ES2331075T3 - Vectores virales. - Google Patents
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Abstract
Un herpesvirus que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende: (i) un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y (ii) un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.
Description
Vectores virales.
La presente invención se refiere a cepas de
herpesvirus con actividad antitumoral mejorada en comparación con
cepas anteriormente conocidas.
Se ha demostrado que los virus tienen utilidad
en una diversidad de aplicaciones en biotecnología y medicina en
muchas ocasiones. Cada una se debe a la capacidad única de los virus
de introducirse en células con gran eficacia. Esto viene seguido en
dichas aplicaciones de la expresión de genes de virus y de la
replicación y/o expresión de un gen heterólogo insertado. Por lo
tanto, los virus pueden suministrar y expresar genes virales u
otros genes en células que pueden ser útiles, por ejemplo, en
terapia génica o en el desarrollo de vacunas, o pueden ser útiles
en la destrucción selectiva de células por replicación lítica o por
la acción de un gen suministrado, por ejemplo, en el
cáncer.
cáncer.
Se ha sugerido que el virus herpes simple (HSV)
es de utilidad para el tratamiento oncolítico del cáncer. Sin
embargo, un virus para el uso en el tratamiento del cáncer debe
incapacitarse de modo que ya no sea patógeno, es decir, que no se
replique en y destruya células no tumorales, pero de modo que
todavía pueda introducirse en y destruir células tumorales. Para el
tratamiento oncolítico del cáncer, que también puede incluir el
suministro de un gen o genes que aumenten el efecto terapéutico, se
han identificado varias mutaciones en HSV que todavía permiten que
el virus se replique en cultivo y en células activamente en división
in vivo (por ejemplo, en tumores), pero que evitan una
replicación significativa en tejido normal. Dichas mutaciones
incluyen la alteración de los genes que codifican ICP34.5, ICP6 y
timidina quinasa. De estos, los virus con mutaciones en ICP34.5 o
ICP34.5 junto con la mutación de, por ejemplo, ICP6, han demostrado
hasta ahora el perfil de seguridad más favorable. Se ha demostrado
que los virus en los que se ha realizado una deleción solamente en
el factor de neurovirulencia ICP34.5 se replican en muchos tipos de
células tumorales in vitro y se replican selectivamente en
tumores cerebrales inducidos artificialmente en ratones al tiempo
que evitan el tejido circundante. Los ensayos clínicos de fase
temprana también han demostrado su seguridad en seres humanos.
La presente invención proporciona virus con
capacidades mejoradas para la destrucción de células tumorales
in vivo. Los virus proporcionados por la presente invención
comprenden una mutación inactivante en el gen que codifica ICP34.5
y son capaces de suministrar dos genes que, en combinación, aumentan
el efecto terapéutico. El virus comprende los dos tipos de gen
siguientes:
- Un gen heterólogo que codifica una enzima activadora de profármaco capaz de convertir un profármaco inactivo o escasamente activo en la forma activa o más activa. El tratamiento de tumores con el virus se acompaña por lo tanto de la administración del profármaco; y
- Un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de fusionar células (es decir, provocar la formación de sincitios). Esto proporciona por sí mismo efectos antitumorales que pueden estar mediados por la inducción de una respuesta inmune. Sin embargo, en combinación con la activación de profármaco este efecto antitumoral se aumenta. Dichos genes fusogénicos incluyen lipoproteínas de la envuelta retroviral modificadas tales como las procedentes del virus de la leucemia del mono gibón o retrovirus endógeno humano W, las proteínas F y H fusogénicas del virus del sarampión o la proteína G del virus de la estomatitis vesicular, pero también pueden usarse otros genes que codifican proteínas capaces de causar fusión celular.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus puede comprender además un gen
heterólogo que codifique una proteína inmunomoduladora. La proteína
inmunomoduladora promueve una respuesta inmune antitumoral. Dicho
gen o genes incluyen inmunomoduladores tales como
GM-CSF, TNF\alpha, CD40L u otras citocinas o
moléculas co-estimuladoras. La proteína
inmunomoduladora aumenta los efectos del gen activador de
profármaco y/o la proteína capaz de causar la fusión de célula con
célula en solitario.
La presente invención proporciona por lo tanto
virus capaces de la destrucción oncolítica de células tumorales en
los que, cuando se administran a un paciente, opcionalmente en
combinación con un profármaco, las propiedades
anti-tumorales del virus se aumentan por las
acciones combinadas del profármaco activado y la proteína fusogénica
y, opcionalmente, la proteína inmunomoduladora expresada a partir
del genoma viral.
\newpage
Por consiguiente, la invención proporciona:
- -
- un herpesvirus que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que comprende:
- (i)
- un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y
- (ii)
- un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona:
- -
- un herpesvirus de la invención para el uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia;
- -
- uso de un herpesvirus de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer; y
- una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un herpesvirus de acuerdo con la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La Figura 1 representa los plásmidos usados para
construir los virus de la invención e ilustra cómo se construyen
los plásmidos. Los plásmidos codifican un gen de citosina desaminasa
o una glicoproteína fusogénica de leucemia del mono gibón (GALV), o
ambos genes flanqueados por secuencias de HSV1 que flanquean el gen
codificante de ICP34.5. Los plásmidos pueden usarse para
recombinación homóloga en el gen de HSV1 para sustituir el gen
codificante de ICP34.5 con el gen de la citosina desaminasa, el gen
de la glicoproteína de GALV o ambos genes. Estos plásmidos se usan
después para construir los virus que se muestran en la Figura 2.
La Figura 1a muestra la subclonación del gen
Fcy:Fur a partir de pORF Fcy:Fur (Invitrogen) en pRcRSV
(Invitrogen). El gen Fcy:Fur se eliminó por digestión de
restricción (Nhe I y Nco I (enromado con polimerasa T^{4}). Este
fragmento se ligó después en pRcRSV (Invitrogen) cortado con
Xba I y Hind III (enromado con polimerasa T^{4}).
La Figura 1b muestra la subclonación del casete
RSV Fcy:Fur pA de pRcRSV en p-34.5 mediante
digestión de restricción (Pvu II, NruI). Este fragmento se ligó
después en el vector lanzadera p-34.5 cortado con
NotI (enromado con polimerasa T^{4}). El plásmido
p-34.5 se basa en pSP72 (Promega) y contiene
dos regiones flanqueantes a cualquier lado del gen de ICP34.5 de
HSV-1 (basado en la cepa 17+ del
HSV-1 (123462-124958 pb,
125713-126709 pb)) Genbank X14112).
La Figura 1c muestra la envuelta truncada
(env) del virus de la leucemia del mono gibón (Genbank
NC_001885, 5552-7555 pb) que se obtuvo por
RT-PCR a partir de una línea celular productora de
virus (MLV 144, Rangan et al., 1979). La envuelta (GALV
envR-) se clonó en pcDNA3 (Invitrogen) (mediante
digestión de restricción con EcoRI y Not I), un vector de expresión
de mamíferos, y se ensayaron tres de los clones para determinar la
producción de sincitios.
La Figura 1d muestra la anulación de un sitio
Not-1 en pcDNA3 GALV env R- por digestión usando Not
I y enromado con polimerasa T^{4}, seguido de religación.
La Figura 1e muestra la subclonación de virus
GALV env R-menos (Genbank NC_001885,
5552-7555 pb) de pcDNA3 (Invitrogen) en pGEM
T Easy por PCR (Promega).
La Figura 1f muestra la subclonación de GALV env
R de pGEM T Easy (Promega) en p-34.5 mediante
digestión de restricción (NotI). El plásmido p-34.5
se basa en pSP72 (Promega) y contiene dos regiones
flanqueantes a cualquier lado del gen de ICP 34.5 de
HSV-1 (basado en la cepa 17+ del
HSV-1 (123462-124958 pb,
125713-126790 pb)) Genbank X14112).
La Figura 1g muestra el vector lanzadera final
que contiene regiones flanqueantes de ICP34.5 (basadas en la cepa
17+ del HSV-1 (123462-124958 pb,
125713-126790 pb) Genbank X14112) y que expresa la
envuelta truncada (env) del virus de la Leucemia del Mono
Gibón (Genbank NC_001885, 5552-7555 pb) bajo un
promotor de CMV y poli A de BGH (Invitrogen).
La Figura 1h muestra la subclonación del casete
RSV Fcy:Fur pA de pRcRSV en p-34.5 GALV (**)
mediante digestión de restricción (Pvu II, NruI). Este fragmento se
ligó después en el vector lanzadera p-34.5 GALV
cortado con Nru I. El plásmido p-34.5 se basa en
pSP72 (Promega) y contiene dos regiones flanqueantes a
cualquier lado del gen de ICP 34.5 del HSV-1
(basado en la cepa 17+ del HSV-1
(123462-124958 pb, 125713-126790 pb)
Genbank X14112) y que expresa la envuelta truncada (env) del
virus de la Leucemia del Mono Gibón (Genbank NC_001885,
5552-7555 pb) bajo un promotor de CMV y poli A de
BGH (Invitrogen).
La Figura 2 es una representación esquemática de
los vectores virales usados en este estudio. La cepa JS1 del
HSV-1 se aisló tomando un hisopo de una calentura de
un voluntario de otro modo sano (Liu et al 2003). El
JS1/34.5-/47- tiene dos deleciones. La primera implica la
eliminación de la región codificante del gen de ICP34.5
(nucleótidos 124948-125713 basándose en la secuencia
de la cepa 17+ del HSV-1). El segundo implica una
deleción de 280 pb de ICP47 (nucleótidos
145570-145290 basándose en la secuencia de la cepa
17+ del HSV-1) (Liu et al 2003). El
JS1/34.5-/GALenv R-/47- expresa la envuelta retroviral del virus de
la leucemia del mono gibón -el péptido R (Genbank NC_001885,
5552-7555 pb) (Bateman et al 2000, Galanis
et al 2001) bajo el promotor de CMV. El
JS/34.5-/RSV/Fcy:Fur/47- expresa la fusión del activador de
profármaco enzimático citosina desaminasa de levadura con uracil
fosforribosiltransferasa (Invivogen) para el promotor de RSV. El
JS1/34.5-/GALV/env R-/Fyc:Fur/47- combina tanto la envuelta
retroviral fusogénica como el activador de profármaco
enzimático.
La Figura 3 muestra la fusión de células
tumorales por GALV en R-. Se muestra una placa de JS1/34.5-/47- (A)
y JS1/34.5-/47-/GALV (B) después de la infección de células RG2 de
rata y tinción con cristal violeta.
La Figura 4 muestra el efecto del sobrenadante
de células HT1080 48 horas después de la infección con el virus de
control JS1/34.5-/47-, JS 1/34.5-/47-/Fcy:Fur o JS
1/34.5-/47-/GALV/Fcy:Fur, en presencia o ausencia de
5-fluorocitosina (5-FC). Después
estos sobrenadantes se inactivaron por calor y después se añadieron
a células HT1080 recién preparadas durante 72 horas. Los dos
paneles de más abajo a la derecha muestran una muerte celular casi
completa indicando que la 5-fluorocitosina se había
convertido en 5-fluorouracilo por los virus que
contienen Fcy:Fur.
La Figura 5 muestra el efecto de los virus
JS1/34.5-/47, JS1/34.5-/47-GALV,
JS1/34.5-/47-/Fcy:Fur sobre el encogimiento de tumores implantados
en ratas. Se implantaron células tumorales 9L de rata en el flanco
de ratas Fischer y se dejó que se desarrollaran para dar un
diámetro tumoral de aproximadamente 4-5 mm. Después
se les inyectó a grupos de cinco ratas 50 \mul de 1 x 10esp8
ufp/ml del virus indicado, por vía intratumoral, los días 7, 10,
13, 17 y 20. Se administraron 500 mg/kg de
5-fluorocitosina por la vía intraperitoneal los
días 9, 11, 12, 14, 16, 18, 19, 21, 23, 24, 25, 26 y se midieron los
diámetros tumorales. Las barras de error representan la desviación
típica.
Un herpesvirus de la invención es capaz de
infectar eficazmente células tumorales diana. Los genes que
codifican ICP34.5 están inactivados en el virus. La mutación de
ICP34.5 permite una actividad oncolítica selectiva. Se describen
mutaciones adecuadas en los genes de ICP34.5 en Chou et al
1990 y Maclean et al 1991, aunque puede usarse cualquier
mutación que vuelva a ICP34.5 no funcional. Los genes que codifican
ICP47, ICP6 y/o timidina quinasa pueden inactivarse adicionalmente,
así como otros genes si dicha inactivación reduce significativamente
el efecto oncolítico o si dicha deleción aumenta la oncolisis u
otras propiedades deseables del virus. Cuando el gen que codifica
ICP47 se muta puede mutarse de tal forma que el gen de US11 cercano
se exprese en momentos más tempranos de lo habitual en el ciclo de
replicación del HSV. Dicha mutación se describe en Liu et al
2003. Los virus de la invención codifican además dos o más de una
enzima activadora de profármaco, una proteína capaz de causar la
fusión de célula con célula y una proteína inmunomoduladora.
La terminología usada en este documento para los
genes de herpesvirus es la usada comúnmente para genes de HSV.
Cuando los herpesvirus de la invención son de un herpesvirus que no
es HSV, se inactiva el equivalente funcional de cada uno de los
genes de HSV mencionados. Un gen que no es de HSV que es un
equivalente funcional de un gen de HSV realiza la misma función que
el gen de HSV y comparte un grado de homología de secuencia con el
gen de HSV. El equivalente funcional puede tener una homología de al
menos el 30%, por ejemplo de al menos el 40% o de al menos el 50%
con el gen de HSV. La homología puede determinarse como se describe
a continuación.
Las regiones virales modificadas para los fines
descritos anteriormente pueden eliminarse (completamente o
parcialmente) o hacerse no funcionales o sustituirse por otras
secuencias, en particular por un gen que codifique una enzima
conversora de profármaco, un gen que codifique una proteína capaz de
causar la fusión de célula con célula o un gen que codifique una
proteína inmunomoduladora.
El virus de la invención puede proceder de una
cepa de HSV de virus herpes simple. La cepa de HSV puede ser una
cepa de HSV1 o HSV2, o un derivado de la misma y preferiblemente es
de HSV-1. Los derivados incluyen recombinantes
intertipo que contienen ADN de cepas de HSV1 y HSV2. Dichos
recombinantes intertipo se describen en la técnica, por ejemplo, en
Thompson et al 1998 y Meignier et al 1988. Los
derivados tienen preferiblemente una homología de secuencia de al
menos el 70% con el genoma de HSV1 o HSV2, más preferiblemente de al
menos el 80%, aún más preferiblemente de al menos el 90% o 95%. Más
preferiblemente, un derivado tiene una identidad de secuencia de al
menos el 70% con el genoma de HSV1 o HSV2, más preferiblemente una
identidad de al menos el 80%, aún más preferiblemente una identidad
de al menos el 90%, 95%, 98%.
Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el
programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por
ejemplo, usarse en sus ajustes por defecto) (Devereux et al.
(19849, Nucleic Acids Research, 12, págs. 387-395).
Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la
homología o alinear secuencias (típicamente en sus ajustes por
defecto), por ejemplo como se describe en Altschul (1993) J. Mol.
Evol. 36: 290-300; Altschul et al. (1990) J.
Mol. Biol. 215: 403-10.
El programa informático para realizar análisis
de BLAST está disponible públicamente a través del National Centre
of Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.Hov/).
Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de
alta puntuación (HSP) por identificación de palabras cortas de
longitud W en la secuencia de consulta que coincidan o cumplen
cierta puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con
una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de
datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina
(Altschul et al., 1990). Estas coincidencias de palabra
vecina inicial actúan como semillas para iniciar búsquedas para
encontrar HSP que las contengan. Las coincidencias de palabra se
extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta
que pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las
extensiones para las coincidencias de palabra en cada dirección se
detienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa
disminuye en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la
puntuación acumulativa se hace cero o inferior debido a la
acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación
negativa; o se alcanza al final de cualquiera de las secuencias.
Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la
sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa
como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11,
alineamientos de la matriz de puntuación BLOSUM62 (B) (véase
Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10915-10919) de 50, un valor esperado (E) de 10, M =
5, N = 4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, por
ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por
el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor (P(N))
que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una
coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se
produciría por azar. Por ejemplo, una secuencia se considera
similar a otra secuencia si la probabilidad de suma menor en la
comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es
menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente
0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y, más
preferiblemente, menor de aproximadamente 0,001.
Un derivado puede tener la secuencia de un
genoma de HSV1 o HSV2 modificada por sustituciones de nucleótidos,
por ejemplo, de 1, 2 ó 3 a 10, 25, 50 ó 100 sustituciones. El genoma
de HSV1 o HSV2 puede modificarse como alternativa o además mediante
una o más inserciones y/o deleciones y/o mediante una extensión en
cualquiera o ambos extremos.
Las cepas de virus de la invención pueden ser
cepas "que no sean de laboratorio". Estas también pueden
denominarse cepas "clínicas". Un especialista en la técnica
será capaz de distinguir fácilmente entre una cepa de laboratorio y
una cepa que no es de laboratorio o cepa clínica. Se proporcionan a
continuación orientaciones adicionales sobre las propiedades que
probablemente presentarán las cepas de virus.
La distinción clave entre una cepa de
laboratorio y una cepa que no es de laboratorio es que las cepas de
laboratorio actualmente en uso común se han mantenido durante
periodos prolongados, muchos años en algunos casos, en cultivo.
Todas las cepas de HSV de laboratorio se han aislado originariamente
a partir de individuos infectados y de este modo proceden de cepas
clínicas. El cultivo de virus tales como HSV implica una técnica
conocida como pase en serie. Para cultivar y mantener virus, se
infectan células adecuadas con el virus, el virus se replica en el
interior de la célula y después se recoge el virus; después se
reinfectan células recién preparadas, constituyendo este proceso un
ciclo del pase en serie. Cada ciclo de este tipo puede llevar, por
ejemplo, unos pocos días en el caso del HSV. Como se ha analizado
anteriormente, dicho pase en serie puede conducir a cambios en las
propiedades de la cepa de virus en el sentido de que tiene lugar una
selección para propiedades que favorezcan el desarrollo en cultivo
(por ejemplo, replicación rápida) en oposición a propiedades útiles
para aplicaciones prácticas, por ejemplo, mantenimiento de la
capacidad para viajar a lo largo de axones en el caso del HSV o
para infectar células humanas.
Las cepas de laboratorio en uso actualmente
incluyen cepa F de HSV-1, cepas 17+ de
HSV-1 y cepa KOS de HSV-1. Las
cepas que no son de laboratorio útiles en la presente invención
tienen típicamente una actividad oncolítica mejorada en comparación
con las cepas de HSV-1 F, 17+ y cepas KOS con
modificaciones equivalentes.
Una cepa que no es de laboratorio es una que se
ha aislado recientemente a partir de un individuo infectado. Una
cepa que no es de laboratorio de la presente invención es una cepa
recientemente aislada que se ha modificado para que el gen que
codifica ICP34.5 se inactive de modo que no puede expresarse una
proteína ICP34.5 funcional y para incluir un gen que codifica una
proteína activadora de profármaco, un gen que codifica una proteína
capaz de causar fusión celular y/o una proteína inmunomoduladora. Un
virus de la invención habrá pasado cierto tiempo en cultivo para
permitir que se realicen las modificaciones necesarias pero
cualquier tiempo que haya pasado en cultivo será comparativamente
corto. El aislado clínico puede haberse congelado para
almacenamiento antes de la modificación o puede congelarse después
de que se hayan realizado las modificaciones. Se preparan de la
invención de tal forma que se conserven sustancialmente las
propiedades deseables de los aislados clínicos originales de los
que proceden.
Una cepa de virus de la invención procede una
cepa de virus parental si la cepa de virus parental se muta para
producir el virus. Por ejemplo, un virus de la invención puede
proceder del aislado clínico JS1. La cepa parental de dicho virus
procedente de JS1 puede ser JS1 u otra cepa de HSV procedente de
JS1. Por lo tanto, un virus de la invención puede ser un virus JS1
que carece de un gen codificante de ICP34.5 funcional y que
comprende dos o más de un gen que codifica una enzima conversora de
profármaco, un gen que codifica una proteína capaz de causar la
fusión de célula con célula y un gen que codifica una proteína
inmunomoduladora. Además, dicho virus puede contener cualquier otra
mutación, por ejemplo, como se menciona en este documento.
Un virus de la invención es capaz de infectar
eficazmente células cancerosas humanas diana. Cuando dicho virus es
una cepa que no es de laboratorio o clínica se habrá aislado
recientemente de un individuo infectado por HSV y después se habrá
explorado para determinar la capacidad deseada de replicación,
infección o destrucción aumentada de células tumorales y/o de otras
células in vitro y/o in vivo en comparación con cepas
de laboratorio convencionales tales como cepas F, KOS y 17+ de
HSV-1. Dichos virus de la invención con propiedades
mejoradas en comparación con cepas de virus de laboratorio se
modifican después por ingeniería genética de modo que carezcan de
un gen de ICP34.5 funcional y codifiquen dos o más de los siguientes
genes: un gen para una enzima activadora de profármaco, un gen para
una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula y un
gen que codifique una proteína inmunomoduladora, donde dichos genes
están bajo el control de un promotor o promotores adecuados. Una
cepa de virus se ha aislado recientemente si se ha sometido a tres
años o menos de cultivo desde el aislamiento de la cepa parental
clínica no modificada a partir de su hospedador. Más
preferiblemente, la cepa se ha sometido a un año o menos de
cultivo, por ejemplo, nueve meses o menos, seis meses o menos, tres
meses o menos, dos meses o menos, un mes o menos, dos semanas o
menos o una semana o menos. Mediante estas definiciones de tiempo
en cultivo, se entiende tiempo realmente pasado en cultivo. Por lo
tanto, por ejemplo, una práctica común es congelar cepas de virus
para conservarlas. Evidentemente, la conservación por congelación o
de una forma equivalente no se califica de mantenimiento de la cepa
en cultivo. Por lo tanto, el tiempo pasado congelado o conservado
de otro modo no se incluye en las definiciones anteriores de tiempo
pasado en cultivo. El tiempo pasado en cultivo es típicamente el
tiempo realmente pasado some-
tiéndose a pase en serie, es decir, tiempo durante el que se puede suceder la selección de características no deseables.
tiéndose a pase en serie, es decir, tiempo durante el que se puede suceder la selección de características no deseables.
Preferiblemente, una cepa de virus que no es de
laboratorio se ha sometido a 1.000 o menos ciclos o pase en serie
desde el aislamiento de su cepa precursora clínica no modificada a
partir de su hospedador. Más preferiblemente, se ha sometido a 500
o menos, 100 o menos, 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o
menos, 50 o menos, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos, 10 o menos,
5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 ó 1 de dichos ciclos.
Preferiblemente, un virus que no es de
laboratorio tiene una mayor capacidad, medida mediante ensayos
estadísticos convencionales, que una cepa de laboratorio de
referencia con las modificaciones equivalentes para realizar
ciertas funciones útiles en la aplicación a mano. En el caso de un
virus oncolítico para tratamiento de tumores, una cepa de virus que
no es de laboratorio de la invención tendrá preferiblemente una
mayor capacidad que una cepa de laboratorio de referencia con
modificaciones equivalentes para infectar o replicarse en células
tumorales, destruir células tumorales o propagarse entre células en
tejido. Más preferiblemente, dicha mayor capacidad es una capacidad
estadísticamente significativamente superior. Por ejemplo, de
acuerdo con la invención, una cepa que no es de laboratorio de la
invención puede tener hasta 1,1 veces, 1,2 veces, 1,5, veces, 2
veces, 5, veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces la
capacidad de la cepa de referencia en lo que se refiere a la
propiedad que se esté ensayando. Preferiblemente, la cepa de
referencia se selecciona de la cepa 17+ de HSV-1,
HSV-1(F) y HSV-1 KOS.
El análisis estadístico de las propiedades
descritas en este documento puede realizarse mediante ensayos
convencionales, por ejemplo, pruebas t, ANOVA o pruebas de Chi
cuadrado. Típicamente, la significación estadística se mediará a un
nivel de p = 0,005 (5%), más preferiblemente p = 0,01p, p = 0,001, p
= 0,0001, p = 0,000001.
Los virus de la invención infectan y se replican
en células tumorales, destruyendo posteriormente las células
tumorales. Por lo tanto, dichos virus son competentes para la
replicación. Preferiblemente, son competentes para la replicación
selectivamente en células tumorales. Esto significa que se replican
en células tumorales y no en células no tumorales o que se replican
más eficazmente en células tumorales que en células no tumorales.
Por ejemplo, cuando se usa el virus para tratar un tumor en el
sistema nervioso central, el virus es capaz de replicarse en las
células tumorales pero no en las células neuronales circundantes.
Las células en las que el virus es capaz de replicarse son células
permisivas. La medición de la competencia para replicación
selectiva puede realizarse mediante los ensayos descritos en este
documento para medición de la capacidad de replicación y
destrucción de células tumorales y también se analiza mediante las
técnicas estadísticas mencionadas en este documento si se
desea.
Las propiedades de la cepa de virus respecto a
las células tumorales pueden medirse de cualquier forma conocida en
la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un virus para infectar una
célula tumoral puede cuantificarse midiendo la dosis de virus
necesaria para medir un porcentaje dado de células, por ejemplo, el
50 u 80% de células. La capacidad para replicarse en una célula
tumoral puede medirse por mediciones del desarrollo tales como las
realizadas en los Ejemplos, por ejemplo, por medición del desarrollo
de virus en células durante un periodo de 6, 12, 24, 36, 48 ó 72
horas o durante más tiempo.
La capacidad de un virus para destruir células
tumorales puede cuantificarse aproximadamente a ojo o cuantificarse
más exactamente por recuento del número de células vivas que quedan
con el tiempo para un punto de tiempo y MOI dados para un tipo
celular dado. Por ejemplo, pueden realizarse comparaciones a lo
largo de 24, 48 ó 72 horas y usarse cualquier tipo de célula
tumoral conocido. En particular, pueden usarse células de
adenocarcinoma colorrectal HT29, adenocarcinoma de próstata
LNCaP.FGC, adenocarcinoma de mama
MDA-MB-231, melanoma maligno
SK-MEL-28 o astrocitoma glioblastoma
U-87 MG. Puede usarse cualquiera de estos tipos
celulares o cualquier combinación de estos tipos celulares, así
como otros tipos celulares tumorales. Puede ser deseable construir
un panel convencional de tipos de células tumorales para este fin.
Para realizar un recuento del número de células vivas que quedan en
un punto de tiempo dado, puede contarse el número de células que
excluyen tripán azul (es decir, células vivas). La cuantificación
también puede realizarse mediante separación de células activadas
por fluorescencia (FACS) o ensayo de MTT. La capacidad para destruir
células tumorales también puede medirse in vivo, por
ejemplo, por medición de la reducción en el volumen del tumor
engendrada por un virus particular.
Para determinar las propiedades de virus de la
invención, generalmente será deseable usar una cepa de referencia
de laboratorio convencional para comparación. Puede usarse cualquier
cepa de referencia de laboratorio convencional adecuada. En el caso
de HSV, se prefiere usar una o más de la cepa 17+ de
HSV-1, cepa F de HSV1 o cepa KOS de HSV1. La cepa
de referencia tendrá típicamente modificaciones equivalentes a las
de la cepa de la invención que se esté ensayando. Por lo tanto, la
cepa de referencia tendrá típicamente modificaciones equivalentes
tales como deleciones de genes e inserciones de genes heterólogos.
En el caso de un virus de la invención, en el que los genes
codificantes de ICP34.5 se han vuelto no funcionales, los genes
codificantes de ICP34.5 también se habrán vuelto no funcionales en
la cepa de referencia. Las modificaciones realizadas en la cepa de
referencia pueden ser idénticas a las realizadas en la cepa de la
invención. Mediante esto, se entiende que las alteraciones de genes
en la cepa de referencia serán en posiciones exactamente
equivalentes a las de la cepa de la invención, por ejemplo, las
deleciones serán del mismo tamaño y en el mismo lugar. De forma
similar, en estas realizaciones, se insertarán genes heterólogos en
el mismo lugar, dirigidos por el mismo promotor, etc. Sin embargo,
no es esencial que se realicen modificaciones idénticas. Lo que es
importante es que el gen de referencia tenga modificaciones
funcionalmente equivalentes, por ejemplo, que los mismos genes se
vuelvan no funcionales y/o se inserte el mismo gen o genes
heterólogos.
Los diversos genes a los que se hace referencia
pueden volverse funcionalmente inactivos mediante varios
procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden
volverse funcionalmente inactivos por deleción o deleciones,
sustitución o sustituciones o inserción o inserciones,
preferiblemente por deleción. Las deleciones pueden eliminar una o
más porciones del gen o el gen completo. Por ejemplo, puede
realizarse la deleción de un solo nucleótido, dando como resultado
un cambio de la fase de lectura. Sin embargo, preferiblemente se
realiza una deleción o deleciones de mayor tamaño, por ejemplo, de
al menos el 25%, más preferiblemente de al menos el 50% de la
secuencia codificante y no codificante total (o como alternativa, en
términos absolutos, al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente al
menos 100 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1000
nucleótidos). Se prefiere particularmente eliminar el gen completo
y algunas de las secuencias flanqueantes. Cuando están presentes
dos o más copias del gen en el genoma viral, se prefiere que ambas
copias del gen se vuelvan funcionalmente inactivas.
Se realizan mutaciones en los herpesvirus
mediante métodos de recombinación homóloga bien conocidos por los
especialistas en la técnica. Por ejemplo, el ADN genómico del HSV se
transfecta junto con un vector preferiblemente un vector
plasmídico, que comprende la secuencia mutada flanqueada por
secuencias de HSV homólogas. La secuencia mutada puede comprender
una deleción o deleciones, sustitución o sustituciones o inserción o
inserciones, pudiendo todas construirse mediante técnicas de
rutina. Las inserciones pueden incluir genes marcadores de
selección, por ejemplo, lacZ o proteína verde fluorescente (GFP),
que pueden usarse para explorar virus recombinantes, por ejemplo,
actividad \beta-galactosidasa o fluorescencia.
Los virus de la invención llevan un gen
heterólogo que codifica una enzima activadora de profármaco y un gen
heterólogo que codifica una proteína capaz de causar una fusión de
célula con célula y opcionalmente un gen heterólogo que codifica
una proteína inmunomoduladora. La proteína fusogénica también puede
funcionar como proteína inmunomoduladora.
Preferiblemente, la proteína activadora de
profármaco es una enzima citosina desaminasa. Los genes de citosina
desaminasa son capaces de convertir el profármaco inactivo
5-fluorocitosina en el fármaco activo
5-fluorouracilo. Están disponibles diversos genes
de citosina desaminasa incluyendo los de origen bacteriano y de
origen de levadura. Puede usarse un segundo gen, típicamente un gen
que codifica una segunda enzima para aumentar la actividad de
conversión de profármaco del gen de citosina desaminasa. Por
ejemplo, el segundo gen puede codificar una uracil
fosforribosiltransferasa como los virus descritos en la Figura
2.
Puede usarse cualquier gen fusogénico adecuado
que codifica una proteína capaz de causar una fusión de célula con
célula. Preferiblemente, la proteína capaz de causar una fusión de
célula con célula se selecciona de una glicoproteína de envuelta
retroviral modificada, tal como una glicoproteína de la envuelta
procedente del virus de la leucemia del mono gibón (GALV) o
retrovirus endógeno humano W, una proteína F o H fusogénica del
virus del sarampión y la proteína G del virus de la estomatitis
vesicular. Más preferiblemente, la proteína capaz de causar la
fusión de célula con célula es una glicoproteína fusogénica de
GALV.
El gen inmunomodulador puede ser cualquier gen
que codifique una proteína que sea capaz de modular una respuesta
inmune. La proteína capaz de modular una respuesta inmune puede ser
una citocina, tal como GM-CSF,
TNF-\alpha, una interleucina (por ejemplo IL12),
una quimiocina tal como RANTES o una proteína inflamatoria de
macrófagos (por ejemplo MIP-3) u otra molécula
inmunomoduladora tal como B7.1, B7.2 o CD40L. La proteína capaz de
causar una fusión de célula con célula también puede ser capaz de
modular una respuesta inmune. Por ejemplo, GALV es capaz de modular
una respuesta inmune.
Los virus de la invención pueden usarse por lo
tanto para suministrar los genes a una célula in vivo donde
se expresarán.
\newpage
El gen activador de profármaco, el gen que
codifica una proteína capaz de causar una fusión de célula con
célula y/o el gen que codifica una proteína inmunomoduladora pueden
insertarse en el genoma viral por cualquier técnica adecuada tal
como recombinación homóloga de cepas de HSV con, por ejemplo,
vectores plasmídicos que lleven el gen flanqueado por secuencias de
HSV. Los genes pueden insertarse en el mismo sitio en el genoma de
HSV, por ejemplo, para sustituir el gen codificante de ICP34.5 o en
sitios diferentes. Los genes pueden expresarse a partir de
promotores separados, por ejemplo, un promotor de CMV y un promotor
de RSV o a partir de un solo promotor. Cuando los genes se expresen
a partir de un solo promotor, los genes pueden separarse mediante
un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). Los genes también
pueden expresarse como una fusión traduccional de modo que la
proteína fusionada conserve las dos actividades de los genes
separados (es decir, activación de profármaco y fusión de célula
con célula, actividad de profármaco y actividad inmunomoduladora o
fusión de célula con célula y actividad inmunomoduladora) de modo
que las proteína fusionadas se escindan después de la expresión
mediante una proteasa en cis o en trans con la
proteína fusionada. En una realización preferida, las dos proteínas
o dos de las tres proteínas se expresan a partir de un promotor de
RSV y de CMV respectivamente, colocados en una orientación contigua
el uno respecto al otro, e insertarse en el genoma de HSV para
sustituir los genes que codifican ICP34.5. Dicho virus se describe
en la Figura 2. Sin embargo, el gen puede insertarse en el genoma
viral en cualquier localización o localizaciones con tal de que se
conserven las propiedades oncolíticas.
Las secuencias transcritas de los genes
insertados están preferiblemente unidas operativamente a secuencias
de control que permiten la expresión de los genes en una célula
tumoral. La expresión "unida operativamente" se refiere a una
yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una
relación que los permite funcionar de la forma deseada. Una
secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia
codificante está ligada de tal modo que la expresión de la
secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con la
secuencia de control.
Una secuencia de control comprende típicamente
un promotor que permite la expresión del gen unido operativamente a
la misma y una señal para la terminación de la transcripción. El
promotor se selecciona de promotores que son funcionales en células
de mamífero, preferiblemente células tumorales humanas. El promotor
puede proceder de secuencias promotoras de un gen eucariota. Por
ejemplo, el promotor puede proceder del genoma de una célula en la
que se produce la expresión del gen heterólogo, preferiblemente una
célula tumoral de mamífero, más preferiblemente una célula tumoral
humana. Con respecto a promotores eucariotas, pueden ser promotores
que funcionen de una forma ubicua (tal como promotores de
\beta-actina, tubulina) o, como alternativa, de
una forma específica de tumor. También pueden ser promotores que
respondan a estímulos específicos, por ejemplo, promotores que se
unan a receptores de hormonas esteroideas. También pueden usarse
promotores virales, por ejemplo, el promotor de la repetición
terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR)
u otros promotores retrovirales tales como los procedentes del
virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor IE de citomegalovirus
(CMV) humano o de ratón o promotores de genes de herpesvirus
incluyendo los que dirigen la expresión de los transcritos
asociados con latencia.
Los casetes de expresión y otras construcciones
adecuadas que comprenden el gen codificante de la enzima conversora
de profármaco, el gen que codifica una proteína capaz de promover la
fusión de célula con célula y/o el gen inmunomodulador y secuencias
de control pueden generarse usando técnicas de clonación de rutina
conocidas por especialistas en la técnica (véase, por ejemplo,
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A laboratory
manual; Cold Spring Harbor Press).
También puede ser ventajoso que el promotor o
promotores sean inducibles de modo que los niveles de expresión de
los genes puedan regularse durante el tiempo de vida de la célula
tumoral. Inducibles significa que pueden regularse los niveles de
expresión obtenidos usando el promotor. Por ejemplo, un virus de la
invención puede comprender además un gen heterólogo que codifique
la proteína de fusión represor tet/activador de la transcripción
VP16 bajo el control de un promotor fuerte (por ejemplo, el promotor
IE de CMV) y el gen de conversión de profármaco, de fusión de
célula con célula o inmunomodulador u otro gen pueden estar bajo el
control de un promotor sensible a la proteína de fusión de represor
tet/activador de la transcripción VP16 anteriormente descrito
(Gossen y Bujard, 1992, Gossen et al., 1995). Por lo tanto,
en este ejemplo, la expresión del gen o genes dependería de la
presencia o ausencia de tetraciclina.
Los virus de la invención codifican múltiples
genes heterólogos. Los virus de la invención pueden comprender uno
o más genes adicionales, por ejemplo, de 1, 2 a 3, 4 ó 5 genes
adicionales. El gen o genes adicionales pueden ser copias
adicionales del gen conversor de profármaco, el gen fusogénico y/o
el gen inmunomodulador. El gen o genes adicionales pueden codificar
uno o más genes conversores de profármaco diferentes, uno o más
genes fusogénicos diferentes y/o uno o más genes inmunomoduladores
diferentes. El gen o genes adicionales pueden codificar otro gen o
genes destinados a aumentar el efecto terapéutico.
Podría introducirse más de un gen y secuencias
de control asociadas en una cepa de HSV particular en un solo sitio
o en múltiples sitios en el genoma del virus. Como alternativa,
pueden usarse pares de promotores (promotores iguales o diferentes)
enfrentados en orientaciones opuestas entre sí, dirigiendo cada una
la expresión de un gen.
Los virus de la invención pueden usarse en un
método de tratamiento del cuerpo humano o animal. En particular,
los virus de la invención pueden usarse en métodos de terapia del
cáncer. Preferiblemente, los virus de la invención se usan en el
tratamiento oncolítico del cáncer. Los virus de la invención pueden
usarse en el tratamiento terapéutico de cualquier tumor sólido en
un mamífero, preferiblemente un ser humano. Por ejemplo, los virus
de la invención pueden administrarse a un sujeto con carcinoma de
próstata, mama, pulmón, hígado, célula renal, endometrial, vejiga,
colón o cervical; adenocarcinoma; melanoma; linfoma; glioma;
sarcomas tales como sarcomas de tejidos blandos y óseos; o cáncer
de cabeza y cuello.
Los virus de la invención pueden usarse en un
paciente, preferiblemente un paciente humano, que necesite
tratamiento. Un paciente que necesite tratamiento es un individuo
que padece cáncer, preferiblemente un individuo con un tumor
sólido. El objetivo del tratamiento terapéutico es mejorar el estado
del paciente. Típicamente el tratamiento terapéutico usando un
virus de la invención alivia los síntomas del cáncer. Un método de
tratamiento del cáncer de acuerdo con la invención comprende
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus de la
invención a un paciente que padece cáncer. La administración de un
virus oncolítico de la invención a un individuo que padece un tumor
destruirá típicamente las células del tumor, disminuyendo por lo
tanto el tamaño del tumor y/o evitando la propagación de células
malignas desde el tumor.
Un método de terapia de administración implica
combinar el virus con un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable para producir una composición farmacéutica. Los vehículos
y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por
ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.
El tratamiento terapéutico puede realizarse
después de la inyección directa de la composición viral en el
tejido diana. El tejido diana puede ser el tumor o un vaso sanguíneo
que suministre sangre al tumor. La cantidad de virus administrado
está en el caso del HSV en el intervalo de 10^{4} a 10^{10} ufp,
preferiblemente de 10^{5} a 10^{8} ufp, más preferiblemente de
aproximadamente 10^{6} a 10^{9} ufp. Típicamente, se usarían
1-4 ml, tal como de 2 a 3 ml de una composición
farmacéutica que consiste esencialmente en el virus y un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable para inyección directa en un
tumor individual. Sin embargo, para algunas aplicaciones de terapia
oncolítica también pueden usarse volúmenes mayores de hasta 10 ml
dependiendo del tipo tumoral, del tamaño tumoral y del sitio de
inoculación. Asimismo, también pueden usarse volúmenes menores de
menos de 1 ml.
Las vías de administración y dosificaciones
descritas pretenden ser solamente orientativas puesto que un
especialista será capaz de determinar fácilmente la vía de
administración y dosificación óptimas. La dosificación puede
determinarse de acuerdo con diversos parámetros, especialmente de
acuerdo con la localización del tumor, el tamaño del tumor, la
edad, el peso y el estado del paciente a tratar y la vía de
administración. Preferiblemente, el virus se administra por
inyección directa en el tumor. El virus también puede administrarse
por vía sistémica o por inyección en un vaso sanguíneo que
suministre sangre al tumor. La vía óptima de administración
dependerá de la localización y del tamaño del tumor.
Los siguientes Ejemplos ilustran la
invención.
En un trabajo que tenía por objetivo producir
HSV con ICP34.5 delecionado con potencial oncolítico y antitumoral
aumentado, se han delecionado ICP47 e ICP34.5 a partir de la cepa
JS1 del HSV1 y se han insertado los genes que codifican un gen
activador de profármaco (un gen de fusión de citosina
desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa) y/o un gen para una
glicoproteína fusogénica de GALV.
Los virus usados estaban basados en la cepa de
HSV1 clínica o "no de laboratorio" JS1. Se delecionó
completamente ICP34.5 e ICP47 de la cepa JS1. Este virus se
describe en Lui et al 2003. El GALV env R- (Bateman et
al 2000, Galanis et al 2001) y/o el gen de fusión de
citosina desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa (Fcy:Fur;
Invitrogen) se insertaron después en lugar del gen codificante de
ICP34.5 bajo el control del promotor de CMV y RSV
respectivamente.
Las Figuras 1a-1h demuestran la
construcción paso a paso de los plásmidos usados para construir los
virus:
Etapa 1. (Figura 1a): El gen Fcy::Fur se
escindió de pORF Fcy::Fur con Ncol y NheI y se insertó en pRCRSV
después de la digestión con HindIII y XbaI;
Etapa 2 (Figura 1b): El casete de promotor de
RSV/Fcy::Fur/BGH-pA de PRcRSV Fcy::Fur se insertó
entre las regiones flanqueantes de ICP34.5 (Lui et al 2003)
para generar p34.5 Fcy::Fur;
Etapa 3 (Figura 1c): El GALV env R- se amplificó
mediante PCR a partir de células que contenían el provirus
integrado y se clonó en pcDNA3 entre los sitios NotI y EcoRI para
generar pcDNA3 kGALV env R-;
Etapa 4 (Figuras 1d-1e):
Manipulación para eliminar los sitios de restricción que no eran
necesarios;
Etapa 4 (Figura 1g); El casete de promotor de
CMV/GALV R-BGH-pA se clonó en
regiones flanqueantes de ICP34.5 para generar p34.5 CMV GALV env
R-;
Etapa 5 (Figura 1h): Para generar un plásmido
que permite la inserción en lugar de ICP34.5 y que contiene los
genes tanto GALV env R- como Fcy::Fur, el casete de promotor de
RSV/Fcy::Fur/pA de pRcRSV Fcy::Fur se escindió y se insertó en
p-34.5 CMV GALV env R- para generar
p-34.5 GALV FCY.
Los plásmidos p-34.5 Fcy::Fur,
p-34.5 CMV GALV env R- y p-34.5 GALV
FCY se insertaron en la cepa de virus JS1/34.5-/47- CMV GFP (Lui
et al 2003) mediante recombinación homóloga para sustituir la
secuencia de GFP que sustituye a ICP34.5. Se seleccionaron placas
recombinantes que no expresaban GFP generando tres virus
(JS1/34.5-/47-/Fcy::Fur, JSI/34.5-/47-/GALV y JSI/34.5-/47-/Fcy::Fur). Estos se muestran en la Figura 2.
(JS1/34.5-/47-/Fcy::Fur, JSI/34.5-/47-/GALV y JSI/34.5-/47-/Fcy::Fur). Estos se muestran en la Figura 2.
\vskip1.000000\baselineskip
El virus que expresa GALV en solitario (i) causa
la fusión de célula con célula de varias líneas de células
tumorales humanas in vitro, incluyendo HT1080, Fadu y U87MG,
mediada por la expresión de la proteína GALV y (ii) proporciona una
actividad antitumoral aumentada in vivo en modelos de ratón
(Fadu y HT1080) en comparación con el virus equivalente que no
expresa la proteína GALV.
La fusión de célula con célula se demuestra en
la Figura 3. Se infectaron células de glioma RG2 de rata con
JS1/34.5-/47- o JS1/34.5-/47-/GALV y se observaron los efectos sobre
la morfología de placas. Puede observarse que el virus que expresa
GALV produce placas enormemente aumentadas, observándose signos de
un efecto sincitial (fusión de célula con célula).
\vskip1.000000\baselineskip
El virus que contiene el gen de fusión de
citosina desaminasa/uracil fosforribosiltransferasa ha demostrado
que dirige la conversión de 5-fluorocitosina en
5-fluorouracilo in vitro de modo que se
produce la destrucción de células mediada por
5-fluorouracilo. Esto se muestra en la Figura 4
donde se infectaron células HT1080 con los tres virus en presencia
en ausencia de 5-fluorocitosina. Después, los
sobrenadantes de estas células se trataron térmicamente para
inactivar el virus presente en los sobrenadantes. Estos
sobrenadantes se usaron después para cubrir nuevas células. Si la
5-fluorocitosina se había convertido en el
5-fluorouracilo tóxico entonces se destruirían
estas nuevas células. Puede observarse a partir de la Figura 4 que
cuando los virus usados para infectar las células HT1080 originales
contenían el gen Fcy::Fur, las células que se cubrieron con los
sobrenadantes resultantes se destruyeron demostrando la actividad
biológica del gen Fcy::Fur.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 muestra los efectos de tres virus
(JS1/34.5-/47-/GALV, JS1/34.5/47-/Fcy::Fur y
JS1/34.5-/47-GALV/
Fcy::Fur) y un control de vector vacío (JS 1/34.5-/47-) sobre el encogimiento de tumores implantados en los francos de ratas. Los virus se administraron en combinación con 5-fluorocitosina. Puede observarse a partir de la Figura 5 que cada uno de los virus causa encogimiento de los tumores inyectados. Sin embargo, mientras que la administración de GALV env R- o Fcy::Fur en solitario proporciona encogimiento tumoral mejorado en comparación con el control de vector vacío, el suministro combinado tanto de GALV env R- como de Fcy::Fur proporciona efectos de encogimiento tumoral aún mejores, curándose en este caso todos los tumores. Puede concluirse por lo tanto que el cosuministro de un gen activador de profármaco y una glicoproteína fusogénica proporciona mejoras respecto a la terapia tumoral en comparación con cualquiera de las estrategias cuando se usan en solitario.
Fcy::Fur) y un control de vector vacío (JS 1/34.5-/47-) sobre el encogimiento de tumores implantados en los francos de ratas. Los virus se administraron en combinación con 5-fluorocitosina. Puede observarse a partir de la Figura 5 que cada uno de los virus causa encogimiento de los tumores inyectados. Sin embargo, mientras que la administración de GALV env R- o Fcy::Fur en solitario proporciona encogimiento tumoral mejorado en comparación con el control de vector vacío, el suministro combinado tanto de GALV env R- como de Fcy::Fur proporciona efectos de encogimiento tumoral aún mejores, curándose en este caso todos los tumores. Puede concluirse por lo tanto que el cosuministro de un gen activador de profármaco y una glicoproteína fusogénica proporciona mejoras respecto a la terapia tumoral en comparación con cualquiera de las estrategias cuando se usan en solitario.
La cepa JS1 de HSV1 se ha depositado en la
Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Sailsbury,
Wiltshire SP40 0JG, Reino Unido, el 2 de enero de 2001 bajo el
número de acceso 01010209.
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Cancer Research 60; 1492-1497
Galanis et al 2001,
Human Gene Therapy 12; 811-821
Claims (17)
1. Un herpesvirus que carece de un gen
codificante de ICP34.5 funcional y que comprende:
- (i)
- un gen heterólogo que codifica una enzima conversora de profármaco; y
- (ii)
- un gen heterólogo que codifica una proteína capaz de causar la fusión de célula con célula.
2. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha enzima conversora de profármaco es una citosina
desaminasa.
3. Un virus de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que dicha proteína capaz de causar la fusión de célula con
célula es una glicoproteína fusogénica de leucemia del mono
gibón.
4. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprende uno o más genes
heterólogos adicionales capaces de aumentar el efecto terapéutico
antitumoral del virus.
5. Un virus de acuerdo con la reivindicación 4,
que comprende un gen heterólogo que codifica una proteína
inmunomoduladora.
6. Un virus de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que la proteína inmunomoduladora es GM-CSF,
TNF-\alpha o CD40L.
7. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen funcional
que codifique ICP47.
8. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen funcional
que codifica ICP6, glicoproteína H y/o timidina quinasa.
9. Un virus de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que carece además de un gen que
codifica una proteína funcional capaz de inhibir la función de
células dendríticas.
10. Un virus de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicho gen que codifica una proteína funcional capaz de
inhibir la función de células dendríticas es UL43 o vhs.
11. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que es una cepa de virus herpes
simple 1 ó 2.
12. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores que es una cepa de virus que no es
de laboratorio.
13. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, que procede de HSV1 JS1, como se
depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECAAC) bajo
el número de acceso 01010209.
14. Un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones anteriores para el uso en un método de
tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
15. Uso de un virus de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento del cáncer.
16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15, en
el que dicho medicamento es para inoculación intratumoral
directa.
17. Una composición farmacéutica que comprende
como ingrediente activo un virus de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13 y un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
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