ES2335017T3

ES2335017T3 - Separacion cromatografica de polipeptidos terapeuticos.

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Publication number: ES2335017T3
Application number: ES04783837T
Authority: ES
Inventors: Patricio T. Chiron Corporation RIQUELME; Corazon Terciano Chiron Corporation VICTA; Walter Joseph Chiron Corporation CROSIER; John Tharin Chiron Corporation WENDELL
Original assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-09-09
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2010-03-18
Anticipated expiration: 2024-09-09
Also published as: CA2538183C; JP4642025B2; CA2538183A1; US20050131213A1; EP1664086A1; PT1664086E; US20080161544A1; JP2007526905A; JP2010248254A; DE602004023863D1; PL1664086T3; ATE446967T1; EP1664086B1; US7338935B2; WO2005023840A1

Abstract

Un método para purificar interferón-β mediante cromatografía de exclusión de tamaño que comprende las etapas de: preparar una solución de amortiguación que tiene un resistencia iónica de más de 50 mM y menos de 500 mM, dicha solución de amortiguación comprende adicionalmente un detergente iónico; cargar una columna de cromatografía de tamaño de exclusión con dicho interferón-β o interferón-β1b; eluir dicho interferón con solución de amortiguación de la columna de cromatografía de tamaño de exclusión; observar un perfil de elución y determinar el valor de asimetría del pico interferón del perfil de elución, en donde el valor de asimetría es la relación de amplitud de la mitad de una cola de un pico con una amplitud de una mitad delantera del pico medido en 10% de la altura del pico; y recolectar las fracciones de elución cuando el valor de asimetría del pico interferón del perfil de elución está entre 0.4 y 1.6

Description

Separación cromatográfica de polipéptidos terapéuticos.

Antecedente de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se dirige a la purificación y comercialización de polipéptidos que han demostrado valor terapéutico.

2. Estado de la técnica Referencias

Las siguientes publicaciones bibliográficas se mencionan en esta sección.

Helenius, A., McCaslin, D.R., Fries, E. y Tanford, C. in "Properties of Detergents"Methods in Enzymology, vol. 56 (1979), Páginas 734-749.

Turro, N.J., Lei, X., Ananthapadmanabhan, K.P. y Aronson, M. in "Spectroscopic probe analysis of proteinsurfactant interactions: the BSA/SDS system"Langmuir (1995), vol. 11, Páginas 2525-2533.

Existen muchos polipéptidos terapéuticamente importantes comercializados actualmente para el tratamiento de una enfermedad. Los interferones, por ejemplo, son citoquinas importantes que exhiben actividades antivíricas, antiproliferativas e inmunomoduladoras. Tales actividades se han utilizado para derivar beneficios clínicos de los polipéptidos para un número de estados de enfermedad, tal como hepatitis, varios cánceres y esclerosis múltiples. Los interferones se clasifican por ser de dos tipos diferentes interferones \alpha, \beta, \tau y \omega tipo I y tipo II. Los Interferones \alpha, \beta, \tau y \omega son miembros de los interferones tipo I, aunque el interferón y es el único miembro conocido de la clase tipo II distinta.

El Interferón \beta humano consiste de 166 residuos de aminoácido y tiene un peso molecular de aproximadamente 22 kDa. Se produce mediante la mayoría de células en el cuerpo, pero particularmente mediante fibroblastos en respuesta a una infección vírica u otro invasor biológico. El objetivo de unión de Interferón \beta es un receptor de superficie celular multimérico, que, luego de unión, activa una cascada de eventos intracelulares que conducen a la expresión de características antivíricas, antiproliferativas e inmunomoduladoras.

Se han utilizado una variedad de diferentes técnicas para caracterizar la estructura de interferón \beta humano. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido de interferón humano se ha reportado (ver Taniguchi, Gene 10:11-15, 1980), así como también estructuras de cristal para interferón \beta humano y de murino (ver respectivamente, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11813-11818, 1997. J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995). Tales datos estructurales también se han sometido a un artículo de revisión. (Ver, Cell Mol. Life Sci. 54:1203-1206, 1998.)

Las preparaciones de Interferón \beta se venden bajo los nombres comerciales BETASERON®, AVONEX^{TM}, y
REBIF®. También se conoce BETASERON ® como Interferón \beta-1_{b}, que es una proteína no glucosilada que tiene una eliminación de metionina de terminal N. El interferón \beta-1_{b} es una muteína en la que la cisterna en la posición 17 ha mutado a una serina. Esto se produce utilizando células bacterianas recombinantes. AVONEX^{TM} y REBIF®, que son diferentes formas comerciales de Interferón \beta-1_{a}, se glucosilan y se producen utilizando células de mamífero recombinantes. El Interferón \beta-1_{a} no contiene una mutación en la posición de aminoácido 17. Estos agentes se utilizan para tratar pacientes con esclerosis múltiple, y se han mostrado por ser efectivos en reducir la velocidad de exacerbación de la enfermedad.

El interferón \beta ha sido mostrado por retrasar la progresión de esclerosis múltiple y por ser efectivo en el tratamiento de una variedad de otras enfermedades. Su mecanismo de acción para retrasar la esclerosis múltiple no es claro. Algunas actividades que pueden actuar en relación para dar cuenta del efecto terapéutico del compuesto, sin embargo, incluyen los siguientes: el Interferón \beta tiene efectos inhibidores en la proliferación de leucocitos y la presentación de antígeno y puede modular el perfil de producción de citoquina hacia un fenotipo anti-inflamatorio; e, Interferón \beta, a través de la inhibición de metaloproteasas de matriz de célula T, puede reducir la migración de célula T. (Ver, Neurol. 51:682-689, 1998.) Otras enfermedades que pueden utilizar Interferón \beta para tratamiento incluyen osteosarcoma, carcinoma de célula basal, displasia cervical, glioma, leucemia mieloide agua, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, carcinoma de mama, melanoma, e infecciones víricas tal como virus de papiloma, hepatitis vírica, herpes genitalis, herpes zóster, queratitis herpética, herpes simplex, encefalitis vírica, neumonía citomegalovirus, y rinovirus.

Dada la importancia terapéutica del Interferón \beta, es crucial obtener preparaciones comerciales del polipéptido en una forma eficiente y económica. Los métodos recombinantes de la preparación de Interferón \beta producen cantidades sustanciales del compuesto, pero esta es solo la primera etapa. Después de producción, el Interferón \beta se puede aislar y purificar a un grado que es médicamente aceptable. Es un objetivo de la invención objeto tal purificación del polipéptido, y otros polipéptidos como este.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a la purificación y comercialización de Interferón-\beta que tiene valor terapéutico.

En un aspecto de un método de la invención, se proporciona un método para purificar Interferón \beta-1_{b} utilizando cromatografía de tamaño de exclusión en la presencia de un detergente iónico. En este método, se prepara una solución de amortiguación. La solución de amortiguación comprende más de 50 mM de sal y menos de 500 mM de sal. El Interferón \beta-1_{b} se carga en una columna de cromatografía de tamaño de exclusión. El Interferón \beta-1_{b} se carga preferiblemente en la columna utilizando la solución de amortiguación. Cuando el Interferón \beta-1_{b} se carga utilizando una solución de amortiguación, se puede preparar una mezcla que comprende Interferón \beta-1_{b} y la solución de amortiguación. El Interferón \beta-1_{b} se pasa a través de una columna que contiene un gel polimérico, y se recolectan las fracciones de elución que contienen interferón \beta-1_{b} purificado y solución de amortiguación. Durante la elución de Interferón \beta-1_{b}, se observa un perfil de elución y se determina un valor de asimetría del perfil de elución. Las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría de un perfil de elución está entre 0.1 y 2.0. Preferiblemente, las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.2 y 1.9, entre 0.3 y 1.8, 0.4 y 1.7, 0.4 y 1.6, y 0.5 y 1.5. Aún más preferiblemente, las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.8 y 1.2 o entre 0.9 y 1.1.

Cualquier cantidad deseada de Interferón \beta-1_{b} se purifica utilizando el método. Las cantidades típicas, sin embargo, son más de 1.0 g, 2.5 g, 5.0 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, o 300 g.

Este método proporciona el polipéptido purificado en donde la cantidad de un polipéptido contaminante (por ejemplo, una proteína anfitriona cuando el polipéptido deseado se produce recombinantemente) está presente en una concentración de menos de 1 \mug por 1 mg del polipéptido deseado. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido contaminante está presente en una concentración de menos de 500 ng por 1 mg del polipéptido deseado, menos de 250 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 100 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 75 ng por 1 mg del polipéptido deseado. Aún más preferiblemente, la cantidad de polipéptido contaminante está presente en una concentración de menos de 50 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 25 ng por 1 mg del polipéptido deseado, y 10 ng por 1 mg del polipéptido deseado.

El gel polimérico es de cualquier composición adecuada. Típicamente, el gel se selecciona de un grupo de geles que incluyen dextrano (es decir, SEPHADEX®), agarosa (es decir, SEPHAROSE®), y poliacrilamida (SEPHACRIL®). Un gel que se utiliza frecuentemente es Sephadex G75 SF, que es un gel con base en dextrano que tiene un diámetro de partícula seca de 10 a 40 \mum.

El volumen de la columna que contiene el gel polimérico es típicamente menos de 450 cm^{3}. Algunas veces, el volumen es menos de 400 cm^{3}, 350 cm^{3}, o 300 cm^{3}.

La sal de la solución de amortiguación puede ser cualquier sal útil en cromatografía de tamaño de exclusión. Las sales útiles en la invención incluyen sales de acetato, fosfato, pirofosfato, bicarbonato, carbonato, borato, citrato, formato, succinato, oxalato, tartarato, maleato, arseniato, histidina, MES, ADA, Pipes, tris, etilendiamina, BES, MOPS, TES, Hepes, trietanolamina, EPPS, tricina, glicilglicina, bicina, amoniaco, cloruro, sulfato, fluoruro, yoduro, bromuro, trifluoroacetato, y tricloroacetato. Típicamente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es mayor de 75 mM de sal y menor de 250 mM de sal, o más de 100 mM de sal y menos de 200 mM de sal, o aproximadamente 150 mM de sal. Preferiblemente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es alrededor, 50 mM de sal, 75 mM de sal, 100 mM de sal, 125 mM de sal, 150 mM de sal, 175 mM de sal, 200 mM de sal, 225 mM de sal, o 250 mM de sal. El pH de la solución de amortiguación puede ser cualquier pH útil en los polipéptidos terapéuticos purificantes en cromatografía de tamaño de exclusión. Típicamente, el pH de la solución de amortiguación está entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10. Preferiblemente, el pH está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 6 y 7, o entre 7 y 8.

La sal de la solución de amortiguación es algunas veces un acetato. Típicamente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación contiene más de 75 mM acetato y menos de 250 mM acetato, o más de 100 mM acetato y menos de 200 mM acetato, o aproximadamente 150 mM acetato. Preferiblemente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es alrededor, 50 mM acetato, 75 mM acetato, 100 mM acetato, 125 mM acetato, 150 mM acetato, 175 mM acetato, 200 mM acetato, 225 mM acetato, o 250 mM acetato. Se puede utilizar cualquier acetato adecuado, que incluye acetato de litio, acetato de sodio, acetato de potasio, y acetatos de aminas orgánicas protonados tal como tris, trietilamina, y piperidina.

La solución de amortiguación contiene un detergente iónico. Ejemplos de tales detergentes incluyen, sin limitación, dodecil sulfato de sodio (es decir, "SDS"), bromuro de amonio cetiltrimetilo, lisolecitina, desoxilisolecitina de éter, colato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, sulfonatos alquilo, arilsulfonatos alquilo, sulfonatos alquilo, arilsulfatos alquilo, sarcosidatos alquilo, alquilaminas catiónicas, aminas cuaternarias, y derivados alquilpiridinio. Cualquier sal soluble del detergente iónico se puede utilizar, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio. Cuando está presente, el detergente está típicamente en una concentración entre 0.05% en peso y 0.25% en peso. Algunas veces, este está presente en una concentración entre 0.075% en peso y 0.2% en peso, o a aproximadamente 0.1% en peso.

Algunas veces, la solución de amortiguación contiene un quelador de metal. Típicamente, se utiliza ácido etilenodiaminatetracético, pero se puede utilizar cualquier quelador adecuado de metal. Las concentraciones de quelador de metal dentro de la solución de amortiguación son típicamente entre 0.5 mM y 1.5 mM, 0.75 mM a 1.25 mM, o aproximadamente 1 mM.

La etapa de recolectar las fracciones de elución típicamente incluye observar un perfil de elución durante cromatografía de tamaño de exclusión. Cuando el Interferón \beta-1_{b} existe en la columna, su presencia en una fracción de elución se determina usualmente al observar la absorbancia óptima de las fracciones de elución a 280 nm: Los valores de absorbancia de cada una de las fracciones se utilizan para preparar un perfil de elución.

Se calcula un valor de asimetría del perfil de elución. El valor de asimetría es una relación de amplitud de la mitad de una cola de pico con una amplitud de una mitad delantera del pico medido en 10% de altura del pico. Las fracciones de elución que contienen Interferón \beta-1_{b} se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.4 y 1.6. Algunas veces las fracciones de elución que contienen Interferón \beta-1_{b} se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.5 y 1.5, 0.6 y 1.4, 0.7 y 1.3, 0.8 y 1.2, o 0.9 y 1.1.

Los métodos para monitorear la presencia de Interferón \beta-1_{b} en una fracción de elución incluyen, sin limitación, observar la absorbancia de la fracción de elución a A_{280}, mediciones de conductividad y análisis mediante SDS-PAGE.

Toma típicamente menos de 48 horas a la mezcla que comprende Interferón \beta-1_{b} pasar a través de la columna. Algunas veces, toma menos de 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, o 3 horas.

En otro método descrito aquí, se proporciona un método para purificar un polipéptido utilizando cromatografía de tamaño de exclusión. En este método, se prepara una solución de amortiguación. La solución de amortiguación incluye más de 50 mM de sal y menos de 500 mM de sal. El polipéptido se carga en cromatografía de columna de tamaño de exclusión. El polipéptido se carga preferiblemente en una columna utilizando la solución de amortiguación. Cuando el polipéptido se carga utilizando la solución de amortiguación, se puede preparar una mezcla que comprende el polipéptido y una solución de amortiguación. El polipéptido se pasa a través de una columna que contiene un gel polimérico, y se recolectan las fracciones de elución que contienen el polipéptido purificado y la solución de amortiguación. Durante la elución del polipéptido, se observa un perfil de elución y se determina un valor de asimetría del perfil de elución. Las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría de un perfil de elución está entre 0.1 y 2.0. Preferiblemente, las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.2 y 1.9, entre 0.3 y 1.8, 0.4 y 1.7, 0.4 y 1.6, y 0.5 y 1.5. Aún más preferiblemente, las fracciones de elución se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.8 y 1.2 o entre 0.9
y 1.1.

Ejemplos no limitantes de polipéptidos purificados mediante el método incluyen cualquier polipéptido terapéuticamente útil que incluye anticuerpos monoclonales, interferones (por ejemplo, IFN \beta, IFN \beta-1a, y IFN \beta-1b), interleuquinas (por ejemplo, IL-2), Filgrastina, y Epoyetina-\alpha.

Cualquier cantidad deseada de polipéptido Interferón se purifica utilizando el método. Las cantidades típicas, sin embargo, son más de 1.0 g, 2.5 g, 5.0 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, o 300 g.

Este método proporciona el polipéptido purificado en donde la cantidad de un polipéptido contaminante (por ejemplo, Proteína E. coli cuando IFN \beta-1_{b} se produce recombinantemente) está presente en una concentración de menos de 1 \mug por 1 mg del polipéptido deseado. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido contaminante está presente en una concentración de menos de 500 ng por 1 mg del polipéptido deseado, menos de 250 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 100 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 75 ng por 1 mg del polipéptido deseado. Aún más preferiblemente, la cantidad de polipéptido contaminante está presente en una concentración de menos de 50 ng por 1 mg del polipéptido deseado, 25 ng por 1 mg del polipéptido deseado, y 10 ng por 1 mg del polipéptido deseado.

El gel polimérico es de cualquier composición adecuada. Típicamente, el gel se selecciona de un grupo de geles que incluyen dextrano (es decir, SEPHADEX®), agarosa (es decir, SEPHAROSE®), y poliacrilamida (SEPHACRIL®). Un gel que se utiliza algunas veces es Sephadex G75 SF, que es un gel con base en dextrano que tiene un diámetro de partícula seca de 10 a 40 \mum.

La sal de la solución de amortiguación puede ser cualquier sal útil en cromatografía de tamaño de exclusión. Las sales útiles en la invención incluyen sales de acetato, fosfato, pirofosfato, bicarbonato, carbonato, borato, citrato, formato, succinato, oxalato, tartarato, maleato, arseniato, histidina, MES, ADA, Pipes, tris, etilendiamina, BES, MOPS, TES, Hepes, trietanolamina, EPPS, tricina, glicilglicina, bicina, amoniaco, cloruro, sulfato, fluoruro, yoduro, bromuro, trifluoroacetato, y tricloroacetato. Típicamente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es mayor de 75 mM de sal y menos de 250 mM de sal, o más de 100 mM de sal y menos de 200 mM de sal, o aproximadamente 150 mM de sal. Preferiblemente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es alrededor, 50 mM de sal, 75 mM de sal, 100 mM de sal, 125 mM de sal, 150 mM de sal, 175 mM de sal, 200 mM de sal, 225 mM de sal, o 250 mM de sal. Típicamente, el pH de la solución de amortiguación está entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10. Preferiblemente, el pH está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 9, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7, entre aproximadamente 6 y 7, o entre 7 y 8.

La sal de la solución de amortiguación es algunas veces un acetato. Típicamente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación contiene más de 75 mM acetato y menos de 250 mM acetato, o más de 100 mM acetato y menos de 200 mM acetato, o aproximadamente 150 mM acetato. Preferiblemente, la resistencia iónica de la solución de amortiguación es alrededor 50 mM acetato, 75 mM acetato, 100 mM acetato, 125 mM acetato, 150 mM acetato, 175 mM acetato, 200 mM acetato, 225 mM acetato, o 250 mM acetato. Cualquier acetato adecuado se puede utilizar, que incluye acetato de litio, acetato de sodio, y acetatos de aminas orgánicas protonados tal como tris-acetato, trietilamina, y piperidina.

Típicamente, la solución de amortiguación contiene un detergente iónico. Ejemplos de tales detergentes incluyen, sin limitación, dodecilsulfato (es decir, "SDS"), bromuro de amonio cetiltrimetilo, lisolecitina, desoxilisolecitina de éter, colato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, sulfonatos alquilo, arilsulfonatos alquilo, sulfonatos alquilo, arilsulfatos alquilo, sarcosidatos alquilo, alquilaminas catiónicas, aminas cuaternarias, y derivados alquilpiridinio. Cualquier sal soluble del detergente iónico se puede utilizar, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio. Cuando está presente, el detergente es típicamente en una concentración entre 0.05% en peso y 0.25% en peso. Algunas veces, está presente en una concentración entre 0.075% en peso y 0.2% en peso, o a aproximadamente 0.1% en peso.

Algunas veces, la solución de amortiguación contiene un quelador de metal. Típicamente, se utiliza ácido etilenodiaminatetracético, pero cualquier quelador adecuado de metal se puede utilizar. Las concentraciones de quelador de metal dentro de la solución de amortiguación son típicamente entre 0.5 mM y 1.5 mM, 0.75 mM a 1.25 mM, o aproximadamente 1 mM.

La etapa de recolectar las fracciones de elución típicamente incluye observar un perfil de elución durante cromatografía de tamaño de exclusión. Cuando el polipéptido existe en la columna, esta presencia en una fracción de elución se determina usualmente al observar la absorbancia óptica de las fracciones de elución a 280 nm. Los valores de absorbancia de cada una de las fracciones se utilizan para preparar un perfil de elución.

Un valor de asimetría del perfil de elución se calcula. El valor de asimetría es una relación de una amplitud de la mitad de una cola de pico con una amplitud de una mitad delantera del pico medido en 10% de la altura del pico. Las fracciones de elución que contiene el polipéptido se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.4 y 1.6. Algunas veces las fracciones de elución que contiene el polipéptido se recolectan cuando el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.5 y 1.5, 0.6 y 1.4, 0.7 y 1.3,0.8 y 1.2, o 0.9 y 1.1.

Los métodos para monitorear la presencia del polipéptido en una fracción de elución incluyen, sin limitación, observar la absorbancia de la fracción de elución a A_{280}, las mediciones de conductividad, y análisis mediante SDS-PAGE.

Típicamente toma menos de 48 horas a la mezcla que comprende el polipéptido pasar a través de la columna. Algunas veces, toma menos de 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, o 3 horas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra un método para purificar polipéptidos utilizando el método de la presente invención a través del uso de un diagrama de flujo.

La Figura 2 ilustra un método para purificar Interferón \beta-1_{b} utilizando el método de la presente invención a través del uso de un diagrama de flujo.

La Figura 3 ilustra un cromatograma y SDS-PAGE de separación de Interferón \beta-1_{b} utilizando una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 150 mM acetato de sodio y 0.1% SDS. La línea horizontal muestra las mediciones de conductividad de las fracciones de elución. El histograma muestra las fracciones de elución donde las impurezas eluyen de la columna.

La Figura 4 ilustra un cromatograma y SDS-PAGE de separación de Interferón \beta-1_{b} utilizando una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 50 mM acetato de sodio y 0.1% SDS. La línea horizontal muestra las mediciones de conductividad de las fracciones de elución. El histograma muestra las fracciones de elución donde las impurezas eluyen de la columna.

La Figura 5 ilustra varios cromatogramas de separación de Interferón \beta-1_{b} utilizando una columna Sephadex G-75 de 50 cm con una solución de amortiguación que contiene cinco concentraciones diferentes de acetato de sodio (50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM y 250 mM) en una velocidad de flujo lineal de 1.1 cm/hr.

La Figura 6 ilustra un método para comercializar un polipéptido como se destaca en un diagrama de flujo.

La Figura 7 ilustra un cromatograma y SDS-PAGE de separación de Interferón \beta-1_{b} de la proteína E. coli utilizando una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 50 mM acetato de sodio y 0.1% SDS. La línea horizontal muestra las mediciones de conductividad de las fracciones de elución. El histograma muestra las fracciones de elución donde las impurezas eluyen de la columna.

La Figura 8 ilustra dos cromatogramas de separación de Interferón \beta-1_{b}. El cromatograma superior muestra el uso de una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 50 mM acetato de sodio y 0.1% SDS. El cromatograma de fondo muestra el uso de una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 10 mM acetato de sodio y 0.1% SDS.

La Figura 9 ilustra dos cromatogramas de separación de Interferón \beta-1_{b}. El cromatograma superior muestra el uso de una solución de amortiguación que contiene 50 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA, y 0.1% SDS en un pH de 5.5. El cromatograma de fondo muestra el uso de una solución de amortiguación que contiene 10 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA, y 0.25% SDS en un pH de 5.5.

La Figura 10 ilustra dos cromatogramas de separación de Interferón \beta-1_{b}. El cromatograma superior muestra el uso de una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 150 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA, y 0.1% SDS a pH 5.5. El cromatograma de fondo muestra el uso de una columna Sephadex G-75 de 50 cm con una solución de amortiguación que contiene 150 mM acetato de sodio, 1 mM EDTA, y 0.1% SDS a pH 5.5.

La Figura 11 ilustra varios cromatogramas de separación de Interferón \beta-1_{b} utilizando una columna Sephadex G-75 de 50 cm con una solución de amortiguación que contiene cinco concentraciones diferentes de acetato de sodio (50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM y 250 mM) en una velocidad de flujo lineal de 3.3 cm/hr.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención se dirige a la purificación y comercialización de polipéptidos terapéuticos.

Definiciones

"Acetato" se refiere a la sal aniónica de ácido acético.

"Anticuerpo" se refiere a una proteína o proteínas producidas por ciertos glóbulos blancos cuando se expone a sustancias forasteras.

"Solución de amortiguación" se refiere a una solución acuosa en un pH definido.

"Columna" se refiere a una cubierta para soportes sólidos utilizados en cromatografía. Las columnas son típicamente cilíndricas y se orientan en una posición hacia arriba vertical.

"Comercializar" se refiere a desarrollar un negocio o modelo de negocios que involucra ventas y distribución de un producto particular.

"Detergente" se refiere a un compuesto que tiene parte hidrófoba no polar, y parte hidrófila polar. Ejemplos de detergentes iónicos incluyen, sin limitación, dodecil sulfato de sodio (es decir, "SDS"), bromuro de amonio cetiltrimetilo, lisolecitina, desoxilisolecitina de éter, colato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, sulfonatos alquilo, arilsulfonatos alquilo, sulfonatos alquilo, arilsulfatos alquilo, sarcosidatos alquilo, alquilaminas catiónicas, aminas cuaternarias, y derivados alquilpiridinio.

"Diámetro de partícula seca" se refiere al rango de diámetros de gel poliméricos en la ausencia de una solución de amortiguación.

"Perfil de elución" se refiere a una gráfica hecha para mostrar cuanto material se lleva a cabo de una columna mediante la solución de amortiguación durante cromatografía de tamaño de exclusión durante el tiempo. La gráfica puede mostrar un número de diferentes picos; cada pico representa un material diferente separado de la sustancia de mezcla original.

"Epoyetina-\alpha" se refiere a un polipéptido de 165 aminoácidos que tiene los mismos efectos biológicos como eritropoyetina. Este se vende bajo el nombre comercial de EPOGEN®.

"Filgrastima" se refiere a un factor que estimula la colonia de granulocito humana (G-CSF). Este se vende bajo el nombre comercial de NEUPOGEN®.

"Interferón" se refiere a cualquiera de varios polipéptidos que ayudan al cuerpo a luchar contra infecciones víricas. Durante una invasión vírica, las células infectadas producen tres tipos de interferón \alpha, \beta y y que circula en al torrente sanguíneo y ayuda a hacer inmunes al ataque a las células no infectadas.

"Interferón \beta-1_{b}" se refiere a un interferón que tiene 165 aminoácidos y un peso molecular aproximado de 18,500 daltons. Este se fabrica típicamente mediante fermentación celular o cultivo de tejido de un plásmido construido por ingeniería genética que contiene el gen para interferón humano beta_{ser17}.

"Interleuquina" se refiere a cualquiera de un grupo de factores de proteína que se producen mediante linfocitos T y macrófagos en la presencia de antígenos o mitógenos. Ellos provocan que se activen y proliferen los linfocitos T.

"Interleuquina-2" se refiere a un factor de proteína que se produce mediante linfocitos T que se han activado mediante un antígeno. La Interleuquina-2 estimula otros linfocitos T para activar y diferenciar independiente de qué antígeno específico esté involucrado. La Interleuquina-2 se conoce por estar involucrada en alcanzar inmunidad mediada por célula T.

"Resistencia iónica,"\mu, se define como:

1

c_{i} es la concentración de cada ión en la solución y Z es la carga de cada ión en la solución. Como un ejemplo: una solución de 0.1 M de Na_{2}SO_{4} tiene una resistencia iónica de:

2

En un amortiguador tal como amortiguador de acetato de sodio, solo la parte de acetato de sodio contribuye a la resistencia iónica debido a que el ácido acético no tiene carga (Z=0). A pH 5.5 y utilizando el pKa = 4.8 a 25ºC para ácido acético, calculamos que aproximadamente 80% de la concentración de amortiguador de acetato total está presente en su forma de sal. La tabla adelante indica la resistencia iónica de las varias concentraciones de amortiguadores de acetato en pH 5.5.

3

"Quelador de metal" se refiere a un químico orgánico que une con y remueve los iones de metal libres de la solución. Un ejemplo no limitante de un quelador de metal es ácido etilenodiamina-tetraacético.

"Anticuerpo Monoclonal" se refiere a un anticuerpo producido por un único clon de células B. Los anticuerpos monoclonales consisten de una población de moléculas de anticuerpo idénticas todas específicas para un único determinante antigénico.

"Ruta Natural de Producción" se refiere al uso de maquinaria celular para producir un compuesto particular. Un ejemplo de esta forma de producción es el uso de técnicas de ADN recombinante para formar un plásmido construido con ingeniería genética que produce un compuesto objetivo.

"Empacar" se refiere a colocar un producto en un recipiente para presentación a un consumidor.

"Pico" se refiere a una deflexión positiva de valores iniciales en un perfil de elución.

"Asimetría de Pico" se refiere a una relación de amplitud de la mitad de una cola de un pico con una amplitud de una mitad delantera del pico medido en 10% de la altura del pico. La asimetría perfecta corresponde a un valor de asimetría de pico 1.0.

"Polipéptido" se refiere a una cadena de péptidos o aminoácidos, en donde la cadena es mayor de 2 aminoácidos de longitud.

"Gel Polimérico" se refiere a un polímero reticulado de tal forma que se forma una red de gel. Ejemplos de geles poliméricos adecuados para cromatografía de tamaño de exclusión incluyen, sin limitación, dextrano (es decir, SEPHADEX®), agarosa (es decir, SEPHAROSE ®), y poliacrilamida (es decir, SEPHACRIL®). Los geles poliméricos tal como Sephadex G75 SF, un gel polimérico preferido, están disponibles comercialmente de una variedad de vendedores.

\newpage

"Proteína" se refiere a una molécula grande compuesto de una o más cadenas de aminoácido en un orden específico. El orden se determina mediante una secuencia base de nucleótidos en un gen que codifica a la proteína. Se requieren proteínas para la estructura, función, y regulación de las células del cuerpo, tejidos y órganos, y cada proteína tiene una única función. Ejemplos de proteínas incluyen, sin limitación, hormonas, enzimas, y anticuerpos.

"Purificado" se refiere al incremento en la concentración de un primer componente en una mezcla con relación a otros componentes en la mezcla. Típicamente, después de purificación, la concentración del primer componente en la mezcla se incrementa en más de 50% en peso. Preferiblemente, la concentración se incremente en más de 60, 70, 80, 90, 95, o 99% en peso.

"SDS-PAGE" se refiere a una técnica de laboratorio bien conocida llamada electrofóresis de gel poliacrilamida dodecil sulfato de sodio. La técnica es típicamente un método analítico utilizado para separar polipéptidos.

"Venta y Distribución" se refieren a la disposición comercial de un producto.

"Cromatografía de tamaño de exclusión" se refiere a un tipo de cromatografía que utiliza partículas porosas para separar moléculas de diferentes tamaños. Esto se utiliza frecuentemente para separar moléculas biológicas y para determinar pesos moleculares y distribuciones de peso molecular de polímeros. Las moléculas que son más pequeñas que el tamaño de poro pueden ingresar partículas y por lo tanto tienen una ruta más larga y mayor tiempo de tránsito (tiempo de retención) que las moléculas más grandes que no pueden ingresar las partículas.

"Ruta Sintética de Producción" se refiere a la producción de un compuesto utilizando reacciones químicas conducidas in vitro. Un ejemplo sería la síntesis de fase sólida de un polipéptido utilizando una resina.

Purificación General de Polipéptido

El método de la presente invención, en un aspecto, se utiliza para purificar polipéptidos. Ejemplos de aquellos polipéptidos que se pueden purificar incluyen, sin limitación, proteínas tal como anticuerpos monoclonales, interferones (por ejemplo, IFN \beta, IFN \beta-1_{a}, y IFN \beta -1_{b}), interleuquinas (por ejemplo, IL-2), Filgrastina, y Epoyetina-\alpha. El método se utiliza para purificar cualquier cantidad deseada de polipéptido, pero son típicas cantidades de más de 1.0 g, 2.5 g, 5.0 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, o 300 g.

La cromatografía de tamaño de exclusión es la técnica principal utilizada en el método objeto, que se describe en relación a la Figura 1. El método 100 inicia con la carga de una columna (por ejemplo, 2.6 x 90 cm o 2.6 x 50 cm) con un gel polimérico (100). El gel polimérico es de cualquier composición adecuada. Ejemplos no limitantes de geles poliméricos incluyen dextrano (es decir, SEPHADEX®), agarosa (es decir, SEPHAROSE®), y poliacrilamida (es decir, SEPHACRIL®). El Sephadex G75 SF, que tiene un diámetro de partícula seca de 10 a 40 \mum, es un tipo específico de gel polimérico utilizado.

Una solución de amortiguación con un pH entre 5.0 y 6.0 se prepara a 102, que sirve como el eluyente cromatográfico. La solución típicamente incluye más de 75 mM de acetato y menos de 500 mM de acetato. Los acetatos adecuados incluyen, sin limitación, acetato de litio, acetato de sodio, y acetatos de aminas orgánicas protonados tal como tris, trietilamina, y piperidina.

Los componentes opcionales del sistema de amortiguación incluyen un detergente iónico y un quelador de metal. Ejemplos no limitantes de detergente iónicos incluyen dodecil sulfato de sodio (es decir, "SDS"), bromuro de amonio cetiltrimetilo, lisolecitina, desoxilisolecitina de éter, colato de sodio, taurodesoxicolato de sodio, sulfonatos alquilo, arilsulfonatos alquilo, sulfonatos alquilo, arilsulfatos alquilo, sarcosidatos alquilo, alquilaminas catiónicas, aminas cuaternarias, y derivados alquilpiridinio. El detergente, cuando se utiliza, típicamente está presente en la solución de amortiguación en una concentración entre 0.05% en peso y 0.25% en peso. Cualquier quelador de metal adecuado se puede utilizar, con ácido etilenodiaminatetracético (es decir, "EDTA") que es un ejemplo. El quelador de metal típicamente está presente en la solución de amortiguación en una concentración entre 0.5 mM y 1.5 mM.

En 103, la columna se equilibra con una solución de amortiguación. El polipéptido, que se concentra, se carga en la columna (104), y una velocidad de flujo lineal adecuada para la columna se establece a 105. Las velocidades de flujo lineales utilizadas para la cromatografía de tamaño de exclusión son algunas veces entre 0.8 cm/hr y 5 cm/hr, con valores típicos que son 1.1 cm/hr y 3.3 cm/hr.

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La purificación del polipéptido se monitorea (106) a través de observación del perfil de elusión de la columna. Los picos en la gráfica de perfil de elución se identifican como el polipéptido deseado o una impureza. Los métodos para monitorear la presencia del polipéptido incluyen, sin limitación, observar los perfiles de absorbancia de las fracciones de elución a A_{280}, la conductividad de la solución, y desarrollar geles utilizando una alícuota de la columna eluada cuando se compara con una muestra de polipéptido pura, estándar.

El polipéptido objetivo se recolecta de las fracciones de elución cuando el perfil de elución exhibe un valor de asimetría entre 0.2 y 1.8. Algunas veces, el valor de asimetría será entre 0.3 y 1.7, 0.4 y 1.6, 0.5 y 1.5, 0.6 y 1.4, 0.7 y 1.3, 0.8 y 1.2, o 0.9 y 1.1.

Las fracciones de elución que contienen el polipéptido purificado en la solución de amortiguación se recolectan (107) durante un periodo particular. Los componentes de la solución no amortiguadora de las fracciones contienen usualmente por lo menos 50% en peso del polipéptido objetivo. Algunas veces, sin embargo, los componentes de la solución no amortiguadora contienen por lo menos 60, 70, 80, 90, 95, o 99% en peso del polipéptido objetivo. Las fracciones se recolectan en menos de 48 horas después que polipéptido se carga en la columna de exclusión de tamaño. Algunas veces, las fracciones se recolectan menos de 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 o 3 horas después que el polipéptido se carga en la columna.

En 108, el polipéptido se concentra opcionalmente de las fracciones. El polipéptido purificado se proporciona de acuerdo con lo anterior.

Purificación de Interferón \beta-1_{b}

El método de la presente invención, en otro aspecto, se utiliza para la purificación de Interferón \beta-1_{b}. Se describe la cromatografía de tamaño de exclusión cuando se aplica a IFN \beta-1_{b} en relación con la Figura 2, que se dirige a una realización.

El método 200 inicia con la carga de una columna de cromatografía de tamaño de exclusión (por ejemplo, 2.6 x 90 cm o 2.6 x 50 cm) con un gel polimérico de composición adecuada (100). Como se muestra, se carga Sephadex G75 SF. El volumen de columna que contiene el gel polimérico es típicamente menos de 500 cm^{3}. Algunas veces el volumen es menos de 450 cm^{3}, 400 cm^{3}, 350 cm^{3}, o 300 cm^{3}. El método se utiliza para purificar cualquier cantidad deseada de Interferón \beta-1_{b}, pero son típicas cantidades más de 1.0 g, 2.5 g, 5.0 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 150 g, 200 g, 250 g, o 300 g.

Una solución de amortiguación con un pH entre 5.0 y 6.0 se prepara a 202, que sirve como el eluyente de cromatografía. Algunas veces, el pH de la solución de amortiguación está entre 5.2 y 5.8 o es aproximadamente 5.5. La solución típicamente incluye más de 75 mM acetato y menos de 500 mM acetato. Otras concentraciones adecuadas, incluyen, sin limitación, 100 mM a 225 mM, 100 mM a 200 mM, y aproximadamente 150 mM. La etapa 202 muestra el uso de 150 mM acetato, que es algunas veces acetato de sodio.

Los componentes opcionales del sistema amortiguante incluyen un detergente iónico y un quelador de metal. Algunas veces se selecciona dodecil sulfato de sodio (es decir, "SDS") como el detergente y se incluye típicamente en una concentración entre 0.05% en peso y 0.25% en peso. Otras concentraciones aceptables incluyen, sin limitación, 0.075% en peso a 0.2% en peso y aproximadamente 0.1% en peso. Se utiliza comúnmente ácido etilenodiamina-tetraacético (es decir, "EDTA") que es un quelador de metal. Las concentraciones de EDTA en la solución de amortiguación están algunas veces entre 0.5 mM y 1.5 mM, que son típicas con concentraciones de 0.75 mM a 1.25 mM o aproximadamente 1 mM.

La columna se equilibra con una solución de amortiguación a 203. El Interferón \beta-1_{b} concentrado se carga en la columna (204), asegurando que la carga no es generalmente más de 1% de volumen de la columna. Se establece una velocidad de flujo lineal de la columna (205). Las velocidades de flujo lineales para la cromatografía de exclusión de tamaño son algunas veces entre 0,8 cm/hr y 5 cm/hr, con valores típicos que son aproximadamente 1.1 cm/hr y 3.3 cm/hr.

Se monitorea la purificación de interferón \beta-1_{b} (206) a través de la observación del perfil de elusión de columna. Los picos en la gráfica de perfil de elución se identifican con Interferón \beta-1_{b} o una impureza. Los métodos para monitorear la presencia de Interferón \beta-1_{b} incluyen, sin limitación, observar los perfiles de absorbancia de la fracción de elución A_{280}, las mediciones de conductividad, y análisis mediante SDS-PAGE. Los contaminantes de proteína E. coli se pueden cuantificar mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima).

El Interferón \beta-1_{b} se recolecta de las fracciones de elución cuando el perfil de elución exhibe un valor de asimetría entre 0.2 y 1.8. Algunas veces, el valor de asimetría estará entre 0.3 y 1.7, 0.4 y 1.6, 0.5 y 1.5, 0.6 y 1.4, 0.7 y 1.3, 0.8 y 1.2, o 0.9 y 1.1. Un pico correspondiente al Interferón \beta-1_{b} exhibe un valor de asimetría entre 0.4 y 1.6. Algunas veces, el valor de asimetría estará entre 0.5 y 1.5, 0.6 y 1.4, 0.7 y 1.3, 0.8 y 1.2, o 0.9 y 1.1.

Se recolectan fracciones de Interferón \beta-1_{b} purificado en solución de amortiguación (207) durante un periodo particular. Los componentes de la solución no amortiguadora de las fracciones contienen usualmente por lo menos 70% en peso del polipéptido objetivo. Algunas veces, sin embargo, los componentes de la solución no amortiguadora contienen por lo menos 80, 90, 95, o 99% en peso del polipéptido objetivo. Las fracciones se recolectan menos de 48 horas después que el polipéptido se carga en la columna de exclusión de tamaño. Algunas veces, las fracciones se recolectan menos de 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, o 3 horas después que el polipéptido se carga en la columna. El Interferón \beta-1_{b} purificado se concentra opcionalmente de las fracciones a 208.

La Figura 3 ilustra un cromatograma y un SDS-PAGE de separación de Interferón \beta-1_{b} utilizando una columna Sephadex G-75 de 90 cm con una solución de amortiguación que contiene 150 mM acetato de sodio y 0.1% SDS. Una comparación con la Figura 4 (50 mM acetato de sodio) muestra como un cambio en la concentración de acetato puede afectar la purificación Interferón \beta-1_{b}. El pico 301 de la Figura 3, que corresponde a Interferón \beta-1_{b}, se resuelve claramente del pico amplio 302, que representa los contaminantes E. Coli. El pico 402 de la Figura 4, que también corresponde a los contaminantes E. Coli, sin embargo, se fusiona con el pico 401 de Interferón \beta-1_{b}. En otras palabras, la separación (es decir, purificación) que se muestra en la Figura 4 es significativamente peor que aquella mostrada en la Figura 3.

El efecto de la concentración de acetato en la resolución de Interferón \beta-1_{b} se ve adicionalmente en referencia a la Figura 5. Esta figura muestra los perfiles de elusión de cromatografía de tamaño de exclusión de Interferón \beta-1_{b} puro en 5 diferentes concentraciones de acetato. Procediendo de 50 mM de acetato a 100 mM de acetato, uno ve que el pico exhibido llega a ser más simétrico. El pico simétrico, que típicamente corresponde con la resolución del compuesto, llega a ser aún mejor a 150 mM y luego declina cuando se emplean concentraciones mayores de acetato (200 mM y 250 mM).

Las Tablas 1 y 2 muestran estudios que comparan la asimetría de pico de Interferón \beta-1_{b} a la concentración de acetato de sodio en dos diferentes velocidades de flujo. Los valores en la tabla 1 se miden utilizando Unicorn 4.10, un sistema de cromatografía disponible comercialmente de GE Healthcare.

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TABLA 1 Peso de columna 49 cm, columna V_{0} 86.7 ml; flujo 1.1 cm/hr

4

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TABLA 2 Peso de columna 49 cm, columna V_{0} 86.7 ml; flujo 3.3 cm/hr

5

Comercialización de Polipéptido

El método de la presente descripción, en otro aspecto, se relaciona con la comercialización de un polipéptido. Este aspecto se describe en relación a la Figura 6.

El método 600 empieza con identificar un polipéptido que se puede utilizar para tratar una enfermedad en 601. Ejemplos de tales polipéptidos incluyen, sin limitación, anticuerpos monoclonales, interferones (por ejemplo, IFN \beta, IFN \beta-1_{a}, y IFN \beta-1_{b}), interleuquinas (por ejemplo, IL-2), Filgrastina, y Epoyetina-\alpha. Cualquier método adecuado se puede utilizar para identificar el polipéptido. Tal un método, sin embargo, algunas veces incluirá un análisis de datos de ventas Europeas o Estadounidenses para un polipéptido particular o un pronóstico de mercado que predice ventas futuras.

En 602, se produce el polipéptido. La producción se lleva a cabo utilizando una ruta sintética o natural. La cromatografía de tamaño de exclusión se utiliza para aislar el polipéptido. Los métodos adecuados de cromatografía de tamaño de exclusión utilizados en la etapa 602 incluyen los métodos descritos anteriormente en las secciones tituladas Purificación de Polipéptido General y Purificación de Interferón \beta-1_{b}.

El polipéptido se empaca en 604 en un recipiente para presentación a un consumidor. Ejemplos de consumidores incluyen, sin limitación, grupos de atención médica, enfermerías, médicos y pacientes. La venta y distribución del producto empacado se desarrolla en 605.

Con el fin que la invención y sus ventajas se entiendan más completamente, se proporcionan los siguientes ejemplos como un medio de ilustración pero no en una forma considerada como una limitación en el alcance de la presente invención.

Sección Experimental Ejemplo 1 Método General para Cromatografía de tamaño de exclusión de Polipéptidos

Una columna (por ejemplo, 2.6 x 90 cm o 2.6 x 50 cm) se empaca con un gel polimérico apropiado. Se desarrolla equilibrio de columna con una solución de amortiguación. La solución de amortiguación es una solución acuosa que contiene típicamente 75 a 250 mM acetato de sodio, 0.1% SDS, y 1 mM ácido etilenodiaminatetracético a pH 5.5. La columna se carga con polipéptido concentrado (por ejemplo, Interferón \beta-1, anticuerpo monoclonal, Interleuquina-2, Filgrastima, Epoyetina-\alpha), haciendo segura la carga que no es más de 1% del volumen de columna. La carga de velocidad de flujo lineal y la elución del polipéptido se establece a aproximadamente 1 cm/hr. La separación cromatográfica se sigue por la espectroscopia UV-VIS a A_{280} o conductividad. Se analizan las fracciones seleccionadas mediante SDS-PAGE en 15% de geles (Criterion, Bio-Rad) con teñido de plata y los contaminantes de Proteína E. coli cuantificados por ELISA (cortesía de QC). Las fracciones de elución se recolectan y se concentran para proporcionar el polipéptido purificado.

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Ejemplo 2 Purificación de Interferón \beta-1_{b} Utilizando Cromatografía de Tamaño de Exclusión

Se desarrollan los siguientes procedimientos a temperatura ambiente. Se empaca una columna 2.6 x 50 cm o a 2.6 x 90 cm con Sephadex G75 SF. Se desarrolla equilibrio de columna con una solución de amortiguación acuosa a pH 5.5 que contiene los siguientes componentes: 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, o 250 mM acetato de sodio. La solución de amortiguación también comprende 0.1% SDS, o 0.25% SDS y 1 mM ácido etilenodiaminatetracético. Las columnas se cargan con Interferón \beta-1_{b} concentrado, haciendo segura la carga no es más de 1% del volumen de columna. La velocidad de flujo lineal para carga y la elución del polipéptido se establecen a aproximadamente 1 cm/hr o 3.3 cm/hr. Se observa separación cromatográfica mediante la absorbancia de polipéptido a A_{280} y conductividad. Se analizan fracciones seleccionadas mediante SDS-PAGE en 15% de geles (Criterion, Bio-Rad) con teñido de plata y los contaminantes de Proteína E. coli cuantificados por ELISA (cortesía de QC). Se recolectan fracciones puras y se concentran para proporcionar el polipéptido purificado.

Los resultados de purificación se muestran en las figuras 7-11.

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Ejemplo 3 Discusión de efecto de resistencia iónica en cromatografía de tamaño de exclusión en la presencia de detergentes

En detergentes iónicos a bajas concentraciones existe como monómeros, hasta que la concentración alcanza un valor conocido como la Concentración de Micelas Crítica (CMC) donde coexisten los monómeros con una forma agregada de detergente conocido como Micelas (Helenius et. al. 1979). El CMC se define como la concentración de monómero máxima que puede coexistir con micelas. La siguiente ecuación describe el comportamiento del monómero y micelas:

Micelas <=> Monómero

Esta ecuación no es una ecuación de equilibrio químico verdadero; si la concentración total de detergente se incrementa por encima del CMC, la cantidad de detergente de monómero permanece igual (CMC) pero la cantidad de detergente en Micelas se incrementa.

Las Micelas en soluciones acuosas son normalmente estructuras con la cola hidrófoba del monómero de detergente que interactúa con la cola hidrófoba de otros monómeros que forman una estructura similar a gota de aceite. El grupo funcional iónico del detergente se orienta a la fase externa de esta microgota de aceite, que interactúa con el disolvente acuoso y protege el grupo funcional hidrófobo de la micela de la fase acuosa. La repulsión de las cargas del grupo funcional iónico del detergente limita la estabilidad y el tamaño de la micela.

El número de moléculas de monómero de detergente iónico por micela, y por lo tanto, el tamaño de los Micelas iónicos, es una función de la resistencia iónica.

Incrementar la resistencia iónica de la solución en contacto con los Micelas reduce la repulsión de la carga entre los grupos funcionales iónicos de las moléculas de detergente en las Micelas que producen una estabilización de las micelas. Un incremento en la resistencia iónica incrementa el número de monómero de detergente en una micela y por lo
tanto incrementa el tamaño de la micela. Adicionalmente, el CMC se reduce con el incremento de la resistencia iónica.

Cuando una proteína se expone a detergentes iónicos la siguiente ecuación aplica:

Micelas <=> Monómero + Proteína <=> Proteína-Micelas

Un modelo para la unión de detergentes iónicos a proteínas se ha establecido con un modelo de proteína como BSA y un modelo de detergente tal como SDS (Turro et. al. 1995). La unión de SDS monomérico a proteína se puede describir en las etapas. En la fase de unión a detergente inicial, un número pequeño de moléculas de detergente se unen con muy alta afinidad a sitios seleccionados en la proteína. En la fase no plegada, existe una unión cooperativa de los monómeros SDS a la proteína que expone nuevos sitios de unión de detergente, y finalmente una proteína de fase de saturación, donde la proteína alcanza la unión máxima de detergente. Partiendo de la fase no plegada las moléculas de SDS empiezan agregarse, creando mini-micelas, de nuevo con el grupo funcional de detergente cargado que enfrenta la fase exterior, y las colas hidrófobas que interactúan con cada una crean de nuevo una microgota de aceite. La proteína se envuelve alrededor de las mini-Micelas cargadas creando una "estructura de glóbulo y collar".

Efecto de la resistencia iónica en Proteína-(mini-micelas)_{x}

Observamos un incremento continuo evidente en el tamaño del complejo IFN-SDS con el incremento de la concentración de acetato durante cromatografía Sephadex G75 SF en la presencia de 0.1% SDS. El incremento de tamaño evidente del complejo IFN-SDS se detecta mediante la reducción en el parámetro IFN Kav con el incremento de la concentración de acetato.

Antes que se proporciona la definición de Kav, se discuten las diferentes fases en la columna de filtración de gel. El volumen total de la columna (Vt) es la suma del volumen de los glóbulos de resina (Vb) más el volumen entre los glóbulos (volumen Vo o Vacío); el volumen de los glóbulos de resina es la suma del volumen de resina interno (Vi) más el volumen del gel (Vg). El Vo es una constante en las resinas Sefadex de 30% de Vt. Por lo tanto, el Vt se define como:

V_{t} = V_{o} + V_{b} = V_{o} + V_{i} + V_{g}

El K_{av} se define como:

K_{av} = (V_{e} - V_{o})/(V_{t} - V_{o})

Ve es el volumen de elusión del complejo IFN-SDS.

El término (Ve - Vo) es una medición de cuanto volumen interno de la resina es accesible al complejo IFN-SDS; si el complejo es muy grande para penetrar los poros de la resina el complejo eluará en el Vo (Ve = Vo) y el Kav = 0.

El término (Vt - Vo) es el volumen de glóbulo de resina total, por lo tanto Kav es una relación de cuanta molécula puede particionar con el volumen interno de los glóbulos. Entre más grande es la molécula más pequeño es el Kav.

Existen dos mecanismos propuestos para el efecto observado de resistencia iónica del Kav y el volumen de elusión (Ve) del complejo IFN-SDS en cromatografía de tamaño de exclusión.

Incremento en el tamaño de la micela SDS. El tamaño de los Micelas de detergente iónico se incrementa con la resistencia iónica como se describió anteriormente. Las micelas más grandes pueden llenar más volumen en el volumen interno del glóbulo de resina (Vi), por lo tanto puede reducir el volumen de glóbulo interno disponible para el complejo de Proteína-SDS. El efecto neto en el complejo de Proteína-SDS resultaría en volumen de elusión más pequeño (V_{e}) y una reducción en la partición del complejo de Proteína-SDS dentro del glóbulo (reducción de K_{av}). 1B) Es posible que la alta densidad de las cargas negativas en Micelas SDS puede producir repulsión electrostática de las cargas negativas en la Proteína-SDS, que contribuye a la reducción del volumen interno disponible del glóbulo de resina (V_{i}), que reduce el volumen de elusión (V_{e}) y una reducción en la partición del complejo de Proteína-SDS dentro del glóbulo (reducción de K_{av}).

Expansión de tamaño del complejo de Proteína-SDS en resistencia iónica mayor. La resistencia iónica mayor puede también incrementar el tamaño de miniMicelas SDS adheridas a la proteína al incrementar el número de moléculas SDS en las mini-micelas. El incremento en el tamaño de las mini-Micelas adheridas a la proteína puede producir expansión de tamaño del complejo Proteína-SDS que resulta en volumen de elusión más pequeño (V_{e}) y una reducción en la partición del complejo de Proteína-SDS dentro del glóbulo de resina (reducción de K_{av}).

Finalmente, es posible que los efectos cromatográficos observados sean el resultado de una combinación de uno y dos mecanismos.

Es también posible que los grandes cambios en las propiedades de elusión de complejos IFN- SDS con resistencia iónica en Sephadex G75 SF se deba a su K_{av} pequeño (0.096 a 50 mM acetato). El complejo IFN-SDS se particiona escasamente en el volumen interno del glóbulo de resina (V_{i}), por lo tanto cambios pequeños en su tamaño tienen un efecto más dramático que las proteínas más pequeñas que particionan más fácilmente en el volumen interno del glóbulo de resina (V_{i}).

Claims

1. Un método para purificar interferón-\beta mediante cromatografía de exclusión de tamaño que comprende las etapas de:

preparar una solución de amortiguación que tiene un resistencia iónica de más de 50 mM y menos de 500 mM, dicha solución de amortiguación comprende adicionalmente un detergente iónico;

cargar una columna de cromatografía de tamaño de exclusión con dicho interferón-\beta o interferón-\beta_{1b};

eluir dicho interferón con solución de amortiguación de la columna de cromatografía de tamaño de exclusión;

observar un perfil de elución y determinar el valor de asimetría del pico interferón del perfil de elución, en donde el valor de asimetría es la relación de amplitud de la mitad de una cola de un pico con una amplitud de una mitad delantera del pico medido en 10% de la altura del pico; y

recolectar las fracciones de elución cuando el valor de asimetría del pico interferón del perfil de elución está entre 0.4 y 1.6

2. El método de la Reivindicación 1 en donde dicha solución de amortiguación tiene una resistencia iónica de más de 75 mM y menos de 250 mM.

3. El método de la Reivindicación 2 en donde dicha solución de amortiguación tiene una resistencia iónica de más de 100 mM y menos de 200 mM.

4. El método de la Reivindicación 2 en donde dicha solución de amortiguación tiene una resistencia iónica de 100 mM.

5. El método de la Reivindicación 2 en donde dicha solución de amortiguación tiene una resistencia iónica de 150 mM.

6. El método de la Reivindicación 2 en donde dicha solución de amortiguación tiene una resistencia iónica de 200 mM.

7. El método de cualquier reivindicación precedente en donde dicha solución de amortiguación comprende acetato de sodio.

8. El método de cualquier reivindicación precedente en donde dicho detergente iónico está presente en la solución de amortiguación en una concentración de entre 0.05% en peso y 0.25% en peso.

9. El método de la Reivindicación 8 en donde dicho detergente iónico está presente en la solución de amortiguación en una concentración de entre 0.075% en peso y 0.2% en peso

10. El método de la Reivindicación 9 en donde dicho detergente iónico está presente en la solución de amortiguación en una concentración de 0.1% en peso.

11. El método de cualquier reivindicación precedente en donde dicho detergente iónico es dodecilsulfato de sodio.

12. El método de cualquier reivindicación precedente en donde dicha solución de amortiguación comprende adicionalmente un quelador de metal.

13. El método de la Reivindicación 12 en donde dicho quelador de metal está presente en una concentración de entre 0.5 mM a 1.5 mM.

14. El método de la Reivindicación 12 o Reivindicación 13 en donde dicho quelador de metal es ácido etilenodiamina-tetraacético.

15. El método de una cualquiera de las Reivindicaciones 12 a 14 en donde dicho quelador de metal está presente en una concentración de 1 mM.

16. El método de cualquier reivindicación precedente en donde el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.5 y 1.5.

17. El método de la Reivindicación 16 en donde el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.6 y 1.4.

18. El método de la Reivindicación 17 en donde el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.8 y 1.2.

19. El método de la Reivindicación 18 en donde el valor de asimetría del perfil de elución está entre 0.9 y 1.1.

20. El método de cualquier reivindicación precedente en donde dicho interferón es interferón-\beta1_{b}.

21. El método de cualquier reivindicación precedente en donde la cantidad del interferón purificado es mayor de 1 gramo.