en un procedimiento según la reivindicación 1, comprendiendo dicho equipo:

partículas de un tamaño entre 0,1 a 50 \mu, que comprenden un tinte de absorción de infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo y que están unidas a un componente de unión; y por lo menos un constituyente adicional que es:

por lo menos un anticuerpo a un inhibidor GP IIb/IIIa;

un activador de plaquetas;

un Vacutainer que comprende un anticoagulante en una cantidad que inhibe la coagulación;

una mezcla de trombina y de partículas de un tamaño entre 0,1 y 50 \mu, que absorben luz en el infrarrojo, y/o

un soporte de una mezcla de ensayo con una entidad de mezcla.

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27. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho elemento de unión es fibrinógeno o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KGD.

28. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho elemento de unión es fibrinógeno.

29. Equipo según la reivindicación 26, en el que dichas partículas a las que están unidas un componente de unión son partículas de carbono.

30. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho activador de plaquetas se selecciona entre el grupo que consiste en TRAP, iso-TRAP, ADP, colágeno, ácido araquidónico, y ristocetina.

31. Equipo según la reivindicación 26, en el que dicho anticoagulante es citrato.

32. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímero orgánico.

33. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dicho tinte que absorbe infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

34. Equipo según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31, en el que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno] -N,N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.

35. Composición de materia que comprende partículas de un tamaño entre 0,1 y 50 \mu, que comprenden un tinte que absorbe infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo y que están unidas a un componente de unión.

36. Composición de materia según la reivindicación 35, en la que dicho tamaño es entre 2 y 8 \mu.

37. Composición de materia según la reivindicación 35, en la que dicho elemento de unión es fibrinógeno o un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos RGD o KGD.

38. Composición según la reivindicación 35, en la que dicha luz absorbida es 800 nm \pm 10 nm.

39. Composición de materia según la reivindicación 35, en el que dichas partículas son partículas de carbono.

40. Composición que comprende partículas poliméricas de un tamaño entre 0,1 y 50 \mu, que comprenden un tinte absorbente de infrarrojos y luz absorbente en el infrarrojo, en combinación con trombina.

41. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dichas partículas son partículas basadas en biovidrio o basadas en polímeros orgánicos.

42. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en dicho tinte que absorbe infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en una una bacterioclorina, una bacteriocloropitina, un tinte de meropolimetina, un benzoanuleno, una porfirina viníloga, un tinte de polimetina, un cianina y una merocianina.

43. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, en la que dicho tinte de absorción de infrarrojos se selecciona entre el grupo que consiste en IR-132, IR-140, 1,1'-dietil-4,4'-yoduro de dicarbocianina, 1,1'-dietil-2,2'-yoduro de quinotricarbocianina, Vanadyl 3,10,17,24-tetra-terc-butil-1, 8, 15, 22-Tetrakis (dimetilamino)-29H, 31H-ftalocianina, IRA800, ProJet 830NP, 2,3-diciano-4-[4-(dimetilamino) fenilimino]-1,4-naftoquinona, 9-[4-(dimetilamino) feniletinil]-perclorato de tioxantenilio, 2-[4-(4-dimetilaminofenil)-1,3-butadienil]-4-fenil-1-perclorato de benzotiopilio, 2-[2-[2-cloro-3-[2-(1,3-dihidro-1,3,3-trimetil-2H-indol-2-iliden)etilideno]1-ciclohexen-1il]etenil]-1,3,3-trimetil-3H-perclorato de indolio, N-[4-[5-(4-dimetilaminofenil)-3-fenil-2-penten-4-in-1-iliden]-2,5-ciclohexadien-1-ilideno] -N,N-perclorato de dimetilamonio, N,N-dietil-N-[4-[1,5,5-Tris (4-dietilaminofenil)-2,4-pentadienilideno]-2,5-ciclohexadien-1-iliden] perclorato de amonio, 1-etil-4-[5-(1-etil-4(1H)-quinolinilideno)-1,3-pentadienil] quinolinio y yoduro de 1-etil-4-[3-cloro-5-9]-etil-4(1H)-yoduro de quinolinio.