ES2289399T3 - Derivados de la clase del extasis, inmunogenos y anticuerpos y su utilizacion para detectar farmacos de la clase del extasis. - Google Patents

Derivados de la clase del extasis, inmunogenos y anticuerpos y su utilizacion para detectar farmacos de la clase del extasis. Download PDF

Info

Publication number
ES2289399T3
ES2289399T3 ES04016651T ES04016651T ES2289399T3 ES 2289399 T3 ES2289399 T3 ES 2289399T3 ES 04016651 T ES04016651 T ES 04016651T ES 04016651 T ES04016651 T ES 04016651T ES 2289399 T3 ES2289399 T3 ES 2289399T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mdma
compound
mmol
mdea
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES04016651T
Other languages
English (en)
Inventor
Mitali Ghoshal
Gerald F. Sigler
Richard Terry Root
Anlonga Ouyang
Salvatore J. Salamone
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2289399T3 publication Critical patent/ES2289399T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D317/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/946—CNS-stimulants, e.g. cocaine, amphetamines
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)

Abstract

Un compuesto que tiene la estructura en la que L es CO o CH2, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada, Y es un grupo funcional activado, elegido entre el conjunto formado por los ésteres activos, los isocianatos, los tioles, los imidoésteres, los anhídridos, las maleimidas, las tiolactonas, los restos diazonio y los aldehídos, R1 es H, CH3, C2H5 o C3H7, R2 es CH3 o C2H5 y R3 es un grupo protector o H.

Description

Derivados de la clase del éxtasis, inmunógenos y anticuerpos y su utilización para detectar fármacos de la clase del éxtasis.
Ámbito de la invención
Esta invención se refiere en general al ámbito de los métodos de determinación de fármacos de abuso en muestras biológicas y, más en particular, a métodos para la detección de la 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) y derivados y metabolitos de MDMA, es decir, compuestos de la clase del éxtasis.
Antecedentes de la invención
Los análogos de anfetamina de las metilenodioxifenilalquilaminas forman un grupo de compuestos que a menudo se denominan anfetaminas de diseño. Estos fármacos psicotrópicos son derivados sustituidos en un anillo, químicamente afines con la mescalina. Incluyen a la 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), la 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, éxtasis), la 3,4-metilenodioxietanfetamina (MDE, eva), la 3,4-metilenodioxietilanfetamina (MDEA), la 3,4-metilenodioxi-N-propilanfetamina (MDPA), la 3,4-metilenodioxi-N-metilbutanamina (MBDB) y la 3,4-metilenodioxibutanamina (BDB), la más frecuente de las cuales es la MDMA.
Está aumentando en todo el mundo el abuso de estas anfetaminas de diseño y su detección por métodos de exploración se ha convertido en un tema más importante. Zhao, H. y col., J. Anal. Toxicology, vol. 25, pp. 258-269, 2001, han encontrado que un 71% de las muestras de orina de participantes en fiestas llamadas "rave" contienen la MDMA o la MDA sola o en combinación con anfetamina o con otras anfetaminas de diseño, por ejemplo la MDEA.
La cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) es muy específica y se ha descrito para la detección simultánea de las MDMA, MDA, anfetamina, metanfetamina, MDEA y sus metabolitos. El análisis por CG/EM normalmente es necesario para confirmar y verificar los resultados de los ensayos inmunológicos o de un diagnóstico de sospecha. En esta técnica, se extraen la MDMA o los fármacos de diseño en fase sólida, después se derivatizan y se analizan mediante CG/EM. Sin embargo, es posible que algunos establecimientos médicos no sean capaces de detectar fármacos de la clase del éxtasis porque carecen de la instrumentación sofisticada y cara que se requiere para ello.
Para comprobar la existencia de fármacos de abuso han demostrado ser especialmente ventajosos los inmunoensayos, en particular los inmunoensayos de competencia de fijación. En los inmunoensayos de competencia de fijación, un analito de una muestra biológica compite con un reactivo marcado, o con un análogo de analito, o con un trazador, para ocupar un número limitado de sitios de fijación de receptor existentes en anticuerpos específicos del analito o del análogo de analito. Las sustancias marcadoras habituales que se emplean como trazadores son las enzimas, por ejemplo la \beta-galactosidasa y la peroxidasa, las moléculas fluorescentes, por ejemplo los compuestos de fluoresceína, los compuestos radiactivos, tales como el I^{125} y las micropartículas. La concentración de analito de la muestra determina la cantidad de análogo de analito que se fijará sobre el anticuerpo. La cantidad de análogo de analito que se fijará es inversamente proporcionar a la concentración de analito de la muestra, porque el analito y el análogo de analito se fijarán en cada caso sobre el anticuerpo en modo proporcional a sus concentraciones respectivas. La cantidad de análogo de analito libre o fijado puede determinarse por métodos apropiados para el marcador concreto que se haya utilizado.
Hasta fechas recientes no había inmunoensayos comerciales diseñados específicamente para la detección de fármacos de la clase del éxtasis y, por ello, su detección depende de las reactividades cruzadas relativas que presentan en el método de exploración de la anfetamina o de la metanfetamina que se emplee. En general, la reactividad cruzada de los ensayos comerciales de la anfetamina y metanfetamina con respecto a estos compuestos es baja, lo cual significa que el ensayo no logra detectar los compuestos de la clase del éxtasis en concentraciones relativamente bajas, lo cual equivale a decir que algunas muestras positivas quedarán sin detectarse. Es más, los inmunoensayos existentes de la anfetamina y metanfetamina están limitados por su reactividad cruzada con medicaciones antialérgicas y contra el resfriado, por ejemplo la efedrina, pseudoefedrina y fenilpropanolamina y con fármacos dietéticos, por ejemplo la fentermina. Este factor de reactividad cruzada impide bajar el nivel de corte para la detección de la anfetamina y metanfetamina, lo cual impide a su vez detectar fármacos de la clase del éxtasis cuando están presentes en concentraciones más bajas. Se requiere, por tanto, un ensayo que tenga mayor especificidad con respecto a los compuestos de la clase del éxtasis, ya sea en un ensayo para detectar compuestos de la clase del éxtasis solos, ya sea en un ensayo para detectar compuestos de la clase del éxtasis así como la anfetamina y metanfetamina.
Ya son conocidos los anticuerpos de la anfetamina y metanfetamina de reactividad cruzada significativa con uno o más componentes del fármacos de la clase del éxtasis (Cody, J., J. Anal. Toxicology 14, 321, 1990).
Por la bibliografía técnica (solicitud de patente europea 329,326, publicada el 23 de agosto de 1989) se conoce la síntesis de compuestos aromáticos sustituidos unidos mediante restos metilenodioxi (MDO).
En la solicitud de patente GB-2,361,473, publicada del 24 de octubre de 2001, se describen análogos de la clase del éxtasis para la detección de compuestos de la clase del éxtasis en muestras biológicas. Los conjugados e inmunógenos descritos se derivan de la posición del nitrógeno de la MDA. En la presente solicitud se describe una solución alternativa del problema, es decir, conjugados e inmunógenos derivados de la posición del carbono del resto MDO de los compuestos de la clase del éxtasis.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a nuevos análogos de compuestos de la clase del éxtasis y nuevos inmunógenos de la clase del éxtasis derivados de la posición del carbono del resto MDO de los compuestos de la clase del éxtasis. La invención se refiere además a anticuerpos monoclonales únicos, generados empleando inmunógenos de MDMA unidos mediante MDO así como a conjugados y trazadores únicos. Estos anticuerpos, conjugados y trazadores son útiles para inmunoensayos destinados a detectar compuestos de la clase del éxtasis en líquidos biológicos.
La presente invención describe nuevos derivados de compuestos de la clase del éxtasis que tienen un grupo de engarce en la posición del metilenodioxi:
1
en esta fórmula, L es CO o CH_{2}, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada, Y es un grupo funcional activado, elegido entre el conjunto formado por los ésteres activos, los isocianatos, los tioles, los imidoésteres, los anhídridos, las maleimidas, las tiolactonas, los restos diazonio y los aldehídos, R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7}, R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5} y R_{3} es un grupo protector o H.
La presente invención describe también nuevos conjugados que tienen un grupo de engarce en la posición del carbono del resto MDO de los compuestos de la clase del éxtasis:
2
en esta fórmula, R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7}, R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5}, Z es una molécula vehículo, L es CO o CH_{2}, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es una representación esquemática de un método de síntesis de derivados de MDMA protegidos con t-BOC y provistos de grupos funcionales amino (1F), hidroxilo (1N) y carboxilo (1M).
La figura 2 es una representación esquemática de un método de síntesis de un éster de N-hidroxisuccinimida de un derivado hapteno activado con MDMA protegido con trifluoracetamido (1L).
La figura 3 es una representación esquemática de la síntesis de un inmunógeno de MDMA (1P) y de un conjugado de MDMA-BSA (1O) a partir del derivado hapteno activado con MDMA (1L).
La figura 4 es una representación esquemática de un método de síntesis de derivados de MDEA protegidos con t-BOC y provistos de grupos funcionales amino (2F) y carboxilo (2M).
La figura 5 es una representación esquemática de un método de síntesis de un éster de N-hidroxisuccinimida de un derivado de hapteno activado con MDEA y protegido con trifluoracetamido (2L).
La figura 6 es una representación esquemática de la síntesis del inmunógeno de MDEA (2U) y del conjugado de exploración de MDMA-BSA (2T) a partir de derivado de hapteno activado con MDEA (2L).
La figura 7 es una representación esquemática de la síntesis del derivado maleimido de MDEA (2O) a partir del derivado amino (2F).
La figura 8 es una representación esquemática de la síntesis del conjugado de MDEA-maleimido-BSA (2R) a partir del derivado maleimido de MDEA (2O) y BSA tiolado.
La figura 9 es una representación esquemática de la síntesis del conjugado de MDEA-maleimido-KLH (2S) a partir del derivado maleimido de MDEA (2O) y KLH tiolado.
La figura 10 es una representación esquemática de la síntesis de un hapteno activado de MDA (3H).
La figura 11 es una representación esquemática de la síntesis de un conjugado de MDA-aminodextrano (3I).
La figura 12 es una representación esquemática de un método de síntesis de derivados de BDB (4H) y MBDB (5H) protegidos con carbobenzoxi.
La figura 13 es una representación esquemática de un método de síntesis de conjugados de KLH y aminodextrano de derivados de BDB (4M y 4N) y MBDB (5M y 5N).
Descripción detallada de la invención
Los compuestos, p.ej., los haptenos, los compuestos intermedios y los inmunógenos útiles para la obtención de anticuerpos específicos de los compuestos de la clase del éxtasis, los anticuerpos específicos de compuestos de la clase del éxtasis, los kits de reactivos que contienen anticuerpos específicos de compuestos de la clase del éxtasis, los métodos de obtención de anticuerpos específicos de los compuestos de la clase del éxtasis y los métodos de detección de analitos incluidos los componentes de la clase de compuestos del éxtasis se han descubierto y se han descrito en la presente.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones adjuntas, se aplican las definiciones siguientes.
Se entiende por "metilenodioxi-anfetaminas", "compuestos de la clase MD" o "compuestos de la clase del éxtasis" el grupo de análogos de anfetamina de las metilenodioxifenilalquilaminas que tienen un sistema de anillo fenilometilenodioxi fusionado, que incluye a la 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), la 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, éxtasis), la 3,4-metilenodioxietanfetamina (MDEA, eva), la 3,4-metilenodioxi-N-propilanfetamina (MDPA), la 3,4-metilenodioxi-N-metilbutanamina (MBDB) y la 3,4-metilenodioxibutanamina (BDB). Los diseñadores de fármacos continúan sintetizando nuevos compuestos que pertenecen a la clase del éxtasis, por lo cual está clase continúa creciendo. Por consiguiente, tal como se emplea aquí, los compuestos de la clase del éxtasis incluyen tanto a los compuestos ya sintetizados o identificados como a los que todavía no se han sintetizado ni identificado.
Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" indican sustancias capaces inducir, producir o generar una respuesta inmune en un organismo.
El término "conjugado" indica cualquier sustancia formada por unión de los dos componentes. Los conjugados representativos con arreglo a la presente invención incluyen a los formados por unión de una molécula pequeña con una molécula grande, por ejemplo una proteína. El término conjugado incluye al término inmunógeno.
Los "haptenos" son antígenos parciales o incompletos. Son sustancias exentas de proteínas, en su mayor parte son sustancias de pesos moleculares bajos, que no son capaces de estimular la formación de un anticuerpo, pero que reaccionan con anticuerpos. Estos últimos se forman por unión de un hapteno con un vehículo de peso molecular elevado y después inyección de este producto de la unión, es decir, un inmunógeno, en un sujeto humano o animal. Las MDA, MDMA, MDEA, MBDB, BDB y MDPA son haptenos.
El término "hapteno activado" indica un hapteno provisto de un sitio de reacción disponible, por ejemplo, por fijación de un grupo de engarce que lleve un resto reactivo, que pueda utilizarse para unir al hapteno con un vehículo, inmunógeno, marcador, trazador u otro resto.
Tal como se emplea aquí, un "grupo de engarce" o "engarce" indica una porción de una estructura química, que conecta dos o más subestructuras del tipo haptenos, vehículos, inmunógenos, marcadores, trazadores u otros engarces. Un grupo de engarce tiene por lo menos 1 cadena ininterrumpida de átomos distintos de hidrógeno (u otros átomos monovalentes) que se extienden entre las subestructuras. Los átomos del grupo de engarce y los átomos de la cadena de un grupo de engarce están unidos entre sí mediante enlaces químicos. Los engarces pueden ser cadenas carbonadas lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Pueden incluir además uno o más heteroátomos dentro de la cadena y en los extremos de las cadenas. Se entiende por "heteroátomos" los átomos distintos del carbono, que se eligen entre el grupo formado por oxígeno, nitrógeno y azufre. Los grupos de engarce pueden contener también grupos cíclicos o aromáticos como parte de la cadena o como sustituyentes de uno de los átomos de la cadena.
El número de átomos en un grupo de engarce se determina contando los átomos que no son hidrógeno. El número de átomos en una cadena dentro de un grupo de engarce se determina contando el número de átomos que no son hidrógeno tomando el camino más corto entre las subestructuras conectadas. Los grupos de engarce pueden utilizarse para activar, p.ej., proporcionar un sitio disponible en un hapteno para sintetizar un conjugado de un hapteno con un marcador o vehículo.
Un "vehículo" o "vehículo inmunogénico" son términos que se emplean aquí para indicar una sustancia inmunogénica, normalmente una proteína, que puede unirse a un hapteno, permitiendo de este modo que el hapteno induzca una respuesta inmune y provoque la formación de anticuerpos que pueden fijarse específicamente sobre el antígeno (hapteno). Las sustancias vehículo incluyen a las proteínas, las glucoproteínas, los polisacáridos complejos, las partículas y los ácidos nucleicos, que se reconocen como ajenos y, de este modo, provocan una respuesta inmunológica en el hospedante.
Pueden emplearse varios tipos de proteínas como vehículo inmunogénico poli(aminoácido). Estos tipos incluyen a las albúminas, proteínas del suero, p.ej. globulinas, proteínas de lente ocular, lipoproteínas, etc. Las proteínas ilustrativas incluyen a la albúmina de suero bovino (BSA), la hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), la ovalbúmina de huevo, la gamma-globulina bovina (BGG), etc. Como alternativa pueden utilizarse poli(aminoácidos) sintéticos.
El vehículo inmunogénico puede ser también un polisacárido que es un polímero de peso molecular elevado, formado por condensaciones repetidas de monosacáridos. Los ejemplos de monosacáridos son los almidones, el glucógeno, la celulosa, las gomas de hidratos de carbono, por ejemplo la goma arábiga, el agar, etcétera. Los polisacáridos pueden contener además restos poliaminoácidos y/o restos lípidos.
El vehículo inmunogénico puede ser también un poli(ácido nucleico) solo o conjugado con uno de los poli(aminoácidos) o polisacáridos recién mencionados.
El vehículo inmunogénico puede ser también una partícula. Las partículas tienen por lo general un tamaño por lo menos de 0,02 micras (\mum) y no superior a 100 \mum, normalmente entre 0,05 \mum y 10 \mum de diámetro. La partícula puede ser orgánica o inorgánica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, opcionalmente de una densidad similar a la del agua, por lo general entre 0,7 y 1,5 g/ml y compuesta de un material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partículas pueden ser materiales biológicos, tales como células y microorganismos, los ejemplos no limitantes de las mismas son los eritrocitos, los leucocitos, los linfocitos, los hibridomas, los Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli y los virus. Las partículas pueden estar formadas también por polímeros orgánicos e inorgánicos, liposomas, látex, vesículas de fosfolípidos o lipoproteínas.
Los "poli(aminoácidos)" o "polipéptidos" son poliamidas formadas a partir de aminoácidos. Los poli(aminoácidos) tienen un peso molecular que se sitúa en general en 2.000 daltones, pero no tienen un límite superior de peso molecular, que normalmente será inferior a 10.000.000 y por habitualmente no superior a 600.000 daltones. Los intervalos serán por lo general distintos, en función de si se emplea un vehículo inmunogénico o una enzima.
Un "péptido" es cualquier compuesto formado por unión de dos o más aminoácidos mediante enlaces amídicos (peptídicos), por lo general un polímero de \alpha-aminoácidos en el que el grupo \alpha-amino de cada resto aminoácido (excepto el extremo NH_{2}) está unido al grupo \alpha-carboxilo del resto siguiente de la cadena lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido) se utilizan indistintamente para indicar este grupo de compuestos sin restricciones, por ejemplo sin la restricción del tamaño. Los componentes más voluminosos de este grupo se llaman proteínas.
Un "marcador" o "molécula detectora" o "trazador" es cualquier molécula que produce o puede inducir la producción de una señal detectable. El marcador puede conjugarse con un analito, inmunógeno, anticuerpo u otra molécula, por ejemplo un receptor o una molécula que pueda fijarse sobre un receptor tal como un ligando, en particular un hapteno. Los ejemplos no limitantes de marcadores incluyen a los isótopos radiactivos, las enzimas, los fragmentos de enzimas, los sustratos de enzimas, los inhibidores de enzimas, las coenzimas, los catalizadores, los fluoróforos, los colorantes, los agentes quimioluminiscentes y los sensibilizadores; una partícula magnética o no magnética; un soporte sólido, un liposoma, un ligando o un receptor.
El término "anticuerpo" indica un reactivo de fijación específico de una proteína que se dirige contra un antígeno y es cualquier sustancia o grupo de sustancias, que tiene una afinidad de fijación específica para un antígeno, con exclusión de otras sustancias. El término genérico "anticuerpo" incluye a los anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
El término "analito" indica cualquier sustancia o grupo de sustancias, cuya presencia o cantidad se quiere determinar. Tal como se emplea aquí, el término "analito" incluye al término "antígeno", que indica cualquier compuesto que puede fijarse sobre un anticuerpo. Además, tal como se emplea aquí, el término analito indica cualquier tipo de sustancias químicas, incluidos, pero sin limitarse a ellos, los conjugados, inmunógenos, fármacos, derivados de fármacos, hormonas, proteínas, antígenos, oligonucleótidos y similares. Los analitos representativos de la clase del éxtasis incluyen, pero no se limitan a: las MDA, MDMA, MDEA, MDPA, BDB, MBDB y similares.
El término "derivado" indica un compuesto químico o una molécula formados a partir de un compuesto original después de una o más reacciones químicas.
El término "análogo de analito" indica cualquier sustancia o grupo de sustancias, que pueden emplearse en un inmunoensayo de competición, que se comporta de modo similar a un analito en lo que respecta a la afinidad de fijación sobre un anticuerpo. Los análogos de analito representativos incluyen a los fármacos e isómeros de los mismos, derivados de fármacos, hormonas, polipéptidos, nucleótidos y similares.
La frase "detección de un analito" indica cualquier método cuantitativo, semicuantitativo o cualitativo, así como todos los demás métodos de determinación de un analito en general y de un fármaco de la clase del éxtasis en particular. Por ejemplo, un método que detecta meramente la presencia o ausencia de un fármaco de la clase del éxtasis en una muestra está comprendido dentro del alcance de la presente invención, al igual que los métodos que proporcionan datos tales como la cantidad o la concentración del fármaco en la muestra. Los términos "detección", "determinación", "identificación" y similares se emplean aquí de forma indistinta; todos ellos están comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
El término "kit de reactivos" o "kit de ensayo" indica un conjunto de materiales que se emplean en la ejecución de un ensayo. Los reactivos pueden suministrarse en una combinación envasada dentro de un solo recipiente o en recipientes separados, en función de sus estabilidades y reactividades cruzadas y en forma líquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de los reactivos suministrados en el kit pueden elegirse de manera que proporcionen resultados óptimos en una aplicación particular. Un kit de reactivos que satisfaga las exigencias de la presente invención contiene anticuerpos específicos de los compuestos de la clase del éxtasis. El kit puede contener además ligandos del analito y materiales de calibrado y control. Los materiales pueden permanecer en forma líquida o estar liofilizados.
La frase "materiales de calibrado y control" indica cualquier patrón o material de referencia que contenga una cantidad conocida de un analito a determinar. Una muestra, de la que se sospecha que contiene un analito y el correspondiente material de calibrado se ensayan en condiciones similares. Se calcula la concentración de analito por comparación de los resultados obtenidos con una muestra desconocida con los resultados obtenidos con el patrón. Esto se realiza por lo general trazando una curva de calibrado.
El término "grupo alquilo" indica cualquier cadena de hidrocarburo saturada o insaturada, cíclica, acíclica, lineal o ramificada. Los grupos alquilo representativos incluyen a los alcanos, alquenos, alquinos, cicloalcanos, cicloalquenos, cicloalquinos, arilos y similares y combinaciones de los mismos.
La frase "opcionalmente sustituido" indica la unión opcional de uno o más sustituyentes a un grupo alquilo.
El término "grupo saliente" indica cualquier resto químico de un sustrato que puede desplazarse por acción de un sustituyente que reaccione con él. Los grupos salientes idóneos incluyen, pero no se limitan a: haluros, mesilatos, tosilatos, alcoxis, sales de amonio cuaternario y similares. Los grupos salientes preferidos para el uso según las formas de ejecución actualmente preferidas se proporcionan en forma de ésteres activados, p.ej. ésteres de trifluoretoxi, ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de pentafluorfenilo, ésteres de imidazolilo y ésteres de N-hidroxibenzotriazolilo, en tales casos la porción del éster que contiene oxígeno unido al carbono del carbonilo se desplaza en el curso de la reacción.
El término "grupo protector" indica cualquier resto que está unido a un átomo o centro reactivo con el fin de alterar su reactividad habitual. Los grupos protectores idóneos incluyen, pero no se limitan a los descritos en el manual titulado "Protective Groups in Organic Synthesis", 3ª edición, de Theodora W. Greene y Peter G.M. Wuts (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999). En química orgánica se conocen varios grupos protectores del nitrógeno de las aminas, entre los cuales actualmente es preferido el trifluoracetilo como grupo protector del nitrógeno.
El término "muestra biológica" incluye, pero no se limita a: cualquier cantidad de una sustancia derivada de un ser vivo o lo que fue un ser vivo. Tales seres vivos incluyen, pero no se limitan a: humanos, ratones, simios, ratas, conejos, caballos y animales similares. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a: sangre, suero, orina, lágrimas, células, órganos, tejidos, huesos, médula ósea, linfa, nódulos linfáticos, tejido sinovial, condrocitos, macrófagos sinoviales, células endoteliales y piel.
Un compuesto que satisfaga los requisitos de la presente invención es útil como compuesto intermedio, hapteno o inmunógeno para la producción de anticuerpos específicos de los fármacos de la clase del éxtasis. Una primera serie de compuestos que cumplen los requisitos de la presente invención tienen la estructura siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que L es CO o CH_{2}, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada, Y es un grupo funcional activado, elegido entre el conjunto formado por los ésteres activos, los isocianatos, los tioles, los imidoésteres, los anhídridos, las maleimidas, las tiolactonas, los restos diazonio y los aldehídos, R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7}, R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5} y R_{3} es un grupo protector o H.
\newpage
Una segunda serie de compuestos que cumplen los requisitos de la presente invención tienen la estructura siguiente:
4
en la que R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7}, R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5}, Z es una molécula vehículo, L es CO o CH_{2} y X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada.
Los esquemas de síntesis de inmunógenos y los conjugados de exploración de las MDMA, MDEA, MDA, MBDB y BDB se ilustran en las figuras l-13. En estas figuras, las reacciones se efectúan en orden sucesivo. Los números subrayados y en negrita indica la estructura correspondiente, representada de las figuras.
En general, la aminación reductora de la 3,4-dimetoxifenil-acetona (ver figura 1) se efectúa empleando una amina apropiada (amoníaco, metilamina o etilamina) en presencia de un agente reductor, con preferencia borhidruro sódico o cianoborhidruro sódico, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 25ºC para obtener la 3,4-dimetoxifenil-propilamina (1A). Este último compuesto intermedio se desmetila a continuación para obtener 3,4-dihidroxifenil-propilamina. Por ejemplo, la desmetilación de derivados fenólicos se lleva a cabo por reacción con tribromuro de boro en diclorometano entre -70ºC y temperatura ambiente. En química orgánica se conoce una gran variedad de reacciones de desmetilación reacciones, por ejemplo, yoduro de trimetilsililo, tioetóxido sódico, tiofenóxido potásico, cianuro sódico en DMSO, tribromuro de aluminio en etanotiol y ácido bromhídrico (Greene, T. y Wuts, P., "Protective groups in organic synthesis", 2ª edición, Wiley-Intersciences, 1991). La desmetilación del derivado 3,4-dimetoxifenil-propilamina (1A) se lleva a cabo con preferencia en presencia de HBr del 48% a reflujo durante 3-4 horas, obteniéndose el compuesto 1B. A continuación se protege el grupo amino de la 3,4-dihidroxifenil-propilamina 1B.
En química orgánica ya se conoce la protección del grupo amino en presencia de grupos hidroxi fenólicos libres. Estas reacciones se efectúan eligiendo correctamente el grupo protector y las condiciones de reacción. Un ejemplo de grupo protector de N, que se elimina en condiciones ligeramente básicas, es el fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC). Un ejemplo de grupo protector de N que se elimina fácilmente en condiciones ácidas es el t-butiloxicarbonilo (BOC). La protección preferida del grupo amino del derivado 3,4-dihidroxifenil-propilamina (1B) es el BOC en este orden de reacciones. La protección selectiva del grupo amino del derivado 3,4-dihidroxifenil-propilamina (1B) en forma de BOC en presencia de grupos hidroxi fenólicos libres se efectúa con preferencia por reacción con dicarbonato de di-t-butilo en THF acuoso que contiene una base moderada, con preferencia bicarbonato sódico. Después se convierte el compuesto intermedio 3,4-dihidroxifenil-N-BOC-propilamina (1C) en el derivado 3,4-metilenodioxifenil-N-BOC-propilamina (1D) por una reacción de alquilación con un dihaloacetato de alquilo (RCOOCHX2, en el que X = I, Br o Cl y R = alquilo inferior de 1 a 5 átomos de carbono), con preferencia dibromoacetato de etilo en presencia de una base y un disolvente aprótico dipolar y con preferencia especial carbonato potásico en DMF a 120ºC, en condiciones anhidras. El grupo funcional éster del derivado clave resultante, la 3,4-metilenodioxifenilo-N-BOC-propilamina sustituida por etoxicarbonilo (1D), puede modificarse para introducir varios grupos funcionales mediante diversas uniones con grupos de engarce. El último éster de etilo se convierte con preferencia especial en primer lugar en una amida (1E) con amoníaco en metanol en condiciones bien conocidas de la química orgánica. Después sigue la reducción de la amida (1E) con un agente reductor, con preferencia hidruro de litio y aluminio, entre -70ºC y temperatura ambiente. Se somete el grupo amino del derivado resultante aminometil-3,4-metilenodioxifenil-N-BOC-propilamina (1F) a reacciones de acilación con una gran variedad de extensiones de engarce activadas con carbonilo o de marcadores, que son bien conocidos de los expertos en la materia. La extensión de engarce se realiza a menudo para generar un grupo activado terminal. Por ejemplo, en una forma preferida de ejecución, se hace reaccionar un derivado 3,4-metilenodioxifenil-N-BOC-propilamina modificado con aminometilo (1F) con engarces, que son productos comerciales, de un éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido maleimido-alcanoico para generar grupos maleimido terminales para la posterior conjugación con grupos tiol de polipéptidos y marcadores (ver figura 7). El grupo N-BOC del derivado maleimido resultante (2N) se desprotege en presencia de ácido trifluoracético. Entonces el aducto de maleimido desprotegido (2O) está listo para reaccionar con proteínas que contengan grupos tiol y formar los conjugados tiol-éter. Los grupos tiol de las proteínas pueden derivarse de restos cisteína nativos o pueden introducirse por reacción con reactivos tiolantes. Algunos ejemplos de reactivos tiolantes son el 2-iminotiolano (2-IT), acetiltiopropionato de succinimidinilo (SATP) y 2-piridilditiopropionato de succinimidilo (SPDP). El grupo tiol incipiente queda disponible después de la desprotección correcta la proteína modificada con el SATP (o el SPDP) para la conjugación con un derivado maleimido (2O). Como alternativa se extiende un engarce terminado en amino de un derivado 3,4-metilenodioxifenilo sustituido con aminometilo (1F) con un agente tiolante heterobifuncional que reaccione para formar un enlace amida en un extremo y un tiol libre o protegido en el otro extremo y a continuación se utiliza para la conjugación con una proteína modificada con maleimido. Como alternativa se puede emplear una extensión de engarce, empleando un engarce homobifuncional por ejemplo un éster de N-hidroxisuccinimida de un ácido dicarboxílico, por ejemplo el ácido tereftálico, para generar un éster activado en un solo paso por reacción con el derivado amino recién mencionado. Para un buen tratamiento del tema de los engarces se remite al lector a la obra de Hermanson, Greg T., "Bioconjugate Techniques", Academic Press Inc., 1996. En otra forma preferida de ejecución de la extensión del engarce se efectúa una succinilación del grupo amino del derivado aminometil-3,4-metilenodioxifenil-N-trifluoracetil-propilamina (1J) con anhídrido succínico en presencia de una base (ver figura 2). Las bases preferidas son la piridina, la trietilamina, la diisopropiletilamina, la 4-dimetilaminopiridina y con preferencia especial la trietilamina, la 4-dimetilaminopiridina o una combinación de dos de las bases recién mencionadas. Se efectúa la reacción a 40-60ºC en un disolvente anhidro, por ejemplo acetato de etilo, THF, 1,2-dicloroetano, con preferencia 1,2-dicloroetano. Se activa el ácido resultante por conversión del mismo en un éster activo, con preferencia en un éster de N-hidroxisuccinimida, por reacción con una carbodiimida, con preferencia la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) o con la N-hidroxisuccinimida. Se utiliza este éster activado para la conjugación con polipéptidos sintéticos o con aminodextrano con arreglo a un procedimiento estándar ya conocido de la técnica. La desprotección del grupo N-trifluoracetilo del resto hapteno del conjugado se realiza por tratamiento con una base, con preferencia hidróxido amónico del 10% o carbonato potásico de pH 11. Como alternativa puede utilizarse un grupo protector lábil, tal como el BOC, en el mismo orden de reacciones y eliminarlo del conjugado por tratamiento con ácido trifluoracético.
Para la obtención de conjugados de proteínas se prefiere un grupo protector sensible a las bases en el derivado hapteno, debido a la estabilidad de la proteína. Se sabe que las condiciones ácidas desnaturalizan a las proteínas. Se puede elegir entre una gran variedad de grupos protectores sensibles a las bases, siendo preferido el grupo trifluoracetilo. Se protege el derivado BOC-metilenodioxifenil-amino (1F) con un grupo carbobenzoxi (CBz). Ya es conocida en la técnica la protección del grupo funcional amino con el grupo CBz empleando el reactivo cloruro de CBz a una temperatura de 0ºC a 25ºC, con preferencia a temperatura ambiente. Después se efectúa la desprotección del BOC en condiciones ácidas, con preferencia con ácido trifluoracético. Se protege el grupo amino libre (amina primaria o secundaria, 1H o 2H) en forma de trifluoracetamida. En la técnica es bien conocida la reacción en la que se emplea cualquier reactivo trifluoracetilante, trifluoracetato de etilo o anhídrido trifluoracético, con preferencia empleando el anhídrido trifluoracético. El grupo protector CBz del compuesto trifluoracetamida (1I) se desprotege por hidrogenación empleando Pd al 10% sobre C a presión atmosférica. El grupo amino libre (1J) se extiende a un grupo carboxilo por una reacción de succinilación ya descrita antes. La activación del grupo carboxilo (1K) se efectúa mediante un paso de activación empleando una carbodiimida del tipo diciclohexilcarbodiimida (DCC) o EDC, con preferencia EDC en presencia de N-hidroxisuccinimida. La conjugación con la proteína proporciona el inmunógeno y protegido y los conjugados de exploración. La desprotección del grupo trifluoracetamido de los conjugados de proteína se realiza por tratamiento con una base acuosa, con preferencia por diálisis frente al carbonato potásico acuoso (pH 11) o hidróxido amónico del 10% (pH 11,5), obteniéndose un inmunógeno (1P) y un conjugado de exploración de BSA (1O).
La conversión del grupo éster de la 3,4-metilenodioxi-fenil-N-BOC-propilamina sustituida por etoxicarbonilo (1D) en su producto ácido hidrolizado (1M) y posterior extensión mediante un grupo de engarce empleando un engarce amida puede ser también una vía para la obtención de un éster conjugado para la conjugación con un proteína. Como alternativa puede reducirse el grupo funcional éster (1D) con un agente reductor, con preferencia el hidruro de litio y aluminio, obteniéndose un alcohol (1N) que se extiende mediante un grupo éster, uretano o un engarce éter y, de modo similar, tal como se ha descrito antes, se convierte en un éster activo para la conjugación con la proteína.
Se aplican métodos similares a los descritos para la MDMA (figuras 1-3) para sintetizar los derivados de la MDEA y conjugados (figuras 4-9), derivados de MDA y conjugados (figuras 10 y 11) y derivados y conjugados de la BDB o de la MBDB (figuras 12 y 13).
Un resultado imprevisto del trabajo aquí descrito es que en varios casos se obtienen anticuerpos de fijación mucho más alta con moléculas estructuralmente afines que para el fármaco correspondiente al inmunogéno. A partir de las fusiones, en las que se emplea como inmunógeno la MDMA-KLH, se obtienen clones que muestran una preferencia muy significativa por la MDEA por encima de la reacción con la MDMA. El clon MDMA 8.2 muestra una preferencia aprox. 89 mayor por la MDEA que por la MDMA. No era de esperar que la presencia de un grupo etilo pudiera conferir una reactividad cruzada tan elevada con respecto a un anticuerpo dirigido contra una molécula provista de un grupo metilo en la misma posición.
Otro anticuerpo sorprendente, obtenido por la fusión MDMA-KLH, es el MDMA 6.1, en el que de forma inesperada se observan elevadas reactividades cruzadas con la d-metanfetamina y la MBDB. El primer fármaco carece de la porción metilenodioxi en la estructura de inmunógeno y el segundo fármaco tiene un grupo etilo en lugar de un metilo en el inmunógeno. Aunque pueda parecer lo mismo que se ha encontrado para el MDMA 8.2, en realidad no lo es ya que la sustitución se efectúa en una posición significativamente diferente.
Además se ha encontrado que el uso de un inmunógeno de MDEA da lugar a la formación de anticuerpos inesperados. Los clones MDEA 2.2 muestran una preferencia 4 veces mayor por la MDMA y una preferencia 44 veces mayor por la MBDB con respecto al hapteno inmunizante MDEA. Ambas reactividades son inesperadas sobre la base de las diferencias estructurales de estos fármacos.
Formas de ejecución específicas
En los ejemplos que siguen, los números en negrita remiten a las estructuras correspondientes de las figuras.
Ejemplo 1 [2-(3,4-dimetoxi-fenil)-1-metil-etil]-metil-amina (1A)
Se enfría a 4ºC una solución de 15,1 g (78 mmoles) de (3,4-dimetoxifenil)-acetona (1) en 102 ml de metanol y se trata con 35 ml de metilamina al 40% en agua. A la mezcla reaccionante se le añaden 3,5 g (92,5 mmoles) de borhidruro sódico y la temperatura de la reacción se mantiene en 4ºC. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación durante 30 minutos más y se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 60 ml de agua y se acidifica la mezcla reaccionante resultante a pH 1 empleando HCl 6N. Se extrae la fase acuosa con 5 x 50 ml de diclorometano y se ajusta el pH a 13 con NaOH 6N. Se extrae la fase acuosa con 4 x 75 ml de diclorometano. Se reúnen las fases orgánicas, se secan y se concentran, obteniéndose 15 g (72 mmoles, 92%) del compuesto 1A en forma de aceite incoloro (M+H, 210).
Ejemplo 2 4-(2-metilamino-propil)-benceno-1,2-diol, compuesto con sal del ácido bromhídrico (1B)
Se calienta a reflujo en atmósfera de argón durante 3,5 horas una solución de 2 g (9,5 mmoles) del compuesto 1A en 20 ml de HBr del 48% y se concentra a presión reducida, obteniéndose el compuesto 1B en forma de aceite marrón oscuro. Este se utiliza en el paso siguiente sin más purificación.
Ejemplo 3 [2-(3,4-dihidroxi-fenil)-1-metil-etil]-metil-carbamato de tert-butilo (1C)
A todos los 1B de la anterior mezcla reaccionante se les añaden 40 ml de tetrahidrofurano (THF) al 50% en agua. A la mezcla reaccionante se le añaden 2,0 g de bicarbonato sódico. Se añade por goteo y con agitación durante un período de 30 minutos una solución de 2 g (9,2 mmoles) de dicarbonato de di-t-butilo en 10 ml de THF y se mantiene la mezcla en agitación durante 12 horas. Se añaden otros 500 mg (2,29 mmoles) de dicarbonato de di-t-butilo en 10 ml de THF a la mezcla reaccionante durante un período de 40 minutos y se mantiene la mezcla reaccionante en agitación durante 20 minutos más, después se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 50 ml de agua y se extrae la mezcla resultante con 4 x 50 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 30% en hexano, de este modo se obtienen 2,5 g (8,8 mmoles, 93% con respecto al compuesto 1A) del compuesto 1C en forma de aceite incoloro (M+Na, 304).
Ejemplo 4 5-[2-(tert-butoxicarbonil-metil-amino)-propil]-benzo[1,3]dioxol-2-carboxilato de etilo (1D)
A 2,5 g (8,8 mmoles) del compuesto 1C se le añaden 20 ml de N,N-dimetilformamida anhidra (DMF) y después 3,68 g (26 mmoles) de K_{2}CO_{3} anhidro y 3 ml (23 mmoles) de dibromoacetato de etilo. Se calienta la mezcla reaccionante a 100ºC durante 4,5 horas y después se deja enfriar a temperatura ambiente. Se concentra a sequedad a presión reducida y al residuo se le añaden 50 ml de agua. Se ajusta la mezcla a pH 3 con HCl 1N y se extrae con 4 x 50 ml de diclorometano. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran a sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 15% en hexano, de este modo se obtienen 1,1 g (3,01 mmoles, 34%) del compuesto 1D en forma de aceite incoloro (M+Na, 388).
Ejemplo 5 [2-(2-hidroximetil-benzo[1,3]dioxo-5-il)-1-metil-etil]-metilcarbamato de tert-butilo (1N)
Se enfría entre -25ºC y -35ºC una mezcla de 313 mg (8,24 mmoles) de hidruro de litio y aluminio en 4 ml de THF recién destilado. A la mezcla reaccionante se le añade por goteo durante un período de 20 minutos una solución de 630 mg (1,72 mmoles) del compuesto 1D en 10 ml de THF. Se mantiene la mezcla en agitación entre -30 y -40ºC durante 20 minutos y se interrumpe la reacción con 10 ml de acetato de etilo. Se filtra la mezcla reaccionante a través de CELITE y se concentra el líquido filtrado a sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía a través de gel de sílice empleando acetato de etilo como eluyente, obteniéndose 480 mg (1,48 mmoles, 86%) del compuesto 1N en forma de goma densa incolora (M+Na, 346).
Ejemplo 6 Ácido 5-[2-(tert-butoxicarbonil-metil-amino)-propil]-benzo[1,3]dioxol-2-carboxílico (1M)
A una mezcla de 21 mg (0,06 mmoles) del compuesto 1D en 0,5 ml de THF, 0,5 ml de metanol y 1 ml de agua se le añaden 50 mg (1,19 mmoles) de hidróxido de litio monohidratado en forma de sólido. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 2,5 horas y se concentra a sequedad. Al residuo se le añaden 10 ml de agua y se ajusta el pH de la mezcla resultante a 2 por adición de ácido fosfórico. Se extrae la mezcla con 3 x 35 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran a sequedad, obteniéndose 10 mg (0,029 mmoles, 53%) del compuesto 1M (M+Na, 360).
Ejemplo 7 [2-(2-carbamoil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-carbamato de tert-butilo (1E)
Se prepara una solución de 0,85 g (2,32 mmoles) del compuesto 1D en 10 ml de metanol anhidro. Se hace burbujear amoníaco gaseoso anhidro a través de la mezcla reaccionante durante 60 minutos y se concentra la mezcla reaccionante resultante a presión reducida hasta sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando hexano al 15% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 0,76 g (2,25 mmoles, 97%) del compuesto 1E en forma de aceite incoloro (M+H, 359).
Ejemplo 8 [2-(2-aminometil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-metilcarbamato de tert-butilo (1F)
A 500 mg de hidruro de litio y aluminio (13,2 mmoles) se les añaden 10 ml de THF recién destilado y se enfría el matraz de la reacción a -30ºC. Se añade por goteo una solución de 0,75 g (2,22 mmoles) del compuesto 1E en 14 ml de THF recién destilado y se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a -30ºC durante 1,5 horas y a 0ºC durante 1,5 horas. Se deja calentar la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 1,5 horas. A la mezcla reaccionante se le añaden 50 ml de acetato de etilo y se filtra a través de CELITE (Celite Corporation). Se concentra el líquido filtrado a sequedad y se le añaden 50 ml de agua. Se extrae el residuo seco con 4 x 50 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando como disolvente el acetato de etilo, de este modo se obtienen 0,31 g (43%, 0,96 mmoles) del compuesto 1F en forma de aceite viscoso incoloro (M+Na, 345).
Ejemplo 9 [2-[2-(benciloxicarbonilamino-metil)-benzo[1,3]dioxol-5-il]-1-metiletil}-metil-carbamato de tert-butilo (1G)
A una solución de 0,31 g (0,96 mmoles) del compuesto 1F en 5 ml de diclorometano se le añaden a temperatura ambiente 0,2 ml (1,14 mmoles) de N,N-diisopropiletilamina, 10 mg (0,08 mmoles) de 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) y después 0,15 ml de cloroformiato de bencilo (1,04 mmoles). Se mantiene la mezcla en agitación durante 1 horas y se concentra a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 40% en hexano, de este modo se obtienen 0,41 g (0,89 mmoles, 94%) del compuesto 1G en forma de goma densa incolora (M+Na, 479).
Ejemplo 10 [5-(2-metilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-il-metil]-carbamato de bencilo, compuesto con ácido trifluoracético (1H)
A una solución de 0,41 g (0,89 mmoles) del compuesto 1G en 2 ml de diclorometano se le añaden 2 ml de ácido trifluoracético. Se mantiene la solución resultante en agitación a temperatura ambiente durante 90 minutos y se concentra a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando metanol al 20% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 0,29 g (0,64 mmoles, 69%) del compuesto 1H en forma de goma densa e incolora (M+Na, 357).
Ejemplo 11 (5-{2-[metil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil)-carbamato de bencilo (1I)
Se enfría a 0ºC una solución de 299 mg (0,64 mmoles) de 1H en 5 ml de diclorometano. A la mezcla reaccionante se le añaden a 0ºC 0,25 ml (1,43 mmoles) de diisopropiletilamina, 10 mg (0,08 mmoles) de 4-DMAP y 0,3 ml (2,12 mmoles) de anhídrido trifluoracético. Se deja calentar la mezcla a temperatura ambiente y se agita durante 1 hora. Se concentra la mezcla reaccionante a presión reducida y se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 20% en hexano, de este modo se obtienen 150 mg (0,33 mmoles, 52%) del compuesto 1I en forma de aceite incoloro (M+Na, 453).
Ejemplo 12 N-[2-(2-aminometil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-2,2,2-trifluor-N-metil-acetamida (1J)
A una solución de 150 mg (0,33 mmoles) del compuesto 1I en 10 ml de metanol se le añaden 24 mg de Pd al 10% sobre C y se hidrogena la mezcla a temperatura ambiente a presión atmosférica durante 4 horas, empleando un globo lleno de hidrógeno. Se filtra la mezcla reaccionante a través de CELITE y se lava el residuo con 20 ml de metanol. Se reúnen los líquidos filtrados y se concentran a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando metanol al 10% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 95 mg (0,29 mmoles, 86%) del compuesto 1J en forma de aceite incoloro (M+H, 319).
Ejemplo 13 Ácido N-(5-{2-[metil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-il-metil-succinámico (1K)
A una solución de 680 mg (2,13 mmoles) del compuesto 1J en 20 ml de metanol se le añaden 0,6 ml (3,4 mmoles) de diisopropiletilamina y después 10 mg (0,08 mmoles) de 4-DMAP y se enfría la mezcla reaccionante a 0ºC. A la mezcla reaccionante se le añaden 800 mg (7,9 mmoles) de anhídrido succínico y se calienta a temperatura ambiente. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se concentra a presión reducida. Se purifica por cromatografía de columna flash a través de gel de sílice empleando como disolvente el acetato de etilo, de este modo se obtienen 400 mg (0,95 mmoles, 45%) del compuesto 1K en forma de sólido gomoso blanco (M+H, 419).
Ejemplo 14 N-(5-{2-[metil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-il-metil)-succinamato de 2,5-dioxo-pirrolin-1-ilo (1L)
A una solución de 400 mg (0,27 mmoles) del compuesto 1K en 40 ml de diclorometano se le añaden 273 mg (2,37 mmoles) de N-hidroxisuccinimida y después 440 mg (2,29 mmoles) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 11 horas. Se lava la mezcla reaccionante con 2 x 15 ml de agua, 4 x 15 ml de una solución saturada de bicarbonato sódico y después 15 ml de agua. Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentra a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna flash, obteniéndose 250 mg (0,48 mmoles, 51%) del compuesto 1L en forma de goma densa (M+H, 516).
Ejemplo 15 Inmunógeno de MDMA (1P)
En un baño de hielo se enfría una solución de 173 mg de hemocianina de lapa de ojo de cerradura en 7 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5). A esta solución se le añaden por goteo 10,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se mantiene la temperatura de la reacción por debajo de la temperatura ambiente. A la solución de la proteína se le añade por goteo una solución de 40,2 mg del compuesto 1L en 1,5 ml de DMF. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa a temperatura ambiente en 1 l de DMSO al 70% en fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, por lo menos 3 horas cada uno), 1 l de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas). Se desprotege el grupo trifluoracetamido del conjugado por diálisis del conjugado resultante frente a hidróxido amónico del 10% durante 3 días (1 l cada vez durante aproximadamente 24 horas cada vez), después se realizan 6 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (1 l cada uno durante por lo menos 6 horas cada vez). Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 2,9 mg/ml aplicando un ensayo de proteína BioRad con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 34 ml del conjugado. Se determina el grado de modificación de lisina disponible que resulta ser del 72% por el método del 2,4,6-trinitrobenceno-sulfonato (TNBS) (Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988).
Ejemplo 16 Conjugado de MDMA-BSA (1O)
En un baño de hielo se enfría una solución de 800 mg de albúmina de suero bovino (BSA) en 8 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5). A esta solución se le añaden por goteo 12 ml de DMSO y se mantiene la mezcla reaccionante por debajo de la temperatura ambiente. A la solución de proteína se le añade por goteo una solución de 15 mg de un derivado de MDMA (1L) en 1 ml de DMF anhidra. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 48 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa en 1 l de DMSO al 70% en fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, por lo menos durante 3 horas cada uno), 1 l de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas) a temperatura ambiente. Se desprotege el grupo trifluoracetamido del conjugado por diálisis del conjugado resultante frente al hidróxido amónico del 10% durante 3 días (1 l cada vez durante aproximadamente 24 horas cada vez) y después 6 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (1 l cada vez durante por lo menos 6 horas). Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 6,8 mg/ml realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 38 ml del conjugado.
Ejemplo 17 [2-(3,4-dimetoxi-fenil)-1-metil-etil]-etil-amina (2A)
Se enfría a 0ºC una solución de 10 g (51,4 mmoles) de 3,4-dimetoxifenilacetona en 50 ml de metanol y se trata con 50 ml de una solución 2M de etilamina en metanol. A la mezcla reaccionante se le añaden 11,5 g (0,183 mmoles) de cianoborhidruro sódico y se ajusta el pH de la mezcla reaccionante a 6,5-7 por adición de ácido acético glacial. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 4 días. Se concentra a presión reducida y se le añaden 150 ml de agua. Se ajusta el pH de la solución resultante a 1 empleando HCl 6 N. Se extrae con 4 x 150 ml de éter y se descartan las fases orgánicas. Se ajusta el pH de la fase acuosa a 14 y se extrae la solución con 6 x 100 ml de cloroformo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na2SO4) y se concentran a sequedad, obteniéndose 10,6 g (47,4 mmoles, 92%) del compuesto 2A en forma de aceite amarillo pálido (M+H, 224).
Ejemplo 18 4-(2-etilamino-propil)-benceno-1,2-diol, compuesto con sal de ácido bromhídrico (2B)
Se calienta a reflujo en atmósfera de argón durante 3,5 horas una solución de 1,1 g (4,92 mmoles) del compuesto 2A en 10 ml de HBr del 48% y se concentra a sequedad a presión reducida. Se le añaden 50 ml de diclorometano y se concentra a sequedad a presión reducida, obteniéndose el compuesto 2B en bruto, en forma de polvo marrón oscuro (M+Na, 318).
Ejemplo 19 [2-(3,4-dihidroxi-fenil)-1-metil-etil]-etil-carbamato de tert-butilo (2C)
A todos los 2B de la anterior mezcla reaccionante se les añaden 30 ml de THF al 50% en agua. A la mezcla reaccionante se le añaden por goteo durante un período de 30 minutos 1,1 g de bicarbonato sódico en forma de sólido y después 1,35 g (6,18 mmoles) de dicarbonato de di-t-butilo en 7 ml de THF. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas, después se concentra a presión reducida. Se diluye con 50 ml de agua y se ajusta el pH de la solución a 5. Se extrae la fase acuosa con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran a sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 30% en hexano, de este modo se obtienen 764 mg (2,58 mmoles, 53% a partir del 2A) del compuesto 2C en forma de goma transparente (M+Na, 318).
Ejemplo 20 5-[2-(tert-butoxicarbonil-etil-amino)-propil]-benzo[1,3]dioxol-2-carboxilato de etilo (2D)
A 2 g (6,7 mmoles) del compuesto 2C se le añaden 40 ml de DMF anhidra y después 3,5 g (25 mmoles) de K_{2}CO_{3} anhidro, 5 g de tamices moleculares de 3 \ring{A} y 3,2 ml (25 mmoles) de dibromoacetato de etilo. Se calienta la mezcla reaccionante a 120ºC durante 3 horas en atmósfera de argón y después se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 75 ml de acetato de etilo y se filtra. Al líquido filtrado se le añaden 75 ml de agua y se trasvasa a un embudo de decantación. Se separa la fase orgánica y se extrae la fase acuosa con 5 x 75 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentran a sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 10% en hexano, obteniéndose 954 mg (5,3 mmoles, 37%) del compuesto 2D en forma de goma incolora (M+Na, 402).
Ejemplo 21 [2-(2-carbamoil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-etil-carbamato de tert-butilo (2E)
A 2,04 g (5,37 mmoles) del compuesto 2D se le añaden 30 ml de metanol anhidro y se hace burbujear amoníaco gaseoso a través de la solución a temperatura ambiente durante 1 hora. Se concentra la mezcla a sequedad y se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando hexano al 30% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 1,8 g (5,13 mmoles, 96%) del compuesto 2E en forma de goma incolora (M+Na, 373).
Ejemplo 22 [2-(2-aminometil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-etil-carbamato de tert-butilo (2F)
Se enfría a -60ºC un matraz que contiene 20 ml de THF recién destilado y se le añaden 615 mg (16,2 mmoles) de hidruro de litio y aluminio (LAH). A la mezcla reaccionante se le añade por goteo en atmósfera de argón una solución de 1,8 g (5,13 mmoles) del compuesto 2E en 20 ml de THF recién destilado. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a -60ºC durante 20 minutos, a 0ºC durante 45 minutos y a temperatura ambiente durante 2 horas. Se interrumpe la reacción con 430 \mul de NaOH del 15% y 3 ml de agua y se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se filtra la solución resultante a través de CELITE y se lava el residuo con 100 ml de THF. Se concentra el líquido filtrado a sequedad a presión reducida y se purifica por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo como eluyente, de este modo se obtienen 1,3 g (3,86 mmoles, 75%) del compuesto 2F en forma de goma incolora (M+Na, 359).
Ejemplo 23 [2-[2-(benciloxicarbonilamino-metil)-benzo[1,3]dioxol-5-il]-1-metil-etil}-etil-carbamato de tert-butilo (2G)
A una solución de 1,3 g (3,86 mmoles) del compuesto 2F en 40 ml de diclorometano (destilado a través de CaH_{2}) se le añaden 1,52 ml (8,6 mmoles) de diisopropiletilamina, 30 mg (0,24 mmoles) de 4-DMAP y 1,14 ml (7,9 mmoles) de cloroformiato de bencilo. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de argón y se concentra a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 20% en hexano, de este modo se obtienen 1,58 g (3,3 mmoles, 71%) del compuesto 2G en forma de goma incolora (M+Na, 493).
Ejemplo 24 [5-(2-etilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil]-carbamato de bencilo, compuesto con ácido trifluoracético (2H)
A una solución de 1,58 g (3,3 mmoles) del compuesto 2G en 10 ml de diclorometano (destilado a través de CaH_{2}) se le añade a temperatura ambiente ácido trifluoracético y se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se concentra a sequedad la mezcla reaccionante resultante a presión reducida y se purifica por cromatografía de columna a través de gel de sílice, obteniéndose 1,6 g (3,3 mmoles, 98%) del compuesto 2H en forma de goma incolora (M+H, 371).
Ejemplo 25 (5-{2-[etil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil)-carbamato de bencilo (2I)
A 1,6 g (3,3 mmoles) del compuesto 2H se le añaden 18 ml de DMF anhidra y se enfrían a -10ºC. A esta solución se le añaden 3,0 ml (21 mmoles) de anhídrido trifluoracético y se mantiene la mezcla reaccionante en agitación en atmósfera de argón a -10ºC durante 3 horas. Se deja calentar la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se concentra a sequedad a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 30% en hexano, de este modo se obtiene 1 g (2,2 mmoles, 65%) del compuesto 2I en forma de goma incolora (M+H, 467).
Ejemplo 26 N-[2-(2-aminometil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-N-etil-2, 2,2-trifluor-acetamida (2J)
A 987 mg (2,1 mmoles) del compuesto 2I se le añaden 50 ml de metanol anhidro y después 150 mg de Pd al 10% sobre C. Se hidrogena esta mezcla a presión atmosférica durante 18 horas, se filtra y se lava el residuo con 50 ml de metanol. Se reúnen los líquidos filtrados, se concentran a sequedad y se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando metanol al 5% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 558 mg (1,67 mmoles, 79%) del compuesto 2J en forma de goma incolora (M+H, 333).
Ejemplo 27 Ácido N-(5-[2-[etil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil)-succinámico (2K)
A una solución de 558 mg (1,67 mmoles) del compuesto 2J en 25 ml de 1,2-dicloroetano se le añaden 435 mg (4,34 mmoles) de anhídrido succínico, 280 \mul (2 mmoles) de trietilamina y 112 mg (0,91 mmoles) de 4-DMAP. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a 40ºC en atmósfera de argón durante 2,5 horas. Se diluye con 50 ml de acetato de etilo y se lava con 3 x 30 ml de una solución de cloruro amónico al 5%. Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se concentra a presión reducida hasta sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice, obteniéndose 629 mg (1,45 mmoles, 86%) del compuesto 2K en forma de goma incolora (M+H, 433).
Ejemplo 28 N-(5-{2-[etil-(2,2,2-trifluor-acetil)-amino]-propil}-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil)-succinamato de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo (2L)
A 150 mg (0,34 mmoles) del compuesto 2K se le añaden 15 ml de diclorometano (destilado a través de CaH_{2}) y después 99 mg (0,86 mmoles) de N-hidroxisuccinimida y 166 mg (0,86 mmoles) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente en atmósfera de argón durante 18 horas. Se diluye la mezcla reaccionante con otros 40 ml de diclorometano y se lava con 2 x 25 ml de agua, 3 x 25 ml de una solución saturada de bicarbonato sódico y 2 x 25 ml de agua. Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentra a sequedad, obteniéndose 154 mg (0,29 mmoles, 84%) del compuesto 2L en forma de sólido blanco (M+Na, 552).
Ejemplo 29 Ácido 5-[2-(tert-butoxicarbonil-etil-amino)-propil]-benzo[1,3]dioxol-2-carboxílico (2M)
A una solución de 50 mg (0,13 mmoles) del compuesto 2D en 2 ml de metanol al 50% en agua se le añaden 50 mg (1,19 mmoles) de hidróxido de litio monohidratado. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente 18 horas y se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 10 ml de agua y se ajusta el pH a 6 con ácido fosfórico. Se extrae la solución acuosa resultante con 2 x 25 ml de cloroformo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4}) y se concentran a presión reducida, obteniéndose 41 mg (0,12 mmoles, 82%) del compuesto 2M en forma de goma densa incolora.
Ejemplo 30 Inmunógeno de MDEA (2U)
Se enfría en un baño de hielo una solución de 188 mg de hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH) en 5,5 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5). A esta solución se le añaden por goteo 6 ml de sulfóxido de dimetilo y se mantiene la temperatura de la reacción por debajo de la temperatura ambiente. Entonces se añade a la solución de proteína por goteo una solución de 54 mg (0,10 mmoles) del compuesto 2L en 1,2 ml de DMF. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa en 1 l de DMSO al 70% en fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, por lo menos durante 3 horas cada uno), 1 l de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas) a temperatura ambiente. Se desprotege el grupo trifluoracetamido del conjugado por diálisis del conjugado resultante frente a hidróxido amónico del 10% durante 3 días (1 l cada vez durante aproximadamente 24 horas cada vez), y después con 6 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (1 l cada vez durante por lo menos 6 horas cada vez). Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 2,1 mg/ml realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 34 ml de conjugado. Se determina el grado de modificación de lisina disponible, que resulta ser del 60%, por el método TNBS (Habeeb AFSA, Anal. Biochem. 14, 328-34, 1988).
Ejemplo 31 Conjugado de MDEA-BSA (2T)
Se enfría en un baño de hielo una solución de 500 mg de albúmina de suero bovino (BSA) en 6,7 ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,5). A esta solución se le añaden por goteo 8,5 ml de DMSO y se mantiene la mezcla reaccionante por debajo de la temperatura ambiente. A la solución de proteína se le añade por goteo una solución de 12 mg (0,022 mmoles) del compuesto 2L en 1,5 ml de DMF anhidra. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 48 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa en 1 l de DMSO al 70% en fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, por lo menos durante 3 horas cada uno), 1 l de DMSO al 50% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 L de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas) a temperatura ambiente. Se desprotege el grupo trifluoracetamido del conjugado por diálisis del conjugado resultante frente a hidróxido amónico del 10% durante 3 días (1 l cada vez durante aproximadamente 24 horas cada vez), y después con 6 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (1 l cada vez). Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 7,12 mg/ml, realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 45 ml del conjugado.
Ejemplo 32 2(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-propionilamino]-metil}-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-etil-carbamato de tert-butilo (2N)
Se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas una mezcla que contiene 150 mg (0,44 mmoles) del compuesto 2E y 130 mg (0,48 mmoles) de 3-maleimido-propionato de succinimidilo en 2 ml de DMF anhidra que contiene 100 \mul (0,71 mmoles) de trietilamina y después se concentra a presión reducida hasta sequedad. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando metanol al 15% en cloroformo, obteniéndose 203 mg (0,41 mmoles, 93%) del compuesto 2N en forma de sólido blanco (M+Na, 510).
Ejemplo 33 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-N-[5-(2-etilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil]-propionamida, compuesto con ácido trifluor-acético (2O)
A 75 mg (0,15 mmoles) del compuesto 2N en 1 ml de diclorometano (destilado con CaH_{2}) se le añade 1 ml de ácido trifluoracético. Se mantiene la mezcla reaccionante resultante en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos y se concentra a sequedad a presión reducida. Al residuo se le añaden 5 ml de diclorometano y se concentra de nuevo a sequedad la solución resultante. Se repite el procedimiento anterior tres veces más, obteniéndose 75 mg (0,14 mmoles, 97%) del compuesto 20 en forma de sólido blanco (M+Na, 410).
Ejemplo 34 Conjugado de MDEA-SATP-BSA (2R)
Se disuelve la albúmina de suero bovino (0,5 g) en 50 ml de fosfato potásico 50 mM que contiene ácido etilenodiamino-tetra-acético 1 mM (EDTA). A la mezcla reaccionante se le añaden 1,24 ml de S-acetiltiopropionato de succinimidilo (SATP) en DMSO (15 mg/ml en DMSO). Se deja la mezcla reaccionante en reposo a temperatura ambiente durante 1 hora. Se introduce la solución resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000), se dializa frente a fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) durante un período de 3 días y se almacena el conjugado BSA-SATP resultante (2P) a -20ºC hasta el momento de su futuro uso. Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 9 mg/ml, realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976.
La eliminación del grupo protector acetilo del conjugado BSA-SATP se realiza por adición de 850 \mul del siguiente tampón que contiene hidroxilamina a 5 ml de BSA-SATP (9 mg/ml): fosfato potásico 50 mM, EDTA 25 mM, NH_{2}OH 0,5 M, pH 7,2. Se trata la mezcla en el vórtice y se deja en reposo a temperatura ambiente durante 2 horas.
Se desaliniza la solución resultante empleando tres columnas PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) para obtener 5,5 ml de solución reunida de proteínas. Se enfría esta solución a 0ºC y se le añaden por goteo 4 ml de DMSO. A la solución de proteínas se le añade una solución de 7 mg (0,014 mmoles) del derivado MDEA-maleimido (2O) en 0,5 ml de DMSO. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. A la solución de proteínas se le añaden 400 \mul de 5 mg/mL de etil-maleimida en DMSO para destruir cualquier grupo tiol que no haya reaccionado y se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa en 1 l de DMSO al 30% en fosfato potásico 50 mM (pH 7,5, 3 cambios, por lo menos durante 3 horas cada uno), 1 l de DMSO al 20% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas), 1 l de DMSO al 10% en fosfato potásico 50 mM (por lo menos durante 3 horas) y después 6 cambios con fosfato potásico 50 mM (pH 7,5) a 4ºC (1 l cada uno durante por lo menos 6 horas cada uno). Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 0,9 mg/ml realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 15 ml del conjugado.
Ejemplo 35 MDEA 2IT-KLH (2S)
Se reconstituye la hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH, 60 mg) en tampón fosfato sódico 100 mM de pH 7,2. A la solución de proteínas se le añade el 2-iminotiolano (2IT, 13,5 mg) en forma de sólido y se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente en la oscuridad y en atmósfera de argón durante 1 hora. Se desaliniza la KLH-(SH)_{n} activada en una columna Sephadex PD-10 pre-equilibrada con tampón fosfato sódico 100 mM de pH 6,5. Se determina la carga de SH (reactivo de Ellman), que resulta ser de 886 por molécula de KLH (PM = 5.000.000). A 6 ml de KLH-(SH)_{n}, 4,7 mg/ml, se les añade por goteo una solución de 14 mg (0,027 mmoles) de MDEA-maleimida (2O) en 1 ml de DMF y se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente 18 horas. Se introduce el conjugado resultante en un tubo de diálisis (corte en PM = 10.000) y se dializa en 1 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) [NaCl 180 mM, fosfato sódico 10 mM, pH 7,2] que contiene un 20% de DMF (3 veces, por lo menos 6 horas cada vez). Después se dializa con 1 l de tampón PBS, pH 7,2 a 4ºC. Se determina la concentración de proteína, que resulta ser de 2,08 mg/ml, realizando un ensayo RioRad de proteínas con azul Coomassie (Bradford, M., Anal. Biochem. 72, 248, 1976). Se obtiene un total de 20 ml del conjugado.
Ejemplo 36 2-(3,4-dimetoxi-fenil)-1-metil-etilamina (3A)
A 2 g (10,29 mmoles) de 3,4-dimetoxifenil-acetona se les añaden 10 ml de metanol, 7,9 g (102 mmoles) de acetato amónico, 844 mg (10,2 mmoles) de acetato sódico y 970 mg (15,4 mmoles) de cianoborhidruro sódico. Se ajusta el pH de la mezcla reaccionante entre 6-7 por adición de ácido acético glacial. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 100 ml de agua y se ajusta el pH de la mezcla reaccionante a 14 empleando NaOH 6 N. Se extrae la fase acuosa con 6 x 30 ml de cloroformo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4}) y se concentran a presión reducida, obteniéndose 2 g (10,24 mmoles, 99%) del 3A en forma de goma ligeramente amarilla (M+H, 196).
Ejemplo 37 4-(2-amino-propil)-benceno-1,2-diol, compuesto con sal de ácido bromhídrico (3B)
A 2,0 g del compuesto 3A (2,01 mmoles) se le añade HBr del 48% y se calienta la mezcla en un baño de aceite precalentado durante 3 horas en atmósfera de argón. Se concentra la mezcla reaccionante a presión reducida, obteniéndose un aceite viscoso. Al residuo se le añaden 75 ml de diclorometano y se concentra a sequedad a presión reducida. Se repite esta actuación cuatro veces más, obteniéndose 2,3 g del compuesto 3B en forma de polvo ligeramente rosa (M+H, 168).
Ejemplo 38 [2-(3,4-dihidroxi-fenil)-1-metil-etil]-carbamato de tert-butilo (3C)
Al conjunto del compuesto 3B de la anterior mezcla reaccionante se le añaden 50 ml de THF al 50% en agua. A la mezcla reaccionante se le añaden 2,4 g de bicarbonato sódico en forma sólida y después por goteo 3,02 g (13,8 mmoles) de dicarbonato de di-t-butilo en 7 ml de THF durante un período de 30 minutos. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se concentra a presión reducida. Se diluye con 50 ml de agua y se ajusta el pH de la solución a 5. Se extrae la fase acuosa con 3 x 100 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4}) y se concentran. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 40% en hexano, obteniéndose 1,3 g (4,6 mmoles, 46%) del compuesto 3C en forma de espuma pegajosa blanca (M+Na, 290).
Ejemplo 39 5-(2-tert-butoxicarbonilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-carboxilato de etilo (3D)
A 1,30 g (4,6 mmoles) del compuesto 3C se le añaden 40 ml de DMF anhidra y después 2,5 g (18 mmoles) de K_{2}CO_{3} anhidro, 2,5 g de tamices moleculares de 3 \ring{A} y 2,3 ml (17,7 mmoles) de dibromoacetato de etilo. Se calienta la mezcla reaccionante a 120ºC en atmósfera de argón durante 3 horas y se concentra a presión reducida. Al residuo se le añaden 100 ml de agua y 75 ml de acetato de etilo y se filtra. Se trasvasa el líquido filtrado a un embudo de decantación y se separa la fase orgánica. Se extrae la fase acuosa con 4 x 50 ml de acetato de etilo. Se reúnen las fases orgánicas, se secan (Na_{2}SO_{4}) y se concentran. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 20% en hexano, obteniéndose 413 mg (1,17 mmoles, 26%) del compuesto 3D en forma de goma incolora (M+Na, 374).
Ejemplo 40 2(2-carbamoil-benzo[1,3]dioxol-5-il)-1-metil-etil]-carbamato de tert-butilo (3E)
A 413 mg (1,17 mmoles) del compuesto 3D se le añaden 30 ml de metanol anhidro y se hacer burbujear amoníaco gaseoso a través de la solución a temperatura ambiente durante 1 hora. Se concentra la mezcla y se purifica por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando hexano al 30% en acetato de etilo, de este modo se obtiene el producto en bruto. Este se purifica por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo al 30% en hexano, obteniéndose 356 mg (1,10 mmoles, 94%) del compuesto 3E en forma de goma incolora (M+Na, 345).
Ejemplo 41 [2-(2-aminometil-benzo[1,3]dioxo-5-il)-1-metil-etil]-carbamato de tert-butilo (3F)
Se enfría a -60ºC un matraz que contiene 7 ml de THF recién destilado y se le añaden 76 mg (2,0 mmoles) de hidruro de litio y aluminio. A la mezcla reaccionante se le añade por goteo en atmósfera de argón una solución de 214 mg (0,66 mmoles) del compuesto 3E en 7 ml de THF recién destilado. Se deja calentar la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se mantiene en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. A la mezcla reaccionante se le añaden 70 \mul de NaOH del 15% NaOH y 570 \mul de agua y se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se filtra la solución resultante a través de CELITE y se lava el residuo con 50 ml de THF. Se concentra a presión reducida el líquido filtrado y se purifica por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando como eluyente en primer lugar acetato de etilo y después metanol al 10% en acetato de etilo, de este modo se obtienen 46 mg (0,15 mmoles, 23%) del compuesto 3F en forma de goma incolora (M+Na, 331).
Ejemplo 42 Ácido N-[5-(2-tert-butoxicarbonilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil]-succinámico (3G)
A una solución de 46 mg (0,15 mmoles) del compuesto 3F en 4 ml de 1,2-dicloroetano se le añaden 46 mg (0,46 mmoles) de anhídrido succínico y 22 mg (0,18 mmoles) de 4-DMAP. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a 40ºC y en atmósfera de argón durante 2,5 horas. Se diluye con 50 ml de acetato de etilo y se lava con 3 x 30 ml de una solución de cloruro amónico al 5%. Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentra a presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía de columna a través de gel de sílice empleando acetato de etilo como eluyente, así se obtienen 36 mg (0,08 mmoles, 60%) del compuesto 3G en forma de goma incolora (M+Na, 431).
Ejemplo 43 N-[5-(2-tert-butoxicarbonilamino-propil)-benzo[1,3]dioxol-2-ilmetil]-succinamato de 2,5-dioxo-pirrolidin-1-ilo (3H)
A 32 mg (0,078 mmoles) del compuesto 3G se le añaden 4 ml de diclorometano (destilado con CaH_{2}) y después 14 mg (0,12 mmoles) de N-hidroxisuccinimida y 30 mg (0,152 mmoles) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. Se mantiene la mezcla reaccionante en agitación a temperatura ambiente y en atmósfera de argón 18 horas. Se diluye la mezcla reaccionante con otros 25 ml de diclorometano y se lava con 2 x 20 ml de agua, 2 x 20 ml de una solución saturada de bicarbonato sódico y 1 x 20 ml de agua. Se seca la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se concentra, obteniéndose 36 mg (0,071 mmoles) del compuesto 3H en forma de goma incolora.
Ejemplo 44 Conjugado de MDA-aminodextrano (3I)
En un matraz de 3 l y tres bocas, equipado con un agitador mecánico, se introducen 700 ml de agua desionizada. Se añade gradualmente dextrano (70 g, 1,86 mmoles) que tiene un peso molecular de 37.500 (Sigma Chemicals, Milwaukee, WI) al matraz al tiempo que se que agita la mezcla, disolviendo el dextrano en el agua a temperatura ambiente. A la mezcla reaccionante se le añaden 140 ml de NaOH 1N y se calienta a 30-35ºC. Se añade por goteo a 30-35ºC durante un período de 45 minutos una solución de 79 ml (923 mmoles) de epibromhidrina en 245 ml de 1,4-dioxano. Se agita la mezcla resultante y se calienta a 30-35ºC durante 4 horas más. Se deja enfriar la mezcla reaccionante a temperatura ambiente y se trasvasa a un embudo de decantación de 2 l. Se separa lentamente la fase orgánica y de desecha la fase del fondo. Se trasvasa la mezcla acuosa a un matraz de 3 l y se enfría con un baño de hielo. Entonces se añade al matraz de la reacción una solución de 700 ml de hidróxido amónico del 25% y se ajusta el pH a 11 con HCl 1N. Se deja calentar la solución resultante a temperatura ambiente durante una noche. Se trasvasa la mezcla reaccionante a tubos de diálisis (corte en PM = 2000) y se dializa a dos recipientes de 12 l con arreglo al esquema siguiente, empleando 20 l de disolvente para cada paso: ácido acético del 1% durante 6 horas, ácido acético del 1% durante 24 horas, ácido acético del 1% durante 48 horas y agua desionizada durante 24 horas (6 veces).
Se concentra la solución en evaporador rotatorio hasta un tercio de su volumen y se liofiliza, obteniéndose 48 g de producto en forma de sólido blanco. Realizando ensayos TNBS se encuentra que el producto contiene 5,7 grupos amino por cada mol de aminodextrano (Anal. Biochem. 64, 284-288, 1975). Este aminodextrano se emplea para preparar el conjugado de MDA-aminodextrano.
A 78 mg de aminodextrano se les añaden a temperatura ambiente 5 ml de DMSO. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos hasta que se disuelva la totalidad del aminodextrano. Se disuelve el derivado de MDA 3H (9,6 mg, 0,2 mmoles) en 1 ml de DMSO anhidro y se añade por goteo a una solución agitada de aminodextrano. Se mantiene la mezcla en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y se trasvasa a tubos de diálisis Spectrapor (corte en PM = 2000) y se dializa (empleando en cada diálisis un volumen de 1 l) con arreglo al esquema siguiente: 60% de DMSO en 40% de agua desionizada a temperatura ambiente (3 veces, por lo menos durante 3 horas cada vez); 50% de DMSO en 50% de agua desionizada a temperatura ambiente (2 veces, durante por lo menos durante 3 horas cada vez); 30% de DMSO en 70% de agua desionizada (1 vez, durante por lo menos durante 3 horas); 10% de DMSO en 90% de agua desionizada (1 vez, durante por lo menos durante 3 horas); y agua desionizada a temperatura ambiente (6 veces, durante por lo menos 6 horas cada vez).
Se recoge la solución de los tubos de diálisis y se liofiliza, obteniéndose 64 mg del conjugado de MDA-aminodextrano protegido en forma de polvo blanco. Este conjugado protegido está listo para el siguiente paso de desprotección.
Al total del conjugado de MDA-dextrano protegido anterior se le añaden 2 ml de diclorometano y se mantiene la suspensión en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla reaccionante se le añaden lentamente 2 ml de ácido trifluoracético y se mantiene en agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se concentra la mezcla reaccionante hasta sequedad a presión reducida y se disuelve el residuo en 10 ml de agua desionizada. Se trasvasa la mezcla reaccionante a tubos de diálisis (corte en PM = 2000) y se dializa con 1 l de agua desionizada (4 veces, por lo menos durante 6 horas cada vez). Se saca la solución de los tubos de diálisis y se liofiliza, obteniéndose 53 mg del conjugado de MDA-aminodextrano (3I) en forma de polvo blanco.
Ejemplo 45 Producción del clon MDMA 8.3 y el anticuerpo Inmunizaciones
Se inmunizan ratones Balb/C hembras de 16 semanas de edad o mayores por inyecciones múltiples de los inmunógenos del modo siguiente. Se mezclan 100 \mug del inmunógeno DMA 1P por ratón con un volumen igual de inmunógeno RIBI (Sigma Chemicals) durante 2-3 minutos y se introducen en una jeringuilla de tamaño apropiado, dotada de una aguja hipodérmica de calibre 37. Cada ratón recibe una dosis de 100 \mug de inmunógeno con adyuvante mediante una inyección intraperitoneal. Treinta y nueve días después, los mismos ratones reciben otra inyección idéntica a la primera. Se repiten las inyecciones en el día 60º y de nuevo en el día 80º. En el día 192º se administra a un ratón una inyección de 150 \mug preparada del modo descrito anteriormente y por la misma vía. Se utiliza este animal para la fusión cuatro días más tarde.
Fusión y desarrollo de anticuerpos monoclonales
El ratón escogido para la fusión se desangra por sangrado retro-orbital para recoger el suero y a continuación se somete a dislocación cervical. Se le extrae el bazo por una técnica aséptica y se coloca en 10 ml de medio de cultivo completo (medio Iscove's Modified Dulbecco's (IMDM), Irvine Scientific) en una cápsula petri estéril. Después se muele el bazo entre dos cuchillas microscópicas congeladas estériles. Se deja en reposo la suspensión celular resultante en un tubo de centrífuga de 15 ml durante 1-2 minutos para que sedimenten las partículas grandes. Se separa la suspensión resultante de células individuales y se cuentan con un hemocitómetro. Se mezclan las células de mieloma FO (CRL-1646, American Type Culture Collection) con células de bazo en una proporción 1:5, células de mieloma FO:células de bazo y se centrifugan durante 15 minutos a 800 rpm. Se separa el líquido sobrenadante y se descarta y se añaden 15 ml de medio de cultivo IMDM sin suero. Se suspenden de nuevo las células y se vuelven a centrifugar. Se fusiona el culote resultante de las células empleando polietilenglicol/DMSO según el método de Fazekas de St. Groth, J. Immunol. Meth. 35, 1-21, 1980.
Después de la fusión se diluyen las células a razón de 2 x 10^{5} linfocitos esplénicos por ml en medio completo Iscove's Modified Dulbecco's (de alto contenido de glucosa) suplementado con un 10% suero fetal bovino (Hyclone Labs), 10% de Condimed HI (Roche Molecular Chemicals), 50 mM 2-mercaptoetanol, 20 mM etanolamina, hipoxantina-metotrexato-timidina (HMT, Sigma Chemicals, diluido 1:50 para el uso), 4 mM glutamina y antibióticos penicilina/estreptomicina (Irvine Scientific). Se introduce esta mezcla de células fusionadas a razón de 200 \mul/hoyo en placas estériles de microcultivo de 96 hoyos. Se introducen las placas recubiertas en un incubador a 37ºC y 5% de CO_{2} y se incuban durante 6 días. El sexto día se sacan aproximadamente 150 \mul de medio mediante un colector de vacío de ocho plazas y se añaden 150 \mul de HT-IMDM. Este medio se prepara del modo descrito antes, salvo que la hipoxantina-timidina (HT, Sigma, diluidas 1:50) se emplea en lugar de la HMT. Se incuban las placas del modo descrito antes hasta que la inspección visual ponga de manifiesto un crecimiento idóneo para la exploración, en torno al 50% de confluencia.
Exploración
La exploración consiste en un ensayo de inmunosorbente fijado a enzima (ELISA), en el que se adsorben 0,1 ml de MDMA-BSA (1O) sobre hoyos de plástico en una concentración de 1 mg/ml a 37ºC durante una hora. Después se enjuagan los hoyos con PBS-TWEEN (solución salina tamponada con fosfato con 0,05% de TWEEN 20) y se bloquean con 200 \mul de solución post-recubrimiento (1% de hidrolizado de gelatina, 2% de sucrosa en Tris 0,15 M de pH 7,2-7,4) a temperatura ambiente durante una hora. Después se enjuagan las placas con un 2% de sucrosa, se secan con aire y se almacenan en bolsas de plástico selladas y desecadas a 4ºC hasta el momento del uso.
Para efectuar el ensayo de exploración se recubren dos placas con MDMA-BSA pipeteando en hoyos separados 25 \mul de PBS-TWEEN y 25 \mul de una solución de 400 ng/ml de MDMA libre en PBS-TWEEN. Se toma el líquido sobrenadante del cultivo celular (25 \mul) de los hoyos que presenten una confluencia del 50% de crecimiento celular y se diluyen 1:20 en PBS-TWEEN en placas flexibles de microvaloración (Falcon Plastics). Se añaden 25 \mul de del líquido sobrenadante diluido a un hoyo de cada una de las placas de microvaloración y se incuban recubiertas a 37ºC durante una hora. Después se lavan las placas empleando un lavador de placas Biotek Elx 300 y PBS-TWEEN. Se diluye el conjugado de IgG de cabra anti-ratón/HRP (peroxidasa de rábano rusticano) (Zymed Labs) a razón de 1:5.000 con PBS-TWEEN inmediatamente antes del uso y se añaden 100 ml a todos los hoyos de las cuatro placas. Se incuban de nuevo las placas recubiertas a 37ºC durante una hora. Se lavan las placas del modo descrito antes y se les añaden 100 ml de K Blue Substrate (Neogen). Se deja revelar el color a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Se interrumpe el revelado por adición de 100 \mul de HCl 1 N y se lee el color a 450 nm empleando un aparato lector de microplacas (Molecular Devices Corp.). Se registran los datos en un ordenador Macintosh y se tabulan para mostrar la OD_{450} de cada hoyo de las diferentes placas por hoyo de cultivo ensayado.
Para el trabajo posterior se seleccionan las líneas celulares que presentan producción de anticuerpos que proporcionan una buena fijación sobre el MDMA-BSA (OD elevada) y buena competición con el MDMA libre (OD baja). Los hibridomas seleccionados se someten inmediatamente a una subclonación estringente por dilución limitada en el medio de cultivo antes descrito. Después del crecimiento con una confluencia del 50% se ensayan de nuevo los hibridomas por un método similar al descrito anteriormente, en el que se examina la fijación sobre el MDMA-BSA y la competición con la MDMA o MDEA libres. Se seleccionan los clones que presentan buena fijación sobre el MDMA-BSA y competición con el fármaco libre para emplearlos en los ensayos de especificidad y acopio celular. En el caso de que todos los subclones de una línea celular concreta no se comportan de modo aproximadamente igual, este hecho se interpreta como signo de inestabilidad y se emplean tres hoyos para otro ciclo de subclonación. Se repite este proceso hasta que cada línea de hibridoma sea estable. Una vez conseguida la estabilidad, las células se expanden en cultivo y se congelan las muestras a -80C en la fase vapor de nitrógeno líquido para su almacenaje. Las muestras del líquido sobrenadante del cultivo se guardan para los análisis de especificidad.
\newpage
Determinación de la especificidad
La especificidad de fijación del anticuerpo monoclonal se determina aplicando un ensayo ELISA de competición con el fármaco. Se emplean placas recubiertas con MDMA-BSA a razón de 0,1 \mug/ml (las demás condiciones se han descrito antes). Se determina la concentración de anticuerpo en los líquidos sobrenadantes de cultivo de hibridoma descritos antes mediante un ensayo de series de diluciones de los sobrenadantes incubados en las placas recubiertas. Se traza una gráfica de la OD_{450} de cada sobrenadante de cada dilución frente al factor de dilución. A partir de estos datos se determina el factor de dilución de proporciona un 50-60% de la OD_{450} máxima. Después se utiliza esta dilución para el ensayo de inhibición en competición utilizando el mismo tipo de placas que para la determinación de la concentración.
Para obtener los fármacos competidores se disuelven los siguientes fármacos libres en metanol a razón de 1 mg/ml: MDMA, MDEA, MDA, MBDB, BDB, d-anfetamina, d-metanfetamina, l-anfetamina y l-metanfetamina. Se diluyen estas soluciones patrón en PBS-TWEEN en una proporción 1:333 y se trasvasan 100 \mul de cada una de ellas a la fila A de una placa de microvaloración. Se diluyen en serie estas soluciones trasvasando 50 \mul de la fila A a los hoyos de la fila B que contienen 100 \mul de PBS-TWEEN y mezclándolos con la pipeta. Se repite este proceso de dilución hasta que siete filas de la placa de microvaloración contengan diluciones en serie de las soluciones de los fármacos libres. La fila octava se deja sin fármaco.
Se preparan las placas recubiertas con MDMA-BSA a razón de 0,1 \mug/ml del modo descrito antes. Se trasvasa una parte alícuota de 25 \mul de cada dilución de cada fármaco libre a la placa recién recubierta con el conjugado. A estas soluciones se les añaden 25 \mul de líquido sobrenadante diluido de cultivo de hibridoma. Con este procedimiento se exploran en cada placa 9 reactivos cruzados, es decir, los reactivos cruzados descritos antes, incluida la MDMA, fármaco estándar, con un solo anticuerpo. Los ensayos de competición se realizan por incubación a 37ºC durante una hora. Después se lavan las placas empleando un lavador del tipo Biotek Elx 300 y PBS-TWEEN. Se diluye el conjugado de IgG de cabra anti-ratón/peroxidasa de rábano rusticano (IgG-HRP) (Zymed Labs) a razón de 1:5.000 con PBS-TWEEN inmediatamente antes del uso y se añaden 100 \mul a todos los hoyos de las cuatro placas. Se incuban de nuevo las placas recubiertas a 37ºC durante una hora. Se lavan las placas del modo descrito antes y se les añaden 100 \mul de K Blue substrate (Neogen). Se deja revelar el color a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Se interrumpe el revelado por adición de 100 \mul de HCl 1 N y se lee el color a 450 nm empleando un aparato lector de microplacas de Molecular Devices Corp. Se registran los datos en un ordenador Macintosh y se tabulan para mostrar la OD_{450} de cada una de las diferentes concentraciones del fármaco libre competidor (10^{-12}-10^{-4} M).
Los datos obtenidos con este método de determinación de especificidad se emplean para calcular el porcentaje de reactividad cruzada de cada anticuerpo con los diferentes fármacos por comparación con el fármaco inmunizador, la MDMA. Esto se efectúa analizando los datos para determinar la ED_{50} de cada fármaco. La ED_{50} es la medida la concentración eficaz de fármaco competidor libre (MDEA, MDA, etc.) que se requiere para inhibir en un 50% la fijación del anticuerpo monoclonal sobre el conjugado-fijado a la MDMA. Se calcula la reacción cruzada dividiendo la ED_{50} del patrón por la ED_{50} del fármaco en cuestión y se calcula el porcentaje de reacción cruzada multiplicando la reactividad cruzada por 100. Este análisis indica que un clon, llamado MDMA 8.3, presenta de modo inesperado una afinidad 89 veces mayor para el fármaco MDEA que para el fármaco inmunizador MDMA. Este clona presenta además de modo inesperado una afinidad 4,6 veces mayor para la MDA que para la MDMA. Estos hallazgos se resumen en la siguiente tabla 1.
TABLA 1 Determinación de especificidad del MDMA 8.3, % reacción cruzada
5
La línea celular de hibridoma murino MDMA 8.3 (también llamada XTCB 8.3) se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) con fecha 23 de julio de 2003 y se le ha dado la designación ATCC PTA-5340.
Ejemplo 46 Producción del hibridoma de MDMA 6.1 y del anticuerpo monoclonal Inmunizaciones
Se inmunizan ratones Balb/C hembras de 16 semanas de edad o mayores por inyecciones múltiples de los inmunógenos con arreglo al siguiente esquema. Se mezclan 100 \mug del inmunógeno MDMA 1P por ratón con un volumen igual de inmunógeno RIBI (Sigma Chemicals) durante 2-3 minutos y se introducen en una jeringuilla de tamaño apropiado, dotada de una aguja hipodérmica de calibre 37. Cada ratón recibe una dosis de 100 \mug de inmunógeno con adyuvante mediante una inyección intraperitoneal. Treinta y nueve días después, los mismos ratones reciben otra inyección idéntica a la primera. Se repiten las inyecciones en el día 60º y de nuevo en el día 80º. Se utiliza un animal para la fusión cuatro días más tarde.
Fusión y desarrollo de anticuerpos monoclonales
Todos los métodos de manipulación de los animales, cultivo celular y fusión del modo descrito antes en el ejemplo 45.
Exploración
Se aplican los mismos métodos que se han descrito en el ejemplo 45.
Especificidad
Se realizan las determinaciones de especificidad del modo descrito en el ejemplo 45. Se encuentra de modo inesperado que un anticuerpo desarrollado en este ejemplo, a diferencia de los hallazgos anteriores, presenta un alto grado de reacción cruzada con la d-metanfetamina. Este clon, llamado MDMA 6.1, presenta esencialmente la misma afinidad con la d-metanfetamina y con la MBDB que con la MDMA, tal como se indica en la siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2 Determinación de especificidad del MDMA 6.1, % de reacción cruzada
6
La línea celular de hibridoma murino MDMA 6.1 (también llamada XTCB 6.1) se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) con fecha 23 de julio de 2003 y se le ha dado la designación ATCC PTA-5339.
Ejemplo 47 Producción de clones de anticuerpo monoclonal MDEA 2.2 Inmunizaciones
Se inmunizan ratones Balb/C hembras de 16 semanas de edad o mayores por inyecciones múltiples de los inmunógenos con arreglo al siguiente esquema. Se mezclan 100 \mug del inmunógeno MDEA 2U por ratón con un volumen igual de inmunógeno RIBI (Sigma Chemicals) durante 2-3 minutos y se introducen en una jeringuilla de tamaño apropiado, dotada de una aguja hipodérmica de calibre 37. Cada ratón recibe una dosis de 100 \mug de inmunógeno con adyuvante mediante una inyección intraperitoneal. Treinta y nueve días después, los mismos ratones reciben otra inyección idéntica a la primera. Se repiten las inyecciones en el día 60º y de nuevo en el día 80º. Se repiten las inyecciones en el día 137º y, 4 días más tarde, se utiliza un ratón para la fusión.
Fusión y desarrollo de anticuerpos monoclonales
Todos los métodos de manipulación de los animales, cultivo celular y fusión se realizan del modo descrito en el ejemplo 45.
Exploración
Se emplean los mismos métodos que en el ejemplo 45 con varias sustituciones. Se emplea el MDEA-BSA (2T) para el recubrimiento de la placa, en lugar del MDMA-BSA (1O) del ejemplo 45. Para la fijación competitiva se emplea también la MDEA además de la MDMA del ejemplo 45.
Especificidad
Se efectúan las determinaciones de especificidad del modo establecido en el ejemplo 45, pero el MDEA-BSA (2T) se emplea en lugar del MDMA-BSA (1O). Las reacciones cruzadas porcentuales se determinan para dos anticuerpos de esta fusión que se presentan en la siguiente tabla 3. El anticuerpo MDEA 1.1 es un ejemplo de perfil de reactividad cruzada esperada, dado el inmunógeno empleado para provocar la respuesta inmune en los ratones.
TABLA 3 Especificidades del anticuerpo monoclonal MDEA
7
La línea celular de hibridoma murino MDEA 2.2 (también llamada EVE A2.2) se ha depositado en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) con fecha 23 de julio de 2003 y se le ha dado la designación ATCC PTA-5338.
El inmunógeno estimulador empleado para provocar la respuesta inmune en el ratón empleado para la fusión es la MDEA-KLH, por ello cabe esperar que se observe una afinidad especialmente elevada en los anticuerpos monoclonales con respecto a este resto. Esto es lo que se observa en el clon MDEA 1.1, siendo relativamente menores las reacciones cruzadas con otros fármacos. El clon MDEA 2.2 se desvía varias veces y de forma inesperada de este comportamiento. Su afinidad para la MDMA es del 412% de la que posee para la MDEA, mientras que la afinidad para la MDBD es, de forma inesperada, muy elevada: del 4.360%.

Claims (15)

1. Un compuesto que tiene la estructura
8
en la que L es CO o CH_{2}, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada, Y es un grupo funcional activado, elegido entre el conjunto formado por los ésteres activos, los isocianatos, los tioles, los imidoésteres, los anhídridos, las maleimidas, las tiolactonas, los restos diazonio y los aldehídos, R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7}, R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5} y R_{3} es un grupo protector o H.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X es NH, Y es un éster activado, R_{1} es CH_{3}, R_{2} es CH_{3} y R_{3} es un grupo protector.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X es NH, Y es un éster activado, R_{1} es C_{2}H_{5}, R_{2} es CH_{3} y R_{3} es un grupo protector.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X es NH, Y es un éster activado, R_{1} es H, R_{2} es CH_{3} y R_{3} es un grupo protector.
5. Un compuesto que tiene la estructura
9
en la que L es CO o CH_{2}, X es NH u O, M es una cadena de 0 a 10 átomos de carbono o heteroátomos, saturada o insaturada, alifática o aromática, sustituida o sin sustituir, lineal o ramificada, Z es un vehículo inmunogénico, R_{1} es H, CH_{3}, C_{2}H_{5} o C_{3}H_{7} y R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5}.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en el que X es NH, Z se elige entre el grupo formado por la KLH, BSA y aminodextrano, R_{1} es H, CH_{3} o C_{2}H_{5} y R_{2} es CH_{3} o C_{2}H_{5}.
7. Línea celular MDMA 8.3, de designación ATCC PTA-5340, que produce un anticuerpo monoclonal específico de la MDMA que tiene una reactividad cruzada superior al 100% para la MDEA.
8. Un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular MDMA 8.3, de designación ATCC PTA-5340, este anticuerpo específico de la MDMA tiene una reactividad cruzada superior al 100% para la MDEA.
9. Línea celular MDMA 6.1, de designación ATCC PTA-5339, que produce un anticuerpo monoclonal específico de la MDMA que tiene una reactividad cruzada superior al 90% para la MBDB y la d-MAMP.
10. Un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular MDMA 6.1, de designación ATCC PTA-5339, este anticuerpo específico de la MDMA tiene una reactividad cruzada superior al 90% para la MBDB y la d-MAMP.
11. Línea celular MDEA 2.2, de designación ATCC PTA-5338, que produce un anticuerpo monoclonal específico de la MDEA que tiene una reactividad cruzada superior al 100% para la MDMA y la MBDB.
12. Un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular MDEA 2.2, de designación ATCC PTA-5338, este anticuerpo específico de la MDEA tiene una reactividad cruzada superior al 100% para la MDMA y la MBDB.
13. Un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto según la reivindicación 5.
14. El anticuerpo de reivindicación 13, en el que L es CH_{2}, X es NH, M es OC(CH_{2})_{2}CO, Z es KLH, R_{1} es CH_{3} o C_{2}H_{5} y R_{2} es CH_{3}.
15. Uso del compuesto según la reivindicación 5 como inmunógeno.
ES04016651T 2003-07-18 2004-07-15 Derivados de la clase del extasis, inmunogenos y anticuerpos y su utilizacion para detectar farmacos de la clase del extasis. Expired - Lifetime ES2289399T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US622254 2003-07-18
US10/622,254 US7060847B2 (en) 2003-07-18 2003-07-18 Ecstasy-class derivatives, immunogens, and antibodies and their use in detecting ecstasy-class drugs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2289399T3 true ES2289399T3 (es) 2008-02-01

Family

ID=33477128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04016651T Expired - Lifetime ES2289399T3 (es) 2003-07-18 2004-07-15 Derivados de la clase del extasis, inmunogenos y anticuerpos y su utilizacion para detectar farmacos de la clase del extasis.

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7060847B2 (es)
EP (1) EP1498415B1 (es)
JP (1) JP4369814B2 (es)
AT (1) ATE365728T1 (es)
CA (1) CA2473596C (es)
DE (1) DE602004007200T2 (es)
ES (1) ES2289399T3 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050130243A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-16 Zheng Yi F. Assay for entactogens
US7294649B2 (en) * 2004-12-17 2007-11-13 Roche Diagnostics Operatins, Inc. Methamphetamine derivatives and conjugates for immunoassay
US20060161076A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-20 Diamics, Inc. Systems and methods for collection of cell clusters
US20060189893A1 (en) * 2005-01-06 2006-08-24 Diamics, Inc. Systems and methods for detecting abnormal cells
WO2008016677A2 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Preparation and utility of deuterated amphetamines
EP4366715A1 (en) * 2021-07-07 2024-05-15 Terran Biosciences, Inc. 3,4-methylenedioxymethamphetamine and related psychedlics and uses thereof
WO2023164203A2 (en) * 2022-02-28 2023-08-31 Mydecine Innovations Group Inc. Novel prodrug compounds of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (mdma) and methods of synthesizing the same

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4041076A (en) 1974-10-23 1977-08-09 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoassay for pharmacologically active phenethylamines
JPH01211582A (ja) 1988-02-16 1989-08-24 Tanabe Seiyaku Co Ltd ベンゾジオキソール誘導体
DK0386644T3 (da) 1989-03-10 1997-10-13 Hoffmann La Roche Reagenser til bestemmelse af lægemidler
DK0471515T3 (da) * 1990-08-15 1997-07-21 Lilly Co Eli Ringsubstituerede 2-amino-1,2,3,4-tetrahydronphtalener, 3-aminochromaner og 3-aminothiochromaner
US5470997A (en) 1992-04-06 1995-11-28 Biosite Diagnostics Incorporated Amphetamine derivatives and protein and polypeptide amphetamine derivative conjugates and labels
CA2096495C (en) 1992-06-16 2002-07-09 Kathy Palmer Ordonez Dual analyte immunoassay
DE19630102A1 (de) 1996-07-25 1998-01-29 Boehringer Mannheim Gmbh Neue aktivierte Amphetamine
GB2361473C (en) * 2000-03-08 2005-06-28 Microgenics Corp Ecstasy-class analogs and use of same in detection of ecstasy-class compounds
US6534325B1 (en) * 2000-06-30 2003-03-18 Roche Diagnostics Corporation Immunoassay for the detection of amphetamines, methamphetamines and methylenedioxy designer amphetamines
EP1321772B1 (en) * 2001-12-20 2008-09-17 Randox Laboratories Ltd. Method and kit for detecting, or determining, 3,4-methylenedioxymethamphetamine
US7169907B2 (en) * 2002-03-01 2007-01-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Derivatives, immunogens, and antibodies for detecting ecstasy-class drugs

Also Published As

Publication number Publication date
DE602004007200T2 (de) 2008-02-28
ATE365728T1 (de) 2007-07-15
EP1498415B1 (en) 2007-06-27
JP4369814B2 (ja) 2009-11-25
JP2005097252A (ja) 2005-04-14
US7569676B2 (en) 2009-08-04
US20050153439A1 (en) 2005-07-14
US7060847B2 (en) 2006-06-13
CA2473596A1 (en) 2005-01-18
EP1498415A1 (en) 2005-01-19
CA2473596C (en) 2008-09-30
US20050014210A1 (en) 2005-01-20
DE602004007200D1 (de) 2007-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2357249T3 (es) Inmunoensayo de docetaxel.
ES2353212T3 (es) Inmunoensayo de doxorrubicina.
ES2347336T3 (es) Inmunoanalisis del taxol.
CA2419696C (en) Compounds, antibodies, reagent kits, methods of producing antibodies, and methods of detecting analytes
CA2473759C (en) Antibodies for detecting ecstasy-class analytes
US7569676B2 (en) Ecstasy-class derivatives, immunogens, and antibodies and their use in detecting ecstasy-class drugs
US7175993B2 (en) Taxol immunoassay
CA2419698C (en) Compounds, antibodies, reagent kits, methods of producing antibodies, and methods of detecting analytes
CA2465017A1 (en) Reagents for detecting efavirenz
US20140273023A1 (en) Gemcitabine immunoassay
US8426143B2 (en) Gemcitabine immunoassay
ES2330104T3 (es) Anticuerpos para la deteccion de efavirenz.
AU2012259309A1 (en) Gemcitabine immunoassay