ES2330104T3 - Anticuerpos para la deteccion de efavirenz. - Google Patents
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Abstract
Compuesto que tiene la estructura **(Ver fórmula)** en la que L es NH u O; R1 es una cadena de 0-10 átomos de carbono o heteroátomos saturada o insaturada, sustituida o no sustituida, recta o ramificada; X es un grupo enlazador que consiste en 0-2 anillos aromáticos sustituidos o no sustituidos, o grupos enlazadores alifáticos conteniendo 0-10 átomos de carbono o heteroátomos; y Y es un éster activado, grupo maleimido, tiol, o NH-Z en la que Z es un portador o un marcador.
Description
Anticuerpos para la detección de efavirenz.
La invención se refiere a inmunógenos que
comprenden efavirenz y a derivados de efavirenz para su utilización
en un inmunoensayo para la detección de efavirenz.
El virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1
(HIV-1) es un retrovirus que conduce al desarrollo
del síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA). La tasa de
infectividad de HIV en Estados Unidos ha sido estimada
aproximadamente en 40.000 nuevas infecciones por año. Los
tratamientos actuales para la infección por HIV están diseñados
para interferir con la capacidad del virus en replicarse por la
inhibición de la proteasa de HIV o de la transcriptasa inversa de
HIV (RT).
El efavirenz (SUSTIVA,
Bristol-Meyers Squibb) es uno de los medicamentes
aprobados por la FDA que se utilizan en el tratamiento de pacientes
infectados con HIV. El efavirenz se ha demostrado que disminuye la
proporción de HIV en la sangre (la "carga viral"). Cuando se
toma con otros medicamentos anti-HIV, el efavirenz
se ha demostrado que reduce la carga viral de los pacientes y que
incrementa el número de células CD4.
La investigación clínica ha demostrado que el
HIV puede desarrollar resistencia a medicamentos utilizados en la
terapia de HIV, incluyendo el efavirenz. Esta resistencia a los
medicamentos se cree que es una razón básica para los fallos de la
terapia. El desarrollo de resistencia al medicamento en HIV puede
ser el resultado de la tasa de replicación rápida del virus. A
pesar de su potencia, el efavirenz tiene una barrera genética baja.
Un alto nivel de resistencia fenotípica puede ser inducido por una
mutación única, frecuentemente en lisina 103 (K103N) en el gen RT.
La emergencia de mutantes de HIV resistentes al efavirenz podría ser
resultado de una exposición repetida a niveles de medicamento
ineficaces o subterapéuticos.
Se observan fallos terapéuticos más
frecuentemente en pacientes que tienen bajas concentraciones de
efavirenz en el suero. Por ejemplo, Marzolini y otros, AIDS 15
(Londres), 71-75, 2001, han informado sobre fallos
virológicos en el 50% de pacientes (85 pacientes en total) que
tenían bajos niveles de efavirenz en plasma, por ejemplo, <1000
\mug/L. En pacientes con niveles de efavirenz en plasma
comprendidos entre 1000-4000 \mug/L, o superiores
a 4000 \mug/L, observaron fallo biológico en
18-22% de dichos pacientes. Además,
20-40% de los pacientes que recibieron efavirenz
mostraron efectos secundarios del sistema nervioso central (CNS)
incluyendo torpeza, alucinaciones, pesadillas e insomnio. Si bien,
estos síntomas son habitualmente de suaves a moderados en cuanto a
gravedad, y se ha informado que desaparecen progresivamente a lo
largo de unas semanas después del inicio de la terapia con
efavirenz, se ha informado que aproximadamente 4% de los pacientes
discontinúa la terapia a causa de la gravedad o persistencia de
estos efectos secundarios. La toxicidad en el CNS era
aproximadamente tres veces más frecuente en pacientes con altos
niveles de efavirenz, por ejemplo, >4000 \mug/L comparado con
los pacientes con niveles en el intervalo de
1000-4000 \mug/L. Esto implica que el fallo del
tratamiento y los efectos secundarios en CNS están asociados con
niveles bajo y alto de efavirenz en plasma respectivamente. La
variabilidad de niveles de efavirenz en individuos soporta
claramente que el ajuste de la dosis se debe basar en el control
del medicamento terapéutico (TDM) para optimizar los efectos
beneficiosos, mientras se minimizan al mismo tiempo los efectos
secundarios en CNS.
Dado que las diferencias farmacológicas entre
pacientes introducen una amplia heterogeneidad en respuesta a la
terapia antiviral, el control de los niveles de medicamento se podía
utilizar en la gestión de la infección de HIV y también en
desórdenes y enfermedades asociadas con la infección por HIV. Se
conoce el control formal de medicamentos terapéuticos aplicado a
medicamentos antivíricos utilizable en terapia HIV utilizando
métodos cromatográficos en líquido de alto rendimiento (HPLC)
(Marzolini y otros, ver anterior).
Si bien, los métodos HPLC pueden ser utilizados
para determinar niveles de efavirenz en plasma, estos métodos son
poco prácticos para utilización comercial debido, por ejemplo, al
largo de tiempo de preparación de las muestras, largo tiempo de los
ensayos, costes elevados y procesos que requieren mucho trabajo. Por
lo tanto, un método analítico simple y rápido para la medición de
los niveles de efavirenz en plasma es necesario para TDM efectivo.
Las técnicas de inmunoensayo son muy apropiadas para estas
aplicaciones analíticas.
La práctica médica habitual para el tratamiento
de infecciones por HIV consiste en coadministrar tres medicamentos
HIV, de los que, como mínimo, dos de ellos proceden de diferentes
clases, por ejemplo, 2 inhibidores del nucleósido de transcriptasa
inversa (los NRTI) y un inhibidor del no nucleósido de la
transcriptasa inversa (NNRTI). Por lo tanto, para una técnica de
inmunoensayo para medir el efavirenz es esencial que un anticuerpo
sea altamente específico para efavirenz.
El documento
EP-A-1,470,825 da a conocer la
disposición de anticuerpos específicos para efavirenz. Estos
anticuerpos fueron aislados para ratones inmunizados con un
conjugado que comprende efavirenz y un portador inmunogénico.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención da a conocer un compuesto
que tiene la estructura
en la que L es NH u O; R_{1} es
una cadena saturada o insaturada, sustituida o no sustituida, recta
o ramificada de 0 a 10 carbonos o heteroátomos; X es un grupo
enlazador que consiste en 0-2 anillos aromáticos
sustituidos o no sustituidos o grupos de enlace alifáticos que
contienen 0-10 átomos de carbono o heteroátomos e Y
es un éster activado, grupo maleimido, tiol o NH-Z,
en el que Z es un portador o un
marcador.
Se describe además un anticuerpo producido como
respuesta a un compuesto que tiene la estructura
en la que L es NH u O; R_{1} es
una cadena saturada o insaturada, sustituida o no sustituida, recta
o ramificada de 0-10 átomos de carbono o
heteroátomos; X es un grupo enlazador que consiste en
0-2 anillos aromáticos sustituidos o no sustituidos
o grupos alifáticos enlazadores que contienen 0-10
átomos de carbono o heteroátomos e Y es NH-Z, en la
que Z es un portador tal como
poli(aminoácido).
También se dan a conocer anticuerpos
monoclonales con elevada especificidad para el efavirenz con
respecto a otros medicamentos habitualmente coadministrados contra
HIV. Estos medicamentos incluyen otros inhibidores del no nucleósido
de transcriptasa inversa (los NRTI) tales como nevirapine y
delaviradine, así como inhibidores nucleósidos de la transcriptasa
inversa (los NRTI) tales como
3'-azido-3'deoxitimidina y 2', 3'-
didehidro -3'-deoxitimida e inhibidores de proteasa
(PI) tales como nelfinavir, saquinavir, indinavir, ritonavir,
amprenavir, lopinavir y atazanavir.
Otro aspecto de la invención es la línea celular
EFA 97.1, designación ATCC PTA-5820, que produce un
anticuerpo monoclonal que tiene especificidad para el efavirenz.
Otro aspecto adicional es un anticuerpo monoclonal producido a
partir de la línea celular EFA 97.1, con designación ATCC
PTA-5820, cuyo anticuerpo tiene especificidad para
el efavirenz.
Otro aspecto de la presente invención da a
conocer un compuesto que tiene la estructura
en la que L es NH u O; R_{1} es
una cadena saturada o instaurada , sustituida o no sustituida, recta
o ramificada de 0-10 átomos de carbono o
heteroátomos; X es un grupo enlazador que consiste en
0-2 anillos aromáticos sustituidos o no sustituidos
o grupos enlazadores alifáticos que contienen 0-10
átomos de carbono o heteroátomos, e Y es NH-Z en la
que Z es un marcador tal como una enzima, un compuesto fluorogénico,
un material quimioluminiscente, mediador electroquímico, partícula,
grupo indicador, inhibidor de enzimas y ácido
nucleico.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto adicional de la invención es el
6-hidroxi análogo de efavirenz (9, quiral y
racémico):
La figura 1 es una representación esquemática de
un método de síntesis para el análogo 6-hidroxi de
efavirenz, estructura 9.
La figura 2 es una representación esquemática de
un método de síntesis para los conjugados KLH y BSA de efavirenz,
estructuras 13 y 14.
La figura 3 es una representación esquemática de
un método de síntesis para un éster activado de efavirenz con un
enlazador aromático.
La figura 4 es una representación esquemática de
un método de síntesis para un conjugado de proteína utilizando un
derivado maleimido de efavirenz.
La figura 5 es una representación esquemática de
un método de síntesis del conjugado KLH
2-iminotiolano de efavirenz.
La figura 6 es una representación esquemática de
un método de síntesis para el conjugado KLH utilizando un derivado
carbonilo diimidazol de efavirenz.
La figura 7 es una representación esquemática de
un método de síntesis de un conjugado alternativo de proteína
utilizando 6-amino efavirenz.
La figura 8 es un gráfico que muestra la
respuesta por efavirenz libre en un inmunoensayo de inhibición
competitiva utilizando el anticuerpo monoclonal EFA 97.1.
"Efavirenz" se refiere al compuesto que es
el ingrediente activo de SUSTIVA (Bristol-Meyers
Squibb), medicamento aprobado por FDA utilizado en el tratamiento
de pacientes infectados por HIV, virus que puede conducir al
desarrollo de SIDA. El efavirenz puede ser representado por la
estructura química:
El término "efavirenz" puede ser adoptado
para comprender compuestos que tienen la misma estructura
sustancial, incluyendo mezclas quirales y racémicas de la estructura
anterior, metabolitos y análogos de los mismos.
Los "haptenos" son antígenos parciales o
incompletos. Son sustancias libres de proteínas, principalmente
sustancias de bajo peso molecular que no son capaces de estimular
la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con anticuerpos.
Estos últimos se forman por acoplamiento de un hapteno a un portador
de alto peso molecular e inyectando luego este producto acoplado,
es decir, inmunógeno, en un humano o un animal. El efavirenz es un
hapteno.
El término "derivado" se refiere a un
compuesto químico o molécula preparado a partir de un compuesto
principal o molécula principal mediante una o varias reacciones
químicas.
Un "hapteno derivado" se refiere a un
derivado de hapteno que ha sido dotado de un lugar adecuado para
reacción, por ejemplo, por acoplamiento de un grupo de enlace, para
sintetizar un conjugado de un derivado de hapteno.
Tal como se utiliza en esta descripción, los
términos "grupo de enlace" o "enlazador" se refieren a una
parte de una estructura química que conecta dos o más
subestructuras, tal como haptenos, portadores, inmunógenos,
marcadores, trazadores u otros enlazadores. Un grupo de enlace
tiene, como mínimo, 1 cadena no interrumpida de átomos distintos
del hidrógeno (u otros átomos monovalentes) que se extiende entre
las subestructuras. Los átomos de un grupo de enlace y los átomos
de una cadena dentro de un grupo de enlace están conectados por su
parte por enlaces químicos. Los enlazadores pueden ser rectos o
ramificados, saturados o insaturados, cadenas de carbono. También
pueden incluir uno o varios heteroátomos dentro de la cadena o en
terminales de las cadenas. Por "heteroátomos" se deben
comprender átomos distintos del carbono que son escogidos del grupo
que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. Los grupos de enlace
pueden incluir también grupos cíclicos o aromáticos como parte de
la cadena o como sustitución en uno de los átomos de la cadena.
El número de átomos en un grupo de enlace o
enlazador es determinado por conteo de los átomos distintos de
hidrógeno. El número de átomos en una cadena dentro de un grupo de
enlace es determinado al contar el número de átomos distintos de
hidrógeno a lo largo de la ruta más corta entre las subestructuras
conectadas.
Se pueden utilizar grupos de enlace para
activar, por ejemplo, proporcionar un lugar disponible en un hapteno
para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o
portador.
Los términos "inmunógeno" e
"inmunogénico" utilizados en esta descripción se refieren a
sustancias capaces de producir o generar una respuesta inmune en un
organismo.
Un "éster activo" se refiere a un grupo
éster que puede reaccionar con un grupo amino libre de compuestos
tales como, por ejemplo, péptidos y proteínas. Se incluyen entre los
ejemplos de los ésteres activos la
N-hidroxisuccinimida,
p-nitrofenilo, pentafluorofenilo y
N-hidroxibenzotriazolilo.
Un "portador" o "portador
inmunogénico", según los términos utilizados en esta descripción,
es una sustancia inmunogénica, habitualmente una proteína, que se
puede unir con un hapteno, posibilitando de esta manera que el
hapteno induzca una respuesta inmune y elicite la producción de
anticuerpos que se puede unir específicamente con el antígeno
(hapteno). Entre las sustancias portadoras se incluyen proteínas,
glicoproteínas, polisacáridos complejos, partículas y ácidos
nucleicos que son reconocidos como extraños y, por lo tato, elicitan
una respuesta inmunológica del huésped.
Se pueden utilizar varios tipos de proteínas
como portador inmunogénico poli(aminoácido). Estos tipos
comprenden albúminas, proteínas de suero, por ejemplo, globulinas,
proteínas de lentes oculares, lipoproteínas, etc. Entre las
proteínas ilustrativas se comprenden la albúmina de suero bovina
(BSA), hemocianina Keyhole limpet (KLH), ovalbúmina de huevo,
gamma-globulina bovina (BGG), etc. De manera
alternativa se pueden utilizar poli(aminoácidos)
sintéticos.
El portador inmunogénico puede ser también un
polisacárido, que es un polímero de elevado peso molecular
constituido por condensaciones repetidas de monosacáridos. Son
ejemplos de polisacáridos los almidones, glicógeno, celulosa, gomas
carbohidrato, tales como goma arábiga, agar y otros. El polisacárido
puede contener también residuos de poli(aminoácido) y/o
residuos de lípidos.
El portador inmunogénico puede ser también un
poli(ácido nucleico) solo o conjugado a uno de los antes mencionados
poli(aminoácidos) o polisacáridos.
El portador inmunogénico puede ser también una
partícula. Las partículas tienen en general aproximadamente 0,02
micras (\mum) y no más de 100 \mum y habitualmente de 0,05
\mum a 10 \mum en diámetro. La partícula puede ser orgánica o
inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa,
opcionalmente de una densidad aproximada a la del agua, en general
aproximadamente de 0,7 a 1,5 g/ml y compuesta de material que puede
ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas
pueden ser materiales biológicos, tales como células y
microorganismos, incluyendo como ejemplos no limitativos
eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, estreptococos,
estafilococos aureus, E. coli y virus. Las partículas pueden estar
formadas también por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas,
látex, vesículas de fosfolípido o lipoproteínas.
Un "poli(aminoácido)" o
"polipéptido" es una poliamida formada a partir de aminoácidos.
Los poli(aminoácidos) están comprendidos en general desde un
peso molecular de 2.000, sin límite superior de peso molecular,
normalmente menores de 10.000.000 y habitualmente no superiores a
unos 600.000 daltons. Existirán habitualmente diferentes rangos
dependiendo de si se trata de un portador inmunogénico o una
enzima.
Un péptido es cualquier compuesto formado por el
enlace de dos o más aminoácidos mediante enlaces amida (péptido),
habitualmente un polímero de \alpha-aminoácidos en
el que el grupo \alpha-amino de cada residuo de
aminoácido (excepto el terminal NH2) está enlazado al grupo
\alpha-carboxilo del residuo siguiente de una
cadena lineal. Los términos "péptidos", "polipéptido" y
"poli(aminoácido)" se utilizan en esta descripción como
sinónimos para hacer referencia a este tipo de compuestos sin
restricción en cuanto a dimensiones. Los miembros más grandes de
esta clase se designan proteínas.
Un "marcador", "molécula detectora" o
"trazador" es cualquier molécula que induce o que puede ser
inducida a producir una señal detectable. El marcador puede ser
conjugado de un analito, inmunógeno, anticuerpo o de otra molécula,
tal como una molécula receptora o una molécula que se puede unir a
un receptor, tal como un ligando, particularmente un hapteno. Se
incluyen entre los ejemplos no limitativos de los marcadores los
isótopos radioactivos, las enzimas, fragmentos de enzimas,
sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas, coenzimas,
catalizadores, fluoróforos, tintes, quimioluminiscentes,
luminiscentes, sensibilizantes, partículas no magnéticas o
magnéticas, soportes sólidos, liposomas, ligandos, receptores e
isótopos radiactivos de hapteno.
El término "muestra biológica" comprende,
sin que ello sea limitativo, cualquier cantidad de una sustancia
procedente de un ente vivo o un ente anteriormente vivo. Estos entes
vivos incluyen, sin que ello sea limitativo, humanos, ratones,
monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Estas sustancias
incluyen, sin que ello sea limitativo, sangre, suero, orina,
lágrimas, células, órganos, tejidos, hueso, tuétano de hueso, linfa,
nodos de linfa, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos
sinoviales, células endoteliales y piel.
El término "paciente" comprende sujetos
humanos y animales.
La presente invención da a conocer derivados de
hapteno de efavirenz que son útiles para la preparación de
inmunógenos y conjugados para su utilización en inmunoensayos para
la detección de efavirenz.
Al acoplar un derivado de efavirenz, de acuerdo
con la presente invención, a un material portador inmunogénico se
pueden producir y aislar antisueros y anticuerpos policlonales, así
como anticuerpos monoclonales, que son reactivos útiles para
inmunoensayos para la detección de efavirenz.
Los derivados pueden ser también acoplados a una
serie de marcadores por métodos bien conocidos en esta técnica para
proporcionar una serie de reactivos útiles en diferentes formatos de
inmunoensayos. A efectos de detección se pueden acoplar moléculas
detectoras, tales como fluoróforos, por ejemplo, fluoresceína, o
grupos radiomarcados o quimioluminiscentes para producir
trazadores. El hapteno puede ser unido a micropartículas incluyendo
látex coloreado a utilizar en formatos de detección óptica directa
o espectrofotométrica, tales como aglutinación de látex o pruebas
con bandas cromatográficas. El grupo acoplado puede ser también una
molécula de detección indirecta, tal como un asociado de
transferencia de energía, enzima u otro grupo detectado por una
reacción química adicional.
El acoplamiento puede ser conseguido por
cualquier reacción química que efectúe la unión del marcador o
portador. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por
ejemplo, enlace covalente, unión por afinidad, intercalación, unión
coordinada y formación de complejos. De modo más frecuente, el
enlace es realizado mediante unión covalente. La unión covalente
puede ser conseguida mediante condensación directa de cadenas
laterales existentes o por incorporación de moléculas puente
externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes de enlace son
útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas, tales como un
portador, a otras moléculas. Se incluyen entre los agentes de
acoplamiento representativos los compuestos orgánicos, tales como
tioésteres, carbodiimidas, ésteres de
N-hidroxisuccinimida, diisocionatos,
glutaraldehído, diazobencenos y hexametilen diaminas. La lista no
es un resumen exhaustivo de las diferentes clases de agentes de
acoplamiento conocidos en esta técnica, sino que es representativa
de los agentes de acoplamiento más habituales (ver Killen y otros,
J. Immunol. 133:1335-2549, 1984; Jansen, F. K., y
otros,
Immunological Reviews 62:185-216, 1982; y Hermanson, G., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1995.
Immunological Reviews 62:185-216, 1982; y Hermanson, G., "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1995.
La presente invención da a conocer un compuesto
que tiene la estructura:
en la que L es NH u O, R_{1} es
una cadena de 0-10 carbonos o heteroátomos, saturada
o insaturada, sustituida o no sustituida, recta o ramificada, X es
un grupo enlazador que consiste en 0-2 anillos
aromáticos sustituidos o no sustituidos o grupos de enlace
alifáticos que contienen 0-10 átomos de carbono o
heteroátomos, e Y es un éster activado, un grupo maleimido, tiol o
NH-Z, en el que Z es un portador o un
marcador.
Una característica principal de la síntesis de
un inmunógeno de efavirenz, de acuerdo con la presente invención,
es la preparación de un análogo de efavirenz por alquilación o
acilación de un grupo fenólico o amino sobre el anillo aromático
del efavirenz. La síntesis general del inmunógeno requiere la
constitución del sistema de anillo de benzoxacinona. La síntesis
del análogo de efavirenz que contiene un grupo fenólico empieza con
la protección del grupo fenólico de 5-hidroxi
2-nitro benzaldehído (1) utilizando un grupo
protector sensible a los ácidos, especialmente
2-metoxi etoxi metil (MEM) éter. La
trifluorometilación de aldehídos con trifluorometil trimetilsilano
catalizada con fluoruro de cesio es conocida en la literatura (J.
Org. Chem. 64, 2873, 1999). La trifluorometilación de
5-OMEM-2-nitrobenzaldehído
(2) puede ser llevada a cabo en presencia de trifluorometil
trimetilsilano en presencia de fluoruro de cesio a una temperatura
comprendida entre 20º y 30ºC.
La reducción de un grupo nitro a un grupo amino
es conocida en la literatura y puede ser llevada a cabo en
diferentes condiciones de reacción por un técnico en la materia a la
que corresponde la presente invención.
La reducción del grupo nitro del producto
fluorado (3) es llevado a cabo en condiciones de hidrogenación,
preferentemente con 10% Pd-C bajo la presión de 50
psi para conseguir el producto de alcohol amino desililado (4). La
protección de un grupo amino como grupo t-Boc es
conocida en la literatura (ver "Protective Groups in Organic
Synthesis", 2ª edición, T. Greene y P. Wuts,
Wiley-Interscience, 1991). El amino alcohol (4) está
protegido como grupo t-Boc utilizando
di-t-butildicarbonato en presencia
de carbonato sódico para conseguir el producto (5).
La oxidación de un alcohol secundario a una
acetona se puede llevar a cabo en una serie de condiciones de
reacción, por ejemplo, PCC, PDC, CrO3, utilizando preferentemente
cloruro de oxalilo DMSO en condiciones de oxidación Swern. Así, por
ejemplo, en el ejemplo 4, el compuesto (5) fue reaccionado con
cloruro de oxalilo en presencia de DMSO a una temperatura de -40º a
-60ºC en diclorometano para conseguir el producto (6). La adición
nucleofílica a un grupo carbonilo puede ser llevada a cabo en
diferentes condiciones de reacción incluyendo una adición de
Grignard o adición sin nucleófilos litiados. La reacción de adición
de nucleófilo de ciclopropil acetilida litiada sobre la
trifluorometil cetona del análogo de efavirenz (6) tiene como
resultado el producto de adición (7). Este producto de adición (7)
puede sufrir ciclización pasando a un sistema de anillo de
benzoxazinona por reacción con el n-butil litio en
presencia de un disolvente, preferentemente tolueno, en condiciones
de reflujo para conseguir el producto (8). Este tipo de ciclización
para preparar efavirenz es conocido en la literatura (Synthetic
Communication 27, 4373, 1997). La desprotección del
2-metoxi etoxi metil éter puede ser realizada en
condiciones ácidas, preferentemente utilizando ácido
trifluoroacético. De este modo, en el ejemplo 6, el grupo MEM de
derivado de benzoxacinona (8) fue desprotegido utilizando ácido
trifluoroacético para proporcionar el producto (9). La reacción de
alquilación de un grupo hidroxil fenólico puede ser llevada a cabo
utilizando un haluro de alquilo en presencia de una base, tal como
hidruro sódico, carbonato sódico, carbonato potásico, carbonato de
cesio, preferentemente carbonato potásico con o sin presencia de un
catalizador de transferencia de fase. De este modo, en el ejemplo
7, la reacción de alquilación del análogo de efavirenz (9) con un
etil-4-bromobutirato fue llevada a
cabo en presencia de carbonato potásico a una temperatura
comprendida entre 50º y 150ºC en acetona en presencia de un
catalizador de transferencia de fase
18-crown-6 para conseguir el
producto (10). La desprotección de un grupo alquil éster se puede
realizar en condiciones básicas suaves o en condiciones ácidas,
utilizando preferentemente hidróxido de litio en una solución de
alcohol en agua.
De este modo, en el ejemplo 9 se hizo reaccionar
el producto (10) con hidróxido de litio en metanol acuoso para
proporcionar el producto de ácido carboxílico hidrolizado (11). El
derivado ácido fue convertido en éster activo y a continuación
conjugado a una proteína. La reacción de alquilación sobre el
análogo de efavirenz (9) puede ser realizada también utilizando una
cadena de haloalquilo con una amina protegida (ver figura 3). El
grupo de protección para la amina puede ser un t-BOC
(grupo protector inestable en ácido) o bien una ftalimida o FMOC
(grupo protector inestable en medio básico). El enlazador de grupo
alquilo sirve para el objetivo de proporcionar un separador
adicional entre el análogo de efavirenz apropiadamente
funcionalizado y la proteína o péptido. La extensión del enlazador
puede ser utilizada en esta etapa para generar grupos terminales
activadores, tales como ésteres activos, isocianatos, tioles y
maleimidas. Por ejemplo, la reacción del grupo amino que contiene
un derivado de efavirenz con un extremo de los ésteres
homobifuncionales de N-hidroxisuccinimida de los
ácidos bis-carboxílicos, tales como ácido
tereftálico generará aductos enlazadores estables (18) de éster
N-hidroxisuccinimida que son útiles para la
conjugación a aminas sobre polipéptidos, polisacáridos y
marcadores. La extensión de un enlazador puede ser conseguida
también con reactivos eterobifuncionales para conseguir
funcionalidad maleimido (19) para la conjugación subsiguiente a
grupos tiol sobre polipéptidos y marcadores (ver figuras 4 y 5). De
manera alternativa, un enlazador terminado en amino, puede ser
extendido con un agente tiolizante heterobifuncional que reacciona
para formar un enlace amida en un extremo y un tiol libre o
protegido en el otro extremo. Algunos ejemplos de reactivos
tiolizantes de este tipo, que son bien conocidos en la técnica son
2-iminotiolano (2-IT), succinimidil
acetiltiopropionato (SATP), y succinimido
2-piridilditiopropionato (SPDP). El grupo tiol
incipiente queda entonces a disposición para formar tiol éteres con
inmunógenos o marcadores modificados con maleimida. Otro enfoque
para generar un derivado acilado con enlaces de urea o tiourea en
el punto de acoplamiento del derivado de efavirenz enlazado amino es
hacer reaccionar la funcionalidad amino del derivado de efavirenz
con 4-nitrocloroformato, fosgeno, o tiofosgeno.
Estos últimos intermediaros reaccionan fácilmente con aminas (de
aminodextrano, proteína o péptidos) para conseguir urea o tiourea.
Los equivalentes de fosgeno alternativo, tales como
carbonildiimidazol (ver figura 6) o disuccinimidil carbonato
reaccionarán de manera similar.
Además del derivado hidroxi en posición 6 (9),
se puede preparar un derivado de efavirenz funcionalizado amino en
posición 6 (23) de acuerdo con un proceso de la literatura
(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9, 3221, 1991).
La extensión del grupo amino del análogo de
efavirenz (23) se puede realizar por reacción de acilación del
grupo amino, preferentemente con anhídrido succínico en presencia de
la base, tal como se describe en la figura 7. El derivado ácido
puede ser funcionalizado como éster activo, preferentemente como
éster de N-hidroxisuccinimida (25) que es apropiado
para acoplamiento a polipéptidos y proteínas para conseguir el
compuesto (26).
Los ésteres activos de la presente invención,
por ejemplo, los compuestos (12), (18) y (25) son reactivos con
nucleopniles, especialmente aminas primarias, a una temperatura
relativamente baja en mezclas disolventes acuosas y no acuosas. El
portador inmunogénico es típicamente un polipéptido o un
polisacárido con un peso molecular superior a 100 kD. Son ejemplos
de portadores preferentes la hemocianina "keyhole limpet" (KLH)
y la tiroglobulina bovina (BTG). La reacción entre el hapteno
activo y el grupo amino del portador se lleva a cabo de manera
típica en una mezcla tamponada de agua y un disolvente orgánico
miscible en agua, tal como DMSO a temperatura ambiente y con un pH
comprendido aproximadamente entre 6 y 8.
Los siguientes ejemplos sirven solamente para
ilustrar ciertos aspectos de la invención.
Una suspensión de 5 g (30 mmol) de
5-hidroxi-2-nitrobenzaldehído
(1) en 100 ml de diclorometano y 10 ml tetrahidrofurano recién
destilado se enfrió a 0ºC. A esta suspensión se añadieron 6,25 ml
(57 mmol) de N,N-diisopropiletilamina, y la mezcla
de reacción resultante se agitó durante 5 minutos. A esta mezcla de
reacción se añadieron 3,76 ml (33 mmol) de
2-metoxietoximetil cloruro, se agitó durante 10
minutos a 0ºC, se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó a
temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se
concentró bajo presión reducida y se añadieron 150 ml de acetato de
etilo. El precipitado de color beis resultante se separó por
filtrado y el filtrado se transfirió en un embudo de separación. La
capa orgánica se lavó con 75 ml de una solución de hidróxido sódico
1N, 100 ml de agua y 75 ml de salmuera. La capa orgánica se secó
sobre carbonato potásico anhidro, se filtró y se concentró para dar
7,4 g (29 mmol, 97 %) de 2 [LC-MS; M+Na 278].
A una solución de 2 g (7,8 mmol) del producto
(2) se añadieron 5 ml de acetonitrilo seguido de 2 ml (13,5 mmol)
de trimetil (trifluorometil) silano y 20 mg (0,13 mmol) de fluoruro
de cesio. La mezcla de reacción se dejó en agitación bajo argón a
temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se
volvió marrón durante este periodo. Se concentró y purificó por
cromatografía "flash" en columna de gel de sílice utilizando
diclorometano como eluyente para dar 2,89 g (7,3 mmol, 93%) de
(3).
Se preparó una solución de 3,9 g (9,8 mmol) de
(3) en 75 ml de metanol, y se burbujeó argón a través de la misma
durante 2 minutos. A esta solución se añadieron 280 mg de 10%
Pd-C y 4 gotas de ácido acético glacial, y la
mezcla resultante fue hidrogenada en un aparato Pars bajo 50 psi
durante 2 horas. La mezcla resultante se filtró a través de CELITE
(Celite Corp.) y el filtrado se concentró bajo presión reducida. El
producto
1-[2-amino-5-(2-metoxi-etoximetoxi)-fenil]-2,2,2-trifluoro-etanol
(4) se utilizó en el ejemplo 4 sin purificación adicional.
A la totalidad del producto (4) se añadieron 50
ml de agua, 50 ml de THF, 2,5 g (23,5 mmol) de carbonato sódico y
2,5 g (11,4 mmol) de bicarbonato
di-t-butilo. La mezcla de reacción
resultante se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas y el
disolvente volátil se eliminó bajo presión reducida. Se añadieron 20
ml de agua a la solución resultante y la mezcla acuosa se extrajo
con 5 x 40 ml de diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron,
se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron. El residuo fue
purificado por cromatografía flash en columna de gel de sílice
utilizando 2:1, hexano:etil acetato como eluyente para dar 1,18 g
(2,98 mmol, 30% en dos etapas) del producto (5), en forma de
producto gomoso de color marrón claro [LC-MS; M+Na
418,1].
Una solución de 410 \muL (4,6 mmol) de oxalil
cloruro en 20 ml de diclorometano se enfrió de -40ºC a -60ºC, y se
añadieron lentamente a la reacción 650 \mul (9,1 mmol) de DMSO
anhidro. La solución se agitó de -40ºC a -60ºC durante 55 minutos y
se añadió la solución de 450 mg (1,1 mmol) de (5) en 1 ml de
diclorometano. La mezcla de reacción se agitó de -40ºC a -60ºC
durante 55 minutos y se añadió 1 ml (7,1 mmol) de trietilamina
seguido de 20 ml de agua. La mezcla de reacción resultante se agitó
durante 2 horas y la parte orgánica se separó, se lavó con 20 ml de
agua, se secó (Na_{2}SO_{4} anhidro), y se concentró bajo
presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía flash en
columna de gel de sílice utilizando diclorometano para dar 400 mg
(1,0 mmol, 89%) del producto (6) en forma de aceite amarillo intenso
[LC-MS; M+ K 432].
Una solución de 200 \mul (2,3 mmol) de
etinil-ciclopropano en 2 ml de THF recién destilado
se enfrió a -40ºC y se añadió bajo atmósfera de argón 1 ml (2,5
mmol) de n-butil litio (2,5M en hexano). La mezcla
de reacción se agitó a -40ºC durante 10 minutos. A la mezcla de
reacción se añadió una solución de 400 mg (1,0 mmol) del producto
(6) en 4 ml de THF recién destilado y la reacción se agitó a -40ºC
durante 15 minutos. A la mezcla de reacción se añadieron 2 ml de
isopropanol seguido de 20 ml de una solución de cloruro amónico
saturado a -40ºC. La mezcla de reacción se calentó hasta alcanzar la
temperatura ambiente y se añadieron 30 ml de diclorometano. La capa
orgánica se separó y se extrajo la capa acuosa con 3 x 30 ml de
diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron
(Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentraron a presión reducida. El
residuo se purificó por cromatografía flash en columna de gel de
sílice utilizando 20% de etil acetato en hexano para dar 280 mg
(0,61 mmol, 60%) de 7 [LC-MS; M+Na
482,2].
482,2].
A una solución de 1,2 g (2,6 mmol) de (7) se
añadieron 15 ml de tolueno y la mezcla de reacción se enfrío a 0ºC
-4ºC en atmósfera de argón. A la mezcla de reacción se añadieron 1,4
ml (3,5 mmol) de n-butil litio (2,5M en hexano) y la
mezcla de reacción resultante se agitó de 0ºC a -4ºC durante 10
minutos, se calentó hasta temperatura ambiente y se dejó en reflujo
durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró. A continuación
se añadieron 20 ml de agua y se extrajo la capa acuosa con 4 x 20 ml
de diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron
(Na_{2}SO_{4}) y se concentraron. El residuo se purificó
mediante cromatografía flash en columna de gel de sílice usando 20%
de etil acetato en hexano para dar 965 mg (2,5 mmol, 96%) de (8) en
forma de aceite marrón claro [LC-MS; M+H
386,1].
386,1].
A 150 mg (0,39 mmol) de (8) se añadieron 2 ml de
ácido trifluoroacético. La mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a presión
reducida y el residuo se purificó por cromatografía en capa fina
preparativa (2 mm de placa de gel de sílice, E. Merck) utilizando 5%
de metanol en diclorometano para dar 110 mg (0,37 mmol, 96%) de (9)
en forma de aceite incoloro [LC-MS; M+H 298,1].
A 120 mg (0,40 mmol) del producto (9) se
añadieron 12 ml de acetona anhidra, 120 mg (0,86 mmol) de carbonato
potásico anhidro, 2 mg de 18-crown-6
y 40 \mul (0,28 mmol) de etil 4-bromobutirato. La
mezcla de reacción se agitó a 56ºC durante 3 horas y se concentró a
presión reducida. Al residuo se añadieron 20 ml de agua seguido de
1 ml de 1N HCl. La capa acuosa se extrajo con 4 x 20 ml de
diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron
(Na_{2}SO_{4}), y se concentraron a presión reducida. El residuo
se purificó por cromatografía en capa fina preparativa (gel de
sílice, 2 mm de grosor, E. Merck) usando 1% de metanol en
diclorometano para dar 45 mg (0,11 mmol, 27%) de (10) como aceite
denso incoloro [LC-MS; M+H 412,1].
A una suspensión de 45 mg (0,11 mmol) de (10) en
4 ml de 50% de metanol en agua se añadieron 60 mg (2,5 mmol) de
hidróxido de litio. La mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 1 hora y se concentró a presión reducida. Se
añadieron 20 ml de agua al residuo seguido de 1 ml de 1N HCl. La
mezcla de reacción se extrajo con 4 x 30 ml de etil acetato. Las
capas orgánicas se combinaron, se secaron (Na_{2}SO_{4}), y se
concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por
cromatografía preparativa en capa fina (gel de sílice, 2 mm de
grosor, E. Merck) utilizando 5% metanol en diclorometano para dar 35
mg (0,091 mmol, 83%) de (11).
Una solución de 35 mg (0,091 mmol) del ácido
(11) en 2 ml de TF anhidro se enfrió a 0ºC y se añadieron 30 \mul
(0,15 mmol) de N, N-diisopropiletilamina seguida de
40 mg (1,28 mmol) de
O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
tetrafluoroborato. La mezcla de reacción se calentó hasta
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a presión
reducida y el residuo se purificó por HPLC preparativa RP
("cromatografía preparativa de alta presión en fase inversa")
usando acetonitrilo y agua como fase móvil con 0,1% de ácido
trifluoroacético para dar 30 mg (0 0,62 mmol, 68%) de (12) en forma
de polvo blanco [LC-MS; M+H 481,0].
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de 68 mg de hemocianina de
Megathura crenulata ("lapa californiana") (KLH) en 4,5 ml de 50
mM fosfato potásico (pH 7,5) se enfrió en un baño de hielo. Se
añadieron a la solución gota a gota 5 ml de DMSO, y la temperatura
de reacción se mantuvo por debajo de la temperatura ambiente. A
continuación se añadió gota a gota a la solución proteínica una
solución de 25 mg (0,052 mmol) de (12) en 0,5 ml de DMF. La mezcla
se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El conjugado
resultante se colocó en un tubo de diálisis (valor límite peso
molecular 10.000) y se dializó a temperatura ambiente en 1 L de 70%
DMSO en 50 mM de fosfato potásico (pH 7,5, 3 cambios, al menos 3
horas cada uno de ellos), 1 L de 50% DMSO en 50 mM fosfato potásico
(al menos 3 horas), 1 L de 30% DMSO en 50 mM fosfato potásico (al
menos 3 horas), 1 L de 10% DMSO en 50 mM fosfato potásico (al menos
3 horas), seguido de 6 cambios con 50 mM fosfato potásico (pH 7,5) a
4ºC (1L cada uno para al menos 6 horas cada uno). La concentración
proteínica se determinó que era de 2,1 mg/mL utilizando un ensayo de
proteína BioRad Coomassie azul (Bradford, M., Anal. Biochem. 72,
248, 1976).Se obtuvo un total de 20 ml del conjugado. La extensión
de la modificación de lisina disponible se determinó en 60% por el
método TNBS (Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14,
328-34,1988).
\vskip1.000000\baselineskip
En un baño de hielo se enfrió una solución de
475 mg de albúmina sérica bovina (BSA) en 5 ml de 50 mM fosfato
potásico (pH 7,5). A la solución se añadieron gota a gota 7 ml de
DMSO y la mezcla de reacción se mantuvo por debajo de la
temperatura ambiente. A la solución proteínica se añadió gota a gota
una solución de 10 mg (0,020 mmol) de (12) en 1 ml de DMF anhidro.
La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48
horas. El conjugado resultante se colocó en un tubo de diálisis
(valor límite peso molecular 10.000) y se dializó a temperatura
ambiente en 1 L de 70% DMSO en 50 mM de fosfato potásico (pH 7,5, 3
cambios, al menos 3 horas cada uno de ellos), 1 L de 50% DMSO en 50
mM de fosfato potásico (al menos 3 horas), 1 L de 30% DMSO en 50 mM
de fosfato potásico (al menos 3 horas), 1 L de 10% DMSO en 50 mM de
fosfato potásico (al menos 3 horas), seguido de 6 cambios con 50 mM
de fosfato potásico (pH 7,5) a 4ºC (1 L cada uno). La concentración
proteínica se determinó que era de 7,12 mg/mL utilizando ensayo
proteínico BioRad Coomassie azul. Se obtuvo un total de 45 ml del
conjugado.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 100 mg (0,33 mmol) de (23) en
25 ml de 1,2 dicloroetano se añadieron 50 mg (0,5 mmol) de anhidro
succínico, 0,50 ml (0,35 mmol) de trietilamina y 20 mg (0,16 mmol)
de 4-(dimetilamino) piridina. La mezcla de reacción se calentó
hasta reflujo durante 1,5 horas y se enfrió a temperatura ambiente.
La capa orgánica se lavó con 5% de solución acuosa de cloruro
amónico, agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) ,y se concentró para dar
el ácido (24).
\vskip1.000000\baselineskip
El éster activado (25) se preparó a partir de
(24) siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 10 para la
conversión de (11) en (12).
El derivado de amino benzoxazinona (23) se puede
preparar según el procedimiento descrito en Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters 9, 3221-3224, 1999.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron Ratones hembra de 16 emanas de
edad Balb/c con inmunogen efavirenz-KLH (13). Las
inmunizaciones iniciales fueron de 100 \mug de inmunogen
emulsionado en Adyuvante Completo de Freund, suministrado por vía
intraperitoneal. Se dejaron pasar aproximadamente tres semanas entre
las inmunizaciones. Todas las inmunizaciones posteriores fueron de
las mismas dosis emulsionadas en Adyuvante Incompleto de Freund y
también por inyección intraperitoneal. Se administraron un total de
cuatro inmunizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro días después de la última inmunización,
el ratón fue sacrificado por dislocación cervical y se extrajo el
bazo. El bazo se procesó por trituración entre dos plaquitas de
vidrio frías estériles en medio de cultivo celular caliente. Las
células liberadas se recogieron en un tubo de centrifugadora estéril
de 15 ml y un fragmento grande se dejó depositar durante
1-2 minutos. Las células suspendidas se pipetearon
en un tubo de centrifugadora de 50 ml estéril distinto y se tomó
una muestra para recuento. Las células del mieloma de la cepa F0
(ATCC) se añadieron en una relación de 1 a 5 esplenocitos y la
mezcla resultante se centrifugó dejando depositar las células en
forma de pastilla compacta. La fusión comprende la adición de
células del mieloma (1/5 del número de linfocitos), el lavado por
centrifugado, resuspensión en medio de Dulbecco modificado de Iscove
caliente libre de suero (IMDM, Irvine Scientific), y
recentrifugado. Los tubos de centrifugadora que contenían las
pastillas resultantes se agitaron con suavidad para desprender las
células, a continuación se añadió 1 ml de solución PED/DMSO caliente
(Sigma Chemicals) y se mezclaron lentamente. Las células se
mantuvieron calientes durante 1,5 minutos, después de lo cual se
añadió IMDM libre de suero, precalentado, con las siguientes
proporciones: 1 ml/min, 2 ml/min, 4 ml/min y 10 ml/min, a
continuación el tubo fue llenado hasta 50 ml, cerrado de forma
estanca e incubado durante 15 minutos. Las suspensiones de células
fueron centrifugadas, el sobrenadante se decantó y se añadió IMDM
conteniendo 10% de suero fetal de vaca (Summit Biologicals). Las
células fueron centrifugadas nuevamente y resuspendidas en medio de
clonado completo. Éste estaba formado por IMDM, 10% FCS, 10%
Condimed H1 (Roche Molecular Systems), 4 mM de glutamina, 50 \mum
2-mercaptoetanol, 40 \mum de etanolamina y
antibióticos pen/strep (penicilina/estreptomicina) (todos ellos de
Sigma). Las células fueron suspendidas a una densidad de 4x10^{5}
linfocitos/ml, distribuidas 10 \mul/pocillo en placas de
microcultivo estériles de 96 pocillos e incubadas a 37ºC en 5% de
CO_{2} durante 24 horas. Al día siguiente se añadieron 100 \mul
de medio selectivo HMT (medio de clonado + 1:25 suplemento HMT de
Sigma Chemicals). Al 6º día de incubación se retiraron
aproximadamente 150 \mul del medio de cada uno de los pocillos
utilizando un colector estéril de 8 bocas conectado a una fuente de
vacío suave. Se añadieron, a continuación, 150 microlitros de medio
HT. Éste estaba formado por el medio de clonado + 1:50 suplemento
HT (Sigma Chemicals). Las placas fueron devueltas al incubador e
inspeccionadas diariamente en cuanto a signos de crecimiento.
Cuando el crecimiento se estimó suficiente, los pocillos fueron
rastreados para determinar la producción de anticuerpos mediante
ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrieron microplacas con 100 \mul de
conjugado BSA de efavirenz (14) en tampón de carbonato 0,1 M, pH
9,5, durante 1 hora a 37ºC (humidificado). Las placas fueron
vaciadas a continuación y llenadas con una solución
post-recubrimiento consistente en tampón Tris, 1% de
hidrolizado de gelatina, 2% de sacarosa y 0,17% de TWEEN 20 (todos
los reactivos procedían de Sigma Chemicals). Las placas fueron
incubadas durante algún tiempo adicional de 1 hora a 37ºC
(humidificadas) después de lo cual fueron lavadas con solución
salina con tampón fosfato conteniendo 0,1% de TWEEN 20. Las placas
fueron llenadas a continuación brevemente con una solución de
sacarosa al 2% en 0,15M Tris, pH 7,2-7,4, y luego se
vaciaron y se dejaron secar al aire a temperatura ambiente. Una vez
secas, las placas fueron envasadas en bolsas con cierre de
cremallera ("zip-lock") conteniendo varias
bolsitas de secante, se cerraron de manera estanca y se almacenaron
a 4ºC hasta su utilización.
Cuando se determinó que los clones en
crecimiento estaban preparados para la prueba, se retiraron 25
\mul de sobrenadante de los pocillos y se transfirieron a placas
flexibles de 96 pocillos. Se añadió medio de cultivo a cada uno de
los pocillos para proporcionar una dilución 1:10 de la muestra del
medio. 25 microlitros de PBS-TWEEN fueron añadidos
a cada uno de los pocillos de una placa dotada de recubrimiento y se
añadieron 25 microlitros de una solución 800 ng/ml de efavirenz
quiral en PBS-TWEEN a los pocillos de otra placa
dotada de recubrimiento. Se transfirieron 25 microlitros de las
muestras del medio diluido a cada una de las placas dotadas de
recubrimiento que se han descrito anteriormente. Las placas fueron
incubadas cubiertas durante 1 hora a 37ºC y, a continuación,
lavadas con PBS-TWEEN. Los pocillos fueron llenados,
a continuación, con 100 \mul de conjugado IgG-HRP
de cabra antiratón (Zymed Labs) diluido en PBS-TWEEN
y las placas fueron reincuvadas durante 1 hora. Las placas fueron
lavadas a continuación nuevamente y se añadió a cada pocillo 100
\mul de sustrato K-blue (Neogen Corp). Se dejó
desarrollar color durante 5-15 minutos y, a
continuación, la reacción se interrumpió por adición de 100 \mul
de HCl 1 N. Se leyó el color mediante un lector de microplacas a
450 nm y se recogió mediante ordenador para su análisis. El criterio
de selección fue en unión a los pocillos recubiertos con conjugado
efavirenz-BSA que recibieron el
PBS-TWEEN y unión reducida en los pocillos con
recubrimiento conteniendo el medicamento de efavirenz libre.
La siguiente tabla muestra datos seleccionados
del rastreo de las placas de fusión y un subclón procedente de un
cultivo en dilución limitativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones escogidos fueron subclonados
inmediatamente con intermedio de una dilución limitativa y una vez
preparados se volvieron a probar mediante el mismo método. Se
expansionaron los subclones estables, congelados en nitrógeno
líquido y el medio agotado fue utilizado para determinar la
especificidad utilizando el siguiente ensayo de reactividad
cruzada.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sobrenadantes fueron sometidos a diluciones
en serie y recomprobados en el rastreo ELISA antes mencionado
omitiendo la inhibición competitiva con medicamento libre. Se
escogió la dilución que proporciona aproximadamente una reducción
del 50% con respecto al OD máximo para proceder a pruebas de
reactividad cruzada. Esto comprendía la repetición del ensayo
precedente con el anticuerpo a la dilución escogida y en presencia
de concentraciones variables de diferentes medicamentos. La figura
8 presenta los resultados de esta determinación.
Al determinar la concentración del medicamento
que resulta en una reducción del 50% de unión (ED_{50}) del
medicamento estándar, efavirenz, y dividiendo por el ED_{50} de
cualquier otro medicamento y multiplicando por 100, se calculó la
siguiente tabla de reactividades cruzadas porcentuales del
anticuerpo monoclonal EFA 97,1.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Este anticuerpo, obtenido mediante
inmunizaciones con efavirenz-KLH (racémico),
demostró de manera sorprendente una especificidad definida hacia la
forma quiral, clínicamente relevante del medicamento. El anticuerpo
demostró también menos del 1% de reactividad cruzada con otros
medicamentos habitualmente coadministrados incluyendo la nevapirina
de los NNRTI y la delaviradina, la
3'-ácido-3'-deoxitimidina de los
NNRTI y
2'3'-didehidro-3'-deoxitimidina,
así como el nelfinavir de los PI, saquinavir, indinavir, ritonavir,
amprenavir, lopinavir, y atazanavir.
La línea celular de hibridoma murino EFA 97,1
fue depositada en el American Type Culture Collection (ATCC,
Manassas, VA) en 14 de Febrero de 2004, recibiendo la asignación
ATCC PTA-5820.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó anticuerpo monoclonal
EFA-97,1 para desarrollar un inmunoensayo para
cuantificar efavirenz quiral mediante inhibición competitiva. Los
pocillos de la microplaca fueron recubiertos con conjugado de prueba
(14) a una concentración de 0,1 \mug/ml bajo las mismas
condiciones indicadas para el anterior rastreo ELISA. La curva
estándar fue llevada a cabo preparando una serie de dilución de
efavirenz quiral en tampón PBS-T empezando con 9,5
\muM (micromoles) y diluciones 1:3 en el mismo tampón. Se añadió
nuevos pocillos de la microplaca con recubrimiento partes alícuotas
de 25 \mul de la serie de dilución. Esto fue seguido por la
adición de 25 \mul de anticuerpo previamente diluido al doble de
la concentración utilizada para las determinaciones de
especificidad. La placa fue sellada de forma estanca e incubada
durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, los pocillos de la
placa fueron lavados 4 veces con 200 \mul de tampón
PBS-T y 50 \mul de anticuerpo
IgG-HRP de cabra antiratón prediluido a 1:5000. La
placa fue cerrada de forma estanca y devuelta al incubador durante
1 hora, después de lo cual los pocillos fueron lavados con tampón
PBS-T. El resto del ensayo fue el indicado
anteriormente.
La dosis de respuesta de densidad óptica de 450
nm con respecto a la concentración del medicamento resultó en una
curva mediante la cual se podía comparar la respuesta de muestras
desconocidas determinando de esta manera la concentración de
efavirenz. La figura 8 muestra que el rango de la concentración del
ensayo es de 0,0004 a
0,1 \muM. Dado los valores máximos de 12,9 \muM para este medicamento (Referencia Physician's Desk), esto indica que una muestra de suero con un tamaño aproximadamente de 0,2 \mul debería ser suficiente para cubrir el rango de concentración clínica máximo de este medicamento. La figura 8 es un gráfico que muestra la respuesta por efavirenz libre en un inmunoensayo de inhibición competitiva.
0,1 \muM. Dado los valores máximos de 12,9 \muM para este medicamento (Referencia Physician's Desk), esto indica que una muestra de suero con un tamaño aproximadamente de 0,2 \mul debería ser suficiente para cubrir el rango de concentración clínica máximo de este medicamento. La figura 8 es un gráfico que muestra la respuesta por efavirenz libre en un inmunoensayo de inhibición competitiva.
Claims (7)
1. Compuesto que tiene la estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que L es NH u
O;
R_{1} es una cadena de 0-10
átomos de carbono o heteroátomos saturada o insaturada, sustituida o
no sustituida, recta o ramificada;
X es un grupo enlazador que consiste en
0-2 anillos aromáticos sustituidos o no sustituidos,
o grupos enlazadores alifáticos conteniendo 0-10
átomos de carbono o heteroátomos; y
Y es un éster activado, grupo maleimido, tiol, o
NH-Z en la que Z es un portador o un marcador.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el
que el portador es seleccionado del grupo que consiste en
poli(aminoácidos), polisacáridos, poli (ácidos nucleicos) y
partículas.
3. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que el marcador es seleccionado entre
el grupo que consiste en enzimas, fragmentos de enzimas, isótopos
radiactivos, sustratos de enzimas, inhibidores de enzimas,
coenzimas, compuestos fluorogénicos, materiales quimiluminiscentes,
mediadores electroquímicos, grupos indicadores, ácidos nucleicos y
partículas.
4. Compuesto, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que Y es un éster activado
seleccionado entre el grupo que consiste en ésteres de
N-hidroxisuccinimidil, p-nitrofenil,
pentafluorofenil, y éster
N-hidroxibenzotriazolil.
5. Línea celular EFA 97,1 designación ATCC
PTA-5820, que produce un anticuerpo monoclonal que
tiene especificidad para efavirenz.
6. Anticuerpo monoclonal producido a partir de
la línea celular EFA 97,1 designación ATCC, según la reivindicación
5, teniendo el anticuerpo especificidad para efavirenz.
7. Análogo 6-hidroxi de
efavirenz que tiene una estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US732767 | 1996-10-21 | ||
| US10/732,767 US7420043B2 (en) | 2003-12-10 | 2003-12-10 | Reagents for detecting efavirenz |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330104T3 true ES2330104T3 (es) | 2009-12-04 |
Family
ID=34523056
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES04028897T Active ES2330104T3 (es) | 2003-12-10 | 2004-12-07 | Anticuerpos para la deteccion de efavirenz. |
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|---|---|---|---|---|
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| US5874430A (en) * | 1996-10-02 | 1999-02-23 | Dupont Pharmaceuticals Company | 4,4-disubstitued-1,4-dihydro-2H-3,1-benzoxazin-2-ones useful as HIV reverse transcriptase inhibitors and intermediates and processes for making the same |
| US20030100088A1 (en) | 2001-07-13 | 2003-05-29 | Sigler Gerald F. | Protease inhibitor conjugates and antibodies useful in immunoassay |
| US7271252B2 (en) * | 2003-04-22 | 2007-09-18 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Reagents for detecting efavirenz |
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2008
- 2008-05-16 US US12/121,952 patent/US20080227959A1/en not_active Abandoned
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| EP1542012B8 (en) | 2009-09-23 |
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