CN1829737A - 与Bcl－2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－W和/或Bcl－XL相互作用的新肽的鉴定，并且也涉及允许鉴定那些相互作用的调节剂的筛选方法。
Description
技术领域
本发明涉及与Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用的新肽，并且也涉及允许鉴定能够调节该相互作用的化合物的筛选方法。
发明背景
大多数生物过程涉及蛋白-蛋白相互作用。蛋白质组学设立的目标之一就是制得这些相互作用的图谱。由于它们参与多数信号传导机制，这些相互作用是药物研发中优选的靶标。
存在着许多方法学使得蛋白的相互作用得以鉴定。最普遍的一种是由Fields等(US 5,283,173；US 5,468,614；US 5,667,973)最初描述和发展的双杂合系统。
这个系统基本上是由两个重组蛋白质之间的体外试验组成的。其中第一，通常称为“诱饵”蛋白，是融合于能够结合报告基因上游的DNA结合结构域(BD)的嵌合蛋白。常用的结合结构域为Gal4或大肠杆菌LexA的结构域。
第二个蛋白质还是嵌合蛋白，一般称之为“捕获”蛋白，含有激活结构域(AD)，一般来自Gal4。
然而，这些传统方法有其局限性。众所周知的，例如，这些筛选方法可造成假阳性和/或假阴性，从而所得结果的生化确认是必须的。
专利申请WO9942612中描述了一种更有效的技术使得假阳性或阴性降到最低，并使用含有“诱饵”和“捕获”蛋白的重组单倍体酵母。与本领域中使用的传统方法相比，这个系统允许以更精确、更可再现和更灵敏的方式使用一个“诱饵”蛋白检测大量的“捕获”蛋白。
细胞凋亡是细胞死亡的过程，其在多细胞生物体中起到关键的作用。实际上，细胞死亡有两种形式：细胞坏死和细胞凋亡。细胞坏死发生在组织病变的情况中：细胞肿胀，导致释放细胞内容物，然后细胞裂解，引起周围组织的炎症。
另一方面，细胞凋亡是一个程序性的和受调控的生理过程，由于每天我们的细胞有大约109个因这种机制死亡，其重要性不可低估。许多病理学与解除存在于细胞生长、存活和死亡之间的平衡的调控有关。
这里尤其要提及的是自身免疫病、某些神经紊乱和癌症。
保持细胞存活或编程其死亡需要至少十个家族的不同蛋白质，其中Bcl-2家族起到主要的作用。该家族包括大约20种蛋白质，有Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W，是抗凋亡蛋白，利于细胞存活，相反的Bax、Bak和Bid是促凋亡蛋白。在细胞凋亡过程中将看到Bcl-2家族成员调节它们与其配偶体之间的相互作用，由此在细胞中产生不可逆的变化导致细胞死亡。
因此能鉴定能够调节这些相互作用的化合物，以得到在涉及解除凋亡、特别是自身免疫病、某些神经退形性变的紊乱和癌症的调控的病理学方面有效的真正候选药物是必需的。
发明内容
本申请人现在鉴定到一种新肽，其与Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特别是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W相互作用。
这个具有22个氨基酸的肽对应于与Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特别是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W的精确相互作用结构域，并具有“BH3”基序的典型结构特征，相互作用结构域允许同源或异源二聚体的形成。
这个肽的小尺寸使其成为理想的候选物，以建立允许高效筛选能够调节这些蛋白质之间相互作用的化合物的测试。
文献中可见到许多筛选蛋白-蛋白相互作用的调节剂的测试，但是它们通常在灵敏度和高通量可行性方面具有局限性。传统上所采用的方法必需要求使用复杂的工具(融合蛋白质之间、重组蛋白质之间等的相互作用)，这不十分适合高通量筛选。它们非常频繁地产生高水平的背景噪音，并且从定量的观点看具有低可信性：它们提供减少了的阅读窗口，不允许测试化合物的最佳筛选。
然而，本申请人建立了一种基于荧光偏振的高效筛选测试(Owicki J.C.等，《生物分子筛杂志》5，2000，297-306)。这个技术使得，例如，荧光基团标记的配体和受体之间的相互作用得以测量。原理在于测量与游离配体相比当配体为受体所结合时发射的荧光偏振的增加。游离配体的荧光偏振取决于其分子量，并且上述配体分子量越高，则荧光偏振将越大。因此，当使用有固有的高水平荧光偏振的高分子量配体进行测试时，难于可信地评价游离配体与结合配体之间荧光偏振的差别。另一方面，使用减少尺寸的配体，将可以使得差别明显，因此使得测定的精确性得以提高。从而可以更好的评价化合物的真实活性并进行高通量筛选。
更具体的，本发明涉及包含SEQ.ID.NO.1所述的氨基酸序列的肽，并涉及其功能性变体。。
“功能性变体”应理解为SEQ.ID.NO.1所述肽的任何片段或点突变体，其能与Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特别是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
通过双杂合方法用Bcl-XL、Bcl-W和Bcl-2作为“诱饵”蛋白鉴定到这个肽。筛选了三个人cDNA库(胎盘、脑、细胞系CEMC7)，并允许鉴定了与序列HC21ORF80(登录号NM-015227)的部分序列对应的“捕获”片段。
然后通过双杂合技术经实验确定该序列上的一个片断是实现与Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用所必须的并且也是足够的，其对应于SEQ.ID.NO.1所述的22个氨基酸片段。
与Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W蛋白的相互作用由生化技术(共免疫沉淀、GST沉降)证实，并且有可能通过转染和/或显微注射进细胞中在显示发生凋亡的情况下证实这个肽的生物活性。
本发明还涉及依照遗传密码由SEQ.ID.NO.1所述的氨基酸序列推导的核酸序列，并且还涉及从上文描述的功能性变体推导出的那些核酸序列。
更具体的，发明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.2，其编码SEQ.ID.NO.1所述的肽。
“核酸序列”应理解为从其自然环境中分离的核酸序列，并且特别意味着已经被分离、扩增和/或纯化、以及视情况而定经遗传工程修饰的序列。
本发明还涉及包含根据本发明的核酸序列的重组载体。
“载体”应理解为允许将核酸序列导入宿主细胞并表达多肽的任何类型的载体。
根据本发明的重组载体特征在于其包含表达照根据本发明的肽，更具体的，SEQ.ID.NO.1所述的肽所必须的DNA序列。
尤其要提及的是衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒和染色体、病毒等的载体。
本发明还涉及由重组载体转化的宿主细胞。这些细胞优选为细菌或真核细胞。作为举例可提及的有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本发明进一步涉及筛选能够调节根据发明的肽，更具体地，SEQ.ID.NO.1所述的肽，和Bcl-2家族抗凋亡蛋白，更具体地Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W之间的相互作用的试剂的方法。调节这些相互作用的试剂将有利地是业已被化学合成或得自化合物库的化合物。
根据本发明所述的筛选方法包括下列步骤：
a)制备根据本发明用荧光标记标记的肽；
b)与待测化合物一起孵育；
c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量荧光偏振。
本发明尤其涉及筛选能够抑制所述肽和所述抗凋亡蛋白之间的相互作用的化合物的方法，包括下列步骤：
a)制备根据本发明用荧光标记标记的肽；
b)与或不与待测化合物一起孵育；
c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量有或无待测化合物的荧光偏振；
e)选择与无待测化合物的观测结果相比，有待测化合物时观察到的荧光偏振增高显著较低的化合物。
本发明还涉及筛选能够增强所述肽和抗调亡蛋白之间的相互作用的化合物的方法，包括下列步骤：
a)制备根据本发明用荧光标记标记的肽；
b)与或不与待测化合物一起孵育；
c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量有或无待测化合物的荧光偏振；
e)选择与无待测化合物的观测结果相比，有待测化合物时观察到的荧光偏振显著更高的化合物。
根据上文描述的方法的优选实施方案，所述荧光标记将是，例如，俄勒冈绿(oregon green)、bodipy或荧光素，更特别是荧光素。
根据发明在筛选方法中使用的肽优选SEQ.ID.NO.1所述的肽。
根据发明的方法有利地使用Bcl-2家族抗凋亡蛋白进行，更特别地是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W。
因此，本发明还涉及根据本发明的肽在根据本发明的方法中筛选能够调节凋亡的活性化合物的用途。
更具体地，本发明还涉及根据本发明的肽在根据本发明的方法中筛选用于治疗涉及解除凋亡调节的病理的化合物的用途。
本发明还涉及根据本发明的肽在根据本发明的方法中筛选用于治疗自身免疫病、某些神经紊乱和癌症的化合物的用途。
附图说明
图1.“GST沉降”与SEQ.ID.NO.1所述的肽竞争的GST-Bcl-XL+TBid。
图2.测定SEQ.ID.NO.1所述的肽对Bcl-XL的Kd。
图3.测定SEQ.ID.NO.1所述的肽对Bcl-W的Kd。
如下实施例阐释而不以任何方式限制本发明：
实施例1：SEQ.ID.NO.1所述肽的鉴定
在酵母中利用接合方案(Legrain等，Nature Genetics，1997，16，277-282)通过双杂合技术(Fields等)对三个人类cDNA库(胎盘、脑、细胞系CEMC7)进行了筛选。
1)
“诱饵”和“捕获”蛋白的制备
a)所用“诱饵”为：
-融合于LexA DNA结合结构域的Bcl-XL(1-209)C-末端截短物
-融合于LexA DNA结合结构域的Bcl-2(1-211)C-末端截短物
-融合于LexA DNA结合结构域的Bcl-XL(1-209)C末端截短物
将它们在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(CG1945或L40ΔGal4)中表达，并于30℃在缺乏色氨酸的合成培养基(DO-Trp)中预培养，直至DO600nm达到包括端值在内的0.1到0.5之间。将50ml预培养物稀释液(DO600nm＝0.006)于30℃过夜孵育。
b)含有表达融合于Gal4转录激活结构域的cDNA库的质粒的酵母集合是通过转化继之以在缺乏亮氨酸的培养基(DO-Leu)中选择获得的。将酵母等分成小份并贮存于-80℃。
2)
接合
使用比率为2的“诱饵”/“捕获”比进行接合。
将得自步骤1)a)相当于50单位DO600nm的量的“诱饵酵母”细胞与得自步骤1)b)的“捕获酵母”混合。离心后，将沉淀物重悬于YPGlu培养基中，涂布在YPGlu培养板上并在30℃孵育4小时30分钟。在DO-Leu-Trp-His培养基中进行含有彼此能够相互作用的“诱饵”和“捕获”的接合酵母的选择：培养基中缺少亮氨酸和色氨酸使得有可能维持选择压力，只允许含有两种类型质粒(“诱饵”/“捕获”)的这些酵母生长；培养基中缺少组氨酸使得有可能选择含有彼此能够相互作用的“诱饵”质粒和“捕获”质粒的接合酵母：这种相互作用使得有可能激活HIS3基因，其编码参与组氨酸生物合成的酶。
3)
阳性克隆的鉴定
通过PCR使用“捕获”载体的特异引物自2)选择的酵母克隆的粗裂解液扩增该克隆的“捕获”片段。
ABS1 5’-GCTTTGGAATCACTACAGG-3’(SEQ.ID.NO.3)，
ABS2 5’-CACGATGCACGTTGAAGTG-3’(SEQ.ID.NO.4)。
接着对PCR产物测序，并与数据库对照以鉴定得到的序列。
在得到的阳性克隆中，有可能鉴定大约300个氨基酸的片段是序列HC21ORF80(登录号：NM-015227)的部分序列。
4)
SEO.ID.NO.1所述肽的鉴定
对HC21ORF80序列更小的片段依照上述步骤1)、2)和3)进行双杂合实验，允许鉴定到实现与Bcl-XL和/或Bcl-W和/或Bcl-2相互作用所必须且足够的22个氨基酸的短肽：Asp-Thr-Arg--Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg(SEQ.ID.NO.1)。
实施例2：实施例1中所述的肽与Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之间相
互作用的鉴定
1)GST“沉降”
通过测定有“BH3”基序的Bid蛋白与融合蛋白GST-Bcl-W、GST-Bcl-XL或GST-Bcl-2之间相互作用的变化来验证得自实施例1中所述的肽与Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之间的相互作用。
a)合成放射性标记的Bid
使用TNT quick master试剂盒(Promega)得到标记蛋白。将40μl TNT混合物与2μl(相当于20μCi)35S-甲硫氨酸(Amersham)、1μg编码Bid的质粒DNA和使体积达到50μl的足量水一起在30℃孵育90分钟。
基于蛋白中的甲硫氨酸数目计算产生的放射性蛋白的fmole/μl数。
b)GST“沉降”
将4fmole的放射性Bid蛋白与3μg融合蛋白谷胱甘肽-S-转移酶-Bcl-XL(GST-Bcl-XL)或谷胱甘肽-S-转移酶-Bcl-2(GST-Bcl-2)或谷胱甘肽-S-转移酶-Bcl-W(GST-Bcl-W)或仅仅GST一起在300μl结合缓冲液(142mM KCl、5mM MgCl2、10mM Hepes缓冲液、0.5mM DTT、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂、pH7.4)和0.4％Triton X100中4℃孵育3小时。“谷胱甘肽琼脂糖4速流”珠(Amersham)用所述结合缓冲液洗涤3遍，并用所述缓冲液重悬从而得到50％的溶液。向每个样品加入20μl并在4℃旋转孵育1小时。接着用结合缓冲液洗涤所述珠3次，然后加入25μl 2xSDS缓冲液Laemmli(Sigma)。然后将样品保持在95℃5分钟并接着施加到12％Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。电泳后，随后将凝胶在干燥液(Invitrogen)中孵育30分钟，然后在70℃干燥150分钟。经由KodakBioMax MS-1膜(Sigma)曝光显示荧光蛋白。为进行待测肽的竞争测试，其向初始溶液添加的浓度范围从5到20μM。
c)结果
当得自实施例1的肽加入到初始溶液中时，Bid的放射自显影信号消失。这个结果显示得自实施例1的肽抑制Bcl-W和Bid之间、Bcl-XL和Bid之间以及Bcl-2和Bid之间的相互作用。
作为举例，得自Bcl-XL和Bid之间的结果示于图1。
2)荧光偏振：实施例1得到的肽和抗凋亡蛋白质之间相互作用的Kd 的测定
在包括Na2HPO420mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronicacid F-680.05％的缓冲液中，将15nM得自实施例1用荧光素标记N-末端的肽溶液与浓度范围从1nM到5μM变动含有融合蛋白GST-Bcl-XL或GST-Bcl-W的溶液混合。然后用En显示仪(Packard Perkin-Elmer)测量荧光偏振。
得到的结果示于图2和3。
结果：在得自实施例1的肽与含有Bcl-XL和Bcl-W的融合蛋白孵育时，观察到荧光偏振显著提高，证明其已与这些蛋白质结合。
Bcl-XL得到的Kd是2.15×10-7M(图2)，而Bcl-W得到的Kd是4.11×10-7M(图3)。
实施例3：能够抑制Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2与实施例1中所获得
的肽之间的相互作用的化合物的筛选试验
将待测化合物以10μg/ml的终浓度分配到384孔板(Corning平底)中。在一个孔中装满不含待测化合物的等量缓冲液/溶剂以形成对照。向各孔添加由荧光素标记的实施例1中所获得的肽，从而得到15nM的终浓度。然后添加融合蛋白GST-Bcl-XL、GST-Bcl-W或GST-Bcl-2，从而在含Na2HPO4 20mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronic acid F-680.05％的缓冲液中得到500nM(Bcl-XL、Bcl-2)和1μM(Bcl-W)的终浓度。然后通过En显示仪(Packard Perkin-Elmer)测量荧光偏振。与无测试化合物(对照孔)所获得的相比，在有测试化合物所进行的试验中记录到的荧光偏振显著下降，则允许得出所述化合物具有抑制活性的结论。相反，测试化合物试验中的荧光偏振与对照相比显著升高，则允许得出所述化合物具有激活活性的结论。
序列表
<110>瑟维尔实验室
哈伯里健尼克斯公司
<120>与Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽
<130>肽-1
<150>FR 03.09697
<151>2003-08-06
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Asp Thr Arg Arg Ser Met Val Phe Ala Arg His Leu Arg Glu Val Gly
1 5 10 15
Asp Glu Phe Arg Ser Arg
20
<210>2
<211>66
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gatacccgtc gcagcatggt gtttgccagg cacctgcggg aggtgggaga cgagttcagg 60
agcaga 66
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<400>3
gctttggaat cactacagg 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<400>4
cacgatgcac gttgaagtg 19
Claims (20)
1、与Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的肽，特征在于其为序列SEQ.ID.NO.1：Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg。
2、如权利要求1所述的肽，其与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
3、如权利要求1或2所述的肽，特征在于其对应于SEQ.ID.NO.1所述肽的片段或点突变体。
4、核酸序列，其编码如权利要求1所述的肽，特征在于其为序列SEQ.ID.NO.2：5’-GATACCCGTCGCAGCATGGTGTTTGCCAGGCACCTGCGGGAGGTGGGAGACGAGTTCAGGAGCAGA-3’。
5、核酸序列，其是由如权利要求1或2所述的氨基酸序列根据遗传密码推断出来的。
6、核酸序列，其是由如权利要求3所述的氨基酸序列根据遗传密码推断出来的。
7、重组载体，特征在于其包含如权利要求4至6中任一项所述的核酸序列。
8、如权利要求7所述的重组载体，特征在于所述载体为质粒，其中所述质粒包含为在宿主细胞中表达肽所必需的序列。
9、宿主细胞，特征在于其已被如权利要求7或8中任一项所述的重组载体转化。
10、鉴定能够调节如权利要求1、2或3中任一项所述的肽与Bcl-2家族抗凋亡蛋白之间的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步骤：
a)制备用荧光标记标记了的如权利要求1、2或3中任一项所述的肽；
b)与待测化合物一起孵育；
c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量荧光偏振。
11、鉴定能够抑制如权利要求1、2或3中任一项所述的肽与Bcl-2家族抗凋亡蛋白之间的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步骤：
a)制备用荧光标记标记了的如权利要求1或2中任一项所述的肽；
b)与或不与待测化合物一起孵育；
c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量荧光偏振；
e)选择与无待测化合物所观察到的相比，有待测化合物所观察到的荧光偏振的增加显著更低的化合物。
12、鉴定能够增强如权利要求1、2或3中任一项所述的肽与Bcl-2家族抗凋亡蛋白之间的相互作用的化合物的方法，特征在于其包括如下步骤：
a)制备用荧光标记标记了的如权利要求1或2中任一项所述的肽；
b)与或不与待测化合物一起孵育；
c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)测量荧光偏振；
e)选择与无待测化合物所观察到的相比，有待测化合物所观察到的荧光偏振的增加显著更高的化合物。
13、如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中抗凋亡蛋白为Bcl-2。
14、如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中抗凋亡蛋白为Bcl-XL。
15、如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中抗凋亡蛋白为Bcl-W。
16、如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所用的肽特征在于其为序列SEQ.ID.NO.1。
17、如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所用的荧光标记为荧光素。
18、如权利要求1、2或3中任一项所述的肽在如权利要求10至17中任一项所述的方法中在鉴定凋亡调节化合物中的用途。
19、如权利要求1、2或3中任一项所述的肽在如权利要求10至17中任一项所述的方法中在鉴定可用于治疗涉及解除凋亡调控的病理的化合物中的用途。
20、如权利要求1、2或3中任一项所述的肽在如权利要求10至17中任一项所述的方法中在鉴定可用于治疗自身免疫病、某些神经紊乱和癌症的化合物中的用途。
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