ES2332467T3 - Procedimiento diagnostico para el reconocimiento de portadores de la variante marburg i de la proteasa que activa el factor vii (fsap) con ayuda de la modulacion diferencial de la actividad de fsap. - Google Patents
Procedimiento diagnostico para el reconocimiento de portadores de la variante marburg i de la proteasa que activa el factor vii (fsap) con ayuda de la modulacion diferencial de la actividad de fsap. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico para la detección de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I de la proteasa que activa el factor VII (FSAP), en el que se determina la actividad del FSAP, caracterizado porque se determina la actividad del FSAP que se halla contenido en una muestra, en ausencia y también en presencia de un modulador diferencial de la actividad, en el que el modulador diferencial de la actividad cambia la actividad del FSAP en muestras de personas que tienen una expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I del FSAP en una amplitud que es distinta de la amplitud en las muestras de personas que no expresan la variante MRI del FSAP.
Description
Procedimiento diagnóstico para el reconocimiento
de portadores de la variante Marburg I de la proteasa que activa el
factor VII (FSAP) con ayuda de la modulación diferencial de la
actividad de FSAP.
La invención forma parte del campo del
diagnóstico de la Mutación Marburg I (MR I) de la proteasa que
activa el factor de coagulación VII de la sangre (FSAP), que se
encuentra en aproximadamente 5 a 10% de la población de Europa
Occidental. De acuerdo con un estudio de Willeit y Otro(s),
los portadores heterocigotos de la mutación FASP MR I presentan en
comparación con el promedio de la población, un mayor riesgo de
desarrollar una estenosis de la carótida (Carotis Stenose) [Willeit
y Otro(s) (2003): Marburg I polymorphism of factor VII
activating protease: a prominent risk predictor of carotid
stenosis. Circulation 107, 667-670]. Dado que la
presencia de una mutación FASP MR I representa un marcador
potencial de una predisposición genética para el desarrollo de
enfermedades ateroscleróticas, la detección fiable de portadores
homo o heterocigotos de la mutación FASP MR I es de interés, en
especial en vista a un tratamiento médico preventivo individual.
El FSAP es una serin proteasa plasmática, que
también se ha descrito bajo el nombre PHBSP (serin proteasa que
liga el hialuronan del plasma). El FSAP se encuentra presente en el
plasma humano en una concentración de aproximadamente 12 \mug/ml,
y por medio de autocatálisis de la proenzima de una sola cadena
(sc-FSAP, single chain-FSAP) puede
transformarse en la proteasa de dos cadenas, activa
(tc-FSAP, two chain-FSAP). La
proteasa activa dispone de diversas funciones o actividades. Se sabe
que el FSAP tiene por una parte la capacidad de activar el Factor
de Coagulación Sanguínea VII así de activar los activadores del
plasminógeno, de una sola cadena, como las prouroquinasas que
activan plasminógenos, como el scuPA (single chain urokinase
plasminogen activator) y el sctPA (single chain tissue plasminogen
activator). Por otra parte, el FSAP dispone de la capacidad de
inactivar los factores de coagulación sanguínea V/Va y
VIII/VIIIa).
En el documento EP 952 215 A2 se describen
diversos procedimientos de ensayo para la determinación cualitativa
o cuantitativa del FSAP, que aprovechan estas actividades biológicas
del FSAP. Otra actividad del FSAP, que permite una determinación de
la proteasa activa y que también se ha descrito en el documento
patente anteriormente mencionado, así como en Römish y
Otro(s): The FVII activating protease cleaves
single-chain plasminógeno activators. Haemostasis
29, 292-299 y en Hungfeld y Otro(s). (1999):
Detection of a novel plasma serine protease during purification of
vitamin K-dependent coagulation factors. FEBS
Letters 456, 290-294, es la actividad amidolítica
del FSAP con respecto a los substratos de bajo peso molecular, en
especial frente al substrato de cromógeno
S-2288^{TM}
(HD-Ile-Pro-Arg-pNA).
Además de la secuencia de tipo salvaje del gen
humano de FSAP se conocen diversos polimorfismos de nucleótidos,
que en dos casos también conducen a un cambio en la secuencia de
aminoácidos (EP 1 182 258 A1). La denominada mutación Marburg I
(también denominada polimorfismo, alelo o variante Marburg I)
conduce a un intercambio de aminoácidos Gly/Glu en la posición 534
de la proenzima, péptido de señal (Gly/Gu 534) inclusive, y tiene
como resultado una disminución del 50 - 80% de la actividad que
activa la prouroquinasa, mientras que la capacidad de activar el
Factor VII se conserva sin modificaciones. Otra mutación, la
denominada mutación Marburg II (MR II) (también denominada
polimorfismo, alelo o variante MR II) conduce a un intercambio de
aminoácidos Glu/Gln en la posición 370 de la proenzima, péptido
señal (Glu/Gln 370) inclusive. Sin embargo, la Mutación Marburg II
no tiene ninguna influencia sobre la actividad del FSAP como
activador de la prouroquinasa.
En el estado de la técnica, la detección
individual de personas portadoras de por lo menos una copia de la
variante FASP MR I, es posible mediante dos enfoques metódicos
diferentes. Hasta la actualidad, una detección segura del
intercambio de aminoácidos Gly/Glu en la posición 534 de la
proenzima (Gly/Glu 534) sólo es posible mediante la secuenciación
de la correspondiente región codificadora en el ADN genómico o en el
ARNm. Un intercambio de bases G/A en la secuencia genómica, que
puede detectarse en la posición de nucleótidos 1601 del ADNc,
constituye el causante genético del mutante FSAP MR I (EP 1 182 258
A1). Si bien el análisis de las secuencias de ADN provee resultados
fiables, desde el punto de vista de los análisis de laboratorio
rutinarios, existe una necesidad de procedimientos de ensayo que
sean lo más económicos, rápidos y seguros posible, y que además
puedan implementarse automáticamente en los equipos de diagnóstico
disponibles. Se prefieren predominantemente procedimientos
inmunoquímicos para la detección o para los ensayos, por cuanto
cumplen con los criterios mencionados y ya han encontrado una
amplia utilización en los diagnósticos basados en análisis de
laboratorio.
Otro método para la determinación de un mutante
FASP MR I se basa en la determinación del potencial del FSAP
presente en una muestra para activar la prouroquinasa. A tal efecto
se acopla a una fase sólida un anticuerpo específico que no está en
condiciones de diferenciar entre FSAP de tipo salvaje y las
variantes de FSAP conocidas, y se lo somete a incubación junto con
el líquido de la muestra. Después del añadido de prouroquinasa como
substrato de FSAP y de un substrato de uroquinasa cromógeno, se
determina la cantidad de cromógeno hecha reaccionar como medida de
la actividad del FSAP como activador de la prouroquinasa. Los
portadores de la mutación Marburg I muestran una actividad para
activar la prouroquinasa, disminuida en un 50 - 80%. Sin embargo,
una menor actividad para activar la prouroquinasa también puede
estar condicionada (impuesta) por una pequeña concentración de FSAP
en la muestra. Por ello, hasta la actualidad es necesario determinar
no solamente la actividad para activar la prouroquinasa, sino
adicionalmente también la concentración de antígeno de FSAP en una
muestra (EP 1 348 761 A1 o US 2002/0142316 A1). En el estado de la
técnica se conocen anticuerpos monoclonales, que permiten la
detección inmunológica del FSAP. En el documento EP 1 182 258 se
describen dos anticuerpos monoclonales, que provienen de células
hibridoma DSM ACC2453 o DSM ACC2454, que se habían obtenido después
de la inmunización de ratones con proteína del FSAP. Ambos
anticuerpos ligan no solamente proteína del FSAP de tipo salvaje,
sino también las variantes Marburg I y Marburg II. Otros anticuerpos
del FSAP conocidos se ligan de igual manera al FSAP de tipo salvaje
así como a las variantes mutantes conocidas; de manera que, por
ejemplo, en un ELISA Sandwich se determina el contenido total de
antígeno de FSAP en una muestra (véase también el documento DE 100
23 923 A1). Por ello el estado de la técnica enseña que sólo si se
comprueba una menor actividad para activar la prouroquinasa, junto
con una concentración de antígeno de FSAP en el intervalo normal,
esto es una indicación concreta de la presencia de una variante
FSAP MRI.
La presente invención tuvo como cometido poner a
disposición otros procedimientos para el diagnostico fiable de una
mutación MR I o para la detección individual de portadores
heterocigotos u homocigotos de una mutación MR I, que permitan
prescindir de una determinación del antígeno de FSAP.
Este cometido se logra poniendo a disposición el
procedimiento conforme a la invención, descrito en las
reivindicaciones, que permiten diferenciar de manera fiable los
portadores heterocigotos u homocigotos de un polimorfismo MR I, de
los que no son portadores. La ventaja del presente procedimiento,
que aprovecha la modulación diferencial de la actividad de la
variante FASP MR I, consiste en una discriminación fiable entre
portadores y no portadores de la mutación FASP MR I, y en especial
en que puede prescindirse de una determinación adicional del
contenido de antígeno en una muestra.
Se ha descubierto que mediante la utilización de
moduladores adecuados de la actividad, los denominados moduladores
diferenciales de la actividad, la actividad del FSAP, en especial la
actividad amidolítica del FSAP en comparación con substratos
péptidos de bajo peso molecular, así como la actividad del FSAP para
activar el activador del activador del plasminógeno, en muestras de
no portadores de un polimorfismo MR I, se modula de manera diferente
que la actividad del FSAP en muestras de portadores heterocigotos u
homocigotos de un polimorfismo MR I, por lo que una diferenciación
entre no portadores y portadores de un polimorfismo MR I puede
lograrse en base a que la amplitud de la modulación de la actividad
del FSAP es distinta.
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Dentro de los alcances de la presente invención,
bajo la expresión "modulador diferencial de la actividad" cabe
entender una sustancia o mezcla de sustancias, que:
i).- inhibe o refuerza la actividad del FSAP
tanto en muestras de portadores de la variante MR I del FSAP así
como también en muestras de no portadores de la variante MR I del
FSAP, pero que hace esto con una amplitud diferente; o:
ii).- inhibe la actividad del FSAP en muestras
de portadores de la variante MR I del FSAP, y que en muestras de no
portadores de la variante MR I refuerza dicha actividad, o
inversamente; o
iii).- refuerza o inhibe la actividad del FSAP
en uno de los tipos de muestra, pero en el otro tipo de muestra no
causa ningún cambio significativo en la actividad del FSAP.
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Por consiguiente, para su utilización como
modulador diferencial de la actividad es adecuada una sustancia o
una mezcla de sustancias, que:
a).- causa una diferencia cuantitativa en la
inhibición (reducción) o refuerzo (elevación) de la actividad del
FSAP en muestras de no portadores o portadores de la variante MR I
del FSAP, es decir, por ejemplo en ambos tipos de muestra la
actividad del FSAP se eleva o reduce, pero con una amplitud
diferente; o
b).- causa una diferencia cualitativa en la
modulación de la actividad del FSAP en muestras de no portadores o
de portadores de la variante MR I del FSAP, es decir, en uno de los
tipos de muestra se refuerza la actividad, por lo tanto se eleva,
mientras que en el otro tipo de muestra se reduce la actividad, es
decir se inhibe.
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La modulación diversa (diferencial) de la
actividad FSAP en muestras de portadores y no portadores de la
variante FASP MR I permite una mejor diferenciación entre ambos
tipos de muestra. Como se representa en la Figura 6, esto conduce a
que se reduce la superposición de las distribuciones de las
actividades del FSAP en muestras tomadas de los universos de no
portadores del polimorfismo MR I y de portadores del polimorfismo MR
I. Con ello es posible distinguir mejor entre no portadores y los
diversos portadores, por lo que se eleva la sensibilidad y/o
carácter específico del diagnóstico [Vizthum, F. y Otro(s)
(2005) Proteomics: from basic research to diagnostic application. A
review of requirements & needs. J. Proteome Res., 4 (4):
1086-97].
A título de ejemplo, durante la utilización de
aprotinina como modulador diferencial de la actividad se observa
una diferencia cuantitativa: la actividad del FSAP que activa el
activador del plasminógeno en muestras de no portadores y
portadores, se inhibe más fuertemente que la actividad del FSAP que
activa el activador del plasminógeno en muestras de portadores de
la mutación FASP MR I. De esta manera es posible diferenciar entre
los portadores homocigotos y heterocigotos de la forma de tipo
salvaje o de la variante MR I del FSAP, y con ello
identificarlos.
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Otro objetivo de la presente invención es un
procedimiento de diagnóstico in vitro para la detección
individual de personas que tienen una expresión heterocigota u
homocigota, genéticamente condicionada, de la variante MR I del
FSAP, en el que se determina la amplitud del cambio en la actividad
del FSAP que está contenido en una muestra. Para esto se determina
la actividad del FSAP que está contenido en una muestra, en ausencia
así como en presencia de un modulador diferencial de la actividad,
pudiéndose efectuar la determinación de la actividad del FSAP en
ausencia y en presencia:
1).- en paralelo, es decir, en dos preparados
reactivos, o
2).- de manera sucesiva, es decir,
consecutivamente en un único preparado reactivo, primero en ausencia
y a continuación, después de la adición del modulador diferencial
de la actividad, en presencia del modulador diferencial de la
actividad.
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Puede distinguirse entre dos metodologías de
ensayo preferidos, que son adecuados para la determinación de la
amplitud del cambio en la actividad del FSAP:
En esta metodología se determina la amplitud del
cambio en la actividad del FSAP que está contenido en una muestra,
en la cual metodología, en un primer preparado reactivo, es decir en
una primera alícuota de una muestra, se mide la actividad del FSAP
en presencia de un modulador diferencial de la actividad, y en un
segundo preparado reactivo, es decir, en una segunda alícuota de la
misma muestra, se mide la actividad del FSAP en ausencia de este
modulador diferencial de la actividad. La comparación de los
resultados de ambas reacciones provee información acerca de la
amplitud del cambio en la actividad del FSAP en presencia del
modulador de la actividad.
Es preferible determinar la amplitud del cambio
en la actividad del FSAP que activa el activador del plasminógeno,
de una muestra biológica, preferentemente una muestra de sangre o de
plasma, para lo cual se mide la actividad del FSAP que activa la
prouroquinasa una vez en ausencia y una vez en presencia de un
modulador diferencial de la actividad, por medio de la cinética de
conversión de un activador del plasminógeno y de su substrato.
En otra forma de realización se determina la
amplitud del cambio en la actividad amidolítica del FSAP de una
muestra biológica, preferentemente de una muestra de sangre o de
plasma, midiéndose la actividad amidolítica del FSAP una vez en
ausencia y una vez en presencia de un modulador diferencial de la
actividad, por medio de la cinética de conversión del substrato de
FSAP de bajo peso molecular.
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En esta metodología de ensayo se determina la
amplitud del cambio en la actividad del FSAP que se halla contenida
en una muestra, para lo cual se somete a incubación la muestra en un
único preparado reactivo junto con uno o varios reactivos que
permiten la determinación de la actividad del FSAP, añadiéndose
durante el desarrollo de la reacción un modulador diferencial de la
actividad, y haciéndose el seguimiento del cambio resultante en la
reacción.
Es preferible que se determine la amplitud del
cambio en la actividad del FSAP que activa el activador del
plasminógeno, en una muestra biológica, preferentemente una muestra
de sangre o de plasma, para lo cual se mide la actividad del FSAP
que activa la prouroquinasa, primero en ausencia de un modulador
diferencial de la actividad por medio de la cinética de conversión
de un substrato de activador del plasminógeno o de un substrato de
uroquinasa. Durante el desarrollo de la reacción se añade
seguidamente un modulador diferencial de la actividad al preparado
reactivo, y se efectúa el seguimiento del cambio resultante en la
reacción.
En otra forma de realización se determina la
amplitud del cambio en la actividad amidolítica del FSAP de una
muestra biológica, preferentemente una muestra de sangre o de
plasma, midiéndose la actividad amidolítica del FSAP en primer
lugar en ausencia de un modulador diferencial de la actividad, por
medio de la cinética de reacción de un substrato de FSAP de bajo
peso molecular. Durante el desarrollo de la reacción se añade
seguidamente un modulador diferencial de la actividad al preparado
reactivo, y se efectúa el seguimiento del cambio resultante en la
reacción.
Dentro de los alcances de la invención, el
término "muestra" se refiere al material del que se presume que
contiene el FSAP o la variante FASP MR I. El concepto
"muestra" abarca fluidos o tejidos biológicos, en especial de
humanos y animales como sangre, plasma, suero, así como otros
fluidos corporales, secreciones o extractos, de los que se presume
que contienen el FSAP o el mutante FASP MR I. Eventualmente es
necesario aplicar un tratamiento preliminar a las muestras, para
que los analitos sean accesibles para el procedimiento de detección
o para remover componentes perturbadores indeseables de las
muestras. Dicho tratamiento preliminar de las muestras puede
incluir la separación o lisis de células, la precipitación, la
hidrólisis o la desnaturalización de los componentes de las
muestras como por ejemplo las proteínas, la centrifugación de
muestras, el tratamiento de las muestras con solventes orgánicos
como por ejemplo alcoholes, en especial metanol; el tratamiento de
las muestras con detergentes. Frecuentemente se transfiere la
muestra a otro medio, por lo general agua, que en lo posible no
debería interferir con el procedimiento de detección.
En una forma de realización preferida para
determinar la actividad del FSAP, se somete a incubación una muestra
biológica, preferentemente una muestra de sangre o una muestra de
plasma, en una fase sólida en la que previamente se había acoplado
un coligante con una afinidad para el FSAP. Cabe preferir coligantes
que ligan la proteína del FSAP de tipo salvaje con la misma
afinidad que una proteína del FSAP con la mutación MR I. Los
coligantes que presentan una afinidad para el FSAP y que son
adecuados para el enriquecimiento, o aislación, de la proteína del
FSAP a partir de soluciones complejas de proteínas, como por ejemplo
muestras de plasma, abarcan por ejemplo sustancias del grupo de la
heparina, sulfato de heparan, sulfato de dextrano y ácidos
hialourónicos. También son adecuados los anticuerpos monoclonales y
policlonales contra el FSAP o fragmentos de anticuerpos, como los
fragmentos F(ab') o F(ab')_{2}. Se prefieren
especialmente los anticuerpos monoclonales que se forman a partir
de una de las cepas de células hibridoma DSM ACC2453 y DSM2454,
depositadas ante el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen (Colección Alemana de Microorganismos, GmbH,
Mascheroder weg 1b, 38124, Braunschweig, Alemania.
Dentro de los alcances de esta invención, el
término "fase sólida" abarca un objeto que consiste en un
material poroso y/o no poroso, por lo general no soluble en agua y
que puede presentar las formas más diversas, como por ejemplo la
forma de recipientes, pequeños tubos, placas de microtitulación,
esferas, micropartículas, varillas, tiras, papel filtro o papel de
cromatografía. Por lo general la superficie de la fase sólida es
hidrófila, o es posible conferirle un carácter hidrófilo. La fase
sólida puede consistir en los materiales más diversos posibles,
como por ejemplo en materiales inorgánicos y/o orgánicos, de
materiales que se presentan en la naturaleza y/o de procedencia
natural modificados. Ejemplos de materiales para fase sólida son los
polímeros, como por ejemplo celulosa, nitrocelulosa, acetato de
celulosa, cloruro de polivinilo, poliacrilamida, moléculas de
dextrano reticuladas, agarosa, poliestireno, polietileno,
polipropileno, polimetacrilato o nylon; cerámica, vidrio, metales,
en especial metales nobles como oro y plata; magnetita, mezclas o
combinaciones de los mismos, etc. La fase sólida puede presentar un
revestimiento consistente en una o más capas, por ejemplo de
proteínas, hidratos de carbono, sustancias lipófilas, biopolímeros,
polímeros orgánicos o mezclas de los mismos, a efectos de por
ejemplo reprimir o impedir el enlace no especifico de componentes de
muestras en la fase sólida o para por ejemplo lograr mejoras en
cuanto a la estabilidad de la suspensión de fases sólidas
particulares, la estabilidad bajo condiciones de almacenamiento, la
estabilidad de la configuración (estabilidad dimensional) o la
resistencia contra la luz UV, contra los microbios o contra
cualesquiera otros agentes de acción perjudicial. Las
micropartículas se utilizan frecuentemente como fase sólida. Dentro
de los alcances de esta invención, la noción "micropartículas"
se refiere a partículas que presentan un diámetro aproximado de por
lo menos 20 nm y de no más de 20 \mum, usualmente entre 40 nm y
10 \mum, preferentemente entre 0,1 y 10 \mum, de manera
especialmente preferida entre 0,1 y 0,5 \mum, más preferentemente
aún entre 0,15 y 2 \mum. Las micropartículas pueden tener una
configuración regular o irregular. Pueden ser bolillas, esferoides,
esferas con cavidades o poros más o menos grandes. Las
micropartículas pueden consistir en material orgánico o inorgánico,
o de una mezcla o combinación de ambos. Pueden consistir en un
material poroso o no poroso, o de un material hinchable o no
hinchable. En principio, las micropartículas pueden ser de
cualquier densidad. Las micropartículas pueden consistir en varias
capas como por ejemplo las denominadas partículas
"core-and-shell" con un núcleo
y uno o más capas de envoltura. El concepto "micropartícula"
abarca por ejemplo cristales de colorantes, metalsoles, partículas
de sílice, partículas de vidrio, partículas imantadas, partículas
de polímeros, gotas de aceite, partículas de lípidos, dextrano y
agregados de proteína, partículas consistentes en material polímero,
en especial de polietilenos sustituidos, partículas de látex, por
ejemplo de poliestireno, polímeros de ácido acrílico, polímeros de
ácido metacrílico, polímeros de acrilonitrilo,
acrilnitrilbutadieno-estireno, acetato de
polivinilo-acrilato, polivinilpiridina, cloruro de
vinilo-acrilato. Son de especial interés las
partículas que tienen grupos reactivos en su superficie, como por
ejemplo grupos carboxilo, amino o aldehído, que permiten un enlace
covalente de, por ejemplo, los coligantes, en la partícula de
látex.
Para la determinación de la actividad del FSAP
que activa el activador del plasminógeno, después del lavado de la
fase sólida se somete a incubación el FSAP ligado al coligante con
un activador de plasminógeno de una sola cadena, inactivo, como por
ejemplo prouroquinasa o sct-PA y un substrato de
uroquinasa o un substrato de sct-PA. La activación,
dependiente del FSAP, de por ejemplo la prouroquinasa de manera de
obtener uroquinasa, se mide por medio de la conversión o
desdoblamiento del substrato de uroquinasa. Los substratos
preferidos son substratos de péptidos de bajo peso molecular, que
disponen de un grupo formador de señales. El desdoblamiento del
substrato conduce a la liberación de los grupos formadores de
señales. Las propiedades físicas o químicas de los grupos
formadores de señales, liberados, se diferencian de las propiedades
de los grupos acoplados al péptido, y pueden determinarse
cuantitativamente con ayuda de procedimientos adecuados. Como grupos
formadores de señales son adecuados por ejemplo los luminóforos,
fluórforos o cromóforos, conocidos de la persona experta, que
pueden medirse mediante procedimientos ópticos como por ejemplo
mediciones de luminescencia, fluorescencia o de absorción. Dado que
la intensidad de la señal está correlacionada con la cantidad de
substrato desdoblado, es posible determinar de esta manera la
actividad del FSAP que activa el activador del plasminógeno. Se
utiliza preferentemente un substrato de bajo peso molecular del
grupo S-2444^{TM}
(Glu-Gly-Arg-para-nitroanilina;
Chromogenix Instrumentation laboratory S.p.A., Milán, Italia),
Pefachrom® uPA
(Ala-Gly-Arg-para-nitroanilina
[Pefa-5221]; Pentapharm Ltd., Basilea, Suiza) y
Chromozym^{TM} U (Roche Applied Science, Indianapolis,
EE.UU.).
Para la determinación de la actividad
amidolítica del FSAP, después del lavado de la fase sólida se somete
a incubación el FSAP ligado al coligante junto con un substrato de
bajo peso molecular, y se mide la conversión o desdoblamiento del
substrato. Dentro de los alcances de la presente invención, los
substratos de bajo peso molecular son substratos de péptidos,
consistentes en una secuencia de 2 a 100, preferentemente 2 a 50, de
manera especialmente preferida 3 a 10, aminoácidos naturales o no,
que adicionalmente poseen un grupo formador de señales y que se
desdoblan del FSAP. El desdoblamiento de un substrato de bajo peso
molecular conduce a la liberación de los grupos formadores de
señales. Las propiedades físicas o químicas de los grupos formadores
de señales, liberados, se diferencian de las propiedades de los
grupos formados en el péptido, y pueden determinarse con ayuda de
procedimientos adecuados. Como grupos formadores de señales son
adecuados por ejemplo los luminóforos, fuórforos o cromóforos,
conocidos de la persona experta, que pueden medirse mediante
procedimientos ópticos como por ejemplo mediciones de
luminescencia, fluorescencia o de absorción. Dado que la intensidad
de la señal está correlacionada con la cantidad de substrato
desdoblada, es posible determinar de esta manera la actividad
amidolítica del FSAP. Se emplea preferentemente un substrato de
cromógeno de bajo peso molecular seleccionado del grupo consistente
en: Pefa-3297, Pefa-5114,
Pefa-5523, Pefa-5773,
Pefa-5979, Pefa-3107,
Pefa-5329 (todos ellos de la serie Pefachrom®,
Pentapharm Ltd, Basilea, Suiza), S-2288^{TM},
S-2765^{TM}, S-2338^{TM},
S-2222^{TM}, S-2302^{TM} (todos
ellos de la Serie S, Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A.,
Milán, Italia) (Véase también Römish y Otro(s) (1999)
Hemostasis 29, 292-299 y Hunfeld y Otro(s)
(1999) FEBS Letters 456, 290-294).
La medición de la reacción de desdoblamiento del
substrato puede tener lugar sobre la totalidad del intervalo de
tiempo de la reacción hasta la ocurrencia del equilibrio, o por lo
menos en un intervalo de tiempo determinado, o por lo menos hasta
un momento en el tiempo. Para determinar la actividad pueden
utilizarse los datos fotométricos, por ejemplo los espectros o
valores de absorción bajo determinadas longitudes de onda, de por
sí, o haciéndose referencia a un intervalo de tiempo. Si la
actividad se determina mediante datos fotométricos referidos a un
intervalo de tiempo, es decir, si incluye la velocidad de conversión
o de reacción, pueden utilizarse diversos procedimientos para la
determinación de la velocidad de conversión o de reacción. Por
ejemplo, es posible determinar la velocidad de conversión mediante
curvas de tiempo-conversión. En el caso de las
curvas de tiempo-conversión se representa
gráficamente la concentración del producto de desdoblamiento en
función del tiempo. Para la determinación de la velocidad de
conversión se traza una línea recta en la región de la reacción de
orden 0-ésimo de la curva de tiempo-conversión,
usualmente en el inicio de la medición de la reacción de una enzima.
En tal caso la inclinación o pendiente de la línea recta provee la
velocidad de la conversión, es decir, el cambio en la concentración
del substrato o del producto en un intervalo de tiempo determinado
[Bibliografía: Bisswanger, H., Enzymkinetik: Theorie und Methoden,
2, völlig neu bearbeite Auflage, VCH Verlaggesellschaft mbH, 1994,
Weinheim, NY, Basilea, Cambridge, Tokio; en especial Págs.
66-67].
Las magnitudes de medición o los parámetros, que
son adecuados para la evaluación de la cinética de la conversión,
son por ejemplo todos los parámetros que describen la cinética de la
reacción, como por ejemplo el análisis de las curvas de por sí,
pero en especial determinados parámetros individuales de la cinética
de la reacción, como la inclinación máxima, es decir, la velocidad
de la reacción (V_{max}), los parámetros relacionados con la
cinética sigmoidal, el área bajo la curva, etc. Los parámetros que
son adecuados para la evaluación del ensayo, son por ejemplo
también los valores de medición absolutos, como por ejemplo los
valores de absorción que se miden en un instante de tiempo
determinado, o un instante en el tiempo en el que se ha alcanzado un
valor de absorción determinado, por ejemplo un valor máximo.
Para la determinación del cambio en la actividad
del FSAP en dos preparados reactivos, se forma preferentemente la
diferencia o el cociente de un parámetro de ensayo, que se determinó
una vez en ausencia y otra vez en presencia del modulador de la
actividad, a efectos de determinar la amplitud del cambio de la
actividad del FSAP. Por ejemplo, en el caso de emplearse un
inhibidor que inhibe la actividad del FSAP en muestras de no
portadores más fuertemente que en muestras de portadores de MR I, la
formación de la diferencia o del cociente obtenidos a partir de la
velocidad de la reacción (V_{max}) del índice de conversión del
substrato en ausencia del inhibidor (V_{max \ 0}) y de la
velocidad de reacción del índice de conversión del substrato en
presencia del inhibidor (V_{max \ inhibidor}), permite
diferenciar entre portadores de FSAP MR I y no portadores de FSAP
MR I. Los portadores homocigotos o heterocigotos de la mutación FSAP
MR I muestran una menor diferencia, o un cociente de valor más
pequeño, que los no portadores. También son adecuados otros
algoritmos como la suma o el producto, siempre y cuando permitan
una diferenciación.
Además de la velocidad de la reacción también
pueden emplearse señales de ensayo absolutas o valores de medición
como, por ejemplo, valores de absorción que se alcanzan en un
instante determinado en el tiempo (Cfg. las Figuras 1 y 2; en este
caso podría establecerse preferentemente un instante adecuado en el
tiempo en un intervalo de tiempo entre 10 y 70 minutos, de manera
especialmente preferida entre 30 y 45 minutos, en especial a los 40
minutos, ya que en este caso existe una diferencia máxima entre los
preparados con aprotinina y sin ella).
Para la determinación del cambio en la actividad
del FSAP en un sólo preparado reactivo, es necesario medir la
reacción del desdoblamiento del substrato antes y después de
añadirse el modulador diferencial de la actividad. Por lo menos es
necesario medir la reacción en por lo menos un instante en el tiempo
o a lo largo de un intervalo de tiempo discreto, antes y por lo
menos en un instante en el tiempo o a lo largo de un intervalo de
tiempo discreto después de añadirse el modulador diferencial de la
actividad.
Un modulador diferencial de la actividad,
preferido, de la actividad del FSAP para su utilización en el
procedimiento conforme a la invención, es la aprotinina. La
aprotinina inhibe la actividad del FSAP en muestras de no
portadores, más intensamente que en muestras de portadores MR I
(Véase la Tabla 3).
Otros moduladores diferenciales de la actividad,
preferidos, de la actividad del FSAP para su utilización en el
procedimiento conforme a la invención, son los anticuerpos
anti-FSAP monoclonales o policlonales. Los
anticuerpos monoclonales especialmente preferidos son aquellos que
se producen a partir de la cepa de células hibridoma, depositada
con el Número de Registro DSM ACC2726 (EP 1 360 175 A1) ante la
Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkuklturen GmbH,
Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania. También se
prefiere un anticuerpo anti-FSAP monoclonal, que se
liga a un epítope del FSAP, que se une por un anticuerpo
anti-FSAP monoclonal formado a partir de la cepa de
células hibridoma DSM ACC 2726. Estos anticuerpos monoclonales se
ligan al FSAP y modulan la actividad del FSAP en muestras de no
portadores, en una amplitud que es distinta que la amplitud
correspondiente a las muestras de portadores MR I (Véase la Tabla
3).
Para comprobar si dentro de los alcances de la
presente invención una sustancia o una combinación de sustancias es
adecuada para su utilización como modulador diferencial de la
actividad, puede procederse como sigue:
La influencia de la sustancia objeto de estudio,
o de la combinación de sustancias objeto de estudio, sobre la
actividad del FSAP que activa el activador del plasminógeno, se
determina mediante muestras de las que se sabe que contienen la
variante FASP MR I y con muestras de las que se sabe que no
contienen la variante FASP MR I pero sí contienen el FSAP de la
forma de tipo salvaje. En este caso, puede tratarse por ejemplo de
muestras de una o más personas cuyo genotipo FSAP es conocido.
Además pueden utilizarse muestras que contienen una cantidad
definida de proteína del FSAP de tipo salvaje o de proteína del FSAP
MR I. La proteína del FSAP, o la proteína del FSAP MRI, que puede
emplearse para la preparación de una muestra de este tipo, puede
enriquecerse o aislarse por ejemplo a partir de material biológico
humano, o producirse por recombinación o transgénicamente. En los
documentos EP 1 226 829, EP 1 074 615 A1 y EP 1 074 616 A1 se
describen procedimientos para el enriquecimiento, aislación,
preparación o estabilización de proteína del FSAP.
La actividad del FSAP que activa el activador
del plasminógeno, que se halla contenido en diversas muestras, se
determina seguidamente en ausencia así como en ausencia de la
sustancia que se está investigando. En este caso la sustancia, o la
combinación de sustancias, cuya aptitud como modulador diferencial
de la actividad es objeto de estudio, se aplican en por lo menos
una concentración, pero preferentemente en diversas concentraciones,
como se representa por ejemplo para la aprotinina en las Figuras 1
y 2.
La amplitud del cambio en la actividad del FSAP
que activa el activador del plasminógeno, en muestras con la
variante FSAP MR I, en comparación con muestras que no contienen la
variante FSAP MR I, pero sí muestran una actividad del FSAP la
forma de tipo salvaje, permite la identificación de sustancias o de
combinaciones de sustancias, que pueden emplearse como moduladores
diferenciales de la actividad. Con ello es posible identificar
sustancias como moduladores diferenciales de la actividad por el
hecho de que inhiben o refuerzan tanto la actividad de la variante
FSAP MR I como también la actividad de la forma de tipo salvaje del
FSAP, si bien lo hacen en una amplitud diferente. Empero, una
sustancia es también un modulador diferencial de la actividad si
inhibe la actividad de la variante FSAP MR I y refuerza la actividad
de la forma de tipo salvaje del FSAP.
Los primeros estudios para establecer si
determinadas sustancias son adecuadas como moduladores
diferenciales, se llevan a cabo con una cantidad relativamente
reducida de muestras, por ejemplo con en cada caso por lo menos una
muestra de la variante FSAP MR I, pero preferentemente con en cada
caso dos a diez muestras. Las sustancias que al respecto proveen
una diferenciación significativa, preferentemente una diferenciación
significativa desde el punto de vista estadístico, de muestras con
FSAP de tipo salvaje y con FSAP MR I, podrían validarse con
estudios adicionales con mayores cantidades de muestras.
Para la validación ulterior de sustancias o de
combinaciones de sustancias se utilizan preferentemente ensayos de
muestras de personas cuyo genotipo sea conocido, a efectos de
obtener informaciones realistas acerca de la performance del
ensayo, y para determinar con una suficiente especificidad y
sensibilidad de diagnóstico la presencia o ausencia de una variante
FSAP MRI. La cantidad de muestras a investigarse, de un estudio de
fase I de este tipo, depende de la exactitud prevista para el ensayo
y de la relación entre la cantidad de muestras con o sin la
variante FSAP MR I [Obuchowsky, N.A. y Otro(s) (2004) ROC
Curves in Clinical Chemistry: Uses, Misuses and Possible Solutions,
Clinical Chemistry, 50:7, 1118-1125]. En el caso de
tener los ensayos una exactitud prácticamente perfecta, y si la
relación entre las muestras con y sin la variante FSAP MR I es
igual a uno, en cada caso serán suficientes diez muestras para
obtener valores estadísticamente significativos. La cantidad de
muestras aumenta al aumentar o disminuir la relación entre las
muestras con y sin la variante FSAP MR I, como también si decae la
exactitud de los ensayos. En esta eventualidad será necesario
investigar por ejemplo más de cien muestras en cada caso.
El estudio de sustancias o combinaciones de
sustancias para establecer su aptitud como moduladores diferenciales
de la actividad puede efectuarse por ejemplo mediante la
determinación de la actividad del FSAP que activa la prouroquinasa,
en presencia y ausencia de estas sustancias, eventualmente en
diversas concentraciones. A título de ejemplo, se emplean como en
el Ejemplo 1 coligantes asociados en fase sólida y con afinidad para
el FSAP, en especial un anticuerpo anti-FSAP, que
se forma a partir de la cepa de células hibridoma DSM ACC2453, y se
lleva a cabo un ensayo de la actividad como el descrito en el
Ejemplo 1. La diferenciación entre portadores y no portadores de la
variante FASP MR I se determina mediante la formación de un cociente
entre V_{max} de la cinética de la reacción de una muestra sin
aditivo (V_{max \ 0}) y con la adición de la sustancia (V_{max \
sustancia}).
Puede procederse de manera análoga cuando se han
de estudiar sustancias o combinaciones de sustancias para
establecer su aptitud como moduladores diferenciales de la actividad
de la actividad amidolítica del FSAP. Un procedimiento de ensayo
para la determinación de la actividad amidolítica del FSAP, como se
describe en el Ejemplo 2, puede llevarse a cabo una vez en ausencia
y una vez en presencia de la sustancia objeto de estudio, y los
resultados de los ensayos pueden emplearse de manera análoga a la
valoración de la aptitud de una sustancia, como descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las clases de sustancias que son especialmente
adecuadas para un estudio en cuanto a su aptitud como moduladores
diferenciales de la actividad para la actividad del FSAP, abarcan
por ejemplo:
a).- iones (aniones como cloruro, carbonato,
sulfato, fosfato, etc., o cationes como sodio, litio, amonio,
magnesio, calcio, manganeso, etc.);
b).- agentes quelantes, como tetraacetato de
etiléndiamina (EDTA), N,N,N',N'-tetraacetato de
etilen-glicol-bis(\beta-aminoetileter),
citrato, etc.;
c).- detergentes como dodecilsulfato de sodio
(SDS), Triton® X 100, Tween®, etc.;
d).- sustancias redoactivas como ditioeritrol,
ditiotreitol, \beta-mercaptoetanol, glutationa,
ácido lipónico, vitamina C, vitamina E, etc.;
e).- ácidos nucleicos, en especial
aptámeros;
f).- anticuerpos;
g).- proteínas, péptidos y oligopéptidos como
por ejemplo antitrombina III, inhibidor C1 esterasa, inhibidor de
la trayectoria del factor de los tejidos (TFPI), cofactor de
heparina II, alfa2-macroglobulina,
alfa2-antiplasmina, inhibidor
inter-alfa-tripsina,
alfa1-antitripsina,
alfa1-antiquimotripsina, Inhibidor de tipo 2 del
activador del plasminógeno (PAI-2), inhibidor de
tipo 3 del activador del plasminógeno (PAI-3),
quininógeno, quininógeno de elevado peso molecular (HMWK),
etc.;
h).- inhibidores sintéticos de serin proteasas,
como FOY-305
[N,N-dimetilcarbamoílmetil
4-(4-guanidinobenzoíloxi)-fenilacetato
metanosulfonato] y derivados correspondientes;
i).- inhibidores de proteasas, de bajo peso
molecular, como FOIPAN (camostato mesilato).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
La Figura 1 muestra la inhibición de la
actividad del FSAP que activa la prouroquinasa en presencia de
aprotinina, que se determinó para una muestra de plasma de un no
portador (tipo salvaje).
Figura
2
La Figura 2 muestra la inhibición de la
actividad del FSAP que activa la prouroquinasa en presencia de
aprotinina, que se determinó para una muestra de plasma de un
portador heterocigoto del polimorfismo MR I.
Figura
3
La Figura 3 muestra la inhibición de la
actividad amidolítica del FSAP en presencia de aprotinina, que se
determinó para una muestra de una recolección de plasmas de no
portadores de la mutación FSAP MR I (tipo salvaje).
Figura
4
La Figura 4 muestra la inhibición de la
actividad amidolítica del FSAP en presencia de aprotinina, que se
determinó para una muestra de plasma de un portador heterocigoto del
polimorfismo MR 1.
Figura
5
La Figura 5 muestra el cambio en la actividad
amidolítica del FSAP para una muestra de plasma de un no portador
(tipo salvaje; círculo abierto) y de un portador heterocigoto del
polimorfismo MR I (cuadrados llenos) en ausencia de aprotinina y en
presencia de aprotinina después de haberse añadida la misma
(flecha), para un tiempo de reacción de aproximadamente una hora,
habiéndose medido la actividad en un sólo preparado reactivo. Si
bien ambas muestras muestran inicialmente la misma actividad FSAP en
ausencia de aprotinina, por lo que no es posible una
diferenciación, las actividades cambian en presencia de aprotinina,
de manera que es posible distinguir entre ambas muestras, ya que
actividad del FSAP se inhibe más fuertemente en la muestra del no
portador.
Figura
6
La Figura 6 muestra a título de ejemplo una
posible distribución de las frecuencias en muestras de universos de
portadores homocigotos de la forma de tipo salvaje (línea de trazos)
y de heterocigotos MR I (líneas continuas y de puntos). Para el
caso de la línea de puntos se empleó un modulador que no influye
sobre la actividad del FSAP para los portadores homocigotos de la
forma de tipo salvaje, y que reduce en mayor grado la actividad del
FSAP para los heterocigotos MR I. En la presencia del modulador de
la actividad, la superposición de las distribuciones de las
actividades del FSAP tomado de muestras de universos de portadores
de la forma de tipo salvaje y de heterocigotos MR I, es menor que
en el caso de la ausencia del modulador de la actividad. De esta
manera, en el caso de la presencia del modulador de la actividad la
diferenciación entre los diversos portadores o formas puede
efectuarse mejor que en ausencia del modulador de la actividad, por
lo que se eleva la sensibilidad y/o carácter específico del
diagnóstico.
diagnóstico.
Los ejemplos descritos a continuación sirven
para aclarar aspectos individuales de esta invención, y no han de
considerarse como una delimitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Como coligante asociado en fase sólida con
afinidad para el FSAP se utilizó un anticuerpo
anti-FSAP que se forma a partir de la cepa de
células hibridoma DSM ACC2453. Para la realización del procedimiento
de detección heterogéneo se utilizaron placas de microtitulación
(MTPs) de poliestireno como fase sólida. Sobre la fase sólida de
poliestireno se asoció durante la noche a temperatura ambiente
anticuerpo anti-FSAP en 50 ml de NaHCO_{3}, pH
8,2, con un volumen de recubrimiento de 120 \mul para cada copita
del MTP y una concentración de recubrimiento de 20 \mug de
anticuerpo por cada ml. Los anticuerpos no ligados se removieron
mediante triple lavado con 50 ml de solución isotónica de NaCl
tamponada con fosfato de sodio, Tween® 20 al 0,2%, pH 6,5.
En cada una de las cavidades se introdujo
mediante pipeta 100 \mul de una muestra de plasma a ser
determinada, en una dilución de 1:80 en tampón para muestras
(citrato de sodio 20 mM, pH 6,0 con 150 ml de NaCl, monoclorhidrato
de L-arginina 100 mM, albúmina de suero bovino al
1%, Tween® 80 al 0,1%, 100 U.I. de heparina/ml). Después de
incubación a +37ºC durante una hora se retiraron las partes
componentes que han quedado sin ligar mediante triple lavado con
una solución de ClNa isotónica tamponada con fosfato de sodio 50 mM,
Tween ® 20 al 0,02%,
pH 6,5.
pH 6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la actividad del FSAP
que activa la prouroquinasa, después de la remoción de la muestra y
del lavado de la fase sólida, se añadieron:
a).- 30 \mul del tampón para ensayos I
(Tris/HCl 50 mM, pH 7,2 con NaCl 150 mM, Tween® 80 al 0,2%,
CaCl_{2} 15 mM y 50 U.I. de heparina por litro), o:
b).- 30 \mul del tampón para ensayos I, que
además contenía aprotinina en una concentración tal que se logró
una concentración final de 0,055 KIE/ml de aprotinina en el
preparado reactivo (1 U = unidad que inhibe la calicreína [KIE];
aprotinina tomada de pulmones bovinos, Sigma-Aldrich
Laborchemikalien GmbH, Taufkirchen, Alemania),
y en cada caso 50 \mul de prouroquinasa
recombinante (Landing Biotech Inc., Brighton, MA, EE.UU.; 5
\mug/ml en tampón para ensayos I) y en cada caso 50 \mul de la
sustancia cromógena S-2444^{TM} (0,6 mM) en el
tampón para ensayos II (Tris/HCl 100 mM, NaCl 150 mM,
Na-azida 15 mM, Tween® 80 al 0,1%, pH 8,2) en una
copita de la MTP, y se sometió a incubación a + 37ºC. Se observó el
cambio en la absorción (OD) del preparado reactivo bajo una
longitud de onda de 405 nm. Los resultados se han resumido en la
Tabla 1. Es posible una diferenciación entre portadores y no
portadores de la variante FASP MR I mediante la formación de un
cociente entre V_{max} de la cinética de reacción de una muestra
sin la adición de aprotinina (V_{max \ 0}) y con la adición de
aprotinina (V_{max \ aprotinina}). A tal efecto rige la siguiente
expresión:
V_{max0} de
FSAP de tipo salvaje / V_{max \ aprotinina} de FSAP de tipo
salvaje > V_{max0} de FSAP MR I / V_{max \ aprotinina}
de FSAP MR
I.
Por otra parte, las muestras de FSAP MR I (MR I)
muestran una diferencia entre V_{max0} y V_{max \ aprotinina}
que es manifiestamente menor que las muestras de FSAP de tipo
salvaje (WT) (Véase la Tabla 1). En la columna "MW" se ha
consignado el valor medio (Mittelwert) de las tres determinaciones
individuales.
La máxima inclinación (pendiente) de las curvas
tiempo-conversión se determinó mediante regresión
lineal en una región suficientemente lineal de la curva
tiempo-conversión, y proveyó la máxima velocidad de
reacción V_{max} de una reacción en mOD/minuto.
Las Figuras 1 y 2 muestran las diferentes
cinéticas de reacción de la conversión del
S-2444^{TM}, por consiguiente la actividad del
FSAP que activa la prouroquinasa. La Figura 1 muestra las cinéticas
de reacción que se han determinado para una muestra de plasma de un
no portador, con y sin la adición de aprotinina (0,036 y 0,0554
KIE/ml, concentración final de aprotinina). En este caso, 0,036
KIE/ml de aprotinina corresponden a una dilución de aprotinina de
1:30.000, y 0,055 KIE/ml corresponde a una dilución de aprotinina de
1:20.000. La Figura 2 muestra las cinéticas de reacción que se
determinaron para una muestra de plasma de un portador heterocigoto
de la variante FASP MR I con y sin la adición de aprotinina (0,036 y
0,055 KIE/ml de concentración final de la aprotinina). Puede
reconocerse claramente que la actividad del FSAP que activa la
prouroquinasa en la muestra del no portador en presencia de
aprotinina se inhibe manifiestamente en mayor grado que la actividad
del FSAP que activa la prouroquinasa en la muestra del portador
heterocigoto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se utilizaron las mismas placas de
microtitulación como se describe en el Ejemplo 1. En cada una de las
cavidades se introdujeron mediante pipeta 100 \mul de una muestra
de plasma a ser determinada, en una dilución de 1:50 en tampón para
muestras (Véase el Ejemplo 1). Después de incubación a +37ºC durante
una hora se removieron las partes componentes que han quedado sin
ligar mediante triple lavado con una solución de ClNa isotónica
tamponada con fosfato de sodio 50 mM, Tween® 20 al 0,02%, pH
6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de la actividad
amidolítica del FSAP, después de la remoción de la muestra y del
lavado de la fase sólida, se añadieron:
a).- 30 \mul del tampón para ensayos I (Véase
el Ejemplo 1); o
b).- 30 \mul del tampón para ensayos I, que
además contenía aprotinina en una concentración tal que se logró
una concentración final de 0,055 KIE/ml de aprotinina en el
preparado reactivo (Véase el Ejemplo 1);
y en cada caso 80 \mul del substrato de
cromógeno S-2288^{TM} (1,5 mmol/L; Chromogenix
Instrumentation Laboratory S.p.A., Milán, Italia) en el tampón para
ensayos (Véase el Ejemplo 1) en la cavidad de ensayo, y se sometió
a incubación a + 37ºC durante una hora. A efectos de reducir los
efectos de volatilización durante el tiempo de incubación,
relativamente prolongado en el MTP, se recubrió con aceite
mineral.
\vskip1.000000\baselineskip
El cambio en la absorción (OD) del preparado
reactivo fue objeto de seguimiento con una longitud de onda de 405
nm, y se determinó la máxima velocidad de la reacción V_{max}
(Véase el Ejemplo 1). Se han resumido los resultados en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Es posible una diferenciación entre portadores y
no portadores de la variante FASP MR I mediante la formación de una
relación (cociente) entre la V_{max} de la cinética de reacción de
una muestra sin adición de aprotinina (V_{max0}) y con adición de
aprotinina (V_{max \ aprotinina}). A tal efecto rige la siguiente
expresión:
V_{max0} de
FSAP de tipo salvaje / V_{max \ aprotinina} de FSAP de tipo
salvaje > V_{max0} de FSAP MR I / V_{max \ aprotinina}
de FSAP MR
I.
Por otra parte, las muestras de FASP MR I (MR I)
muestran una diferencia entre V_{max0} y V_{max \ aprotinina}
manifiestamente menor que las muestras de FSAP de tipo salvaje (WT)
(Véase la Tabla 2). En la columna "MW" se ha consignado el
valor medio de las tres determinaciones individuales.
Las Figuras 3 y 4 muestran las diferentes
cinéticas de reacción de la conversión del
S-2488^{TM}, por consiguiente la actividad
amidolítica del FSAP. La Figura 3 muestra las cinéticas de reacción
que se han determinado para una muestra de plasma de un no portador
de la mutación MR I, con y sin la adición de aprotinina (0,036 y
0,055 KIE/ml, concentración final de la aprotinina). La Figura 4
muestra las cinéticas de reacción que se determinaron para una
muestra de plasma de un portador heterocigoto de la variante FASP MR
I con y sin la adición de aprotinina (0,036 y 0,055 KIE/ml de
concentración final de aprotinina). Puede reconocerse claramente que
la actividad amidolítica del FSAP en la muestra del no portador en
presencia de aprotinina se inhibe manifiestamente en mayor grado
que la actividad amidolítica del FSAP en la muestra del portador
heterocigoto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utilizaron las mismas placas de
microtitulación que en el Ejemplo 1. En cada una de las cavidades
se introdujeron mediante pipeta 100 \mul de una muestra de plasma
a ser analizada, en una dilución de 1:15 en tampón para muestras
(Véase el Ejemplo 1). Después de incubación a +37ºC durante una hora
se removieron mediante triple lavado las partes componentes que han
quedado sin ligar, como en el Ejemplo 1.
Para determinar la actividad amidolítica del
FSAP, en el momento t_{0} se introdujeron en la copita de la MTP
en cada caso 80 \mul del substrato de cromógeno
S-2288^{TM} (1,5 mmol/L; Chromogenix
Instrumentation Laboratory S.p.A., Milán, Italia) en una mezcla
50:50 de tampón para ensayo I y tampón para ensayo II (tampón para
ensayo I y II, véase el Ejemplo 1), y se somete a incubación a +37ºC
en el fotómetro. Después de aproximadamente 60 minutos se añadió
aprotinina hasta una concentración final de 2,95 KIE/ml o del
correspondiente anticuerpo monoclonal (MAK) hasta un concentración
final de aproximadamente 60 \mug/ml para cada preparado reactivo.
Se observó el cambio en la absorción de los preparados reactivos
bajo una longitud de onda de 405 nm, y se determinó la velocidad
máxima de la reacción V_{max} (véase el Ejemplo 1). A efectos de
reducir los efectos de vaporización durante el período de
incubación, relativamente prolongado en el MTP, se recubrió con
aceite mineral.
Es posible una diferenciación entre portadores y
no portadores de la variante FASP MR I mediante la formación de una
relación, por ejemplo del cociente entre la velocidad máxima de la
reacción antes de la adición del modulador diferencial de la
actividad (V_{max}) y la velocidad máxima de la reacción después
de la adición del modulador diferencial de la actividad (V_{max \
aprotinina}).
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a la Figura 5, para el modulador de la
actividad aprotinina rige la siguiente expresión:
V_{max0} de
FSAP de tipo salvaje / V_{max \ aprotinina} de FSAP de tipo
salvaje > V_{max0} de FSAP MR I / V_{max \ aprotinina}
de FSAP MR
I.
En la Tabla 3 se ha representado, además de la
aprotinina también la influencia de anticuerpos monoclonales (MAKS)
sobre el cociente V_{max}/V_{max \ modulador \ de \ actividad}.
En el caso de la muestra del no portador de la variante FASP MR I
(muestra de tipo salvaje; WT) se llevaron a cabo tres mediciones
independientes entre sí. En el caso de la muestra del portador
heterocigoto de la variante FASP MR I (MR I) se llevaron a cabo 6
mediciones independientes entre sí. Se calcularon los valores medios
(MW) de V_{max}/V_{max \ modulador \ de \ actividad}
(V_{max}/V_{maxA}) y las desviaciones estándar referidas al
universo estadístico (Staw). Los controles negativos, es decir, la
adición de un correspondiente volumen de tampón para ensayos I y de
tampón para ensayos II en la relación 50:50 sin modulador de la
actividad, dieron como resultado un MW V_{max}/V_{max \ A}, de
0,81 +/- 0,12.
A efectos de obtener un indicio acerca del
significado de la influencia de un modulador de la actividad, se
llevó a cabo un ensayo-t (t-Test).
El ensayo-t se basaba en la adopción de dos muestras
aleatorias de varianza igual y desigual. Se llevó a cabo un ensayo
unilateral (un área extrema). Este ensayo-t muestra
que la aprotinina, el anticuerpo monoclonal
anti-FSAP MAK 2004-151/013 (2) (DSM
ACC2726) y el anticuerpo monoclonal anti-FSAP MAK
2004-98/016(3), este último sirve aquí para
fines ilustrativos solamente y no forma parte de la invención,
reduce más fuertemente la correspondiente significancia la actividad
de la muestra WT con respecto a la muestra de MR I, por lo que el
cociente WT/MR I es > 1. En cambio, el anticuerpo monoclonal
anti-FSAP MAK 1102/1189-2 (DSM
ACC2454) reduce más fuertemente la actividad de la muestra de MR I
con respecto a la muestra de tipo salvaje, por lo que el cociente
WT/MR I es < 1. Este es también el caso para el anticuerpo
monoclonal anti-FSAP MAK
2004-35/90(1) (DSM ACC2674). Dado que en este
caso los valores de P todavía no indican ninguna significancia sino
que son comparativamente bajos, puede partirse de la base que en
caso de haber una cantidad suficiente de mediciones, es decir en
caso de un mayor número de casos, puede excluirse la hipótesis a
cero. El MAK 1102/1189-2 (DSM ACC 2454) y el MAK
2004 2004-35/05 (1) (DSM ACC 2674), que sirven para
fines de ilustración solamente y que no forman parte de la
invención, también pueden ser adecuados como moduladores de la
actividad.
\newpage
En contraste con ello, debido a sus cocientes
WT/MR I y los valores de sus ensayos-t, los
anticuerpos monoclonales anti-FSAP, MAK
1102/570-09 (DSM ACC2533, véase el documento EP 1
334 983 A2), MAK 2004-9/026(2) (DSM ACC2676,
véase el documento EP 1 630 175 A1) y MAK
2004-34/08(2) DSM ACC2725, véase el documento
EP 1 630 175 A1) no son adecuados como moduladores de la
actividad.
Claims (10)
1. Procedimiento de diagnóstico para la
detección de personas que tienen una expresión heterocigota u
homocigota genéticamente condicionada de la variante MR I de la
proteasa que activa el factor VII (FSAP), en el que se determina la
actividad del FSAP, caracterizado porque se determina la
actividad del FSAP que se halla contenido en una muestra, en
ausencia y también en presencia de un modulador diferencial de la
actividad, en el que el modulador diferencial de la actividad
cambia la actividad del FSAP en muestras de personas que tienen una
expresión heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la
variante MR I del FSAP en una amplitud que es distinta de la
amplitud en las muestras de personas que no expresan la variante MRI
del FSAP.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el que la actividad del FSAP que se determina, es la actividad
del FSAP que activa el activador del plasminógeno.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
en el que la actividad del FSAP que se determina es la actividad
amidolítica del FSAP.
4. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el modulador diferencial de la
actividad inhibe o activa la actividad del FSAP en muestras de
personas que no expresan la variante MR I del FSAP, en una amplitud
mayor que en muestras de personas que tienen una expresión
heterocigota u homocigota genéticamente condicionada de la variante
MR I del FSAP.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, en el que como modulador diferencial
de la actividad se utiliza aprotinina.
6. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, en el que como modulador diferencial
de la actividad se utiliza un anticuerpo anti-FSAP
monoclonal o policlonal.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
en el que se utiliza un anticuerpo anti-FSAP
monoclonal producido por la cepa de células hibridoma DSM
ACC2726.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
en el que se utiliza un anticuerpo anti-FSAP
monoclonal que se liga a un epítope de FSAP que se liga por un
anticuerpo anti-FSAP monoclonal producido por la
cepa de células hibridoma DSM ACC 2726.
9. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la amplitud del cambio en la
actividad del FSAP se determina como sigue:
a).- determinación de la actividad del FSAP en
una primera alícuota de una muestra en presencia del modulador
diferencial de la actividad;
b).- determinación de la actividad del FSAP en
una segunda alícuota de la misma muestra en ausencia del modulador
diferencial de la actividad; y
c).- comparación de ambas actividades
determinadas en a) y b).
10. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la amplitud del cambio en la
actividad del FSAP se determina como sigue:
a).- determinación de la actividad del FSAP en
una alícuota de una muestra en presencia del modulador diferencial
de la actividad; seguida por:
b).- adición del modulador diferencial de la
actividad al preparado reactivo; y
c).- determinación de la actividad del FSAP en
presencia del modulador diferencial de la actividad; y
d).- comparación de ambas actividades
determinadas en a) y c).
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