ES2330007T3 - Nuevo peptido que interactua con proteinas antiapopticas de la familia bcl-2. - Google Patents

Nuevo peptido que interactua con proteinas antiapopticas de la familia bcl-2. Download PDF

Info

Publication number
ES2330007T3
ES2330007T3 ES04786256T ES04786256T ES2330007T3 ES 2330007 T3 ES2330007 T3 ES 2330007T3 ES 04786256 T ES04786256 T ES 04786256T ES 04786256 T ES04786256 T ES 04786256T ES 2330007 T3 ES2330007 T3 ES 2330007T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
bcl
peptide
baselineskip
family
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04786256T
Other languages
English (en)
Inventor
Olivier Geneste
John Hickman
Richard Bennett
Jean- Christophe Rain
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hybrigenics SA
Laboratoires Servier SAS
Original Assignee
Hybrigenics SA
Laboratoires Servier SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybrigenics SA, Laboratoires Servier SAS filed Critical Hybrigenics SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2330007T3 publication Critical patent/ES2330007T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Péptido que interactúa con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 que consiste en la secuencia SEQ. ID. NO. 1: Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg.

Description

Nuevo péptido que interactúa con proteínas antiapópticas de la familia Bcl-2.
La presente invención se refiere a un nuevo péptido que interactúa con Bcl-XL y/o Bcl-2 y/o Bcl-W, así como a los métodos de cribado que permiten identificar moléculas capaces de modular esta interacción.
La mayoría de los procesos biológicos implican interacciones proteína-proteína. Uno de los objetivos fijados por la proteómica es la realización de un mapa de estas interacciones. Éstas, implicadas en la mayoría de los mecanismos de transducción de señales, son los blancos escogidos en la elaboración de un medicamento.
Existen numerosas metodologías que permiten identificar las interacciones proteicas. Una de las más difundidas es el sistema de doble híbrido, desarrollado y descrito inicialmente por Fields y col. (US 5.283.173; US 5.468.614; US 5.667.973). Este sistema se compone básicamente de una prueba in vitro entre dos proteínas recombinantes. La primera, llamada proteína "cebo" es una proteína quimérica fusionada a un dominio de unión a ADN (DNA binding domain/BD) capaz de unirse aguas arriba a un gen reportero. Los dominios de unión comúnmente utilizados son los Gal4 o E. coli LexA. La segunda proteína es también una proteína quimérica comúnmente denominada "presa" que contiene un dominio de activación (activation domain/AD), que proviene en general de Gal4. Sin embargo, estos métodos convencionales tienen sus propios límites. Por ejemplo, es bien conocido que tales cribados pueden llevar a falsos positivos y/o falsos negativos y es necesaria la confirmación bioquímica de los resultados obtenidos. Una técnica más eficaz que permite minimizar los falsos positivos o negativos se describe en la solicitud de patente WO 9942612 y utiliza levaduras haploides recombinantes que contienen las proteínas "cebo" y "presa". Este sistema permite la detección de un mayor número de "presas" a partir de un "cebo" de forma más concreta, más reproducible y más sensible que el resto de los métodos convenciones empleados en este campo.
La apoptosis es un proceso de muerte celular que desempeña un papel crucial en los organismos pluricelulares. En efecto, existen dos formas de muerte celular: la necrosis y la apoptosis. La necrosis se encuentra en las lesiones tisulares: las células se hinchan, lo que lleva a la salida de los constituyentes celulares y después a la lisis de la célula, provocando una inflamación de los tejidos cercanos. Por el contrario, la apoptosis es un proceso fisiológico programado y regulado del que no se puede subestimar su importancia, ya que aproximadamente 10^{9} de nuestras células mueren todos los días por este mecanismo. Numerosas patologías están asociadas a la desregulación del equilibrio existente entre el crecimiento, la supervivencia y la muerte celular. Se pueden mencionar en particular las enfermedades autoinmunes, algunas enfermedades neurológicas y el cáncer. Mantener una célula viva o programar su muerte necesita al menos diez familias de proteínas diferentes, entre las cuales desempeña un papel principal la familia Bcl-2. Esta familia contiene aproximadamente veinte proteínas, entre ellas Blc-2, Bcl-XL y Bcl-W, proteínas antiapoptóticas que favorecen la supervivencia de la célula, al contrario que Bax, Bak y Bid, que son proteínas proapoptóticas. Durante la apoptosis parece que los miembros de la familia Bcl-2 modifican sus interacciones con sus asociadas de forma que inducen cambios irreversibles en las células, cambios que conducen a la muerte celular.
Así, es esencial poder identificar moléculas capaces de modificar estas interacciones para obtener candidatos reales a medicamentos eficaces para las patologías que implican una desregulación de la apoptosis, en particular enfermedades autoinmunes, ciertas enfermedades neurodegenerativas y el cáncer.
El solicitante ha identificado ahora un nuevo péptido que interactúa con las proteínas antiapoptóticas de la familla Bcl-2, y en particular Bcl-2, Bcl-XL y Bcl-W.
Este péptido de 22 aminoácidos corresponde al dominio preciso de interacción con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, y en particular Bcl-2 y/o Bcl-XL y/o Bcl-W, y posee los criterios estructurales típicos de un motivo "BH3", un dominio de interacción que permite la formación de homo- o heterodímeros.
El pequeño tamaño de este péptido hace del mismo un candidato ideal para el diseño de un ensayo que permita un cribado altamente eficaz de moléculas capaces de modular las interacciones entre estas proteínas.
En la literatura se encuentran numerosos ensayos de cribado de moduladores de interacciones proteína-proteína, pero a menudo presentan límites en cuanto a su sensibilidad y factibilidad a alto rendimiento. Los métodos habitualmente utilizados necesitan de herramientas complejas (interacciones entre proteínas de fusión, entre proteínas recombinantes...) poco compatibles con un cribado de alto rendimiento. En la mayoría de los casos, generan un ruido de fondo importante y son poco fiables desde un punto de vista cuantitativo: presentan un marco de lectura reducido que no permite un cribado óptimo de las moléculas ensayadas.
El solicitante, por el contrario, ha diseñado una prueba de cribado altamente eficaz que se basa en la polarización de fluorescencia (Owicki J.C. y col., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306). Esta técnica permite por ejemplo medir la interacción entre un ligando marcado por un fluoróforo y un receptor. El principio consiste en medir el incremento de la polarización de fluorescencia emitida por el ligando fijado a su receptor comparada con la que emite el ligando libre. La polarización de fluorescencia del ligando libre depende de su peso molecular y será mayor cuanto mayor sea el peso molecular de dicho ligando. Así, cuando se realiza esta prueba con un ligando de alto peso molecular, con fuerte polarización de fluorescencia intrínseca, será difícil apreciar fiablemente la diferencia de polarización de fluorescencia entre el ligando libre y el ligando fijado. Por el contrario, la utilización de un ligando de tamaño reducido permitirá exacerbar esta diferencia y, por consiguiente, aumentar la precisión del ensayo. Así, será posible evaluar mejor la actividad real de una molécula y llevar a cabo estos cribados de alto rendimiento.
Más en particular, se describe un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos descritas en SEQ. ID. NO. 1, así como sus variantes funcionales.
Se entiende por "variantes funcionales" todo fragmento o mutante puntual del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1 capaz de interactuar con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 y en particular Bcl-2 y/o Blc-XL y/o Bcl-W.
Este péptido ha sido identificado por el método del doble híbrido utilizando Bcl-XL, Bcl-W y Bcl-2 como proteínas "cebos". Se han cribado tres bancos de cADN humanos (placenta, cerebro, línea celular CEMC7), y ello ha permitido la identificación de fragmentos "presas" correspondientes a secuencias parciales de la secuencia HC21ORF80 (Nº de acceso NM_015227). Después, se determina experimentalmente mediante la técnica del doble híbrido que es necesario y suficiente un fragmento de esta secuencia para obtener la interacción con Bcl-XL y/o Bcl-2 y/o Bcl-W, y corresponde al fragmento de 22 aminoácidos descrito en la SEQ. ID. NO. 1.
La interacción con las proteínas Bcl-2, Bcl-W y Bcl-XL ha sido validada por técnicas bioquímicas de coinmunoprecipitación (GST pull-down) y se ha podido confirmar la actividad biológica de este péptido mediante transfecciones y/o microinyecciones en células en las que se ha demostrado que inducía la apoptosis.
Se describen asimismo las secuencias de ácido nucleicos deducidas según el código genético de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ. ID. NO. 1, así como de las de las variantes funcionales descritas anteriormente.
De forma más particular, la invención se refiere a la secuencia de ácido nucleico SEQ. ID. NO. 2 que codifica para el péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1.
Se debe entender por "secuencia de ácido nucleico" una secuencia nucleica aislada de su contexto natural. Se trata en particular de secuencias aisladas, amplificadas y/o purificadas y eventualmente modificadas por ingeniería genética.
La invención se refiere asimismo a un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según la invención. Se debe entender por "vector" todo tipo de vector que permita la introducción de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped y la expresión del polipéptido. El vector recombinante según la invención se caracteriza porque comprende las secuencias de ADN necesarias para la expresión de los péptidos según la invención y en particular del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1. Se pueden mencionar en particular vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, plásmidos y cromosomas de levadura, virus, etc.
La invención se refiere también a las células huésped transformadas por los vectores recombinantes. Estas células son preferentemente bacterias o células eucariotas. Se pueden mencionar a modo de ejemplo Escherichia coli, levaduras, células de insectos o de mamíferos.
La invención se refiere además a un proceso de cribado de agentes capaces de modular la interacción entre los péptidos según la invención y en particular del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1, y proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2, y especialmente Bcl-2, Bcl-W y Bcl-XL. Los agentes moduladores de estas interacciones serán ventajosamente moléculas sintetizadas químicamente o procedentes de bancos de productos.
El proceso de cribado según la invención comprende los siguientes pasos:
a)
la preparación de un péptido según la invención marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación con el compuesto a ensayar;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia.
La invención se refiere en particular al proceso de cribado de moléculas capaces de inhibir la interacción entre el péptido y la proteína antiapoptótica, incluyendo los siguientes pasos:
a)
la preparación de un péptido según la invención marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación o no con el compuesto a ensayar;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia con y sin el compuesto a ser ensayado;
e)
la selección de las moléculas para las que el incremento de la polarización de fluorescencia observada con el compuesto a ser ensayado es notablemente inferior al que se observa sin el compuesto a ensayar.
La invención se refiere en particular al proceso de cribado de moléculas capaces de aumentar la interacción entre el péptido y la proteína antiapoptótica, comprendiendo los siguientes pasos:
a)
la preparación del péptido según la invención marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación o no con el compuesto a ser ensayado;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia con y sin el compuesto a ser ensayado;
e)
la selección de las moléculas para las que el incremento de la polarización de fluorescencia observada con el compuesto a ser ensayado es notablemente superior al que se observa sin el compuesto a ensayar.
Según un modo de realización preferente de los procesos descritos anteriormente, el marcado de fluorescencia será por ejemplo Oregon Green, Bodipy o fluoresceína, especialmente fluoresceína.
El péptido según la invención utilizado en los procesos de cribado será preferentemente el péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1.
Ventajosamente, los procesos según la invención se realizarán con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 y especialmente Bcl-2, Bcl-W y Bcl-XL.
Por consiguiente, la invención también se refiere a la utilización de los péptidos según la invención para el cribado según los procesos de la invención de moléculas activas capaces de modular la apoptosis.
En especial, la invención se refiere a la utilización de los péptidos según la invención para el cribado según los procesos de la invención de moléculas útiles en el tratamiento de patologías que implican una desregulación de la apoptosis.
Por tanto, la invención se refiere a la utilización de los péptidos según la invención para el cribado según los procesos de la invención de moléculas útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, de ciertas enfermedades neurológicas y del cáncer.
Descripción de las figuras
Figura 1: "GST-Pulldown" GST-Bcl-XL + TBid con competición por el péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1.
Figura 2: Determinación de K_{d} del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1 para Bcl-XL.
Figura 3: Determinación de K_{d} del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1 para Bcl-W.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no la limitan en modo alguno.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
Identificación del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1
Se cribaron tres bancos de cADN humano (placenta, cerebro, línea celular CEMC7) mediante la técnica de doble híbrido (Fields y col.) en una levadura según el protocolo de conjugación (Legrain y col., Nature Genetics, 1997, 16, 277-282).
\vskip1.000000\baselineskip
1) Preparación de "cebos" y "presas"
a)
Los "cebos" utilizados son:
-
\vtcortauna Bcl-XL privada de su extremo C-terminal (1-209) fusionada en el dominio de unión a ADN LexA.
-
\vtcortauna Bcl-2 privada de su extremo C-terminal (1-211) fusionada en el dominio de unión a ADN LexA.
\quad
Se expresan en Saccharomyces cerevisiae (CG1945 o L40\DeltaGa14) y se colocan en un precultivo a 30ºC en un medio sintético libre de triptófano (DO-Trp) hasta la obtención de una DO_{600nm} comprendida entre 0,1 y 0,5. Se incuban a 30ºC durante una noche cincuenta ml de una dilución de este precultivo (DO_{600nm} = 0,006).
b)
Se obtiene una colección de levaduras que contienen los plásmidos que expresan los bancos de cADN fusionados al dominio de activación de transcripción Gal4 por transformación después de su selección en un medio libre de leucina (DO-Leu). Se fraccionan en partes alícuotas estas levaduras y se conservan a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
2) Conjugación
\quad
La conjugación se lleva a cabo a una relación "cebo"/"presa" igual a 2. Una cantidad de células de "levadura-cebo" obtenidas en el paso 1) a) correspondiente a 50 unidades DO_{600nm} se mezcla con las "levadura-presa" obtenidas en el paso 1) b). Después de su centrifugación, se resuspende el residuo en un medio YPGlu, extendido en cajas de cultivo YPGlu, y se incuba durante 4,5 horas a 30ºC. La selección de las levaduras conjugadas que contienen un "cebo" y una "presa" capaces de interactuar juntas se lleva a cabo en un medio DO-Leu-Trp-His: la ausencia de leucina y de triptófano permite mantener una presión de selección que sólo permite el desarrollo de las levaduras que contienen los dos tipos de plásmidos ("cebos"/"presas"); la ausencia de histidina en el medio permite seleccionar las levaduras conjugadas que contienen un plásmido "cebo" y un plásmido "presa" capaces de interactuar juntos: esta interacción permite activar el gen HIS3 que codifica para una enzima implicada en la biosíntesis de la histidina.
\vskip1.000000\baselineskip
3) Identificación de los clones positivos
\quad
Los fragmentos "presa" de una colonia de levaduras seleccionada según 2) se amplifican por PCR a partir de un lisado bruto de esta colonia, utilizando cebadores específicos del vector "presa":
\quad
ABS1 5'-GCTTTGGAATCACTACAGG-3' (SEQ. ID. NO. 3),
\quad
ABS2 5'-CACGATGCACGTTGAAGTG-3' (SEQ ID NO. 4).
\quad
Después, se secuencian los productos PCR y las secuencias obtenidas se identifican por comparación con los bancos de datos. Entre los clones positivos obtenidos, han podido ser identificados fragmentos de 300 aminoácidos aproximadamente como secuencias parciales de la secuencia HC210RF80 (Número de acceso: NM_015227).
\vskip1.000000\baselineskip
4) Identificación del péptido descrito en la SEQ. ID. NO. 1
\quad
Experimentos de doble híbrido realizados según los pasos 1), 2) y 3) descritos anteriormente a partir de fragmentos más pequeños de la secuencia HC21ORF80 permitieron identificar un pequeño péptido de 22 aminoácidos como necesario y suficiente para obtener la interacción con Bcl-XL y/o Bcl-W y/o Bcl-2: Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg (SEQ. ID. NO. 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Validación de la interacción entre el péptido descrito en el Ejemplo 1 y Bcl-W y/o Bcl-XL y/o Bcl-2 1) GST "pull-down"
\quad
La interacción entre el péptido obtenido en el Ejemplo 1 y Bcl-W y/o Bcl-XL y/o Bcl-2 se valida mediante la medida del desplazamiento de la interacción entre una proteína hacia un motivo "BH3" Bid y la proteína de fusión GST-Bcl-XL, GST-Bcl-W o GST-Bcl-2.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Síntesis de Bid radiomarcada
\quad
La proteína marcada se obtiene mediante el kit TNT Quick Master (Promega). Se incuban cuarenta \mul de mezcla TNT durante 90 minutos a 30ºC con 2 \mul (equivalente a 20 \muCi) de ^{35}S-metionina (Amersham), 1 \mug de ADN plasmídico que codifica para Bid y agua en una cantidad suficiente para alcanzar un volumen 50 \mul. El número de fmoles/\mul de proteína radioactiva producida se calcula a partir del número de metioninas en la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
b) GST "pull-down"
\quad
Se incuban cuatro fmoles de proteína Bid radioactiva a 4ºC durante 3 horas con 3 \mug de la proteína de fusión glutatión-S-transferasa-Bcl-XL (GST-Bcl-XL) o glutatión-S-transferasa-Bcl-2 (GST-Bcl-2) o glutatión-S-transferasa-Bcl-W (GST-Bcl-W) o GST sola en 300 \mul de tampón de unión (142 mM KCl, 5 mM MgCl_{2}, 10 mM tampón Hepes, 0,5 mM DTT, 1 mM EDTA, inhibidor de proteasas, pH 7,4) y un 0,4% de Triton x 100. Se lavan 3 veces bolas de "glutatión-sefarosa 4 fast flow" (Amersham) en el tampón de unión y se vuelven a suspender en este tampón para obtener una solución al 50%. Se añaden 20 \mul a cada muestra y se incuban bajo rotación a 4ºC durante 1 hora. Luego se lavan las bolas 3 veces en el tampón de unión, después se añaden 25 \mul de tampón 2 x SDS, Laemmli (Sigma). Se colocan las muestras durante 5 minutos a 95ºC, después se depositan en un gel al 12% de Tris-Glycine (Invitrogen). Después de la electroforesis, se incuba el gel en una solución de secado (Invitrogen) durante 30 minutos, luego se seca durante 150 minutos a 70ºC. Las proteínas radioactivas se revelan mediante exposición de una película Kodak BioMax MS-1 (Sigma). Para realizar la prueba de competición con el péptido a ensayar, éste se añade a la solución inicial a concentraciones que oscilan entre 5 y 20 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
c) Resultados
\quad
Cuando se añade a la solución inicial el péptido obtenido en el Ejemplo 1, la señal autorradiográfica de Bid desaparece. Este resultado demuestra que el péptido obtenido en el Ejemplo 1 inhibe la interacción entre Bcl-W y Bid, entre Blc-XL y Bid y entre Bcl-2 y Bid.
A modo de ejemplo, el resultado obtenido entre Bcl-XL y Bid se muestra en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
2) Polarización de fluorescencia: Determinación de la K_{d} de la interacción entre el péptido obtenido en el Ejemplo 1 y la proteína antiapoptótica
Se mezcla una solución que contiene 15 nM del péptido obtenido en el Ejemplo 1 marcado con fluoresceína en el extremo N-terminal con una solución que contiene la proteína de fusión GST-Bcl-XL o GST-Bcl-W a una concentración que oscila entre 1 nM y 5 \muM, en un tampón que contiene 20 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 7,4, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, ácido plurónico F-68 al 0,05%. La polarización de fluorescencia se mide entonces con el aparato En Vision (Packard Perkin-Elmer). Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 2 y 3.
Resultado: Se observa un incremento significativo de la polarización de fluorescencia cuando el péptido obtenido en el Ejemplo 1 se incuba con las proteínas de fusión que contienen Bcl-XL y Bcl-W, lo que demuestra su fijación a estas proteínas.
La K_{d} obtenida con Bcl-XL es 2,15\cdot10^{-7} M (Figura 2) y la K_{d} obtenida con Bcl-W es 4,11\cdot10^{-7} M (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
Ensayo de cribado de moléculas capaces de inhibir la interacción entre Bcl-W y/o Bcl-XL y/o Bcl-2 y el péptido obtenido en el Ejemplo 1
Los productos a ensayar se distribuyen en placas de 384 pocillos (Coming Flat Bottom) a una concentración final de 10 \mug/ml. Un pocillo se rellena con una cantidad equivalente de tampón/disolvente sin compuesto a ensayar y constituirá el control. El péptido obtenido en el Ejemplo 1 marcado con fluoresceína se añade en cada pocillo para obtener una concentración final de 15 nM. Después, se añade la proteína de fusión GST-Bcl-XL, GST-Bcl-W o GST-Bcl-2 para obtener una concentración final de 500 nM (Bel-XL, Bcl-2) y de 1 \muM (Bcl-W) en un tampón que contiene 20 mM Na_{2}HPO_{4}, pH 7,4, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, ácido plurónico F-68 al 0,05%. Luego se mide la polarización de fluorescencia mediante un aparato En Vision (Packard Perkin-Elmer). Una reducción significativa de la polarización de fluorescencia registrada en la prueba realizada con el compuesto a ensayar, comparada con la que se obtiene sin el compuesto a ensayar (pocillo control), permite concluir una actividad inhibidora de la molécula. A la inversa, un aumento significativo de la polarización de fluorescencia en la prueba con el producto a ensayar comparado con el control permite concluir una actividad activadora de la molécula.
<110> LABORATORIOS SERVIER HYBRIGENICS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo péptido que interactúa con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Péptido-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 03.09697
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 06.08.2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
1 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
4

Claims (20)

1. Péptido que interactúa con las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 que consiste en la secuencia SEQ. ID. NO. 1: Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg.
2. Péptido según la reivindicación 1 que interactúa con las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-XL y/o Bcl-W.
3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque corresponde a un fragmento o a un mutante puntual del péptido descrito en la SEQ ID. NO. 1.
4. Secuencia de ácidos nucleicos que codifican para un péptido según la reivindicación 1 que consiste en la secuencia SEQ. ID. NO. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
5. Secuencias de ácidos nucleicos deducidas según el código genético de la secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 ó 2.
6. Secuencias de ácidos nucleicos deducidas según el código genético de la secuencia de aminoácidos según la reivindicación 3.
7. Vector recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Vector recombinante según la reivindicación 7, caracterizado porque el vector es un plásmido que comprende las secuencias necesarias para la expresión del péptido en una célula huésped.
9. Célula huésped caracterizada porque es transformada por el vector recombinante según una de las reivindicaciones 7 ú 8.
10. Procedimiento de identificación de moléculas capaces de modular la interacción entre un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y una proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a)
la preparación de un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación con el compuesto a ser ensayado;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento de identificación de moléculas capaces de inhibir la interacción entre un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y una proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a)
la preparación de un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación con o sin el compuesto que a ser ensayado;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia;
e)
la selección de las moléculas para las que el incremento de la polarización de fluorescencia observada con el compuesto a ser ensayado es notablemente inferior al que se observa sin el compuesto a ensayar.
\newpage
12. Procedimiento de identificación de moléculas capaces de incrementar la interacción entre un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 y una proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a)
la preparación del péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 marcado con un marcador de fluorescencia;
b)
la incubación con o sin el compuesto a ser ensayado;
c)
la adición de la proteína de fusión que contiene la proteína antiapoptótica de la familia Bcl-2;
d)
la medida de la polarización de fluorescencia;
e)
la selección de las moléculas para las que el incremento de la polarización de fluorescencia observada con el compuesto a ser ensayado es notablemente superior al que se observa sin el compuesto a ensayar.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la proteína antiapoptótica es Bcl-2.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la proteína antiapoptótica es Bcl-XL.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en el que la proteína antiapoptótica es Bcl-W.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en el que el péptido utilizado se caracteriza por la secuencia SEQ. ID. NO. 1.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12 en el que el marcador de fluorescencia utilizado es fluoresceína.
18. Utilización de un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la identificación según el procedimiento de una de las reivindicaciones 10 a 17 de moléculas moduladoras de la apoptosis.
19. Utilización de un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la identificación según el procedimiento de una de las reivindicaciones 10 a 17 de moléculas útiles en el tratamiento de patologías que implican una desregulación de la apoptosis.
20. Utilización de un péptido según una de las reivindicaciones 1, 2 ó 3 para la identificación según el procedimiento de una de las reivindicaciones 10 a 17 de moléculas útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, de ciertas enfermedades neurológicas y del cáncer.
ES04786256T 2003-08-06 2004-08-04 Nuevo peptido que interactua con proteinas antiapopticas de la familia bcl-2. Active ES2330007T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0309697A FR2858621B1 (fr) 2003-08-06 2003-08-06 Nouveau peptide interagissant avec bcl-xl et bcl-2
FR0309697 2003-08-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2330007T3 true ES2330007T3 (es) 2009-12-03

Family

ID=34073058

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04786256T Active ES2330007T3 (es) 2003-08-06 2004-08-04 Nuevo peptido que interactua con proteinas antiapopticas de la familia bcl-2.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7459434B2 (es)
EP (1) EP1651668B1 (es)
JP (1) JP4395514B2 (es)
CN (1) CN1829737B (es)
CA (1) CA2533557A1 (es)
CY (1) CY1110507T1 (es)
DE (1) DE602004022053D1 (es)
DK (1) DK1651668T3 (es)
ES (1) ES2330007T3 (es)
FR (1) FR2858621B1 (es)
HR (1) HRP20090481T1 (es)
PL (1) PL1651668T3 (es)
PT (1) PT1651668E (es)
SI (1) SI1651668T1 (es)
WO (1) WO2005014638A2 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2881430B1 (fr) * 2005-02-01 2010-10-22 Servier Lab Nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
WO2002072761A2 (en) * 2001-03-08 2002-09-19 Phylos, Inc. Polypeptides interactive with bcl-x¿l?

Also Published As

Publication number Publication date
PT1651668E (pt) 2009-08-21
FR2858621B1 (fr) 2007-09-07
US7459434B2 (en) 2008-12-02
CN1829737A (zh) 2006-09-06
JP2007529193A (ja) 2007-10-25
HRP20090481T1 (hr) 2009-10-31
JP4395514B2 (ja) 2010-01-13
WO2005014638A3 (fr) 2005-06-09
FR2858621A1 (fr) 2005-02-11
EP1651668A2 (fr) 2006-05-03
WO2005014638A2 (fr) 2005-02-17
CA2533557A1 (fr) 2005-02-17
CN1829737B (zh) 2012-10-10
CY1110507T1 (el) 2015-04-29
US20060183688A1 (en) 2006-08-17
DK1651668T3 (da) 2009-10-19
PL1651668T3 (pl) 2010-01-29
SI1651668T1 (sl) 2009-12-31
EP1651668B1 (fr) 2009-07-15
DE602004022053D1 (de) 2009-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lalwani et al. Human nonsyndromic hereditary deafness DFNA17 is due to a mutation in nonmuscle myosin MYH9
Davies et al. Novel BTB/POZ domain zinc-finger protein, LRF, is a potential target of the LAZ-3/BCL-6 oncogene
Chen et al. The BRC repeats in BRCA2 are critical for RAD51 binding and resistance to methyl methanesulfonate treatment
Tarabykina et al. Metastasis-associated protein S100A4: spotlight on its role in cell migration
Goutebroze et al. Cloning and characterization of SCHIP-1, a novel protein interacting specifically with spliced isoforms and naturally occurring mutant NF2 proteins
Berthold et al. Characterization of RhoBTB-dependent Cul3 ubiquitin ligase complexes—evidence for an autoregulatory mechanism
Petit et al. The tumor suppressor Scrib interacts with the zyxin-related protein LPP, which shuttles between cell adhesion sites and the nucleus
Herzig et al. Dynein light chain interacts with NRF-1 and EWG, structurally and functionally related transcription factors from humans and drosophila
Chang et al. The BH3 domain of Bcl-XS is required for inhibition of the antiapoptotic function of Bcl-XL
US7919233B2 (en) Motif of the beclin protein which interacts with anti-apoptotic members of the Bcl-2 protein family, and uses
Bañuelos et al. Activation mechanism of the nuclear chaperone nucleoplasmin: role of the core domain
ES2330007T3 (es) Nuevo peptido que interactua con proteinas antiapopticas de la familia bcl-2.
JP4315249B2 (ja) アポトーシス亢進のための組成物と方法
US20070231835A1 (en) Proteomic Screening for Redox State Dependent Protein-Protein Interactions
Lee et al. Langerhans cell protein 1 (LCP1) binds to PNUTS in the nucleus: implications for this complex in transcriptional regulation
ES2318187T3 (es) Metodos y composiciones para dirigir proteinas a lisosomas secretores.
WO2021260074A1 (en) Cross-linking methods
Wang et al. Drosophila Enhancer of zeste protein interacts with dSAP18
ES2319977T3 (es) Represor de la diferenciacion del musculo esqueletico, acido nucleico que lo codifica y su uso en diagnostico y terapia.
Spittle Microtubule assembly: regulation at ends by accessory proteins
Monzo et al. CD2AP, Rabip4, and Rabip4′: Analysis of Interaction with Rab4a and Regulation of Endosomes Morphology
Tran Regulation of Composition and Functions of SWI/SNF Chromatin Remodeling Complex
ES2315273T3 (es) Parejas del dominio ptb1 de fe65, preparacion y utilizaciones.
Bhaskar Modulation of Dorsal function by Smt3-conjugation
Stillwell Human ninein: Centrosomal targeting and regulation of microtubule nucleation